JP5224477B2 - 親和性アッセイのための結合表面 - Google Patents

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Description

関連出願への相互参照
この出願は、２００６年１１月１日に出願された、米国仮特許出願第６０／８６３，８２０号への優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、不飽和であるか、または不飽和であり配向性を持つ結合表面を有している支持体に関する。これには、親和性アッセイに使用されるリガンドが含まれている結合表面を有している支持体が含まれる。本発明の特定の態様は、ビオチン、またはビオチンとビオチンに特異的なリガンド結合基（ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｅｒ）（例えば、ストレプトアビジン（ＳＡ））が含まれている結合表面に関する。抗原もしくは抗体、またはその断片が含まれている結合表面を含む、免疫測定法のための結合表面が提供される。本発明のさらなる実施形態は、ブロックされた固体支持体表面、および分散したマイクロ粒子に関する。そのような支持体を作製し、使用するための方法が提供される。
背景
結合表面は、例えば、親和性アッセイを含む多種多様な用途に使用される。従来の結合表面は、通常、固相支持体表面の単位表面積あたりのリガンド結合基の量を最大にすることによって調製される。従来のアプローチによっては、高密度でリガンド結合基を有している支持体表面が得られるが、支持体表面上のリガンド結合基の数を単純に最大にすることによっては、結合表面の性能を必ずしも改善することはできない。親和性アッセイにおいて使用されるいくつかの従来の結合表面は、リガンド結合基（例えば、抗体）またはビオチン特異的リガンド結合基（例えば、ＳＡ）の固相上への直接的なコーティング、および、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはオボアルブミンでの固相のブロックによって、結合能力が最大化させられる。これによっては、結合表面の抗原またはビオチン結合能力が最大となるが、それぞれの抗体またはビオチン特異的リガンド結合基は、特異的な配向性を持たずに結合表面上に集められており、そして伝統的なブロッキング方法は結合表面からの抗体またはビオチン特異的リガンド結合基の脱落を防ぐ、あるいは軽減することは必要ない。さらに、脱落は、アッセイの低い感度（最適には満たないシグナル対ノイズ比）、精度、正確度、安定性、または製造可能性、あるいはそれらの組み合わせを生じ得る。結合表面の密集とランダムな配向は、立体障害が原因で、結合表面の結合効率または結合能力を低下させる可能性がある。したがって、改良された結合表面と、結合表面上のリガンド結合基の密度を単純に最大にすることには頼らない、改良された結合表面を作製するための組成物および方法が必要である。
要旨
不飽和である結合表面または不飽和であり配向性を持つ結合表面、不飽和である結合表面または不飽和であり配向性を持つ結合表面を作製するための方法、および不飽和である結合表面または不飽和であり配向性を持つ結合表面の構成成分を作製するための方法が提供される。親和性アッセイ（例えば、免疫測定法）のための不飽和である結合表面または不飽和であり配向性を持つ結合表面のための方法および組成物もまた、提供される。
１つの態様においては、本発明により、免疫測定法のための不飽和である捕捉部分または不飽和であり配向性を持つ捕捉部分を調製するための方法と組成物が提供される。ここでは、捕捉部分は、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面への結合によって、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持たせられる。特異的な実施形態においては、捕捉部分には、免疫グロブリンまたはその断片が含まれる。この場合、捕捉部分は、支持体連結器（ｓｕｐｐｏｒｔ ｃｏｕｐｌｅｒ）上に固定させられたリガンドとの結合によって、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面上に固定される。この場合、支持体連結器は固相支持体表面上に固定される。特異的な実施形態においては、免疫グロブリンまたはその断片はビオチン化され、ビオチン化された免疫グロブリンまたはその断片がビオチン特異的リガンドリガンド結合基（ビオチン結合部分）と結合させられ、そしてビオチン特異的リガンド結合基は、支持体に直接、または支持体連結器を介して結合させられたビオチンと結合させられる。特異的な実施形態においては、支持体連結器にはタンパク質が含まれ、固相支持体表面にはマイクロ粒子が含まれる。
別の態様においては、本発明により、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を有している支持体を使用する免疫測定法を実行するための方法が提供される。ここでは、この方法には、分析物を捕捉するために免疫グロブリンまたはその断片を使用することが含まれる。この場合、免疫グロブリンまたはその断片は、結合表面上で不飽和であるか、または不飽和であり配向性を持たせられる。様々な実施形態においては、免疫グロブリンまたはその断片の不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ性質は、免疫グロブリンまたはその断片が結合する結合表面の、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ性質によって決定される。
別の態様においては、本発明により、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を有している支持体が提供される。これには、直接、または支持体に結合させられた支持体連結器に対する結合を介して間接的のいずれかで、支持体と結合したリガンドが含まれる。この場合、リガンドは、支持体１平方メートルあたり約１．０×１０−３からから約５．０×１０−１マイクロモルのリガンド、または支持体１平方メートルあたり約０．５×１０−２から約２．０×１０−１マイクロモルのリガンド、または支持体１平方メートルあたり約１．０×１０−２から約１．６×１０−１マイクロモルのリガンド、または支持体１平方メートルあたり約１．０×１０−２から約２．０×１０−１マイクロモルのリガンドの密度で存在するか、あるいは、リガンドは、マイクロ粒子１ミリグラム（ｍｇ）あたり約０．５×１０−４から約１０×１０−４マイクロモルのリガンド、またはマイクロ粒子１ｍｇあたり約１．０×１０−４から約５．５×１０−４マイクロモルのリガンドの密度で存在する。様々な実施形態においては、支持体連結器は、アッセイ支持体１平方メートルあたり約１．２×１０−２マイクロモルから１平方メートルあたり約７．５×１０−２マイクロモルの密度で、アッセイ支持体上に存在する。様々な実施形態においては、リガンドはリガンド結合基と結合させられ、ここでは、リガンド結合基は、支持体１平方メートルあたり約０．４×１０−２未満から約８×１０−２マイクロモル未満のリガンド結合基の密度で、または、アッセイ支持体１平方メートルあたり約１．０×１０−２から約５．０×１０−２マイクロモルの密度で存在する。
本発明の実施形態は、アッセイ支持体上に存在する捕捉部分を、アッセイ支持体１平方メートルあたり約１．０×１０−４マイクロモルから１平方メートルあたり約２．０×１０−２マイクロモルの密度で有することに関する。様々な実施形態においては、結合表面にはさらに捕捉部分が含まれる。この場合、捕捉部分は、支持体１平方メートルあたり約２×１０−３未満から約４×１０−２マイクロモル未満の捕捉部分の密度で存在する。特異的な実施形態においては、リガンド（例えば、ビオチン）は、支持体１平方メートルあたり約１．９×１０−２から約１．６×１０−１マイクロモルのリガンドの密度で存在し、リガンド結合基（例えば、ビオチン結合部分、例えば、ＳＡ）は、アッセイ支持体１平方メートルあたり約１．０×１０−２から約５．０×１０−２マイクロモル、または支持体１平方メートルあたり約１．２×１０−２から約４．６×１０−２マイクロモル未満のリガンド結合基で存在し、そして捕捉部分（例えば、ビオチン化された捕捉部分、例えば、ビオチン化された分析物特異的抗体）は、支持体１平方メートルあたり約２．５×１０−３から約１．４×１０−２マイクロモルの捕捉部分の密度で存在する。本発明の少なくとも１つの実施形態においては、支持体連結器は状況に応じたものである。そのような１つの実施形態においては、リガンドはビオチンまたはその誘導体であり得る。
特異的な実施形態においては、リガンドにはビオチンまたはその誘導体が含まれる。別の特異的な実施形態においては、リガンド結合基には、ビオチン結合部分またはその断片（例えば、アビジン、ＳＡ、ニュートラアビジン、ＳＡの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはそれらの混合物）が含まれる。様々な実施形態においては、捕捉部分には、抗体、抗体の結合断片、受容体、受容体のリガンド、ホルモン、ホルモンの受容体、酵素、酵素の基質、１本鎖のオリゴヌクレオチド、１本鎖のポリヌクレオチド、２本鎖のオリゴヌクレオチド、２本鎖のポリヌクレオチド、抗原、ペプチド、またはタンパク質のうちの１つ以上が含まれる。様々な実施形態においては、リガンドは、支持体連結器を介して支持体と結合させられ、そして順に、支持体連結器が支持体と結合させられる。特異的な実施形態においては、支持体連結器にはタンパク質が含まれる。特異的な実施形態においては、タンパク質は、ＢＳＡ、オボアルブミン、ＢＳＡの断片、オボアルブミンの断片、またはそれらの混合物である。特異的な実施形態においては、支持体はマイクロ粒子である。特異的な実施形態においては、結合表面は、支持体１平方メートルあたり約１×１０−２から約５×１０−１マイクロモルのリガンドを有するか、あるいは、結合表面は、支持体１平方メートルあたり約２×１０−２から約２×１０−１マイクロモルのリガンドを有する。別の特異的な実施形態においては、結合表面は、支持体１平方メートルあたり約１．９×１０−２から約１．６×１０−１マイクロモルのリガンドを有する。別の特異的な実施形態においては、結合表面は、支持体１平方メートルあたり約１．６×１０−２から約６．６×１０−２マイクロモルのリガンドを有する。別の特異的な実施形態においては、結合表面は、支持体１平方メートルあたり約１．６×１０−２から約３．２×１０−２マイクロモルのリガンドを有する。別の特異的な実施形態においては、結合表面は、支持体１平方メートルあたり約１．６×１０−２から約２．０×１０−１マイクロモルのリガンドを有する。
様々な実施形態においては、結合表面には、リガンドに結合させられたリガンド結合基と、リガンド結合基に結合させられた捕捉部分が含まれる。この場合、捕捉部分は、様々な実施形態においては、リガンドの約７５％の密度で、リガンドの約５０％の密度で、およびリガンドの約２５％の密度で存在する。
特異的な実施形態においては、リガンドにはビオチンが含まれ、ビオチンは、ＢＳＡ、オボアルブミン、ＢＳＡの断片、オボアルブミンの断片、またはそれらの混合物から選択される支持体連結器を介して支持体と結合させられる。ビオチンは、アビジン、ＳＡ、ニュートラアビジン、ＳＡの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはそれらの混合物から選択されるビオチン結合部分を含むリガンド結合基に結合させられ、そしてビオチン結合部分はビオチン化された捕捉部分に結合させられる。この場合、捕捉部分は、抗体、抗体の結合断片、受容体、受容体のリガンド、ホルモン、ホルモンの受容体、酵素、酵素の基質、１本鎖のオリゴヌクレオチド、２本鎖のオリゴヌクレオチド、１本鎖のポリヌクレオチド、２本鎖のポリヌクレオチド、抗原、ペプチド、またはタンパク質の１つ以上からなる群より選択される。
別の態様においては、本発明により、支持体上に配置された複数の支持体連結器、および支持体連結器と結合したリガンドが含まれている、不飽和であり配向性を持つ結合表面を有している支持体が提供される。この場合、リガンドは不飽和であり、立体的に接近することができるリガンドを提供する様式で表面上に配向性を持たせられる。特異的な実施形態においては、リガンドは、リガンドと特異的に結合することができる２価または多価リガンド結合基と結合させられ、そして結合表面には、結合していない遊離のリガンドは実質的には含まれない。
様々な実施形態においては、支持体連結器は、支持体１平方メートルあたり約１．９×１０−２から約１．６×１０−１マイクロモルのリガンドと結合させられる。
支持体連結器は、共有結合または非共有結合によって支持体と結合させることができる。様々な実施形態においては、支持体連結器は、支持体と共有結合させられる。支持体連結器が支持体と共有結合させられる実施形態においては、当該分野で公知の任意の適切な結合化学を、支持体に対して支持体連結器を結合させるために使用することができる。適切な結合化学反応としては、カルボキシル、ヒドロキシル、トシル、エポキシ、アルデヒド、アミン、アミド、ヒドラジド、イソチオシアネート、マレイミド、およびスルフヒドリルからなる群より選択される１つ以上の官能基を介する結合が挙げられるが、これらに限定されない。特異的な実施形態においては、支持体連結器は、結合のためのトシル化学反応を使用して支持体と共有結合させられる。
支持体連結器には、支持体と結合させることができ、またリガンドとも結合させることができる任意の適切な物質が含まれ得る。支持体との結合、およびリガンドとの結合は、共有結合であり得る。適切な支持体連結器としては、マクロ分子（例えば、タンパク質または他のポリマー）が挙げられるが、これらに限定されない。様々な実施形態においては、支持体連結器にタンパク質が含まれる。タンパク質は、例えば、単量体、二量体、多量体、または融合タンパク質であり得る。特異的な実施形態においては、タンパク質には、少なくとも１つのアルブミン（例えば、ＢＳＡ、オボアルブミン、ＢＳＡの断片、オボアルブミンの断片、またはそれらの混合物）が含まれる。
様々な実施形態においては、リガンドにはビオチンが含まれる。支持体表面または支持体連結器に対してビオチンを結合させるための適切なビオチン試薬としては、アミン反応性ビオチン標識試薬（例えば、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン、スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン、ＮＨＳ−ビオチン、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン、ＰＦＰ−ビオチン、ＴＦＰ−ＰＥＯ−ビオチン、またはＮＨＳ−イミノビオチントリフルオロアセトアミド）、スルフヒドリル反応性ビオチン標識試薬（例えば、マレイミド−ＰＥＯ２−ビオチン、ビオチン−ＢＭＣＣ、ＰＥＯ−ロドアセチルビオチン、ヨードアセチル−ＬＣ−ビオチン、またはビオチン−ＨＰＤＰ）、カルボキシル反応性ビオチン標識試薬（例えば、ビオチンＰＥＯ−アミンまたはビオチンＰＥＯ−ＬＣ−アミン）、炭水化物反応性ビオチン標識試薬（例えば、ビオシチンヒドラジド、ビオチンヒドラジド、またはビオチン−ＬＣ−ヒドラジド）、あるいは、光反応性ビオチン標識試薬（例えば、ソレラン−ＰＥＯ−ビオチン）が挙げられる。特異的な実施形態においては、リガンドにはビオチンが含まれ、これは、アミン反応性ビオチン標識試薬であるスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを使用して支持体または支持体連結器に結合させられる。
リガンドにビオチンが含まれる実施形態においては、支持体上の結合表面にはさらに、ビオチンと結合したリガンド結合基が含まれる。特定の実施形態においては、リガンド結合基にビオチン結合部分が含まれる。様々な実施形態においては、ビオチン結合部分にはタンパク質（例えば、少なくとも１つのビオチン結合タンパク質、例えば、アビジン、ＳＡ、ニュートラアビジン、ＳＡの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはそれらの混合物）が含まれる。ビオチン結合部分にはまた、融合タンパク質（例えば、様々な結合タンパク質と融合させられたアビジン）も含まれ得る。
様々な実施形態においては、支持体連結器にはタンパク質が含まれ、リガンドにはビオチンが含まれ、そしてタンパク質は、低入力比のビオチンでビオチン化され、その結果、支持体連結器は、支持体連結器１モルあたり５モル未満または５モルのビオチンの取り込みの割合を有する。特異的な実施形態においては、タンパク質は、ＢＳＡ、オボアルブミン、ＢＳＡの断片、オボアルブミンの断片、またはそれらの混合物である。
支持体上の結合表面にビオチン結合部分が含まれる様々な実施形態においては、支持体上の結合表面にはさらに、ビオチン結合部分と結合したビオチン化された捕捉部分が含まれる。ビオチン化された捕捉部分には、スペーサーが含まれ得、例えば、この場合、スペーサーは、ビオチン部分と捕捉部分との間に存在する。ビオチン化された捕捉部分には、捕捉される物質にしたがって、任意の適切な捕捉部分が含まれ得る。適切な捕捉部分には、抗体、抗体の結合断片、受容体、受容体のリガンド、ホルモン、ホルモンの受容体、酵素、酵素の基質、１本鎖のオリゴヌクレオチド、２本鎖のオリゴヌクレオチド、１本鎖のポリヌクレオチド、２本鎖のポリヌクレオチド、抗原、ペプチド、またはタンパク質の少なくとも１つが含まれる。
様々な実施形態においては、支持体上の結合表面には、少なくとも２つの親水性のテールが隣接している疎水性の頭部基を含むブロックコポリマーがさらに含まれる。この場合、疎水性の頭部基は支持体と接触する。
親水性のテールの長さは、それぞれ別々に、頭部基の長さの約２倍から約２．５倍であり得る。ブロックコポリマーには、ポリプロピレンオキサイドブロックとポリエチレンオキサイドブロックを有している、一般式Ｉの構造が含まれ得る：
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｘ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｙ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｚＨ （Ｉ）、
式中、ｘおよびｙは、ポリプロピレンオキサイドブロックが支持体と結合するように選択される。特異的な実施形態においては、ｘは、約１００から約１３５であり、ｙは、約４０から約７５であり、そしてｚは、約１００から約１３５である。他の実施形態においては、ｘは、約１１０から約１２５であり、ｙは、約６０から約７０であり、そしてｚは、約１１０から約１２５である。様々な実施形態においては、ブロックコポリマーは、約１２，７００（Ｄａ）ダルトン〜１７，４００Ｄａの平均分子量；または、約９，０００から約１８，０００Ｄａの平均分子量を有する。特異的な実施形態においては、ブロックコポリマーは、約９，８４０Ｄａから約１４，６００Ｄａの平均分子量を有する。特異的な実施形態においては、ブロックコポリマーは、約１４，６００Ｄａの平均分子量を有する。別の特異的な実施形態においては、ブロックコポリマーは、約１２，６００Ｄａの平均分子量を有する。
様々な実施形態においては、支持体には、有機ポリマーまたはコポリマーが含まれる。様々な実施形態においては、有機ポリマーまたはコポリマーは疎水性である。適切なポリマーとしては、ポリスチレン、ポリ（ジビニルベンゼン）、スチレン−アクリレートコポリマー、スチレン−ブタンジエンコポリマー、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、ポリ（スチレン−オキシエチレン）、ポリメチルメタクリレート、ポリウレタン、ポリグルタルアルデヒド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス−アクリルアミド、ポリオレフィン類、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリスルホン、ポリ（エーテルスルホン）、熱分解された物質、ブロックコポリマー、および上記のもののコポリマー、シリコーン、またはシリカが挙げられるが、これらに限定されない。特異的な実施形態においては、支持体には、スチレンとジビニルベンゼンが含まれ、そして支持体はポリウレタン層でコーティングされる。
様々な実施形態においては、疎水性であるポリマーまたはコポリマーを使用することにより、約６０度を超える水接触角を有する支持体が得られるであろう。様々な実施形態においては、疎水性であるポリマーまたはコポリマーを使用することにより、約７０度を超える水接触角を有する支持体が得られるであろう。
様々な実施形態においては、支持体にマイクロ粒子が含まれる。特異的な実施形態においては、マイクロ粒子には、常磁性または超常磁性の材料（例えば、強磁性の酸化鉄Ｆｅ３Ｏ４またはＦｅ２Ｏ３）が含まれる。用語「常磁性」および「超常磁性」は、傾斜磁場の中で力を受けるが、永久には磁化されない物質をいう。特異的な実施形態においては、支持体には、磁赤鉄鉱、すなわち、Ｆｅ２Ｏ３の形態で鉄が含まれる。様々な実施形態においては、マイクロ粒子の平均直径は、１００ｎｍから２２，９００ｎｍの範囲である。特異的な実施形態においては、マイクロ粒子の平均直径は、約７５０ｎｍから約３，０００ｎｍの範囲である。別の特異的な実施形態においては、マイクロ粒子の平均直径は、約９５０ｎｍから約１，１５０ｎｍの範囲である。
別の態様においては、以下を含む、親和性アッセイのための改良された支持体が提供される：ポリスチレン、ポリ（ジビニルベンゼン）、スチレン−アクリレートコポリマー、スチレン−ブタンジエンコポリマー、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、ポリ（スチレン−オキシエチレン）、ポリメチルメタクリレート、ポリウレタン、ポリグルタルアルデヒド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、Ｎ．Ｎ’−メチレンビス−アクリルアミド、ポリオレフィン類、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリスルホン、ポリ（エーテルスルホン）、熱分解された物質、ブロックコポリマー、および上記のもののコポリマー、シリコーン、またはシリカからなる群より選択される１つ以上の物質を含む支持体；支持体に共有結合したタンパク質（ここでは、タンパク質にはビオチンが含まれ、ここではタンパク質１モルあたり５モル未満のビオチンが結合させられる）；ビオチンと結合したビオチン結合部分（ここでは、ビオチン結合部分は少なくとも２価である）；ビオチン結合部分と結合したビオチン化された捕捉部分（ここでは、ビオチン化された捕捉部分は、抗体、抗体の結合断片、受容体、受容体のリガンド、ホルモン、ホルモンの受容体、酵素、酵素の基質、１本鎖のオリゴヌクレオチド、２本鎖のオリゴヌクレオチド、１本鎖のポリヌクレオチド、２本鎖のポリヌクレオチド、抗原、ペプチド、またはタンパク質のうちの少なくとも１つからなる群より選択される）；支持体と接触するブロックコポリマー（ここでは、ブロックコポリマーには、ポリエチレンオキサイドテールが隣接しているポリプロピレンオキサイド頭部基が含まれ、ポリプロピレンオキサイド頭部基は支持体と接触しており、ポリエチレンオキサイドテールは、それぞれ別々に、ポリプロピレンオキサイド頭部基の長さの約２倍から約２．５倍の長さであり、そしてブロックコポリマーの平均分子量は約９，８４０Ｄａから約１７，４００Ｄａである）。改良された支持体にはマイクロ粒子が含まれ得る。特異的な実施形態においては、マイクロ粒子には、常磁性または超常磁性の物質（例えば、Ｆｅ２Ｏ３）が含まれ、そしてマイクロ粒子の平均直径は、９５０ｎｍから１，１５０ｎｍの範囲である。特異的な実施形態においては、ビオチン化された捕捉部分に、免疫グロブリンまたはその断片が含まれる。
別の態様においては、支持体をコーティングするための方法が提供される。この方法には以下の工程が含まれる：リガンドと支持体連結器を、リガンド：：支持体連結器複合体に少なくとも実質的には遊離のリガンドが含まれないリガンド：：支持体連結器複合体の混合物が得られるように選択されたリガンド対支持体連結器の入力比で、混合する工程；そして、支持体に対してリガンド：：支持体連結器複合体を共有結合させる工程。特異的な実施形態においては、リガンド対支持体連結器の入力比は、８モルのリガンド：１モルの支持体連結器未満であるか、またはそれに等しい。あるいは、リガンド対支持体連結器の入力比は、４モルのリガンド：１モルの支持体連結器未満であるか、またはそれに等しい。
特異的な実施形態においては、この方法のリガンドにはビオチンが含まれ、この場合、リガンドには、アミン反応性ビオチン標識試薬（例えば、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン）が含まれる。
様々な実施形態においては、支持体連結器にはタンパク質が含まれ、リガンドにはビオチンが含まれ、そして、タンパク質は、低入力比のビオチンでビオチン化され、その結果、支持体連結器は、支持体連結器１モルあたり５モル未満のビオチンの取り込みの割合を有する。特異的な実施形態においては、タンパク質は、ＢＳＡ、オボアルブミン、ＢＳＡの断片、オボアルブミンの断片、またはそれらの混合物である。
別の態様においては、マイクロ粒子をコーティングするための方法が提供される。この方法には、以下の工程が含まれる：マイクロ粒子を分散剤と接触させて分散液を形成させる工程（ここでは、マイクロ粒子には、リガンド：支持体連結器複合体を生じるように結合させられるリガンドと支持体連結器が含まれている結合表面が含まれ、そして分散剤には、親水性のテール基が隣接している疎水性の頭部基を有しているブロックコポリマーが含まれる）；そして、分散液を、リガンド：：支持体連結器複合体のリガンドと結合するリガンド結合基と接触させる工程。
コーティングのための方法の特異的な実施形態においては、リガンドにはビオチンが含まれ、そして、アミン反応性ビオチン標識試薬（例えば、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン）を有している支持体または支持体連結器と結合させられる。様々な実施形態においては、支持体連結器には、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を有している支持体について上記に記載されたように、タンパク質が含まれる。特異的な実施形態においては、タンパク質には、ＢＳＡ、オボアルブミン、ＢＳＡの断片、オボアルブミンの断片、またはそれらの混合物が含まれる。
コーティングのための方法の様々な実施形態においては、リガンド結合基にはビオチン結合部分が含まれる。特異的な実施形態においては、ビオチン結合部分は少なくとも２価であり、これには、アビジン、ＳＡ、ニュートラアビジン、ＳＡの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはそれらの混合物のうちの数なくとも１つが含まれる。
様々な実施形態においては、コーティングのための方法にはさらに、ビオチン化された捕捉部分をビオチン結合部分と結合させる工程が含まれる。コーティングのための方法の特異的な実施形態においては、ビオチン化された捕捉部分には、抗体、抗体の結合断片、受容体、受容体のリガンド、ホルモン、ホルモンの受容体、酵素、酵素の基質、１本鎖のオリゴヌクレオチド、２本鎖のオリゴヌクレオチド、１本鎖のポリヌクレオチド、２本鎖のポリヌクレオチド、抗原、ペプチド、またはタンパク質のうちの少なくとも１つが含まれる。特異的な実施形態においては、ビオチン化された捕捉部分にはスペーサーが含まれる。
別の態様においては、以下の工程を含む、支持体上に不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を作製するための方法が提供される：分析物に結合する部分の空間充填部分との混合物を調製して、希釈された混合物を形成させる工程；および分析物に結合する部分と空間充填部分を支持体に結合させて、支持体表面と結合した分析物に結合する部分の数に関して不飽和である、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を形成させるために十分な条件下で、アッセイ支持体に対して混合物を接触させる工程。本明細書中で使用される場合は、分析物に結合する部分は、任意の分子（例えば、タンパク質、抗体、または核酸）であり得、これらは、支持体表面と結合すると、目的の分析物と直接、または結合分子を介して間接的にのいずれかで結合するであろう。すなわち、これは、結合表面の一部を形成するであろう。本明細書中で使用される場合は、空間充填部分は任意の分子（例えば、タンパク質、抗体、または核酸）であり、これらは、支持体表面と結合するであろうが、目的の分析物とは、直接、または結合分子を介して間接的にのいずれによっても結合はしないであろう。空間充填部分は、結合表面の一部を形成するものではないが、支持体表面上の空間を占有するように機能し、そして過剰な分析物に結合する部分に対する結合を妨害するであろう。
別の態様においては、以下の工程を含む、支持体上に不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を作製するための方法が提供される：リガンドを含まない支持体連結器でリガンド：：支持体連結器複合体の混合物を稀釈して、稀釈された混合物を形成させる工程；および、リガンド：：支持体連結器複合体を支持体と結合させて、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を形成させるために十分な条件下で、支持体に対して稀釈された混合物を接触させる工程。
支持体にマイクロ粒子が含まれる、支持体上に不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を作製するための方法の様々な実施形態においては、不飽和である結合表面は、マイクロ粒子１ミリグラム（ｍｇ）あたり約０．５×１０−４から約１．０×１０−４マイクロモルのリガンド、マイクロ粒子１ｍｇあたり約１．０×１０−４から約５．５×１０−４マイクロモルのリガンド、またはマイクロ粒子１ｍｇあたり約２×１０−４から約４×１０−４マイクロモルのリガンドを有する。支持体にマイクロ粒子が含まれる、支持体上に不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を作製するための方法の特異的な実施形態においては、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面は、マイクロ粒子１ｍｇあたり約１．０×１０−４から約５．５×１０−４マイクロモルのリガンド、またはマイクロ粒子１ｍｇあたり約１．６×１０−４から約４．９×１０−４マイクロモルのリガンドを有する。
支持体上に不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を作製するための方法の特異的な実施形態においては、支持体は粗く（ｒｏｕｇｈ）、そして不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面は、１平方メートルあたり約１．０×１０−２から約２．０×１０−１マイクロモルのリガンドを有する。あるいは、結合表面は、１平方メートルあたり約１．９×１０−２から約６．６×１０−２マイクロモルのリガンドを有する。支持体上に不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を作製するための方法の他の特異的な実施形態においては、支持体は滑らかであり、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面は、１平方メートルあたり約３．３×１０−２から約１．６×１０−１マイクロモルのリガンドを有する。支持体上に不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を作製するための方法の他の特異的な実施形態においては、粗い不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面は、１平方メートルあたり約１．９×１０−２から約６．６×１０−２マイクロモルの支持体連結器を有し、そして滑らかな不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面は、１平方メートルあたり約２．７×１０−２から約７．１×１０−２マイクロモルの支持体連結器を有する。用語「粗い」には、カリフラワー状の、または多孔質の形態が含まれる。用語「滑らか」は、実質的に滑らかであり、そして実質的に球形の形態をいう。同じ直径を有しているマイクロ粒子について、「粗い」支持体表面は、粗い支持体表面の溝、窪み、または孔によってもたらされる大きな支持体表面積が原因で、「滑らかな」支持体表面よりも大きな支持体の表面積を有するであろう。支持体連結器、リガンド、リガンド結合基、捕捉部分などの実際のマイクロモル数は、必ずしも全ての粗い支持体の表面積が、リガンド、または支持体連結器、連結のために立体的に利用できるわけではないので、計算される粗い表面積と滑らかな表面積との間のどこかになるであろう。
支持体上に不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を作製するための方法の様々な実施形態においては、支持体連結器には、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を有している支持体について上記に記載されるように、タンパク質が含まれる。特異的な実施形態においては、タンパク質には、ＢＳＡ、オボアルブミン、ＢＳＡの断片、オボアルブミンの断片、またはそれらの混合物が含まれる。
別の態様においては、以下の工程を含む、支持体上に不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を作製するための方法が提供される：リガンド対支持体連結器の任意の入力比で、リガンド：：支持体連結器複合体の混合物を調製する工程；リガンドに対して複合体形成していない支持体連結器で、リガンド：：支持体連結器複合体の混合物を稀釈して、希釈された混合物を形成させる工程；および、リガンド：：支持体連結器複合体と支持体連結器を支持体と結合させて、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を形成させるために十分な条件下で、支持体に対して希釈された混合物を接触させる工程。リガンドを含む支持体は、その後、本明細書中に記載される任意の適切な方法にしたがって処理することができる。
支持体連結器には、１つ以上のタンパク質または非タンパク質ポリマーが含まれ得る。様々な実施形態においては、リガンドは、支持体連結器上の官能基を介して支持体連結器に対して複合体形成させられる。１つ以上の支持体連結器上にある官能基の一部は、リガンドに対する支持体連結器の接触の前に、支持体連結器と複合体を形成することができるリガンドの数を減少させるこの様式で、除去することができるか、また中和することができる。リガンド：：支持体連結器複合体の混合物を調製することにおいて、リガンドに対して接触させられる支持体連結器の全て、またはわずかに一部は、１つ以上の中和された官能基を有し得る。
別の態様においては、本発明により、免疫測定法のための結合表面が提供される。この場合、結合表面には、目的の捕捉部分に結合できるリガンド結合基に結合することができる複数のリガンドが含まれる。結合表面のリガンドは、支持体上で不飽和であるか、または不飽和であり配向性を持ち、リガンドは、（ａ）支持体に対して直接結合させられるか、または（ｂ）支持体連結器を介して結合させられ、そして支持体連結器が支持体に結合させられるかのいずれかである。様々な実施形態においては、結合表面には、遊離の（すなわち、結合していない）リガンドは実質的には含まれない。特異的な実施形態においては、支持体にはマイクロ粒子が、約１ミクロンから約５ミクロンの直径で含まれ、リガンドにはビオチンが含まれ、そしてビオチンはタンパク質を含む支持体連結器に対して複合体形成させられる。特異的な実施形態においては、リガンドにはビオチンが含まれ、リガンド結合基にはビオチン結合タンパク質が含まれ、支持体連結器には、ＢＳＡ、オボアルブミン、ＢＳＡの断片、オボアルブミンの断片、またはそれらの混合物が含まれ、そして、ＢＳＡ、オボアルブミン、ＢＳＡの断片、オボアルブミンの断片、またはそれらの混合物は、低入力比のビオチン化によってビオチン化される。特異的な実施形態においては、ビオチン結合タンパク質はＳＡであり、そしてビオチン化された抗体はＳＡでコーティングされた結合表面上に存在する。この場合、ビオチン化された抗体は、免疫測定法（例えば、競合免疫測定法またはサンドイッチアッセイ）において目的の分析物を捕捉するように選択される。免疫測定法の支持体上の結合表面は、本明細書中に記載される任意の適切な方法を使用して作製することができる。
別の態様においては、以下を含む、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を有している支持体が提供される：支持体上に配置された複数の支持体連結器；および支持体連結器と結合したリガンド；この場合、支持体連結器は、支持体１平方メートルあたり約１．６×１０−２から約７．１×１０−２マイクロモルの密度で支持体上に存在する。様々な実施形態においては、支持体連結器にはタンパク質が含まれる。特異的な実施形態においては、タンパク質は、ＢＳＡ、オボアルブミン、ＢＳＡの断片、オボアルブミンの断片、またはそれらの混合物である。様々な実施形態においては、リガンドにはビオチンが含まれる。特異的な実施形態においては、ビオチンは、支持体１平方メートルあたり約１．９×１０−２から約１．６×１０−１マイクロモルのビオチンの密度で存在する。様々な実施形態においては、結合表面には、リガンドと特異的に結合することができるリガンド結合基が含まれる。様々な実施形態においては、リガンド結合基は、支持体１平方メートルあたり約１．２×１０−２から約４．６×１０−２マイクロモルのリガンド結合基の密度で存在する。様々な実施形態においては、リガンド結合基は、アビジン、ＳＡ、ニュートラアビジン、ＳＡの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはそれらの混合物である。様々な実施形態においては、結合表面にはさらに、リガンド結合基と特異的に結合することができる捕捉部分が含まれる。様々な実施形態においては、捕捉部分は、支持体１平方メートルあたり約２．５×１０−３から約１．４×１０−２マイクロモルの捕捉部分の密度で存在する。特異的な実施形態においては、捕捉部分には、免疫グロブリンまたはその断片が含まれる。
別の態様においては、以下を含む、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を有している支持体が提供される：支持体上に配置された複数の支持体連結器；および、支持体連結器と結合したリガンド；この場合、支持体連結器は、支持体１ｍｇあたり約１．３×１０−４から約２．１×１０−４マイクロモルの支持体連結器の密度で、支持体上に存在する。様々な実施形態においては、リガンドにはビオチンが含まれる。特異的な実施形態においては、ビオチンは、支持体１ｍｇあたり約１．６×１０−４から約４．９×１０−４マイクロモルのビオチンの密度で存在する。様々な実施形態においては、結合表面には、リガンドと特異的に結合することができるリガンド結合基が含まれる。様々な実施形態においては、リガンド結合基は、支持体１ｍｇあたり約１．０×１０−４から約１．４×１０−４マイクロモルのリガンド結合基の密度で存在する。様々な実施形態においては、リガンド結合基は、アビジン、ＳＡ、ニュートラアビジン、ＳＡの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはそれらの混合物である。様々な実施形態においては、結合表面にはさらに、リガンド結合基と特異的に結合することができる捕捉部分が含まれる。様々な実施形態においては、捕捉部分は、支持体１ｍｇあたり約２．１×１０−５から約４．１×１０−５マイクロモルの捕捉部分の密度で存在する。特異的な実施形態においては、捕捉部分には、ビオチン化された免疫グロブリンまたはその断片が含まれる。
