KR101457716B1 - 친화도 분석을 위한 결합 표면 - Google Patents

친화도 분석을 위한 결합 표면 Download PDF

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조슈아 씨. 솔도
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Abstract

비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면, 및 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 제조하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상자성 마이크로입자 상에 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 사용하는 것을 포함하는, 친화도 분석을 위한 지지체 표면을 준비하기 위해 결합 표면을 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 임의로 지지체 커플러에 대한 낮은 투입비의 리간드를 사용하는 공정에 의해, 희석에 의해, 및 블록 공중합체를 사용하는 분산 및/또는 코팅 단계를 사용하는 방법에 의해 리간드::지지체 커플러-기반 복합체를 제조하는 방법을 포함한다. 비오틴-BSA 및 비오틴-오발부민 결합 표면을 사용하는 특정 예, 및 스트렙타비딘-코팅된 마이크로입자 및 예를 들어, 비오티닐화된 면역글로불린 또는 그의 단편과 같은 포획 모이어티로 코팅된 마이크로입자를 또한 제공한다. 다른 예는 리간드를 고체 표면에 커플링시킨다. 매우 다양한 분석물 및 포획 모이어티와 관련된 방법 및 조성물의 용도를 제공한다. 면역분석을 위한 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 제공한다. 분산된 마이크로입자 및 그를 제조하기 위한 방법도 제공한다.
친화도 분석, 결합 표면, 비-포화, 배향, 마이크로입자, 비오틴

Description

친화도 분석을 위한 결합 표면 {BINDING SURFACES FOR AFFINITY ASSAYS}
<관련 출원에 대한 교차 참조>
본원은 2006년 11월 1일 출원된 미국 특허 가출원 60/863,820을 기초로 한 우선권을 주장한다.
본 발명은 친화도 분석에서 사용하기 위한 리간드를 포함하는 결합 표면을 갖는 지지체를 비롯한, 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 갖는 지지체에 관한 것이다. 본 발명의 특정 측면은 비오틴, 또는 비오틴 및 비오틴-특이적 리간드 바인더 (binder), 예를 들어 스트렙타비딘 (SA)을 포함하는 결합 표면에 관한 것이다. 항원 또는 항체 또는 그의 단편을 포함하는 결합 표면을 포함하는 면역분석을 위한 결합 표면을 제공한다. 본 발명의 추가의 실시태양은 차단된 고체 지지체 표면 및 분산된 마이크로입자에 관한 것이다. 상기 지지체를 제조하고 사용하기 위한 방법을 제공한다.
결합 표면은 예를 들어 친화도 분석을 비롯한 매우 다양한 용도에서 사용된다. 통상적인 결합 표면은 대개 고상 지지체 표면의 단위 표면적당 리간드 바인더의 양을 최대화함으로써 제조된다. 통상적인 방안은 고밀도의 리간드 바인더를 갖는 지지체 표면을 생성하지만, 단순히 지지체 표면 상의 리간드 바인더의 수를 최 대화하는 것이 반드시 결합 표면의 성능을 개선하는 것은 아니다. 친화도 분석에서 사용되는 일부 통상적인 결합 표면은 고상 상에 리간드 바인더, 예를 들어 항체, 또는 비오틴-특이적 리간드 바인더, 예를 들어 SA를 직접 코팅하고 고상을 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 오발부민으로 차단함으로써 결합능을 최대화한다. 이는 결합 표면의 항원 또는 비오틴 결합능을 최대화하지만, 각각의 항체 또는 비오틴-특이적 리간드 바인더는 구체적인 배향 없이 결합 표면 상에 군집하고, 전통적인 차단 전략이 반드시 결합 표면으로부터 항체 또는 비오틴-특이적 리간드 바인더의 탈락 (sloughing)을 방지 또는 완화하지는 않는다. 또한, 탈락은 분석 감도 (최적 미만의 (sub-optimal) 신호 대 노이즈 (noise) 비), 정확도, 정밀도, 안정성, 또는 제조가능성, 또는 이들의 조합을 불량하게 할 수 있다. 결합 표면 군집 및 무작위 배향은 입체 장애로 인해 결합 표면의 결합 효율 또는 결합능을 감소시킬 수 있다. 따라서, 단순히 결합 표면 상의 리간드 바인더의 밀도를 최대화하는 것에 의존하지 않는 개선된 결합 표면 및 개선된 결합 표면을 제조하기 위한 조성물 및 방법이 필요하다.
<발명의 개요>
비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면, 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 제조하기 위한 방법, 및 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면의 성분을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 면역분석과 같은 친화도 분석을 위한 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 위한 방법 및 조성물을 또한 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 면역분석을 위해 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 포획 모이어티 (moiety)를 제조하기 위한 방법 및 조성물을 제공하고, 여기서 포획 모이어티는 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면에 대한 결합에 의해 비-포화되거나 비-포화되고 배향된다. 특정 실시태양에서, 포획 모이어티는 면역글로불린 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 포획 모이어티는 지지체 커플러 (coupler) 상에 고정된 리간드와의 회합에 의해 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면 상에 고정되고, 여기서 지지체 커플러는 고상 지지체 상에 고정된다. 특정 실시태양에서, 면역글로불린 또는 그의 단편은 비오티닐화되고, 상기 비오티닐화된 면역글로불린 또는 그의 단편은 비오틴-특이적 리간드 바인더 (비오틴 결합 모이어티)와 회합되고, 비오틴-특이적 리간드 바인더는 직접 또는 지지체 커플러를 통해 지지체에 부착된 비오틴과 회합된다. 특정 실시태양에서, 지지체 커플러는 단백질을 포함하고, 고상 지지체는 마이크로입자를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 갖는 지지체를 사용하여 면역분석을 수행하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 분석물을 포획하기 위해 면역글로불린 또는 그의 단편을 사용하는 것을 포함하고, 여기서 면역글로불린 또는 그의 단편은 결합 표면 상에서 비-포화되거나 비-포화되고 배향된다. 여러 실시태양에서, 면역글로불린 또는 그의 단편의 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 성질은 면역글로불린 또는 그의 단편이 결합하는 결합 표면의 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 성질에 의해 결정된다.
다른 측면에서, 본 발명은 직접적으로 또는 지지체에 커플링되는 지지체 커 플러에 대한 커플링을 통해 간접적으로 지지체와 커플링되는 리간드를 포함하는, 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 갖는 지지체를 제공하고, 여기서 리간드는 지지체의 제곱미터당 약 1.0 x 10-3 내지 약 5.0 x 10-1 마이크로몰의 리간드, 또는 지지체의 제곱미터당 약 0.5 x 10-2 내지 약 2.0 x 10-1 마이크로몰의 리간드, 또는 지지체의 제곱미터당 약 1.0 x 10-2 내지 약 1.6 x 10-1 마이크로몰의 리간드, 또는 지지체의 제곱미터당 약 1.0 x 10-2 내지 약 2.0 x 10-1 마이크로몰의 리간드의 밀도로 존재하거나, 별법으로 리간드는 마이크로입자의 밀리그램 (mg)당 약 0.5 x 10-4 내지 약 10 x 10-4 마이크로몰의 리간드, 또는 마이크로입자의 mg당 약 1.0 x 10-4 내지 약 5.5 x 10-4 마이크로몰의 리간드의 밀도로 존재한다. 여러 실시태양에서, 지지체 커플러는 분석 지지체 상에 분석 지지체의 제곱미터당 약 1.2 x 10-2 마이크로몰 내지 분석 지지체의 제곱미터당 약 7.5 x 10-2 마이크로몰의 밀도로 존재한다. 여러 실시태양에서, 리간드는 리간드 바인더와 회합되고, 여기서 리간드 바인더는 지지체의 제곱미터당 약 0.4 x 10-2 미만 내지 약 8 x 10-2 미만 마이크로몰의 리간드 바인더의 밀도, 또는 분석 지지체의 제곱미터당 약 1.0 x 10-2 내지 약 5.0 x 10-2 마이크로몰의 밀도로 존재한다.
본 발명의 실시태양은 분석 지지체 상에 분석 지지체의 제곱미터당 약 1.0 x 10-4 마이크로몰 내지 분석 지지체의 제곱미터당 약 2.0 x 10-2 마이크로몰의 밀도로 존재하는 포획 모이어티를 갖는 결합 표면에 관한 것이다. 여러 실시태양에서, 결합 표면은 포획 모이어티를 추가로 포함하고, 여기서 포획 모이어티는 지지체의 제곱미터당 약 2 x 10-3 미만 내지 약 4 x 10-2 미만 마이크로몰의 포획 모이어티의 밀도로 존재한다. 특정 실시태양에서, 리간드 (예를 들어, 비오틴)는 지지체의 제곱미터당 약 1.9 x 10-2 내지 약 1.6 x 10-1 마이크로몰의 리간드의 밀도로 존재하고, 리간드 바인더 (예를 들어, 비오틴 결합 모이어티, 예를 들어 SA)는 분석 지지체의 제곱미터당 약 1.0 x 10-2 내지 약 5.0 x 10-2 마이크로몰, 또는 지지체의 제곱미터당 약 1.2 x 10-2 내지 약 4.6 x 10-2 미만 마이크로몰의 리간드 바인더로 존재하고, 포획 모이어티 (예를 들어, 비오티닐화된 포획 모이어티, 예를 들어 비오티닐화된 분석물-특이적 항체)는 지지체의 제곱미터당 약 2.5 x 10-3 내지 약 1.4 x 10-2 마이크로몰의 포획 모이어티의 밀도로 존재한다. 본 발명의 적어도 하나의 실시태양에서, 지지체 커플러는 선택적이다. 상기 실시태양에서, 리간드는 비오틴 또는 그의 유도체일 수 있다.
특정 실시태양에서, 리간드는 비오틴 또는 그의 유도체를 포함한다. 다른 특정 실시태양에서, 리간드 바인더는 비오틴 결합 모이어티 또는 그의 단편, 예를 들어, 아비딘, SA, 뉴트라비딘, SA의 단편, 아비딘의 단편, 뉴트라비딘의 단편, 또 는 이들의 혼합물을 포함한다. 여러 실시태양에서, 포획 모이어티는 항체, 항체의 결합 단편, 수용체, 수용체의 리간드, 호르몬, 호르몬의 수용체, 효소, 효소의 기질, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드, 항원, 펩티드, 또는 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 여러 실시태양에서, 리간드는 지지체 커플러를 통해 지지체와 커플링되고, 이어서 지지체 커플러는 지지체와 커플링된다. 특정 실시태양에서, 지지체 커플러는 단백질을 포함한다. 특정 실시태양에서, 단백질은 BSA, 오발부민, BSA의 단편, 오발부민의 단편, 또는 이들의 혼합물이다. 특정 실시태양에서, 지지체는 마이크로입자이다. 특정 실시태양에서, 결합 표면은 지지체의 제곱미터당 약 1 x 10-2 내지 약 5 x 10-1 마이크로몰의 리간드를 갖거나, 별법으로 결합 표면은 지지체의 제곱미터당 약 2 x 10-2 내지 약 2 x 10-1 마이크로몰의 리간드를 갖는다. 다른 특정 실시태양에서, 결합 표면은 지지체의 제곱미터당 약 1.9 x 10-2 내지 약 1.6 x 10-1 마이크로몰의 리간드를 갖는다. 다른 특정한 실시태양에서, 결합 표면은 지지체의 제곱미터당 약 1.6 x 10-2 내지 약 6.6 x 10-2 마이크로몰의 리간드를 갖는다. 다른 특정 실시태양에서, 결합 표면은 지지체의 제곱미터당 약 1.6 x 10-2 내지 약 3.2 x 10-2 마이크로몰의 리간드를 갖는다. 다른 특정 실시태양에서, 결합 표면은 지지체의 제곱미터당 약 1.6 x 10-2 내지 약 2.0 x 10-1 마이크로 몰의 리간드를 갖는다.
여러 실시태양에서, 결합 표면은 리간드에 부착된 리간드 바인더 및 리간드 바인더에 부착된 포획 모이어티를 포함하고, 여기서 포획 모이어티는 여러 실시태양에서 리간드의 밀도의 약 75%, 리간드의 밀도의 약 50%, 및 리간드의 밀도의 약 25%의 밀도로 존재한다.
특정 실시태양에서, 리간드는 비오틴을 포함하고, 상기 비오틴은 BSA, 오발부민, BSA의 단편, 오발부민의 단편, 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 지지체 커플러 단백질을 통해 지지체와 커플링되고, 비오틴은 아비딘, SA, 뉴트라비딘, SA의 단편, 아비딘의 단편, 뉴트라비딘의 단편, 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 비오틴 결합 모이어티를 포함하는 리간드 바인더에 부착되고, 비오틴 결합 모이어티는 비오티닐화된 포획 모이어티에 부착되고, 여기서 포획 모이어티는 항체, 항체의 결합 단편, 수용체, 수용체의 리간드, 호르몬, 호르몬의 수용체, 효소, 효소의 기질, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드, 항원, 펩티드, 또는 단백질 중 하나 이상으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
다른 측면에서, 본 발명은 지지체 상에 배치된 복수의 지지체 커플러; 및 지지체 커플러와 커플링된 리간드를 포함하는, 비-포화되고 배향된 결합 표면을 갖는 지지체를 제공하고; 여기서 리간드는 비-포화되고, 입체적으로 접근가능한 리간드를 제공하는 방식으로 표면 상에 배향된다. 특정 실시태양에서, 리간드는 리간드와 특이적으로 회합할 수 있는 2가 또는 다가 리간드 바인더와 회합되고, 결합 표 면은 비결합된 유리 리간드가 실질적으로 없다.
여러 실시태양에서, 지지체 커플러는 지지체의 제곱미터당 약 1.9 x 10-2 내지 약 1.6 x 10-1 마이크로몰의 리간드와 커플링된다.
지지체 커플러는 공유 또는 비-공유 회합을 통해 지지체와 커플링될 수 있다. 여러 실시태양에서, 지지체 커플러는 지지체와 공유 커플링된다. 지지체 커플러가 지지체와 공유 커플링되는 실시태양에서, 지지체 커플러를 지지체에 부착하기 위해 당업계에 공지된 임의의 적합한 결합 화학을 이용할 수 있다. 적합한 결합 화학은 카르복실, 히드록실, 토실, 에폭시, 알데히드, 아민, 아미드, 히드라지드, 이소티오시아네이트, 말레이미드 및 술프히드릴로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 관능기를 통한 부착을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 지지체 커플러는 부착을 위해 토실 화학을 이용하여 지지체와 공유 커플링된다.
지지체 커플러는 지지체와 커플링되고 또한 리간드와 커플링될 수 있는 임의의 적합한 물질을 포함할 수 있다. 지지체와의 커플링 및 리간드와의 커플링은 공유일 수 있다. 적합한 지지체 커플러는 거대분자, 예를 들어 단백질 또는 다른 중합체를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 여러 실시태양에서, 지지체 커플러는 단백질을 포함한다. 단백질은 예를 들어 단량체, 이량체, 다량체 또는 융합 단백질일 수 있다. 특정 실시태양에서, 단백질은 적어도 하나의 알부민, 예를 들어, BSA, 오발부민, BSA의 단편, 오발부민의 단편, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
여러 실시태양에서, 리간드는 비오틴을 포함한다. 비오틴을 지지체 표면 또는 지지체 커플러에 부착하기 위한 적합한 비오틴 시약은 아민-반응성 비오틴 표지 시약, 예를 들어, 술포-NHS-비오틴, 술포-NHS-LC-비오틴, 술포-NHS-LC-LC-비오틴, 술포-NHS-SS-비오틴, NHS-PEO4-비오틴, NHS-비오틴, NHS-LC-비오틴, NHS-LC-LC-비오틴, PFP-비오틴, TFP-PEO-비오틴, 또는 NHS-이미노비오틴 트리플루오로아세트아미드, 술프히드릴-반응성 비오틴 표지 시약, 예를 들어, 말레이미드-PEO2-비오틴, 비오틴-BMCC, PEO-요오도아세틸 비오틴, 요오도아세틸-LC-비오틴, 또는 비오틴-HPDP, 카르복실-반응성 비오틴 표지 시약, 예를 들어, 비오틴 PEO-아민 또는 비오틴 PEO-LC-아민, 탄수화물-반응성 비오틴 표지 시약, 예를 들어, 바이오시틴 히드라지드, 비오틴 히드라지드, 또는 비오틴-LC-히드라지드, 또는 광반응성 비오틴 표지 시약, 예를 들어, 소랄렌-PEO-비오틴을 포함한다. 특정 실시태양에서, 리간드는 비오틴을 포함하고, 아민 반응성 비오틴 표지 시약인 술포-NHS-LC-비오틴을 사용하여 지지체 또는 지지체 커플러에 부착된다.
리간드가 비오틴을 포함하는 실시태양에서, 지지체 상의 결합 표면은 비오틴과 회합된 리간드 바인더를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 리간드 바인더는 비오틴 결합 모이어티를 포함한다. 여러 실시태양에서, 비오틴 결합 모이어티는 단백질, 예를 들어, 비오틴-결합 단백질, 예를 들어 아비딘, SA, 뉴트라비딘, SA의 단편, 아비딘의 단편, 뉴트라비딘의 단편, 또는 이들의 혼합물 중 적어도 하나를 포함한다. 비오틴 결합 모이어티는 또한 융합 단백질, 예를 들어, 상이 한 결합 단백질에 융합된 아비딘을 포함할 수도 있다.
여러 실시태양에서, 지지체 커플러는 단백질을 포함하고, 리간드는 비오틴을 포함하고, 단백질은 지지체 커플러가 지지체 커플러의 몰당 5 몰 이하의 비오틴의 통합비를 갖도록 비오틴의 낮은 투입비 (input ratio)에서 비오티닐화된다. 특정 실시태양에서, 단백질은 BSA, 오발부민, BSA의 단편, 오발부민의 단편, 또는 이들의 혼합물이다.
여러 실시태양에서, 지지체 상의 결합 표면이 비오틴 결합 모이어티를 포함하는 경우에, 지지체 상의 결합 표면은 비오틴 결합 모이어티와 회합된 비오티닐화된 포획 모이어티를 추가로 포함한다. 비오티닐화된 포획 모이어티는 스페이서 (spacer)를 포함할 수 있고, 여기서, 예를 들어, 스페이서는 비오틴 모이어티와 포획 모이어티 사이에 존재한다. 비오티닐화된 포획 모이어티는 포획될 물질에 따라 임의의 적합한 포획 모이어티를 포함할 수 있다. 적합한 포획 모이어티는 항체, 항체의 결합 단편, 수용체, 수용체의 리간드, 호르몬, 호르몬의 수용체, 효소, 효소의 기질, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 단일 폴리뉴클레오티드, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드, 항원, 펩티드, 또는 단백질 중 적어도 하나를 포함한다.
여러 실시태양에서, 지지체 상의 결합 표면은 적어도 2개의 친수성 테일 (tail)에 인접하는 소수성 헤드기 (head group)를 포함하는 블록 공중합체를 추가로 포함하고, 여기서 소수성 헤드기는 지지체에 접촉한다.
친수성 테일의 길이는 각각 독립적으로 헤드기의 약 2 내지 약 2.5배일 수 있다. 블록 공중합체는 폴리프로필렌 옥시드 블록과 폴리에틸렌 옥시드 블록을 갖는 하기 일반식 I의 구조를 포함할 수 있다.
HO(C2H4O)x(C3H6O)y(C2H4O)zH (I)
식에서, x 및 y는 폴리프로필렌 옥시드 블록이 지지체와 회합되도록 선택된다. 특정 실시태양에서, x는 약 100 내지 약 135이고, y는 약 40 내지 약 75이고, z는 약 100 내지 약 135이다. 다른 실시태양에서, x는 약 110 내지 약 125이고, y는 약 60 내지 약 70이고, z는 약 110 내지 약 125이다. 여러 실시태양에서, 블록 공중합체는 평균 분자량이 약 12,700 달톤 (Da) 내지 17,400 Da이거나; 평균 분자량이 약 9,000 내지 약 18,000 Da이다. 특정 실시태양에서, 블록 공중합체는 평균 분자량이 약 9,840 Da 내지 약 14,600 Da이다. 특정 실시태양에서, 블록 공중합체는 평균 분자량이 약 14,600 Da이다. 다른 특정 실시태양에서, 블록 공중합체는 평균 분자량이 약 12,600 Da이다.
여러 실시태양에서, 지지체는 유기 중합체 또는 공중합체를 포함한다. 여러 실시태양에서, 유기 중합체 또는 공중합체는 소수성이다. 적합한 중합체는 폴리스티렌, 폴리(디비닐벤젠), 스티렌-아실레이트 공중합체, 스티렌-부타디엔 공중합체, 스티렌-디비닐벤젠 공중합체, 폴리(스티렌-옥시에틸렌), 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리글루타르알데히드, 폴리에틸렌 이민, 폴리비닐피롤리돈, N,N'-메틸렌 비스-아크릴아미드, 폴리올레핀, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리술폰, 폴리(에테르 술폰), 상기한 중합체, 실리콘 또는 실리카의 피롤화 (pyrolized) 물질, 블록 공중합체 및 공중합체를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 지지체는 스티렌 및 디비닐벤젠을 포함하고, 폴리우레탄층으로 코팅된다.
여러 실시태양에서, 소수성인 중합체 또는 공중합체를 사용하면 물 접촉각이 약 60도를 초과하는 지지체를 생성할 것이다. 여러 실시태양에서, 소수성인 중합체 또는 공중합체를 사용하면 물 접촉각이 약 70도를 초과하는 지지체를 생성할 것이다.
여러 실시태양에서, 지지체는 마이크로입자를 포함한다. 특정 실시태양에서, 마이크로입자는 상자성 (paramagnetic) 또는 초상자성 물질, 예를 들어, 강자성 철 산화물 Fe3O4 또는 Fe2O3을 포함한다. 용어 "상자성" 및 "초상자성"은 자기장 구배 내에서 힘을 경험하지만 영구적으로 자화되지 않는 물질을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 지지체는 마게마이트 (maghemite) 또는 Fe2O3의 형태의 철을 포함한다. 여러 실시태양에서, 마이크로입자의 평균 직경은 100 nm 내지 22,900 nm 범위이다. 특정 실시태양에서, 마이크로입자의 평균 직경은 약 750 nm 내지 약 3,000 nm 범위이다. 다른 특정 실시태양에서, 마이크로입자의 평균 직경은 약 950 nm 내지 약 1,150 nm 범위이다.
다른 측면에서, 폴리스티렌, 폴리(디비닐벤젠), 스티렌-아실레이트 공중합체, 스티렌-부타디엔 공중합체, 스티렌-디비닐벤젠 공중합체, 폴리(스티렌-옥시에틸렌), 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리글루타르알데히드, 폴리에틸렌 이민, 폴리비닐피롤리돈, N.N'-메틸렌 비스-아크릴아미드, 폴리올레핀, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리술폰, 폴리(에테르 술폰), 상기한 중합체, 실리콘 또는 실리카의 피롤화 물질, 블록 공중합체 및 공중합체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 지지체; 지지체에 공유 부착된 단백질 (여기서, 단백질은 비오틴을 포함하고, 단백질의 1 몰당 5 몰 미만의 커플링된 비오틴이 존재한다); 비오틴과 회합된 비오틴 결합 모이어티 (여기서, 비오틴 결합 모이어티는 적어도 2가이다); 비오틴 결합 모이어티와 회합된 비오티닐화된 포획 모이어티 (여기서, 비오티닐화된 포획 모이어티는 항체, 항체의 결합 단편, 수용체, 수용체의 리간드, 호르몬, 호르몬의 수용체, 효소, 효소의 기질, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드, 항원, 펩티드 또는 단백질 중 적어도 하나로 이루어지는 군 중에서 선택된다); 지지체에 접촉하는 블록 공중합체 (여기서, 블록 공중합체는 폴리에틸렌 옥시드 테일에 인접하는 폴리프로필렌 옥시드 헤드기를 포함하고, 폴리프로필렌 옥시드 헤드기는 지지체에 접촉하고, 폴리에틸렌 옥시드 테일은 독립적으로 폴리프로필렌 옥시드 헤드기의 약 2 내지 약 2.5배이고, 블록 공중합체의 평균 분자량은 약 9,840 Da 내지 약 17,400 Da이다)를 포함하는, 친화도 분석을 위한 변형된 지지체를 제공한다. 변형된 지지체는 마이크로입자를 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 마이크로입자는 상자성 또는 초상자성 물질, 예를 들어 Fe2O3을 포함하고, 마이크로입자의 평균 직경은 950 nm 내 지 1,150 nm 범위이다. 특정 실시태양에서, 비오티닐화된 포획 모이어티는 면역글로불린 또는 그의 단편을 포함한다.
다른 측면에서, 리간드 및 지지체 커플러를 리간드::지지체 커플러 복합체의 혼합물을 생성시키도록 선택된 리간드 대 지지체 커플러의 투입비에서 조합하고 (여기서, 리간드::지지체 커플러 복합체에는 유리 리간드가 적어도 실질적으로 존재하지 않는다); 리간드::지지체 커플러 복합체를 지지체에 공유 부착시키는 것을 포함하는, 지지체를 코팅하기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시태양에서, 리간드 대 지지체 커플러의 투입비는 8 몰 이하의 리간드: 1 몰의 지지체 커플러이다. 별법으로, 리간드 대 지지체 커플러의 투입비는 4 몰 이하의 리간드: 1 몰의 지지체 커플러이다.
특정 실시태양에서, 방법의 리간드는 비오틴을 포함하고, 여기서 리간드는 아민 반응성 비오틴 표지 시약, 예를 들어 술포-NHS-LC-비오틴을 포함한다.
여러 실시태양에서, 지지체 커플러는 단백질을 포함하고, 리간드는 비오틴을 포함하고, 단백질은 지지체 커플러가 지지체 커플러의 몰당 5 몰 미만의 비오틴의 통합비를 갖도록 비오틴의 낮은 투입비에서 비오티닐화된다. 특정 실시태양에서, 단백질은 BSA, 오발부민, BSA의 단편, 오발부민의 단편, 또는 이들의 혼합물이다.
다른 측면에서, 마이크로입자를 분산매에 노출시켜 분산액을 형성하고 (여기서, 마이크로입자는 커플링하여 리간드::지지체 커플러 복합체를 생성하는 리간드 및 지지체 커플러를 포함하는 결합 표면을 포함하고, 분산매는 친수성 테일기에 인접하는 소수성 헤드기를 갖는 블록 공중합체를 포함한다); 분산액을 리간드::지지 체 커플러 복합체의 리간드와 회합하는 리간드 바인더에 노출시키는 것을 포함하는, 마이크로입자를 코팅하기 위한 방법을 제공한다.
코팅 방법의 특정 실시태양에서, 리간드는 비오틴을 포함하고, 아민 반응성 비오틴 표지 시약, 예를 들어 술포-NHS-LC-비오틴을 사용하여 지지체 또는 지지체 커플러와 커플링된다. 여러 실시태양에서, 지지체 커플러는 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 갖는 지지체에 대해 상기 설명한 바와 같이 단백질을 포함한다. 특정 실시태양에서, 단백질은 BSA, 오발부민, BSA의 단편, 오발부민의 단편, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
코팅 방법의 여러 실시태양에서, 리간드 바인더는 비오틴 결합 모이어티를 포함한다. 특정 실시태양에서, 비오틴 결합 모이어티는 적어도 2가이고, 아비딘, SA, 뉴트라비딘, SA의 단편, 아비딘의 단편, 뉴트라비딘의 단편, 또는 이들의 혼합물 중 적어도 하나를 포함한다.