別の態様においては、結合表面が支持体１ｍｇあたり約４．０×１０−４マイクロモルを超えないのビオチンに特異的に結合する、支持体上の結合表面が提供される。特異的な実施形態においては、支持体にはマイクロ粒子が含まれ、そして支持体は、マイクロ粒子１ｍｇあたり約２．５×１０−５から、約４．０×１０−４マイクロモルを超えないビオチンに特異的に結合する。特異的な実施形態においては、支持体にはマイクロ粒子が含まれ、支持体は、マイクロ粒子１ｍｇあたり約７．５×１０−５から約３．５×１０−４マイクロモルのビオチンに特異的に結合する。別の特異的な実施形態においては、支持体にはマイクロ粒子が含まれ、支持体は、マイクロ粒子１ｍｇあたり約１．０×１０−４から約３．０×１０−４マイクロモルのビオチンに特異的に結合する。様々な実施形態においては、支持体には、ビオチン結合部分（例えば、ＳＡ）と（直接、または支持体連結器を介して）結合させられた支持体に結合させられたビオチンが含まれ、上記ビオチンの結合能力は、遊離のビオチンに結合するビオチン結合部分（例えば、ＳＡ）の能力をいう。
別の態様においては、支持体上の結合表面が提供され、この場合、結合表面は、支持体１平方メートルあたり約１．３×１０−１マイクロモルを超えないビオチンに特異的に結合する。特異的な実施形態においては、支持体は、支持体１平方メートルあたり約３．０×１０−３から、約１．３×１０−１マイクロモルを超えないビオチンに特異的に結合する。特異的な実施形態においては、支持体は、支持体１平方メートルあたり約８．９×１０−３から約１．２×１０−１マイクロモルのビオチンに特異的に結合する。特異的な実施形態においては、支持体は、支持体１平方メートルあたり約１．２×１０−２から約９．９×１０−２マイクロモルのビオチンに特異的に結合する。様々な実施形態においては、支持体には、ビオチン結合部分（例えば、ＳＡ）と（直接、または支持体連結器を介して）結合させられた支持体に結合させられたビオチンが含まれ、上記ビオチンの結合能力は、遊離のビオチンに結合するビオチン結合部分（例えば、ＳＡ）の能力をいう。
他の場所に明記されないか、または開示から暗示されない限りは、本明細書中に記載される任意の特定の方法または組成物に関連して記載される任意の実施形態は、本明細書中に記載される任意の他の実施形態に関連して使用することができる。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
ａ）アッセイ支持体；および
ｂ）少なくとも１つの支持体連結器
を含む、親和性アッセイのための不飽和である結合表面であって、飽和量未満のこの支持体連結器がこのアッセイ支持体に連結させられる、不飽和である結合表面。
（項目２）
上記支持体連結器と結合した少なくとも１つのリガンドがさらに含まれている、項目１に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目３）
上記不飽和であるアッセイ結合表面が、上記アッセイ支持体１ミリグラムあたり約０．５×１０ −４ から約１．０×１０ −４ マイクロモルのリガンド、またはこのアッセイ支持体１平方メートルあたり約０．５×１０ −２ から約２．０×１０ −１ マイクロモルのリガンドを有している、項目２に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目４）
上記アッセイ結合表面が、上記アッセイ支持体１ミリグラムあたり約１．０×１０ −４ から約５．５×１０ −４ マイクロモルのリガンド、またはこのアッセイ支持体１平方メートルあたり約１．０×１０ −２ から約２．０×１０ −１ マイクロモルのリガンドを有している、項目１に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目５）
上記リガンドと結合した少なくとも１つのリガンド結合基がさらに含まれている、項目２に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目６）
上記リガンド結合基が少なくとも２価であり、この２価のリガンド結合基に、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジンの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはそれらの組み合わせが含まれている、項目５に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目７）
上記リガンド結合基と結合した捕捉部分がさらに含まれている、項目５に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目８）
上記捕捉部分が、上記アッセイ支持体１平方メートルあたり約１．０×１０ −４ マイクロモルから１平方メートルあたり約２．０×１０ −２ マイクロモルまでの密度でこのアッセイ支持体上に存在する、項目７に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目９）
上記捕捉部分が上記アッセイ支持体に対して空間的配向性を持つ、項目７に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目１０）
上記捕捉部分が、上記アッセイ支持体に対して空間的配向性を持ち、そして物理的配向性を持つ、項目７に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目１１）
ブロックコポリマーがさらに含まれており、このブロックコポリマーには、少なくとも２つの親水性テール基が隣接している疎水性頭部基が含まれており、この疎水性の頭部基がアッセイ支持体と接触する、項目１に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目１２）
上記支持体連結器にタンパク質または融合タンパク質が含まれている、項目１に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目１３）
上記支持体連結器が上記アッセイ支持体と共有結合している、項目１に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目１４）
上記リガンドが上記支持体連結器と共有結合している、項目２に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目１５）
上記支持体連結器がウシ血清アルブミン、ウシ血清アルブミンの断片、オボアルブミン、オボアルブミンの断片、またはそれらの混合物である、項目１に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目１６）
上記リガンドにビオチンが含まれている、項目２に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目１７）
上記支持体連結器が、５：１未満または５：１に等しい、ビオチン対支持体連結器のモル取り込み比が得られるようにビオチン化されている、項目１６に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目１８）
上記支持体連結器が、３：１未満または３：１に等しい、ビオチン対支持体連結器のモル取り込み比が得られるようにビオチン化されている、項目１７に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目１９）
上記ビオチンと結合したリガンド結合基がさらに含まれている、項目１６に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目２０）
上記リガンド結合基が少なくとも２価であり、この少なくとも２価のリガンド結合基に、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジンの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはそれらの組み合わせが含まれている、項目１９に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目２１）
上記リガンド結合基と結合した捕捉部分がさらに含まれている、項目１９に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目２２）
上記捕捉部分がビオチン化されている、項目２１に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目２３）
上記ビオチン化されている捕捉部分が、抗体、抗体の結合断片、受容体、受容体のリガンド、ホルモン、ホルモンの受容体、酵素、酵素の基質、１本鎖のオリゴヌクレオチド、２本鎖のオリゴヌクレオチド、１本鎖のポリヌクレオチド、２本鎖のポリヌクレオチド、抗原、ペプチド、およびタンパク質のうちの少なくとも１つからなる群より選択される、項目２２に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目２４）
上記ビオチン化された捕捉部分にスペーサーが含まれている、項目２２に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目２５）
上記アッセイ支持体に、マイクロ粒子、ビーズ、マイクロタイタープレート、コーティングされたチューブ、マイラーが裏打ちされたニトロセルロース支持体、ナイロン支持体、微小管、ナノ粒子、ナノチューブ、または常磁性もしくは超常磁性物質が含まれる、項目１に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目２６）
上記リガンド結合基と結合した少なくとも１つの第２の捕捉部分がさらに含まれている、項目７に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目２７）
上記リガンド結合基が、上記アッセイ支持体１平方メートルあたり約１．０×１０ −２ から約５．０×１０ −２ マイクロモルの密度でこのアッセイ支持体上に存在する、項目５に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目２８）
上記リガンド結合基が、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジンの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはそれらの組み合わせである、項目２７に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目２９）
上記少なくとも１つの支持体連結器が、上記アッセイ支持体１平方メートルあたり約１．２×１０ −２ マイクロモルから１平方メートルあたり約７．５×１０ −２ マイクロモルの密度でこのアッセイ支持体上に存在する、項目１に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目３０）
上記支持体連結器と結合したリガンドがさらに含まれており、このリガンドがビオチンまたはその誘導体であり、このビオチンまたはその誘導体が、上記アッセイ支持体１平方メートルあたり約１．６×１０ −２ から約２．０×１０ −１ マイクロモルの密度で存在する、項目１に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目３１）
上記アッセイ結合表面に複数のマイクロ粒子が含まれ、この複数のマイクロ粒子は、マイクロ粒子１ミリグラムあたり少なくとも約２５ピコモルのビオチンまたはその誘導体の容量を有しているが、マイクロ粒子１ミリグラムあたり約４２５ピコモルを超えないビオチンまたはその誘導体の容量を有している、項目１に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目３２）
ａ）支持体；
ｂ）この支持体と共有結合したタンパク質または融合タンパク質であって、ここでは、このタンパク質または融合タンパク質はビオチン化されており、ここでは、タンパク質または融合タンパク質１モルあたり５モル未満のビオチンが結合している、タンパク質または融合タンパク質；
ｃ）このビオチンと結合したビオチン結合部分であって、このビオチン結合部分は少なくとも２価である、ビオチン結合部分；
ｄ）このビオチン結合部分と結合したビオチン化された捕捉部分；および
ｅ）この支持体と接触するブロックコポリマーであって、このブロックコポリマーには、少なくとも２つのポリエチレンオキサイドテール基が隣接しているポリプロピレンオキサイド頭部基が含まれており、このポリプロピレンオキサイド頭部基はこの支持体と接触する、ブロックコポリマー
が含まれている、親和性アッセイのための不飽和であり配向性を持つ結合表面。
（項目３３）
不飽和であるアッセイ結合表面を調製するための方法であって、この方法は、
ａ）支持体連結器とリガンドを、リガンド：：支持体連結器複合体の混合物が得られるように選択された支持体連結器に対するリガンドの割合で合わせる工程；および
ｂ）リガンド：：支持体連結器複合体の不飽和である密度が生じるように、リガンド：：支持体連結器複合体をアッセイ支持体に共有結合させる工程
を包含する、方法。
（項目３４）
上記リガンド：：支持体連結器複合体を上記アッセイ支持体と共有結合させた後に、このアッセイ支持体に、アッセイ支持体１平方メートルあたり約１．０×１０ −２ マイクロモルのリガンドからアッセイ支持体１平方メートル当たり約２．０×１０ −１ マイクロモルのリガンドが含まれる、項目３３に記載の不飽和であるアッセイ結合表面を調製する方法。
（項目３５）
上記リガンドが上記支持体連結器と共有結合させられる、項目３３に記載の不飽和であるアッセイ結合表面を調製する方法。
（項目３６）
上記支持体連結器が、ウシ血清アルブミン、ウシ血清アルブミンの断片、オボアルブミン、オボアルブミンの断片、またはそれらの混合物であり、そして上記リガンドがビオチンであり、そしてこのウシ血清アルブミン、ウシ血清アルブミンの断片、オボアルブミン、オボアルブミンの断片、またはそれらの混合物が、５：１未満または５：１に等しいビオチン：：支持体連結器のモル取り込み比が得られるようにビオチン化される、項目３３に記載の不飽和であるアッセイ結合表面を調製する方法。
（項目３７）
不飽和であり配向性を持つアッセイ結合表面を調製する工程がさらに含まれ、このアッセイ結合表面を複数のブロックコポリマー分子と接触させる工程が含まれ、このブロックコポリマー分子には、少なくとも２つの親水性テール基が隣接している疎水性頭部基が含まれる、項目３３に記載の不飽和であるアッセイ結合表面を調製する方法。
（項目３８）
上記リガンド結合基が、リガンド：：支持体連結器複合体となるような物理的配向性を持つ、項目３４に記載の不飽和であり、配向性を持つアッセイ結合表面を調製する方法。
（項目３９）
ａ）アッセイ支持体、
ｂ）少なくとも１つの支持体連結器；および
ｃ）このアッセイ支持体と接触する複数のブロックコポリマー分子であって、このブロックコポリマー分子には、少なくとも２つの親水性テール基が隣接している疎水性頭部基が含まれている、複数のブロックコポリマー分子
が含まれている、ブロックされたアッセイ結合表面。
（項目４０）
上記２つ以上の親水性テールの長さが、それぞれ独立して、上記疎水性頭部基の長さの約２倍から約２．５倍であり得る、項目３９に記載のブロックされたアッセイ結合表面。
（項目４１）
上記ブロックコポリマーに、式Ｉ：
ＨＯ（Ｃ ２ Ｈ ４ Ｏ） ｘ （Ｃ ３ Ｈ ６ Ｏ） ｙ （Ｃ ２ Ｈ ４ Ｏ） ｚ Ｈ （Ｉ）、
の構造が含まれ、式中、ｘは約１００から約１３５であり、ｙは約４０から約７５であり、そしてｚは約１００から約１３５である、項目３９に記載のブロックされたアッセイ結合表面。
（項目４２）
上記ブロックコポリマーが約９，０００ダルトンから約１８，０００ダルトンの平均分子量を有している、項目３９に記載のブロックされたアッセイ結合表面。
（項目４３）
分散したマイクロ粒子の集団であって、このマイクロ粒子が分散剤と接触させられ、この分散剤には、少なくとも２つの親水性テール基が隣接している疎水性の頭部基を有しているブロックコポリマーが含まれている、分散したマイクロ粒子の集団。
（項目４４）
上記マイクロ粒子に、
ａ）少なくとも１つの支持体連結器；および
ｂ）このマイクロ粒子と接触する複数のブロックコポリマー分子であって、このブロックコポリマー分子には、少なくとも２つの親水性テール基が隣接している疎水性頭部基が含まれている複数のブロックコポリマー
が含まれている、項目４３に記載の分散したマイクロ粒子の集団。
（項目４５）
上記支持体連結器と結合したリガンドがさらに含まれている、項目４４に記載の分散したマイクロ粒子の集団。
（項目４６）
上記集団が実質的に単分散している、項目４４に記載の分散したマイクロ粒子の集団。
（項目４７）
コーティングされ、かつ分散したマイクロ粒子の集団を調製する方法であって：
ａ）マイクロ粒子を分散剤と接触させて、分散したマイクロ粒子の集団を形成させる工程であって：ここでは：
ｉ）このマイクロ粒子には、リガンド：：支持体連結器複合体が得られるように結合させられた支持体連結器とリガンドが含まれ；
ｉｉ）この分散剤には、少なくとも２つの親水性テール基が隣接している疎水性の頭部基を有しているブロックコポリマーが含まれている、
工程；ならびに
ｂ）この分散したマイクロ粒子をリガンド結合基で、この分散したマイクロ粒子の集団をこのリガンド：：支持体連結器複合体のこのリガンドと結合するリガンド結合基に曝露させることによってコーティングする工程
が含まれる、方法。
（項目４８）
以下の工程を含む、不飽和であるアッセイ結合表面を調製する方法：
ａ）分析物に結合する部分と空間充填部分の混合物を調製する工程であって、この分析物に結合する部分は、目的の分析物と直接または間接的のいずれかで結合し、この空間充填部分は、目的の分析物とは直接または間接的のいずれでも結合しない、工程；および
ｂ）この分析物に結合する部分とこの空間充填部分がこのアッセイ支持体と結合して、このアッセイ支持体と結合した分析物に結合する部分の量と比較して飽和していない、不飽和であるアッセイ結合表面を形成するように、この混合物をこのアッセイ支持体に曝露させる工程。
（項目４９）
上記分析物に結合する部分にリガンド：：支持対連結器複合体が含まれ、上記空間充填部分に、リガンドを含まない支持体連結器が含まれている、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記不飽和であるアッセイ結合表面にブロックコポリマーがさらに含まれており、このブロックコポリマーには、少なくとも２つの親水性テール基が隣接している疎水性の頭部基が含まれている、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
以下の工程を含む、ブロックされたアッセイ結合表面を作製する方法：
アッセイ支持体を支持体連結器と結合させて結合表面を得る工程、
この結合表面をブロックコポリマーと接触させる工程であって、このブロックコポリマーには、少なくとも２つの親水性テール基が隣接している疎水性の頭部基が含まれている工程。
（項目５２）
不飽和であるアッセイ結合表面を使用する親和性アッセイであって、この親和性アッセイは：
不飽和であるアッセイ結合表面を分析物と接触させる工程であって、この不飽和であるアッセイ結合表面には、支持体連結器、リガンド、リガンド結合基、および分析物特異的捕捉部分が含まれる、工程、ならびに、
この分析物のこの不飽和であるアッセイ結合表面との結合を検出する工程、
を包含する、親和性アッセイ。
（項目５３）
上記分析物特異的捕捉部分がビオチン化される、項目５２に記載の親和性アッセイ。
（項目５４）
上記親和性アッセイが免疫測定法である、項目５２に記載の親和性アッセイ。
（項目５５）
ａ）アッセイ支持体；および
ｂ）少なくとも１つのリガンドであって、飽和量未満のこのリガンドがこのアッセイ支持体と結合している、リガンド
が含まれている、不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目５６）
上記リガンドと結合した少なくとも１つのリガンド結合基がさらに含まれており、このリガンド結合基が少なくとも２価である、項目５５に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目５７）
上記リガンド結合基が、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジンの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはそれらの組み合わせである、項目５６に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目５８）
上記リガンド結合基と結合した捕捉部分がさらに含まれている、項目５７に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
（項目５９）
上記リガンドがビオチンまたはその誘導体である、項目５５に記載の不飽和であるアッセイ結合表面。
図１Ａは、常磁性マイクロ粒子（ＰＭＰ）結合表面上に不飽和であり方向性を持つＳＡを調製するプロセスを説明する。 図１Ｂは、図１Ａのプロセスの説明の続きである。 図２は、固体支持体表面；支持体表面に共有結合したＢＳＡまたはオボアルブミン；ＢＳＡまたはオボアルブミンに共有結合したビオチン；ビオチンと結合したストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはアビジン；および、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはアビジンと結合したビオチン化抗体が含まれている本発明の１つの実施形態を説明する。 図３は、低入力比のビオチン化方法における、ＢＳＡ分子上のいくつかの可能なビオチン分子の配向性を説明する。 図４は、不飽和である結合表面を作製するための、低入力比のビオチン化ＢＳＡでの固相のコーティングを説明する。 図５は、固相支持体表面用のブロッキング剤としてのブロックコポリマーの使用を説明する。 図６は、ビオチンを含む結合表面用の分散剤としてのブロックコポリマーの使用を説明する。 図７は、ＳＡでの、ブロックコポリマーでブロックされたビオチン化された結合表面のコーティングを説明する。 図８は、本発明にしたがって作製された固相支持体表面上のＳＡでコーティングされた結合表面に対する様々なビオチン化された捕捉部分の適用を説明する。 図９Ａは、ビオチン化された抗体またはＦａｂ断片でコーティングされた、従来のまたは標準的なＳＡでコーティングされたマイクロ粒子結合表面を説明する。 図９Ｂは、ビオチン化された抗体またはＦａｂ断片でコーティングされた、不飽和であり配向性を持つ、ＳＡでコーティングされたマイクロ粒子を説明する。 図１０は、パネルＡおよびＢにおいて、本発明の分散工程の使用と関連する、結合可能な表面積の増大を説明する。 図１１は、４℃または３７℃で３日間の後の、ＳＡでコーティングされたビオチン−ＢＳＡ固体支持体からのビオチンの脱落の分析を説明する。 図１２は、実施例６のプロセスの再現性（製造可能性）実験について表形式でデータを示す。 図１３は、実施例６のさらなるプロセスの再現性（製造可能性）実験について表形式でデータを示す。 図１４Ａは、実施例７の安定性の増大の実験について表形式でデータを示す。 図１４Ｂは、図１４Ａの表の続きであり、実施例７の安定性の増大の実験についてのデータを示している。 図１５Ａは、脱落の分析の結果を示す。 図１５Ｂは、脱落の分析の結果のさらなる説明である。 図１６Ａは、本発明の実施形態にしたがって調製したマイクロ粒子の様々なロットについての実施例１１の実際の結合表面密度の計算について、表形式でデータを示す。 図１６Ｂは、粗さの仮定を使用したマイクロ粒子のデータから導いた、本発明の実施形態にしたがって調製したマイクロ粒子についての実際の結合表面密度の計算について、表形式でデータを示す。 図１６Ｃはさらに、本発明の実施形態にしたがって調製したマイクロ粒子の様々なロットについての、滑らかな支持体表面を仮定する結合表面積の計算について、表形式でデータを示す。 図１６Ｄは、マイクロ粒子のデータから導いた、本発明の実施形態にしたがって調製した、滑らかな支持体表面を仮定している結合表面密度の計算について、表形式でデータを示す。 図１７は、本発明の不飽和である結合表面と、本発明の不飽和であり配向性を持つ結合表面との間での相違の模式的な説明である。
詳細な説明
本発明は、結合表面の設計の実現化に少なくとも一部基づく：（ａ）飽和量未満のリガンドを結合させることによって、接近することができる空間的配向性で支持体の結合表面全体にまばらに分散させられた、捕捉部分が含まれている複合体が得られ、そして状況に応じて、（ｂ）タンデムにリガンドを配置し、その後、捕捉部分を含む複合体の他の構成成分の部分を、直線的またはほぼ直線的な構造（物理的）の配向性で配置することにより、リガンドの密度を大きくすることにより支持体表面を単純に密集させることによる結合表面の設計よりも、アッセイ（例えば、親和性アッセイ（例えば、免疫測定法または核酸アッセイ））を行うためのより望ましい量を有している結合表面を生じさせることができる。
結合表面を作製するための従来のアプローチは、通常は、リガンドの接近性および／または配向性には関係なく、支持体の単位面積あたりのリガンドの量を最大にすることを目的としており、多くの場合には、これにより支持体上にリガンドの密集が生じる。結合表面上の単位面積あたりのリガンドを最大にすることによっては、立体的な作用が少なくとも一部原因で、結合表面の性能の低下が生じる可能性がある。性能の低下はまた、結合表面からの過剰なリガンドの脱落によっても生じる可能性がある。
本明細書中で使用される場合は、「〜と結合した」またはその文法上の等価物は、２つの部分の間での共有結合もしくは非共有結合、または共有的相互作用もしくは非共有的相互作用を意味する。用語「〜と結合した」は、結合の配向性または方向性を暗示するようには意図されない。
本明細書中で使用される場合は、用語「融合タンパク質」には、組み換え体タンパク質（例えば、キメラタンパク質）、ハイブリッドタンパク質、および合成によって誘導されたタンパク質が含まれる。その使用法は当該分野で周知である。
本発明の不飽和である結合表面、または不飽和であり配向性を持つ結合表面には、支持体上に飽和量未満のリガンドを結合させることによって（例えば、支持体に直接結合させることによって、または支持体に結合させられる支持体連結器に結合させることによって）構築される結合表面が含まれる。リガンドに関して「不飽和である」結合表面は、支持体の単位表面積あたり最大密度には満たないリガンド、または支持体の単位重量あたり最大密度には満たないリガンドを有している結合表面である。本発明の特異的な実施形態においては、不飽和結合表面のリガンドは空間的に配向性を持つ。本明細書中で使用される場合には、用語「空間的に配向性を持つ」またはその文法上の等価物は、長さ全体または面積全体にわたって散りばめられた部分をいう。言い換えると、これらの部分は、これらが最も近いものと実質的に接することのないように、支持体表面上で配向性を持たせられるかまたは間隔をあけて配置される。
支持体の単位表面積あたりのリガンドの「最大に満たない」密度は、支持体表面上に存在することができるリガンドの数と比較して飽和していない結合表面をいう。例えば、リガンドで飽和した支持体表面は、１００％によって表される、所定の条件の設定のもとで支持体表面上に配置することができるリガンドの最大の割合を有する（例えば、所定のリガンド：：支持体連結器複合体、ここでは、支持体連結器はリガンドで飽和しており、複合体は、支持体に対するリガンド：：支持体連結器複合体の最大の結合を促進する条件下で、支持体上にその最も可能な最大密度で配置される）。
不飽和である結合表面、または不飽和であり配向性を持つ結合表面は、免疫測定法に使用される結合表面に特に望ましいものであり得る。ほとんどの免疫測定法では、支持体上の結合表面が使用される。これらの用途の多くにおいては、支持体はマイクロ粒子またはマイクロタイタープレートであり、ここでは、分析物（例えば、抗原）を捕捉する部分は、分析物に結合する、捕捉部分を含む複合体を形成させるために、他の分子上に組み立てられる。この１つの限定ではない例は、マイクロ粒子上に固定された免疫グロブリンを有している免疫測定法である。免疫グロブリンは支持体上に直接固定される場合があり、また、免疫グロブリンは他の分子に（例えば、共有）結合させられ、次いで、他の分子が支持体に固定される場合もある。不飽和結合表面の調製は、両方の状況について本明細書中に記載される。免疫グロブリンまたはその断片は支持体に直接は結合させられないが、その代わりに、支持体に結合させられる他の部分と結合させられる状況についての詳細な例が提供される。
用語「結合」には、（ａ）共有結合（例えば、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、炭素−酸素結合などのうちの１つ以上による、直接または間接的のいずれか）、および（ｂ）非共有結合（直接または間接的のいずれか）
互いに特異的に相互作用することが公知の物質を共有結合させることができる。特異的に相互作用することが公知であり、そして共有結合させることができる物質の１つの限定ではない例は、抗原とその特異的抗体である。これらは、例えば、カップリング化学反応によって共有結合させることができる。
互いに特異的には相互作用しない物質を共有結合させることができる。互いに特異的に相互作用することが明らかではなく、そして共有結合させることができる物質の１つの限定ではない例は、ＳＡとＢＳＡであり、これらは、例えば、カップリング化学反応によって共有結合させることができる。
非共有結合の例としては、親和性相互作用、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用（例えば、双極性／双極性、またはＬｏｎｄｏｎ力）、水素結合相互作用（例えば、ポリヌクレオチド二本鎖の間）、および疎水性相互作用が挙げられる。結合が非共有結合である場合には、物質の間での結合は特異的であることが好ましい。特異的な非共有結合の限定ではない例としては、ビオチンと、ビオチン結合タンパク質（例えば、アビジン、ＳＡ、ニュートラアビジン、ＳＡの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはそれらの混合物）との間での結合相互作用；ビオチン化されたＦａｂ、ビオチン化された免疫グロブリン、またはその断片、ビオチン化された低分子（例えば、ホルモン、または受容体のリガンド）、ビオチン化されたポリヌクレオチド、ビオチン化されたマクロ分子（例えば、タンパク質、または天然のもしくは合成のポリマー）の、ビオチン結合タンパク質（例えば、アビジン、ＳＡ、ニュートラアビジン、ＳＡの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはそれらの混合物）に対する結合；基質のその酵素に対する結合；糖タンパク質の糖タンパク質に特異的なレクチンに対する結合；リガンドの、そのリガンドに特異的な受容体に対する結合；抗体の、その抗体が惹起させられる抗原に対する結合；ならびに、ポリヌクレオチドと、相補的なまたは実質的に相補的なポリヌクレオチドとの間での二本鎖の形成などが挙げられる。
マイクロ粒子に結合させられたビオチン化されたタンパク質（リガンド：：支持体連結器複合体）を有しているマイクロ粒子についての特定の例が提供される。ここでは、ビオチン化されたタンパク質はＳＡ（ビオチン結合部分）でコーティングされ、そしてＳＡ−ビオチン化タンパク質でコーティングされたマイクロ粒子は、その後、アッセイにおいて分析物を捕捉するために、あるいは、アッセイにおいて分析物を捕捉するために使用される別の免疫グロブリンまたはその断片に結合させるために使用されるビオチン化された免疫グロブリンまたはそのビオチン化された断片（ビオチン化された捕捉部分）でコーティングされる。（例えば、ビオチン化されたＧｏａｔ×Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧが、マウスＩｇＧ×抗原１（これは抗原１を捕捉するために使用される）を捕捉するために使用される。）支持体表面上のビオチン化されたタンパク質の不飽和の性質は、ＳＡコーティングにおいて反映され、これもまた、分析物を捕捉するビオチン化された免疫グロブリン（またはビオチン化された免疫グロブリンの断片）の不飽和性、または分析物を捕捉するさらに別の免疫グロブリンもしくは断片を捕捉する、ビオチン化された免疫グロブリン（またはビオチン化された免疫グロブリンの断片）の不飽和性を生じる、それと会合するビオチンの不飽和である性質によって不飽和である。
本発明の様々な実施形態においては、リガンドは、支持体連結器に共有結合させることができ、また、支持体連結器に非共有結合させることもできる。特異的な実施形態においては、リガンドは支持体連結器に共有結合させられ、そしてリガンド結合基は少なくとも２価である。さらなる特異的な実施形態においては、リガンドはビオチンであり、これは支持体連結器に対して共有結合させられ、そしてリガンド結合基は、ストレプトアビジン、アビジン、またはニュートラアビジン、ストレプトアビジンの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはそれらの混合物のような、少なくとも２価の部分である。リガンド結合基が少なくとも２価である複数の実施形態においては、支持体連結器に対するリガンドの共有結合によって、過剰なリガンドの脱落が減少するかまたは回避されるので、より安定な結合表面を得ることができる。
他の実施形態においては、支持体連結器に対するリガンドの共有結合は随意的である。例えば、リガンドが１つの結合部位を有している抗体断片である場合には、リガンドは、支持体連結器と共有結合させることができる。
したがって、本発明には、免疫測定法のための飽和量ではない量の捕捉部分を提供するための方法と組成物が含まれる。この場合、捕捉部分は、不飽和である支持体表面に対する結合によって不飽和である。様々な実施形態においては、捕捉部分は、さらなる捕捉部分を捕捉するために使用することができる。例えば、ＳＡ（リガンド結合基）（これは、ビオチン化されたＧｏａｔ×Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧでコーティングされる）でコーティングされたビオチン−ＢＳＡでコーティングされた支持体（リガンド：：支持体連結器複合体）はさらに、例えば、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ×ＴＳＨでコーティングすることができ、これはその後、ＴＳＨ分析物を捕捉するために使用することができる。
支持体表面上の構成成分の密度は様々な方法で表現することができる。特定の支持体（例えば、マイクロ粒子）については、マイクロ粒子の単位重量に関して結合表面の構成成分の密度（例えば、マイクロ粒子１ｍｇあたりの構成成分（例えば、リガンド（例えば、ビオチン）；リガンド結合基（例えば、ＳＡ）；捕捉部分（例えば、分析物特異的であるビオチン化ＩｇＧ；など）のマイクロモル数）を議論することが一般的である。粒子ではない支持体（例えば、マイクロタイタープレート）については、支持体上の表面積に関して構成成分の密度（例えば、１平方メートルあたりのリガンド結合基のマイクロモル数）を議論することが一般的である。支持体表面上の構成成分の密度は、支持体表面上に構築されたリガンド（例えば、ビオチンの結合に関する複数の実施例のビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子のビオチン）または任意の他の構成成分（例えば、マイクロ粒子と結合したＳＡに関する複数の実施例のビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子、またはＳＡと結合した分析物特異的ビオチン化免疫グロブリン）について表現することができる。
支持体と（直接、または例えばタンパク質を介して間接的に）結合させられるリガンドの飽和量に満たない量が原因で、リガンド結合基の連続する層（ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ ｌａｙｅｒｓ）は不飽和であり、支持体に結合させられたリガンドの層上のリガンド結合基の密度には、連続する小さい密度（例えば、マイクロ粒子１ｍｇあたり連続するより小さいマイクロモル数、または１平方メートルあたりの連続するより小さいマイクロモル数）が含まれるであろう。したがって、本発明のビオチン化されたマイクロ粒子の例については、支持体表面上のＳＡの密度は、ＢＳＡ支持体連結器の密度よりも低く、これは、支持体表面上のビオチンリガンドの密度（ＳＡの付加の前に推算した）よりも低いであろう。
したがって、支持体連結器がリガンドよりも有意に大きい（例えば、アルブミン支持体連結器は約６６，０００ＤａのＭ．Ｗ．を有し、そしてビオチンリガンドは、約２４４ＤａのＭ．Ｗ．を有する）粒子状の支持体（例えば、約１．０ミクロンの直径のマイクロ粒子）について、または非粒子状の支持体（例えば、マイクロタイタープレート）についての様々な実施形態においては、リガンド結合基（例えば、ＳＡ）の密度は、リガンド：：支持体連結器複合体（例えば、ビオチン−ＢＳＡ）の密度の約１０％から約９０％未満、様々な実施形態においては、リガンド：：支持体連結器複合体の密度の約３０％から約７０％未満、そして様々な実施形態においては、リガンド：：支持体連結器複合体の密度の約４０％から約６０％未満である。特異的な実施形態においては、リガンド結合基には、ビオチン結合部分（例えば、ＳＡ）が含まれ、リガンドには、支持体連結器（例えば、ＢＳＡもしくはオボアルブミン、またはそれらの混合物、あるいは、ＢＳＡもしくはオボアルブミンの断片、またはそれらの混合物）と結合したビオチンが含まれる。
様々な実施形態においては、リガンド結合基に結合させられた捕捉部分（ここでは、リガンド結合基は、順にリガンドと結合させられる）もまた不飽和である。様々な実施形態においては、マイクロ粒子またはナノ粒子支持体上の捕捉部分の密度は、リガンド結合基の密度の約１０％から約９０％未満であり、様々な実施形態においては、リガンド結合基の密度の約３０％から約７０％未満であり、そして様々な実施形態においては、リガンド結合基の密度の約４０％から約６０％未満である。
飽和のレベルを表現するための別の方法は、支持体と結合させることができるリガンドの最大量との比較である。様々な実施形態においては、リガンドと比較して飽和していない支持体表面は、結合させられたリガンドの１００％未満を有するであろう。例えば、支持体表面上のリガンドの割合（％）は、支持体表面に配置することができるリガンドの最大量の約１０％から約９０％であり得る。あるいは、支持体表面上のリガンドの割合（％）は、支持体表面上に配置することができるリガンドの最大量の約２０％から約８０％であり得る。あるいは、支持体表面上のリガンドの割合（％）は、支持体表面上に配置することができるリガンドの最大量の約３０％から約７０％であり得る。支持体表面上のリガンドの最適な割合（％）（リガンドの最大量を１００％として）は、最良のシグナル対ノイズ比、結合表面からのリガンドの最少量の解離、最良の安定性（用途に適した温度（単数または複数）で）、そして従来の結合表面と比較した検証実験における比較的低い分散（例えば、１０％未満、より好ましくは５％、またはそれ未満）を提供するリガンドの割合（％）（または百分率の範囲）である。本出願のほかの場所に説明されるように、支持体連結器は随意的である。例えば、リガンドはビオチンまたはその誘導体であり得、これは、固相支持体表面と結合させられる。
支持体と（直接、または例えば、タンパク質を介して間接的に）結合させられるリガンドの飽和量に満たない量が原因で、リガンド結合基と捕捉部分の連続する層は不飽和であり、支持体と結合したリガンドの層の上のリガンド結合基と捕捉部分の連続する層の密度には、連続的なより小さい密度（例えば、マイクロ粒子１ｍｇあたりの連続的なより小さいマイクロモル数、または１平方メートル当たりの連続的なより小さいマイクロモル数）が含まれるであろう。したがって、本発明のビオチン化されたマイクロ粒子の例については、支持体表面上のビオチン化されたＩｇＧ（ビオチン化された捕捉部分）の密度は、ＳＡ（ビオチン結合部分）の密度より低く、支持体表面上のＳＡの密度は、ＢＳＡ支持体連結器（ビオチン−ＢＳＡ）の密度よりも低く、これは、支持体表面上のビオチンの密度（ビオチン−ＢＳＡ；ＳＡの付加の前に推算したビオチンの密度）よりも低いであろう。
特異的な実施形態においては、表面には、ビオチン（ビオチン−ＢＳＡ）が、マイクロ粒子１ｍｇあたり約１×１０−５から約５×１０−２マイクロモルのビオチンの密度で、あるいは、マイクロ粒子１ｍｇあたり約１．６×１０−４から約４．９×１０−４マイクロモルのビオチンの密度で含まれる。他の実施形態においては、表面には、ＢＳＡ（ビオチン−ＢＳＡ）が、マイクロ粒子１ｍｇあたり約１．６×１０−４から約４．９×１０−４マイクロモルのＢＳＡの密度で含まれるか、ＳＡが、マイクロ粒子１ｍｇあたり約１．０×１０−４から約１．４×１０−４マイクロモルのＳＡの密度で含まれるか、または、ビオチン化されたＩｇＧが、マイクロ粒子１ｍｇあたり約２．１×１０−５から約４．１×１０−５マイクロモルのビオチン化されたＩｇＧの密度で含まれる。特異的な実施形態においては、粗い支持体表面には、ビオチン（ビオチン−ＢＳＡ）が、１平方メートルあたり約１．９×１０−２から約６．６×１０−２マイクロモルのビオチンの密度で含まれ、ＢＳＡ（ビオチン−ＢＳＡ）が、１平方メートルあたり約１．６×１０−２から約２．９×１０−２マイクロモルのＢＳＡの密度で含まれ、ＳＡが、１平方メートルあたり約１．２×１０−２から約１．９×１０−２マイクロモルのＳＡの密度で含まれ、そして、ビオチン化されたＩｇＧが、１平方メートルあたり約２．５×１０−３から約５．５×１０−３マイクロモルのビオチン化されたＩｇＧの密度で含まれる。
任意のリガンドを使用する、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を含む支持体は、本明細書中の方法および組成物にしたがって調製することができる。例えば、オリゴヌクレオチド結合表面またはポリヌクレオチド結合表面は、支持体または支持体連結器に対するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、選択された入力比のうちの２つまたは３つまたは４つまたはそれ以上で、表面に対してオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを（直接、または支持体連結器を介して）結合させることによって不飽和とすることができる。それを用いて開始される通常の入力比は当該分野で公知の入力比であり、その後、段階的に（例えば、半分、８分の１、１６分の１など）入力比が減少させられる。なぜなら、当該分野で公知の入力比は、一般的には、支持体表面上のリガンドの量を最大にするように選択されるからである。一旦、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが支持体表面に結合させられると、結合の効率を、当該分野で公知の任意の適切な方法（例えば、リガンドであるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに相補的な蛍光オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドについての結合した蛍光の定量）を使用して測定することができる。支持体連結器または支持体に対するリガンドオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの適切な入力比は、固定された量の結合表面（例えば、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドリガンドでコーティングされた１ミクロンのマイクロ粒子のグラム数）についての表面によって生じるシグナルの量（例えば、蛍光が結合した相補性オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）を測定することによって決定される。所望される飽和レベルは、マイクロ粒子の重量（全ての他の可変のおおよその定数）に対するシグナルの量の比が最大である場合に得られる。この一般的手順は、任意の所望される結合表面上での所望される飽和レベルを評価するために使用することができる。本明細書中で使用される場合は、オリゴヌクレオチドは、約３０塩基の長さまたはそれ未満の核酸であり、ポリヌクレオチドは、約３０塩基の長さまたはそれより長い核酸である。
所定の用途についての結合表面上のリガンドの最適な割合は、ビオチンをベースとする用途について本明細書中に記載される方法と同じ種類の方法を使用して当業者によって決定され得る。例えば、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがビオチンの代わりにリガンドとして使用される場合には、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは支持体連結器（例えば、タンパク質またはヌクレオタンパク質）と結合させることができ、そして適切な固相を、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとその支持体連結器でコーティングすることができる。安定性、脱落、または解離、シグナル対ノイズ、および検証の実験を、結合表面の単位表面積あたりのリガンドの最適な量（例えば、最大の１０％から９０％、最大の２０％から８０％、最大の３０％から７０％など）を得るために、本明細書中に記載されるものと同様に行うことができる。１つの従来のアプローチは、単位表面積あたりのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの量を最初に最大にし、その後、不飽和であり配向性をもつ表面を調製するために、（リガンド：：支持体連結器複合体の調製において支持体連結器に対していくつかの低入力モル比のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドで）本明細書中に記載する方法を使用し、そして様々な調製物による安定性、解離、シグナル対ノイズ、および検証の結果を比較することである。
結合表面上のリガンドの配向には、リガンドの物理的な配向、すなわち、その周囲に対してリガンドの配置を調整することが含まれる。支持体連結器あたり最大量のリガンドを含む結合表面は、一般的には、複合体のリガンドに対する結合のための目的分子が入ってくることに関して、密接な間隔の隣接しているリガンドの間では立体的に接近することができずに競合する多くのリガンドが生じる。本明細書中で使用される場合は、「物理的な（構造的な）配向性」またはその文法上の等価物は、１つの部分が、複数の部分のうちの大多数が特定の方向に向いて配向される様式で操作されることを意味する。本発明の１つの実施形態においては、部分は、認識部位または結合部位が、支持体表面から実質的に離れた方向を向くように配向される。本発明の別の実施形態においては、物理的配向性を持つ部分はタンデムに結合させられる。
配向性を持たせること（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｎｇ）は、任意のリガンド：：支持体連結器の対について本明細書中の方法によって得ることができる。結合表面上のリガンドに配向性を持たせる１つの方法は、支持体連結器に対するリガンドの低入力モル比で、リガンド：：支持体連結器複合体（ビオチン−ＢＳＡ複合体の例が本明細書中で提供される）を調製することである。本明細書中の別の場所に記載されているように、支持体連結器に対するリガンドの低入力モル比を使用する目的は、支持体連結器あたりに結合させられたリガンドの数が制御されている複合体を作製することである。支持体連結器あたりのリガンドの数の制御（すなわち、最大未満）を行うことにより、表面上のリガンドのより良好な立体的接近性、隣接しているリガンドとの間でのより少ない相互作用、結合表面上のリガンドの間でのより均一な距離（平均）、および遊離のリガンドが実質的に含まれていない表面が提供されることによる、安定性の改善（例えば、リガンドの脱落の防止または減少）を得ることができる。
本発明の組成物および方法には、感度（シグナル対ノイズ比）、精度、アッセイの正確度（定量的アッセイ）、アッセイの再現性（定性的アッセイ）、および安定性を含むアッセイの性能についてのパラメーターに対する、ならびに、常磁性マイクロ粒子（ＰＭＰ）製造プロセスの再現性（ＰＭＰ製造可能性）のようなアッセイの製造についてのパラメーターに対する、またはそれらの組み合わせに対する改善が含まれる。本発明には、以下のための組成物と方法が含まれる：親和性アッセイにおいて使用される不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つビオチン結合分子（例えば、サンドイッチアッセイおよび競合アッセイにおいて固相捕捉抗体として使用される不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つビオチン化された抗体）；非特異的結合または異好性界面に付随する、アッセイのノイズまたはバックグラウンドの減少；マイクロ粒子の分散の増大が原因であるアッセイシグナルの増大（利用することができる表面積および衝突頻度の増大、アッセイの拡散距離の減少）；ＳＡの不飽和または不飽和と配向性が原因である高いアッセイシグナル（大きいビオチン結合分子と小さいビオチン結合分子に結合する立体的自由度、これにより結合効率が改善される）；ビオチンが結合した分子の不飽和または不飽和と配向性が原因である高いアッセイシグナル（大きいまたは小さい分析物結合基（ビオチン化された捕捉部分）および／または分析物を捕捉するかあるいはそれらに結合する立体的自由度、改善された分析物結合基（ビオチン化された捕捉部分および／または分析物の認識ならびに分析物結合基（ビオチン化された捕捉部分）特異的活性）；高い生成物安定性（改善されたブロッキング効力と、表面からのＳＡの脱落の減少；ならびに／あるいは、マイクロ粒子表面上に不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つＳＡを調製するために使用されるプロセスの最適化が原因である、高い免疫測定法のロバスト性の増大とプロセスの再現性。様々な実施形態においては、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ支持体表面上のシグナル対ノイズ比は、最適なシグナル対ノイズ比を得るために、リガンド（例えば、ビオチン）に対するリガンド結合基（例えば、ＳＡ）の様々なレベルを滴定すること、そして／またはリガンド結合基（例えば、ＳＡ）に対する捕捉部分（例えば、ビオチン化抗体）の様々なレベルを滴定することによって、高めることができる。
低入力比のビオチン化ＢＳＡでコーティングされ、ブロックコポリマーＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８（ＢＡＳＦから入手することができる）でブロックされ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８とともに分散させられ、そしてＳＡでコーティングされたマイクロ粒子に基づく１つの実施形態においては、免疫測定法における最適なシグナル対のイズ比とＩｇＧ結合能力は、マイクロ粒子１ｍｇあたり３から６マイクログラムのビオチン化ＩｇＧの、ビオチン化抗体の入力を使用して得られる。マイクロ粒子１ｍｇあたり１０マイクログラムを越えるビオチン化ＩｇＧのＩｇＧ入力を用いた場合には、ＩｇＧ結合能力のシグナル対ノイズ比には有意な変化はなかった。マイクロ粒子１ｍｇあたり３マイクログラム未満のビオチン化ＩｇＧのＩｇＧの入力によっては、シグナル対ノイズ比とＩｇＧの結合能力の有意な低下が生じ、抗体入力がゼロに近づくに伴い、ゼロに近づく。
本明細書中の考察と実施例、および添付の図面には、リガンドとしてビオチンを使用する本発明の実施形態が示されるが、本発明は、ビオチンを有している結合表面に限定されない。本明細書中に記載されるものは、記載される方法と組成物を使用してそのリガンドが不飽和であり得るかまたは不飽和であり配向性を持つ任意の結合表面について一般化することができる。リガンドとしてビオチンを有している結合表面についての以下の記載は、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を作製するための特定の組成物と方法を説明するために使用される。
さらに、本明細書中の別の場所で説明されるように、支持体連結器は随意的である。したがって、支持体連結器は本発明の１つの実施形態にすぎず、支持体連結器の記載は本発明を限定するようには意図されない。
不飽和であり配向性を持つリガンドを含む結合表面が提供される。結合表面は、目的の任意の分子を捕捉するために適している捕捉部分の表面を構築するために使用することができる。表面上のリガンドの不飽和の性質と配向性により、結合表面上へのその配置が下にあるリガンドの不飽和の性質と配向性を反映するさらなる構成成分（例えば、捕捉部分）の置換が可能である。
様々な実施形態においては、本明細書中に記載される方法にしたがって支持体連結器の上に最大数未満の数のリガンドが配置され、そして脱落が少なくなるように、支持体連結器に対してリガンドを低入力モル比で使用することによって作製される、リガンド：：支持体連結器複合体が提供される。これらの複合体は、本発明の不飽和であり配向性を持つ結合表面を作製するために使用することができる。リガンド：：支持体連結器複合体を作製することにおいて支持体連結器に対してリガンドを低入力比で使用する実施形態は、２価または多価のリガンド結合基が使用される場合（例えば、ビオチンがリガンドであり、２価または多価のビオチン結合タンパク質（例えば、ＳＡ）がリガンド結合基である）に特に有用であり得る。
結合表面を含むマイクロ粒子を作製するための分散剤および方法、ならびに、例えば、ビオチン結合部分（例えば、ＳＡ（リガンド結合基））を付加させる前にビオチン（リガンド）でコーティングされマイクロ粒子を分散させることにおいてＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ブロックコポリマーのようなブロックコポリマーを使用する、結合表面を有しているマイクロ粒子を作製するための方法が提供される。本明細書中で使用することができる特異的なＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ブロックコポリマー、およびそれらの数平均分子量としては、Ｆ１０８（約１２，７００〜１７，４００Ｄａ、約１４，６００Ｄａの平均）、およびＦ１２７（約９，８４０〜１４，６００Ｄａ、約１２，６００Ｄａの平均）が挙げられる。本明細書中に記載されるそれぞれのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）のブロック長は、製造業者によるおよその値である。なぜなら、正確なブロック長はバッチごとに異なるであろうからである。他の場所に明記されているか、または状況から明らかではない限りは、ブロックコポリマーの分子量は、数平均分子量として表される。
２つ以上のビオチン結合ドメイン（例えば、アミノ酸ビジン、ＳＡ、およびニュートラアビジン）を有する分子を捕捉するために使用されるコーティング表面において使用される、安定なビオチン化された分子（例えば、ビオチン−ＢＳＡ、およびビオチン−オボアルブミン）を作製する方法が示される。したがってこれらは、結合アッセイの目的である他の分子を捕捉できるビオチン化された捕捉部分への結合に有用である（例えば、ビオチン化された抗体については、目的の分子は抗原である；ビオチン化された低分子については、目的の分子は酵素、抗体、またはその低分子に結合する結合タンパク質であり得る；など）。ＳＡを捕捉するための支持体のコーティングに使用されるＢＳＡをビオチン化する場合には、低入力比のビオチンを使用することによって調製された低入力比でビオチン化されたＢＳＡを使用する特定の例が提供される。その後、ＳＡを、適切なビオチン化された捕捉部分に対して複合体形成させることができる。
２つ以上のビオチン−結合ドメイン（例えば、アビジン、ＳＡ、またはニュートラアビジン）を有している分子の飽和量に満たない量を捕捉する、配向性を持たせる、および結合するための、支持体上へのビオチン化された分子のコーティングのための方法が示される。飽和量未満のＳＡを捕捉する、配向性を持たせる、および結合するために使用されるＰＭＰ表面上への低入力モル比でのビオチン−ＢＳＡコーティングを説明する特定の例が提供される。
ビオチン化された分子および／またはビオチン化されていない分子でコーティングされた支持体についてブロッキング剤としてブロックコポリマーを使用する方法が示される。低入力比のビオチン−ＢＳＡでコーティングされたＰＭＰについてのブロッキング剤としてトリ−ブロックコポリマーＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８を使用することを説明する特定の例が提供される。
ビオチン化された分子および／またはビオチン化されていない分子でコーティングされたマイクロ粒子について分散剤としてブロックコポリマーを使用するための方法が示される。低入力比のビオチン−ＢＳＡでコーティングされたＰＭＰについての分散剤としてのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の使用を説明する特定の例が提供される。
２つ以上のビオチン結合ドメイン（例えば、アビジン、ＳＡ、およびニュートラアビジン）を含む分子のコーティングの間に、ビオチン化された分子でコーティングされたマイクロ粒子についての分散剤としてブロックコポリマーを使用するための方法が示される。低入力比のビオチン−ＢＳＡでコーティングされたＰＭＰの表面上にＳＡをコーティングする間に、分散剤としてＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８を使用することを説明する特定の例が提供される（例えば、ＳＡを付加させる前に低入力比のビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子の単分散物を作製するためにＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８を添加すること）．
ビオチン化された表面に対して２つ以上のビオチン結合部位（例えば、アミノ酸ビジン、ＳＡ、またはニュートラアビジン）を含む分子の飽和量に満たない量をコーティングする、配向性を持たせて配置する、および結合させるための方法が示される。低入力比のビオチン−ＢＳＡでコーティングされたＰＭＰの表面上に、ＳＡの飽和量に満たない量をコーティングすること、配向性を持たせて配置すること、および結合させることを説明する特定の例が提供される。
表面上にビオチン結合分子の飽和量に満たない量を結合させる、そして状況に応じて配向性を持たせて配置するための方法が示される。親和性アッセイ（例えば、免疫測定法）に使用されるＳＡ（すなわち、不飽和であり配向性を持つＳＡ）で特異的にコーティングされたＰＭＰの表面上に、飽和量未満のビオチンを含む結合体（例えば、ビオチン化抗体、Ｆａｂ断片、低分子、高分子、担体分子など）をコーティングすること、配向性を持たせて配置すること、および結合させることを説明する特定の例が提供される。
親和性アッセイには、分析物と分析物に優先的に結合する分子との間での特異的相互作用または比較的特異的な相互作用に基づいて、直接または間接的に、試料中の分析物の存在またはそれらが存在しないことを決定する、ならびに／あるいは、試料中の分析物の量を定量するアッセイが含まれる。親和性アッセイには、別の物質に対する１つの物質の特異的または比較的特異的である結合親和性に少なくとも一部依存するアッセイが含まれる。親和性アッセイには、受容体とリガンドとの間、酵素とその基質との間、ポリヌクレオチドとその相補物もしくは実質的な相補物との間、低分子とその低分子に特異性を有して結合する結合タンパク質との間などでの結合相互作用によるアッセイが含まれるが、これらに限定されない。免疫測定法には、例えば、抗原とその抗原を認識する抗体との間での相互作用によるアッセイが含まれる。免疫測定法にはまた、例えば、試料中の目的の抗原に結合する抗体またはその断片を使用するアッセイも含まれる。親和性アッセイにはまた、例えば、競合アッセイおよびサンドイッチアッセイも含まれる。そのようなアッセイには、試料中の目的の抗体を検出するために表面に結合した抗原の相互作用を使用するアッセイ、および試料中の目的の抗原を検出するために表面に結合した抗体またはその断片の相互作用を利用するアッセイが含まれる。本明細書中で使用される場合は、抗原はポリペプチドまたはタンパク質に限定されず、抗原には低分子（例えば、ハプテン）および抗体（例えば、抗体をそれらを認識する他の抗体を作製するための抗原として使用することができる）もまた含まれ得る。一般的には、本明細書中で使用される抗原には、本発明の組成物または方法を使用して抗体またはその断片を用いて免疫測定法される試料中の目的の任意の分析物が含まれる。
本明細書中に記載される組成物および方法の特定の実施形態の適用は、ＰＭＰ表面上へのＳＡの飽和量未満の配向性を持たせた配置および結合の特定の場合について、図１Ａおよび１Ｂに示される。このプロセスの様々な工程のさらに詳細な説明は、本明細書中の別の場所に提供される。
ＳＡに結合でき、その後、例えば、免疫グロブリンまたはその断片のようなビオチン化された捕捉部分に結合することができる、ビオチン化されたＢＳＡを含む表面の場合について、不飽和であり配向性を持つ表面を作製するプロセスの一般的な記載が提供される。提供される考察および実施例の多くは、ビオチン／ＳＡシステムを議論するが、本発明は、ビオチン化された表面に限定されない。
考察および実施例でビオチンが使用され、そしてビオチンは通常、２価または多価のビオチン結合部分（例えば、ＳＡ）に結合させるために使用されるので、多価のビオチン結合部分を使用するという事実は、多価リガンド結合基を使用しない多くの結合表面と遭遇しない可能性があるという特定の問題点を示すことに留意しなければならない。これらの問題のうちの１つは、ＳＡでコーティングされたビオチン化されたマイクロ粒子を使用する場合には、共有結合していないビオチンの脱落が結合表面の能力を妨害する可能性がある（例えば、遊離のビオチンが解離して、ＳＡと複合体を形成する可能性がある）ことである。そのような場合には、この表現形は、任意の大過剰量のビオチンでＢＳＡをビオチン化するよりもむしろ、ＢＳＡの低入力比でのビオチン化を行うことによって減少させることができる。なぜなら、低入力比でのビオチン化によっては、ＢＳＡと結合する共有結合以外によって結合させられたビオチンの量を減少させることができるからである。
また、マイクロ粒子上の多価の部分（例えば、ＳＡ）で支持体をコーティングする場合には、ＳＡでのコーティングの間に凝集が起こる可能性もある。これは、個々のＳＡ分子が１つ以上のビオチンの分子に結合することが原因である。ＳＡは、およそ５６，０００Ｄａの分子量を有している四量体タンパク質であり、これは、２つ以上のビオチン結合ドメインを有している生物学的分子の特異的な例である。アビジン−ビオチン相互作用は、タンパク質とリガンドとの間での知られている最も強い非共有相互作用であり、ＳＡの４個のサブユニットはそれぞれ、Ｋａ＝１０１５Ｍ−１の結合定数でビオチンと結合する。ＳＡの四量体構造は、分子の向かい合う面に配置されたその４個のビオチン結合ドメインを生じる。ＳＡビオチン結合ドメインのうちの１つがビオチン化された表面に結合しても、３個の占有されていないビオチン結合ドメインのうちの少なくとも２つは、なおもビオチン化された捕捉部分に結合するために立体的に利用できるであろう。アビジンとニュートラアビジンは、４個のビオチン結合ドメインを有している四量体タンパク質の他の例である；これらは、それらのｐＩ、溶解度、および非特異的結合特性においてＳＡとは異なる。
ビオチン化された表面がＳＡに曝されると、遊離のＳＡは表面のビオチンと結合するであろうが、表面と結合したＳＡは、その後、別のマイクロ粒子と結合したビオチンに結合できる。この方法では、大きなマイクロ粒子の凝集物が形成する可能性がある。これは、ＳＡ付加工程でマイクロ粒子の単分散物を作製することによって対処することができる。
簡単に説明すると、マイクロ粒子上にビオチン−ＢＳＡ表面を作製するためのプロセスは、低入力比でのＢＳＡのビオチン化を用いて開始される。その後、低入力比でビオチン化されたＢＳＡは、ＰＭＰの表面官能基に対するビオチン−ＢＳＡのＢＳＡの第１級アミンの共有結合によってＰＭＰと結合させられる。得られるビオチン化されたＰＭＰは、一旦適切なＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の中に懸濁させられ（ブロッキング工程）、リンスされ、その後、単離される。次に、ビオチン化されたＰＭＰが適切なＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の中に懸濁させられ（改良された分散工程）、そしてＳＡが添加される。マイクロ粒子は、少しの間、室温でインキュベートされ、リンスされ、その後、単離される。一旦単離されると、適切なビオチン化された分子（例えば、ビオチン化された捕捉部分）を、任意の特定のアッセイ用途のために添加することができる。
適切なＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）を使用する上記ブロッキング工程によっては、本発明のリガンドをベースとする複合体を作製するために必要な特異的結合を可能にしつつ、本発明の不飽和である結合表面の別の方法では占められていない結合部位が関与している非特異的な人工的な結合事象が最少となる（図５および７）。そのようなブロッキングによっては、それが形成されると、それらの部分が、本発明の個々のリガンドをベースとする複合体に結合し、その直線的な構造的配向を促進するので、本発明のリガンドをベースとする複合体の空間的（立体的）接近性を促進し、それにより、本発明の個々の得られる捕捉部分を含む複合体が、一例として、シグナル対ノイズ比が挙げられるがこれに限定されるようには意図されない、アッセイの性能のパラメーターを最適化するように機能する可能性が高くなる。さらに、そして免疫測定法について一般的に真であるように、ブロッキング工程によってはまた、限定ではない例としてシグナル対ノイズ比を含む、アッセイの性能のパラメーターに悪影響を及ぼす可能性がある望ましくない副生成物を生じる、その構成成分および／または支持体表面が関係している免疫測定法の人工的な結合事象として記載することができる非特異的結合も最少となる。シグナル対ノイズ比に対するそのような人工的な結合事象の有害な影響は、シグナルの減少、ノイズの増大、またはそれらの両方の形態をとる可能性がある。最後に、支持体表面と結合表面の両方との特異的結合が最適化されるので、これらの表面との非特異的結合が最少となっても、支持体およびマイクロ粒子またはマイクロプレートの結合表面からの本発明のリガンドをベースとする構成成分の脱落は、それと同時に最小となる。そのような理由から、適切なＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）を用いたブロッキング工程により、アッセイの感度（シグナル対ノイズ比）、アッセイの精度、アッセイの正確度（定量的アッセイ）、アッセイの再現性（定性的アッセイ）、アッセイの安定性、またはＰＭＰ製造プロセスの再現性（ＰＭＰ製造可能性）、あるいは、それらの組み合わせに対して好ましい影響を与える、性能および製造の改善が生じる。
マイクロ粒子上にビオチン−ＢＳＡ表面を作製するプロセスの間の、ＳＡの付加の前の適切なＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）を使用する上記の改良された分散工程により、マイクロ粒子の凝集が減少し、同時に、マイクロ粒子上に露出させられる表面積が大きくなり（図６および１０）、それによって、結合に利用することができないマイクロ粒子表面上のリガンドをベースとする複合体の数を最少にすることができる。そのようなＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）によって媒介される凝集の阻害は、ＰＭＰ製造可能性（ＰＭＰプロセスの再現性）を高めること、ならびに、そのようなＰＭＰが使用されるアッセイおよびキットの性能を改善することが含まれるが、これらに限定されない用途に有用である。ＰＭＰ製造可能性は、ＰＭＰの個々のロットのマイクロ粒子の凝集のレベルが、ＰＭＰの製造プロセスの前、その間、およびその後に制御可能である場合には、高くなる。ＰＭＰ製造プロセスの後、そのようなＰＭＰを使用するアッセイの性能は、免疫測定法の間の試料の添加の前にＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）を含む溶液に対してマイクロ粒子を接触させること、および／または免疫測定法の間の基質の添加の前にＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）を含む溶液に対してマイクロ粒子を接触させることを含む手段によって最適化することができる。そのような理由から、適切なＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）を用いた改良された分散工程により、アッセイの感度（シグナル対ノイズ比）、アッセイの精度、アッセイの正確度（定量的アッセイ）、アッセイの再現性（定性的アッセイ）、アッセイの安定性、またはＰＭＰ製造プロセスの再現性（ＰＭＰ製造可能性）、あるいは、それらの組み合わせに対して好ましい影響を与える、性能および製造の改善が生じる。
均一な大きさ（＜５％ＣＶ）の１．０μｍのＭｙＯｎｅ（登録商標）トシル活性化（それ以上の表面の活性化は必要ない）Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＰＭＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、低入力比（４ビオチン試薬：１ＢＳＡ）でビオチン化されたＢＳＡ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８トリ−ブロックコポリマー（合成の非生物学的なもの；ＢＡＳＦ）、ＳＡ２１ ＳＡ−ＰＬＵＳ（登録商標）（凍結（決して凍結乾燥ではない）；ＰｒｏＺｙｍｅ（登録商標））、マイクロ粒子を分離し洗浄するため（緩衝液交換）の磁石を使用する特定の実施形態についてのプロセスを図１Ａおよび１Ｂに示される。マイクロ粒子のプロセスには、２５ｍｇのＰＭＰ／ｍＬの濃縮、オーバーヘッド混合、および（ｏｖｅｒｈｅａｄ ｍｉｘｉｎｇ）、およびプロセスの再懸濁のためにマイクロ粒子を再懸濁させ分散させるための超音波処理、プロセスのインキュベーションのためのオーバーヘッド混合、高温（３８〜４２℃）および室温でのプロセスのインキュベーション、ＢＳＡの第１級アミノ基を介したマイクロ粒子表面のトシル基に対してビオチン化されたＢＳＡを共有結合させるためのトシル化学、マイクロ粒子表面のブロッキングのためのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８トリ−ブロックコポリマー（受動的に吸着したタンパク質を除去すること、マイクロ粒子の表面に対するタンパク質の非特異的結合を最少にすること）、ＰＭＰの単分散のためのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８ ｔｒｉ−ブロックコポリマー、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８トリ−ブロックコポリマーの存在下でのビオチン−ＢＳＡ ＰＭＰ中間体に対するＳＡの二次的結合（親和性）（ＳＡの結合プロセスの間のマイクロ粒子の凝集を減少させる）が含まれる。
不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ表面を作製することにおいて低入力比でのビオチン化の背景にある原理を明らかにするための便利な方法は、ポアソン分布のレンズを介してビオチン化プロセスを観察することである。以下のような説明が根底にある原理を、全てのリガンドと支持体連結器の対（ビオチンとＢＳＡだけではなく）に適用することができる。支持体連結器に対して低入力比のリガンドを使用して調製されたリガンド：：支持体連結器複合体は、リガンド支持体連結器が支持体上にコーティングされると、リガンド分子のさらに好ましい配向性を生じると考えられる。リガンド分子のこのより好ましい配向性は、支持体上のコーティングの立体的接近性に寄与する。任意の特定の支持体連結器またはリガンドだけには限定されないその原理の説明のために、表現形は、本明細書中のビオチン化されたＢＳＡを使用して記載される。以下の説明は、任意のリガンドと支持体連結器に適用され、この場合、支持体連結器は、１つ以上のリガンドと結合することができる。ビオチンとＢＳＡ以外のリガンドと支持体連結器については、支持体連結器に対するリガンドの入力比は、所望される安定性を提供する入力比を選択すること、平均置換度（λ）を決定すること、そして、適切な分布（例えば、ポアソン分布）において配向性の効果を観察することによって、実施例１（表１を参照のこと）においてＢＳＡとビオチンについて行ったように決定することができる。
ＢＳＡのビオチン化の場合には、第１級アミン反応性ビオチン化試薬であるスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを使用してビオチン化させることができる多数の可能な部位が、ＢＳＡのアミノ酸配列の中に存在する。遊離の第１級アミンを含むアミノ酸であるリジンは、ＢＳＡのアミノ酸配列の中に５９回現れる。しかし、アミン反応性ビオチン化試薬と反応させるために利用することができるリジンの第１級アミンは、ＢＳＡの中には約３０から３５個しか存在しない。例えば、Ｎ末端アミンは、ＢＳＡの三次構造においては埋まった状態である場合があり、また、ブロックされている場合もある。分子の表面（例えば、先端、底面、側面、溝、ポケットなど）上に配置されている第１級アミンだけが、ビオチン化に利用できる。ＢＳＡ１モルあたり４モルのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンのモル入力比でＢＳＡをビオチン化することによっては、平均すると、ＢＳＡ分子１個あたり約１．６３のビオチン分子が生じる（表１を参照のこと）ことは、経験的に決定されている。
ビオチン化のためには、ＢＳＡ分子を有しているスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（１モルのＢＳＡに対して４モルのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン）のランダムな反応と、ＢＳＡ分子１個あたり１．６３個のビオチンの平均置換度（λ）を仮定すると、ビオチン化されたＢＳＡ分子の分布は、ポアソン分布を使用して概算することができる（図３を参照のこと：ＢＳＡのうちの２０％は０個のビオチンを有する；ＢＳＡのうちの３２％は１個のビオチンを有する；ＢＳＡのうちの２６％は２のビオチンを有する；ＢＳＡのうちの１４％は３個のビオチンを有する；ＢＳＡのうちの６％は４個のビオチンを有する；ＢＳＡのうちの２％は５個のビオチンを有する；そして、ＢＳＡのうちの＜１％は６個のビオチンを有する）。図３に示されるように、ポアソン分布から、ビオチン−ＢＳＡ複合体のうちの少なくとも５０％が、選択されたビオチン：ＢＳＡのモル入力比で支持体連結器（すなわち、ＢＳＡ）１個あたり３個未満または３個のビオチンを有することが明らかである。分布からはまた、選択されたモル入力比では、ＢＳＡ分子１個当たり０個から６個のビオチンが結合させられることも明らかである。
低入力比でビオチン化されたＢＳＡは、支持体と共有結合させることができる。なぜなら、ＢＳＡは、第１級アミン化学に利用することができる第１級アミンを３０個から３５個有しているからであり、ポアソン分布は、ＢＳＡの０個から６個の第１級アミンが、低入力比でのビオチン化の後にビオチンに結合させられると予想する。したがって、約２４から３５個の第１級アミンは、第１級アミン化学（例えば、トシル、エポキシ、カルボジイミドなど）により支持体に対してそれぞれのＢＳＡ分子を共有結合させるためになおも利用することができる。複数の利用することができる第１級アミンは、支持体の官能基に対するＢＳＡの結合効率を改善する場合があり、そして、複数の結合点（すなわち、ＢＳＡ分子１個あたり１個以上の支持体対ＢＳＡ共有結合）によって安定性を改善する場合がある。
ビオチン化試薬についての製造業者の説明書（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｍ．Ｓａｖａｇｅら、第２版，１９９２，３４頁）にしたがうと、タンパク質１モルあたり２．５モルのビオチンでビオチン化タンパク質されたもまた、タンパク質のプールの間でガウス（ベル型）分布を生じることができる。プールの中のいくつかのタンパク質にはビオチンが取り込まれていない場合があるが、ほとんどのものには、２〜３モルのビオチンが取り込まれており、プールのうちの極めて小さな割合は、５モルのビオチンを取り込むことができる。ビオチンは任意の利用することができる第１級アミンと結合することができるので、それぞれのＢＳＡ分子上の様々な利用できるアミンに結合させられたビオチンと、様々なビオチン−ＢＳＡ結合体が生じる可能性は極めて高い。
どこまで低い入力比でビオチン化されたＢＳＡを使用できるかの説明は図４に示される。これは、ビオチン−ＢＳＡ第１級アミノ基またはスルフヒドリル官能基に共有結合させるために使用された表面官能基（すなわち、カルボン酸、トシル活性化されたもの、エポキシなど）を有している１．０ミクロンのトシル活性化マイクロ粒子固相に対する、低入力比のビオチン−ＢＳＡの結合を示す。得られる支持体は不飽和であり、その表面上のビオチンに対して配向性を持つ。
ビオチン−ＢＳＡ結合体（リガンド：：支持体連結器複合体）は、ＢＳＡ分子１個あたり様々な数のビオチンを有することができ、ＢＳＡ分子の配向性と表面ビオチンの位置はランダムであるので、ビオチン−ＢＳＡ結合体は、溶液中に伸びるそれらのビオチンが結合表面として立体的に利用でき、そして支持体表面に面しているこれらのビオチンが結合表面としては立体的には利用できないように支持体表面と結合するであろう。
最も商業的に利用されているマイクロ粒子はポリスチレン系のものであり、マイクロ粒子表面に対するタンパク質の吸着は受動的に（例えば、疎水性相互作用および／またはイオン性相互作用による）、そして非特異的に起こる。トシル活性化マイクロ粒子が示されているが、支持体は、ビオチン−ＢＳＡ官能基（例えば、ＢＳＡの第１級アミノ基またはスルフヒドリル基）に共有結合することができる任意の適切な官能基（例えば、カルボン酸、エポキシなど）で活性化させることができる。ＢＳＡ分子の表面上の個々のイプシロンアミンが同じｐＫを有する場合は、ＢＳＡ表面上でのビオチンの分布は、ガウス分布であるはずである（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ｍ．Ｓａｖａｇｅら、第２版，１９９２，３４頁）。図４は、１．０ミクロンの支持体に対して、ＢＳＡ分子１個あたり１．６３個のビオチンの平均置換度（λ）を有しているビオチン−ＢＳＡを共有結合させることによって作製された不飽和表面を説明する。説明から見ることができるように、本明細書中では、不飽和は、低入力比のビオチン化ＢＳＡで支持体をコーティングすることによって、少なくとも一部行われる。
支持体上に不飽和結合表面を得るための別の方法には、支持体連結器に対するリガンドの選択されたモル入力比で、リガンド：：支持体連結器複合体を調製すること、得られるリガンド：支持体連結器複合体の稀釈された調製物を調製すること、およびリガンド：：支持体連結器複合体を支持体と結合させるプロセスにおいて、リガンド：：支持体連結器複合体の稀釈された調製物を使用して支持体をコーティングすることが含まれる。少なくとも２価のビオチン結合部分に結合するビオチン化された表面については、選択されるモル入力比は、脱落が原因である性能の低下を小さくするために、支持体連結器に対するビオチンの低いモル入力比が好ましい。この方法においては、低入力比は、得られる支持体の不飽和の特性の原因ではなく、これは、支持体と結合したリガンドの不飽和の性質が、支持体連結器あたりのリガンドの量を制限することによるのではなく、むしろ、支持体上の単位面積あたりのリガンド：：支持体連結器複合体の濃度を制限することによって得られる。したがって、例えば、この方法を使用して、ＢＳＡを、ＢＳＡ１モルあたり４モルのビオチンの過剰なモル入力比でビオチンと結合させることができるが、ビオチン化は、結合表面にある共有結合以外によって結合させられたビオチンの量を減少させるために、ビオチンの低入力比で行われることが好ましい。