여러 실시태양에서, 코팅 방법은 비오티닐화된 포획 모이어티를 비오틴 결합 모이어티와 회합시키는 것을 추가로 포함한다. 코팅 방법의 특정한 실시태양에서, 비오티닐화된 포획 모이어티는 항체, 항체의 결합 단편, 수용체, 수용체의 리간드, 호르몬, 호르몬의 수용체, 효소, 효소의 기질, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드, 항원, 펩티드, 또는 단백질 중 적어도 하나를 포함한다. 특정 실시태양에서, 비오티닐화된 포획 모이어티는 스페이서를 포함한다.
다른 측면에서, 공간 충전 모이어티를 갖는 분석물 회합 모이어티의 혼합물 을 제조하여 희석된 혼합물을 형성하고; 분석물 회합 모이어티와 공간 충전 모이어티가 지지체와 커플링하고, 지지체 표면과 커플링되는 분석물 회합 모이어티의 수에 관하여 비-포화된, 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 형성하기에 충분한 조건 하에 혼합물을 분석 지지체에 노출시키는 것을 포함하는, 지지체 상에 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 본원에서 사용될 때, 분석물 회합 모이어티는 지지체 표면과 결합될 때 목적하는 분석물과 직접적으로, 또는 연결 분자를 통해 간접적으로 회합될 수 있다. 즉, 분석물 회합 모이어티는 결합 표면의 일부를 형성할 임의의 분자, 예를 들어 단백질, 항체 또는 핵산일 수 있다. 본원에서 사용될 때, 공간 충전 모이어티는 지지체 표면과 커플링할 것이지만 목적하는 분석물과 직접적으로, 또는 연결 분자를 통해 간접적으로 회합하지 않을 임의의 분자, 예를 들어 단백질, 항체 또는 핵산이다. 공간 충전 모이어티는 결합 표면의 일부를 형성하지 않을 것이지만, 지지체 표면 상의 공간을 점령하고, 과잉의 분석물 회합 모이어티의 결합을 방지하는 역할을 할 것이다.
다른 측면에서, 리간드::지지체 커플러 복합체와 리간드가 없는 지지체 커플러의 혼합물을 희석하여 희석된 혼합물을 형성하고; 희석된 혼합물을 리간드::지지체 커플러 복합체가 지지체와 커플링하여 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 형성하기에 충분한 조건 하에 지지체에 노출시키는 것을 포함하는, 지지체 상에 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 제조하기 위한 방법을 제공한다.
지지체 상에 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 제조하기 위한 방법의 여러 실시태양에서, 지지체는 마이크로입자를 포함하고, 비-포화된 결합 표면은 마이크로입자의 밀리그램 (mg)당 약 0.5 x 10-4 내지 약 10 x 10-4 마이크로몰의 리간드, 마이크로입자의 mg당 약 1.0 x 10-4 내지 약 5.5 x10-4 마이크로몰의 리간드, 또는 마이크로입자의 mg당 약 2 x 10-4 내지 약 4 x 10-4 마이크로몰의 리간드를 갖는다. 지지체 상에 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 제조하기 위한 방법의 특정 실시태양에서, 지지체는 마이크로입자를 포함하고, 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면은 마이크로입자의 mg당 약 1.0 x 10-4 내지 약 5.5 x 10-4 마이크로몰의 리간드, 또는 마이크로입자의 mg당 약 1.6 x 10-4 내지 약 4.9 x 10-4 마이크로몰의 리간드를 갖는다.
지지체 상에 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 제조하기 위한 방법의 특정한 실시태양에서, 지지체는 거칠고 (rough), 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면은 제곱미터당 약 1.0 x 10-2 내지 약 2.0 x 10-1 마이크로몰의 리간드를 갖는다. 별법으로, 결합 표면은 제곱미터당 약 1.9 x 10-2 내지 약 6.6 x 10-2 마이크로몰의 리간드를 갖는다. 지지체 상에 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 제조하기 위한 방법의 다른 특정한 실시태양에서, 지지체는 평탄 하고 (smooth), 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면은 제곱미터당 약 3.3 x 10-2 내지 약 1.6 x 10-1 마이크로몰의 리간드를 갖는다. 지지체 상에 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 제조하기 위한 방법의 다른 특정 실시태양에서, 거친 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면은 제곱미터당 약 1.9 x 10-2 내지 약 6.6 x 10-2 마이크로몰의 지지체 커플러를 갖고, 평탄한 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면은 제곱미터당 약 2.7 x 10-2 내지 약 7.1 x 10-2 마이크로몰의 지지체 커플러를 갖는다. 용어 "거친"은 콜리플라워와 유사한 또는 다공성 형태를 포함한다. 용어 "평탄한"은 실질적으로 평탄하고 실질적으로 구형 형태를 나타낸다. 동일한 직경의 마이크로입자에 대해, "거친" 지지체 표면은 거친 지지체 표면의 홈, 구멍 또는 공극에 의해 제공되는 증가된 지지체 표면적으로 인해 "평탄한" 지지체 표면보다 더 큰 지지체 표면적을 가질 것이다. 지지체 커플러, 리간드, 리간드 바인더, 포획 모이어티 등의 실제 마이크로몰은 모든 거친 지지체 표면적이 리간드, 또는 지지체 커플러, 부착을 위해 입체적으로 이용가능한 것은 아니기 때문에, 계산된 거친 지지체 표면적과 평탄한 지지체 표면적 사이의 어떤 지점에 놓일 것이다.
지지체 상에 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 제조하기 위한 방법의 여러 실시태양에서, 지지체 커플러는 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 갖는 지지체에 대해 상기 설명한 바와 같이 단백질을 포함한다. 특정 실시태양에서, 단백질은 BSA, 오발부민, BSA의 단편, 오발부민의 단편, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
다른 측면에서, 지지체 커플러에 대한 리간드의 임의의 투입비에서 리간드::지지체 커플러 복합체의 혼합물을 제조하고; 리간드에 복합체화되지 않은 리간드::지지체 커플러 복합체의 혼합물을 지지체 커플러로 희석하여 희석된 혼합물을 형성하고; 희석된 혼합물을 리간드::지지체 커플러 복합체와 지지체 커플러가 지지체와 커플링하여 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 형성하기에 충분한 조건 하에 지지체에 노출시키는 것을 포함하는, 지지체 상에 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 이어서, 리간드를 포함하는 지지체를 본원에 설명된 임의의 적합한 방법에 따라 처리할 수 있다.
지지체 커플러는 하나 이상의 단백질 또는 비-단백질 중합체를 포함할 수 있다. 여러 실시태양에서, 리간드는 지지체 커플러 상의 관능기를 통해 지지체 커플러에 복합체화된다. 하나 이상의 지지체 커플러 상의 관능기의 수의 일부는 지지체 커플러를 리간드에 노출시키기 전에 제거되거나 중화될 수 있고, 이는 상기 방식에서 지지체 커플러와 복합체화할 수 있는 리간드의 수를 감소시킨다. 리간드::지지체 커플러 복합체의 혼합물의 제조에서 리간드에 노출된 지지체 커플러의 전부 또는 단지 일부는 하나 이상의 중화된 관능기를 가질 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 면역분석을 위한 결합 표면을 제공하고, 여기서 결합 표면은 목적하는 포획 모이어티에 결합할 수 있는 리간드 바인더에 결합할 수 있는 복수의 리간드를 포함한다. 결합 표면의 리간드는 지지체 상에서 비-포화되 거나 비-포화되고 배향되고, 리간드는 (a) 지지체에 직접 부착되거나, (b) 지지체 커플러를 통해 부착되고 지지체 커플러는 지지체에 부착된다. 여러 실시태양에서, 결합 표면에는 유리 (즉, 비결합된) 리간드가 실질적으로 존재하지 않는다. 특정 실시태양에서, 지지체는 직경 약 1 미크론 내지 약 5 미크론의 마이크로입자를 포함하고, 리간드는 비오틴을 포함하고, 비오틴은 단백질을 포함하는 지지체 커플러에 복합체화된다. 특정한 실시태양에서, 리간드는 비오틴을 포함하고, 리간드 바인더는 비오틴-결합 단백질을 포함하고, 지지체 커플러는 BSA, 오발부민, BSA의 단편, 오발부민의 단편 또는 이들의 혼합물을 포함하고, BSA, 오발부민, BSA의 단편, 오발부민의 단편 또는 이들의 혼합물은 낮은 투입비 비오티닐화에 의해 비오티닐화된다. 특정 실시태양에서, 비오틴-결합 단백질은 SA이고, 비오티닐화된 항체는 SA-코팅된 결합 표면 상에 존재하고, 여기서 비오티닐화된 항체는 면역분석, 예를 들어, 경쟁 또는 샌드위치 (sandwich) 면역분석에서 목적하는 분석물을 포획하도록 선택된다. 면역분석의 지지체 상의 결합 표면은 본원에 설명된 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
다른 측면에서, 지지체 상에 배치된 복수의 지지체 커플러; 및 지지체 커플러와 커플링된 리간드를 포함하는, 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 갖는 지지체를 제공하고; 여기서 지지체 커플러는 지지체 상에 지지체의 제곱미터당 약 1.6 x 10-2 내지 약 7.1 x 10-2 마이크로몰의 밀도로 존재한다. 여러 실시태양에서, 지지체 커플러는 단백질을 포함한다. 특정 실시태양에서, 단백질은 BSA, 오발부민, BSA의 단편, 오발부민의 단편, 또는 이들의 혼합물이다. 여러 실시태양에서, 리간드는 비오틴을 포함한다. 특정 실시태양에서, 비오틴은 지지체의 제곱미터당 약 1.9 x 10-2 내지 약 1.6 x 10-1 마이크로몰의 비오틴의 밀도로 존재한다. 여러 실시태양에서, 결합 표면은 리간드와 특이적으로 회합할 수 있는 리간드 바인더를 포함한다. 여러 실시태양에서, 리간드 바인더는 지지체의 제곱미터당 약 1.2 x 10-2 내지 약 4.6 x 10-2 마이크로몰의 리간드 바인더의 밀도로 존재한다. 여러 실시태양에서, 리간드 바인더는 아비딘, SA, 뉴트라비딘, SA의 단편, 아비딘의 단편, 뉴트라비딘의 단편, 또는 이들의 혼합물이다. 여러 실시태양에서, 결합 표면은 리간드 바인더와 특이적으로 회합할 수 있는 포획 모이어티를 추가로 포함한다. 여러 실시태양에서, 포획 모이어티는 지지체의 제곱미터당 약 2.5 x 10-3 내지 약 1.4 x 10-2 마이크로몰의 포획 모이어티의 밀도로 존재한다. 특정 실시태양에서, 포획 모이어티는 면역글로불린 또는 그의 단편을 포함한다.
다른 측면에서, 지지체 상에 배치된 복수의 지지체 커플러; 및 지지체 커플러와 커플링된 리간드를 포함하는, 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 갖는 지지체를 제공하고; 여기서 지지체 커플러는 지지체 상에 지지체의 mg당 약 1.3 x 10-4 내지 약 2.1 x 10-4 마이크로몰의 지지체 커플러의 밀도로 존재한다. 여러 실시태양에서, 리간드는 비오틴을 포함한다. 특정 실시태양에서, 비오틴은 지지체의 mg당 약 1.6 x 10-4 내지 약 4.9 x 10-4 마이크로몰의 비오틴의 밀도로 존재한다. 여러 실시태양에서, 결합 표면은 리간드와 특이적으로 회합할 수 있는리간드 바인더를 포함한다. 여러 실시태양에서, 리간드 바인더는 지지체의 mg당 약 1.0 x 10-4 내지 약 1.4 x 10-4 마이크로몰의 리간드 바인더의 밀도로 존재한다. 여러 실시태양에서, 리간드 바인더는 아비딘, SA, 뉴트라비딘, SA의 단편, 아비딘의 단편, 뉴트라비딘의 단편, 또는 이들의 혼합물이다. 여러 실시태양에서, 결합 표면은 리간드 바인더와 특이적으로 회합할 수 있는 포획 모이어티를 추가로 포함한다. 여러 실시태양에서, 포획 모이어티는 지지체의 mg당 약 2.1 x 10-5 내지 약 4.1 x 10-5 마이크로몰의 포획 모이어티의 밀도로 존재한다. 특정 실시태양에서, 포획 모이어티는 비오티닐화된 면역글로불린 또는 그의 단편을 포함한다.
다른 측면에서, 지지체 상의 결합 표면을 제공하고, 여기서 결합 표면은 지지체의 mg당 약 4.0 x 10-4 마이크로몰 이하의 비오틴에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 지지체는 마이크로입자를 포함하고, 마이크로입자의 mg당 약 2.5 x 10-5 내지 약 4.0 x 10-4 마이크로몰 이하의 비오틴에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 지지체는 마이크로입자를 포함하고, 마이크로입자의 mg당 약 7.5 x 10-5 내지 약 3.5 x 10-4 마이크로몰의 비오틴에 특이적으로 결합한다. 다른 특정 실시태양에서, 지지체는 마이크로입자를 포함하고, 마이크로입자의 mg당 약 1.0 x 10-4 내지 약 3.0 x 10-4 마이크로몰의 비오틴에 특이적으로 결합한다. 여러 실시태양에서, 지지체는 비오틴 결합 모이어티, 예를 들어, SA와 회합된 지지체에 부착된 (직접 또는 지지체 커플러를 통해) 비오틴을 포함하고, 앞서 말한 비오틴 결합능은 유리 비오틴에 결합하는 비오틴 결합 모이어티 (예를 들어, SA)의 능력을 나타낸다.
다른 측면에서, 지지체 상의 결합 표면을 제공하고, 여기서 결합 표면은 지지체의 제곱미터당 약 1.3 x 10-1 마이크로몰 이하의 비오틴에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 지지체는 지지체의 제곱미터당 약 3.0 x 10-3 내지 약 1.3 x 10-1 마이크로몰 이하의 비오틴에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 지지체는 지지체의 제곱미터당 약 8.9 x 10-3 내지 약 1.2 x 10-1 마이크로몰의 비오틴에 특이적으로 결합한다. 특정한 실시태양에서, 지지체는 지지체의 제곱미터당 약 1.2 x 10-2 내지 약 9.9 x 10-2 마이크로몰의 비오틴에 특이적으로 결합한다. 여러 실시태양에서, 지지체는 비오틴 결합 모이어티, 예를 들어, SA와 회합된 지지체에 부착된 (직접 또는 지지체 커플러를 통해) 비오틴을 포함하고, 앞서 말한 비오틴 결합능은 유리 비오틴에 결합하는 비오틴 결합 모이어티 (예를 들어, SA)의 능력을 나타낸다.
달리 진술하거나 개시문으로부터 암시되지 않으면, 본원에 설명된 임의의 특 정 방법 또는 조성물과 연관하여 설명되는 임의의 실시태양은 본원에 설명되는 임의의 다른 실시태양과 연관하여 사용될 수 있다.
도 1A는 상자성 마이크로입자 (PMP) 결합 표면 상에 비-포화되고 배향된 SA를 제조하는 공정을 도시한 것이다.
도 1B는 도 1A의 공정도의 연속 도면이다.
도 2는 고체 지지체 표면; 지지체 표면에 공유 부착된 BSA 또는 오발부민; BSA 또는 오발부민에 공유 부착된 비오틴; 비오틴과 회합된 스트렙타비딘, 뉴트라비딘 또는 아비딘; 및 스트렙타비딘, 뉴트라비딘 또는 아비딘과 회합된 비오티닐화된 항체를 포함하는 본 발명의 실시태양을 도시한 것이다.
도 3은 낮은 투입비 비오티닐화 방법에서 BSA 분자 상의 일부 가능한 비오틴 분자 배향을 도시한 것이다.
도 4는 비-포화된 결합 표면을 제조하기 위해 고상을 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA로 코팅하는 것을 도시한 것이다.
도 5는 고상 지지체 표면을 위한 차단제로서 블록 공중합체를 사용하는 것을 도시한 것이다.
도 6은 비오틴을 포함하는 결합 표면을 위한 분산제로서 블록 공중합체를 사용하는 것을 도시한 것이다.
도 7은 비오티닐화된 결합 표면 (블록 공중합체를 사용하여 차단된)을 SA로 코팅하는 것을 도시한 것이다.
도 8은 각종 비오티닐화된 포획 모이어티를 본 발명에 따라 제조된 고상 지지체 표면 상의 SA-코팅된 결합 표면에 적용하는 것을 도시한 것이다.
도 9A는 비오티닐화된 항체 또는 Fab 단편으로 코팅된, 통상적인 또는 표준 SA-코팅된 마이크로입자 결합 표면을 도시한 것이다.
도 9B는 비오티닐화된 항체 또는 Fab 단편으로 코팅된, 비-포화되고 배향된 SA-코팅된 마이크로입자를 도시한 것이다.
도 10 (패널 A 및 B)은 본 발명의 분산 단계를 사용하는 것과 연관되는 증가된 결합가능한 표면적을 도시한 것이다.
도 11은 4℃ 또는 37℃에서 3일 후 SA로 코팅된 비오틴-BSA 고체 지지체로부터 비오틴 탈락 분석을 도시한 것이다.
도 12는 실시예 6의 공정 재현성 (제조가능성) 연구에 대한 데이타를 표 형식으로 도시한 것이다.
도 13은 실시예 6의 추가의 공정 재현성 (제조가능성) 연구에 대한 데이타를 표 형식으로 도시한 것이다.
도 14A는 실시예 7의 향상된 안정성 연구에 대한 데이타를 표 형식으로 도시한 것이다.
도 14B는 도 14A의 표의 연속이고, 실시예 7의 향상된 안정성 연구에 대한 데이타를 보여준다.
도 15A는 탈락 분석의 결과를 도시한 것이다.
도 15B는 탈락 분석의 결과의 추가의 도면이다.
도 16A는 본 발명의 실시태양에 따라 제조된 마이크로입자의 다양한 로트 (lot)에 대한, 실시예 11의 실제 결합 표면 밀도 계산에 대한 데이타를 표 형식으로 도시한 것이다.
도 16B는 거칠기 가정을 이용하여 마이크로입자 데이타로부터 유도된, 본 발명의 실시태양에 따라 제조된 마이크로입자에 대한 실제 결합 표면 밀도 계산에 대한 데이타를 표 형식으로 도시한 것이다.
도 16C는 본 발명의 실시태양에 따라 제조된 마이크로입자의 다양한 로트에 대한, 평탄한 지지체 표면을 가정한 결합 표면적 계산에 대한 추가의 데이타를 표 형식으로 도시한 것이다.
도 16D는 마이크로입자 데이타로부터 유도된, 본 발명의 실시태양에 따라 제조된 평탄한 지지체 표면을 가정한 결합 표면 밀도 계산에 대한 데이타를 표 형식으로 도시한 것이다.
도 17은 본 발명의 비-포화된 결합 표면과 본 발명의 비-포화되고 배향된 결합 표면 사이의 차이를 도시하는 개략도이다.
본 발명은 적어도 부분적으로, 리간드의 밀도를 증가시켜 단순히 지지체 표면을 군집시킴으로써 결합 표면을 설계하는 것보다, (a) 접근가능한 공간적인 배향으로 지지체의 결합 표면을 가로질러 드물게 분산된 포획 모이어티-함유 복합체를 생성시키는 포화량 미만의 리간드를 회합시키고, 임의로 (b) 리간드 및 이어서 포획 모이어티-함유 복합체의 다른 성분 모이어티를 선형 또는 거의 선형 구조적 (물리적) 배향으로 직렬로 배치함으로써 결합 표면을 설계하는 것이 친화도 분석 (예를 들어, 면역분석 또는 핵산 분석)과 같은 분석을 수행하기 위한 보다 바람직한 품질을 갖는 결합 표면을 생성시킬 수 있다는 깨달음에 기초한 것이다.
결합 표면을 제조하기 위한 통상적인 방안은 리간드의 접근가능성 및/또는 배향과 무관하게 대개 지지체의 단위 면적당 리간드의 양을 최대화하는 것을 목적으로 하고, 이는 종종 지지체 상에 리간드의 군집을 일으킨다. 결합 표면 상에서 단위 면적당 리간드를 최대화하는 것은 적어도 부분적으로 입체 효과로 인해 결합 표면의 성능의 퇴보를 일으킬 수 있다. 성능 퇴보는 또한 결합 표면으로부터 과잉의 리간드의 탈락으로부터 일어날 수 있다.
본원에서 사용될 때, "~와 커플링된" 또는 그의 문법적인 동의어는 2개의 모이어티 사이의 공유 또는 비-공유 결합 또는 상호작용을 의미한다. 용어 "~와 커플링된"은 커플링의 배향 또는 방향을 암시하는 것을 의도하지 않는다.
본원에서 사용될 때, 용어 "융합 단백질"은 재조합 단백질 (예를 들어 키메라 (chimera) 단백질), 하이브리드 단백질, 및 합성적으로 유도된 단백질을 포함한다. 그의 용법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
본 발명에 따른 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면은 포화량 미만의 리간드를 지지체 상에 커플링함으로써 (예를 들어, 지지체에 직접 부착함으로써 또는 지지체에 부착된 지지체 커플러에 부착함으로써) 제작된 결합 표면을 포함한다. 리간드에 관하여 "비-포화된" 결합 표면은 지지체의 단위 표면적당 최대 미만 밀도의 리간드, 또는 지지체의 단위 중량당 최대 미만 밀도의 리간드를 갖는 결합 표면이다. 본 발명의 특정한 실시태양에서, 비-포화된 결합 표면의 리간드는 공간적으로 배향된다. 본원에서 사용될 때, 용어 "공간적으로 배향된" 또는 그의 문법적인 동의어는 거리 또는 면적에 걸쳐 널리 퍼진 모이어티들을 나타낸다. 즉, 모이어티들은 최근접 이웃에 실질적으로 접촉하지 않도록 지지체 표면 상에 배향되거나 이격되어 있다.
지지체의 단위 표면적당 "최대 미만" 밀도의 리간드는 지지체 표면 상에 존재할 수 있는 리간드의 수에 관하여 포화되지 않은 결합 표면을 나타낸다. 예를 들어, 리간드로 포화된 지지체 표면은 주어진 조건 세트 하에 지지체 표면 상에 놓일 수 있는 최대 비율의 리간드 (100%로 표시됨)를 갖는다 (예를 들어, 주어진 리간드::지지체 커플러 복합체, 여기서 지지체 커플러는 리간드로 포화되고, 복합체는 지지체에 대한 리간드::지지체 커플러 복합체의 최대 부착을 촉진하는 조건 하에 지지체 상에 그의 최고 가능한 밀도로 배치된다).
비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면은 면역분석에서 사용되는 결합 표면을 위해 특히 바람직할 수 있다. 대부분의 면역분석은 지지체 상의 결합 표면을 이용한다. 많은 이들 용도에 있어서, 지지체는 분석물, 예를 들어, 항원을 포획하는 모이어티가 다른 분자 상에 쌓아 올려져 분석물에 결합하는 포획 모이어티-함유 복합체를 형성하는 마이크로입자 또는 미세적정 플레이트이다. 그의 하나의 비제한적인 예는 마이크로입자 상에 고정된 면역글로불린을 갖는 면역분석이다. 면역글로불린은 지지체 상에 직접 고정될 수 있거나, 면역글로불린은 차례로 지지체 상에 고정되는 다른 분자에 커플링될 수 있다 (예를 들어, 공유 방식으로). 비-포화된 결합 표면을 제조하는 것은 본원에서 두 상황 모두에 대해 설명된다. 면역글로불린 또는 그의 단편이 지지체에 직접 부착되지 않지만, 대신 지지체에 부착되는 다른 모이어티와 회합되는 상황에 대한 상세한 예를 제공한다.
용어 "커플링된"은 (a) 공유 결합 (예를 들어, 하나 이상의 탄소-탄소 결합, 탄소-질소 결합, 탄소-산소 결합 등을 통해 직접적으로 또는 간접적으로), 및 (b) 비-공유 결합 (간접적으로 또는 직접적으로)을 포함한다.
서로 특이적으로 상호작용하는 것으로 알려진 엔티티 (entity)는 공유 커플링될 수 있다. 특이적으로 상호작용하는 것으로 알려지고 공유 커플링될 수 있는 엔티티의 하나의 비-제한적인 예는 항원 및 그의 특이적 항체이고, 이는 예를 들어, 커플링 화학을 통해 공유 부착하도록 만들어질 수 있다.
서로 특이적으로 상호작용하지 않는 엔티티들은 공유 커플링될 수 있다. 서로 특이적으로 상호작용하는 것으로 알려지지 않고 공유 커플링될 수 있는 엔티티의 하나의 비-제한적인 예는 SA 및 BSA이고, 이는 예를 들어 커플링 화학을 통해 공유 부착하도록 만들어질 수 있다.
비-공유 결합의 예는 친화도, 이온, 반 데어 발스 (예를 들어, 쌍극자/쌍극자 또는 런던 힘 (London force)), 수소 결합 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 이중체들 사이에) 및 소수성 상호작용을 포함한다. 회합이 비-공유 방식이면, 엔티티들 사이의 회합은 바람직하게는 특이적이다. 특이적 비-공유 회합의 비-제한적인 예는 비오틴과 비오틴-결합 단백질, 예를 들어 아비딘, SA, 뉴트라비딘, SA의 단편, 아비딘의 단편, 뉴트라비딘의 단편, 또는 이들의 혼합물 사이의 결합 상호작용; 비오틴-결합 단백질, 예를 들어 아비딘, SA, 뉴트라비딘, SA의 단편, 아비딘의 단편, 뉴트라비딘의 단편, 또는 이들의 혼합물에 대한 비오티닐화된 Fab, 비오티닐화된 면역글로불린 또는 그의 단편, 비오티닐화된 소분자 (예를 들어, 호르몬 또는 수용체의 리간드), 비오티닐화된 폴리뉴클레오티드, 비오티닐화된 거대분자 (예를 들어, 단백질 또는 천연 또는 합성 중합체)의 결합; 그의 효소에 대한 기질의 결합; 당단백질에 특이적인 렉틴에 대한 당단백질의 결합; 리간드에 특이적인 수용체에 대한 리간드의 결합; 항체가 그에 대해 유도되는 항원에 대한 항체의 결합; 및 폴리뉴클레오티드와 상보성 또는 실질적으로 상보성 폴리뉴클레오티드 사이의 이중체 형성 등을 포함한다.
마이크로입자에 부착된 비오티닐화된 단백질 (리간드::지지체 커플러 복합체)을 갖는 마이크로입자에 대한 특정 예를 제공하고, 여기서 비오티닐화된 단백질은 SA (비오틴 결합 모이어티)로 코팅되고, 이어서 SA-비오티닐화된 단백질-코팅된 마이크로입자는 분석에서 분석물을 포획하기 위해, 또는 분석에서 분석물을 포획하기 위해 사용되는 다른 면역글로불린 또는 그의 단편에 결합하기 위해 사용되는 비오티닐화된 면역글로불린 또는 그의 비오티닐화된 단편 (비오티닐화된 포획 모이어티)으로 코팅된다 (예를 들어, 비오티닐화된 염소 x 마우스 IgG는 Antigen1을 포획하기 위해 사용되는 마우스 IgG x Antigen1을 포획하기 위해 사용된다). 지지체 표면 상에서 비오티닐화된 단백질의 비-포화된 성질은 또한 그와 회합하는 비오틴의 비-포화된 특성으로 인해 비-포화되는 SA 코팅에서 반영되고, 이는 분석물을 포획하는 비오티닐화된 면역글로불린 (또는 비오티닐화된 면역글로불린 단편)의 비-포화, 또는 분석물을 포획하는 추가의 면역글로불린 또는 단편을 포획하는 비오티닐화된 면역글로불린 (또는 비오티닐화된 면역글로불린 단편)의 비-포화를 일으킨다.
본 발명의 여러 실시태양에서, 리간드는 지지체 커플러에 공유 결합될 수 있거나, 지지체 커플러에 비-공유 결합될 수 있다. 특정 실시태양에서, 리간드는 지지체 커플러에 공유 결합되고, 리간드 바인더는 적어도 2가이다. 추가의 특정한 실시태양에서, 리간드는 비오틴이고, 지지체 커플러에 공유 결합되고, 리간드 바인더는 적어도 2가 모이어티, 예를 들어 스트렙타비딘, 아비딘, 또는 뉴트라비딘, 스트렙타비딘의 단편, 아비딘의 단편, 뉴트라비딘의 단편, 또는 이들의 혼합물이다. 리간드 바인더가 적어도 2가인 실시태양에서, 리간드를 지지체 커플러에 공유 커플링시키면 과잉의 리간드의 탈락이 감소 또는 폐지되므로 보다 안정한 결합 표면을 생성할 수 있다.
다른 실시태양에서, 리간드를 지지체 커플러에 공유 커플링시키는 것은 선택적이다. 예를 들어, 리간드가 단일 결합 부위를 갖는 항체 단편인 경우에, 리간드는 지지체 커플러는 비-공유 커플링될 수 있다.
따라서, 본 발명은 면역분석을 위해 비-포화량의 포획 모이어티를 제공하기 위한 방법 및 조성물을 포함하고, 여기서 포획 모이어티는 비-포화된 지지체 표면에 대한 결합에 의해 비-포화된다. 여러 실시태양에서, 포획 모이어티는 추가의 포획 모이어티를 포획하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 비오티닐화된 염소 x 마우스 IgG로 코팅되는 SA (리간드 바인더)로 코팅된 비오틴-BSA (리간드::지지체 커플러 복합체)로 코팅된 지지체는 예를 들어 마우스 IgG x TSH로 추가로 코팅될 수 있고, 이후 이는 TSH 분석물을 포획하기 위해 사용될 수 있다.
지지체 표면 상의 성분의 밀도는 다양한 방식으로 표현될 수 있다. 예를 들어, 마이크로입자와 같은 입자형 지지체에 있어서, 결합 표면의 성분의 밀도를 마이크로입자의 단위 중량에 의하여, 예를 들어, 마이크로입자의 mg당 성분 (예를 들어, 리간드, 예를 들어 비오틴; 리간드 바인더, 예를 들어 SA; 포획 모이어티, 예를 들어 분석물-특이적 비오티닐화된 IgG 등)의 마이크로몰로 논의하는 것이 편리하다. 예를 들어, 미세적정 플레이트와 같은 비-입자형 지지체에 있어서, 성분의 밀도를 지지체의 표면적에 의하여, 예를 들어, 제곱미터당 리간드 바인더의 마이크로몰로 논의하는 것이 편리하다. 지지체 표면 상의 성분의 밀도는 리간드 (예를 들어, 실시예의 비오틴-BSA 마이크로입자의 비오틴에서, 비오틴 결합에 관하여) 또는 지지체 표면 상에 쌓인 임의의 다른 성분에 대해 표현될 수 있다 (예를 들어, 실시예의 비오틴-BSA 마이크로입자에서, 마이크로입자와 결합된 SA, 또는 SA와 결합된 분석물-특이적 비오티닐화된 면역글로불린에 관하여).
지지체와 커플링되는 (직접적으로 또는 예를 들어, 단백질을 통해 간접적으로) 포화량 미만의 리간드 때문에, 연속적인 층의 리간드 바인더는 비-포화될 것이고, 지지체에 부착된 리간드의 층 위의 리간드 바인더의 밀도는 연속적으로 보다 작은 밀도 (예를 들어, 마이크로입자의 mg당 연속적으로 보다 작은 마이크로몰, 또는 제곱미터당 마이크로몰)를 포함할 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 비오티닐화된 마이크로입자의 예에 대해, 지지체 표면 상의 SA의 밀도는 지지체 표면 상의 비오틴 리간드의 밀도 (SA의 첨가 후에 추정됨)보다 더 낮을 것인 BSA 지지체 커플러의 밀도보다 더 낮을 것이다.
따라서, 입자상 지지체, 예를 들어 직경 약 1.0 미크론의 마이크로입자 또는 비-입자상 지지체 (예를 들어, 미세적정 플레이트)에 대한 여러 실시태양에서, 지지체 커플러가 리간드보다 유의하게 더 큰 (예를 들어, 알부민 지지체 커플러는 M.W.이 약 66,000 Da이고, 비오틴 리간드는 M.W.이 약 244 Da인) 경우에, 리간드 바인더 (예를 들어, SA)의 밀도는 리간드::지지체 커플러 복합체 (예를 들어, 비오틴-BSA)의 밀도보다 약 10% 내지 약 90% 더 작고, 여러 실시태양에서 리간드::지지체 커플러 복합체의 밀도보다 약 30% 내지 약 70% 더 작고, 여러 실시태양에서 리간드::지지체 커플러 복합체의 밀도보다 약 40% 내지 약 60% 더 작다. 특정 실시태양에서, 리간드 바인더는 비오틴 결합 모이어티, 예를 들어, SA를 포함하고, 리간드는 지지체 커플러, 예를 들어 BSA 또는 오발부민 또는 이들의 혼합물, 또는 BSA 또는 오발부민의 단편 또는 이들의 혼합물과 커플링된 비오틴을 포함한다.
여러 실시태양에서, 리간드 바인더에 부착된 포획 모이어티 (여기서, 리간드 바인더는 차례로 리간드와 회합된다)는 또한 비-포화된다. 마이크로입자 또는 비입자상 지지체 상의 포획 모이어티의 밀도는 여러 실시태양에서 리간드 바인더의 밀도보다 약 10% 내지 약 90% 더 작고, 여러 실시태양에서 리간드 바인더의 밀도보다 약 30% 내지 약 70% 더 작고, 여러 실시태양에서 리간드 바인더의 밀도보다 약 40% 내지 약 60% 더 작다.
포화 수준을 표현하는 다른 방식은 지지체와 커플링될 수 있는 최대량의 리간드와 비교하는 것이다. 여러 실시태양에서, 리간드에 관하여 비-포화된 지지체 표면은 100% 미만의 커플링된 리간드를 가질 것이다. 예를 들어, 지지체 표면 상의 리간드의 백분율은 지지체 표면 상에 놓일 수 있는 최대량의 리간드의 약 10% 내지 약 90%일 수 있다. 또는, 지지체 표면 상의 리간드의 백분율은 지지체 표면 상에 놓일 수 있는 최대량의 리간드의 약 20% 내지 약 80%일 수 있다. 또는, 지지체 표면 상의 리간드의 백분율은 지지체 표면 상에 놓일 수 있는 최대량의 리간드의 약 30% 내지 약 70%일 수 있다. 지지체 표면 상의 리간드의 최적 백분율 (최대수의 리간드는 100%임)은 통상적인 결합 표면에 비해 최선의 신호 대 노이즈 비, 결합 표면으로부터 리간드의 최저의 해리, 가장 큰 안정성 (용도에 관련한 온도(들)에서), 및 밸리데이션 (validation) 연구에서 비교적 낮은 변동을 제공하는 리간드의 백분율 (또는 백분율 범위)이다 (예를 들어, 10% 미만, 보다 바람직하게는 5% 이하). 본원의 다른 부분에서 설명되는 바와 같이, 지지체 커플러는 선택적이다. 예를 들어, 리간드는 고상 지지체 표면과 커플링되는 비오틴 또는 그의 유도체일 수 있다.
지지체와 커플링되는 (직접적으로 또는 예를 들어, 단백질을 통해 간접적으로) 포화량 미만의 리간드 때문에, 연속적인 층의 리간드 바인더 및 포획 모이어티는 비-포화될 것이고, 지지체와 커플링된 리간드의 층 위의 연속적인 층의 리간드 바인더 및 포획 모이어티의 밀도는 연속적으로 보다 작은 밀도 (예를 들어, 마이크로입자의 mg당 연속적으로 보다 작은 마이크로몰, 또는 제곱미터당 마이크로몰)를 포함할 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 비오티닐화된 마이크로입자의 예에 대해, 지지체 표면 상의 비오티닐화된 IgG (비오티닐화된 포획 모이어티)의 밀도는 SA (비오틴 결합 모이어티)의 밀도보다 더 낮을 것이고, 지지체 표면 상의 SA의 밀도는 지지체 표면 상의 비오틴의 밀도 (비오틴-BSA; SA의 첨가 전에 추정된 비오틴 밀도)보다 더 낮을 것인 BSA 지지체 커플러 (비오틴-BSA)의 밀도보다 더 낮을 것이다.
특정 실시태양에서, 표면은 마이크로입자의 mg당 약 1 x 10-5 내지 약 5 x 10-2 마이크로몰의 비오틴의 밀도, 또는 별법으로 마이크로입자의 mg당 약 1.6 x 10-4 내지 약 4.9 x 10-4 마이크로몰의 비오틴의 밀도로 비오틴 (비오틴-BSA)을 포함한다. 다른 실시태양에서, 표면은 마이크로입자의 mg당 약 1.6 x 10-4 내지 약 4.9 x 10-4 마이크로몰의 BSA의 밀도로 BSA (비오틴-BSA)를 포함하거나, 마이크로입자의 mg당 약 1.0 x 10-4 내지 약 1.4 x 10-4 마이크로몰의 SA의 밀도로 SA를 포함하거나, 마이크로입자의 mg당 약 2.1 x 10-5 내지 약 4.1 x 10-5 마이크로몰의 비오티닐화된 IgG의 밀도로 비오티닐화된 IgG를 포함한다. 특정 실시태양에서, 거친 지지체 표면은 제곱미터당 약 1.9 x 10-2 내지 약 6.6 x 10-2 마이크로몰의 비오틴의 밀도로 비오틴 (비오틴-BSA)을 포함하고, 제곱미터당 약 1.6 x 10-2 내지 약 2.9 x 10-2 마이크로몰의 BSA의 밀도로 BSA (비오틴-BSA)를 포함하고, 제곱미터당 약 1.2 x 10-2 내지 약 1.9 x 10-2 마이크로몰의 SA의 밀도로 SA를 포함하고, 제곱미터당 약 2.5 x 10-3 내지 약 5.5 x 10-3 마이크로몰의 비오티닐화된 IgG의 밀도로 비오티닐화된 IgG를 포함한다.
임의의 리간드를 사용하는 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 포함하는 지지체는 본원의 방법 및 조성물에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드- 또는 폴리뉴클레오티드-결합 표면은 지지체 또는 지지체 커플러에 대한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 2 또는 3 또는 4 이상의 선택된 투입비에서 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킴으로써 (직접적으로 또는 지지체 커플러를 통해) 비-포화될 수 있다. 시작하기에 편리한 투입비는 당업계에 공지된 투입비이고, 당업계에 공지된 투입비는 일반적으로 지지체 표면 상의 리간드의 양을 최대화하기 위해 선택되므로, 이후 투입비를 단계별로 (예를 들어, 절반, 1/8, 1/16 등으로) 감소시킨다. 일단 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 지지체 표면에 부착되면, 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법 (예를 들어, 리간드 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 상보성인 형광 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 결합된 형광의 정량)을 이용하여 결합 효율을 측정할 수 있다. 지지체 커플러 또는 지지체에 대한 리간드 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 적합한 투입비는 고정량의 결합 표면 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 리간드로 코팅된 1 미크론 마이크로입자의 그램)에 대해 표면에 의해 생성된 신호의 양 (예를 들어, 형광 결합된 상보성 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 의해)을 측정함으로써 결정된다. 신호의 양 대 마이크로입자의 중량의 비 (모든 다른 변수는 대략 일정함)가 최고인 경우에 목적하는 포화 수준이 얻어진다. 상기 일반적인 절차는 임의의 목적하는 결합 표면 상에서 목적하는 포화 수준을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 올리고뉴클레오티드는 약 30개 이하의 염기 길이의 핵산이고, 폴리뉴클레오티드는 약 30개 이상의 염기 길이의 핵산이다.
주어진 용도에 대한 결합 표면 상의 리간드의 최적 백분율은 당업자가 비오틴-기반 용도에 대해 본원에 설명된 동일한 종류의 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 리간드로서 비오틴 대신에 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 사용되면, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 지지체 커플러 (예를 들어, 단백질 또는 핵단백질)와 커플링될 수 있고, 적합한 고상은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 및 그의 지지체 커플러로 코팅될 수 있다. 안정성, 탈락 또는 해리, 신호 대 노이즈, 및 밸리데이션 연구는 결합 표면의 단위 표면적당 최적량의 리간드 (예를 들어, 최대값의 10% 내지 90%, 최대값의 20% 내지 80%, 최대값의 30% 내지 70% 등)를 얻기 위해 본원에 설명된 것과 유사하게 수행할 수 있다. 하나의 편리한 방안은 먼저 단위 표면적당 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 양을 최대화한 후, 본원에 설명된 방법 (예를 들어, 리간드::지지체 커플러 복합체를 제조하는데 있어서 지지체 커플러에 대한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 몇몇 낮은 몰 투입비에서)을 사용하여 비-포화되고 배향된 표면을 제조하고, 다양한 제제로부터의 안정성, 해리, 신호 대 노이즈, 및 밸리데이션 결과를 비교하는 것일 것이다.
결합 표면 상에 리간드를 배향시키는 것은 리간드를 물리적으로 배향하는 것, 즉, 그의 주변에 대하여 리간드의 배치를 조정하는 것을 포함한다. 지지체 커플러당 최대량의 리간드를 함유하는 결합 표면은 일반적으로 입체적으로 접근가능하지 않은 많은 리간드, 및 복합체의 리간드 결합에 대한 해당 도입 분자에 대해 가깝게 이격된 인접한 리간드 사이의 경쟁을 일으킨다. 본원에서 사용될 때, 물리적 (구조적) 배향 또는 그의 문법적인 동의어는 대다수의 모이어티가 특정 방향으로 대면하도록 배향되는 방식으로 모이어티가 조작되는 것을 의미한다. 본 발명의 한 실시태양에서, 모이어티는 인식 부위 또는 결합 부위가 지지체 표면으로부터 멀리 실질적으로 배향되도록 배향된다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 물리적으로 배향된 모이어티는 일렬로 회합된다.
배향은 본원에서 임의의 리간드::지지체 커플러 쌍에 대해 설명된 방법에 의해 달성할 수 있다. 결합 표면 상에 리간드를 배향시키는 하나의 방법은 리간드::지지체 커플러 복합체 (비오틴-BSA 복합체의 예를 본원에 제공한다)를 지지체 커플러에 대한 낮은 몰 투입비의 리간드에서 제조하는 것이다. 본원의 다른 부분에서 설명되는 바와 같이, 지지체 커플러에 대한 낮은 몰 투입비의 리간드를 사용하는 목적은 지지체 커플러당 커플링된 제어된 수의 리간드를 갖는 복합체를 제조하기 위한 것이다. 지지체 커플러당 제어된 (즉, 최대 미만) 수의 리간드를 달성하는 것은 표면 상에서 리간드의 보다 우수한 입체 접근가능성, 인접한 리간드 사이에 보다 작은 상호작용, 결합 표면 상의 리간드 사이에 보다 균일한 거리 (평균으로), 및 유리 리간드가 실질적으로 없는 표면을 제공함으로써 개선된 안정성 (예를 들어, 리간드의 탈락을 방지 또는 완화한다)을 일으킬 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 감도 (신호 대 노이즈 비), 정확도, 분석 정밀도 (정량 분석), 분석 재현성 (정성 분석) 및 안정성을 포함한 성능 파라미터를 분석하기 위한, 및 제조 파라미터, 예를 들어 상자성 마이크로입자 (PMP) 제조 공정 재현성 (PMP 제조가능성) 또는 이들의 조합을 분석하기 위한 개선을 포함한다. 친화도 분석에서 사용되는 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 비오틴 컨쥬게이팅된 분자 (예를 들어, 샌드위치 및 경쟁 분석에서 고상 포획 항체로서 사용되는 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 비오티닐화된 항체); 비특이적 결합 또는 이종친화 간섭과 연관된 분석 노이즈 또는 배경의 감소; 향상된 마이크로입자 분산으로 인한 증가된 분석 신호 (증가된 이용가능한 표면적 및 충돌 속도; 감소된 분석 확산 거리); SA 비-포화 또는 비-포화 및 배향으로 인한 증가된 분석 신호 (큰 및 작은 비오틴-컨쥬게이팅된 분자에 결합하기 위한 입체 자유, 이는 결합 효율을 개선시킨다); 비오틴-컨쥬게이팅된 분자의 비-포화 또는 비-포화 및 배향으로 인한 증가된 분석 신호 (큰 또는 작은 분석물 바인더 (비오티닐화된 포획 모이어티) 및/또는 분석물을 포획하거나 결합하기 위한 입체 자유, 이는 분석물 바인더 (비오티닐화된 포획 모이어티) 및/또는 분석물 인식 및 분석물 바인더 (비오티닐화된 포획 모이어티) 특이적 활성을 개선시킨다); 향상된 생성물 안정성 (개선된 차단 효율 및 표면으로부터 SA 탈락 감소); 및/또는 마이크로입자 표면 상에 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 SA를 제조하기 위해 사용된 공정 최적화로 인한 증가된 면역분석의 고효율성 및 공정 재현성을 위한 조성물 및 방법이 본 발명에 포함된다. 여러 실시태양에서, 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 지지체 표면 상의 신호 대 노이즈 비는 최적 신호 대 노이즈 비를 달성하도록 리간드 (예를 들어, 비오틴)에 대해 상이한 수준의 리간드 바인더 (예를 들어, SA)를 적정함으로써 및/또는 리간드 바인더 (예를 들어, SA)에 대해 상이한 수준의 포획 모이어티 (예를 들어, 비오티닐화된 항체)를 적정함으로써 향상될 수 있다.
낮은 투입비 비오티닐화된 BSA로 코팅되고, 블록 공중합체 Pluronic(등록상표) F108 (바스프 (BASF)로부터 이용가능함)로 차단되고, Pluronic(등록상표) F108로 분산되고, SA로 코팅된 마이크로입자에 기반한 실시태양에서, 면역분석에서 최적 신호 대 노이즈 비 및 IgG 결합능은 마이크로입자의 mg당 3 내지 6 마이크로그램의 비오티닐화된 IgG의 비오티닐화된 항체 투입을 이용하여 얻어진다. 마이크로입자의 mg당 10 마이크로그램 초과의 비오티닐화된 IgG의 IgG 투입에서는 IgG 결합능의 신호 대 노이즈 비의 유의한 변화가 없다. 마이크로입자의 mg당 3 마이크로그램 미만의 비오티닐화된 IgG의 IgG 투입은 신호 대 노이즈 비 및 IgG 결합능의 유의한 감소를 일으키고, 항체 투입이 0에 접근함에 따라 0에 접근한다.
본원의 토의 및 실시예와 관련 도면은 리간드로서 비오틴을 사용하는 본 발명의 실시태양을 제공하지만, 본 발명은 비오틴을 갖는 결합 표면으로 제한되지 않는다. 본원에 설명된 것은 그의 리간드가 설명된 방법 및 조성물을 사용하여 비-포화되거나 비-포화되고 배향될 수 있는 임의의 결합 표면에 일반화될 수 있다. 리간드로서 비오틴을 갖는 결합 표면에 뒤따르는 설명은 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 제조하기 위한 특정 조성물 및 방법을 설명하기 위해 사용된다.
또한, 본 명세서의 다른 부분에서 설명되는 바와 같이, 지지체 커플러는 선택적이다. 따라서, 지지체 커플러는 단지 본 발명의 하나의 실시태양일 뿐이고, 지지체 커플러의 설명은 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
비-포화되고 배향된 리간드를 포함하는 결합 표면을 제공한다. 결합 표면은 임의의 목적하는 분자를 포획하기 위해 적합한 포획 모이어티의 표면을 제작하기 위해 사용될 수 있다. 표면 상의 리간드의 비-포화 성질 및 배향은 포획 모이어티와 같은 추가의 성분의 배치를 허용하고, 결합 표면 상에서 그의 배치는 아래에 놓인 리간드의 비-포화 성질 및 배향을 반영한다.
여러 실시태양에서, 본원에 설명된 방법에 따라 지지체 커플러 상에 배치된 최대수 미만의 리간드가 존재하도록, 및 탈락이 감소되도록 지지체 커플러에 대한 낮은 몰 투입비의 리간드를 사용하여 제조되는 리간드::지지체 커플러 복합체가 제공된다. 이들 복합체는 본 발명의 비-포화되고 배향된 결합 표면을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 리간드::지지체 커플러 복합체를 제조하는데 있어서 지지체 커플러에 대한 낮은 투입비의 리간드를 사용하는 실시태양은 2가 또는 다가 리간드 바인더가 사용되는 경우 (예를 들어, 비오틴이 리간드이고, SA와 같은 2가 또는 다가 비오틴-결합 단백질이 리간드 바인더인 경우) 특히 유용할 수 있다.
분산제 및 결합 표면을 포함하는 마이크로입자의 제조 방법, 및 예를 들어, 비오틴 결합 모이어티, 예를 들어 SA (리간드 바인더)를 첨가하기 전에 비오틴 (리간드)으로 코팅된 마이크로입자를 분산시키는데 Pluronic(등록상표) 블록 공중합체와 같은 블록 공중합체를 사용하여 결합 표면을 갖는 마이크로입자를 제조하는 방법을 제공한다. 여기서 사용될 수 있는 특정한 Pluronic(등록상표) 블록 공중합체, 및 그들의 수 평균 분자량은 F108 (약 12,700-17,400 Da, 평균 약 14,600 Da) 및 F127 (약 9,840-14,600 Da, 평균 약 12,600 Da)을 포함한다. 본원에 설명된 각각의 Pluronic(등록상표)의 블록 길이는 정확한 블록 길이는 배치 (batch)마다 다를 것이므로 제조사에 따른 근사값이다. 달리 특정하거나 문맥으로부터 명백하지 않으면, 블록 공중합체의 분자량은 수평균 분자량으로 표현된다.
2개 이상의 비오틴-결합 도메인을 갖는 분자 (예를 들어, 아비딘, SA 및 뉴트라비딘)를 포획하기 위해 사용된 코팅 표면에 사용하기 위한 안정한 비오티닐화된 분자 (예를 들어, 비오틴-BSA 및 비오틴-오발부민)를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 이들은 차례로 결합 분석에서 목적하는 다른 분자를 포획할 수 있는 비오티닐화된 포획 모이어티를 결합시키기 위해 유용하다 (예를 들어, 비오티닐화된 항체에 대해, 목적하는 분자는 항원이고; 비오티닐화된 소분자에 대해, 목적하는 분자는 효소, 항체 또는 소분자에 결합하는 결합 단백질이다). SA를 포획하기 위해 지지체를 코팅하는데 사용하기 위한, BSA를 비오티닐화할 때 낮은 몰 투입비의 비오틴을 사용하여 제조된 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA를 사용하는 특정 예가 제공된다. 이어서, SA는 적합한 비오티닐화된 포획 모이어티에 복합체화될 수 있다.
2개 이상의 비오틴-결합 도메인을 갖는 포화량 미만의 분자 (예를 들어 아비딘, SA 또는 뉴트라비딘)를 포획하고, 배향시키고, 회합시키기 위해 비오티닐화된 분자를 지지체 상에 코팅하기 위한 방법을 제시한다. 포화량 미만의 SA를 포획하고, 배향시키고, 회합시키기 위해 사용된 PMP 표면 상에 낮은 몰 투입비 비오틴-BSA 코팅을 예시하는 특정 예가 제공된다.
비오티닐화된 및/또는 비-비오티닐화된 분자로 코팅된 지지체에 대한 차단제로서 블록 공중합체를 사용하는 방법을 제시한다. 낮은 투입비 비오틴-BSA로 코팅된 PMP에 대한 차단제로서 트리-블록 공중합체 Pluronic(등록상표) F108을 사용하는 것을 예시하는 특정 예가 제공된다.
비오티닐화된 및/또는 비-비오티닐화된 분자로 코팅된 마이크로입자에 대한 분산제로서 블록 공중합체를 사용하는 방법을 제시한다. 낮은 투입비 비오틴-BSA로 코팅된 PMP에 대한 분산제로서 Pluronic(등록상표) F108의 사용을 예시하는 특정 예가 제공된다.
2개 이상의 비오틴-결합 도메인을 함유하는 분자 (예를 들어, 아비딘, SA 및 뉴트라비딘)의 코팅 동안, 비오티닐화된 분자로 코팅된 마이크로입자에 대한 분산제로서 블록 공중합체를 사용하는 방법을 제시한다. 낮은 투입비 비오틴-BSA로 코팅된 PMP의 표면 상에 SA의 코팅 동안 분산제로서 Pluronic(등록상표) F108을 사용하는 것을 예시하는 특정 예가 제공된다 (예를 들어, SA를 첨가하기 전에 낮은 투입비 비오틴-BSA 마이크로입자의 단분산액을 제조하기 위해 Pluronic(등록상표) F108을 첨가).
2개 이상의 비오틴-결합 부위를 포함하는 포화량 미만의 분자 (예를 들어, 아비딘, SA 또는 뉴트라비딘)를 비오티닐화된 표면에 코팅하고, 배향시키고, 회합시키는 방법을 제시한다. 낮은 투입비 비오틴-BSA로 코팅된 PMP의 표면 상에 포화량 미만의 SA를 코팅하고, 배향시키고, 회합시키는 것을 예시하는 특정 예가 제공된다.
포화량 미만의 비오틴-컨쥬게이팅된 분자를 표면 상에 회합시키고 임의로 배향시키기 위한 방법을 제시한다. 예를 들어, 면역분석과 같은 친화도 분석에서 사용하기 위한 SA로 특이적으로 코팅된 (즉, 비-포화되고 배향된) PMP의 표면 상에 포화량 미만의 비오틴-함유 컨쥬게이트 (예를 들어, 비오티닐화된 항체, Fab 단편, 소분자, 큰 분자, 캐리어 분자 등)를 코팅하고, 배향시키고, 회합시키는 것을 예시하는 특정 예가 제공된다.