多くの状況においては、支持体連結器に対するリガンドの高モル入力比（例えば、ＢＳＡ１モルあたり約２０モル以上のビオチン化試薬のモル入力比）でＢＳＡをビオチン化させる（または、任意のリガンドを任意の支持体連結器と結合させる）ことは望ましくない、および／または無駄が多い可能性があるが、この方法を用いて、そのような高入力比で調製されたリガンド：：支持体連結器複合体（例えば、ビオチン−ＢＳＡ）はまた、不飽和である結合表面を作製するためにも使用できる。したがって、支持体連結器あたりのリガンド（例えば、ＢＳＡあたりのビオチン）の平均置換度（λ）を限定することとは無関係に、支持体上のリガンドの飽和度の限定は、支持体に対してリガンド：：支持体連結器複合体を結合させる反応において、リガンド：：支持体連結器複合対の濃度を限定することによって行うことができる。飽和の程度は、さらに、例えば、反応温度を制御すること（例えば、吸熱性の結合反応については冷却、または発熱性の結合反応については加熱）による反応の速度の制御、より遅いかまたは反応性の低い結合化学反応を選択すること、反応時間を制限することなどによって制御することができる。
上記のように、ほとんどの市販されているマイクロ粒子はポリスチレン系のものである。そのような表面に対する、例えば、疎水性相互作用および／またはイオン性相互作用を介する受動的なタンパク質の吸着は公知である。非特異的結合を減少させるためにブロッキング剤（例えば、少なくとも１つのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））を使用することが、本明細書中で議論される。そのような薬剤は、本明細書中の別の場所に詳細に開示され、これらは結合表面を含むマイクロ粒子の単分散物、または実質的に単分散性の調製物を作製することにおいても有用である。
固相についてのブロッキング剤としての、および低入力比のビオチン化ＢＳＡでコーティングされたマイクロ粒子についてのブロッキング剤としてＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ブロックコポリマーを使用する特定の場合についてのブロックコポリマーの使用が、図５に説明される。この説明はＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８（Ｍ．Ｗ．約１３，５１８Ｄａ；親水性親油性バランス（ＨＬＢ）＝２７）についてのものである。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８は、固相の露出している疎水性ポリマー表面をブロックし、共有結合したタンパク質を除去することなく受動的に吸着したタンパク質に置き換わる、除去する、または剥がし取る。その後、表面は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）テールの中に表面ヒドロキシルが存在することが原因で、親水性のままとなる。
支持体表面と結合する能力を有しており、周辺の媒体に向かって比較的親水性であるテールをもまた伸ばす任意の適切なブロックコポリマーを使用することができる。トリ−ブロックコポリマー（例えば、ＢＡＳＦによるＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８）は、約１７から約６９個の単量体単位の長さの１つの疎水性ポリプロピレン（ＰＲＯ）頭部基を有し、それぞれが１から約１２９個の単量体単位の長さの２つの親水性ポリエチレン（ＰＥＯ）テールを有する。トリ−ブロックコポリマーの親水性親油性バランス（ＨＬＢ）は、ＰＰＯ頭部基とＰＥＯテールの長さまたは大きさに直接関係があり、ＨＬＢ値は１（水中で不溶性）から２９（水中で高度に可溶性）までであり得る。ＰＰＯ頭部基が少なくとも５６個の単量体単位の長さである場合には、トリ−ブロックコポリマーの頭部基は、疎水性プローブとして作用できるだけではなく、疎水性表面に対して強く結合することもできるが、これは、同じ疎水性表面と競合し、そして別の分子に置き換わる可能性がある。両方のＰＥＯテールが少なくとも１０５個の単量体単位の長さである場合には、これらは、固相表面から離れて溶液の中に向かって伸びるであろう。それぞれのＰＥＯテールの末端にあるヒドロキシル基は、テールが十分に長く、溶液の中で左右に運動することに関して自由であり、そしてヒドロキシルテールが固相支持体表面に対する受動的なタンパク質の吸着または際吸着を妨げる立体的バリアとして作用するので、親水性の微環境を提供する。
理論的に有用な表面積に基づいて、１．５ｇ／ｃｍ３の密度（マイクロ粒子１ｍｇあたり３８．８３から４８．７７ｃｍ２）の密度を有している０．８２から１．０３ミクロンの球形のマイクロ粒子の滑らかな表面と、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７分子の理論上の界面表面積（１５．１から２０．０ｎｍ２）を仮定すると、マイクロ粒子表面上のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７の理論上の単層は、マイクロ粒子１ｍｇあたり約４．０５×１０−４から約５．４３×１０−４ｎｍｏｌのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７までであると計算される。５−（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン（５−ＤＴＡＦ）で標識されたＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７の蛍光分析は、約３．６８×１０−４から約８．３７×１０−４ｎｍｏｌのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７が、０．８２から１．０３ミクロンの球形のマイクロ粒子１マイクログラムあたりに結合することを示していた。
血球計による分析を使用して、全てのポリスチレン系ＰＭＰの凝集物を完全に破壊し、マイクロ粒子の単分散物を生じさせるために必要な、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７、およびＴｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）９０８の最少濃度を決定した。濃度の最適化実験は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８が、約５ｍＭ（０．００７％ｗ／ｖ）から約５００ｍＭ（０．６７％ｗ／ｖ）までの濃度で、単量体と二量体だけのマイクロ粒子の単分散物を生じたことを示していた。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７は、約６．６７ｍＭ（０．００９％ｗ／ｖ）から約３３．３３ｍＭ（０．０４３％ｗ／ｖ）までのマイクロ粒子の単量体、二量体、および三量体、ならびに、約５０ｍＭ（０．０６４％ｗ／ｖ）から約６６７ｍＭ（０．８５０％ｗ／ｖ）までの単量体、二量体、および大きな凝集物を生じた。しかし、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）９０８は、試験した最大濃度で凝集物を生じた。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８は、約０．４％ｗ／ｖから約０．６％ｗ／ｖまでの濃度でビオチン−ＢＳＡ ＰＭＰブロッキング剤として作用した。本発明の他の実施形態においては、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８は、約０．１％ｗ／ｖから約１．０％ｗ／ｖ、または約０．５％ｗ／ｖから約０．７５％ｗ／ｖの濃度で添加された。
２つ以上のビオチン結合ドメインを有しているビオチン結合分子を付加する前の、ビオチン化分子でコーティングされたマイクロ粒子についての分散剤としてのブロックコポリマーの使用が、ビオチンでコーティングされたマイクロ粒子に対するＳＡの付加の前に分散剤としてＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８を使用する特異的な実施形態について、図６に示される。示される説明においては、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８は、単分散を促進するため、そして表面に対する非特異的結合をブロックするための両方に使用される。少なくとも２価のビオチン結合分子の付加は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の存在下、またはそれが存在しない条件において示される。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８が存在しない場合には、マイクロ粒子は、ビオチン結合分子の付加の間に凝集してしまう可能性がある。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の存在下では、マイクロ粒子は、ビオチン結合分子の付加の間およびその後は単分散物である。
分散工程は、最適な結果のための特定の状況下で行われることが好ましい。なぜなら、例えば、２つ以上のビオチン結合ドメイン（例えば、アビジン、ＳＡ、またはニュートラアビジン）を有しているビオチン結合部分と結合させられる、ビオチン−ＢＳＡを提示するビオチン化されたマイクロ粒子は、個々のビオチン結合部分の２つ以上のビオチン結合ドメインを介するビオチン化されたマイクロ粒子の架橋が原因で、凝集するかまたはかたまる傾向を示す。
（例えば、ビオチン結合部分１個あたり２個以上のビオチン結合ドメインを含む合成のまたは生物学的なリガンド結合基（ビオチン結合部分）でコーティングされた）ビオチン化されたマイクロ粒子は、別のビオチン化されたマイクロ粒子上にある結合されていない接近することが可能なビオチン（リガンド）を有している１つのビオチン化されたマイクロ粒子上のビオチン結合部分の占有されていない接近することが可能な結合ドメインの結合が原因で、凝集するまたはかたまる傾向を有する。マイクロ粒子の凝集は、極めて高濃度またはモル過剰量のビオチン結合部分（例えば、アビジン、ＳＡ、ニュートラアビジン、ＳＡの断片、アビジンの断片、またはニュートラアビジンの断片）を含む継続して混合される溶液に対して、ビオチン化されたマイクロ粒子をゆっくりと滴定する（すなわち、１滴ずつ添加する）ことによって減少させることができる。このアプローチは、架橋が起こり得る前に、ビオチン結合分子を有しているマイクロ粒子の表面のビオチンを飽和させることによって、マイクロ粒子の凝集を減らすことができる。しかし、滴定のアプローチは、極めてコスト効果が低く、確実な作業であり、その理由は、制御するための複数のパラメーターが存在し、そして特定のビオチン結合部分のコストが原因で極めて高価であり得るからであるが、これにより、選択されたビオチン結合部分でのコーティングの後にマイクロ粒子の単分散物を生じさせることができる。
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）のようなブロックコポリマーの使用は、上記のゆっくりとした滴定のアプローチについての優れた代替えであり得る。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８（ＢＡＳＦによって製造されたトリ−ブロックコポリマー）は、約５６個の単量体単位の長さの１つの疎水性ポリプロピレン（ＰＰＯ）頭部基と、約１２９個の単量体単位の長さの２つの親水性ポリエチレン（ＰＥＯ）テールを有する。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８のＰＰＯ頭部基は、疎水性プローブとして作用し、タンパク質または固相支持体表面（例えば、マイクロ粒子支持体表面）上の疎水性パッチまたは部位に対して強く結合する。結果として、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８は、表面タンパク質の相互作用（すなわち、疎水性のタンパク質相互作用またはイオン性のタンパク質相互作用）が原因であるマイクロ粒子の凝集を破壊させるために使用することができる。ＰＥＯテールは、親水性微環境を提供し、疎水性相互作用またはイオン性相互作用が原因であるタンパク質の再結合を防ぐための立体的バリアとして作用することができる。結果として、一旦、マイクロ粒子がＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８で処理されると、これらは、溶液の中では極めて親水性が高く単分散物となる。
本発明の１つの実施形態により、マイクロ粒子を含む改良された親和性アッセイが提供される。この実施形態においては、分散したマイクロ粒子の集団（例えば、マイクロ粒子の単分散集団）が、ブロックコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８またはＦ１２７）を使用して調製される。その後、分散したマイクロ粒子は、従来の親和性アッセイに取り込まれる。マイクロ粒子が分散させられていることが原因で、親和性アッセイは高い感度（シグナル対ノイズ比）、高いアッセイ精度、高いアッセイの正確度（定量的アッセイ）、および高いアッセイの再現性（定量的アッセイ）を有するであろう。
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８およびＳＡでコーティングされたマイクロ粒子の特異的な場合についての分散工程においてブロックコポリマーを使用することの説明が、図６および図７に示される。
図７は、低入力比のビオチン化ＢＳＡでコーティングされ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８でブロックされたマイクロ粒子を示す。これらは、０．４％から０．６％（ｗ／ｖ％）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の中に分散させられたかまたは再懸濁させられる。一旦、ビオチン化されたマイクロ粒子が単分散物となると、ＳＡが、ビオチン化されたマイクロ粒子をコーティングするために付加される。ＳＡ（Ｍ．Ｗ．約５６ｋＤａ）はＢＳＡ（Ｍ．Ｗ．約６６ｋＤａ）よりもわずかに小さいので、おそらく、１つのＳＡ分子だけが１つのビオチン−ＢＳＡ分子と立体的に結合できる（たとえ、ＢＳＡが複数の接近可能なビオチンを有している場合でも）。加えて、全てのＢＳＡ分子が利用できるビオチンを有しているわけではない（上記のポアソン分布についての議論を参照のこと）。したがって、結合表面上に捕捉されたＳＡ分子の総数は、支持体表面と結合したＢＳＡ分子の総数よりも少なく、そして、ＳＡは、結合表面上では不飽和であろう（単位表面積あたりのＳＡ分子の最大量よりも少ないであろう）（実施例１１を参照のこと）。
支持体表面がビオチン化された合成の分子または生物学的分子（リガンド：：支持体連結器複合体）でコーティングされた後、これは、２つ以上のビオチン結合ドメインを含む合成のまたは生物学的なリガンド結合基（ビオチン結合部分）の飽和量に満たない量を捕捉するため、あるいはそれらを捕捉して配向性を持たせて配置するために使用することができる。ビオチン結合ドメインが、それぞれのビオチン結合部分の反対向き、もしくはほぼ反対向きの末端または側面に配置されると仮定すると、そのビオチン結合ドメインのうちの少なくとも１つは、固相ビオチンと結合し、一方、反対側にあるかもしくはほぼ反対側にあるその残りのビオチン結合ドメインは、ビオチン化された捕捉部分（例えば、ビオチン化された抗体または抗原）と結合するために利用されるであろう。
上記で議論されたように、ビオチン化されたマイクロ粒子は、ビオチン結合部分の付加の前に約０．４％から約０．６％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８（トリ−ブロックコポリマー）の中にビオチン化されたマイクロ粒子を分散させることによって、または、極めて高濃度またはモル過剰量のビオチン結合部分を含む持続的に混合される溶液の中にビオチン化されたマイクロ粒子をゆっくりと滴定する（例えば、１滴ずつ）ことによって、マイクロ粒子を凝集させることなく、２個以上のビオチン結合ドメインを含む合成のまたは生物学的なリガンド結合基（ビオチン結合部分）でコーティングすることができる。
実際には、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８は、約０．１％から約１．０％（ｗ／ｖ％）、あるいは約０．４％から約０．６％（ｗ／ｖ％）までの濃度で、低入力比のビオチン化ＢＳＡでコーティングされたマイクロ粒子を分散させた。一旦ビオチン化されると、マイクロ粒子は、約０．４％から約０．６％（ｗ／ｖ％）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８溶液の中で処理され、分散させられると、低レベルのまたは少量のＳＡを、マイクロ粒子の凝集または塊を形成させることなく、ビオチン化されたマイクロ粒子に加えることができた。このプロセスによっては、特異的なビオチン結合部分（例えば、ＳＡ）のコーティングの後にマイクロ粒子の単分散物が生じた。このプロセスは、上記のマイクロ粒子の滴定方法よりもはるかにコスト効果が高く、２つ以上のビオチン結合ドメインを含む合成のまたは生物学的なリガンド結合基（ビオチン結合部分）を有しているビオチン化されたマイクロ粒子をコーティングするための極めて確実な（ｒｏｂｕｓｔ）再現性のある方法である。
したがって、少なくとも１つの実施形態においては、ブロックコポリマーを、非特異的結合を減少させるため、およびマイクロ粒子の単分散の促進を助けるための両方に、約０．１％ｗ／ｖから約１．０％ｗ／ｖまで、または約０．４％から約０．６％（ｗ／ｖ％）までの濃度で使用することができる。
不飽和であり配向性を持つ結合表面を作製することについての１つの目的は、親和性アッセイのための構成成分を構築するための土台または基礎を提供することである。本発明にしたがって構築された基部のリガンド：：支持体連結器複合体は不飽和であり配向性を持つので、このリガンド：：支持体連結器複合体上に組み立てられた任意の構成成分は、その不飽和である性質と配向性を反映するであろう。そのような構造の一例が図８に示される。
図８は、以下によって調製されたビオチン特異的マイクロ粒子結合表面上のビオチン化された捕捉部分のコーティングを示す：（１）低入力比のビオチン化されたＢＳＡでの表面のコーティング；（２）トリ−ブロックコポリマーＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８での表面のブロッキング；（３）２つ以上のビオチン結合ドメインを含む合成のまたは生物学的なビオチン結合部分（例えば、ＳＡ）の付加の前のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の中へのマイクロ粒子の分散；および（４）表面へのＳＡの付加。得られるＳＡでコーティングされたマイクロ粒子は、目的の任意のビオチン化された捕捉部分の飽和量ではない量を配向性を持たせて配置し、そして捕捉するために使用することができる。
図８は、ＳＡでコーティングされたマイクロ粒子が、以下を含む、目的の特定のビオチン化された捕捉部分の飽和量ではない量を配向性を持たせて配置し、そして捕捉するために使用される方法を説明する：（Ａ）抗体のＦａｂ断片（Ｉｇ Ｆｃ領域が存在しないことにより、非特異的結合の問題を減少させるか、または緩和することができる）；（Ｂ）免疫グロブリン（ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体）；ならびに（Ｃ、Ｄ、およびＥ）それぞれ、合成のものであるか生物学的なものであるかにはかかわらず、低分子、中分子、および／または高分子。目的の任意のビオチン化された捕捉部分には、例えば、分子とビオチン部分との間にスペーサーが含まれ得る。
スペーサーは、比較的小さいビオチン化された分子の場合に特に有用であり得る。ＳＡ分子の中のビオチン結合ドメインは表面下に９オングストローム埋め込まれているおで、ビオチン化された低分子（例えば、約１．０００Ｄａ未満の分子量を有しているもの）は、立体障害が原因で大きな免疫測定法のトレーサー（検出可能な結合基）によっては検出できない場合がある。より大きな結合能力とより高い検出感度は、それらに結合させられたスペーサーアームを有しているビオチン誘導体を使用することによって、または大きなビオチン化された分子（すなわち、担体分子）に対して低分子を結合させることによって実現することができる。
それらが有用である程度について、中分子または高分子から低分子を区別するための指針は以下の様式で表すことができる：低分子は、一般的には、約５，０００Ｄａ未満の分子量であると考えられる；中分子は、約５，０００以上から約１５０，０００Ｄａまでの分子量であると一般的に考えられる；高分子は、一般的には、約１５０，０００Ｄａを超える分子量のものであると考えられる。
本発明にしたがって結合表面を有しているマイクロ粒子を作製することにおける本発明の特定の態様は図９Ａおよび９Ｂに説明される。
図９Ａおよび９Ｂは、本発明にしたがって調製されたビオチン結合マイクロ粒子（例えば、ＳＡでコーティングされたマイクロ粒子）上への、飽和量未満のビオチン化抗体またはビオチン化されたＦａｂ断片の配向性を持たせた配置とコーティングを説明する。
本発明にしたがって調製されたＳＡでコーティングされたＰＭＰは、免疫測定法の感度を改善する（シグナル対ノイズ比を高める）ことができる。なぜなら、ビオチンに結合する固相は、ビオチン化された捕捉部分（例えば、分析物特異的であるビオチン化抗体またはＦａｂ断片）の飽和量に満たない量を配向性を持たせて配置し、そして捕捉するために使用することができる。アッセイの感度は、個々のＳＡでコーティングされたマイクロ粒子の支持体表面積あたりのＳＡ分子の総数の減少により、ビオチン化された捕捉抗体の結合能力の低下が生じるので改善されるが、改善された立体的な自由度が原因で、ビオチン化された捕捉抗体の結合能力は改善される。すなわち、表面上に最大量に満たない量のＳＡ分子を提供することの目的は、大きなビオチン化された捕捉部分（例えば、ビオチン化された抗体）に結合して、個々のＳＡ分子の結合効率を改善するための、個々のＳＡ分子の立体的自由度を改善することである。
図９Ａは、従来の、または標準的なＳＡでコーティングされたマイクロ粒子表面を説明する。ここでは、ＳＡは、第１級アミンまたは他の結合化学反応によってマイクロ粒子表面上に直接コーティングされ、そして表面はＢＳＡを使用してブロックされる。そのような従来の、または標準的な表面上では、ＳＡ分子は、特異的に不飽和であることはないか、または表面上に配向性は持たない。すなわち、結合はランダムである。ビオチン化された抗体またはＦａｂ断片を付加することによっては、表面上でＳＡがランダムな配向性を持つことが原因で、主に不飽和ではないかまたは配向性を持たない結合表面が生じる。抗体またはＦａｂが密集することによっては、特に、抗原が高分子である場合に、立体的なバリア（接近性が低い）が生じ得、そして抗原捕捉効率が低下し得る。
図９Ｂは、本発明にしたがって作製されたＳＡでコーティングされたマイクロ粒子結合表面を説明する。この結合表面上では、ＳＡ分子は不飽和であり（マイクロ粒子の単位結合表面積あたりのＳＡ分子の総数の減少）、そして表面上に配向性を持つ。マイクロ粒子支持体表面は、低入力比のビオチン化されたＢＳＡで共有結合によってコーティングされ、そしてＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８でブロックされる。ビオチン化されたマイクロ粒子は、その後、ＳＡの付加の前にＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の中に分散させられる。ＳＡの結合は特異的であり、ランダムではない。
本発明にしたがって作製されたＳＡマイクロ粒子結合表面に対するビオチン化抗体またはビオチン化されたＦａｂ断片の結合は、ＳＡ分子もまた結合表面上で不飽和であり、配向性を持つことが原因で、不飽和であり配向性を持つ。ビオチン化抗体またはビオチン化されたＦａｂ断片の配向性と不飽和の性質は、特に抗原が高分子である場合に、抗原（分析物）捕捉効率を促進する（シグナルが大きくなる）。加えて、マイクロ粒子の表面は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８ブロッカーが原因で親水性であり、表面に対する非特異的結合は最少となるか、または排除される（ノイズが減少する）。
本発明の別の特徴が図１０に示される。これは、マイクロ粒子の単分散に伴う利用可能な表面積の増大を示す。
図１０、パネルＡは、マイクロ粒子対マイクロ粒子の表面相互作用が原因でマイクロ粒子が凝集または凝塊することを示す。この凝集によっては、（１）利用することができるマイクロ粒子の全表面積（なぜなら、凝集の内側にある全ての表面積が立体的に利用できるわけではない（接近できるわけはないからである）と、（２）結合表面上のビオチン結合部分（例えば、ＳＡ）の結合能力と効力のいずれもが低下し、それにより、アッセイシグナルの低下が生じるであろう。
図１０、パネルＢは、本発明のマイクロ粒子が大きな結合表面積を有していることを示し、これにより、結合表面上へのビオチン結合部分（例えば、ＳＡ）の結合能力の改善と、結合効力の改善が生じ、これにより、アッセイシグナルの増大が生じる。単分散マイクロ粒子は、凝集したマイクロ粒子またはマイクロ粒子の塊よりも大きな合計の利用可能な表面積を有し、これらは、高い衝突頻度と低いアッセイの拡散距離が原因で、改善されたアッセイの運動速度論を提供するであろう。
本発明のマイクロ粒子は、低入力比でビオチン化されたＢＳＡ結合表面が、ブロックコポリマー（例えば、トリ−ブロックコポリマーＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８）でブロックされ、ビオチン化されたマイクロ粒子が、上記のようにＳＡ分子の付加の前にＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の中に分散させられるように設計される。もちろん、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８は、この実施形態の一例にすぎない。本発明の任意のブロックコポリマーをこの様式で使用できることが理解される。
本発明のマイクロ粒子は、リガンドとしてのビオチンと、支持体連結器としてのＢＳＡまたはオボアルブミンのいずれかを使用して作製された。ＳＡでコーティングされたマイクロ粒子、ならびに、特異的な捕捉部分を有しているマイクロ粒子もまた作製された。これらの実験の結果は以下で、そして実施例において議論される。
ビオチン化反応においてビオチンのモル入力比を変化させることの効果を実験した。これは、実施例１に示される。３．４：１から３０：１までの範囲のＢＳＡに対するビオチンの様々なモル入力比でのＢＳＡのビオチン化を行い、ビオチン化の程度を決定し、そして、４℃と３７℃で３日間の安定性を決定した（表１を参照のこと）。安定性の低下は、少なくとも一部、ビオチン−ＢＳＡ結合体からのビオチンまたはビオチン試薬の脱落あるいは解離を反映する（図１１）。結果は、ビオチンの高いモル入力比（例えば、８：１、１５：１、および３０：１）で調製したビオチン−ＢＳＡは低い安定性を示すが、ＢＳＡに対するビオチン試薬のモル入力比が３０：１から４：１にまで低下するに伴い、安定性は４％から１００％まで改善することを示していた。したがって、支持体連結器に対するリガンドの比較的低い入力比を選択すること、そして固相に対してリガンド：：支持対連結器複合体を結合させることにより、リガンドとしてビオチンを有している従来の方法で調製された結合表面よりも安定な結合表面が生じる。
任意の入力比で調製されたリガンド：：支持体連結器複合体で（そして特に、支持体連結器に対するリガンドの高入力比で調製されたリガンド：：支持体連結器複合体で）支持体表面をコーティングすることにより不飽和である結合表面を作製することは、その調製後に、支持体表面上にそれがコーティングされる前に、リガンド：：支持体連結器複合体に対して適切な分散剤を付加することによってうまく進めることができる。この方法に適している分散剤は本明細書中で議論される。不飽和である表面を調製するためにＢＳＡに対するビオチンの低入力比で調製されたビオチン−ＢＳＡとともに適切な分散剤を使用するための説明が本明細書中に提供されるが、分散剤を使用する方法はビオチン化コーティングに限定されない。
固相支持体（例えば、マイクロ粒子）の凝集を防ぐために適切な分散剤を使用して不飽和である結合表面を作製するための方法が提供される。この方法は、マイクロ粒子の比較的分散性のある（例えば、ほぼ単分散である）調製物が所望されるという観察に少なくとも一部基づく。
この方法は、マイクロ粒子の凝集が起こり得る場合、例えば、リガンドがビオチンであり、ビオチンがＳＡでコーティングされる場合に使用することができる。分散方法は、リガンド結合基が少なくとも２価である場合、すなわち、１つの少なくとも２価であるビオチン結合部分（例えば、ＳＡ）が、別のマイクロ粒子上にあるビオチン−ＢＳＡ分子のビオチンと１つのマイクロ粒子上のビオチン−ＢＳＡ分子のビオチンを架橋することができる場合に、特に有用である。リガンド：：支持体連結器複合体がビオチン−ＢＳＡであり、リガンド結合基（ビオチン結合部分）がＳＡである場合の実施形態についての分散方法の説明が、以下、および実施例２において、本明細書中に提供される。しかし、先に説明されるように、この方法はビオチン／ＳＡ結合表面に限定されない。
分散剤（例えば、ブロックコポリマー）は、不飽和結合表面を作製するための方法において使用することができる。本明細書中に提供される説明においては、ブロックコポリマーは、２つ以上のビオチン結合ドメインを含む合成のまたは生物学的なビオチン結合部分（リガンド結合基）の付加の前に、合成のまたは生物学的なリガンド：：支持体連結器複合体でコーティングされたマイクロ粒子について分散剤として使用される。本明細書中に提供される説明においては、ブロックコポリマーＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８が使用される；しかし、この方法は、この説明の特定のブロックコポリマーに限定されない。
一般的には、図７は、２つ以上のビオチン結合ドメインを含む合成のまたは生物学的なビオチン結合部分（リガンド結合基）で、合成のまたは生物学的なビオチン化表面をコーティングすることを説明する。さらに具体的には、図７は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８でブロックされ、そしてＳＡの付加の前にＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の中に分散させられた、低入力比でビオチン化されたＢＳＡマイクロ粒子結合表面表上へのＳＡのコーティングを説明する。
本明細書中に提供される方法および組成物は、固相支持体表面についての不飽和コーティングを調製することにおいて使用することができる。この場合、コーティングには、支持体表面と結合したリガンド：：支持体連結器複合体、リガンド：：支持体表面連結器複合体のリガンドと結合したリガンド結合基（ビオチン結合部分）、そしてリガンド結合基と結合した捕捉部分（例えば、ビオチン化された捕捉部分）が含まれる。捕捉部分は、任意の目的の分子（例えば、分析物）の捕捉を容易にするように選択することができる。ビオチン／ＳＡシステムについての説明が、以下と、図８に提供されるが、本発明はビオチン／ＳＡシステムに限定されない。
不飽和結合表面は、支持体表面上に２つ以上のビオチン結合ドメインを含む、合成のまたは生物学的なリガンド結合基（ビオチン結合部分）の飽和量に満たない量を配向性を持たせて配置すること、そして結合させることによって設計することができる。この表面は、マイクロ粒子（例えば、ＰＭＰ）の表面上にＳＡの飽和量に満たない量を配向性を持たせて配置し、提供する例によって説明することができる。図８は、以下によって調製されたビオチンに結合するマイクロ粒子結合表面上にビオチン化された捕捉部分をコーティングすることによって作製された、不飽和であり配向性を持つ結合表面を説明する：（１）低入力比でビオチン化されたＢＳＡで表面をコーティングすること；（２）トリ−ブロックコポリマーＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８で表面をブロックすること；（３）（２つ以上のビオチン結合ドメインを含む合成のまたは生物学的なビオチン結合部分を付加する前に）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の中にマイクロ粒子を分散させること；そして、（４）ビオチン結合部分としてＳＡを付加すること。図８に示されるように、ＳＡでコーティングされたマイクロ粒子を使用して、例えば、以下のようなビオチン化された捕捉部分の飽和量に満たない量を配向性を持たせて配置し、そして／または捕捉するために使用することができる：（Ａ）抗体のＦａｂ断片（Ｉｇ Ｆｃ領域が存在しないことにより、非特異的結合の問題を減少させるか、または緩和することができる）；（Ｂ）免疫グロブリン（ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体）；ならびに（Ｃ、Ｄ、およびＥ）それぞれ、合成のものであるか生物学的なものであるかにはかかわらず、低分子、中分子、および／または高分子。
図８は、ビオチン／ＳＡシステムを使用する、不飽和である結合表面上のビオチン化された捕捉部分を説明する。マイクロ粒子の表面に共有結合した低入力比でビオチン化されたＢＳＡは、トリ−ブロックコポリマーＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８でブロックされ、マイクロ粒子はＳＡの付加の前にＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の中に分散させられ、ＳＡが付加され、その後、所望されるビオチン化された捕捉部分が、不飽和であるＳＡでコーティングされた表面に露出させられる。示されるビオチン化された捕捉部分の例としては、（図８の左から右に向かって：ビオチン化されたＦａｂ断片（約３０，０００ＤａのＭ．Ｗ．）、ビオチン化された抗体（ＩｇＧ、約１５０，０００ＤａのＭ．Ｗ．）；ビオチン化された低分子またはスペーサーアームを有しているビオチン化された低分子（例えば、約５，０００Ｄａ未満のＭ．Ｗ．）；ビオチン化された中分子または低分子用の担体としてのビオチン化された中分子（例えば、約５，０００Ｄａから約１５０，０００ＤａのＭ．Ｗ．）；および、ビオチン化された高分子（例えば、約１５０，０００Ｄａより大きいＭ．Ｗ．）が挙げられる。図８から見ることができるように、固相支持体の表面にあるビオチン−ＢＳＡの配向性と不飽和の性質は、不飽和であるＳＡでコーティングされた表面に反映され、不飽和である捕捉部分のコーティングにもまた反映される。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の疎水性の頭部基は、支持体表面と結合と結合した状態で示され、そしてＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の親水性テール基は、支持体表面から離れて伸びるように示される。
本発明の不飽和結合表面は、通常、市販されている結合表面よりも低い結合能力を有する。ビオチン／ＳＡシステムを使用する一例が提供される（表２、実施例２を参照のこと）。単位表面積あたりより少ない数のＳＡ分子でコーティングされた支持体は、本質的に、ビオチンに結合する能力が低いであろう。なぜなら、表面がより少ない数のビオチン結合部位を有しているからである。表面上に最大量に満たない量のＳＡ分子を提供することの目的は、大きなビオチン化された捕捉部分（例えば、ビオチン化抗体）に結合する個々のＳＡ分子の立体的自由度を改善すること、および個々のＳＡ分子の結合効率を改善することである。
実施例２は、結合能力が低いが、アッセイシグナルを大きくする、結合表面上に配向性を持つ、飽和量未満の分子を持たせること、それによって、親和性アッセイのためのより良好な、そしてより効率のよい結合表面が得られることを説明する。本発明のマイクロ粒子は、同様の、商業的に利用されている、従来の、または標準的な製品との比較においては結合能力の低下を示すが（例えば、表２を参照のこと）、高いアッセイ能力を示す（例えば、表３および表４を参照のこと）。より低いバックグラウンドと高いシグナル応答が原因である高いシグナル対ノイズ比は、高いアッセイ性能を反映する。全体的には、これらの結果は、本発明によって、市販されているＳＡでコーティングされたマイクロ粒子よりも低い結合能力を有しているが、マイクロ粒子表面上でのストレプトアビジンの配向性と立体的な接近性、そして新規の結合表面のブロッキングが原因で高いアッセイの性能を有している、ＳＡでコーティングされたマイクロ粒子の生産が可能となることをサポートする。
実施例３は、本発明の分散工程にしたがって作製したマイクロ粒子が、凝集物または塊を実質的に含まないマイクロ粒子の単分散物の集団を生じることを説明する。
図４は、ＳＡでコーティングされたマイクロ粒子の特異的な実施形態においては、本発明のマイクロ粒子が、従来の、または標準的なマイクロ粒子と比較して、ＳＡの不飽和である性質と配向性、高い表面ブロッキング、および改善された結合効率が原因で、さらに好ましいシグナル対ノイズ比の特徴を示すことを説明する。
実施例５は、本発明のマイクロ粒子を使用した非特異的結合の減少を説明する。本発明のマイクロ粒子における非特異的結合は、分析物が固相上のコーティングとの結合について優先性を有する、例えば、ＢＳＡについては、Ｔ３（トリヨードチロニン）およびＴ４（チロキシン）のような甲状腺ホルモンの優先性を有する場合は、アッセイにおいてさらに減少する。
実施例６は、支持体のコーティングのための本発明のプロセスが再現性があり信頼性があり、診断用の親和性アッセイについて望ましい特徴であることを確認実験を通じて立証する。
実施例７は、本発明のマイクロ粒子が、ＳＡでコーティングされたマイクロ粒子の特定の実施形態について、複数の検証のロットにおいて高い安定性を示したことを示す。実施例８は、本発明のマイクロ粒子の中のリガンドの脱落が問題ではないことを立証し、そして実施例９は、ＢＳＡの代わりにオボアルブミンを用いて作製した本発明の結合表面を示す。
議論のほとんど、および実施例の多くは、それに対して複合体形成させられたリガンドを有している支持体連結器で支持体表面をコーティングすることにより、不飽和である表面を作製することを記載する。ここでは、支持体連結器にはタンパク質が含まれ、不飽和であるか、または不飽和であり配向性を持つ結合表面は、様々な方法において本発明を使用して得ることができる。例えば、支持体連結器は、非タンパク質、例えば、ポリマーであり得る。ポリマーは、リガンドと反応し、複合体を形成するように官能化させることができるか、あるいは、ポリマー／リガンド対を、ポリマー上に自然に存在する官能基が特異的な条件設定のもとでリガンドの官能性と結合するであろうように選択することができる。ポリマー上の反応基または官能基の数は、いくつかの反応基を不活化させることによって制御することができ、それにより、ポリマー分子１個当たり結合させられるリガンドをより少なくすることができる。
ポリマー／リガンド複合体はまた、ポリマーを含まないリガンドで稀釈することができ、希釈された混合物は、不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ結合表面を作製するために支持体表面をコーティングするために使用することができる。１種類のポリマー、またはポリマーの混合物を使用することができる。
したがって、様々な実施形態においては、本発明には、ポリマーに結合させられたリガンドを含む、親和性アッセイのための結合表面を含む支持体が含まれる。ここでは、リガンドは、表面上で不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ。その後、リガンドを含む支持体を、本明細書中に記載される任意の適切な方法にしたがって処理することができる。様々な実施形態においては、表面には、リガンドが全く結合させられていないポリマーの混合物と、リガンドが結合させられたポリマーが含まれる。様々な実施形態においては、支持体はマイクロ粒子であり、結合表面はブロックコポリマーでブロックされ、アッセイは免疫測定法であり、そしてリガンドは、それ自体が捕捉部分（例えば、修飾されたかもしくは未修飾の免疫グロブリンまたはその断片）と結合することができる少なくとも２価のリガンド結合基に結合する。