친화도 분석은 분석물과 분석물에 우선적으로 결합하는 분자 사이의 특이적 또는 비교적 특이적인 상호작용에 기초하여 샘플 내에 분석물의 존재 또는 부재를 결정하고/하거나 샘플 내의 분석물의 양을 정량하는 분석을 포함한다 (직접적으로 또는 간접적으로). 친화도 분석은 적어도 일부 측면에서, 다른 것에 대한 하나의 엔티티의 특이적 또는 비교적 특이적인 결합 친화도에 의존하는 분석을 포함한다. 친화도 분석은 수용체와 리간드, 효소와 그의 기질, 폴리뉴클레오티드와 그의 보체 또는 실질적인 보체, 소분자와 특이성을 갖고 소분자에 결합하는 결합 단백질 등의 사이의 결합 상호작용에 의존하는 분석을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 면역분석은 예를 들어, 항원과 항원을 인식하는 항체 사이의 상호작용에 의존하는 분석을 포함한다. 면역분석은 또한 예를 들어, 샘플 내의 목적하는 항원에 결합하는 항체 또는 그의 단편을 사용하는 분석을 포함한다. 친화도 분석은 또한 예를 들어, 경쟁 분석 및 샌드위치 분석을 포함한다. 상기 분석은 샘플 내의 목적하는 항체를 검출하기 위해 표면-결합된 항원의 상호작용에 의존하는 것, 및 샘플 내의 목적하는 항원을 검출하기 위해 표면-결합된 항체 또는 그의 단편의 상호작용에 의존하는 것을 포함한다. 본원에서 사용될 때, 항원은 폴리펩티드 또는 단백질로 제한되지 않고, 대신 소분자 (예를 들어, 합텐) 및 항체 (예를 들어, 항체는 그를 인식하는 다른 항체를 생성하기 위해 항원으로서 사용될 수 있다)를 또한 포함할 수 있다. 일반적으로, 본원에서 사용될 때 항원은 본 발명의 조성물 또는 방법을 이용하여 항체 또는 그의 단편을 사용하여 면역분석하는 샘플 내의 임의의 목적하는 분석물을 포함한다.
본원에 설명된 조성물 및 방법의 특정 실시태양의 적용을 포화량 미만의 SA를 PMP 표면 상에 배향시키고 회합시키는 특정한 경우에 대해 도 1A 및 1B에 제시한다. 상기 공정에서 각종 단계의 보다 상세한 설명은 본원의 다른 곳에서 제공된다.
비-포화되고 배향된 표면을 제조하기 위한 공정의 일반적인 설명은 차례로 비오티닐화된 포획 모이어티, 예를 들어, 면역글로불린 또는 그의 단편에 결합할 수 있는 SA에 결합할 수 있는 비오티닐화된 BSA를 포함하는 표면의 경우에 대해 제공된다. 제공된 많은 논의 및 실시예는 비오틴/SA 시스템을 논의하지만, 본 발명은 비오티닐화된 표면으로 제한되지 않는다.
논의 및 실시예에서 비오틴을 사용하고, 비오틴은 2가 또는 다가 비오틴 결합 모이어티 (예를 들어, SA)에 결합하도록 일반적으로 사용되기 때문에, 다가 비오틴 결합 모이어티를 사용하는 것은 다가 리간드 바인더를 사용하지 않는 많은 결합 표면에서 발생할 수 없는 특정 문제를 제기한다는 사실을 명심해야 한다. 이들 문제 중 하나는 SA로 코팅된 비오티닐화된 마이크로입자를 사용할 때, 비공유 결합된 비오틴의 탈락이 결합 표면의 성능을 저해할 수 있다는 점이다 (예를 들어, 유리 비오틴은 해리되고, SA와 복합체화할 수 있다). 이 경우에, 낮은 투입비 비오티닐화는 BSA와 회합하는 비공유 결합된 비오틴의 양을 감소시킬 수 있기 때문에, 독단적으로 많은 과잉의 비오틴으로 BSA를 비오티닐화하는 대신에 BSA의 낮은 투입비 비오티닐화를 수행함으로써 상기 현상을 감소시킬 수 있다.
또한, 마이크로입자 상에서 SA와 같은 다가 모이어티로 지지체를 코팅할 때, SA로 코팅하는 동안 응집이 일어날 수 있다. 이는 SA의 각각의 분자가 하나 초과의 분자의 비오틴에 결합하기 때문이다. SA는 분자량이 약 56,000 Da인 사량체 단백질이고, 2개 이상의 비오틴-결합 도메인을 함유하는 생물학적 분자의 특정 예이다. 아비딘-비오틴 상호작용은 단백질과 리간드 사이의 가장 강한 공지의 비-공유 상호작용이고, SA의 4개의 서브유닛의 각각은 결합 상수 Ka = 1015 M-1로 비오틴에 결합할 수 있다. SA의 3차 구조는 분자의 반대편 측면 상에 위치하는 그의 4개의 비오틴-결합 도메인을 생성시킨다. SA 비오틴-결합 도메인 중 하나가 비오티닐화된 표면에 결합하면, 3개의 점령되지 않은 비오틴-결합 도메인 중 적어도 2개는 비오티닐화된 포획 모이어티에 결합하기 위해 여전히 입체적으로 이용가능할 것이다. 아비딘 및 뉴트라비딘은 4개의 비오틴-결합 도메인을 갖는 사량체 단백질의 다른 예이고; 이들은 그들의 pI, 용해도 및 비특이적 결합 특성에서 SA와 상이하다.
비오티닐화된 표면이 SA에 노출되면, 유리 SA는 표면의 비오틴과 결합할 것이지만, 표면과 결합된 SA는 이어서 다른 마이크로입자와 결합된 비오틴에 결합할 수 있다. 이러한 방식으로, 큰 마이크로입자 응집체가 형성될 수 있다. 이는 SA 첨가 단계에서 마이크로입자의 단분산액을 생성함으로써 처리할 수 있다.
간단히 설명하면, 마이크로입자 상에 비오틴-BSA 표면을 제조하는 공정은 BSA의 낮은 투입비 비오티닐화로 시작한다. 이후, 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA를 PMP의 표면 관능기에 대한 비오틴-BSA의 BSA의 1차 아민의 공유 부착에 의해 PMP와 커플링시킨다. 생성되는 비오티닐화된 PMP를 적합한 Pluronic(등록상표) 내에 일정 시간 동안 현탁시키고 (차단 단계), 세정한 후, 단리시킨다. 이후, 비오티닐화된 PMP를 적합한 Pluronic(등록상표) 내에 현탁시키고 (향상된 분산 단계), SA를 첨가한다. 마이크로입자를 실온에서 일정 시간 동안 인큐베이팅하고, 세정한 후, 단리시킨다. 일단 단리된 후에, 적합한 비오티닐화된 분자 (예를 들어 비오티닐화된 포획 모이어티)는 임의의 특정 분석 용도에 첨가될 수 있다.
적합한 Pluronic(등록상표)을 사용한 상기한 차단 단계는 본 발명의 리간드-기반 복합체를 생성하기 위해 요구되는 특이적 회합을 허용하면서, 본 발명의 비-포화된 결합 표면의 점령되지 않은 결합 부위를 포함하는 비특이적인, 인위적인 결합 사건을 최소화한다 (도 5 및 7). 상기 차단은 그들의 모이어티가 회합할 때 본 발명의 리간드-기반 복합체의 공간적 (입체) 접근가능성을 촉진하고, 생성되는 동안 본 발명의 각각의 리간드-기반 복합체의 선형 구조 배향을 용이하게 하여, 본 발명의 각각의 생성되는 포획 모이어티-함유 복합체가 제한되는 것으로 의도되지 않는 예로서 신호 대 노이즈 비를 포함하는 분석 성능 파라미터를 최적화하기 위해 기능할 가능성을 증가시킨다. 또한, 면역분석에 대해 전반적으로 사실인 것과 같이, 차단 단계는 또한 비-제한적인 예로서 신호 대 노이즈 비를 포함하는 분석 성능 파라미터에 불리한 영향을 미칠 수 있는 바람직하지 않은 부산물을 생성시키는 그의 성분 및/또는 지지체 표면을 포함하는 면역분석에서 인위적인 결합 사건으로서 설명될 수 있는 비특이적 결합을 최소화시킨다. 신호 대 노이즈 비에 대한 상기 인위적인 결합 사건의 불리한 효과는 감소된 신호, 증가된 노이즈 또는 둘 모두의 형태를 취할 수 있다. 마지막으로, 지지체 표면 및 결합 표면 모두와의 특이적 회합이 최적화되는 반면, 이들 표면과의 비-특이적 회합은 최소화되므로, 마이크로입자 또는 마이크로플레이트의 지지체 및 결합 표면으로부터 본 발명의 리간드-기반 성분의 탈락이 동시에 최소화된다. 상기 이유로 인해, 적합한 Pluronic(등록상표)를 사용하는 차단 단계는 분석 감도 (신호 대 노이즈 비), 분석 정확도, 분석 정밀도 (정량 분석), 분석 재현성 (정성 분석), 분석 안정성, 또는 PMP 제조 공정 재현성 (PMP 제조가능성), 또는 이들의 조합에 유리한 영향을 미치는 성능 및 제조 개선을 일으킨다.
마이크로입자 상에 비오틴-BSA 표면을 제조하는 공정 동안, SA 첨가 전에 적합한 Pluronic(등록상표)를 사용하는 상기한 향상된 분산 단계는 마이크로입자 응집을 완화하고, 동시에 마이크로입자 상에 노출되는 표면적을 동시에 증가시켜 (도 6 및 10), 마이크로입자 표면 상의 최소수의 리간드-기반 복합체가 결합을 위해 이용가능하지 않도록 만든다. 응집의 상기 Pluronic(등록상표)-매개된 억제는 PMP 제조가능성 (PMP 공정 재현성)을 향상시키고, 상기 PMP가 사용되는 분석 및 키트의 성능을 개선하는 것을 포함하는 용도를 위해 유용하다. PMP 제조 공정 전에, 공정 동안, 및 공정 후에 PMP의 로트들 사이의 마이크로입자 응집의 수준이 제어가능할 때, PMP 제조가능성은 향상된다. PMP 제조 공정 후에, 상기 PMP를 사용하는 분석의 성능은 면역분석 동안 샘플의 첨가 전에 마이크로입자를 Pluronic(등록상표)을 함유하는 용액에 노출시키고/시키거나 면역분석 동안 기질의 첨가 전에 마이크로입자를 Pluronic(등록상표)을 함유하는 용액에 노출시키는 것을 포함하고 이로 제한되는 것으로 의도되지 않는 수단에 의해 최적화될 수 있다. 상기한 이유로 인해, 적합한 Pluronic(등록상표)를 사용하는 향상된 분산 단계는 분석 감도 (신호 대 노이즈 비), 분석 정확도, 분석 정밀도 (정량 분석), 분석 재현성 (정성 분석), 분석 안정성, 또는 PMP 제조 공정 재현성 (PMP 제조가능성), 또는 이들의 조합에 유리한 영향을 미치는 성능 및 제조 개선을 일으킨다.
공정을 균일한 크기 (< 5% CV) 1.0 ㎛ MyOne™ 토실활성화된 (추가의 표면 활성화가 요구되지 않음) Dynal(등록상표) PMP (인비트로겐 코퍼레이션 (Invitrogen Corporation)), 낮은 투입비 (4 비오틴 시약: 1 BSA) 비오티닐화된 BSA, Pluronic(등록상표) F108 트리-블록 공중합체 (합성, 비-생물학적; 바스프), SA21 SA-PLUS™ (동결된, 동결건조되지 않은; ProZyme(등록상표)), 마이크로입자를 분리시키고 세척하기 위한 자석 (버퍼 교환)를 사용하는 특정 실시태양에 대해 도 1A 및 1B에 예시한다. 마이크로입자 공정은 25 mg PMP/mL의 농도, 재현탁 공정을 위한 마이크로입자를 재현탁시키고 분산시키기 위해 오버헤드 혼합 및 초음파 처리, 인큐베이션 공정을 위한 오버헤드 혼합, 승온 (38-42℃) 및 실온 인큐베이션 공정, 비오티닐화된 BSA를 BSA 1차 아미노기를 통해 마이크로입자 표면 토실기에 공유 커플링하기 위한 토실 화학, 마이크로입자 표면 차단을 위한 Pluronic(등록상표) F108 트리-블록 공중합체 (수동적으로 흡수된 단백질을 제거하고, 마이크로입자 표면에 대한 단백질의 비-특이적 결합을 최소화함), PMP 단분산을 위한 Pluronic(등록상표) F108 트리-블록 공중합체, 및 Pluronic(등록상표) F108 트리-블록 공중합체 (SA 커플링 공정 동안 마이크로입자 응집을 완화함)의 존재 하에 비오틴-BSA PMP 중간체에 대한 SA의 2차 커플링 (친화도)을 포함한다.
비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 표면을 제조하는데 있어서 낮은 투입비 비오티닐화의 이면의 원리를 보여주기 위한 편리한 방식은 비오티닐화 공정을 포아송 (Poisson) 분포의 렌즈를 통해 보여주는 것이다. 다음의 예시 이면의 원리는 모든 리간드 및 지지체 커플러 쌍에 대해 적용가능하다 (비오틴 및 BSA만이 아니라). 지지체 커플러에 대한 낮은 투입비의 리간드를 사용하여 제조된 리간드::지지체 커플러 복합체는 리간드 지지체 커플러가 지지체 상에 코팅될 때 리간드 분자의 보다 유리한 배향을 생성시키는 것으로 생각된다. 리간드 분자의 상기 보다 유리한 배향은 지지체 상의 코팅의 입체 접근가능성에 기여한다. 임의의 특정 지지체 커플러 또는 리간드에 제한되지 않으면서 단지 원리의 예시를 위해, 본원에서 비오티닐화된 BSA를 사용하여 현상을 예시한다. 아래의 예시는 임의의 리간드 및 지지체 커플러에 적용되고, 여기서 지지체 커플러는 하나 초과의 리간드와 회합할 수 있다. 비오틴 및 BSA 이외의 리간드 및 지지체 커플러에 대해, 지지체 커플러에 대한 리간드의 투입비는 바람직한 안정성을 제공하는 투입비를 선택하고, 평균 치환 (λ)을 결정하고, 배향 효과를 적합한 분포, 예를 들어, 포아송 분포로 보임으로써 실시예 1에서 BSA 및 비오틴에 대해 이루어진 것과 같이 (표 1 참조) 결정할 수 있다.
BSA의 비오티닐화의 경우에, 1차 아민-반응성 비오티닐화 시약 술포-NHS-LC-비오틴을 사용하여 비오티닐화될 수 있는 다수의 가능한 부위가 BSA의 아미노산 서열 내에 존재한다. 유리 1차 아민을 함유하는 아미노산인 라이신은 BSA의 아미노산 서열 내에 59회 발생한다. 그러나, BSA 내의 약 30 내지 35개의 라이신 1차 아민만이 아민-반응성 비오티닐화 시약과 반응하도록 이용가능하다. 예를 들어, N-말단 아민은 BSA의 3차 구조 내에 묻히거나 차단될 수 있다. 분자의 표면 (예를 들어, 상부, 하부, 측면, 홈, 포켓 등) 상에 놓인 1차 아민만이 비오티닐화를 위해 이용가능하다. BSA 1 몰당 4 몰의 술포-NHS-LC-비오틴의 몰 투입비에서 BSA를 비오티닐화하면 BSA 분자당 평균 약 1.63 비오틴 분자를 생성시키는 것으로 (표 1 참조) 실험에 의해 결정되었다 (실시예 1 참조).
BSA 비오티닐화를 위해, 술포-NHS-LC-비오틴과 BSA 분자와의 무작위 반응 (1 몰 BSA에 대해 4 몰 술포-NHS-LC-비오틴) 및 BSA 분자당 1.63 비오틴의 평균 치환 (λ)을 가정하면, 비오티닐화된 BSA 분자의 분포는 포아송 분포를 이용하여 어림할 수 있다 (도 3 참조: BSA의 20%는 0개의 비오틴을 갖고; BSA의 32%는 1개의 비오틴을 갖고; BSA의 26%는 2개의 비오틴을 갖고; BSA의 14%는 3개의 비오틴을 갖고; BSA의 6%는 4개의 비오틴을 갖고; BSA의 2%는 5개의 비오틴을 갖고; BSA의 1% 미만은 6개의 비오틴을 갖는다). 도 3에 예시된 바와 같이, 포아송 분포는 비오틴-BSA 복합체의 적어도 50%가 비오틴:BSA의 선택된 몰 투입비에서 지지체 커플러 (즉, BSA)당 3개 이하의 비오틴을 갖는 것을 보여준다. 분포는 또한 선택된 몰 투입비에서, BSA 분자당 0 내지 6개의 비오틴이 컨쥬게이팅되는 것을 보여준다.
낮은 투입비 비오티닐화된 BSA는 지지체와 공유 커플링될 수 있고, 이는 BSA는 1차 아민 화학을 위해 이용가능한 약 30 내지 35개의 1차 아민을 갖고 포아송 분포가 BSA의 0 내지 6개의 1차 아민이 낮은 투입비 비오티닐화 후 비오틴에 컨쥬게이팅되는 것을 예측하기 때문이다. 따라서, 각각의 BSA 분자를 1차 아민 화학 (예를 들어, 토실, 에폭시, 카르보디이미드 등)을 통해 지지체에 공유 커플링시키기 위해 약 24 내지 35개의 1차 아민이 여전히 이용가능하다. 다수의 이용가능한 1차 아민은 지지체의 관능기에 대한 BSA 커플링 효율을 개선할 수 있고, 다수의 부착 지점 (즉, BSA 분자당 하나 초과의 지지체-대-BSA 공유 결합)을 통해 안정성을 개선할 수 있다.
비오티닐화 시약 제조사의 지시에 따라 (피어스 케미칼 코. (Pierce Chemical Co.), Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, M. Savage et al., 2nd Ed., 1992, page 34), 단백질의 1 몰당 2.5 몰의 비오틴으로 비오티닐화된 단백질은 또한 단백질 풀 (pool) 사이에 가우스 (Gaussian) (종 모양) 분포를 생성시킬 수 있다. 풀 내의 일부 단백질은 통합된 비오틴을 갖지 않을 수 있지만, 대부분은 2-3 몰의 통합된 비오틴을 가질 것이고, 풀의 매우 적은 분획은 5 몰의 통합된 비오틴을 가질 수 있다. 비오틴은 임의의 이용가능한 1차 아민과 컨쥬게이팅될 수 있으므로, 각각의 BSA 분자 상의 상이한 이용가능한 아민에 컨쥬게이팅된 비오틴을 갖는 상이한 비오틴-BSA 컨쥬게이트를 생산하는 것이 가능하다.
낮은 투입비 비오티닐화된 BSA가 사용될 수 있는 방식의 예시를 도 4에 도시하고, 이는 비오틴-BSA 1차 아미노 또는 술프히드릴 관능기에 공유 결합하도록 사용되는 표면 관능기 (즉, 카르복실산, 토실활성화된, 에폭시 등)을 갖는 1.0 미크론 토실활성화된 마이크로입자 고상에 대한 낮은 투입비 비오틴-BSA의 커플링을 보여준다. 생성되는 지지체는 그의 표면 상에서 비오틴에 관해 비-포화되고 배향된다.
비오틴-BSA 컨쥬게이트 (리간드::지지체 커플러 복합체)는 BSA 분자당 상이한 수의 비오틴을 가질 수 있고, BSA 분자의 배향 및 표면 비오틴의 위치는 무작위이므로, 비오틴-BSA 컨쥬게이트는 용액 내로 연장하는 비오틴은 결합 표면으로서 입체적으로 이용가능하고, 지지체 표면을 대면하는 비오틴은 결합 표면으로서 입체적으로 이용가능하지 않도록 지지체 표면과 커플링될 것이다.
대부분의 상업적으로 입수가능한 마이크로입자는 폴리스티렌-기반이고, 마이크로입자 표면에 대한 단백질 흡수는 수동적으로 (예를 들어, 소수성 및/또는 이온성 상호작용에 의해) 및 비특이적으로 발생한다. 토실-활성화된 마이크로입자가 도시되지만, 지지체는 비오틴-BSA 관능기 (예를 들어, BSA의 1차 아미노 또는 술프히드릴기)에 공유 결합할 수 있는 임의의 적합한 관능기 (예를 들어, 카르복실산, 에폭시 등)로 활성화될 수 있다. BSA 분자의 표면 상의 각각의 엡실론 아민이 동일한 pK를 가지면, BSA 표면 상의 비오틴의 분포는 가우스 분포이어야 한다 (피어스 케미칼 코., [Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook. M. Savage et al., 2nd Ed., 1992, page 34]). 도 4는 BSA 분자당 1.63 비오틴의 평균 치환 (λ)을 갖는 비오틴-BSA를 1.0 미크론 지지체에 공유 회합함으로써 제조된 비-포화된 표면을 도시한 것이다. 도면에서 알 수 있는 바와 같이, 여기서 비-포화는 적어도 부분적으로 지지체를 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA로 코팅함으로써 달성된다.
지지체 상에 비-포화된 결합 표면을 달성하기 위한 다른 방법은 지지체 커플러에 대한 리간드의 선택된 몰 투입비에서 리간드::지지체 커플러 복합체를 제조하고, 생성되는 리간드::지지체 커플러 복합체의 희석된 제제를 제조하고, 리간드::지지체 커플러 복합체를 지지체와 회합시키는 과정에서 리간드::지지체 커플러 복합체의 희석된 제제를 사용하여 지지체를 코팅하는 것을 포함한다. 적어도 2가 비오틴 결합 모이어티에 결합하는 비오티닐화된 표면에 대해, 탈락으로 인한 성능 퇴보를 감소시키기 위해 선택된 몰 투입비는 바람직하게는 지지체 커플러에 대한 비오틴의 낮은 몰 투입비이다. 상기 방법에서, 낮은 투입비는 생성되는 지지체의 비-포화된 성질을 초래하지 않고, 이는 지지체와 커플링된 리간드의 비-포화된 성질이 지지체 커플러당 리간드 양의 제한에 의하기보다는 지지체 상에서 단위 면적당 리간드::지지체 커플러 복합체의 농도를 제한하는 것을 통해 달성되기 때문이다. 따라서, 예를 들어, 상기 방법을 사용하면, BSA는 BSA의 몰당 4 몰 초과의 비오틴의 몰 투입비에서 비오틴과 컨쥬게이팅될 수 있지만, 비오티닐화는 바람직하게는 결합 표면에서 비공유 결합된 비오틴의 양을 감소시키기 위해 비오틴의 낮은 투입비에서 수행된다.
많은 상황에서, 지지체 커플러에 대한 리간드의 높은 몰 투입비 (예를 들어, BSA의 몰당 약 20 몰 이상의 비오티닐화 시약의 몰 투입비)에서 BSA를 비오티닐화하는 (또는 임의의 리간드를 임의의 지지체 커플러와 커플링하는) 것은 바람직하지 않고/않거나 소모적일 것이지만, 본 방법에서, 그러한 높은 투입비에서 제조된 리간드::지지체 커플러 복합체 (예를 들어, 비오틴-BSA)는 또한 비-포화된 결합 표면을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 지지체 커플러당 리간드 (예를 들어, BSA당 비오틴)의 평균 치환 (λ)을 제한하는 것에 무관하게, 지지체 상의 리간드의 포화를 제한하는 것은 리간드::지지체 커플러 복합체를 지지체에 커플링시키는 반응에서 리간드::지지체 커플러 복합체의 농도를 제한함으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, 포화 정도는 예를 들어 반응 온도를 제어하여 (예를 들어, 흡열 커플링에 대한 냉각, 또는 발열 커플링에 대한 가열) 반응 속도를 제어함으로써, 보다 느리거나 반응성이 더 작은 커플링 화학을 선택함으로써, 반응 시간을 제한함으로써 등에 의해 추가로 제어할 수 있다.
상기한 바와 같이, 대부분의 상업적으로 입수가능한 마이크로입자는 폴리스티렌-기반이다. 예를 들어, 소수성 및/또는 이온성 상호작용을 통한 상기 표면으로의 수동적인 단백질 흡수가 알려져 있다. 비특이적 결합을 개선하기 위해 예를 들어 적어도 하나의 Pluronic(등록상표)와 같은 차단제를 사용하는 것이 본원에서 논의된다. 본원에서 다른 곳에서 상세히 개시된 바와 같은 상기 물질은 결합 표면을 포함하는 마이크로입자의 단분산 또는 실질적으로 단분산 제제를 생성하는데 있어서 또한 유용하다.
고상에 대한 차단제로서 블록 공중합체의 사용, 및 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA로 코팅된 마이크로입자에 대한 차단제로서 Pluronic(등록상표) 블록 공중합체를 사용하는 특정한 경우에 대해 도 5에 예시한다. 도면은 Pluronic(등록상표) F108 (M.W. ≒ 13,518 Da; 친수성 친지성 균형 (HLB) = 27)에 대한 것이고, 이는 고상의 노출된 소수성 중합체 표면을 차단하고, 공유 부착된 단백질을 제거하지 않으면서 수동적으로 흡수된 단백질을 대체하거나 제거하거나 벗겨낸다. 이후, 표면은 Pluronic(등록상표) 테일 내의 표면 히드록실의 존재 때문에 친수성으로 유지된다.
지지체 표면과 회합하는 능력이 있고, 또한 비교적 친수성 테일을 주변 매질 내로 연장시키는 임의의 적합한 블록 공중합체가 사용될 수 있다. 트리-블록 공중합체 (예를 들어, Pluronic(등록상표) F108, 바스프)는 길이가 약 17 내지 약 69 단량체 단위인 단일 소수성 폴리프로필렌 (PPO) 헤드기 및 각각 길이가 1 내지 약 129 단량체 단위인 2개의 친수성 폴리에틸렌 (PEO) 테일을 갖는다. 트리-블록 공중합체의 친수성 친지성 균형 (HLB)은 PPO 헤드기 및 PEO 테일의 길이 또는 크기와 직접 관계되고, HLB 값은 1 (물 중에 비-용해성) 내지 29 (물 중에 고도로 용해성)일 수 있다. PPO 헤드기가 길이가 적어도 56 단량체 단위이면, 트리-블록 공중합체의 헤드기는 소수성 프로브로서 작용하고 소수성 표면에 강하게 결합할 뿐만 아니라, 동일한 소수성 표면으로부터의 다른 분자와 경쟁하고 대체할 수 있다. 두 PEO 테일은 길이가 적어도 105 단량체 단위이면 고상 표면으로부터 멀리 용액 내로 연장할 것이다. 테일은 충분히 길고 용액 내에서 측면-대-측면으로 자유롭게 움직이므로 각각의 PEO 테일의 단부에서 히드록실기는 친수성 미세환경을 제공하고, 히드록실 테일은 고상 지지체 표면에 대한 수동적인 단백질 흡수 또는 재-흡수를 방지하기 위해 입체 장벽으로서 작용한다.
이론상 이용가능한 표면적을 기초로 하여, 밀도가 1.5 g/cm3 (마이크로입자 mg당 38.83 내지 48.77 cm2)인 0.82 내지 1.03 미크론 구형 마이크로입자의 평탄한 표면, 및 Pluronic(등록상표) F127 분자의 이론적 계면 표면적 (15.1 내지 20.0 nm2)을 가정하면, 마이크로입자 표면 상의 Pluronic(등록상표) F127의 이론적 단층은 마이크로입자 mg당 약 4.05 x 10-4 내지 약 5.43 x 10-4 nmol Pluronic(등록상표) F127/인 것으로 계산된다. 5-(4,6-디클로로트리아지닐) 아미노플루오레세인 (5-DTAF) 표지된 Pluronic(등록상표) F127의 형광계 분석에서는 약 3.68 x 10-4 내지 약 8.37 x 10-4 nmol Pluronic(등록상표) F127이 0.82 내지 1.03 미크론 구형 마이크로입자의 마이크로그램당 결합하는 것을 나타냈다.