特定の実施形態においては、リガンドは、支持体連結器を使用することなく支持体表面に直接結合させることができる。これらの実施形態においては、リガンドと反応させることができる官能基を有している支持体表面が、リガンドを支持体に結合させるために十分な条件下でリガンドと接触させられる。様々な実施形態においては、結合は、活性化されたリガンドと、これもまた活性化させることができる支持体表面との間での共有結合である。リガンドの不飽和は、支持体表面に結合するリガンドの数を制御することによって行うことができる。様々な実施形態においては、支持体表面には、所定の条件設定のもとでリガンドと反応することができる複数の官能基が含まれる。支持体表面は、反応条件を操作するか、または支持体表面上の官能基の数を減少させる薬剤を添加するかのいずれかによって、リガンドと反応することができる官能基の数が少なくなるような様式で処理することができる。その後、リガンドを含む支持体表面を、本明細書中に記載される任意の適切な方法にしたがって処理することができる。
したがって、本発明によってはまた、リガンドでコーティングされた支持体表面も提供される。この場合、リガンドは、支持体表面の表面上では不飽和である。様々な実施形態においては、結合表面は、ブロックコポリマーでブロックされ、アッセイは免疫測定法であり、そしてリガンドは、それ自体が捕捉部分（例えば、修飾されたかもしくは未修飾の免疫グロブリンまたはその断片）と結合できる少なくとも２価のリガンド結合基に結合する。様々な実施形態においては、支持体表面上のリガンドの密度は、支持体連結器に結合させられたリガンドを記載している実施形態について本明細書中で記載された範囲内である。任意の適切なリガンド（例えば、免疫グロブリンまたはその断片、オリゴヌクレオチド、およびレクチン）を、支持体表面に直接結合させるために使用できる。他の実施形態においてそうであるように、リガンドにはリンカーが含まれ得、そしてリンカーを支持体表面に結合させることができる。
本発明は、マイクロ粒子（例えば、ＰＭＰ）の表面上にＳＡのようなリガンドの飽和量に満たない量を配向性を持たせて配置し、そして結合させるために提供される。市販されているビオチン結合表面（例えば、Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１、およびＤＹＮＡＢＥＡＤＳ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）は、最大のビオチン結合能力を有するように設計される。市販されているビオチン結合表面は、通常、マイクロ粒子の表面上にＳＡまたは他のビオチン結合分子を直接コーティングすることによって生産することができる。対照的に、本発明によっては、低入力比でビオチン化されたＢＳＡでマイクロ粒子をコーティングするため、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８でビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をブロッキングするため、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の中にブロックされたビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子を分散させるため、最後に、ＳＡでビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をコーティングするために提供される。
本発明のマイクロ粒子は、不飽和であること、および配向性、高い表面ブロッキング、そして改善された結合効率が原因で、より好ましいシグナル対ノイズ比の特徴を示す。これは、実施例で示されるように、ＳＡでコーティングされた低入力比でビオチン化されたＢＳＡマイクロ粒子について示される。
本発明の方法および組成物は、当該分野で公知の任意の適切なアッセイ（例えば、任意の適切な親和性アッセイ）または当該分野で公知の免疫測定法（不飽和であるかまたは不飽和であり配向性を持つ表面を有利であるように使用できる場合）（タンパク質−タンパク質親和性アッセイ、タンパク質−リガンド親和性アッセイ、核酸親和性アッセイ、間接的な蛍光抗体アッセイ（ＩＦＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、および酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、直接もしくは間接的なアッセイ、競合アッセイ、サンドイッチアッセイなどを含むがこれらに限定されない）と組み合わせて使用できる。適切なアッセイ形式としては、本明細書中の実施例において使用されるアッセイおよび形式が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の方法および組成物は、当該分野で公知の任意の支持体（例えば、適切な固体支持体）と組み合わせて使用することができる。そのような固相支持体の例が議論されるが、本発明は説明のために議論される支持体に限定されない。例えば、固相支持体は、粒子状の支持体、マイクロ粒子、ポリスチレンマイクロ粒子、マイクロタイタープレート、コーティングされたチューブなどに限定されない。他の固相支持体もまた本発明とともに使用することができ、これには、親和性アッセイと組み合わせて使用される当該分野で公知の任意の支持体が含まれるが、これらに限定されない。例えば、マイラーが裏打ちされた（ｍｙｌａｒ−ｂａｃｋｅｄ）ニトロセルロース、および／またはナイロンを含む固相支持体を使用することができる。例えば、フィルターまたは膜を含む固相支持体を使用することができる。微小管、ナノ粒子、またはナノチューブ（例えば、カーボンナノチューブ）を含む固相支持体を使用することができる。固相支持体には、任意の大きさのマイクロ粒子が含まれ得、大きな平面的な表面積を有している固相支持体を使用することができる。
本発明の方法および組成物は、シグナル対ノイズ比の改善が所望される任意のアッセイと組み合わせて使用することができる。例えば、不飽和であり、適切なブロックコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））で処理された本発明の結合表面は、側方流動アッセイおよび／または拡散アッセイに使用される平面的な、または実質的に平面的な固相支持体の上に調製することができる。側方流動アッセイの一例は、試料が結合表面上に配置され（固定される場合も、固定されない場合もある）、そして液相中の１つ以上の分析用の試薬が試料の上に通過させられ（拡散アッセイにおいては、表面全体への拡散による）、そして分析物が、液相の中の試薬と接触した場合には適切なシグナルによって検出され、そして／または定量される場合である。側方流動アッセイの別の例は、１つ以上の分析用の試薬が結合表面上に配置され（固定される場合も、固定されない場合もある）、そして液相中の試料が１つ以上の分析用の試薬の上に通過させられ（拡散アッセイにおいては、表面全体への拡散による）、そして試料中の分析物が、結合表面上の１つ以上の分析試薬と接触した場合には適切なシグナルによって検出される、そして／または定量される場合である。側方流動アッセイの別の例は、本発明に従う不飽和結合表面を含む検査である。側方流動および／または拡散アッセイは、平面的な支持体の１つの結合表面を越えて液体が移動することを制限しない；そのようなアッセイには、膜またはフィルターを通り抜ける液体の移動が含まれ、この場合、膜またはフィルターには不飽和結合表面が含まれる。したがって、様々な実施形態においては、側方流動アッセイのため、および／または拡散アッセイのための結合表面が提供され、さらに、本明細書中に記載される任意の実施形態にしたがって、側方流動アッセイおよび／または拡散アッセイのための結合表面を作製するための方法と組成物が提供される。
別の態様においては、免疫測定法における本明細書中に記載される任意の方法および組成物の使用が提供される。様々な実施形態においては、支持体連結器と結合した支持体およびリガンド上に配置された複数の支持体連結器を含む不飽和結合表面を有している支持体の免疫測定法における使用が提供される。ここでは、リガンドは不飽和であり、そして立体的に接近可能なリガンドを提供する様式で表面上に配向性を持たせられる。特異的な実施形態においては、ビオチン化されたタンパク質を含む結合表面（リガンド：：支持体結合体複合体）、アビジン、ＳＡ、ニュートラアビジン、ＳＡの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはビオチン化されたタンパク質のビオチン部分と結合したそれらの混合物から選択される少なくとも２価のビオチン結合部分と、少なくとも２価のビオチン結合部分（リガンド結合基）と結合したビオチン化された免疫グロブリンまたはその断片（ビオチン化された捕捉部分）を有しているマイクロ粒子が、試料中の目的の分析物（例えば、抗原）の免疫測定法に使用される。別の実施形態においては、ビオチン化されたタンパク質のビオチン部分と結合させられる少なくとも２価のビオチン結合部分が、ビオチン化された抗原またはその断片（ビオチン化された捕捉部分）と結合させられ、そしてマイクロ粒子が、試料中の目的の分析物（例えば、抗体）についての免疫測定法に使用される。免疫測定法に使用される組成物の特徴と、組成物を作製する方法には、本明細書中に記載される特徴のうちのいずれか（例えば、表面の構成成分の密度を記載する特異的な実施形態を含む）が含まれる。
本発明の方法、組成物、およびキットは、任意の適切な免疫測定法システムとともに使用されるように適応させることができる。適切な免疫測定法システムの例としては、Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）２ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｙｎｃｈｒｏｎ ＬＸｉ（登録商標）７２５ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ、ＵｎｉＣｅｌ（登録商標）ＤｘＩ ８００ Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、ＩＭＭＡＧＥ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（全てＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．による）、およびＴｒｉａｇｅ（登録商標）システム（Ｂｉｏｓｉｔｅ，Ｉｎｃ．）が挙げられるが、これらに限定されない。１つの適切な免疫測定法アレイシステムは、Ａ２（登録商標）Ｍｉｃｒｏａｓｓａｙシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）である。
それについての親和性アッセイが設計される用途に応じて、分析物結合基（捕捉部分）と分析物からなる結合対のメンバーのうちの１つ、あるいは他のメンバーとして機能する可能性がある物質の限定ではないリストが、以下に項目別に示される。そのような物質は、例えば、捕捉部分（分析物結合基）として使用することができ、また、本発明とともに使用することができる捕捉部分を作製するために（例えば、特異的な抗体を作製するためのハプテン／抗原としてそれらを使用することによって）使用することもできる。親和性アッセイ（免疫測定法を含む）は、それらが試料中の分析物である場合には、そのような物質の存在および／またはレベルを検出するために、本発明にしたがって設計することができる。特異的な実施形態においては、本発明の分析物に結合する捕捉部分は、以下の様式で試料中の分析物としてこれらの物質を検出するために使用することができる：捕捉部分は、本発明にしたがってＳＡでコーティングされた固相支持体表面で（例えば、低入力比でビオチン化されたＢＳＡコーティングを用いて、それらの上にＳＡで）ビオチン化させ、それと結合させることができ、そのような物質を捕捉するために使用することができる。あるいは、以下に列挙される物質は、本発明にしたがってＳＡでコーティングされた固相支持体表面でビオチン化することができ、そしてそれと結合させることができ、そしてそれらと相互作用する分子（例えば、列挙される物質、結合タンパク質、または酵素に特異的な抗体あるいはそれらの断片）を捕捉するために使用することができる。
分析物結合基（捕捉部分）と分析物からなる結合対のメンバーの一方、あるいは他方として機能し得る物質の限定ではないリストには以下が含まれる：誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、ＣＡ１９−９、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−ｔ、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ｓＩＬ−２Ｒ、ＳＩＬ−４Ｒ、ｓＩＬ−６Ｒ、ＳＩＶコア抗原、ＩＬ−１ＲＡ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ；ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）のイソ型（例えば、ＰＳＡ、ｐＰＳＡ、ＢＰＳＡ、ｉｎＰＳＡ、非−α１−抗キモトリプシン複合体化ＰＳＡ、α１−抗キモトリプシン複合体化ＰＳＡ）、前立腺カリクレイン（例えば、ｈＫ２、ｈＫ４、およびｈＫ１５、ｅｋ−ｒｈＫ２、Ａｌａ−ｒｈＫ２、ＴＷＴ−ｒｈＫ２、Ｘａ−ｒｈＫ２、ＨＷＴ−ｒｈＫ２、および他のカリクレイン）；ＨＩＶ−１ ｐ２４；フェリチン、Ｌフェリチン、トロポニンＩ、ＢＮＰ、レプチン、ジゴキシン、ミオグロビン、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチドまたは脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）；ヒト成長ホルモン、骨アルカリホスファターゼ、ヒト卵胞刺激ホルモン、ヒト黄体ホルモン、プロラクチン；ヒト絨毛性ゴナドトロピン（例えば、ＣＧα、ＣＧβ）；サイログロブリン；抗サイログロブリン；ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ防御抗原、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ致死因子、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子抗原（ｓｐｏｒｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ＬＰＳ、Ｓ．ａｕｒｅａｓエンテロトキシンＢ、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ莢膜Ｆ１抗原、インシュリン、αフェトプロテイン（例えば、ＡＦＰ３００）、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ １５．３抗原、ＣＡ １９．９抗原、ＣＡ １２５抗原、ＨＡＶ Ａｂ、ＨＡＶ Ｉｇｍ、ＨＢｃ Ａｂ、ＨＢｃ Ｉｇｍ、ＨＩＶ１／２、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｂ、ＨＣＶ Ａｂ、抗ｐ５３、ヒスタミン；ネオプテリン；ｓ−ＶＣＡＭ−１、セロトニン、ｓＦａｓ、ｓＦａｓリガンド、ｓＧＭ−ＣＳＦＲ、ｓ１ＣＡＭ−１、チミジンキナーゼ、ＩｇＥ、ＥＰＯ、内性因子Ａｂ、ハプトグロビン、抗カルジオリピン、抗ｄｓＤＮＡ、抗Ｒｏ、Ｒｏ、抗Ｌａ、抗ＳＭ、ＳＭ、抗ｎＲＮＰ、抗ヒストン抗体、抗Ｓｃｌ−７０、Ｓｃｌ−７０、抗核抗体、抗セントロメア抗体、ＳＳ−Ａ、ＳＳ−Ｂ、Ｓｍ、Ｕ１−ＲＮＰ、Ｊｏ−１、ＣＫ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＲＰ、虚血によって修飾されるアルブミン（ｉｓｃｈｅｍｉａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｌｂｕｍｉｎ）、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ｏｘＬＤＬ、ＶＬＤＬ、トロポニンＴ、トロポニンＩ、ミクロアルブミン、アミラーゼ、ＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、プレアルブミン、抗ストレプトリジン、クラミジア、ＣＭＶ ＩｇＧ、ｔｏｘｏ ＩｇＧ、ｔｏｘｏ ＩｇＭ、アポリポタンパク質Ａ、アポリポタンパク質Ｂ、Ｃ３、Ｃ４、プロペルジン因子Ｂ、アルブミン、α１−酸糖タンパク質、α１−抗トリプシン、α１−ミクログロブリン、α２−マクログロブリン、抗ストレプトリジンＯ、抗トロンビン−ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ａ１、アポリポタンパク質Ｂ、β２−ミクログロブリン、セルロプラスミン、補体第３成分（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ３）、補体第４成分、Ｃ反応性タンパク質、ＤＮａｓｅ Ｂ、フェリチン、遊離のκ軽鎖、遊離のλ軽鎖、ハプトグロビン、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＡ（ＣＳＦ）、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＧ（ＣＳＦ）、免疫グロブリンＧ（尿）、免疫グロブリンＧサブクラス、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンＭ（ＣＳＦ）、κ軽鎖、λ軽鎖、リポタンパク質（ａ）、ミクロアルブミン、プレアルブミン、プロペルジン因子Ｂ、リウマチ因子、フェリチン、トランスフェリン、トランスフェリン（尿）、風疹ＩｇＧ、サイログロブリン抗体、トキソプラズマＩｇＭ、トキソプラズマＩｇＧ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）−３、ヘプシン（ｈｅｐｓｉｎ）、ｐｉｍ−１キナーゼ、Ｅ−カドヘリン、ＥＺＨ２、およびａ−メチルアシル−ＣｏＡラセミ化酵素、ＴＧＦ−β、ＩＬ６ＳＲ、ＧＡＤ、ＩＡ−２、ＣＤ−６４、好中球ＣＤ−６４、ＣＤ−２０、ＣＤ−３３、ＣＤ−５２、チトクロームＰ４５０のイソ型、ｓ−ＶＣＡＭ−１、ｓＦａｓ、ｓＩＣＡＭ、Ｂ型肝炎表面抗原、トロンボプラスチン、ＨＩＶ ｐ２４、ＨＩＶ ｇｐ４１／１２０、ＨＣＶ Ｃ２２、ＨＣＶ Ｃ３３、ヘモグロビンＡ１ｃ、およびＧＡＤ６５、ＩＡ２。
それについての親和性アッセイが設計される用途に応じた、分析物結合基（捕捉部分）と分析物からなる結合対の一方、あるいは他方のメンバーとして作用し得、そして本発明とともに使用することができる適切な物質には、ＷＨＯ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（当該分野で周知の物質を列挙する、２００５年６月３０日に更新されたｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｂｌｏｏｄｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｒｅ＿ｍａｔｅｒｉａｌｓで入手することができる；このリストは引用により本明細書中に組み入れられる）によって維持され、そして特性決定され、そして／または分け与えられる任意のＷＨＯ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓに特異的な部分（例えば、抗体またはその断片）も含まれる。
物質の後ろの括弧書きのＷＨＯコードによって特定されるそのような適切な国際的な参照標準物の部分的なリストには以下が含まれる：ヒト組み換え体トロンボプラスチン（ｒＴＦ／９５）、ウサギトロンボプラスチン（ＲＢＴ／９０）、甲状腺刺激抗体（９０／６７２）、組み換え体ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（９８／７１４）、高分子量のウロキナーゼ（８７／５９４）、前立腺特異的抗原（９６／６６８）、前立腺特異的抗原９０：１０（９６／７００）；ヒト血漿タンパク質Ｃ（８６／６２２）、ヒト血漿タンパク質Ｓ（９３／５９０）、関節リウマチ血清（Ｗ１０６６）、血清アミロイドＡタンパク質（９２／６８０）、ストレプトキナーゼ（００／４６４）、ヒトトロンビン（０１／５８０）、ウシ結合トロンボプラスチン（ｂｏｖｉｎｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ）（ＯＢＴ／７９）、抗Ｄポジティブ対照静脈内免疫グロブリン（０２／２２８）、島細胞抗体（９７／５５０）、リポタンパク質ａ（ＩＦＣＣ ＳＲＭ ２Ｂ）、ヒトパルボウイルスＢ１９ ＤＮＡ（９９／８００）、ヒトプラスミン（９７／５３６）、ヒトプラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（９２／６５４）、血小板因子４（８３／５０５）、プレカリクレイン活性化因子（８２／５３０）、ヒト脳ＣＪＤ対照およびヒト脳の散発性ＣＪＤ調製物１およびヒトの脳の散発性ＣＪＤ調製物２およびヒトの脳の変異体ＣＪＤ（注釈；それぞれ、ＷＨＯ ＴＲＳ ＥＣＢＳ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏ．９２６、第５３版Ｒｅｐｏｒｔ、脳ホモジネートの中に記載されている）、ヒト血清補体成分Ｃ１ｑ、Ｃ４、Ｃ５、Ｂ因子、および完全な機能的補体ＣＨ５０（Ｗ１０３２）、ヒト血清免疫グロブリンＥ（７５／５０２）、ヒト血清免疫グロブリンＧ、Ａ、およびＭ（６７／８６）、ヒト血清タンパク質アルブミン、α−１−抗トリプシン、α−２−マクログロブリン、セルロプラスミン、補体第３成分、トランスフェリン（Ｗ１０３１）、抗−Ｄ陰性対照静脈内免疫グロブリン（０２／２２６）、Ａ型肝炎ＲＮＡ（００／５６０）、Ｂ型肝炎表面抗原サブタイプａｄｗ２遺伝子型Ａ（０３／２６２および００／５８８）、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ（９７／７４６）、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡ（９６／７９８）、ＨＩＶ−１ ｐ２４抗原（９０／６３６）、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ（９７／６５６）、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ遺伝子型（１０ Ｉ０１／４６６のセット）、ヒトフィブリノーゲン濃縮物（９８／６１４）、ヒト血漿フィブリノーゲン（９８／６１２）、惹起させられたＡ２ヘモグロビン（８９／６６６）、惹起させられたＦヘモグロビン（８５／６１６）、ヘモグロビンシアニド（９８／７０８）、低分子量のヘパリン（８５／６００および９０／６８６）、未分画のへパリン（９７／５７８）、血液凝固因子ＶＩＩＩおよびフォン・ヴィレブランド因子（０２／１５０）、ヒト血液凝固因子ＶＩＩＩ濃縮物（９９／６７８）、ヒト血液凝固因子ＸＩＩＩ血漿（０２／２０６）、ヒト血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ（９９／８２６）、ヒト血液凝固因子ＩｌおよびＸ濃縮物（９８／５９０）、ヒトガン胎児性抗原（７３／６０１）、ヒトＣ反応性タンパク質（８５／５０６）、組み換え体ヒトフェリチン（９４／５７２）、アポリポタンパク質Ｂ（ＳＰ３−０７）、β−２−ミクログロビン（Ｂ２Ｍ）、ヒトβ−トロンボグロビン（８３／５０１）、ヒト血液凝固因子ＩＸ濃縮物（９６／８５４）、ヒト血液凝固因子ＩＸａ濃縮物（９７／５６２）、ヒト血液凝固因子Ｖ Ｌｅｉｄｅｎ、ヒトｇＤＮＡ試料ＦＶ野生型、ＦＶＬホモ接合型、ＦＶＬヘテロ接合型（０３／２５４、０３／２６０、０３／２４８）、ヒト血液凝固因子ＶＩＩ濃縮物（９７／５９２）、ヒト血液凝固因子ＶＩＩａ濃縮物（８９／６８８）、ヒト抗梅毒血清（ＨＳ）、ヒト抗破傷風免疫グロブリン（ＴＥ−３）、ヒト抗トロンビン濃縮物（９６／５２０）、ヒト血漿抗トロンビン（９３／７６８）、ヒト抗サイログロブリン血清（６５／９３）、抗トキソプラズマ血清（ＴＯＸＭ）、ヒト抗トキソプラズマ血清（ＩｇＧ）（０１／６００）、ヒト抗帯状疱疹ヘルペス免疫グロブリン（Ｗ１０４４）、アポリポタンパク質Ａ−１（ＳＰ１−０１）、ヒト抗インターフェロンβ血清（Ｇ０３８−５０１−５７２）、ヒト抗麻疹血清（６６／２０２）、抗核リボヌクレオタンパク質血清（Ｗ１０６３）、抗核因子（同種）血清（６６／２３３）、抗パルボウイルスＢ１９（ＩｇＧ）血清（９１／６０２）、抗ポリオウイルス血清１型、２型、３型（６６／２０２）、ヒト抗狂犬病免疫グロブリン（ＲＡＩ）、ヒト抗風疹免疫グロブリン（ＲＵＢＩ−１−９４）、抗平滑筋血清（Ｗ１０６２）、ヒト抗二本鎖ＤＮＡ血清（Ｗｏ／８０）、ヒト抗Ｅ完全血液型血清（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−Ｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｂｌｏｏｄ−ｔｙｐｉｎｇ ｓｅｒｕｍ）（Ｗ１００５）、ヒト抗エキノコックス血清（ＥＣＨＳ）、ヒト抗Ａ型肝炎免疫グロブリン（９７／６４６）、ヒト抗Ｂ型肝炎免疫グロブリン（Ｗ１０４２）、ヒト抗Ｅ型肝炎血清（９５／５８４）、抗ヒト血小板抗原−１ａ（９３／７１０）、抗ヒト血小板抗原５ｂ（９９／６６６）、ヒト抗インターフェロンα血清（Ｂ０３７−５０１−５７２）、ヒトαフェトタンパク質（ＡＦＰ）、アンクロッド（ａｎｃｒｏｄ）（７４／５８１）、ヒト抗Ａ型血液血清（Ｗ１００１）、ヒト抗Ｂ型血液血清（Ｗ１００２）、ヒト抗Ｃ全血液型血清（Ｗ１００４）、抗Ｄ（抗Ｒｈ０）全血液型試薬（９９／８３６）、ヒト抗Ｄ（抗Ｒｈ０）不完全血液型血清（Ｗ１００６）、およびヒト抗Ｄ免疫グロブリン（０１／５７２）。
それについての親和性アッセイが設計される用途に応じて、分析物結合基（捕捉部分）と分析物からなる結合対の１つあるいは他のメンバーとして機能し得る適切な物質の他の例には、化合物を認識することができる抗体を作製するためのハプテンとして使用することができる化合物が含まれ、これには、以下からなる任意の塩、エステル、またはエーテルが含まれるがこれらに限定されない：ホルモン（プロゲステロン、エストロゲン、およびテストステロン、プロゲスチン、コルチコステロイド、およびデヒドロエピアンドロステロンを含むがこれらに限定されない）ならびに、ＷＨＯによって国際的な参照基準として列挙されている任意の非タンパク質／非ポリペプチド抗原。物質の後ろに括弧書きされたＷＨＯコードによって特定される、そのような適切な国際的な参照基準の部分的なリストには以下が含まれる：ビタミンＢ１２（ＷＨＯ８１．５６３）、葉酸（ＷＨＯ９５／５２８）、ホモシステイン、トランスコバラミン、Ｔ４／Ｔ３、および引用により本明細書中に組み入れられるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓのＷＨＯカタログ（ＷＨＯウェブサイト、例えば、２００５年６月３０日に更新されたページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｂｌｏｏｄｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｒｅｆ＿ｍａｔｅｒｉａｌｓ／で入手することができる）に開示されている他の物質。本明細書中に記載される方法および組成物には、上記のＷＨＯ参照標準物または参照標準物を含む混合物の１つ以上が含まれ得る。
少なくとも１つの実施形態においては、本発明により、２つ以上の様々な捕捉部分を有している結合表面が提供される。
それについての親和性アッセイが設計される用途に応じて、分析物結合基（捕捉部分）と分析物からなる結合対の１つの、あるいは他のメンバーとして作用し得る物質の他の例としては、薬物の乱用（ｄｒｕｇｓ ｏｆ ａｂｕｓｅ）が挙げられる。薬物の乱用には、例えば、薬物とそれらの代謝物（例えば、血液中、尿中、および他の生物学的物質の中に存在する代謝物、ならびにそれらの任意の塩、エステル、またはエーテル）の以下のリストが挙げられる：ヘロイン、モルヒネ、ヒドロモルフォン、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、フェンタニル、デメロール、メタドン、ダルフォン、スタドール、タルウィン、パレゴリック、ブプレネックス；覚醒剤、例えば、アンフェタミン、メタンフェタモン；メチルアンフェタミン、エチルアンフェタミン、メチルフェニデート、エフェドリン、シュードエフェドリン、エフェドラ、マ・フアン（ｍａ ｈｕａｎｇ）、メチレンジオキシアンフェタミン（ＭＤＳ）、フェンタミン（ｐｈｅｎｔｅｒｍｉｎｅ）、フェニルプロパノールアミン；アミフェナゾール、ベミグリド、ベンズフェタミン、ブロマタン、クロロフェンタミン（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｔｅｒｍｉｎｅ）、クロプロパミド、クロテタミド（ｃｒｏｔｈｅｔａｍｉｄｅ）、ジエチルプロピオン、ジメチルアンフェタミン、ドキサプラン、エタミバン、フェンカムファミン（ｆｅｎｃａｍｆａｍｉｎｅ）、メクロフェノキサート、メチルフェニデート、ニケタミド、ペモリン、ペンテトラゾール、フェンジメトラジン、フェンメトラジン、フェンテルミン（ｐｈｅｎｔｅｒｍｉｎｅ）、フェニルプロパノールアミン、ピクロトキシン、ピプラドール、プロリンタン、ストリキニーネ、シネフリン、フェンシクリジンおよびアナログ、例えば、エンジェルダスト（ａｎｇｅｌ ｄｕｓｔ）、ＰＣＰ、ケタミン；抑制剤、例えば、バルビツール酸誘導体、グルテチミド（ｇｌｕｔｈｅｔｈｉｍｉｄｅ）、メタカロン、およびメプロバメート、メトヘキシタール、チアミル、チオペンタール、アモバルビタール、ペントバルビタール、セコバルビタール、ブトアルビタール、ブトアバルビタール、タルブタール、およびアプロバルビタール、フェノバルビタール、メフォバルビタール；ベンゾジアゼピン、例えば、エスタゾラン、フラゼパム、テマゼパム、トリアゾラム、ミダゾラム、アルプラゾラム、クロルジアゼポキシド、クロアゼブ酸塩、ジアゼパム、ハラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、プラゼパム、キアゼパム、クロナゼパム、フルニトラゼパム；ＧＢＨ薬、例えば、ガンマヒドロキシル酪酸およびガンマブチロラクトン；グルテチミド、メタクアロン（ｍｅｔｈａｑｕａｌｏｎｅ）、メプロバメート、カリソプロドール、ゾルピデム、ザレプロン；カンナビノイド薬、例えば、テトラヒドロカンナビノールおよびアナログ；コカイン、３−４メチレンジオキシメタンフェタミン（ＭＤＭＡ）；ハルシノジェン、例えば、メスカリンおよびＬＳＤ。
それについての親和性アッセイが設計される用途に応じて、分析物結合基（捕捉部分）と分析物からなる結合対の１つの、あるいは他のメンバーとして作用し得る物質の他の例としては、認められている市場において一般的にめぐり合えるもの、または、性能向上補助剤（ｅｒｇｏｇｅｎｉｃ ａｉｄ）として使用されるもの）を含む、性能の強化に関係があるステロイドおよび他の薬物が挙げられ、例えば、以下の化合物、およびそれらの任意の塩、エステル、またはエーテルが含まれる：テストステロン（例えば、エナント酸塩、シピオン酸塩、およびプロピオン酸塩のような部分とのそのエステルを含む）、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、テトラヒドロゲストリノン、ナンドロロン、ノルテストステロン、メテノロン、スタノゾロール、メタンドロステノロン、メタンジエノン、アンドロステンジオン（例えば、５ａ−アンドロスタン−３、１７−ジオン）、アンドロステンジオール、例えば、１−アンドロステンジオール（３β，１７β−ジヒドロキシ−５α−アンロドスト−１−エン；）、４−アンドロステンジオール（３ｂ，１７ｂ−ジヒドロキシ−アンドロスト−４−エン）、５−アンドロステンジオール（３ｂ，１７ｂ−ジヒドロキシ−アンドロスト−５−エン）、アンドロステンジオン、例えば、１−アンドロステンジオン（［５ａ］−アンドロスト−１−エン−３，１７−ジオン）、４−アンドロステンジオン（アンドロスト−４−エン−３，１７−ジオン）、５−アンドロステンジオン（アンドロスト−５−エン−３，１７−ジオン）、ノルアンドロステンジオン、１９−ノルアンドロステンジオール、１９−ノルアンドロステンジオン、ノルアンドロステンジオール、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、ボルデノン、フルオキシメステロン、メタンドリオール、メチルテストステロン、オキサドロロン、オキシメトロン、トレンボロン、クロステボール、デヒドロクロロメチルテストステロン、ドロモスタノロン、エピトレンボロン、ゲストリノン、メステロロン、メタンジエノン、メテノロン、ノルエタンドロロン、オキサドロロン、オキシメトロン、テトラヒドロゲストリノン（ＴＨＧ）、トレンボロン、クレンブトロール、および以下を含む、Ａｎａｂｏｌｉｃ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ａｃｔ ｏｆ ２００４（引用により本明細書中に組み入れられる）に含まれているステロイド：３ｂ，１７ｂ−ジヒドロキシ−５ａ−アンドロスタン；３ａ，１７ｂ−ジヒドロキシ−５ａ−アンドロスタン；アンドロスタンジオン，ボラステロン（７ａ，１７ａ−ジメチル−１７ｂ−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−３−オン）、ボルデノン（１７ｂ−ヒドロキシアンドロスト−１，４−ジエン−３−オン）、カルステロン（７ｂ，１７ａ−ジメチル−１７ｂ−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−３−オン）、クロステボール（４−クロロ−１７ｂ−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−３−オン）、デヒドロクロロメチルテストステロン（４−クロロ−１７ｂ−ヒドロキシ−１７ａ−メチル−アンドロスト−１，４−ジエン−３−オン）、４−ジヒドロテストステロン（１７ｂ−ヒドロキシ−アンドロスタン−３−オン）、ドロスタノロン（１７ｂ−ヒドロキシ−２ａ−メチル−５ａ−アンドロスタン−３−オン）、エチルエストレノール（１７ａ−エチル−１７ｂ−ヒドロキシエルテル−４−エン）、フルオキシメステロン（９−フルオロ−１７ａ−メチル−１１ｂ，１７ｂ−ジヒドロキシアンドロスト−４−エン−３−オン）、ホルメボロン（２−ホルミル−１７ａ−メチル−１１ａ，１７ｂ−ジヒドロキシアンドロスト−１，４−ジエン−３−オン）、フラザボール（１７ａ−メチル−１７ｂ−ヒドロキシアンドロスタノ［２，３−ｃ］−フラザン）、１８ａ−ホモ−１７ｂ−ヒドロキシエルテル−４−エン−３−オン（１３ｂ−エチル−１７ｂ−ヒドロキシゴン−４−エン−３−オン）、４−ヒドロキシテストステロン（４，１７ｂ−ジヒドロキシ−アンドロスト−４−エン−３−オン）、４−ヒドロキシ−１９−ノルテストステロン（４，１７ｂ−ジヒドロキシ−エステル−４−エン−３−オン）、エスタノロン（１７ａ−メチル−１７ｂ−ヒドロキシ−５ａ−アンドロスタン−３−オン）、メステロロン（１ａ−メチル−１７ｂ−ヒドロキシ−［５ａ］−アンドロスタン−３−オン）、メタンジエノン（１７ａ−メチル−１７ｂ−ヒドロキシアンドロスト−１，４−ジエン−３−オン）、メタンドリオール（１７ａ−メチル−３ｂ，１７ｂ−ジヒドロキシアンドロスト−５−エン）、メテノロン（１−メチル−１７ｂ−ヒドロキシ−５ａ−アンドロスト−１−エン−３−オン）、エチルテストステロン（１７ａ−メチル−１７ｂ−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−３−オン）、ミボレロン（７ａ，１７ａ−ジメチル−１７ｂ−ヒドロキシエルテル−４−エン−３−オン）、ナンドロロン（１７ｂ−ヒドロキシエルテル−４−エン−３−オン）、ノルアンドロステンジオール、１９−ノル−４−アンドロステンジオール（３ｂ，１７ｂ−ジヒドロキシエステル−４−エン）、１９−ノル−４−アンドロステンジオール（３ａ，１７ｂ−ジヒドロキシエステル−４−エン）、１９−ノル−５−アンドロステンジオール（３ｂ，１７ｂ−ジヒドロキシエステル−５−エン）、１９−ノル−５−アンドロステンジオール（３ａ，１７ｂ−ジヒドロキシエステル−５−エン）、ノルアンドロステンジオン、１９−ノル−４−アンドロステンジオン（エステル−４−エン−３，１７−ジオン）、１９−ノル−５−アンドロステンジオン（エステル−５−エン−３，１７−ジオン）、ノルボレトン（１８ａ−ホモ−１７ｂ−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−オン）、ノルクロステボール（４−クロロ−１７ｂ−ヒドロキシエルテル−４−エン−３−オン）、ノルエタンドロロン（１７ａ−エチル−１７ｂ−ヒドロキシエルテル−４−エン−３−オン）、オキサドロロン（１７ａ−メチル−１７ｂ−ヒドロキシ−２−オキサ−［５ａ］−アンドロスタン−３−オン）、オキシメステロン（１７ａ−メチル−４，１７ｂ−ジヒドロキシアンドロスト−４−エン−３−オン）、オキシメトロン（１７ａ−メチル−２−ヒドロキシメチレン−１７ｂ−ヒドロキシ−［５ａ］−アンドロスタン−３−オン）、スタノゾロール（１７ａ−メチル−１７ｂ−ヒドロキシ−［５ａ］−アンドロスト−２−エノ［３，２−ｃ］−ピラゾール）、ステンボロン（１７ｂ−ヒドロキシ−２−メチル−［５ａ］−アンドロスト−１−エン−３−オン）、テストラクトン（１３−ヒドロキシ−３−オキソ−１３，１７−セコアンドロスタ−１，４−ジエノ−１７−イック酸ラクトン）、１−テストステロン（１７ｂ−ヒドロキシ−５ａ−アンドロスト−１−エン−３−オン）、テストステロン（１７ｂ−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−３−オン）、テトラヒドロゲストリノン（１３ｂ，１７ａ−ジエチル−１７ｂ−ヒドロキシゴン−４，９，１１−トリエン−３−オン）、トレンボロン（１７ｂ−ヒドロキシエルテル−４，９，１１−トリエン−３−オン）。
それについての親和性アッセイが設計される用途に応じて、分析物結合基（捕捉部分）と分析物からなる結合対の１つの、あるいは他のメンバーとして作用し得る物質の他の例としては、抗生物質、および動物（ヒトを含む）に投与される他の薬物が挙げられ、それらの検出は臨床診療において有用であり、生物学的調製物の中のそれらの検出は、例えば、免疫測定法を使用して行うことができる。そのような薬物の例としては、抗生物質（例えば、ＷＨＯ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（引用により本明細書中に組み入れられる、２００５年９月２１日に更新された、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｂｌｏｏｄｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｒｅｆ＿ｍａｔｅｒｉａｌｓ／Ａｎｔ−ＳｅｐｔＯ５．ｐｄｆで入手することができる）に列挙されている抗生物質が挙げられる。例としては、ゲンタマイシン（９２／６７０）、ストレプトマイシン（７６／５３９）、トブラマイシン（８２／５１０）、およびバンコマイシン（５０／０２０）が挙げられる。
少なくとも１つの実施形態においては、本発明により、２つ以上の様々な捕捉部分を有している結合表面を提供する。
本明細書中に記載される様々な実施形態の特徴のうちの任意のものを、開示される任意の他の実施形態と組み合わせて記載される特徴と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の組成物と組み合わせて開示される特徴は、本明細書中に記載される任意の方法において使用できるなどである。様々な、または特異的な実施形態と組み合わせて記載される特徴は、そのような排他性が明白に記載されるか、または状況から暗黙的に理解されない限りは、本明細書中に開示される他の実施形態と組み合わせて適切ではないとは解釈されない。
本発明の特定の実施形態は、添付の図面および実施例において説明される。これらは、本発明の特定の実施形態を説明するために提供され、本発明に限定を課すようには意味されない。
（実施例１）
ウシ血清アルブミンの低入力比でのビオチン化