혈구계 분석을 이용하여 모든 폴리스티렌-기반 PMP 응집체를 완전히 파괴하고 마이크로입자 단분산액을 생성하기 위해 요구되는 Pluronic(등록상표) F108, Pluronic(등록상표) F127, 및 Tetronic(등록상표) 908의 최소 농도를 결정하였다. 농도 최적화 연구에서는 Pluronic(등록상표) F108은 약 5 mM (0.007% w/v) 내지 약 500 mM (0.67% w/v)의 농도에서 단지 단량체 및 이량체만의 마이크로입자 단분산액을 생성하였음을 나타냈다. Pluronic(등록상표) F127은 약 6.67 mM (0.009% w/v) 내지 약 33.33 mM (0.043% w/v)에서 마이크로입자 단량체, 이량체 및 삼량체, 및 약 50 mM (0.064% w/v) 내지 약 667 mM (0.850% w/v)에서 단량체, 이량체 및 큰 응집체를 생성하였다. 그러나, Tetronic(등록상표) 908은 시험한 대부분의 농도에서 응집체를 생성하였다. Pluronic(등록상표) F108은 약 0.4% w/v 내지 약 0.6% w/v의 농도에서 비오틴-BSA PMP 차단제로서 작용하였다. 본 발명의 다른 실시태양에서, Pluronic(등록상표) F108은 약 0.1% w/v 내지 약 1.0% w/v, 또는 약 0.5% w/v 내지 약 0.75% w/v의 농도에서 첨가된다.
2개 이상의 비오틴-결합 도메인을 갖는 비오틴-결합 분자를 첨가하기 전에 비오티닐화된 분자로 코팅된 마이크로입자를 위한 분산제로서 블록 공중합체의 사용을 비오틴 코팅된 마이크로입자에 SA를 첨가하기 전에 분산제로서 Pluronic(등록상표) F108을 사용하는 특정한 실시태양에 대해 도 6에 예시한다. 도시된 도면에서, Pluronic(등록상표) F108은 단분산을 촉진하고 또한 표면에 대한 비특이적 결합을 차단하기 위해 사용된다. 적어도 2가 비오틴-결합 분자의 첨가는 Pluronic(등록상표) F108의 존재 또는 부재 하에 도시된다. Pluronic(등록상표) F108의 부재 하에, 비오틴-결합 분자의 첨가 동안 마이크로입자는 응집할 수 있다. Pluronic(등록상표) F108의 존재 하에, 마이크로입자는 비오틴-결합 분자의 첨가 동안 및 첨가 후에 단분산 상태이다.
분산 단계는 최적 결과를 위해 특정 상황 하에서 바람직하고, 이는 예를 들어, 2개 이상의 비오틴-결합 도메인을 갖는 비오틴 결합 모이어티 (예를 들어, 아비딘, SA 또는 뉴트라비딘)와 결합되는 비오틴-BSA를 나타내는 비오티닐화된 마이크로입자는 각각의 비오틴 결합 모이어티의 2개 이상의 비오틴-결합 도메인을 통한 비오티닐화된 마이크로입자의 가교결합으로 인해 응집하거나 덩어리지는 경향을 보이기 때문이다.
예를 들어, 비오틴 결합 모이어티당 2개 이상의 비오틴-결합 도메인을 포함하는 합성 또는 생물학적 리간드 바인더 (비오틴 결합 모이어티)로 코팅된 비오티닐화된 마이크로입자는 하나의 비오티닐화된 마이크로입자 상의 비오틴 결합 모이어티의 점령되지 않은 접근가능한 결합 도메인과 다른 비오티닐화된 마이크로입자 상의 비결합된 접근가능한 비오틴 (리간드) 사이의 결합으로 인해 응집하거나 덩어리지는 경향이 있다. 마이크로입자 응집은 비오티닐화된 마이크로입자를 매우 높은 농도 또는 몰 과량의 비오틴 결합 모이어티 (예를 들어, 아비딘, SA, 뉴트라비딘, SA의 단편, 아비딘의 단편 또는 뉴트라비딘의 단편)을 함유하는 연속적으로 혼합된 용액 내로 느리게 적정함으로써 (즉, 한 방울씩 (drop-by-drop) 첨가) 완화될 수 있다. 상기 방안은 가교결합이 일어날 수 있기 전에 마이크로입자 표면 비오틴을 비오틴-결합 분자로 포화시킴으로써 마이크로입자 응집을 완화시킬 수 있다. 그러나, 적정 방법은 비용 효과 면에서 우수하거나 고효율성이지 않고, 이는 제어해야 하는 다수의 파라미터가 존재하기 때문이고, 특정 비오틴 결합 모이어티의 비용으로 인해 매우 비쌀 수 있지만, 선택된 비오틴 결합 모이어티를 사용하는 코팅 후 마이크로입자 단분산액을 생성시킬 수 있다.
Pluronic(등록상표)와 같은 블록 공중합체를 사용하는 것은 상기한 느린 적정 방안에 대한 보다 우수한 대안이다. Pluronic(등록상표) F108 (트리-블록 공중합체, 바스프)은 길이가 약 56 단량체 단위인 단일 소수성 폴리프로필렌 (PPO) 헤드기, 및 길이가 약 129 단량체 단위인 2개의 친수성 폴리에틸렌 (PEO) 테일을 갖는다. Pluronic(등록상표) F108의 PPO 헤드기는 소수성 프로브로서 작용하고, 단백질 또는 고상 지지체 표면, 예를 들어 마이크로입자 지지체 표면 상의 소수성 패치 또는 부위에 강하게 결합한다. 그 결과, Pluronic(등록상표) F108은 표면 단백질 상호작용 (즉, 소수성 또는 이온성 단백질 상호작용)으로 인한 마이크로입자 응집을 파괴하기 위해 사용될 수 있다. PEO 테일은 친수성 미세환경을 제공하고, 소수성 또는 이온성 상호작용으로 인한 단백질 재-회합을 방지하도록 입체 장벽으로서 작용할 수 있다. 그 결과, 마이크로입자를 Pluronic(등록상표) F108으로 처리하면 매우 친수성으로 되고 용액 내에 단분산으로 존재한다.
본 발명의 하나의 실시태양은 마이크로입자를 포함하는 개선된 친화도 분석을 제공한다. 본 실시태양에서, 분산된 마이크로입자의 집단, 예를 들어 마이크로입자의 단분산 집단은 Pluronic(등록상표) F108 또는 F127과 같은 블록 공중합체를 사용하여 제조한다. 이어서, 분산된 마이크로입자를 통상적인 친화도 분석으로 통합시킨다. 마이크로입자가 분산되기 때문에, 친화도 분석은 증가된 감도 (신호 대 노이즈 비), 증가된 분석 정확도, 증가된 분석 정밀도 (정량 분석), 및 증가된 분석 재현성 (정성 분석)을 가질 것이다.
분산 단계에서 블록 공중합체를 사용하는 도면을 Pluronic(등록상표) F108 및 SA-코팅된 마이크로입자의 특정한 경우에 대해 도 6 및 도 7에 도시한다.
도 7은 0.4% 내지 0.6% (w/v%) Pluronic(등록상표) F108 내에 분산되거나 재현탁되는, 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA로 코팅되고 Pluronic(등록상표) F108으로 차단된 마이크로입자를 도시한 것이다. 일단 비오티닐화된 마이크로입자가 단분산되면, SA를 첨가하여 비오티닐화된 마이크로입자를 코팅한다. SA (M.W. 약 56 kDa)는 BSA (M.W. 약 66 kDa)보다 약간 더 작으므로, 하나의 SA 분자만이 하나의 비오틴-BSA 분자와 입체 결합할 수 있는 것으로 보인다 (BSA가 다수의 접근가능한 비오틴을 갖는 경우에도). 또한, 모든 BSA 분자가 이용가능한 비오틴을 갖지는 않는다 (상기 포아송 분포의 논의 참조). 따라서, 결합 표면 상에 포획된 SA 분자의 총수는 지지체 표면과 커플링된 BSA 분자의 총수보다 더 적을 것이고, SA는 결합 표면 상에서 비-포화될 것이다 (단위 표면적당 최대량 미만의 SA 분자가 존재할 것이다) (실시예 11 참조).
지지체 표면을 비오티닐화된 합성 또는 생물학적 분자 (리간드::지지체 커플러 복합체)로 코팅한 후, 2개 이상의 비오틴-결합 도메인을 함유하는 포화량 미만의 합성 또는 생물학적 리간드 바인더 (비오틴 결합 모이어티)를 포획하거나 포획하고 배향시키기 위해 사용할 수 있다. 비오틴-결합 도메인이 각각의 비오틴 결합 모이어티의 반대편 또는 대략 반대편 단부 또는 측면에 위치하는 것을 가정하면, 그의 비오틴-결합 도메인의 적어도 하나는 고상 비오틴과 결합할 것인 한편, 반대편 또는 대략 반대편의 그의 남아있는 비오틴-결합 도메인은 비오티닐화된 포획 모이어티 (예를 들어, 비오티닐화된 항체 또는 항원)과 결합하도록 이용가능할 것이다.
상기 논의한 바와 같이, 비오티닐화된 마이크로입자는 비오틴 결합 모이어티의 첨가 전에 비오티닐화된 마이크로입자를 약 0.4% 내지 약 0.6% Pluronic(등록상표) F108 (트리-블록 공중합체) 내에 분산시킴으로써 또는 비오티닐화된 마이크로입자를 매우 높은 농도 또는 몰 과량의 비오틴 결합 모이어티를 함유하는 연속적으로 혼합된 용액 내로 느리게 적정함으로써 (예를 들어, 한 방울씩), 마이크로입자 응집 없이 2개 이상의 비오틴-결합 도메인을 함유하는 합성 또는 생물학적 리간드 바인더 (비오틴 결합 모이어티)로 코팅될 수 있다.
실제에서, Pluronic(등록상표) F108 분산된 마이크로입자를 약 0.1% 내지 약 1.0% (w/v %), 또는 별법으로 약 0.4% 내지 약 0.6% (w/v %)의 농도에서 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA로 코팅한다. 일단 비오티닐화된 마이크로입자를 처리하고 약 0.4% 내지 약 0.6% (w/v %) Pluronic(등록상표) F108 용액 내에 분산시킨 후, 낮은 수준 또는 양의 SA를 마이크로입자 응집체 또는 덩어리의 형성 없이 비오티닐화된 마이크로입자에 첨가할 수 있다. 상기 과정은 특이적 비오틴 결합 모이어티 (예를 들어 SA)의 코팅 후에 마이크로입자 단분산액을 생성시켰다. 상기 과정이 상기한 마이크로입자 적정 방법보다 훨씬 더 비용 효과적이고, 비오티닐화된 마이크로입자를 2개 이상의 비오틴-결합 도메인을 함유하는 합성 또는 생물학적 리간드 바인더 (비오틴 결합 모이어티)로 코팅하기 위해 매우 고효율성이고 재현가능한 방법이다.
따라서, 적어도 하나의 실시태양에서, 블록 공중합체는 비특이적 결합을 감소시키고 또한 마이크로입자의 단분산을 촉진하는 것을 돕기 위해 약 0.1% w/v 내지 약 1.0% w/v, 또는 약 0.4% 내지 약 0.6% (w/v %)의 농도로 사용될 수 있다.
비-포화되고 배향된 결합 표면을 생성시키는 한가지 목적은 친화도 분석을 위한 성분을 구성하기 위한 근거 또는 기반을 제공하기 위한 것이다. 본 발명에 따라 구성된 아래에 놓인 리간드::지지체 커플러 복합체는 비-포화되고 배향되므로, 상기 리간드::지지체 커플러 복합체 상에 쌓아올린 임의의 성분은 그의 비-포화 성질 및 배향을 반영할 것이다. 상기 구조의 예를 도 8에 도시한다.
도 8은 (1) 표면을 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA로 코팅하고; (2) 표면을 트리-블록 공중합체 Pluronic(등록상표) F108으로 차단시키고; (3) 2개 이상의 비오틴-결합 도메인을 함유하는 합성 또는 생물학적 비오틴 결합 모이어티 (예를 들어, SA)를 첨가하기 전에 마이크로입자를 Pluronic(등록상표) F108 내에 분산시키고; (4) SA를 표면에 첨가함으로써 제조된 비오틴-특이적 마이크로입자 결합 표면 상에 비오티닐화된 포획 모이어티를 코팅하는 것을 도시한 것이다. 생성되는 SA-코팅된 마이크로입자는 비-포화량의 임의의 목적하는 비오티닐화된 포획 모이어티를 배향시키고 포획하기 위해 사용될 수 있다.
도 8은 (A) 항체의 Fab 단편 (Ig Fc 구역의 부재는 비특이적 결합 문제를 감소하거나 완화할 수 있다); (B) 면역글로불린 (폴리클로날 및/또는 모노클로날 항체); 및 (C, D 및 E) 각각 작은, 중간 및/또는 큰 분자 (합성이든 생물학적이든)을 포함하는 비-포화량의 목적하는 특정 비오티닐화된 포획 모이어티를 배향시키고 포획하기 위해 SA-코팅된 마이크로입자가 사용되는 방식을 도시한 것이다. 임의의 목적하는 비오티닐화된 포획 모이어티는 예를 들어 분자와 비오틴 모이어티 사이에 스페이서를 포함할 수 있다.
스페이서는 비교적 작은 비오티닐화된 분자의 경우에 특히 유용할 수 있다. SA 분자 내의 비오틴-결합 도메인은 표면의 9 옹스트롬 아래에 묻히기 때문에, 비오티닐화된 소분자 (예를 들어, 분자량이 약 1,000 Da 미만인 것)는 입체 장애로 인해 보다 큰 면역분석 추적자 (tracer) (검출가능한 바인더)에 의해 검출가능하지 않을 수 있다. 보다 큰 결합능 및 보다 높은 검출 감도는 그들에 부착된 스페이서 아암 (arm)을 갖는 비오틴 유도체를 사용함으로써, 또는 소분자를 보다 큰 비오티닐화된 분자 (즉, 캐리어 분자)에 컨쥬게이팅함으로써 실현될 수 있다.
유용한 수준에서, 소분자를 중간 또는 큰 분자로부터 구분하기 위한 지침은 다음 방식으로 표현될 수 있다: 소분자는 일반적으로 분자량이 약 5,000 Da 미만의 것으로 간주되고; 중간 분자는 일반적으로 분자량이 약 5,000 이상 내지 약 150,000 Da의 것으로 간주되고; 큰 분자는 일반적으로 분자량이 약 150,000 Da를 초과하는 것으로 간주된다.
본 발명에 따른 결합 표면을 갖는 마이크로입자를 제조하는데 있어서 본 발명의 특정 측면을 도 9A 및 9B에 도시한다.
도 9A 및 9B는 본 발명에 따라 제조된 비오틴-결합 마이크로입자 (예를 들어, SA-코팅된 마이크로입자) 상의 포화량 미만의 비오티닐화된 항체 또는 비오티닐화된 Fab 단편의 배향 및 코팅을 도시한 것이다.
본 발명에 따라 제조된 SA-코팅된 PMP는 면역분석 감도를 개선할 (신호 대 노이즈 비를 개선할) 수 있고, 이는 비오틴-결합 고상이 포화량 미만의 비오티닐화된 포획 모이어티, 예를 들어, 분석물-특이적 비오티닐화된 항체 또는 Fab 단편을 배향시키고 포획하기 위해 사용될 수 있기 때문이다. 분석 감도는 각각의 SA-코팅된 마이크로입자의 지지체 표면적당 SA 분자의 총수의 감소가 감소된 비오티닐화된 포획 항체 결합능을 생성하지만, 개선된 입체 자유로 인해 개선된 비오티닐화된 포획 항체 결합 성능을 생성시키기 때문에 개선된다. 즉, 표면 상에 최대량 미만의 SA 분자를 제공하는 목적은 큰 비오티닐화된 포획 모이어티 (예를 들어, 비오티닐화된 항체)에 결합하도록 각각의 SA 분자의 입체 자유를 개선하고, 각각의 SA 분자의 결합 효율을 개선하기 위한 것이다.
도 9A는 통상적인 또는 표준 SA-코팅된 마이크로입자 표면을 도시한 것이고, 여기서 SA를 1차 아민 또는 다른 커플링 화학에 의해 마이크로입자 표면 상에 직접 코팅하고, BSA를 사용하여 표면을 차단한다. 상기 통상적인 또는 표준 표면 상에서, SA 분자는 표면 상에서 특이적으로 비-포화되거나 배향되지 않고; 즉, 부착은 무작위이다. 비오티닐화된 항체 또는 Fab 단편을 첨가하면 표면 상의 SA가 무작위로 배향되므로 우세하게 비-포화되거나 배향되지 않은 결합 표면을 생성시킨다. 항체 또는 Fab 군집은 입체 장벽 (낮은 접근가능성)을 생성시키고, 특히 항원이 큰 분자인 경우에 항원 포획 효율을 감소시킬 수 있다.
도 9B는 본 발명에 따라 제조된 SA-코팅된 마이크로입자 결합 표면을 도시한 것이다. 상기 결합 표면 상에서, SA 분자는 표면 상에 비-포화되고 (마이크로입자의 단위 결합 표면적당 총 SA 분자의 감소) 배향된다. 마이크로입자 지지체 표면은 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA로 공유 코팅되고, Pluronic(등록상표) F108로 차단된다. 이어서, 비오티닐화된 마이크로입자는 SA 첨가 전에 Pluronic(등록상표) F108 내에 분산된다. SA 부착은 특이적이고, 무작위가 아니다.
SA 분자가 또한 결합 표면 상에서 비-포화되고 배향되기 때문에, 본 발명에 따라 제조된 SA 마이크로입자 결합 표면에의 비오티닐화된 항체 또는 비오티닐화된 Fab 단편 부착은 비-포화되고 배향된다. 비오티닐화된 항체 또는 비오티닐화된 Fab 단편의 배향 및 포화 미만 성질은 특히 항원이 큰 분자이면 항원 (분석물) 포획 효율을 촉진한다 (신호가 증가된다). 또한, 마이크로입자의 표면은 Pluronic(등록상표) F108 차단제로 인해 친수성이고, 표면에 대한 비특이적 결합은 최소화되거나 제거된다 (노이즈가 감소된다).
본 발명의 다른 측면을 도 10에 도시하고, 이는 마이크로입자 단분산과 연관된 증가된 이용가능한 표면적을 보여준다.
도 10, 패널 A는 마이크로입자가 마이크로입자-대-마이크로입자 표면 상호작용으로 인해 응집 또는 접합하는 것을 보여준다. 상기 응집은 (1) 총 이용가능한 마이크로입자 표면적 (응집체 내부의 임의의 면적이 입체적으로 이용가능하지 (접근가능하지) 않기 때문에), 및 (2) 결합 표면 상의 비오틴 결합 모이어티 (예를 들어, SA)의 결합능 및 효율 (이는 분석 신호를 감소시킨다)을 모두 감소시킬 것이다.
도 10, 패널 B는 본 발명에 따른 마이크로입자가 증가된 결합 표면적을 갖는 것을 보여주고, 이는 결합 표면 상에서 비오틴 결합 모이어티 (예를 들어, SA)의 결합능을 개선시키고 결합 효율을 개선시켜 분석 신호를 증가시킨다. 단분산 마이크로입자는 응집된 마이크로입자 또는 마이크로입자 덩어리보다 더 많은 총 이용가능한 표면적을 갖고, 증가된 충돌 속도 및 감소된 분석 확산 거리로 인해 개선된 분석 운동학을 제공할 것이다.
본 발명에 따른 마이크로입자는 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA 결합 표면이 트리-블록 공중합체 Pluronic(등록상표) F108과 같은 블록 공중합체로 차단되고, 비오티닐화된 마이크로입자가 상기 논의된 바와 같이 SA 분자의 첨가 전에 Pluronic(등록상표) F108 내에 분산되도록 설계된다. 물론, Pluronic(등록상표) F108은 단지 상기 실시태양의 예시이다. 본 발명의 임의의 블록 공중합체가 상기 방식으로 사용될 수 있음이 이해된다.
본 발명에 따른 마이크로입자는 리간드로서 비오틴, 및 지지체 커플러로서 BSA 또는 오발부민을 사용하여 제조되었다. SA-코팅된 마이크로입자가 또한 제조되었고, 특이적 포획 모이어티를 갖는 마이크로입자도 제조되었다. 이들 연구의 결과를 아래 및 실시예에서 논의한다.
비오티닐화 반응에서 비오틴의 몰 투입비를 변화시키는 효과를 연구하였고, 실시예 1에 제시한다. 3.4:1 내지 30:1의 BSA에 대한 비오틴의 다양한 몰 투입비에서 BSA의 비오티닐화를 수행하였고, 비오티닐화 정도를 결정하고, 3일 동안 4℃ 및 37℃에서 안정성을 결정하였다 (표 1 참조). 안정성의 감소는 적어도 부분적으로 비오틴-BSA 컨쥬게이트로부터 비오틴 또는 비오틴 시약의 탈락 또는 해리를 반영한다 (도 11 참조). 결과는 비오틴의 높은 몰 투입비 (예를 들어, 8:1, 15:1, 및 30:1)에서 제조된 비오틴-BSA는 불량한 안정성을 보이지만, BSA에 대한 비오틴 시약의 몰 투입비가 30:1에서 4:1로 감소함에 따라 안정성은 4%에서 100%로 증가하는 것을 나타냈다. 따라서, 지지체 커플러에 대한 리간드의 비교적 낮은 투입비를 선택하고, 리간드::지지체 커플러 복합체를 고상에 회합시키면 리간드로서 비오틴을 갖는 통상적으로 제조된 결합 표면보다 더 안정한 결합 표면을 생성시킨다.
지지체 표면을 임의의 투입비에서 제조된 리간드::지지체 커플러 복합체 (및 특히 지지체 커플러에 대한 리간드의 높은 투입비에서 제조된 리간드::지지체 커플러 복합체)로 코팅함으로써 비-포화된 결합 표면을 제조하는 것은 그의 제조 후, 그러나 지지체 표면 상에 코팅되기 전에 리간드::지지체 커플러 복합체에 적합한 분산매를 첨가함으로써 용이하게 될 수 있다. 상기 방법에 적합한 분산매는 본원에서 논의된다. 비-포화된 표면을 제조하기 위해 BSA에 대한 비오틴의 낮은 투입비에서 제조된 비오틴-BSA에 대해 적합한 분산제를 사용하는 것에 대한 예시가 본원에 제공되지만, 분산제를 사용하는 방법은 비오티닐화된 코팅으로 제한되지 않는다.
예를 들어, 마이크로입자와 같은 고상 지지체의 응집을 방지하기 위해 적합한 분산제를 사용하여 비-포화된 결합 표면을 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 적어도 부분적으로 마이크로입자의 비교적 분산 (예를 들어, 대략 단분산) 제제가 바람직하다는 관찰에 기반한다.
방법은 마이크로입자의 응집이 일어날 수 있는 경우, 예를 들어, 리간드가 비오틴이고 비오틴이 SA로 코팅되는 경우에 사용될 수 있다. 분산 방법은 리간드 바인더가 적어도 2가인 경우에, 즉, 하나의 적어도 2가의 비오틴 결합 모이어티, 예를 들어 SA가 하나의 마이크로입자 상의 비오틴-BSA 분자의 비오틴을 다른 마이크로입자 상의 비오틴-BSA 분자의 비오틴과 가교결합시킬 수 있는 경우에 특히 유용하다. 리간드::지지체 커플러 복합체가 비오틴-BSA이고, 리간드 바인더 (비오틴 결합 모이어티)가 SA인 실시태양에 대한 분산 방법의 예시를 본원에서 아래 및 실시예 2에 제공한다. 그러나, 앞서 설명한 바와 같이, 방법은 비오틴/SA 결합 표면으로 제한되지 않는다.
예를 들어, 블록 공중합체와 같은 분산제가 비-포화된 결합 표면을 제조하는 방법에서 사용될 수 있다. 본원에 제공된 예시에서, 블록 공중합체는 2개 이상의 비오틴-결합 도메인을 포함하는 합성 또는 생물학적 비오틴 결합 모이어티 (리간드 바인더)의 첨가 전에 합성 또는 생물학적 리간드::지지체 커플러 복합체로 코팅된 마이크로입자에 대한 분산제로서 사용된다. 본원에 제공된 예시에서, 블록 공중합체 Pluronic(등록상표) F108이 사용되지만; 방법은 예시의 특정 블록 공중합체로 제한되지 않는다.
일반적으로, 도 7은 비오티닐화된 표면 (합성 또는 생물학적)을 2개 이상의 비오틴-결합 도메인을 함유하는 합성 또는 생물학적 비오틴 결합 모이어티 (리간드 바인더)로 코팅하는 것을 도시한 것이다. 보다 구체적으로, 도 7은 SA를 Pluronic(등록상표) F108로 차단되고 SA 첨가 전에 Pluronic(등록상표) F108 내에 분산된 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA 마이크로입자 결합 표면 상에 코팅하는 것을 도시한 것이다.
본원에 제공된 방법 및 조성물은 고상 지지체 표면에 대한 비-포화된 코팅을 제조하는데 사용될 수 있고, 여기서 코팅은 지지체 표면과 커플링된 리간드::지지체 커플러 복합체, 리간드::지지체 커플러 복합체의 리간드와 회합된 리간드 바인더 (비오틴 결합 모이어티), 및 리간드 바인더와 회합된 포획 모이어티 (예를 들어, 비오티닐화된 포획 모이어티)를 포함한다. 포획 모이어티는 임의의 목적하는 분자, 예를 들어 분석물의 포획을 용이하게 하도록 선택될 수 있다. 도면을 비오틴/SA 시스템에 관해 아래 및 도 8에 제공하지만, 본 발명은 비오틴/SA 시스템으로 제한되지 않는다.
비-포화된 결합 표면은 2개 이상의 비오틴-결합 도메인을 함유하는 포화량 미만의 합성 또는 생물학적 리간드 바인더 (비오틴 결합 모이어티)를 지지체 표면 상에 배향시키고 회합시킴으로써 설계될 수 있다. 표면은 포화량 미만의 SA를 마이크로입자, 예를 들어, PMP의 표면 상에 배향시키고 제공하는 예에 의해 예시될 수 있다. 도 8은 비오티닐화된 포획 모이어티를, (1) 표면을 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA로 코팅하고; (2) 표면을 트리-블록 공중합체 Pluronic(등록상표) F108로 차단시키고; (3) 마이크로입자를 Pluronic(등록상표) F108 내에 분산시키고 (2개 이상의 비오틴-결합 도메인을 함유하는 합성 또는 생물학적 비오틴 결합 모이어티를 첨가하기 전에); (4) 비오틴 결합 모이어티로서 SA를 첨가함으로써 제조된 비오틴-결합 마이크로입자 결합 표면 상에 코팅함으로써 제조된 비-포화되고 배향된 결합 표면을 도시한 것이다. 도 8에 도시된 바와 같이, SA-코팅된 마이크로입자는 포화량 미만의 비오티닐화된 포획 모이어티, 예를 들어: (A) 항체의 Fab 단편 (Ig Fc 구역의 부재는 비특이적 결합 문제를 감소 또는 완화할 수 있다); (B) 면역글로불린 (폴리클로날 및/또는 모노클로날 항체); 및 (C, D 및 E) 각각 작은, 중간 크기 및/또는 큰 분자 (이들이 합성이든 생물학적이든)를 배향시키고/시키거나 포획하기 위해 사용될 수 있다.
도 8은 비오틴/SA 시스템을 사용하는 비-포화된 결합 표면 상의 비오티닐화된 포획 모이어티를 도시한 것이다. 마이크로입자의 표면에 공유 부착된 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA를 트리-블록 공중합체 Pluronic(등록상표) F108로 차단시키고, SA를 첨가하기 전에 마이크로입자를 Pluronic(등록상표) F108 내에 분산시키고, SA를 첨가한 후, 목적하는 비오티닐화된 포획 모이어티를 비-포화된 SA-코팅된 표면에 노출시킨다. 도시된 비오티닐화된 포획 모이어티의 예는 (도 8에서 좌측에서 우측으로): 비오티닐화된 Fab 단편 (M.W. 약 30,000 Da), 비오티닐화된 항체 (IgG, M.W. 약 150,000 Da); 비오티닐화된 소분자, 또는 스페이서 아암을 갖는 비오티닐화된 소분자 (예를 들어, M.W. 약 5,000 Da 미만); 비오티닐화된 중간 분자, 또는 소분자에 대한 캐리어로서 비오티닐화된 중간 분자 (예를 들어, M.W. 약 5,000 Da 내지 약 150,000 Da); 및 비오티닐화된 큰 분자 (예를 들어, M.W. 약 150,000 Da 초과)를 포함한다. 도 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 고상 지지체의 표면에서 비오틴-BSA의 배향되고 비-포화된 성질은 비-포화된 SA-코팅된 표면에, 및 비-포화된 포획 모이어티 코팅에 또한 반영된다. Pluronic(등록상표) F108의 소수성 헤드기는 지지체 표면과 회합되는 것으로 도시되고, Pluronic(등록상표) F108의 친수성 테일기는 지지체 표면으로부터 멀리 연장하는 것으로 도시된다.
본 발명에 따른 비-포화된 결합 표면은 대개 상업적으로 입수가능한 결합 표면보다 더 낮은 결합능을 갖는다. 비오틴/SA 시스템을 사용하는 예가 제공된다 (표 2, 실시예 2 참조). 단위 표면적당 더 적은 SA 분자로 코팅된 지지체는 표면이 더 적은 비오틴-결합 부위를 가질 것이므로 고유하게 비오틴에 결합하는 능력이 감소될 것이다. 표면 상에 최대량보다 더 적은 SA 분자를 제공하는 목적은 큰 비오티닐화된 포획 모이어티 (예를 들어, 비오티닐화된 항체)에 결합하도록 각각의 SA 분자의 입체 자유를 개선하고, 각각의 SA 분자의 결합 효율을 개선하기 위한 것이다.
실시예 2는 결합 표면 상에 배향된 포화량 미만의 분자를 갖는 것은 결합능을 감소시키지만, 분석 신호를 증가시키고, 이는 친화도 분석을 위한 보다 우수하고 보다 효율적인 결합 표면을 생성시킴을 예시한다. 본 발명에 따른 마이크로입자는 유사한 상업적으로 입수가능한 통상적인 또는 표준 제품에 비해 감소된 결합능을 보이지만 (예를 들어, 표 2 참조), 향상된 분석 성능을 보인다 (예를 들어, 표 3 및 표 4 참조). 보다 낮은 배경 및 증가된 신호 반응으로 인한 증가된 신호 대 노이즈 비는 향상된 분석 성능을 반영한다. 종합적으로, 결과는 본 발명이 상업적으로 입수가능한 SA-코팅된 마이크로입자보다 더 낮은 결합능을 갖지만, 마이크로입자 표면 상의 스트렙타비딘 배향 및 입체 접근가능성, 및 신규한 결합 표면 차단으로 인한 향상된 분석 성능을 갖는 SA-코팅된 마이크로입자의 생산을 허용함을 지지한다.
실시예 3은 본 발명의 분산 단계에 따라 제조된 마이크로입자가 실질적으로 응집체 또는 덩어리가 없는 마이크로입자의 단분산 집단을 생성시킴을 보여준다.
실시예 4는 본 발명에 따른 마이크로입자가 SA-코팅된 마이크로입자의 특정한 실시태양에서 통상적인 또는 표준 마이크로입자와 반대로, SA의 비-포화된 성질 및 배향, 향상된 표면 차단, 및 개선된 결합 효율로 인해 보다 유리한 신호 대 노이즈 비 특징을 보이는 것을 제시한다.
실시예 5는 본 발명에 따른 마이크로입자를 사용하는 비특이적 결합의 감소를 보여준다. 본 발명에 따른 마이크로입자에서 비특이적 결합은 분석물이 고상 상의 코팅과의 회합에 대한 선호, 예를 들어 BSA에 대한 갑상선 호르몬, 예를 들어 T3 (트리요오도티로닌) 및 T4 (티록신)의 선호를 갖는 분석에서도 감소된다.
실시예 6은 밸리데이션 연구를 통해, 본 발명의 지지체 코팅 방법이 재현가능하고 신뢰가능함 (진단적 친화도 분석을 위한 바람직한 특징)을 입증한다.
실시예 7은 본 발명에 따른 마이크로입자가 SA-코팅된 마이크로입자의 특정 실시태양에 대해 다수의 밸리데이션 로트에서 향상된 안정성을 보임을 보여준다. 실시예 8은 본 발명의 마이크로입자에서 리간드의 탈락이 문제가 되지 않음을 입증하고, 실시예 9는 BSA 대신 오발부민을 사용하여 제조된 본 발명에 따른 결합 표면을 보여준다.
많은 논의와 많은 실시예에서 지지체 표면을 그에 복합체화된 리간드를 갖는 지지체 커플러 (여기서 지지체 커플러는 단백질을 포함함)로 코팅함으로써 비-포화된 표면을 제조하는 것을 설명하지만, 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면은 본 발명을 이용하여 다양한 방식으로 달성할 수 있다. 예를 들어, 지지체 커플러는 비-단백질, 예를 들어 중합체일 수 있다. 중합체는 리간드와 반응하고 복합체화되도록 관능화될 수 있거나, 중합체/리간드 쌍은 중합체 상에 자연적으로 존재하는 관능기가 특정한 조건 세트 하에 리간드의 관능기와 반응하도록 선택될 수 있다. 중합체 상의 반응성 또는 관능기의 수는 일부 반응기를 불활성화시켜, 중합체 분자당 더 적은 리간드가 부착되도록 함으로써 제어할 수 있다.
중합체/리간드 복합체는 또한 리간드가 없는 중합체로 희석될 수 있고, 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 결합 표면을 제조하기 위해 희석된 혼합물을 사용하여 지지체 표면을 코팅할 수 있다. 한가지 종류의 중합체, 또는 중합체의 혼합물을 사용할 수 있다.
따라서, 여러 실시태양에서, 본 발명은 중합체에 부착된 리간드를 포함하는, 친화도 분석을 위한 결합 표면을 포함하는 지지체를 포함하고, 여기서 리간드는 표면 상에서 비-포화되거나 비-포화되고 배향된다. 이어서, 리간드를 포함하는 지지체를 본원에 설명된 임의의 적합한 방법에 따라 처리할 수 있다. 여러 실시태양에서, 표면은 임의의 리간드가 부착되지 않은 중합체, 및 리간드가 부착된 중합체의 혼합물을 포함한다. 여러 실시태양에서, 지지체는 마이크로입자이고, 결합 표면은 블록 공중합체로 차단되고, 분석은 면역분석이고, 리간드는 자체가 포획 모이어티, 예를 들어 변형된 또는 비변형된 면역글로불린 또는 그의 단편과 결합할 수 있는 적어도 2가 리간드 바인더에 결합한다.
특정 실시태양에서, 리간드는 지지체 커플러를 사용하지 않고 지지체 표면 상에 직접 커플링될 수 있다. 이들 실시태양에서, 리간드와 반응할 수 있는 관능기를 갖는 지지체 표면을 리간드가 지지체에 부착하기에 충분한 조건 하에 리간드에 노출시킨다. 여러 실시태양에서, 부착은 활성화된 리간드와 또한 활성화될 수 있는 지지체 표면 사이의 공유 결합이다. 리간드의 비-포화는 지지체 표면에 부착하는 리간드의 수를 제어함으로써 달성할 수 있다. 여러 실시태양에서, 지지체 표면은 주어진 조건 세트 하에 리간드와 반응할 수 있는 복수의 관능기를 포함한다. 지지체 표면은 반응 조건을 조작함으로써 또는 지지체 표면 상의 관능기의 수를 감소시키는 물질을 첨가함으로써 리간드와 반응할 수 있는 관능기의 수를 감소시키는 방식으로 처리될 수 있다. 이어서, 리간드를 포함하는 지지체 표면을 본원에 설명된 임의의 적합한 방법에 따라 처리할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 리간드로 코팅된 지지체 표면을 제공하고, 여기서 리간드는 지지체 표면의 표면 상에서 비-포화된다. 여러 실시태양에서, 결합 표면은 블록 공중합체로 차단되고, 분석은 면역분석이고, 리간드는 자체가 포획 모이어티, 예를 들어 변형된 또는 비변형된 면역글로불린 또는 그의 단편과 결합할 수 있는 적어도 2가 리간드 바인더에 결합한다. 여러 실시태양에서, 지지체 표면 상의 리간드의 밀도는 지지체 커플러에 부착된 리간드를 설명하는 실시태양에 대해 본원에서 설명된 범위 내에 있다. 임의의 적합한 리간드가 지지체 표면, 예를 들어, 면역글로불린 또는 그의 단편, 올리고뉴클레오티드, 및 렉틴에 직접 부착하도록 사용될 수 있다. 다른 실시태양에서와 같이, 리간드는 링커를 포함할 수 있고, 링커는 지지체 표면에 부착될 수 있다.
본 발명은 포화량 미만의 리간드, 예를 들어 SA를 마이크로입자 (예를 들어, PMP)의 표면 상에 배향시키고 회합시키는 방법을 제공한다. 상업적으로 입수가능한 비오틴-결합 표면 (예를 들어, Dynal(등록상표) DYNABEADS™ MyOne 스트렙타비딘 T1, 및 DYNABEADS M-280 스트렙타비딘)은 최대 비오틴 결합능을 갖도록 설계된다. 상업적으로 입수가능한 비오틴-결합 표면은 대개 마이크로입자 표면 상에 SA 또는 다른 비오틴-결합 분자의 직접 코팅에 의해 생산된다. 이와 반대로, 본 발명은 마이크로입자를 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA로 코팅하고, 비오틴-BSA 마이크로입자를 Pluronic(등록상표) F108로 차단하고, 차단된 비오틴-BSA 마이크로입자를 Pluronic(등록상표) F108 내에 분산시키고, 마지막으로 비오틴-BSA 마이크로입자를 SA로 코팅하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 마이크로입자는 비-포화 및 배향, 향상된 표면 차단, 및 개선된 결합 효율로 인해 보다 유리한 신호 대 노이즈 비 특징을 나타낸다. 이는 실시예에 나타낸 바와 같이 SA로 코팅된 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA 마이크로입자에 대해 입증된다.
본 발명의 방법 및 조성물은 비-포화된 또는 비-포화되고 배향된 표면이 유리하게 사용될 수 있는 당업계에 공지된 임의의 적합한 분석, 예를 들어 당업계에 공지된 임의의 적합한 친화도 분석 또는 면역분석과 연관하여 사용될 수 있고, 이는 단백질-단백질 친화도 분석, 단백질-리간드 친화도 분석, 핵산 친화도 분석, 간접적 형광 항체 분석 (IFA), 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA), 방사성 면역분석 (RIA), 및 효소 면역분석 (EIA), 직접 또는 간접 분석, 경쟁 분석, 샌드위치 분석 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 적합한 분석 포맷은 본원에서 실시예에서 사용된 분석 및 포맷을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 방법 및 조성물은 당업계에 공지된 임의의 지지체, 예를 들어 적합한 고체 지지체와 연관하여 사용될 수 있다. 상기 고상 지지체의 예가 논의되지만, 본 발명은 명백하게 논의된 지지체로 제한되지 않는다. 예를 들어, 고상 지지체는 입자형 지지체, 마이크로입자, 폴리스티렌 마이크로입자, 미세적정 플레이트, 코팅된 튜브 등으로 제한되지 않는다. 친화도 분석과 연관하여 사용되는 당업계에 공지된 임의의 지지체를 포함하고 이로 제한되지 않는 다른 고상 지지체가 또한 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 마일라 (mylar)-이면 니트로셀룰로스, 및/또는 나일론을 포함하는 고상 지지체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 필터 또는 막을 포함하는 고상 지지체가 사용될 수 있다. 미세관, 나노입자, 또는 나노튜브를 포함하는 고상 지지체, 예를 들어, 탄소 나노튜브가 사용될 수 있다. 고상 지지체는 임의의 크기의 마이크로입자를 포함할 수 있고, 큰 평면 표면적을 갖는 고상 지지체가 사용될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물은 개선된 신호 대 노이즈 비가 요망되는 임의의 분석과 연관하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 비-포화되고 적합한 블록 공중합체, 예를 들어, Pluronic(등록상표)로 처리된 본 발명에 따른 결합 표면은 측방 유동 분석 및/또는 확산 분석에서 사용하기 위한 평면 또는 실질적으로 평면 고상 지지체 상에 제조될 수 있다. 측방 유동 분석의 한 예는 샘플이 결합 표면 상에 놓이고 (고정되거나 고정되지 않은), 액체상의 하나 이상의 분석 시약이 샘플 위로 통과되고 (확산 분석에서, 표면 위로 확산에 의해), 액체상의 시약과 접촉될 때 적합한 신호에 의해 분석물이 검출되고/되거나 정량되는 것이다. 측방 유동 분석의 다른 예는 하나 이상의 분석 시약이 결합 표면 상에 놓이고 (고정되거나 고정되지 않은), 액체상의 샘플이 하나 이상의 분석 시약 위로 통과되고 (확산 분석에서, 표면 위로 확산에 의해), 결합 표면 상에서 하나 이상의 분석 시약과 접촉될 때 적합한 신호에 의해 샘플 내의 분석물이 검출되고/되거나 정량되는 것이다. 측방 유동 분석의 다른 예는 본 발명에 따른 비-포화된 결합 표면을 포함하는 딥스틱 (dipstick)이다. 측방 유동 및/또는 확산 분석은 평면 지지체의 하나의 결합 표면을 가로질러 이동하는 액체에 제한되지 않고; 상기 분석은 막 또는 필터를 통하여 이동하는 액체를 포함하고, 여기서 막 또는 필터는 비-포화된 결합 표면을 포함한다. 따라서, 여러 실시태양에서, 본원에 설명된 임의의 실시태양에 따른 측방 유동 분석 및/또는 확산 분석을 위한 결합 표면, 및 측방 유동 분석 및/또는 확산 분석을 위한 결합 표면을 제조하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 면역분석에서 본원의 임의의 방법 및 조성물의 사용을 제공한다. 여러 실시태양에서, 면역분석에서 지지체 상에 배치된 복수의 지지체 커플러 및 지지체 커플러와 커플링된 리간드 (여기서, 리간드는 비-포화되고, 입체적으로 접근가능한 리간드를 제공하는 방식으로 표면 상에 배향된다)를 포함하는 비-포화된 결합 표면을 갖는 지지체의 사용을 제공한다. 특정 실시태양에서, 비오티닐화된 단백질 (리간드::지지체 커플러 복합체), 비오티닐화된 단백질의 비오틴 모이어티와 회합된 아비딘, SA, 뉴트라비딘, SA의 단편, 아비딘의 단편, 뉴트라비딘의 단편, 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된 적어도 2가 비오틴 결합 모이어티, 및 적어도 2가 비오틴 결합 모이어티 (리간드 바인더)와 회합된 비오티닐화된 면역글로불린 또는 그의 단편 (비오티닐화된 포획 모이어티)를 포함하는 결합 표면을 갖는 마이크로입자는 샘플 내의 목적하는 분석물, 예를 들어 항원에 대한 면역분석에서 사용된다. 다른 실시태양에서, 비오티닐화된 단백질의 비오틴 모이어티와 회합되는 적어도 2가 비오틴 결합 모이어티는 비오티닐화된 항원 또는 그의 단편 (비오티닐화된 포획 모이어티)과 회합되고, 마이크로입자는 샘플 내의 목적하는 분석물, 예를 들어 항체에 대한 면역분석에서 사용된다. 면역분석에서 사용되는 조성물 및 조성물을 제조하는 방법의 특징은 본원에 설명된 임의의 특징 (예를 들어, 표면의 성분의 밀도를 열거하는 특정한 실시태양 포함)을 포함한다.
본 발명의 방법, 조성물 및 키트는 임의의 적합한 면역분석 시스템과 함께 사용하기 위해 적용될 수 있다. 적합한 면역분석 시스템의 예는 Access(등록상표) 면역분석 시스템, Access(등록상표) 2 면역분석 시스템, Synchron LXi(등록상표) 725 임상 시스템, UniCel(등록상표) Dxl 800 Access(등록상표) 면역분석 시스템, IMMAGE(등록상표) 면역화학 시스템 (모두 베크만 컬터, 인크. (Beckman Coulter, Inc.)) 및 Triage(등록상표) 시스템 (바이오사이트, 인크. (Biosite, Inc.))을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 하나의 적합한 면역분석 어레이 시스템은 A2(등록상표) 면역분석 시스템 (베크만 컬터, 인크.)이다.
친화도 분석이 설계되는 특정 용도에 따라, 분석물 바인더 (포획 모이어티) 및 분석물로 구성되는 결합쌍의 한 멤버 또는 별법으로 다른 멤버로서 기능할 수 있는 물질의 비제한적인 목록을 아래에 항목별로 제시한다. 상기 물질은 예를 들어, 포획 모이어티 (분석물 바인더)로서 사용될 수 있거나, 본 발명에서 사용할 수 있는 포획 모이어티를 생성하기 위해 (예를 들어, 특이적인 항체를 생성시키기 위한 합텐/항원으로서 이들을 사용함으로써) 사용될 수 있다. 면역분석을 포함한 친화도 분석은 샘플 내의 분석물인 경우에 상기 물질의 존재 및/또는 수준을 검출하기 위해 본 발명에 따라 설계될 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 분석물-결합 포획 모이어티는 다음 방식으로 샘플 내의 분석물로서 이들 물질을 검출하기 위해 사용될 수 있다: 포획 모이어티는 비오티닐화되고, 본 발명에 따른 SA-코팅된 고상 지지체 표면과 (예를 들어, 그 위에 SA를 갖는 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA 코팅과) 회합되고, 상기 물질을 포획하기 위해 사용될 수 있다. 별법으로, 아래 나열된 물질은 비오티닐화되고 본 발명에 따른 SA-코팅된 고상 지지체 표면과 회합되고, 그와 상호작용하는 분자 (예를 들어, 나열된 물질에 특이적인 항체 또는 그의 단편, 결합 단백질, 또는 효소)를 포획하기 위해 사용될 수 있다.
분석물 바인더 (포획 모이어티) 및 분석물로 구성되는 결합쌍의 한 멤버 또는 별법으로 다른 멤버로서 기능할 수 있는 물질의 비제한적인 목록은 다음을 포함한다: 유도가능한 산화질소 합성효소 (iNOS), CA19-9, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-t, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, sIL-2R, sIL-4R, sIL-6R, SIV 코어 항원, IL-1RA, TNF-α, IFN-감마, GM-CSF; PSA (전립선-특이적 항원)의 이소형, 예를 들어 PSA, pPSA, BPSA, inPSA, 비-α1-항키모트립신-복합체화된 PSA, α1-항키모트립신-복합체화된 PSA, 전립선 칼리크레인, 예를 들어 hK2, hK4, 및 hK15, ek-rhK2, Ala-rhK2, TWT-rhK2, Xa-rhK2, HWT-rhK2, 및 다른 칼리크레인; HIV-1 p24; 페리틴, L 페리틴, 트로포닌 I, BNP, 렙틴, 디곡신, 미오글로빈, B-형 나트륨 이뇨 펩티드 또는 뇌 나트륨 이뇨 펩티드 (BNP), 심방 나트륨 이뇨 펩티드 (ANP); 인간 성장 호르몬, 뼈 알칼린 포스파타제, 인간 난포 자극 호르몬, 인간 황체 형성 호르몬, 프로락틴; 인간 융모막성 고나도트로핀 (예를 들어, CGα, CGβ); 갑상선 글로불린; 항-갑상선 글로불린; IgE, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 비. 안트라시스 (B. anthracis) 보호 항원, 비. 안트라시스 치사 인자, 비. 안트라시스 포자 항원, 에프. 툴라렌시스 (F. tularensis) LPS, 에스. 아우레아스 (S. aureas) 장독소 B, 와이. 페스티스 (Y. pestis) 피막 F1 항원, 인슐린, 알파 태아단백질 (예를 들어, AFP 300), 암배아 항원 (CEA), CA 15.3 항원, CA 19.9 항원, CA 125 항원, HAV Ab, HAV Igm, HBc Ab, HBc Igm, HIV1/2, HBsAg, HBsAb, HCV Ab, 항-p53, 히스타민; 네오프테린; s-VCAM-1, 세로토닌, sFas, sFas 리간드, sGM-CSFR, s1CAM-1, 티미딘 키나제, IgE, EPO, 내인성 인자 Ab, 합토글로빈, 항-카르디올리핀, 항-dsDNA, 항-Ro, Ro, 항-La, 항-SM, SM, 항-nRNP, 항히스톤, 항-ScI-70, ScI-70, 항-핵 항체, 항-동원체 항체, SS-A, SS-B, Sm, U1-RNP, Jo-1, CK, CK-MB, CRP, 허혈 변형된 알부민, HDL, LDL, oxLDL, VLDL, 트로포닌 T, 트로포닌 I, 마이크로알부민, 아밀라제, ALP, ALT, AST, GGT, IgA, IgG, 전알부민, 항-스트렙토리신, 클라미디아, CMV IgG, 톡소 (toxo) IgG, 톡소 IgM, 아포지단백질 A, 아포지단백질 B, C3, C4, 프로페르딘 인자 B, 알부민, α1-산 당단백질, α1-항트립신, α1-마이크로글로불린, α2-마크로글로불린, 항-스트렙토리신 O, 항트롬빈-III, 아포지단백질 A1, 아포지단백질 B, β2-마이크로글로불린, 세룰로플라스민, 보체 C3, 보체 C4, C-반응성 단백질, DNase B, 페리틴, 유리 카파 경쇄, 유리 람다 경쇄, 합토글로빈, 면역글로불린 A, 면역글로불린 A (CSF), 면역글로불린 E, 면역글로불린 G, 면역글로불린 G (CSF), 면역글로불린 G (소변), 면역글로불린 G 서브클래스, 면역글로불린 M, 면역글로불린 M (CSF), 카파 경쇄, 람다 경쇄, 지단백질 (a), 마이크로알부민, 전알부민, 프로페르딘 인자 B, 류마티스 유사인자, 페리틴, 트랜스페린, 트랜스페린 (소변), 풍진 IgG, 갑상선 글로불린 항체, 톡소플라즈마 IgM, 톡소플라즈마 IgG, IGF-I, IGF-결합 단백질 (IGFBP)-3, 헵신, pim-1 키나제, E-카드헤레인, EZH2, 및 a-메틸아실-CoA 라세마제, TGF-베타, IL6SR, GAD, IA-2, CD-64, 호중구 CD-64, CD-20, CD-33, CD-52, 시토크롬 P450의 이소형, s-VCAM-1, sFas, sICAM, B형 간염 표면 항원, 트롬보플라스틴, HIV p24, HIV gp41/120, HCV C22, HCV C33, 헤모글로빈 A1c, 및 GAD65, IA2.
친화도 분석이 설계되는 특정 용도에 따라, 분석물 바인더 (포획 모이어티) 및 분석물로 구성되는 결합쌍의 한 멤버 또는 별법으로 다른 멤버로서 기능할 수 있고 본 발명에서 사용될 수 있는 적합한 물질은 WHO International Laboratories for Biological Standards에 의해 개최 및 특성화되고/되거나 배포된 임의의 WHO International Biological Reference Preparations (당업계에 잘 공지된 물질을 나열하고 있는 http:/www.who.int/bloodproducts/re_materials (2005년 6월 30일 업데이트됨)에서 이용가능하고, 그 목록은 본원에 참고로 포함됨)에 특이적인 모이어티, 예를 들어 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
적합한 국제 참조 표준물질 (물질 다음의 괄호 내의 WHO 코드로 확인됨)의 부분적인 목록은 다음을 포함한다: 인간 재조합 트롬보플라스틴 (rTF/95), 토끼 트롬보플라스틴 (RBT/90), 갑상선-자극 항체 (90/672), 재조합 인간 조직 플라스미노겐 활성제 (98/714), 고분자량 유로키나제 (87/594), 전립선 특이적 항원 (96/668), 전립선 특이적 항원 90:10 (96/700); 인간 혈장 당백질 C (86/622), 인간 혈장 당백질 S (93/590), 류마티스성 관절염 혈청 (W1066), 혈청 아밀로이드 A 단백질 (92/680), 스트렙토키나제 (00/464), 인간 트롬빈 (01/580), 소 혼합 (combined) 트롬보플라스틴 (OBT/79), 항-D 양성 대조 정맥내 면역글로불린 (02/228), 소도 세포 항체 (97/550), 지단백질 a (IFCC SRM 2B), 인간 파르보바이러스 B19 DNA (99/800), 인간 플라스민 (97/536), 인간 플라스미노겐-활성제 억제제 1 (92/654), 혈소판 인자 4 (83/505), 프리칼리크레인 활성제 (82/530), 인간 뇌 CJD 조절 및 인간 뇌 산발성 CJD 제제 1 및 인간 뇌 산발성 CJD 제제 2 및 인간 뇌 변종 CJD (없음; 각각 [WHO TRS ECBS Report No. 926, 53rd Report]에 언급됨, 뇌 균질액), 인간 혈청 보체 성분 C1q, C4, C5, 인자 B, 및 완전한 기능성 보체 CH50 (W1032), 인간 혈청 면역글로불린 E (75/502), 인간 혈청 면역글로불린 G, A, 및 M (67/86), 인간 혈청 단백질 알부민, 알파-1-항트립신, 알파-2-마크로글로불린, 세룰로플라스민, 보체 C3, 트랜스페린 (W1031), 항-D 음성 조절 정맥내 면역글로불린 (02/226), A형 간염 RNA (00/560), B형 간염 표면 항원 아형 adw2 유전자형 A (03/262 및 00/588), B형 간염 바이러스 DNA (97/746), C형 간염 바이러스 RNA (96/798), HIV-1 p24 항원 (90/636), HIV-1 RNA (97/656), HIV-1 RNA 유전자형 (10 101/466의 세트), 인간 피브리노겐 농축물 (98/614), 인간 혈장 피브리노겐 (98/612), 유도된 (raised) A2 헤모글로빈 (89/666), 유도된 F 헤모글로빈 (85/616), 헤모글로빈시아나이드 (98/708), 저분자량 헤파린 (85/600 및 90/686), 비분별화 헤파린 (97/578), 혈액 응고 인자 VIII 및 폰 빌레브란트 (von Willebrand) 인자 (02/150), 인간 혈액 응고 인자 VIII 농축물 (99/678), 인간 혈액 응고 인자 XIII 혈장 (02/206), 인간 혈액 응고 인자 II, VII, IX, X (99/826), 인간 혈액 응고 인자 II 및 X 농축물 (98/590), 인간 암배아 항원 (73/601), 인간 C-반응성 단백질 (85/506), 재조합 인간 페리틴 (94/572), 아포지단백질 B (SP3-07), 베타-2-마이크로글로불린 (B2M), 인간 베타-트롬보글로불린 (83/501), 인간 혈액 응고 인자 IX 농축물 (96/854), 인간 혈액 응고 인자 IXa 농축물 (97/562), 인간 혈액 응고 인자 V 레이덴 (Leiden), 인간 gDNA 샘플 FV 야생형, FVL 동종접합체, FVL 이종접합체 (03/254, 03/260, 03/248), 인간 혈액 응고 인자 VII 농축물 (97/592), 인간 혈액 응고 인자 VIIa 농축물 (89/688), 인간 항-매독 혈청 (HS), 인간 항-파상풍 면역글로불린 (TE-3), 인간 항트롬빈 농축물 (96/520), 인간 혈장 항트롬빈 (93/768), 인간 항-갑상선 글로불린 혈청 (65/93), 항-톡소플라즈마 혈청 (TOXM), 인간 항-톡소플라즈마 혈청 (IgG) (01/600), 인간 항-대상포진 면역글로불린 (W1044), 아포지단백질 A-1 (SP1-01), 인간 항-인터페론 베타 혈청 (G038-501-572), 인간 항-홍역 혈청 (66/202), 항-핵 리보뉴클레오단백질 혈청 (W1063), 항-핵-인자 (균일한) 혈청 (66/233), 항-파르보바이러스 B19 (IgG) 혈청 (91/602), 항-폴리오바이러스 혈청 타입 1, 2, 3 (66/202), 인간 항-광견병 면역글로불린 (RAI), 인간 항-풍진 면역글로불린 (RUBI-1-94), 항-평활근 혈청 (W1062), 인간 항-이중가닥 DNA 혈청 (Wo/80), 인간 항-E 전혈-혈액형 판정 혈청 (W1005), 인간 항-조충 혈청 (ECHS), 인간 항-A형 간염 면역글로불린 (97/646), 인간 항-B형 간염 면역글로불린 (W1042), 인간 항-E형 간염 혈청 (95/584), 항-인간 혈소판 항원-1a (93/710), 항-인간 혈소판 항원-5b (99/666), 인간 항-인터페론 알파 혈청 (B037-501-572), 인간 알파태아단백질 (AFP), 안크로드 (74/581), 인간 항-A형 혈액형 판정 혈청 (W1001), 인간 항-B형 혈액형 판정 혈청 (W1002), 인간 항-C형 전혈 혈액형 판정 혈청 (W1004), 항-D (항-RhO)형 전혈 혈액형 판정 시약 (99/836), 인간 항-D (항-RhO)형 불완전 혈액형 판정 혈청 (W1006), 및 인간 항-D 면역글로불린 (01/572).