ＢＳＡを、ＢＳＡに対するビオチンの様々なモル入力比で、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（スルホスクシンイミジル−６−［ビオチンアミド］ヘキサノエート；Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でビオチン化した（表１を参照のこと）。簡単に説明すると、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（５５６．５９ｇ／ｍｏｌ）をＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）の中に１ミリリットルあたり３０ミリグラム（ｍｇ／ｍＬ）の濃度で溶解させ、凍結乾燥させたＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、プロテアーゼを含まない；Ｃｅｌｌｉａｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ａ Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；６６，０００ｇ／ｍｏｌ）を０．０５Ｍのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．２）の中に１５から２０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。ＢＳＡに対するスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンの最終的なモル入力比を３．４から３０（スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンのモル数：ＢＳＡのモル数）となるように、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン溶液をＢＳＡ溶液に添加した。反応液を４℃で２時間インキュベートし、その後、直ちに、過剰のスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（すなわち、ビオチン試薬、および加水分解されたビオチン試薬、遊離のビオチン）を取り除くために、０．０５Ｍのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．２）で透析した（すなわち、膜分離精製法（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）または透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ））。この一般的な手順を、低入力比でビオチン化されたＢＳＡを調製することを通してずっと使用した。
ビオチン化の程度は、ビオチンを定量するための当該分野で公知の任意の方法を使用して推算することができる。１つの適切な方法はＨＡＢＡ比色アッセイであり、これは、ビオチンについて選択性がある４’−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸（ＨＡＢＡ）を使用する。ＢＳＡ１モルあたりに結合したビオチンのモル数は、ＨＡＢＡ分析によって推算した。結果を表１に示す。
ビオチン化されたＢＳＡの１７個の個々のビオチン化のロットの安定性分析は、０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０〜９．５）の中で、ビオチン−ＢＳＡで３７〜４２℃で１８〜２４時間、２５ｍｇ／ｍＬのトシル活性化ＰＭＰ（Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ＭｙＯｎｅ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ，１．０ミクロンの直径、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ＰＭＰ１ｍｇあたり０．０３０〜０．０５０ミリグラムのビオチン−ＢＳＡ）をコーティングすること、マイクロ粒子をＴＢＳ（０．０２ＭのＴｒｉｓ、０．１５Ｍの塩化ナトリウム）（ｐＨ７．４）で３回洗浄すること、ビオチン−ＢＳＡでコーティングされたマイクロ粒子表面を、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．４％〜０．６％（ｗ／ｖ）のトリ−ブロックコポリマーＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１０８ ＮＦ Ｐｒｉｌｌ；ＢＡＳＦ）で４〜４．５時間、３７〜４２℃でブロックすること、マイクロ粒子をＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄すること、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子を、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．４％〜０．６％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の中に分散させること、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をＴＢＳ（ｐＨ７．４）中のＳＡ（凍結（決して凍結乾燥ではない）、ＳＡ２１ ＳＡ−ｐｌｕｓ，Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．）で３０〜５０分間、室温でコーティングすること（ビオチン−ＢＳＡ ＰＭＰ１ｍｇあたり０．０２５〜０．０５０ミリグラムのＳＡ）、マイクロ粒子をアジ化ナトリウム（０．１％ｗ／ｖ）を含むＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄すること、マイクロ粒子を、Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４アッセイ特異的マイクロ粒子緩衝液で３回洗浄すること、２５ｍｇ／ｍＬから０．３５ｍｇ／ｍＬのマイクロ粒子をＡｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４アッセイ特異的マイクロ粒子緩衝液で稀釈すること、ビオチン−ＢＳＡでコーティングされた、ＳＡでコーティングされたマイクロ粒子を４℃または３７℃で３日間インキュベートすること、そして、ビオチン−ＢＳＡでコーティングされた、ＳＡでコーティングされたマイクロ粒子の、Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４ Ａｓｓａｙ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）の中でビオチン化されたＦｒｅｅ Ｔ４特異的抗体に結合する能力を試験することによって完了した。安定性は、個々のＦｒｅｅ Ｔ４較正器ＲＬＵ（相対的な光単位、シグナル、または応答）の回収値（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）の平均を計算することによって決定した。Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４アッセイでは、６つの異なる較正器（Ｓ０、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、およびＳ５）が、０ｎｇ／ｍＬから６ｎｇ／ｍＬまでの抗原レベルで使用した（表４を参照のこと）。回収値は、３７℃の較正器でのＲＬＵ応答を、４℃の較正器でのＲＬＵ応答で割り算し、結果に１００％を掛け算することによって計算した。安定性は、６個の較正器全てについての回収値を平均することによって計算した。結果を表１に示す。
安定性は、４℃または３７℃で３日間、固相をインキュベーションした後のＳＡ結合能力の変化の指標であった。安定性の低下は、ビオチン−ＢＳＡ結合体からの受動的に結合したビオチンまたはビオチン試薬の脱落または解離と（図１１を参照のこと；点線：３７℃；実線：４℃）、その後のＳＡによる遊離のビオチンまたはビオチン試薬の経時的な捕捉が原因である。結果は、高モル入力比（すなわち、８：１、１５：１、３０：１）で調製されたビオチン−ＢＳＡが極めて低い安定性を示すことを明らかにしていた。ＢＳＡに対するビオチン試薬のモル入力比が３０：１から４：１まで小さくなるに伴い、安定性は４％から１００％まで改善された。
Figure 0005224477
 ＢＳＡを、ＢＳＡ１モルあたり３０モルのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンのモル入力比でビオチン化した。３０：１のビオチン化されたＢＳＡを、０．１Ｍのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．０〜９．５）（ＰＭＰ１ｍｇあたり０．０３０〜０．０５０ミリグラムのビオチン−ＢＳＡ）の中で、３７〜４２℃で１８〜２４時間、ビオチン−ＢＳＡで、２５ｍｇ／ｍＬのトシル活性化ＰＭＰをコーティングすること、マイクロ粒子をＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄すること、ビオチン−ＢＳＡでコーティングされたマイクロ粒子表面を、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．４％から０．６％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８で、３７〜４２℃で４〜４．５時間ブロックすること、マイクロ粒子をＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄すること、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子を、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．４％〜０．６％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の中に分散させること、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をＴＢＳ（ｐＨ７．４）中のＳＡで、室温で３０〜５０分間コーティングすること（ＰＭＰ１ｍｇあたり０．０２５〜０．０５０ミリグラムのＳＡ）、そしてマイクロ粒子をＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄することによって、Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＭｙＯｎｅトシル活性化ＰＭＰに結合させた。２５ｍｇ／ｍＬのビオチン−ＢＳＡでコーティングされた、ＳＡでコーティングされたＰＭＰを、４℃または３７℃に３日間置いておき、ＰＭＰを分離する（４℃または３７℃の緩衝液からマイクロ粒子を取り除く）ために磁石の上に１０分間置いた。４℃および３７℃のマイクロ粒子を含まない上清液を回収し、この上清液をサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ，３２ ＫＡＲＡＴ（登録商標）５．０ソフトウェア、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ３００×７．８０ｍｍ ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ ３０００カラム、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）移動相、１．０ｍＬ／分の流速、０．０５０ｍＬの試料容量、１７分間の実行時間、２００から４００ｎｍのフォトダイオードアレイ検出）を使用して分析した。
３７℃の上清液の２１０ｎｍでのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により、４℃の上清液と比較して、１０．８分の保持時間（ＲＴ）と１２．４分のＲＴのいずれでも、低分子量の分析物の有意に高いレベルが明らかとなった。これらのピークは、３０：１（ビオチン試薬：ＢＳＡ）の入力比でのビオチン化プロセスの間にＢＳＡ分子に受動的に吸着させられたビオチンおよび／またはビオチン試薬と考えられ、これらは、透析または脱塩によっては取り除くことができなかった。結果はまた、上清液の中には検出可能なＢＳＡまたはＳＡが存在しなかった（この方法の検出限界を下回る）（７．８から８．２分のＲＴ）こと、そしてビオチン−ＢＳＡ結合体および／またはＳＡが固相から脱落していないことをも示している。
ＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果は、３０のビオチン試薬：１のＢＳＡ試料が、４℃と比較して３７℃での安定性（安定性の９５．９％の低下、すなわち、４．１％の安定性）の最も有意な低下を有しており、そしてこれはまた、４℃の上清液と比較して３７℃の上清液の中での低分子量の分析物（単数または複数）の有意な量の存在を示した点で、安定性の結果をサポートする（表１を参照のこと）。安定性の低下は、ビオチン−ＢＳＡ結合体からの受動的に結合したビオチンまたはビオチン試薬の脱落または解離、そしてその後のＳＡによる経時的な遊離のビオチンまたはビオチン試薬の捕捉が原因である。
ビオチン−ＢＳＡコーティングプロセスを、ＢＳＡ１モルあたり４モルのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを使用してＢＳＡをビオチン化すること、マイクロ粒子（Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ＭｙＯｎｅ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ、１．０ミクロンの直径、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）１ｍｇあたり３０、４０、５０、または６０マイクログラムのビオチン−ＢＳＡを提供すること、ビオチン−ＢＳＡをマイクロ粒子とともに、３７℃または４０℃で２時間、４時間、または１８時間、０．１Ｍのホウ酸塩（ｐＨ９．５）とともにインキュベートすること、マイクロ粒子をＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄すること、マイクロ粒子を０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８を含むＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３７℃で４時間ブロックすること、マイクロ粒子をＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄すること、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子を、０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８を含むＴＢＳの中に分散させること、マイクロ粒子１ｍｇあたり３５マイクログラムのＳＡを添加することによりＳＡを結合させること、室温で３０分間インキュベートすること、そして、ビオチン−ＢＳＡでコーティングされた、ＳＡでコーティングされたマイクロ粒子をＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄することによって、最適化した。
アッセイの性能試験（Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４およびＡｃｃｅｓｓ（登録商標）ＡｃｃｕＴｎｌアッセイ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）と、ビオチン化されたＩｇＧの結合能力試験の結果は、ビオチン−ＢＳＡコーティングプロセスは、０．１Ｍのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）の中で、３０から５０μｇのビオチン−ＢＳＡがマイクロ粒子１ｍｇあたりに、２５ｍｇ／ｍＬのマイクロ粒子濃度で付加され、そして３７℃から４２℃で１８から２４時間インキュベートされる場合には確実な作業であることを示していた。簡単に説明すると、１２５Ｉで標識されたビオチン化されたＩｇＧの方法は、標準的なヨウ素化手順を使用して１２５Ｉでビオチン化されたＩｇＧとビオチン化されていないＩｇＧを標識することによって結合能力を評価するために使用される（抗体とビオチン化された抗体はそれぞれ、室温で、Ｎａ１２５ＩおよびクロラミンＴ三水和物とともにインキュベートされ、それぞれの反応は、メタ重亜硫酸ナトリウムで停止させられ、１２５Ｉで標識された非ビオチン化抗体と１２５Ｉで標識されたビオチン化抗体が、それぞれ、０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％のアジ化ナトリウムで予め馴化させられたＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−５０を使用して精製される）。１ｍｇのビオチン化された１２５Ｉ−ＩｇＧおよびビオチン化されていない１２５Ｉ−ＩｇＧあたりの全ＣＰＭ（１分あたりの数）をガンマカウンターを使用して計算し、ＳＡでコーティングされたマイクロ粒子を、モル過剰量の１２５Ｉ−ビオチン−ＩｇＧ（ビオチン結合ドメインを介する活発な吸着）または１２５Ｉ−ＩｇＧ（受動的な吸着または非特異的結合）のいずれかに提供し、マイクロ粒子を洗浄緩衝液で５回洗浄し、洗浄したマイクロ粒子をガンマカウンターの中に置いて、全ＣＰＭを決定し、特異的に捕捉されたビオチン−ＩｇＧの量を、１２５Ｉ−ビオチン−ＩｇＧ ＳＡマイクロ粒子のＣＰＭから１２５Ｉ−ＩｇＧでコーティングされたＳＡマイクロ粒子（非特異的結合についての対照）のＣＰＭを引き算することによって決定した。
（実施例２）
不飽和は結合能力を低下させるが、アッセイシグナルを増大させる
ビオチン／ＳＡシステムを使用する不飽和であり配向性を持つ結合表面を、ＰＭＰを使用して、ＢＳＡに対するビオチンの低モル入力比（４：１）で調製したビオチン−ＢＳＡを用いて調製した。簡単に説明すると、不飽和であり配向性を持つ結合表面を有しているマイクロ粒子のバッチを、Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＡＫＴ−１００トシル活性化ＰＭＰを低入力比でビオチン化されたＢＳＡでコーティングすること、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８でブロックすること、ブロックされたビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の中に分散させること、そして最後に、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をＳＡでコーティングすることによって調製した。表２の「ＢＣＩ試料」を参照のこと。比較のために、市販されているビオチン結合マイクロ粒子（Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を試験した。表２の「Ｄｙｎａｌ（登録商標）対照」を参照のこと。不飽和である表面と、市販されているビオチン−結合表面をそれぞれ、同じ生のマイクロ粒子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによる、Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＭｙＯｎｅ トシル活性化された１．０ミクロンのＰＭＰ）を使用して調製した。
不飽和である、市販されているビオチンに結合する（すなわち、ＳＡでコーティングされた）表面を、１４Ｃ−ビオチン結合能力試験（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してそれらのビオチン結合能力について試験した。結果を表２に示す。較正器のレベルは、１ｍＬあたりのナノグラム数で示される。市販されているマイクロ粒子のビオチン結合能力は、１，４００ｐｍｏｌビオチン／ｍｇであり、一方、本発明にしたがって調製された不飽和結合表面を有しているマイクロ粒子のビオチン結合能力は、わずかに、２１４ｐｍｏｌビオチン／ｍｇであった。したがって、市販されているビオチンに結合するマイクロ粒子は、本発明にしたがって調製された同じ直径のマイクロ粒子よりも６倍大きい、ビオチンに対する結合能力を示した。
マイクロ粒子を、ビオチン化されたＩｇＧに結合するそれらの能力についても試験した。市販されているマイクロ粒子は、マイクロ粒子１ｍｇあたり２０．０マイクログラムのビオチン化されたＩｇＧのビオチン化されたＩｇＧに結合する能力を示したが、本発明のマイクロ粒子は、マイクロ粒子１ｍｇあたり６．７マイクログラムのビオチン化されたＩｇＧの結合能力を示した。したがって、市販されているビオチンに結合するマイクロ粒子は、本発明のマイクロ粒子よりも約３倍大きい、ビオチン化されたＩｇＧに結合する能力を示した。しかし、市販されているマイクロ粒子のビオチン結合能力は、本発明のマイクロ粒子よりも６倍大きかった。
Figure 0005224477
 市販されているビオチンに結合するマイクロ粒子の機能的能力を、タンパク質であるトロポニンＩについてのアッセイにおいて、本発明にしたがって調製した不飽和であるマイクロ粒子の能力と比較した。簡単に説明すると、組み換え体ＳＡでコーティングした市販されている１ミクロンの直径のビオチンに結合するマイクロ粒子（Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と、本発明にしたがってＳＡでコーティングした不飽和である１ミクロンの直径のマイクロ粒子を、ビオチン化された抗トロポニンＩでＳＡでコーティングされたマイクロ粒子を処理し、そして、トロポニンＩ較正器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）に対するアッセイ応答を測定することによって、Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）ＡｃｃｕＴｎｌ Ａｓｓａｙ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、サンドイッチアッセイを使用するトロポニンＩについてのアッセイに使用した。結果を表３に示す。
Figure 0005224477
 表３は、較正器レベル（Ｓ１からＳ５）の範囲全体にわたって、本発明の不飽和であるマイクロ粒子が、市販されているマイクロ粒子よりも高いＲＬＵの読み取り値、そして市販されているマイクロ粒子よりも低いバックグラウンドのＲＬＵ読み取り値（Ｓ０）を示すことを説明している。この結果は、本発明の不飽和であるマイクロ粒子が市販されているビオチンに結合するマイクロ粒子よりも低いビオチン結合能力を示す（表２を参照のこと）との理由から驚くべきであり、予想外である。較正器応答は、ほぼ全範囲にわたって不飽和であるマイクロ粒子よりも高かった。Ｓ０（ＣＶ＝変動係数）の％ＣＶ較正器応答として測定したアッセイの精度は、不飽和であるマイクロ粒子については２倍を超えて大きかった。しかし、不飽和であるマイクロ粒子は、市販されているマイクロ粒子と比較して有意に低いＳ０ ＲＬＵ応答を有しており（８，１１６対１３，０２３）、そして繰り返しの間でのＲＬＵの小さな相違は、ＲＬＵシグナルが低下するのに伴って、より大きな％ＣＶを生じる可能性がある。％ＣＶ較正器量として表したアッセイの正確度は、平均して、不飽和であるマイクロ粒子について有意に低かった。ダイナミックレンジに関して、Ｓ１／Ｓ０とＳ５／Ｓ０の比は、不飽和であるマイクロ粒子よりも約２倍高かった。したがって、本発明のマイクロ粒子はビオチンにはほとんど結合しない（したがって、ビオチン化されたＩｇＧにほとんど結合しない）が、これらは、機能的な親和性アッセイにおいては予想以上に良好な能力を発揮し、市販されているマイクロ粒子と比較してノイズまたは非特異的結合が減少した。
市販されている２．８ミクロンの直径のＳＡでコーティングされたマイクロ粒子（Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ビオチン１ｍｇあたりの６５０から９００ピコモルのビオチンのビオチン結合能力，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の能力を、本発明にしたがって調製した１．０ミクロンのＳＡでコーティングされたマイクロ粒子の能力（１ｍｇあたり約２１４ピコモルのビオチンのビオチン結合能力；表２を参照のこと）と、Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４アッセイ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）において比較した。Ｆｒｅｅ Ｔ４を、Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４アッセイ、競合アッセイを使用して、本発明にしたがってビオチン化された抗Ｔ４でＳＡでコーティングされたマイクロ粒子（「Ｄｙｎａｌ（登録商標）法」については、市販されているＳＡでコーティングされた２．８ミクロンの直径のＰＭＰ；「ＢＣＩ法」については、本発明にしたがって調製された１．０ミクロンの直径のＳＡでコーティングされたＰＭＰ）を処理すること、そして、Ｔ４較正器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）に対するアッセイ応答を測定することによってアッセイした。アッセイは、Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）２ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）上で行い、このシステム上で得られたＲＬＵの結果を表４に示す。
Figure 0005224477
 表４に示すように、本発明にしたがって調製した１．０ミクロンのＳＡでコーティングされたマイクロ粒子は、市販されている２．８ミクロンの直径のＳＡでコーティングされたマイクロ粒子とほぼ同じ分析物（Ｆｒｅｅ Ｔ４）についてのシグナルを生じた。この結果は、本発明の不飽和であるマイクロ粒子が、市販されている抗ビオチンマイクロ粒子（Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ビオチン１ｍｇあたり６５０から９００ピコモルのビオチンのビオチン結合能力、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）よりも低いビオチン結合能力を示すことの理由から、驚くべきであり、予想外である。上記の表に示したような本発明のマイクロ粒子の調製（表２、３、および４を参照のこと）により結合表面の不飽和性が生じ、結果として、リガンド（ビオチン）の数が減少する。本発明のマイクロ粒子は、ほとんど結合しない（市販されているＤＹＮＡＢＥＡＤＳ Ｍ−２８０マイクロ粒子については、１ｍｇあたり６５０から９００ピコモルと比較して、本発明のマイクロ粒子については１ｍｇあたり２１４ピコモルであり、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ＭｙＯｎｅ ＳＡ Ｔ１マイクロ粒子についての１ｍｇあたり１，０００ピコモルを上回る）が，これらはより良好に機能する（表３および表４を参照のこと）。本発明の１．０ミクロンのマイクロ粒子は、２．８ミクロンのマイクロ粒子よりもわずかに少なく結合するが、本発明のマイクロ粒子はより大きなシグナルを生じる。
総合的には、結果から、本発明の不飽和であるマイクロ粒子が、これらは市販されているマイクロ粒子よりも低い結合能力を有しているが、市販されているマイクロ粒子と同様に良好な、またはそれよりも優れたアッセイシグナルを生じることが立証される。これは、市販されているマイクロ粒子よりも有意に低い結合能力を有している本発明の結合表面についてもなお、そのとおりである。
（実施例３）
分散工程を使用した不飽和である表面の作製
ＢＳＡに対するビオチン化試薬の低モル入力比（４：１）を使用して調製したビオチン−ＢＳＡを、不飽和である結合表面を作製するための分散方法において使用した。簡単に説明すると、ビオチン−ＢＳＡ（上記のように調製した）を、上記に記載したように、Ｄｙｎａｌ（登録商標）マイクロ粒子に共有結合させて、単位支持体表面積あたりのビオチンの数に関して不飽和である表面を得た。コーティングされたマイクロ粒子を、その後、ＳＡの付加の前の分散工程において使用した。
最初の実験では、血球計（顕微鏡分析）を使用して、上記に記載したように調製した、ビオチン−ＢＳＡでコーティングされたマイクロ粒子の凝集状態を（１）ＳＡの付加の前、（２）ＳＡの継続的に混合される溶液（１ｍＬあたり０、１２５、２５０、３７５、５００、７５０、または１０００マイクログラムのＳＡ）に対する、１０ｍｇ／ｍＬのビオチン−ＢＳＡでコーティングされたマイクロ粒子の溶液の滴下の後、および（３）１０ｍｇ／ｍＬのビオチン−ＢＳＡでコーティングされたマイクロ粒子の継続的に混合される溶液に対する１８ｍｇ／ｍＬのＳＡ溶液の様々な量（マイクロ粒子１ｍｇあたり２５、５０、７５、１００、１５０、または２００マイクログラムのＳＡ）の添加後に、評価した。血球計の結果は、単量体（１つのマイクロ粒子）、二量体（２つのマイクロ粒子が凝集する）、三量体（３個のマイクロ粒子が凝集する）、小さい凝集物（４個から１０個のマイクロ粒子が凝集する）、および大きな凝集物（１０個を超えるマイクロ粒子が凝集する）として記録した。凝集物は、ＳＡの架橋による２つ以上のビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子の結合として定義される（すなわち、ＳＡは、４個のサブユニットを持つ多価のものであり、個々のサブユニットは１つのビオチン結合ドメインを有する）。血球計の結果は、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子はＳＡの付加の前には単分散物（単量体と二量体のみ）であり、１ミリリットルあたり７５０マイクログラムまでのＳＡのＳＡ溶液の中にビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子が滴定（滴下）された場合にはほとんどが凝集し（大きな凝集物）、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子が１ミリリットルあたり１０００マイクログラムのＳＡのＳＡ溶液の中に滴定（滴下）された場合には単分散物（三量体、二量体、および単量体）であり、そして、試験した全ての濃度でビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子に対してＳＡが添加された場合には、高度に凝集した（大きな凝集物）ことを示していた。本明細書中で使用される場合は、用語「実質的に単分散」は、実質的に、単量体および二量体としてのみ存在するマイクロ粒子の集団を意味する。
ＳＡの混合溶液に対してビオチン−ＢＳＡでコーティングされたマイクロ粒子を滴下することによって、またはビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子の混合溶液に対してＳＡ溶液を添加することによって調製したビオチン−ＢＳＡでコーティングされた、ＳＡでコーティングされたマイクロ粒子は、混合しながら超音波エネルギー（２×３００ワットで６０秒間）にＳＡでコーティングされたマイクロ粒子を曝すことによって一次的に単分散の状態（ほとんどが三量体であり、二量体と単量体を含む）になるように導くことができたが、マイクロ粒子は、長時間にわたり単分散の状態のままでいることはなく、再び高度に凝集した状態になった。超音波エネルギーによっては、永久的な単分散のビオチン−ＢＳＡでコーティングされた、ＳＡでコーティングされたマイクロ粒子を生じさせることはできず、ＳＡの架橋が原因で凝集するビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子の傾向を減少させることはできなかった。
血球計による実験は、疎水性のマイクロ粒子の単分散物（１．０３ミクロンのポリスチレンＰＭＰ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ１−０７０／４０，ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）に必要なＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８（０μＭから１０００μＭまでの１７の希釈レベルの、水中のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８）の量を決定するために完全なものとした。これらの実験の結果は、Ｍ１−０７０／４０マイクロ粒子が、２７．０４μｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８／ｍｇマイクロ粒子（稀釈レベル６）から２０２７．７μｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８／ｍｇマイクロ粒子（稀釈レベル１５）までのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８濃度では、実質的に単分散（すなわち、単量体と二量体だけ）であることを示していた。マイクロ粒子は、２７．０４μｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８／ｍｇマイクロ粒子未満のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８濃度、および２０２７．７μｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８／ｍｇマイクロ粒子より大きい濃度では凝集した（トリ−ブロックコポリマーの多層の積み重ねがおそらく原因である）。表面積の計算から、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の理論上の単層には、少なくとも４．１μｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８／ｍｇマイクロ粒子が必要であると予想し、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８分子１個あたり２０ｎｍ２の界面の表面積と、（１．０３μｍの滑らかな表面を持つ完全なる球形に基づいて）３８．３８ｃｍ２／ｍｇのマイクロ粒子表面積を推測した。Ｍ１−０７０／４０マイクロ粒子は大きさが均一ではなく、滑らかな表面を持たず（不均質な大きさの分布）、そして１．０３ミクロン未満の直径（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＳ１３ ３２０レーザー回折粒子寸法測定器を使用したマイクロ粒子の大きさの分析に基づく）の微粒子の大きな集団を含むことに留意しなければならない。マイクロ粒子の細かさと、ざらざらしたマイクロ粒子表面の両方が、Ｍ１−０７０／４０マイクロ粒子が上記で計算したよりも大きな１ｍｇあたりの表面積を有することを示す。血球計による結果はこの仮説をサポートする。なぜなら、マイクロ粒子の単分散には、２７μｇよりも大きなＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８／ｍｇマイクロ粒子が必要であるからである。この実験の結果は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８が、２７．０４から２０２７．７μｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８／ｍｇマイクロ粒子（稀釈レベル６から１５）の濃度でマイクロ粒子の単分散物を生じ得ることを示していた。
ビオチン−ＢＳＡでコーティングされたマイクロ粒子（Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ＭｙＯｎｅ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ、１．０ミクロンの直径、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の特異的なロットは、７４から８４ｃｍ２／ｍｇ（分析の証書に記載されている；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）までの表面積を有している。これらの値と、上記のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８血球計の実験に基づいて、１ｍＬあたり２５ｍｇのビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子を含む０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８溶液（または４ｍｇ／ｍＬ）が、およそ１６０μｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８／ｍｇマイクロ粒子を提供することを計算した。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８血球計での実験に使用した１．０３ミクロンのＭ１−０７０／４０マイクロ粒子（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）は、３８．３８ｃｍ２／ｍｇより大きな表面積を有しており、２７．０４から２０２７．７μｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８／ｍｇのマイクロ粒子までの濃度では単分散であったので、０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８溶液、または１６０μｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８／ｍｇマイクロ粒子を、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子の単分散を促進するために十分な量のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８が存在することを確実にするための最初の分散実験に使用した。
０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１０８ ＮＦ Ｐｒｉｌｌ，ＢＡＳＦ）を含むＰＢＳ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）緩衝液、または０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８を含むＴＢＳ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）緩衝液の中に分散させた２５ｍｇ／ｍＬのビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子に対してＳＡ（２５から５０μｇのＳＡ／ｍｇマイクロ粒子）を付加することによって調製したビオチン−ＢＳＡでコーティングされた、ＳＡでコーティングされたマイクロ粒子は、ＳＡの付加後は単分散であった。
ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子がＳＡとそれらを結合させる前に０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８を含む溶液の中に分散させられる限りは、ＳＡの付加の程度（すなわち、ＳＡに対して１滴ずつ添加されたビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子、またはビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子に対して加えられたＳＡ）とは無関係に、マイクロ粒子は単分散を維持した。上記のような超音波の使用とは異なり、ビオチン−ＢＳＡでコーティングされた、ＳＡでコーティングされたマイクロ粒子は、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子がＳＡとのそれらの結合の前にＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８を含む緩衝液の中に分散させられた場合には、単分散を維持した。したがって、０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８は、マイクロ粒子のコロイド安定性（マイクロ粒子支持体表面の疎水性の低下、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８のぶら下がっているヒドロキシル基が原因であるマイクロ粒子支持体表面の負電荷の増加、表面対表面の負電荷の斥力が原因であるマイクロ粒子の斥力の増大）を改善することによって、そして、マイクロ粒子の架橋が起こり得る前に利用できる（結合していない、接近できる）全てのマイクロ粒子の表面ビオチンに対してＳＡ分子を結合させることによって、ＳＡとのビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子の結合の前および後のいずれでも、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子の単分散を促進するための分散剤としてうまく働くことができる。架橋は、マイクロ粒子であるビオチンを利用することができ、４つのＳＡ結合ドメインのうちの少なくとも２つが、２つの異なるマイクロ粒子上の結合していない、接近することができるビオチンと結合できる場合にのみ起こり得る。
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８が、０．４％から０．６％（ｗ／ｖ）の濃度で、低入力比でビオチン化されたＢＳＡでコーティングされたマイクロ粒子についての分散剤として作用することは経験的に決定されている。簡単に説明すると、ＳＡ入力比（１０、１５、２５、および３５μｇのＳＡ／ｍｇビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子）、インキュベーション時間（３０分および６０分）、そしてＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の割合（０．４から０．６％ｗ／ｖ）の組み合わせを、分散工程を最適化するために評価した。アッセイの性能試験（Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４およびＡｃｃｅｓｓ（登録商標）ＡｃｃｕＴｎｌアッセイ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）と、ビオチン化されたＩｇＧに結合する能力の試験の結果は、分散プロセスが、２５から３５μｇのＳＡをビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子１ｍｇあたりに、２５ｍｇのビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子／ｍＬのマイクロ粒子濃度で、０．４％から０．６％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８を含むＴＢＳ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）に付加し、そして３０から６０分間インキュベートした場合には、確実な作業であることを示していた。
一旦、ビオチン化されたマイクロ粒子を試験し、０．４％から０．６％（ｗ／ｖ％）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８溶液の中に分散させると、低レベルまたは少量のＳＡを、マイクロ粒子の凝集物または塊を形成させることなく、ビオチン化されたマイクロ粒子に付加することがでっきた。このプロセスにより、ＳＡでのマイクロ粒子のコーティングの後にマイクロ粒子の単分散物が得られた。このプロセスの説明は図６に示す。これは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８が存在しない条件下でのコーティングされたマイクロ粒子のＳＡ処理を示しており、そして、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８での処理によって生じる単分散を説明する。
（実施例４）
ＳＡの不飽和と配向性、高い表面ブロッキング、および結合効率の改善が原因である高いシグナル対ノイズ比
従来のマイクロ粒子のシグナル対ノイズ比と、ＳＡの不飽和と配向性、高い表面ブロッキング、および改善された結合効率を特徴とする本発明の不飽和であるマイクロ粒子のシグナル対ノイズ比の間での比較を、２つのアッセイプラットフォーム上で行った。
Ｂ型ナトリウム利尿ペプチドまたは脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）に特異的な結合表面を、マイクロ粒子の表面に対するＧｘＢｉｏｔｉｎ（ヤギ抗ビオチン）抗体の一次コーティング、続いて、ＢＮＰに特異的なビオチン化されたＯＭＮＩＣＬＯＮＡＬ（登録商標）（Ｂｉｏｓｉｔｅ，Ｉｎｃ．）Ｆａｂ断片での二次コーティングを使用することによって、従来のマイクロ粒子（Ｍ１−０７０／４０マイクロ粒子、ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に構築した。簡単に説明すると、ＧｘＢｉｏｔｉｎ ＩｇＧでの一次コーティングは、マイクロ粒子表面のカルボキシル基（７０から１００μｍｏｌのＣＯＯＨ／ｇ）を、ＭＥＳ（ｐＨ５．５）中の表面カルボキシル１モルあたりおよそ６から１０ｍｏｌのＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドヒドロクロライド；Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と６から１０ｍｏｌのスルホ−ＮＨＳ（ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド；Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で活性化させること、３０から３５分間、マイクロ粒子を活性化剤とともにインキュベートすること、過剰な活性化剤を、ＭＥＳ（ｐＨ５．５）で３回マイクロ粒子を洗浄することによって除去すること、活性化されたマイクロ粒子１ｍｇあたり４０マイクログラムのＧｘＢｉｏｔｉｎ ＩｇＧを添加すること、活性化させられたマイクロ粒子をＧｘＢｉｏｔｉｎ ＩｇＧとともに１２０から１３５分間インキュベートすること、過剰なＧｘＢｉｏｔｉｎ ＩｇＧを除去すること、そして残りの活性化されたカルボキシル基をグリシンをベースとする緩衝液でクエンチすること、受動的に吸着したＧｘＢｉｏｔｉｎ ＩｇＧを、界面活性剤ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）を含む低ｐＨ（ｐＨ２．５）および高ｐＨ（ｐＨ８．０）の緩衝液を使用して剥がし取ること、そしてマイクロ粒子表面をＢＳＡでブロックすることによって、カルボジイミド化学を使用して、１０ｍｇ／ｍＬのマイクロ粒子に対して行った。
二次コーティングは、ＧｘＢｉｏｔｉｎ ＩｇＧで一次コーティングしたマイクロ粒子をＢＮＰアッセイ特異的希釈剤の中で洗浄すること、ＧｘＢｉｏｔｉｎマイクロ粒子１ｍｇあたり１０マイクログラムのビオチン化されたＢＮＰ Ｆａｂを添加すること、ビオチン化されたＢＮＰ Ｆａｂをマイクロ粒子とともに９０から１３５分間室温でインキュベートすること、過剰なビオチン化されたＢＮＰ Ｆａｂを除去するためにマイクロ粒子を洗浄すること、そしてＢＮＰでコーティングされたマイクロ粒子を、ＢＮＰアッセイ特異的希釈剤を用いて１．０ｍｇ／ｍＬに稀釈することによって行った。
本発明の不飽和であるマイクロ粒子は、Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＡＫＴ−１００トシル活性化ＰＭＰに対して低入力比でビオチン化されたＢＳＡを共有結合させることによって調製した。この場合、ＢＳＡは、１モルのＢＳＡに対して４モルのビオチンのモル入力比でビオチン化し、続いて、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８でビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をブロックし、ブロックされたビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の中に分散させ、最後に、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をＳＡでコーティングした。ビオチン化されたモノクローナル抗体の入力比は、従来のコーティングされたマイクロ粒子および不飽和であるマイクロ粒子と同じであった。ビオチン化されたＯＭＩＮＣＬＯＮＡＬ ＦａｂはＢＮＰに特異的であった。従来のコーティングされたマイクロ粒子および不飽和であるマイクロ粒子を同じマイクロ粒子濃度（１．０ｍｇ／ｍＬ）で評価し、そして同じＡｃｃｅｓｓ（登録商標）アッセイ形式（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）で、同じ試薬、対照資料、および患者試料を用いて試験した。結果を表５に示す。
シグナル対ノイズ比を、２つのアッセイプラットフォーム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）：ＵｎｉＣｅｌ（登録商標）ＤｘＩ ８００ Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（比較的高スループットのシステム）およびＡｃｃｅｓｓ（登録商標）２ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（比較的低スループットのシステム）のそれぞれの上で、従来のマイクロ粒子について、および不飽和であるマイクロ粒子について測定した。較正器応答を、較正器レベルの範囲全体にわたって、そして１３の別々の患者試料について測定した。結果は、ＲＬＵとして、従来のマイクロ粒子について（表５の「対照」）、そして不飽和であるマイクロ粒子について（表５の「Ｄｅｖ３」）示す。「％Ｂｉａｓ」として表されるアッセイのプラットフォームの偏りは、対照と不飽和のマイクロ粒子の両方について同じ様式で決定した。用語「偏り」は、ハードウェエア、設計、およびスループットの差（すなわち、Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）２ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍは、１時間あたり１００の試験を完了することができ、ＵｎｉＣｅｌ（登録商標）ＤｘＩ ８００ Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍは１時間あたり４００の試験を完了することができる）が原因で、いずれのプラットフォームでも同じ試薬および供給品が使用されてもなお、Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）２ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ＳｙｓｔｅｍおよびＵｎｉＣｅｌ（登録商標）ＤｘＩ ８００ Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを含む任意のアッセイシステムの間で起こり得るアッセイ量の差をいう。任意の偏りは、個々のプラットフォームがマイクロ粒子試薬を超音波処理する、混合する、洗浄する、そしてインキュベートする方法の差に起因し得る。平均用量は、従来のマイクロ粒子について、そして不飽和であるマイクロ粒子について計算した。
表５に示すように、本発明のマイクロ粒子についての偏りの測定は、従来のマイクロ粒子よりも全体的に良好であった。表５はまた、不飽和であるマイクロ粒子について：（１）バックグラウンドが低かった（Ｓ１〜Ｓ５に対してＳ０を比較する）、（２）バックグラウンドに対するシグナルが、全ての較正器レベルおよび全ての患者試料にわたってより好ましかった、そして（３）感度が、全ての較正器レベルおよび全ての患者試料について高かったことも明らかにしている。したがって、不飽和であるマイクロ粒子は、アッセイシグナルの増大をもたらし（例えば、ＤｘＩプラットフォームを使用した場合は、本発明の不飽和であるマイクロ粒子についてのＳ５での２３×１０６ＲＬＵと比較して、従来のマイクロ粒子についてはＳ５で１３×１０６ＲＬＵ）、そしてアッセイノイズまたはバックグラウンドの有意な減少（例えば、ＤｘＩプラットフォームを使用した場合には、本発明の不飽和であるマイクロ粒子についてのＳ０での７×１０３ＲＬＵと比較して、従来のマイクロ粒子についてのＳ０での１０×１０３ＲＬＵ）をもたらした。
Figure 0005224477
 本発明のマイクロ粒子と市販されている結合性のマイクロ粒子の別の比較を行った（マイクロ粒子の記載についての表２を参照のこと）。この比較においては、Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＡＫＴ−１００トシル活性化ＰＭＰを組み換え体ＳＡで一次コーティングすることによって作製された市販されているＤｙｎａｌ（登録商標）マイクロ粒子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を入手した。市販されているＳＡでコーティングされたマイクロ粒子の性能を、Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＡＫＴ−１００トシル活性化ＰＭＰを低入力比でビオチン化されたＢＳＡでコーティングすること、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８でブロックすること、ブロックされたビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の中に分散させること、そして最後に、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をＳＡでコーティングすることによって生産した本発明のマイクロ粒子と比較した。市販されているマイクロ粒子と不飽和であるマイクロ粒子はいずれも、捕捉部分としてＴｎＩに対するビオチン化抗体を使用するトロポニンＩアッセイ（Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）ＡｃｃｕＴｎｌ Ａｓｓａｙ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）において使用した。市販されているマイクロ粒子と本発明の不飽和であるマイクロ粒子を、いずれも、同じマイクロ粒子濃度で評価し、同じアッセイ形式において同じ試薬、対照試料、および患者試料を用いて試験した。結果を表６に示す。
Figure 0005224477
 本発明の不飽和であるマイクロ粒子は、市販されているマイクロ粒子と比較したアッセイシグナルの有意な増大（例えば、Ｓ５では、９．６×１０６ＲＬＵから１２．４×１０６ＲＬＵに増大した）と、アッセイのノイズまたはバックグラウンドの有意な低下（例えば、Ｓ０では１３×１０３ＲＬＵから８×１０３ＲＬＵに低下した）を生じた。したがって、本発明の不飽和であるマイクロ粒子は、マイクロ粒子結合表面上のＳＡの不飽和の性質と配向性、その後に付加されたビオチン化抗体に対するその累積的な不飽和と配向性の効果が原因で、アッセイのシグナル対ノイズ比の増大を示した。上記Ｄｙｎａｌ（登録商標）法とＢＣＩ法の比較では、最適化された（市販されている製品である、Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）Ｄｙｎａｌ（登録商標）法（最適化されたＢＣＩ Ｍｅｔｈｏｄではない）を使用したことに留意された。最適化されたＢＣＩ法を使用する不飽和であるマイクロ粒子のその後のＴｎＩ試験（Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）ＡｃｃｕＴｎｌ Ａｓｓａｙ）は、アッセイシグナルのなおさらに有意な増大（すなわち、Ｓ１＝８０，０００ＲＬＵ、Ｓ５＝１８，３００，０００ＲＬＵ）、同様のアッセイのノイズまたはバックグラウンド（すなわち、Ｓ０＝８，５００ＲＬＵ）、そして増大した比率曲線（すなわち、Ｓ１／Ｓ０＝９．４、Ｓ５／Ｓ０＝２，１３０）を生じた。
（実施例５）
非特異的結合の減少
非特異的結合が多くのアッセイ形式において望ましくない表現形であるので、本発明にしたがって作製したマイクロ粒子を使用する非特異的結合の減少を明らかにする実験を行った。非特異的結合は、例としてシグナル対ノイズ比を含むがこれに限定されないアッセイの性能のパラメーターに有害な影響を与える可能性がある望ましくない副生成物を生じる、その構成成分および／または支持体表面が関係している、免疫測定法における人工的な結合事象を記載する。非特異的結合には、固相支持体表面自体への結合、および／または支持体表面上にコーティングされたリガンド：：支持体連結器複合体に対する結合が含まれ得る。支持体連結器としてＢＳＡを使用するマイクロ粒子の特異的な実施形態を試験した。
ＢＳＡはアルブミン（ウシ血清アルブミン）であり、アルブミンは甲状腺ホルモンに結合することができる。ＢＳＡは、甲状腺ホルモンＴ３およびＴ４についての結合タンパク質として同定されている。固相支持体表面がＢＳＡでコーティングされると、結合表面は、それがうまくブロックされない限りは、そのような甲状腺ホルモンを捕捉するかまたはそのような甲状腺ホルモンに結合するであろう。
不飽和であるＳＡマイクロ粒子は、マイクロ粒子をビオチン化されたＢＳＡでコーティングすること、表面をＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８でブロックすること、そしてビオチン−ＢＳＡ表面をＳＡでコーティングすることによって生産されるので、不飽和であるＳＡマイクロ粒子は、それらの表面がうまくブロックされない限りは、Ｔ３およびＴ４のような甲状腺ホルモンに結合する可能性がある。具体的には、不飽和であるＳＡマイクロ粒子をＴ３アルカリホスファターゼ結合体とともにインキュベートすると、表面がブロックされて非特異的結合が減少させられるかもしくは排除されない限りは、マイクロ粒子はＴ３−結合体に結合し得、アッセイにおいては非特異的結合（ＮＳＢ）シグナルが生じ得る。バックグラウンドの増大に加えて、較正器シグナルの上昇がＴ３結合体の非特異的結合によって生じる可能性がある。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８が、０．４％から０．６％（ｗ／ｖ）までの濃度で、低入力比でビオチン化されたＢＳＡでコーティングされたマイクロ粒子をブロックすることを経験から決定した。
最初のブロック実験で、ビオチン化されたＢＳＡでコーティングしたトシル活性化常磁性マイクロ粒子についてのブロッキング剤として、０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）中の０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡと、０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）中の０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８を評価した。ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子を、０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡまたは０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８ブロッキング緩衝液とともに３７℃で１８時間インキュベートし、モル過剰量のＳＡの中にビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をゆっくりと滴定することによってＳＡでコーティングした。ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をブロッキングの前に３回洗浄し、ブロッキングの後、以下の緩衝液のうちの１つを使用してまた洗浄した：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％（ｗ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％（ｗ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ ｘ−１００を含むＴＢＳ（ｐＨ７．４）、または０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８を含むＴＢＳ。アッセイの性能の試験（Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）ＡｃｃｕＴｎｌ Ａｓｓａｙ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）の結果は、０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８ブロッキング緩衝液およびＢＳ（ｐＨ７．４）での洗浄により、最も低いバックグラウンドシグナル（最も低いＳ０ ＲＬＵ）、最も高い較正器シグナル（最も高いＳ１およびＳ５ ＲＬＵ）、最も高いアッセイのダイナミックレンジ、そして最も高いシグナル対ノイズ比が生じたことを示していた。
その後のブロッキングの最適化実験では、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、スルホ−ＨＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン、またはＰＦＰビオチンでビオチン化されたＢＳＡを用いて調製し、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡまたは０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８ブロッキング緩衝液で、３７℃で４時間または３７℃で１８時間ブロックし、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、そしてＳＡまたはニュートラアビジンで、モル過剰量のＳＡまたはニュートラアビジンの中にビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をゆっくりと滴定することによってコーティングした、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子の性能を評価した。アッセイの性能の試験（Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）ＡｃｃｕＴｎｌ Ａｓｓａｙ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）の結果は、０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８で３７℃で４時間ブロックし、そしてＳＡまたはニュートラアビジンでコーティングしたスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンＢＳＡマイクロ粒子およびＰＦＰ−ビオチンＢＳＡマイクロ粒子が、最も低いバックグラウンドシグナル（Ｓ０）、最も高い較正器シグナル（Ｓ１およびＳ５）、最も高いアッセイのダイナミックレンジ、そして最も高いシグナル対ノイズ比を生じたことを示していた。
最後のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８ブロッキング最適化実験では、Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＭｙＯｎｅトシル活性化マイクロ粒子（Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ＭｙＯｎｅ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ、１．０ミクロンの直径、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上に、０．１Ｍのホウ酸塩（ｐＨ９．５）中で４０℃で１８時間、低入力比のスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン結合ＢＳＡ（マイクロ粒子１ｍｇあたり４０マイクログラムのビオチン−ＢＳＡ）をコーティングすることによって調製したビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子を使用した。ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子を、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．２％、０．４％、０．６％、または０．８％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８で４０℃で２時間、４時間、または２４時間ブロックし、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、そして０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８を含むＴＢＳ（ｐＨ７．４）中にビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子を分散させることによってＳＡでコーティングし、その後、マイクロ粒子１ｍｇあたり３５マイクログラムのＳＡを付加した。アッセイの性能の試験（Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４およびＡｃｃｅｓｓ（登録商標）ＡｃｃｕＴｎＩ ａｓｓａｙｓ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）と、ビオチン化されたＩｇＧに結合する能力の試験の結果は、０．４％から０．６％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８で４時間ブロックされたマイクロ粒子が最も低いバックグラウンドシグナル、最も高い較正器シグナル、最も高いアッセイのダイナミックレンジ、最も高いシグナル対ノイズ比、そして再現性のあるビオチン化されたＩｇＧに結合する能力を生じたことを示していた。
不飽和であるＳＡでコーティングされたマイクロ粒子の非特異的結合を評価するために、不飽和であるＳＡでコーティングされたマイクロ粒子のロットを、４℃または３７℃で３日間インキュベートし、Ｔ４を含まない免疫測定法において、Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４較正器およびＡｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐａｃｋｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を使用して試験した。ビオチン化されたＦｒｅｅ Ｔ４特異的抗体を含めずに試験した試料（「Ｎｏ ＡＢ」）はマイクロ粒子表面に対するＴ３−結合体の非特異的結合を評価した。オボアルブミンとビオチン化抗体、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるＤｙｎａｌ（登録商標）ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎマイクロ粒子（２．８ミクロンのマイクロ粒子）を使用した市販されているマイクロ粒子アッセイ（Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４）によって生じたシグナルと比較した、ＳＡでコーティングされたビオチン化されたＢＳＡを有している本発明のマイクロ粒子についての結果を表７に示す。
Figure 0005224477
 結果は、４℃および３７℃のいずれの不飽和である試料おいても、ビオチン化させられたＦｒｅｅ Ｔ４特異的抗体が試薬のパックから除去された場合（Ｎｏ Ａｂ）には、Ｓ０アッセイシグナルは＜８，５００ＲＬＵであったので、結合体の非特異的結合が起こらなかったことを示している。非特異的結合が起こる場合、またはビオチン化されたＦｒｅｅ Ｔ４特異的抗体がアッセイの中に存在する場合には、ＳＡ表面が、ビオチン化されたＦｒｅｅ Ｔ４特異的抗体を補足し、この捕捉されたＦｒｅｅ Ｔ４特異的抗体がＴ３結合体に結合したので、アッセイシグナルだけが生じたはずである（すなわち、Ｓ０＞１．５×１０６ＲＬＵ）。非特異的結合を減少させるために、市販されているマイクロ粒子には、オボアルブミン（ＢＳＡではない）とともにＳＡマイクロ粒子が使用されている。不飽和であるマイクロ粒子では低入力比でビオチン化されたＢＳＡを使用したにもかかわらず、これらは良好に機能した。総合的には、結果は、長期間にわたる高温（３７℃で３日間）でもなお、非特異的結合が観察されなかったことを示しており、このことは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８がこれらの条件下では不飽和であるマイクロ粒子から外れることはないことを示唆している。したがって、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８でブロックされた、ビオチン−ＢＳＡでコーティングされ、ＳＡでコーティングされた結合表面は、高温で長時間でもなお、Ｔ３アルカリホスファターゼ結合体の非特異的結合の減少または最少化を生じる。
（実施例６）
コーティングプロセスの再現性
ＳＡコーティングについてのプロセスの検証を、本発明の不飽和であり、配向性を持つマイクロ粒子について行った。結果を表８と、図１２および図１３に示す。プロセスの検証のためのマイクロ粒子は本発明にしたがって調製した。簡単に説明すると、Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＡＫＴ−１００トシル活性化ＰＭＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を低入力比でビオチン化されたＢＳＡでコーティングし、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８でブロックし、ブロックされたビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の中に分散させ、そして、ビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子をＳＡでコーティングした。
アッセイは、別々に調製したＳＡコーティング（「プロセス」）、マイクロ粒子ロット（「トシル活性化ＰＭＰロット」）、低入力比でビオチン化されたＢＳＡロット（「低入力比でビオチン化されたＢＳＡロット」）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８ロット（ブロックコポリマーＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８ロット））、およびＳＡロット（「ＳＡロット」）の様々な組み合わせを用いて行った。表８においては、用語「プロセス」は、低入力比でビオチン化されたＢＳＡでのマイクロ粒子のコーティング、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８でのマイクロ粒子のブロッキング、マイクロ粒子のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の中への分散、およびビオチン−ＢＳＡマイクロ粒子上のＳＡのコーティングをいう；「オペレーター」は、ＳＡコーティングまたは「プロセス」が４人の様々な人間オペレーターによって行われたことを示す。
Figure 0005224477
 ５つの別々の市販されている対照（「Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌｉｑｕｉｄ １」、「Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌｉｑｕｉｄ ２」、「Ｂｉｏ−Ｒａｄ １」、「Ｂｉｏ−Ｒａｄ ２」、および「Ｂｉｏ−Ｒａｄ ３」；Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）と、プールされた患者の血清の２つ試料（「患者プール１」および「患者プール２」）、ならびに３つの個々の試料（「試料１」、「試料２」、および「試料３」）を使用した、１１の検証ロットについてのＦｒｅｅ Ｔ４アッセイを使用するさらなる検証実験の結果（図１２を参照のこと）は、十分な一致を明らかにしており、約５％未満または約５％のＣＶを有していた。対照的に、従来どおり調製されたマイクロ粒子（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ Ｍ−２８０ ＳＡマイクロ粒子）は、少なくともおよそ１０％のＣＶを有する。
抗原が血清にスパイクされた対照の３つのセット（対照Ａ、Ｂ、およびＣ）と、３人の患者の血清対照（ＱＣ患者１、２、および３）を使用した、ＢＰＨ−Ａマーカーを使用する１０の検証ロットについてのさらなる検証実験（図１３を参照のこと）は同様の知見を生じた。
ＳＡコーティングプロセスの検証の結果は、全ての検証事項が全てのロットについて満たされていたことを明らかにした。さらに、これらの結果は、本発明のマイクロ粒子を作製するプロセスには、付随する変異の程度は低く、再現性があり、そして信頼できるものであることを示している。
（実施例７）
不飽和であるマイクロ粒子の安定性の増大
較正器または試料の中でのＴ４の回収率によって測定した、加速型の安定性試験を、ビオチン化された抗Ｔ４抗体を有している不飽和であるＳＡでコーティングされたマイクロ粒子の複数の検証ロットについて、Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４アッセイ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）においてＡｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４較正器を４℃および３７℃で４日間、そして４℃および３７℃で１２７日間使用して行った。結果を、表９と、図１４Ａおよび１４Ｂに示す。
Figure 0005224477
 表９は、４℃で４日間と比較した、３７℃で４日間インキュベートした不飽和であるＳＡでコーティングされたマイクロ粒子の検証ロットについての平均の較正器、対照量、および患者量の回収率を示す。表９から見ることができるように、全てのロットについての平均の回収率は、１００％であったか、またはほぼ１００％であった。
図１４Ａおよび１４Ｂにおいては、回収率は、４℃で１２７日の後にＦＴ４についてアッセイすることによって測定したＲＬＵと比較した、３７℃で１２７日の後にＦＴ４についてアッセイすることによって測定したＲＬＵの割合（「回収率」）として表す。較正器レベルは、Ｓ０＝０．０ｎｇ／ｍＬ、Ｓ１＝０．５４ｎｇ／ｍＬ、Ｓ２＝１．０１ｎｇ／ｍＬ、Ｓ３＝１．９８ｎｇ／ｍＬ、Ｓ４＝３．００ｎｇ／ｍＬ、そしてＳ５＝６．１１ｎｇ／ｍＬであった。較正器から離れて、アッセイした試料には、Ｂｉｏ−Ｒａｄ対照１＝０．６４ｎｇ／ｍＬ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ対照２＝２．１８ｎｇ／ｍＬ、およびＢｉｏ−Ｒａｄ対照３＝４．１９ｎｇ／ｍＬ（「Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｌｙｐｈｏ」）、および５つの異なる患者試料（「患者＃」）（患者１＝１．０２ｎｇ／ｍＬ、患者２＝１．１２ｎｇ／ｍＬ、患者３＝１．８３ｎｇ／ｍＬ、患者４＝２．７４ｎｇ／ｍＬ、および患者５＝３．８０ｎｇ／ｍＬを含む）を含めた。全般的には、回収率は１００％またはほぼ１００％であり、これは高温での長時間にわたる処理が不飽和であるマイクロ粒子の性能に悪影響を与えないことを示している。比較の目的のために、市販されているＳＡでコーティングされたマイクロ粒子（Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４アッセイ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を使用したｆｒｅｅ Ｔ４アッセイについての記載を図１４Ａおよび１４Ｂに含めた（「現在のＦＴ４ Ａｓｓａｙの詳細」）。不飽和であるマイクロ粒子は、市販されているｆｒｅｅ Ｔ４アッセイの記載に含まれた。
全般的には、加速型の安定性試験によって、個別に生産されたＳＡでコーティングされたマイクロ粒子のロットが極めて安定であることを確認した。４℃で３日間または３７℃で３日間インキュベートした検証ロットの間では有意な差は観察されなかった。較正器シグナルは極めて似ており（９９．１％から１１３．５％の較正器回収率）、平均の対照量および患者量の回収率は、全て、９７．２％から１０２．９％であった。
１つのロットを４℃または３７℃で１２７日間インキュベートした場合には、性能の有意な差は観察されなかった。較正器シグナルは極めて似ており（９５．１％から１０９．６％の較正器回収率）、比率曲線は極めて似ており（９１．３％から１０５．１％の回収率（％））、そして平均の対照量および患者量の回収率は全て、９３．７％から１０７．６％であった。
（実施例８）
不飽和であるマイクロ粒子の脱落の分析
本発明にしたがって作製した不飽和であるマイクロ粒子の脱落について実験を行った。ビオチン−ＢＳＡを使用し、ＳＡでコーティングした本発明にしたがって作製したマイクロ粒子の中には、およそ８．７〜１４．０μｇのビオチン−ＢＳＡ／ｍｇ ＰＭＰと、５．６〜７．８μｇのＳＡ／ｍｇ ＰＭＰが存在していた（実施形態１１を参照のこと）。タンパク質のうちの１％が１０ｍｇの全ＰＭＰから脱落した場合には、溶液中にはおよそ０．７〜１．０μｇのタンパク質が存在する。脱落の分析を、そのようなＳＡでコーティングされたマイクロ粒子について行った。ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーの結果は、２１０ｎｍでは検出できるＳＡまたはＢＳＡを示さなかったか、あるいは、１％未満の脱落を示した。ＳＡおよび／またはビオチン−ＢＳＡが溶液の中で遊離している状態である場合には、これらは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ法の検出限界を下回った（図１５Ａおよび１５Ｂを参照のこと）。図１５Ｂにおいては、ガンマグロブリンおよびオボアルブミンＳＥＣ標準物のピーク（ピーク高さ約１，４００ｍＡＵ）は、２１０ｎｍで８３．５μｇの全タンパク質を示す。５ｍＡＵ（ミリ吸着単位）のピーク高さは、０．３μｇのタンパク質を示す。２１０ｎｍでのサイズ排除ＨＰＬＣ分析は、マイクロ粒子に３７℃で３日間のストレスをかけた後の溶液の中に検出可能なビオチン−ＢＳＡまたはＳＡ分子は存在しなかったことを示していた（例えば、マイクロ粒子表面からのタンパク質の脱落はなかった）。したがって、脱落は、本発明にしたがって作製したマイクロ粒子に付随する問題を示すことはない。上記に示した安定性のデータは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ ＳＡの脱落分析の結果をサポートする。なぜなら、アッセイシグナル、そしておそらくはビオチン化されたＩｇＧへの結合は、３７℃で１２７日までマイクロ粒子にストレスをかけることによっては影響を受けなかったからである（図１４Ａ〜Ｂ）。
（実施例９）
オボアルブミンの低入力比でのビオチン化