친화도 분석이 설계되는 특정 용도에 따라, 분석물 바인더 (포획 모이어티) 및 분석물로 구성되는 결합쌍의 한 멤버 또는 별법으로 다른 멤버로서 기능할 수 있는 적합한 물질의 다른 예는 화합물을 인식할 수 있는 항체를 생성시키기 위한 합텐으로서 사용될 수 있는 화합물을 포함하고, 다음 화합물의 임의의 염, 에스테르, 또는 에테르를 포함하고, 이로 제한되지 않는다: 프로게스테론, 에스트로겐, 및 테스토스테론, 프로게스틴, 코르티코스테로이드, 및 데히드로에피안드로스테론을 포함하고 이로 제한되지 않는 호르몬, 및 임의의 비-단백질/비-폴리펩티드 항원 (WHO에 의해 국제 참조 표준물질로 나열됨). 물질 다음의 괄호 내의 WHO 코드로 확인된, 상기 적합한 국제 참조 표준물질의 부분적인 목록은 비타민 B12 (WHO 81.563), 폴레이트 (WHO 95/528), 호모시스테인, 트랜스코발라민, T4/T3, 및 본원에 참고로 포함된 International Biological Reference Preparations의 WHO 카탈로그 (WHO 웹사이트, 예를 들어 http://www.who.int/bloodproducts/ref_materials/ (2005년 6월 30일 업데이트됨)에서 이용가능함)에 개시된 다른 물질을 포함한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 하나 이상의 상기한 WHO 참조 표준물질 또는 참조 표준물질을 함유하는 혼합물을 포함할 수 있다.
적어도 하나의 실시태양에서, 본 발명은 2 이상의 상이한 포획 모이어티를 갖는 결합 표면을 제공한다.
친화도 분석이 설계되는 특정 용도에 따라, 분석물 바인더 (포획 모이어티) 및 분석물로 구성되는 결합쌍의 한 멤버 또는 별법으로 다른 멤버로서 기능할 수 있는 물질의 다른 예는 오용 약물을 포함한다. 오용 약물은 예를 들어 하기 약물 목록 및 그의 대사산물 (예를 들어, 혈액, 소변, 및 다른 생물학적 물질에 존재하는 대사산물), 및 그의 임의의 염, 에스테르, 또는 에테르를 포함한다: 헤로인, 모르핀, 히드로모르폰, 코데인, 옥시코돈, 히드로코돈, 펜타닐, 데메롤, 메타돈, 다르본, 스타돌, 탈윈, 파레고릭, 부프레넥스; 자극제, 예를 들어, 암페타민, 메탐페타민; 메틸암페타민, 에틸암페타민, 메틸페니데이트, 에페드린, 슈도에페드린, 에페드라, 마황, 메틸렌디옥시암페타민 (MDS), 펜테르민, 페닐프로판올아민; 아미페나졸, 베미그라이드, 벤즈페타민, 브로마탄, 클로르펜테르민, 크로프로파미드, 크로테타미드, 디에틸프로피온, 디메틸암페타민, 독사프람, 에타미반, 펜캄파민, 메클로페녹세이트, 메틸페니데이트, 니케타미드, 페몰린, 펜테트라졸, 펜디메트라진, 펜메트라진, 펜테르민, 페닐프로판올아민, 피크로톡신, 피프라돌, 프롤린탄, 스트리크닌, 시네프린, 펜시클리딘 및 유사체, 예를 들어 엔젤분 (angel dust), PCP, 케타민; 억제제, 예를 들어, 바르비투레이트, 글루테티마이드, 메타쿠알론, 및 메프로바메이트, 메토헥시탈, 티아밀, 티오펜탈, 아모바르비탈, 펜토바르비탈, 세코바르비탈, 부탈비탈, 부타바르비탈, 탈부탈 및 아프로바르비탈, 페노바르비탈, 메포바르비탈; 벤조디아자펜, 예를 들어, 에스타졸람, 플루라제팜, 테마제팜, 트리아졸람, 미다졸람, 알프라졸람, 클로르디아제폭시드, 클로라제페이트, 디아제팜, 할라제팜, 로라제팜, 옥사제팜, 프라제팜, 쿠아제팜, 클로나제팜, 플루니트라제팜; GBH 약물, 예를 들어 감마 히드록실 부티르산 및 감마 부티로락톤; 글루테티미드, 메타쿠알론, 메프로바메이트, 카리소프로돌, 졸피뎀, 잘레플론; 칸나비노이드 약물, 예를 들어 테트라히드라칸나비놀 및 및 유사체; 코카인, 3-4 메틸렌디옥시메탐페타민 (MDMA); 환각제, 예를 들어, 메스칼린 및 LSD.
친화도 분석이 설계되는 특정 용도에 따라, 분석물 바인더 (포획 모이어티) 및 분석물로 구성되는 결합쌍의 한 멤버 또는 별법으로 다른 멤버로서 기능할 수 있는 물질의 다른 예는 암시장에서 통상 거래되거나 또는 운동능력 향상 보조물 (ergogenic aid)로서 사용되는 것을 포함하는 스테로이드 및 능력 향상과 관련된 다른 약물, 예를 들어, 다음 화합물 및 그의 임의의 염, 에스테르, 또는 에테르를 포함한다: 테스토스테론 (모이어티를 갖는 그의 에스테르, 예를 들어, 에난테이트, 시피오네이트, 및 프로피오네이트 포함), 디히드로테스토스테론 (DHT), 테트라히드로게스트리논, 난드롤론, 노르테스토스테론, 메테놀론, 스타노졸롤, 메탄드로스테놀론, 메탄디에논, 안드로스텐디온 (예를 들어, 5a-안드로스탄-3,17-디온), 안드로스텐디올, 예를 들어 1-안드로스텐디올 (3β,17β-디히드록시-5α-안드로스트-1-엔;), 4-안드로스텐디올 (3b,17b-디히드록시-안드로스트-4-엔), 5-안드로스텐디올 (3b,17b-디히드록시-안드로스트-5-엔), 안드로스텐디온, 예를 들어 1-안드로스텐디온 ([5a]-안드로스트-1-엔-3,17-디온), 4-안드로스텐디온 (안드로스트-4-엔-3,17-디온), 5-안드로스텐디온 (안드로스트-5-엔-3,17-디온), 노르안드로스텐디온, 19-노르안드로스텐디올, 19-노르안드로스텐디온, 노르안드로스텐디올, 데히드로에피안드로스테론 (DHEA), 볼데논, 플루옥시메스테론, 메탄드리올, 메틸테스토스테론, 옥산드롤론, 옥시메톨론, 트렌볼론, 클로스테볼, 데히드로클로로메틸테스토스테론, 드로모스타놀론, 에피트렌볼론, 게스트리논, 메스테롤론, 메탄디에논, 메테놀론, 노르에탄드롤론, 옥산드롤론, 옥시메톨론, 테트라히드로게스트리논 (THG), 트렌볼론, 클렌부토롤, 및 2004년도의 Anabolic Steroid Control Act (본원에 참고로 포함됨)에 포함된 스테로이드, 예를 들어 3b,17b-디히드록시-5a-안드로스탄; 3a,17b-디히드록시-5a-안드로스탄; 안드로스탄디온, 볼라스테론 (7a,17a-디메틸-17b-히드록시안드로스트-4-엔-3-온), 볼데논 (17b-히드록시안드로스트-1,4-디엔-3-온), 칼루스테론 (7b,17a-디메틸-17b-히드록시안드로스트-4-엔-3-온), 클로스테볼 (4-클로로-17b-히드록시안드로스트-4-엔-3-온), 데히드로클로르메틸테스토스테론 (4-클로로-17b-히드록시-17a-메틸-안드로스트-1,4-디엔-3-온), 4-디히드로테스토스테론 (17b-히드록시-안드로스탄-3-온), 드로스타놀론 (17b-히드록시-2a-메틸-5a-안드로스탄-3-온), 에틸에스트레놀 (17a-에틸-17b-히드록시에스트르-4-엔), 플루옥시메스테론 (9-플루오로-17a-메틸-11b,17b-디히드록시안드로스트-4-엔-3-온), 포르메볼론 (2-포르밀-17a-메틸-11a,17b-디히드록시안드로스트-1,4-디엔-3-온), 푸라자볼 (17a-메틸-17b-히드록시안드로스타노[2,3-c]-푸라잔), 18a-호모-17b-히드록시에스트르-4-엔-3-온 (13b-에틸-17b-히드록시곤-4-엔-3-온), 4-히드록시테스토스테론 (4,17b-디히드록시-안드로스트-4-엔-3-온), 4-히드록시-19-노르테스토스테론 (4,17b-디히드록시-에스트르-4-엔-3-온), 에스타놀론 (17a-메틸-17b-히드록시-5a-안드로스탄-3-온), 메스테롤론 (1a-메틸-17b-히드록시-[5a]-안드로스탄-3-온), 메탄디에논 (17a-메틸-17b-히드록시안드로스트-1,4-디엔-3-온), 메탄드리올 (17a-메틸-3b,17b-디히드록시안드로스트-5-엔), 메테놀론 (1-메틸-17b-히드록시-5a-안드로스트-1-엔-3-온), 에틸테스토스테론 (17a-메틸-17b-히드록시안드로스트-4-엔-3-온), 미볼레론 (7a,17a-디메틸-17b-히드록시에스트르-4-엔-3-온), 난드롤론 (17b-히드록시에스트르-4-엔-3-온), 노르안드로스텐디올, 19-노르-4-안드로스텐디올 (3b,17b-디히드록시에스트르-4-엔), 19-노르-4-안드로스텐디올 (3a,17b-디히드록시에스트르-4-엔), 19-노르-5-안드로스텐디올 (3b,17b-디히드록시에스트르-5-엔), 19-노르-5-안드로스텐디올 (3a,17b-디히드록시에스트르-5-엔), 노르안드로스텐디온, 19-노르-4-안드로스텐디온 (에스트르-4-엔-3,17-디온), 19-노르-5-안드로스텐디온 (에스트르-5-엔-3,17-디온), 노르볼레톤 (18a-호모-17b-히드록시프레그나-4-엔-3-온), 노르클로스테볼 (4-클로로-17b-히드록시에스트르-4-엔-3-온), 노르에탄드롤론 (17a-에틸-17b-히드록시에스트르-4-엔-3-온), 옥산드롤론 (17a-메틸-17b-히드록시-2-옥사-[5a]-안드로스탄-3-온), 옥시메스테론 (17a-메틸-4,17b-디히드록시안드로스트-4-엔-3-온), 옥시메톨론 (17a-메틸-2-히드록시메틸렌-17b-히드록시-[5a]-안드로스탄-3-온), 스타노졸롤 (17a-메틸-17b-히드록시-[5a]-안드로스트-2-에노[3,2-c]-피라졸), 스텐볼론 (17b-히드록시-2-메틸-[5a]-안드로스트-1-엔-3-온), 테스토락톤 (13-히드록시-3-옥소-13,17-세코안드로스타-1,4-디엔-17-오산 락톤), 1-테스토스테론 (17b-히드록시-5a-안드로스트-1-엔-3-온), 테스토스테론 (17b-히드록시안드로스트-4-엔-3-온), 테트라히드로게스트리논 (13b,17a-디에틸-17b-히드록시곤-4,9,11-트리엔-3-온), 트렌볼론 (17b-히드록시에스트르-4,9,11-트리엔-3-온).
친화도 분석이 설계되는 특정 용도에 따라, 분석물 바인더 (포획 모이어티) 및 분석물로 구성되는 결합쌍의 한 멤버 또는 별법으로 다른 멤버로서 기능할 수 있는 물질의 다른 예는 그의 검출이 임상 실무에서 유용하고, 생물학적 제제에서 그의 검출이 예를 들어 면역분석을 사용하여 달성할 수 있는, 동물 (인간 포함)에게 투여되는 항생제 및 다른 약물을 포함한다. 상기 약물의 예는 항생제, 예를 들어 WHO International Biological Reference Preparations (WHO 웹사이트, 예를 들어 본원에 참고로 포함된 http://www.who.int/bloodproducts/ref_materials/Ant-SeptO5.pdf (2005년 9월 21일 업데이트됨)에서 이용가능함)에 나열된 것을 포함한다. 그 예는 겐타미신 (92/670), 스트렙토마이신 (76/539), 토브라마이신 (82/510), 및 반코마이신 (50/020)을 포함한다.
적어도 하나의 실시태양에서, 본 발명은 적어도 2 이상의 상이한 포획 모이어티를 갖는 결합 표면을 제공한다.
본원에 설명된 여러 실시태양의 임의의 특징은 개시된 임의의 다른 실시태양과 연관하여 설명된 특징과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물과 연관하여 개시된 특징은 본원에 설명된 임의의 방법 등에 사용될 수 있다. 다양한 또는 특정한 실시태양과 연관하여 설명되는 특징은 명시적으로 언급되거나 문맥으로부터 암시되지 않는 한, 본원에 개시된 다른 실시태양과 연관하여 적합하지 않은 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 발명의 특정 실시태양은 첨부하는 도면 및 실시예에서 예시되고, 이것은 단지 본 발명의 특정 실시태양을 예시하기 위해 제공되는 것으로서, 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
소 혈청 알부민의 낮은 투입비 비오티닐화
BSA를 BSA에 대한 비오틴의 다양한 몰 투입비 (표 1 참조)에서 술포-NHS-LC-비오틴 (술포숙신이미딜-6-[비오틴아미도]헥사노에이트; 피어스 바이오테크놀로지 인크. (Pierce Biotechnology Inc.)/써모 사이언티픽 (Thermo Scientific))으로 비오티닐화시켰다. 간단히 설명하면, 술포-NHS-LC-비오틴 (556.59 g/mol)을 30 밀리그램/밀리리터 (mg/mL)의 농도로 DMF (디메틸포름아미드)에 용해시키고, 동결건조된 BSA (소 혈청 알부민, 프로테아제 부재; 혈청 제품 회사인 셀리언스 코퍼레이션 (Celliance Corporation); 66,000 g/mol)를 0.05 M 보레이트 버퍼 (pH 8.2)에 15 내지 20 mg/mL의 농도로 용해시켰다. BSA에 대한 술포-NHS-LC-비오틴의 최종 몰 투입비가 3.4 대 30 (몰 술포-NHS-LC-비오틴:몰 BSA)이 되도록 술포-NHS-LC-비오틴 용액을 BSA 용액에 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 4℃에서 인큐베이팅한 후, 0.05M 보레이트 버퍼 (pH 8.2)로 즉시 투석하여 (즉, 투석여과 또는 투석) 과잉의 술포-NHS-LC-비오틴 (즉, 비오틴 시약, 및 가수분해된 비오틴 시약, 유리 비오틴)을 제거하였다. 상기 일반적인 절차는 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA의 제조 전반에 걸쳐 사용되었다.
비오티닐화 정도는 비오틴을 정량하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 추정될 수 있다. 하나의 적합한 방법은 비오틴에 대해 선택적인 4'-히드록시아조벤젠-2-카르복실산 (HABA)을 사용하는 HABA 비색 분석이다. 결합된 비오틴의 몰/BSA의 몰은 HABA 분석에 의해 추정하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
비오티닐화된 BSA의 17개의 독립적인 비오티닐화 로트의 안정성 분석은 25 mg/mL 토실활성화된 PMP (Dynal(등록상표) DYNABEADS MyOne 토실활성화된, 1.0 미크론 직경, 인비트로겐 코퍼레이션)를 0.1 M 보레이트 버퍼 (pH 9.0 - 9.5) 중의 비오틴-BSA로 18-24시간 동안 37-42℃에서 코팅하고 (0.030-0.050 밀리그램 비오틴-BSA/mg PMP), 마이크로입자를 TBS (0.02M Tris, 0.15 M 염화나트륨) (pH 7.4)로 3회 세척하고, 비오틴-BSA 코팅된 마이크로입자 표면을 TBS (pH 7.4) 중의 0.4% - 0.6% (w/v) 트리-블록 공중합체 Pluronic(등록상표) F108 (Pluronic(등록상표) F-108 NF Prill; 바스프)로 4-4.5시간 동안 37-42℃에서 차단하고, 마이크로입자를 TBS (pH 7.4)로 3회 세척하고, 비오틴-BSA 마이크로입자를 TBS (pH 7.4) 중의 0.4% - 0.6% (w/v) Pluronic(등록상표) F108에 분산시키고, 비오틴-BSA 마이크로입자를 TBS (pH 7.4) 중의 SA (동결된, 동결건조되지 않은 SA21 SA-plus, 프로자임, 인크. (Prozyme, Inc.))로 30-50분 동안 실온에서 코팅하고 (0.025-0.050 밀리그램 SA/mg 비오틴-BSA PMP), 마이크로입자를 나트륨 아지드 (0.1% w/v)가 존재하는 TBS (pH 7.4)로 3회 세척하고, 마이크로입자를 Access(등록상표) Free T4 분석-특이적 마이크로입자 버퍼로 3회 세척하고, Access(등록상표) Free T4 분석-특이적 마이크로입자 버퍼를 사용하여 마이크로입자를 25 mg/mL로부터 0.35 mg/mL로 희석하고, 비오틴-BSA-코팅된, SA-코팅된 마이크로입자를 4℃ 또는 37℃에서 3일 동안 인큐베이팅하고, Access(등록상표) Free T4 분석 (베크만 컬터, 인크.)으로 비오틴-BSA-코팅된, SA-코팅된 마이크로입자가 비오티닐화된 Free T4-특이적 항체 항체에 결합하는 능력을 시험함으로써 수행하였다. 안정성은 개개의 Free T4 교정 물질 (교정 물질 RLU 반응) RLU (상대 광 단위, 신호, 또는 반응) 회복의 평균을 계산함으로써 결정하였다. Access(등록상표) Free T4 분석은 항원 수준이 0 ng/mL 내지 6 ng/mL (표 4 참조)인 6개의 상이한 교정 물질 (S0, S1, S2, S3, S4, 및 S5)을 이용한다. 회복은 37℃ 교정 물질 RLU 반응을 4℃ 교정 물질 RLU 반응으로 나누고, 그 결과에 100%를 곱하여 계산하였다. 안정성은 6개의 모든 교정 물질에 대한 회복을 평균하여 계산하였다. 그 결과를 표 1에 제시하였다.
안정성은 고상을 4℃ 또는 37℃에서 3일 동안 인큐베이팅한 후에 SA 결합능 변화를 표시하였다. 안정성의 감소는 비오틴-BSA 컨쥬게이트로부터 수동적으로 결합된 비오틴 또는 비오틴 시약의 탈락 또는 해리 (도 11 참조; 파선: 37℃; 실선: 4℃), 및 시간이 흐르면서 SA에 의한 유리 비오틴 또는 비오틴 시약의 후속적인 포획에 의한 것이다. 결과는 높은 몰 투입비 (즉, 8:1, 15:1, 30:1)에서 제조된 비오틴-BSA가 매우 불량한 안정성을 보임을 나타내었다. BSA에 대한 비오틴 시약의 몰 투입비가 30:1에서 4:1로 감소됨에 따라, 안정성은 4%에서 100%로 개선된다.
Figure 112009026310173-pct00001
BSA를 30 몰 술포-NHS-LC-비오틴/몰 BSA의 몰 투입비에서 비오티닐화하였다. 25 mg/mL 토실활성화된 PMP를 0.1 M 보레이트 버퍼 (pH 9.0 - 9.5) 중의 비오틴-BSA로 18-24시간 동안 37-42℃에서 코팅하고 (0.030-0.050 밀리그램 비오틴-BSA/mg PMP), 마이크로입자를 TBS (pH 7.4)로 3회 세척하고, 비오틴-BSA 코팅된 마이크로입자 표면을 TBS (pH 7.4) 중의 0.4% 내지 0.6% (w/v) Pluronic(등록상표) F108로 4-4.5시간 동안 37-42℃에서 차단하고, 마이크로입자를 TBS (pH 7.4)로 3회 세척하고, 비오틴-BSA 마이크로입자를 TBS (pH 7.4) 중의 0.4% - 0.6% (w/v) Pluronic(등록상표) F108에 분산시키고, 비오틴-BSA 마이크로입자를 TBS (pH 7.4) 중의 SA로 30-50분 동안 실온에서 코팅하고 (0.025-0.050 밀리그램 SA/mg PMP), 마이크로입자를 TBS (pH 7.4)로 3회 세척하여 30:1 비오티닐화된 BSA를 Dynal(등록상표) MyOne 토실활성화된 PMP에 부착시켰다. 25 mg/mL 비오틴-BSA-코팅된, SA-코팅된 PMP를 4℃에서 또는 37℃에서 3일 동안 유지시키고, 10분 동안 자석 위에 두어 PMP를 분리하였다 (4℃ 또는 37℃ 버퍼로부터 마이크로입자를 제거하였다). 4℃ 및 37℃ 마이크로입자 미함유 상등액을 수거하고, 상등액을 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SEC-HPLC; Beckman Coulter System Gold HPLC System, 32 KARAT™ 5.0 소프트웨어, Phenomenex 300 x 7.80 mm BioSep-SEC-S 3000 컬럼, PBS pH 7.2 이동상, 1.0 mL/min 유속, 0.050 mL 샘플 부피, 17분 실행 시간, 200 내지 400 nm 광다이오드 어레이 검출)로 분석하였다.
37℃ 상등액의 210 nm에서의 SEC-HPLC 분석은 4℃ 상등액에 비해 10.8분 체류 시간 (RT) 및 12.4분 RT 모두에서 유의하게 더 높은 수준의 저분자량 분석물을 보여주었다. 이들 피크는 30:1 (비오틴 시약: BSA) 투입비에서 비오티닐화 과정 동안 BSA 분자에 수동적으로 흡수된 비오틴 및/또는 비오틴 시약인 것으로 생각되었고, 투석 또는 탈염에 의해 제거되지 않았다. 이 결과는 또한 상등액에 검출가능한 (방법의 검출 한계 미만) BSA 또는 SA가 존재하지 않고 (RT: 7.8 내지 8.2분), 비오틴-BSA 컨쥬게이트 및/또는 SA가 고상으로부터 탈락되지 않음을 나타낸다.
SEC-HPLC 결과는 30 비오틴 시약:1 BSA 샘플이 4℃에서 비해 37℃ 안정성의 가장 유의한 감소를 보였고 (안정성의 95.9%, 즉 4.1% 안정성), 또한 4℃ 상등액에 비해 37℃ 상등액에서 상당량의 저분자량 분석물(들)의 존재를 나타내었다는 점에서 안정성 결과 (표 1 참조)를 지지한다. 안정성의 감소는 비오틴-BSA 컨쥬게이트로부터 수동적으로 결합된 비오틴 또는 비오틴 시약의 탈락 또는 해리, 및 및 시간이 흐르면서 SA에 의한 유리 비오틴 또는 비오틴 시약의 후속적인 포획에 의한 것이다.
비오틴-BSA 코팅 공정은 4 mol의 술포-NHS-LC-비오틴/1 mol의 BSA를 사용하여 BSA를 비오티닐화시키고, 30, 40, 50, 또는 60 마이크로그램의 비오틴-BSA/1 mg의 마이크로입자 (Dynal(등록상표) DYNABEADS MyOne 토실활성화된, 1.0 미크론 직경, 인비트로겐 코퍼레이션)를 제공하고, 비오틴-BSA를 마이크로입자와 함께 0.1 M 보레이트 (pH 9.5) 중에서 2, 4, 또는 18시간 동안 37℃에서 또는 40℃에서 인큐베이팅하고, 마이크로입자를 TBS (pH 7.4)로 3회 세척하고, 마이크로입자를 0.4% (w/v) Pluronic(등록상표) F108 (pH 7.4)를 함유하는 TBS로 37℃에서 4시간 동안 차단하고, 마이크로입자를 TBS (pH 7.4)로 3회 세척하고, 비오틴-BSA 마이크로입자를 0.4% (w/v) Pluronic(등록상표) F108을 함유하는 TBS에 분산시키고, 35 마이크로그램의 SA/mg 마이크로입자를 첨가하여 SA를 커플링시키고, 실온에서 30분 동안 인큐베이팅하고, 비오틴-BSA-코팅된, SA-코팅된 마이크로입자를 TBS (pH 7.4)로 3회 세척함으로써 최적화되었다.