本発明のマイクロ粒子を、ビオチンと結合させたＢＳＡの代わりに、ビオチンと結合させたオボアルブミンを用いて作製した。オボアルブミンは、実施例１でＢＳＡについて記載したように、オボアルブミンに対するビオチンの様々なモル入力比（表１０を参照のこと）で、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（スルホスクシンイミジル−６−［ビオチンアミド］ヘキサノエート、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でビオチン化した。簡単に説明すると、様々な入力比のスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンで、ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．２）およびＤＭＦの中のオボアルブミン（１．２５３ｍＬ中の２０ｍｇ）をビオチン化するために、４つの異なるビオチン化ロットを、表１０に示すように準備した。
Figure 0005224477
 ビオチンに対する収率（％）は、２の入力比については７５．６％；４の入力比については８３．３％；６の入力比については８５．１％；そして８の入力比については７９．１％であった。ＨＡＢＡ（４’−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）分析を、それぞれの入力比について行った。結果を表１１に示す。
Figure 0005224477
 ビオチン化されたオボアルブミンの４つの別々のビオチン化ロットの安定性分析を、２５ｍｇ／ｍＬのトシル活性化ＰＭＰ（Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ＭｙＯｎｅ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ，１．０ミクロンの直径、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をオボアルブミン−ビオチンで、３７℃で１８〜２４時間、０．１Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）（ＰＭＰ１ｍｇあたり０．０５０ｍｇのオボアルブミン−ビオチン）の中でコーティングすること、マイクロ粒子をＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄すること、オボアルブミン−ビオチンでコーティングされたマイクロ粒子表面をＴＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８で３７℃で４時間ブロックすること、マイクロ粒子をＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄すること、オボアルブミン−ビオチンマイクロ粒子をＴＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．４％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８の中に分散させること、オボアルブミン−ビオチンマイクロ粒子を、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中のＳＡで室温で３０分間コーティングすること（オボアルブミン−ビオチンＰＭＰ１ｍｇあたり０．０３５ｍｇのＳＡ）、マイクロ粒子を、アジ化ナトリウム（０．１％ｗ／ｖ）を含むＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄すること、マイクロ粒子をＡｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４アッセイ特異的マイクロ粒子緩衝液で３回洗浄すること、２５ｍｇ／ｍＬから０．３５ｍｇ／ｍＬのマイクロ粒子をＡｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４アッセイ特異的マイクロ粒子緩衝液で稀釈すること、オボアルブミン−ビオチン−ＳＡでコーティングされたマイクロ粒子を４℃または３７℃で３日間インキュベートすること、そして、Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４アッセイ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）においてビオチン化された抗Ｆｒｅｅ Ｔ４抗体に結合するオボアルブミン−ビオチン−ＳＡマイクロ粒子の能力を試験することによって完了した。安定性は、個々のｆｒｅｅ Ｔ４較正器ＲＬＵ回収率の平均を計算することによって決定した。Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ Ｔ４アッセイでは、０ｎｇ／ｍＬから６ｎｇ／ｍＬまでの抗原レベルを有している６つの異なる較正器（Ｓ０、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、およびＳ５）を使用した（表４を参照のこと）。回収率は、３７℃の較正器ＲＬＵ応答を４℃の較正器ＲＬＵ応答で割り算し、結果に１００％を掛け算することによって計算した。安定性は、６個の較正器全てについて回収率を平均することによって計算した。結果を表１１に示す。
安定性は、４℃または３７℃で３日間、固相をインキュベーションした後のＳＡ結合能力の変化の指標である。安定性の低下は、オボアルブミン−ビオチン結合体からの受動的に結合したビオチンもしくはビオチン試薬の脱落または解離、ならびに、その後のＳＡによる遊離のビオチンもしくはビオチン試薬の経時的な捕捉が原因である。
表１１は、ＢＳＡ以外のタンパク質（例えば、オボアルブミン）を、本明細書中に記載される低入力比でのビオチン化を使用して効率よく調製できることを立証する。オボアルブミン−ビオチンの安定性試験の結果は、先に記載したビオチン−ＢＳＡ安定性試験の結果と極めて似ていた（表１を参照のこと）。結果は、高モル入力比（すなわち、８：１）で調製したオボアルブミン−ビオチンが、低い安定性を示すことを示していた。オボアルブミンに対するビオチン試薬のモル入力比が８：１から２：１に低下するに伴い、安定性は、８２％から９７％に改善された（表１１を参照のこと）。
（実施例１０）
親和性アッセイのためのマイクロ粒子の表面上のビオチン、ＳＡ、および免疫グロブリンの密度
本発明のＰＭＰを、支持体連結器としてＢＳＡを、そしてリガンドとしてビオチンを使用して作製した。ＳＡを、捕捉部分としてのビオチン化されたＩｇＧに結合させるために使用した。
簡単に説明すると、Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＰＭＰｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、実施例１の手順にしたがって作製した（すなわち、ＰＭＰを、実施例１のプロトコールにしたがって調製した低入力比のビオチン−ＢＳＡでコーティングした）。マイクロ粒子を本発明にしたがって調製し、低入力比のビオチン−ＢＳＡ、次いで、ＳＡで、本発明にしたがってコーティングした。その後、ＳＡでコーティングされたＰＭＰを、ビオチン化されたＩｇＧで処理した。以下のＩｇＧを使用した：ビオチン化されたＭ０６ ＩｇＧ（これは、Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）ＡｃｃｕＴｎｌ Ａｓｓａｙ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）において検出抗体（すなわち、アルカリホスファターゼに結合させられた）として使用したＭｃ×Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）ＡｃｃｕＴｎｌモノクローナル抗体である）、およびビオチン化された３９９．４ ＩｇＧ（これは、Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｆｒｅｅ ＰＳＡ Ａｓｓａｙ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）において捕捉抗体（すなわち、これはヤギ抗ビオチンＰＭＰ上にコーティングされた）として使用されたＭｃ×ＦＰＳＡモノクローナル抗体である）。本発明にしたがって調製したＳＡ ＰＭＰの様々なロットを、Ｍ０６ ＩｇＧまたは３９９．４ ＩｇＧでコーティングして、先に記載したように１２５Ｉで標識されたビオチン化されたＩｇＧ法を使用して、ＳＡ ＰＭＰロットのビオチン化されたＩｇＧに結合する能力を評価した。マイクロ粒子についての記述と、表面の構成成分の表面密度に関する結果を表１２に示す。
Figure 0005224477
 表１２のデータはモル値に変換することができる。この変換によって、示した例において約２．４６×１０（μｍｏｌビオチン）／（ｍｇ ＰＭＰ）が存在することが明らかである（Ａを参照のこと）。７．７×１０−３ｍ２／（ｍｇ ＰＭＰ）の表面を有している約１ミクロンの直径のマイクロ粒子については、約３．１９×１０−２（μｍｏｌビオチン）／（ｍ２ ＰＭＰ）が存在していた。
上記のロットに加えて、ビオチン化されたＰＭＰを本発明にしたがって作製し、これは、７．７ｍ２／ｇの表面積を有している１．１０ミクロンのＰＭＰについて１５．１（μｇのビオチン−ＢＳＡ）／（ｍｇ ＰＭＰ）の密度を有することが明らかになった。
上記のロットに加えて、３つのさらなる検証ロットを同じ様式で準備した。これらのさらなるロットを表１３に記載する。
Figure 0005224477
 モル数に関して表１３のデータを見ると、約６．１（μｇのＳＡ）／（ｍｇ ＰＭＰ）が存在し、ＳＡについての５６ｋＤａの分子量を使用すると仮定すると、約１．４１×１０−２（μｍｏｌのＳＡ）／（ｍ２ ＰＭＰ）が存在する。したがって、表１２のデータと比較すると、ビオチンとしてのマイクロ粒子上のＳＡの量の約半分であると見られる。
（実施例１１）
上記で記載した実施例において調製したロットについて、ＢＳＡ、ビオチン、ＳＡ、およびＩｇＧの表面密度の計算を行った。良好な安定性を示した（１３のロット）表１の低入力比でのビオチン化ロットを使用して、マイクロ粒子についての表面密度を得た。マイクロ粒子について、および粒子ではない支持体についての実際の表面密度の計算（マイクロ粒子に基づく）を、図１６Ａおよび１６Ｂに、そして表１４に以下に示す。滑らかな表面を仮定する、マイクロ粒子についての表面密度の計算、および粒子ではない支持体についての表面密度の計算（「滑らかな」マイクロ粒子データに基づく）を、図１６Ａ、１６Ｃ、１６Ｄ、そして以下の表１５に示す。
表面密度の計算は、物理的な試験のパラメーターに基づいた。簡単に説明すると、コーティング工程の間に表面上にコーティングされたＢＳＡおよびＳＡの量を、コーティング工程の後に上清液の分析によって、タンパク質濃度の決定のＢＣＡ方法（ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ［ビシンコニン酸］；Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および／または２８０ｎｍでの吸光度（ＢＳＡとＳＡについて）を使用して測定した。ＨＡＢＡ分析を使用して、ＢＳＡ上のビオチンの量を定量した。１２５Ｉの結合を使用して、ビオチン−ＩｇＧの結合能力を評価した。簡単に説明すると、ＴＢＳ中のマイクロ粒子に既知の量のＢＳＡを加え、インキュベートし、マイクロ粒子を上清液から分離させた。上清液の中に残っているタンパク質を測定し、加えたタンパク質の量から引き算した、マイクロ粒子を洗浄し、タンパク質含有量について洗浄物を分析した。ＴＲＩＳ−緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）を、マイクロ粒子に対する抗体のカップリング、さらには結合のために使用した。計算は、（ａ）マイクロ粒子の製造業者によって提供される実際の測定された表面積と、（ｂ）マイクロ粒子の直径と滑らかであるとの仮定に基づいて計算した表面積に基づいて行った。
表１４に示した表面密度の測定のために、マイクロ粒子の表面積（乾燥固体の重量を使用した計算に基づく）は、７．４ｍ２／ｇの最小から８．４ｍ２／ｇの最大までの範囲にあり、７．７ｍ２／ｇの中央域を有していた。
Figure 0005224477
 表１４（市販されているマイクロ粒子（Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ＭｙＯｎｅ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ，１．０ミクロンの直径；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の測定に基づく）において見ることができるように、一旦、リガンド（例えば、ビオチン）が不飽和であれば、その後の結合表面の層もまた不飽和であろう。特異的な実施形態においては、約０．００７７ｍ２／ｍｇの表面積を有しており、示された量のビオチン化されたＢＳＡおよびＳＡでコーティングされた、１ミクロンのマイクロ粒子は、ＰＭＰ１ｍｇあたり２．１×１０−５μｍｏｌのビオチン−ＩｇＧに結合した。
表１５に示した表面密度の測定については、マイクロ粒子の表面積（滑らかであるとの仮定に基づく、０．９０から１．１０μｍまでのマイクロ粒子の直径、および１．４から１．８ｇ／ｃｍ３のマイクロ粒子の密度）は、０．００３０ｍ２／ｍｇの最小から０．００４８ｍ２／ｍｇの最大までの範囲であった。
Figure 0005224477
 表１５では滑らかな表面を仮定する。重ねて、表１５において見ることができるように、一旦リガンド（例えば、ビオチン）が不飽和であれば、その後の結合表面の層もまた不飽和であろう。しかし、滑らかであるとの仮定が原因で、表面密度の計算により、滑らかであると仮定しなかった表面密度の計算（表１４を参照のこと）と比較して、１平方メートルあたりのリガンド（ビオチン）のより大きなμｍｏｌ数、１平方メートルあたりの支持体連結器（ＢＳＡ）のより大きなμｍｏｌ数、１平方メートルあたりのリガンド結合基（ＳＡ）のより大きなμｍｏｌ数、および１平方メートルあたりの捕捉部分（ビオチン−ＩｇＧ）のより大きなμｍｏｌ数が生じる。表面密度の増大は、μｍｏｌ／ｍｇのビオチン、ＢＳＡ、ＳＡ、またはビオチン−ＩｇＧは一定であるが、滑らかであると仮定したマイクロ粒子表面の全表面積が、滑らかさの補正をしなかったマイクロ粒子の全表面積よりも小さいという事実が原因である。例えば、２つのマイクロ粒子が同じ直径と形状を有しているが、１つのマイクロ粒子が多孔性であり、他方のマイクロ粒子が完全に滑らかである場合には、多孔性のマイクロ粒子は、滑らかなマイクロ粒子よりも、単位質量あたりより大きな利用可能な表面積（ｍ２／ｍｇ）を有するであろう。いずれのマイクロ粒子もりに結合でき、これらがいずれも、同じ量のリガンドを提供する場合には、多孔性のマイクロ粒子は、滑らかなマイクロ粒子よりも１平方メートル当たりより少ない数のリガンドに結合するであろう。

Claims (24)

  1. ａ）不飽和である結合表面を有する固相支持体；
    ｂ）少なくとも１つのリガンドであって、最大未満の該リガンドが該固相支持体に連結される、リガンド、
    ｃ）タンパク質を含み、該固相支持体上に共有結合的に固定される少なくとも１つの支持体連結器であって、飽和量未満の該支持体連結器が該固相支持体に固定され、該リガンドは、該支持体連結器に共有結合的に連結される、支持体連結器、および
    ｄ）少なくとも２つの親水性テール基が隣接している疎水性頭部基を含むブロックコポリマーであって、該疎水性の頭部基が該アッセイ支持体と接触する、ブロックコポリマーを含み、
    該リガンドはビオチンであり、ビオチン対支持体連結器の比率が５：１未満または５：１に等しい、親和性結合支持体。
  2. 前記ビオチン対支持体連結器の比率が、３：１未満または３：１に等しい、請求項１に記載の不飽和である親和性結合支持体。
  3. 前記支持体がマイクロ粒子の形態であり、前記不飽和である結合表面が、アッセイ支持体１平方メートルあたり１．９×１０−２から６．６×１０−２マイクロモルのビオチンを有している、請求項１または２に記載の不飽和である親和性結合支持体。
  4. 前記リガンドと結合した少なくとも１つのリガンド結合基がさらに含まれている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の不飽和である親和性結合支持体。
  5. 前記リガンド結合基が少なくとも２価であり、該２価のリガンド結合基に、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジンの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはそれらの組み合わせが含まれている、請求項４に記載の不飽和である親和性結合支持体。
  6. 前記リガンド結合基と結合した捕捉部分がさらに含まれている、請求項５に記載の不飽和である親和性結合支持体。
  7. 前記捕捉部分が前記アッセイ支持体に対して空間的配向性を持つか、または該アッセイ支持体に対して空間的配向性および物理的配向性を持つ、請求項６に記載の不飽和である親和性結合支持体。
  8. 前記支持体連結器が、ウシ血清アルブミン、ウシ血清アルブミンの断片、オボアルブミン、オボアルブミンの断片、またはそれらの混合物のうちの少なくとも１つから選択されるタンパク質または融合タンパク質を含む、請求項１に記載の不飽和である親和性結合支持体。
  9. 前記リガンドがビオチンであり、前記リガンド結合基が少なくとも２価であり、該少なくとも２価のリガンド結合基に、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジンの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはそれらの組み合わせが含まれ、前記捕捉部分がビオチン化され、かつ少なくとも１つの抗体、抗体の結合断片、受容体、受容体のリガンド、ホルモン、ホルモンの受容体、酵素、酵素の基質、１本鎖のオリゴヌクレオチド、２本鎖のオリゴヌクレオチド、１本鎖のポリヌクレオチド、２本鎖のポリヌクレオチド、抗原、ペプチド、およびタンパク質からなる群より選択される、請求項６に記載の不飽和である親和性結合支持体。
  10. 前記ビオチン化された捕捉部分にスペーサーが含まれている、請求項９に記載の不飽和である親和性結合支持体。
  11. 前記固相支持体に、マイクロ粒子、ビーズ、マイクロタイタープレート、コーティングされたチューブ、マイラーが裏打ちされたニトロセルロース支持体、ナイロン支持体、微小管、ナノ粒子、ナノチューブ、または常磁性もしくは超常磁性物質が含まれる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の不飽和である親和性結合支持体。
  12. 前記リガンド結合基と結合した少なくとも１つの第２の捕捉部分がさらに含まれている、請求項５に記載の不飽和である親和性結合支持体。
  13. さらに：
    ａ）該ビオチンと結合したビオチン結合部分であって、該ビオチン結合部分は少なくとも２価である、ビオチン結合部分；
    ｂ）該ビオチン結合部分と結合したビオチン化された捕捉部分；および
    ｃ）該支持体と接触するブロックコポリマーであって、該ブロックコポリマーには、少なくとも２つのポリエチレンオキサイドテール基が隣接しているポリプロピレンオキサイド頭部基が含まれており、該ポリプロピレンオキサイド頭部基は該支持体と接触する、ブロックコポリマー
    が含まれている、請求項１に記載の不飽和であり配向性を持つ親和性結合支持体。
  14. 前記ブロックコポリマー中の２つ以上の親水性テールの長さが、それぞれ独立して、前記疎水性頭部基の長さの２倍から２．５倍であり得る、請求項８に記載の親和性結合支持体。
  15. 前記ブロックコポリマーが、式Ｉ：
    ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｘ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｙ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｚＨ （Ｉ）、
    の構造を含み、式中、ｘは１００から１３５であり、ｙは４０から７５であり、そしてｚは１００から１３５であり、該ブロックコポリマーが９，０００ダルトンから１８，０００ダルトンの平均分子量を有している、請求項１４に記載の親和性結合支持体。
  16. 請求項１に記載の不飽和である親和性結合支持体を調製する方法であって、該方法は、
    ａ）支持体連結器とリガンドを、共有結合的に連結する工程；および
    ｂ）リガンド：：支持体連結器複合体の不飽和である密度が生じるように、該リガンド：：支持体連結器複合体を該固相支持体に共有結合させる工程
    を包含する、方法。
  17. 前記支持体連結器が、ウシ血清アルブミン、ウシ血清アルブミンの断片、オボアルブミン、オボアルブミンの断片、またはそれらの混合物であり、そして前記リガンドがビオチンであり、そして該ウシ血清アルブミン、ウシ血清アルブミンの断片、オボアルブミン、オボアルブミンの断片、またはそれらの混合物である、請求項１６に記載の方法。
  18. ａ）前記固相支持体を複数のブロックコポリマー分子と接触させる工程であって、該ブロックコポリマー分子には、少なくとも２つの親水性テール基が隣接している疎水性頭部基が含まれる、工程、ならびに
    ｂ）該親和性結合支持体をリガンド結合基で、該親和性結合支持体を前記リガンド：：支持体連結器複合体の該リガンドと結合するリガンド結合基に曝露させることによってコーティングする工程
    による、不飽和であり配向性を持つ親和性結合支持体を調製する工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記親和性結合支持体が、コーティングされ、分散したマイクロ粒子の集団を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 請求項１に記載の不飽和である親和性結合支持体を調製する方法であって、該方法は、
    ａ）リガンド：：支持体連結器複合体、およびリガンドを欠く支持体連結器を含む空間充填部分を含む、分析物に結合する部分の混合物を調製する工程であって、該分析物に結合する部分は、目的の分析物と直接または間接的のいずれかで結合し、該空間充填部分は、目的の分析物とは直接または間接的のいずれでも結合しない、工程；ならびに
    ｂ）該分析物に結合する部分と該空間充填部分がアッセイ支持体と結合して、該アッセイ支持体と結合した分析物に結合する部分の量と比較して飽和していない、不飽和であるアッセイ結合表面を形成するように、該混合物を該アッセイ支持体に曝露させる工程、を包含する、方法。
  21. 前記不飽和であるアッセイ結合表面にブロックコポリマーがさらに含まれており、該ブロックコポリマーには、少なくとも２つの親水性テール基が隣接している疎水性の頭部基が含まれている、請求項２０に記載の方法。
  22. 分析物の親和性アッセイにおける請求項６に記載の不飽和であるアッセイ結合支持体の使用であって、該親和性アッセイは、
    該不飽和である親和性結合支持体を該分析物と接触させる工程であって、捕捉部分が特異的に該分析物に結合する、工程、ならびに、
    該分析物の不飽和であるアッセイ結合表面との結合を検出する工程、
    を包含する、使用。
  23. 分析物特異的な前記捕捉部分がビオチン化される、請求項２２に記載の使用。
  24. 前記親和性アッセイが免疫測定法である、請求項２３に記載の使用。
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Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050118727A1 (en) * 2003-12-01 2005-06-02 Carsten Schelp Conjugates and their use in detection methods
WO2009005552A2 (en) * 2007-03-29 2009-01-08 Epitype Corporation Methods and compositions for multivalent binding and methods for manufacture of rapid diagnostic tests
EP2199391B1 (en) 2007-09-27 2015-11-11 Japan Tobacco, Inc. Factor involved in latent infection with herpesvirus, and use thereof
US7842475B2 (en) * 2008-01-08 2010-11-30 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Stabilization of solid support assay reagents
ES2562659T3 (es) * 2008-04-29 2016-03-07 Psychemedics Corporation Ensayo de múltiples analitos en fase sólida
US20100051554A1 (en) * 2008-08-28 2010-03-04 Dong June Ahn Molecular basket coated micro particles
AU2010219698A1 (en) * 2009-03-02 2011-10-13 Japan Tobacco Inc. Method for detecting substance in biological sample
JP5628793B2 (ja) * 2009-03-31 2014-11-19 日本たばこ産業株式会社 生物学的試料中の物質を検出する方法
TW201040529A (en) * 2009-03-31 2010-11-16 Japan Tobacco Inc Method for detecting antibody against SITH-1 in biological sample
WO2012044387A2 (en) * 2010-07-06 2012-04-05 T2 Biosystems, Inc. Methods and compositions for detection of analytes
CN102207501A (zh) * 2011-03-22 2011-10-05 沃克(天津)生物科技有限公司 生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板及其制备方法
CN102331495B (zh) * 2011-06-21 2013-12-25 沃克(天津)生物科技有限公司 食物过敏原检测试剂盒及其制备方法
GB2497317A (en) * 2011-12-06 2013-06-12 Univ Dublin System and method for the detection of analytes using rod-shaped nanoparticles
JP6231263B2 (ja) * 2012-07-17 2017-11-15 株式会社島津製作所 アフィニティ支持体及びそれを用いた物質の捕捉方法
CN102809650B (zh) * 2012-08-29 2015-02-11 沃克(天津)生物科技有限公司 生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素酶标板及其制备方法
US20140072959A1 (en) * 2012-09-12 2014-03-13 Force Diagnostics, Inc. Rapid tests for insurance underwriting
US20160003819A1 (en) * 2012-09-12 2016-01-07 Force Diagnostics, Inc. Rapid tests for insurance underwriting
WO2014176435A2 (en) * 2013-04-25 2014-10-30 Bergo Vladislav B Microarray compositions and methods of their use
CN103954771B (zh) * 2014-04-28 2016-02-17 陕西师范大学 一种低成本捕获/释放及检测生物分子的方法
AU2016250689B2 (en) 2015-04-22 2021-07-08 Berkeley Lights, Inc. Microfluidic cell culture
ES2865500T3 (es) * 2015-10-16 2021-10-15 Toyo Boseki Pieza de prueba inmunocromatográfica
US10799865B2 (en) 2015-10-27 2020-10-13 Berkeley Lights, Inc. Microfluidic apparatus having an optimized electrowetting surface and related systems and methods
CN105467130A (zh) * 2015-11-16 2016-04-06 北京中航赛维生物科技有限公司 一种使用磁微粒化学发光定量检测抗Sm抗体IgG的试剂盒及其制备方法和检测方法
US10539578B2 (en) 2015-12-28 2020-01-21 Japan Tobacco Inc. Method for diagnosing, treating, or preventing mood disorders
US10818420B2 (en) 2016-03-03 2020-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Anti-fouling and specific binding surface, dispersions comprising particles having such surfaces, and methods of making these
WO2017170994A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 古河電気工業株式会社 細胞収容チップ
US10948484B2 (en) 2016-04-11 2021-03-16 Veravas, Inc. Sample depletion and enrichment to improve the quality of diagnostic test results
WO2017205830A1 (en) * 2016-05-26 2017-11-30 Berkeley Lights, Inc. Covalently modified surfaces, kits, and methods of preparation and use
CN106057394B (zh) * 2016-06-01 2018-02-13 深圳市瀚德标检生物工程有限公司 一种免疫磁性纳米微粒的制备方法
CA3073832A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 Adeptrix Corp. Multiplexed bead arrays for proteomics
ES2953017T3 (es) * 2018-04-03 2023-11-07 Sanofi Sa Dispositivo de tira de inmunoensayo de flujo lateral
CN112424589A (zh) * 2018-07-30 2021-02-26 美国西门子医学诊断股份有限公司 用于进行生物素测定的试剂盒、微流体装置和方法
WO2020061499A1 (en) 2018-09-21 2020-03-26 Berkeley Lights, Inc. Functionalized well plate, methods of preparation and use thereof
JP7054378B2 (ja) * 2018-11-08 2022-04-13 富士レビオ株式会社 Ｃａ１９－９測定方法及びｃａ１９－９測定キット、並びに、これらに用いる抗体固定化担体及びその製造方法
CN109932305B (zh) * 2019-03-27 2024-04-12 西安交通大学 一种测试非饱和颗粒材料粒间接触角的实验装置和方法
DE102020001916B3 (de) * 2020-03-24 2021-08-12 Ava Lifescience Gmbh Mikropartikel für bioanalytische Untersuchungen und Verfahren zum Herstellen eines solchen Mikropartikels
CN111679086B (zh) * 2020-08-11 2020-11-13 苏州康和顺医疗技术有限公司 一种hbp的磁微粒化学发光法检测试剂盒及其制备方法
CN113030461B (zh) * 2021-03-12 2022-04-22 北京华科泰生物技术股份有限公司 含氨基或羧基基团物质标记的IgG抗体、人IgG磁微粒化学检测试剂盒及其制备方法
CN114046749B (zh) * 2021-10-26 2022-07-08 刘红霞 预制混凝土构件点状凹坑结合面粗糙度检测方法及系统
CN116793795B (zh) * 2023-08-29 2023-11-07 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所 一种农产品中农药残留检测装置

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5847258A (ja) * 1981-09-01 1983-03-18 イ−・アイ・デユポン・ド・ネモア−ス・アンド・コンパニ− 光散乱イムノアツセイ用粒子試薬
US4480042A (en) * 1981-10-28 1984-10-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Covalently bonded high refractive index particle reagents and their use in light scattering immunoassays
JPS61252215A (ja) * 1984-05-07 1986-11-10 エイチ・エス・シ−・リサ−チ・デイベロツプメント・コ−ポレイシヨン アミノ基を有する分子の固定化用物質、その製造方法およびその使用方法
DE3532626A1 (de) * 1985-09-12 1987-03-19 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung eines partners einer immunreaktion
JP2619549B2 (ja) * 1989-06-29 1997-06-11 日本商事株式会社 抗原の定量法およびそれに用いる固相
DE4219159A1 (de) * 1992-06-11 1993-12-16 Boehringer Mannheim Gmbh Selbst assemblierende Monoschicht mit kurzkettigen Linkern
US5516703A (en) * 1993-08-20 1996-05-14 The University Of Utah Coating of hydrophobic surfaces to render them protein resistant while permitting covalent attachment of specific ligands
AU704947B2 (en) * 1993-05-18 1999-05-06 University Of Utah Research Foundation Apparatus and methods for multianalyte homogeneous fluoroimmunoassays
US6284503B1 (en) * 1993-08-20 2001-09-04 University Of Utah Research Foundation Composition and method for regulating the adhesion of cells and biomolecules to hydrophobic surfaces
DE19724787A1 (de) * 1997-06-06 1998-12-10 Biotez Berlin Buch Gmbh Bioche Streptavidin/Avidin beschichtete Oberflächen
US6372448B1 (en) * 1998-12-30 2002-04-16 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Use of ylqF, yqeG, yybQ, and ysxC, essential bacterial genes and polypeptides
US6638728B1 (en) 2000-06-16 2003-10-28 Pierce Biotechnology, Inc. Coated surfaces with high capacity for capturing target molecules
US20040072262A1 (en) * 2002-10-11 2004-04-15 Montero-Julian Felix A. Methods and systems for detecting MHC class I binding peptides
JP4022816B2 (ja) * 2002-10-28 2007-12-19 東洋紡績株式会社 蛋白質もしくはペプチドのＫｉｎｅｔｉｃｓ解析方法および解析用基板
US6821744B2 (en) * 2002-10-29 2004-11-23 Roche Diagnostics Operations, Inc. Method, assay, and kit for quantifying HIV protease inhibitors
DE10310261A1 (de) * 2003-03-05 2004-09-23 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Identifizierung von Antigen-Epitopen
FR2855613B1 (fr) * 2003-05-26 2005-08-19 Biocytex Procede de detection et de quantification multiplex d'analytes dans un echantillon a l'aide de microspheres
ATE488767T1 (de) 2003-07-22 2010-12-15 Beckman Coulter Inc Verfahren zum nachweis der aktivierung von t- zellen durch mhc-bindende peptide
ATE426809T1 (de) * 2003-07-28 2009-04-15 Jsr Corp Oberflache eines bei nichtspezifischer adsorption inhibierten basismaterials
JP2005069891A (ja) * 2003-08-25 2005-03-17 Sekisui Chem Co Ltd 測定試薬用担体粒子及び測定試薬
JP4564959B2 (ja) * 2003-09-22 2010-10-20 バイオアレイ ソリューションズ リミテッド 生体分子に共有結合できる、複数の官能基を持つ表面固定化高分子電解質
JP4427312B2 (ja) * 2003-12-19 2010-03-03 三菱化学メディエンス株式会社 分析用キット
JP3774460B2 (ja) * 2004-01-30 2006-05-17 独立行政法人科学技術振興機構 物質の検出方法

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