분석 성능 시험 (Access(등록상표) Free T4 및 Access(등록상표) AccuTnI 분석; 베크만 컬터, 인크.), 및 비오티닐화된 IgG 결합능 시험 결과는 1 mg의 마이크로입자당 30 내지 50 ㎍의 비오틴-BSA가 25 mg/mL의 마이크로입자 농도로 0.1 M 보레이트 버퍼 (pH 9.5)에 첨가되어 18 내지 24시간 동안 37℃ 내지 42℃에서 인큐베이팅될 때 비오틴-BSA 코팅 공정이 고효율성임을 나타내었다. 간단히 설명하면, 125I-표지된 비오티닐화 IgG 방법은 사용하여 결합능을 평가하고, 이것은 표준 요오드화 절차 (항체 및 비오티닐화된 항체를 각각 Na125I 및 클로라민 T 삼수화물과 함께 실온에서 인큐베이팅하고, 각각의 반응을 나트륨-메타-비술파이트로 정지시키고, 125I 표지된 비-비오티닐화된 항체 및 125I 표지된 비오티닐화된 항체를 각각 0.5% BSA/PBS/0.1% 나트륨 아지드로 예비조건화된 SEPHADEX G-50 컬럼을 사용하여 정제한다)를 사용하여 비오티닐화된 IgG 및 비-비오티닐화된 IgG를 125I로 표지하고, 총 CPM (카운트/분)/비오티닐화된 및 비-비오티닐화된 125I-IgG의 mg을 감마 계수기를 사용하여 계산하고, SA-코팅된 마이크로입자에 몰 과량의 125I-비오틴-IgG (비오틴-결합 도메인을 통한 활성 흡수) 또는 125I-IgG (수동적인 흡수 또는 비-특이적 결합)를 첨가하고, 마이크로입자를 버퍼로 5회 세척하고, 세척된 마이크로입자를 감마 계수기에 넣어 총 CPM을 결정하고, 125I-비오틴-IgG SA 마이크로입자의 CPM으로부터 125I-IgG 코팅된 SA 마이크로입자 (비-특이적 결합 대조군)의 CPM을 차감하여 특이적으로 포획된 비오틴-IgG의 양을 결정함으로써 수행되었다.
실시예 2
비-포화는 결합능을 감소시키지만 분석 신호를 증가시킨다.
비오틴/SA 시스템을 사용한 비-포화되고 배향된 결합 표면은 PMP를 사용하여 BSA에 대한 비오틴의 낮은 몰 투입비 (4:1)에서 제조된 비오틴-BSA로 제조하였다. 간단히 설명하면, 비-포화되고 배향된 결합 표면을 갖는 마이크로입자의 배치는 Dynal(등록상표) AKT-100 토실활성화된 PMP를 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA로 코팅하고, 비오틴-BSA 마이크로입자를 Pluronic(등록상표) F108로 차단하고, 차단된 비오틴-BSA 마이크로입자를 Pluronic(등록상표) F108 중에 분산시키고, 마지막으로 비오틴-BSA 마이크로입자를 SA로 코팅하여 제조하였다. 표 2의 "BCI 샘플"을 참고한다. 비교를 위해, 상업적으로 입수가능한 비오틴-결합 마이크로입자 (Dynal(등록상표) DYNABEADS MyOne 스트렙타비딘 T1, 인비트로겐 코퍼레이션)를 시험하였다. 표 2의 "Dynal(등록상표) 대조군"을 참고한다. 비-포화된 표면 및 상업적으로 입수가능한 비오틴-결합 표면은 동일한 가공하지 않은 마이크로입자 (인비트로겐 코퍼레이션의 Dynal(등록상표) MyOne 토실활성화된 1.0 미크론 PMP)를 사용하여 각각 제조하였다.
비-포화된 및 상업적으로 입수가능한 비오틴-결합 (즉, SA-코팅된) 표면을 14C-비오틴 결합능 시험 (인비트로겐 코퍼레이션)을 사용하여 그의 비오틴 결합능에 대해 시험하였다. 그 결과를 표 2에 제시하였다. 교정 물질 수준은 나노그램/mL로 나타내었다. 상업적으로 입수가능한 마이크로입자의 비오틴 결합능은 1,400 pmol 비오틴/mg이었고, 본 발명에 따라 제조된 비-포화된 결합 표면을 갖는 마이크로입자의 비오틴 결합능은 214 pmol 비오틴/mg에 불과하였다. 따라서, 상업적으로 입수가능한 비오틴-결합 마이크로입자는 본 발명에 따라 제조된 동일 직경 마이크로입자보다 6배 이상 더 큰 비오틴 결합능을 보였다.
또한, 마이크로입자를 비오티닐화된 IgG에 결합하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 상업적으로 입수가능한 마이크로입자는 20.0 마이크로그램의 비오티닐화된 IgG/마이크로입자의 mg의 비오티닐화된 IgG 결합능을 보였고, 본 발명에 따른 마이크로입자는 6.7 마이크로그램의 비오티닐화된 IgG/마이크로입자의 mg의 결합능을 보였다. 따라서, 상업적으로 입수가능한 비오틴-결합 마이크로입자는 본 발명에 따른 마이크로입자보다 약 3배 더 큰 비오티닐화된 IgG 결합능을 보였다. 그러나, 상업적으로 입수가능한 마이크로입자의 비오틴 결합능은 본 발명에 따른 마이크로입자보다 6배 이상 더 컸다.
Figure 112009026310173-pct00002
상업적으로 입수가능한 비오틴-결합 마이크로입자의 기능 성능을 단백질, 즉 트로포닌 I에 대한 분석에서 본 발명에 따라 제조된 비-포화된 마이크로입자의 성능과 비교하였다. 간단히 설명하면, 재조합 SA로 코팅된 상업적으로 입수가능한 1 미크론 직경 비오틴-결합 마이크로입자 (Dynal(등록상표) DYNABEADS MyOne 스트렙타비딘 T1, 인비트로겐 코퍼레이션), 및 본 발명에 따른 SA로 코팅된 비-포화된 1 미크론 직경 마이크로입자는, SA-코팅된 마이크로입자를 비오티닐화된 항-트로포닌 I로 처리하고, 트로포닌 I 교정 물질 (베크만 컬터, 인크.)에 대한 분석 반응을 측정함으로써 샌드위치 분석인 Access(등록상표) AccuTnI Assay (베크만 컬터, 인크.)를 사용하는 트로포닌 I에 대한 분석에 사용하였다. 그 결과를 표 3에 제시하였다.
Figure 112009026310173-pct00003
표 3은 일정 범위의 교정 물질 수준 (S1 내지 S5)에 걸쳐서 본 발명에 따른 비-포화된 마이크로입자가 상업적으로 입수가능한 마이크로입자보다 더 높은 RLU 판독치를 보이고, 상업적으로 입수가능한 마이크로입자보다 더 낮은 배경 RLU 판독치 (S0)를 나타냄을 보여준다. 이 결과는 본 발명에 따른 비-포화된 마이크로입자가 상업적으로 입수가능한 비오틴-결합 마이크로입자보다 더 낮은 비오틴 결합능을 보이기 때문에 (표 2 참조) 놀랍고 예기치 않은 것이다. 교정 물질 반응은 거의 전체 범위에 걸쳐 비-포화된 마이크로입자에 대해 더 높았다. S0의 % CV 교정 물질 반응 (CV = 변동 계수)로서 측정된 분석 정밀도는 비-포화된 마이크로입자에 대해서 2배 이상 더 컸다. 그러나, 비-포화된 마이크로입자는 상업적으로 입수가능한 마이크로입자에 비해 유의하게 더 낮은 SO RLU 반응을 보였고 (8,116 대 13,023), 반복 측정시의 RLU의 작은 차이는 RLU 신호가 감소함에 따라 보다 큰 % CV를 생성시킬 수 있다. % CV 교정 물질 용량으로서 표현된 분석 부정확도는 평균적으로 비-포화된 마이크로입자에 대해 더 낮았다. 동적 범위에 있어서, S1/S0 및 S5/S0의 비는 비-포화된 마이크로입자에서 약 2배 더 컸다. 따라서, 본 발명에 따른 마이크로입자가 보다 적은 비오틴 (따라서, 보다 덜 비오티닐화된 IgG)에 결합하지만, 예기치 않게 상업적으로 입수가능한 마이크로입자에 비해 기능적 친화도 분석에서 보다 우수한 효율을 보이고, 감소된 노이즈 또는 비-특이적 결합을 나타내었다.
상업적으로 입수가능한 2.8 미크론 직경 SA-코팅된 마이크로입자 (Dynal(등록상표) DYNABEADS M-280 스트렙타비딘, 비오틴-결합능: 650 내지 900 피코몰의 비오틴/mg, 인비트로겐 코퍼레이션)의 성능을 Access(등록상표) Free T4 분석 (베크만 컬터, 인크.)에서 본 발명에 따라 제조된 1.0 미크론 SA-코팅된 마이크로입자의 성능 (비오틴-결합능: 약 214 피코몰의 비오틴/mg; 표 2 참조)과 비교하였다. Free T4는, SA-코팅된 마이크로입자 ("Dynal(등록상표) Method"을 위한 상업적으로 입수가능한 SA-코팅된 2.8 미크론 직경 PMP; "BCI Method"을 위한 본 발명에 따라 제조된 1.0 미크론 직경 SA-코팅된 PMP)를 본 발명에 따른 비오티닐화된 항-T4로 처리하고, T4 교정 물질 (베크만 컬터, 인크.)에 대한 분석 반응을 측정함으로써 경쟁 분석인 Access(등록상표) Free T4 분석에 의해 분석하였다. 분석은 Access(등록상표) 2 Immunoassay System (베크만 컬터, 인크.)으로 수행하였고, 이 시스템으로 얻은 RLU의 결과를 표 4에 제시한다.
Figure 112009026310173-pct00004
표 4에 제시된 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 1.0 미크론 SA-코팅된 마이크로입자는 분석물 (Free T4)에 대해 상업적으로 입수가능한 2.8 미크론 직경 SA-코팅된 마이크로입자와 대략 동일한 신호를 제시하였다. 이 결과는 본 발명에 따른 비-포화된 마이크로입자가 상업적으로 입수가능한 항비오틴 마이크로입자 (Dynal(등록상표) DYNABEADS M-280 스트렙타비딘, 비오틴-결합능: 650 내지 900 피코몰의 비오틴/mg, 인비트로겐 코퍼레이션)보다 더 낮은 비오틴 결합능을 보이기 때문에 놀랍고 예기치 못한 것이다. 상기 표 (표 2, 3 및 4 참조)에 제시된 바와 같이 본 발명에 따른 마이크로입자를 제조하면 결합 표면의 비-포화를 야기하여, 리간드 (비오틴)의 수가 감소한다. 본 발명에 따른 마이크로입자는 덜 결합하지만 (상업적으로 입수가능한 DYNABEADS M-280 마이크로입자의 650 내지 900 피코몰/mg, 및 DYNABEADS MyOne SA T1 마이크로입자의 1,000 피코몰/mg 초과에 비해 본 발명에 따른 마이크로입자의 214 피코몰/mg), 보다 우수한 기능을 보인다 (표 3 및 표 4 참조). 본 발명에 따른 1.0 미크론 마이크로입자는 2.8 미크론 마이크로입자보다 약간 덜 결합하지만, 본 발명의 마이크로입자가 더 많은 신호를 생성시킨다.
종합적으로, 상기 결과는 본 발명에 따른 비-포화된 마이크로입자가 상업적으로 입수가능한 마이크로입자보다 더 낮은 결합능을 갖지만, 상업적으로 입수가능한 마이크로입자만큼 우수하거나 그보다 더 우수한 분석 신호를 생성시킴을 입증한다. 이것은 상업적으로 입수가능한 마이크로입자보다 유의하게 더 낮은 결합능을 갖는 본 발명의 결합 표면에 대해서도 적용된다.
실시예 3
분산 단계를 사용한 비- 포화된 표면의 제조
BSA에 대한 비오티닐화 시약의 낮은 몰 투입비 (4:1)를 사용하여 제조한 비오틴-BSA를 비-포화된 결합 표면을 제조하기 위한 분산 방법에 사용하였다. 간단히 설명하면, 비오틴-BSA (상기 설명한 바와 같이 제조됨)를 상기 설명한 바와 같이 Dynal(등록상표) 마이크로입자에 공유부착시켜 비오틴의 수/단위 지지체 표면적에 대해 비-포화된 표면을 생성시켰다. 이어서, 코팅된 마이크로입자를 SA 첨가 전의 분산 단계에 사용하였다.
초기 연구는 (1) SA의 첨가 전에, (2) 비오틴-BSA 코팅된 마이크로입자의 10 mg/mL의 용액을 SA의 연속 혼합 용액 (0, 125, 250, 375, 500, 750, 또는 1000 마이크로그램 SA/mL)에 한 방울씩 첨가한 후, 및 (3) 상이한 양의 18 mg/mL SA 용액 (25, 50, 75, 100, 150 또는 200 마이크로그램 SA/mg 마이크로입자)을 10 mg/mL 비오틴-BSA 코팅된 마이크로입자의 연속 혼합 용액에 첨가한 후에, 비오틴-BSA 코팅된 마이크로입자 (상기 설명한 바와 같이 제조됨)의 응집 상태를 평가하기 위해 혈구계 (현미경 분석)를 사용하였다. 혈구계 결과를 단량체 (단일 마이크로입자), 이량체 (2개의 마이크로입자 응집체), 삼량체 (3개의 마이크로입자 응집체), 작은 응집체 (4 내지 10개의 마이크로입자 응집체), 및 큰 응집체 (10개 초과의 마이크로입자 응집체)로서 보고하였다. 응집체는 SA 가교결합을 통한 2개 이상의 비오틴-BSA 마이크로입자의 회합으로서 정의된다 (즉, SA는 4개의 서브유닛을 갖는 다가이고, 각각의 서브유닛은 하나의 비오틴-결합 도메인을 갖는다). 혈구계 결과는 비오틴-BSA 마이크로입자가 SA의 첨가 전에는 단분산 상태이었고 (단량체 및 이량체만 존재), 비오틴-BSA 마이크로입자가 750 마이크로그램의 SA/밀리리터 이하의 SA 용액 내로 적정될 때 (한 방울씩) 대부분 응집되었고 (큰 응집체), 비오틴-BSA 마이크로입자가 1000 마이크로그램 SA/밀리리터의 SA 용액 내로 적정될 때 (한 방울씩) 단분산 상태이었고 (삼량체, 이량체, 및 단량체), SA가 시험된 모든 농도에서 비오틴-BSA 마이크로입자에 첨가될 때 고도로 응집되었음 (큰 응집체)을 보여주었다. 본원에서 사용될 때, 용어 "실질적으로 단분산"은 실질적으로 단량체 및 이량체로서만 존재하는 마이크로입자의 집단을 의미한다.
비오틴-BSA 코팅된 마이크로입자를 SA의 혼합 용액에 한 방울씩 첨가하거나, 또는 비오틴-BSA 마이크로입자의 혼합 용액에 SA 용액을 첨가하여 제조한 비오틴-BSA-코팅된, SA-코팅된 마이크로입자는 혼합하면서 SA-코팅된 마이크로입자에 초음파 처리 에너지 (2 x 300 W, 60초)를 인가함으로써 일시적인 단분산 상태 (이량체 및 단량체가 존재하지만, 대부분 삼량체임)로 유도할 수 있지만, 마이크로입자는 시간이 경과함에 따라 단분산을 유지하지 못하고, 다시 고도로 응집되었다. 초음파 처리 에너지는 비오틴-BSA-코팅된, SA-코팅된 마이크로입자의 영구적인 단분산을 유도하지 않았고, 비오틴-BSA 마이크로입자가 SA 가교결합에 의해 응집하는 경향을 완화시킬 수 없었다.
혈구계 연구는 소수성 마이크로입자 단분산액 (1.03 미크론 폴리스티렌 PMP, Cat. No. M1-070/40, 이엠디 바이오사이언시스, 인크. (EMD Biosciences, Inc.))에 필요한 Pluronic(등록상표) F108의 양 (물 중 0 μM 내지 1000 μM Pluronic(등록상표) F108의 17 희석 수준)을 결정하기 위해 수행하였다. 이들 연구의 결과는 M1-070/40 마이크로입자가 27.04 ㎍ Pluronic(등록상표) F108/mg 마이크로입자 (희석 수준 6) 내지 2027.7 ㎍ Pluronic(등록상표) F108/mg 마이크로입자 (희석 수준 15)의 Pluronic(등록상표) F108 농도에서 실질적으로 단분산 상태임 (즉, 단량체 및 이량체만 존재)을 보여주었다. 마이크로입자는 27.04 ㎍ Pluronic(등록상표) F108/mg 마이크로입자 미만의 Pluronic(등록상표) F108 농도 및 2027.7 ㎍ Pluronic(등록상표) F108/mg 마이크로입자 초과의 농도 (트리-블록 공중합체의 다층 적층에 의해 발생할 가능성이 가장 큼)에서 응집되었다. 표면적 계산은 계면 표면적이 20 nm2/Pluronic(등록상표) F108 분자이고 마이크로입자 표면적이 38.38 cm2/mg (1.03 ㎛, 평탄한 표면의 완전히 둥근 구를 기준으로)인 것으로 가정하여 Pluronic(등록상표) F108의 이론적 단층이 적어도 4.1 ㎍ Pluronic(등록상표) F108/mg 마이크로입자를 필요로 함을 예측하였다. M1-070/40 마이크로입자는 그 크기 또는 평탄한 표면이 균일하지 않고 (불균일 크기 분포), 직경 1.03 미크론 미만의 미세 입자 (Beckman Coulter LS13 320 레이저 회절 입자 크기 측정기 (sizer)를 사용한 마이크로입자 크기 분석을 기초로 함)의 큰 집단을 함유함을 유의해야 한다. 마이크로입자 미세 입자와 거친 마이크로입자 표면 모두가, M1-070/40 마이크로입자가 상기 계산된 것보다 더 큰 표면적/mg을 갖는다는 것을 나타낼 것이다. 혈구계 결과는 마이크로입자 단분산을 위해 27 ㎍ 초과의 Pluronic(등록상표) F108/mg 마이크로입자를 필요로 하기 때문에 상기 가정을 지지한다. 상기 연구의 결과는 Pluronic(등록상표) F108이 27.04 내지 2027.7 ㎍ Pluronic(등록상표) F108/mg 마이크로입자 (희석 수준 6 내지 15)의 농도에서 마이크로입자 단분산액을 생성시킬 수 있음을 나타내었다.
비오틴-BSA로 코팅된 마이크로입자 (Dynal(등록상표) DYNABEADS MyOne 토실활성화된, 1.0 미크론 직경, 인비트로겐 코퍼레이션)의 구체적인 로트의 표면적은 74 내지 84 cm2/mg (분석 증명서 상에 제시됨; 인비트로겐 코퍼레이션)이었다. 이 값 및 상기 Pluronic(등록상표) F108 혈구계 연구를 기초로 하여, 25 mg 비오틴-BSA 마이크로입자/ml을 함유하는 Pluronic(등록상표) F108의 0.4% (w/v) 용액 (또는 4 mg/mL)은 약 160 ㎍의 Pluronic(등록상표) F108/mg 마이크로입자를 제공할 것이다. Pluronic(등록상표) F108 혈구계 연구에 사용된 1.03 미크론 M1-070/40 마이크로입자 (이엠디 바이오사이언시스, 인크.)가 38.38 cm2/mg 초과의 표면적을 갖고, 27.04 내지 2027.7 ㎍ Pluronic(등록상표) F108/mg 마이크로입자의 농도에서 단분산되기 때문에, Pluronic(등록상표) F108의 0.4% (w/v) 용액, 또는 160 ㎍ Pluronic(등록상표) F108/mg 마이크로입자를, 비오틴-BSA 마이크로입자의 단분산을 촉진하기 위해 충분한 양의 Pluronic(등록상표) F108이 존재하는 것을 보장하기 위해 초기 분산 연구에 사용하였다.
0.4% (w/v) Pluronic(등록상표) F108 (Pluronic(등록상표) F-108 NF Prill, 바스프)을 함유하는 PBS (20 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 7.2) 버퍼, 또는 0.4% (w/v) Pluronic(등록상표) F108을 함유하는 TBS (20 mM Tris, 150 mM 염화나트륨, pH 7.2) 버퍼에 분산된 25 mg/mL 비오틴-BSA 마이크로입자에 SA (25 내지 50 ㎍의 SA/mg 마이크로입자)를 첨가함으로써 제조된 비오틴-BSA-코팅된, SA-코팅된 마이크로입자는 SA 첨가 후에 단분산되었다.
마이크로입자는 비오틴-BSA 마이크로입자가 SA와 조합되기 전에 0.4% (w/v) Pluronic(등록상표) F108을 함유하는 용액에 분산되는 한, SA의 첨가 순서에 상관없이 단분산을 유지하였다 (즉, 비오틴-BSA 마이크로입자를 한 방울씩 SA에 첨가하거나, 또는 SA를 비오틴-BSA 마이크로입자에 첨가함). 상기한 바와 같은 초음파 처리의 사용과 달리, 비오틴-BSA-코팅된, SA-코팅된 마이크로입자는 비오틴-BSA 마이크로입자가 SA와 조합되기 전에 Pluronic(등록상표) F108을 함유하는 버퍼에 분산될 경우 단분산을 유지하였다. 따라서, 0.4% (w/v) Pluronic(등록상표) F108은 마이크로입자 콜로이드 안정성을 개선시키고 (감소된 마이크로입자 지지체 표면 소수성, Pluronic(등록상표) F108의 매달린 (pendant) 히드록실기에 의한 증가된 마이크로입자 지지체 표면 음성 전하, 및 표면-대-표면 음성 전하 척력에 의한 증가된 마이크로입자 척력), 마이크로입자 가교결합이 발생할 수 있기 전에 SA 분자가 모든 이용가능한 (비결합되고 접근가능한) 마이크로입자 표면 비오틴과 결합하도록 허용함으로써, 비오틴-BSA 마이크로입자가 SA와 조합되기 전과 후 모두에서 비오틴-BSA 마이크로입자 단분산을 촉진시키는 분산제로서 성공적으로 작용하였다. 가교결합은 마이크로입자 비오틴이 이용가능한 경우에만, 그리고 4개의 SA 결합 도메인 중 적어도 2개가 2개의 별개의 마이크로입자 상의 비결합되고 접근가능한 비오틴과 결합할 수 있는 경우에 발생할 수 있다.
Pluronic(등록상표) F108이, 0.4% 내지 0.6% (w/v)의 농도에서 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA로 코팅된 마이크로입자에 대한 분산제로서 작용하였음이 실험에 의해 결정되었다. 간단히 설명하면, 분산 단계를 최적화하기 위해 SA 투입비 (10, 15, 25 및 35 ㎍ SA/mg 비오틴-BSA 마이크로입자), 인큐베이션 시간 (30 및 60분), 및 % Pluronic(등록상표) F108 (0.4 내지 0.6% w/v)의 조합을 평가하였다. 분석 성능 시험 (Access(등록상표) Free T4 및 Access(등록상표) AccuTnI 분석; 베크만 컬터, 인크.) 및 비오티닐화된 IgG 결합능 시험의 결과는 0.4% 내지 0.6% (w/v) Pluronic(등록상표) F108을 함유하는 TBS 버퍼 (20 mM Tris, 150 mM 염화나트륨, pH 7.2)에 25 mg 비오틴-BSA 마이크로입자/mL의 마이크로입자 농도로 비오틴-BSA 마이크로입자 1 mg당 25 내지 35 ㎍의 SA를 첨가하고 30 내지 60분 동안 인큐베이팅할 때 분산 과정이 고효율적임을 나타내었다.
일단 비오티닐화된 마이크로입자를 처리하여 0.4% 내지 0.6% (w/v %) Pluronic(등록상표) F108 용액에 분산시킨 후에, 마이크로입자의 응집 또는 덩어리의 형성을 야기하지 않으면서 낮은 수준 또는 소량의 SA를 비오티닐화된 마이크로입자에 첨가할 수 있었다. 이 과정은 마이크로입자를 SA로 코팅한 후 마이크로입자 단분산액을 생성시켰다. 공정도를 도 6에 도시하였고, 이것은 Pluronic(등록상표) F108의 부재 하에 코팅된 마이크로입자의 SA 처리를 보여주고, Pluronic(등록상표) F108 처리에 의해 생성되는 단분산액을 예시하는 것이다.
실시예 4
SA 비-포화 및 배향, 향상된 표면 차단, 및 개선된 결합 효율에 의한
증가된 신호-대- 노이즈 비
통상적인 마이크로입자와 SA 비-포화 및 배향, 향상된 표면 차단, 및 개선된 결합 효율을 특징으로 하는 본 발명의 비-포화된 마이크로입자 사이의 신호 대 노이즈 비 차이를 2개의 분석 플랫폼에 대해 비교하였다.
GxBiotin (염소 항-비오틴) 항체를 마이크로입자의 표면에 1차 코팅한 후, BNP에 대해 작용하는 비오티닐화된 OMNICLONAL(등록상표) (바이오사이트, 인크.) Fab 단편을 2차 코팅하여, B-형 나트륨 이뇨 펩티드 또는 뇌 나트륨 이뇨 펩티드 (BNP)에 대해 작용하는 결합 표면을 통상적인 마이크로입자 (M1-070/40 마이크로입자, 이엠디 바이오사이언시스) 상에 만들었다. 간단히 설명하면, GxBiotin IgG 1차 코팅은 카르보디이미드 화학을 사용하여 마이크로입자 표면 카르복실기 (70 내지 100 μmol COOH/g)를 MES (pH 5.5) 중의 약 6 내지 10 mol EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 염산염; 피어스 바이오테크놀로지 인크./써모 사이언티픽) 및 6 내지 10 mol 술포-NHS (n-히드록시술포숙신이미드; 피어스 바이오테크놀로지 인크./써모 사이언티픽)/mol 표면 카르복실로 활성화시키고, 마이크로입자를 활성화제와 함께 30 내지 35분 동안 인큐베이팅하고, 마이크로입자를 MES (pH 5.5)로 3회 세척하여 과잉의 활성화제를 제거하고, 40 마이크로그램의 GxBiotin IgG/mg 활성화된 마이크로입자를 첨가하고, 활성화된 마이크로입자를 GxBiotin IgG와 함께 120 내지 135분 동안 인큐베이팅하고, 과잉의 GxBiotin IgG를 제거하고, 잔류하는 활성화된 카르복실기를 글라이신-기반 버퍼로 켄칭시키고, 계면활성제 TRITON(등록상표) X-100 (폴리에틸렌 글리콜 p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐 에테르)을 함유하는 저 (pH 2.5) 및 고 (pH 8.0) pH 버퍼를 사용하여 수동적으로 흡수된 GxBiotin IgG를 스트리핑(stripping)시키고, 마이크로입자 표면을 BSA로 차단함으로써 10 mg/mL 마이크로입자에 적용하였다.
2차 코팅은 GxBiotin IgG 1차 코팅된 마이크로입자를 BNP 분석-특이적 희석제로 세척하고, 10 마이크로그램의 비오티닐화된 BNP Fab/mg GxBiotin 마이크로입자를 첨가하고, 비오티닐화된 BNP Fab를 마이크로입자와 함께 90 내지 135분 동안 실온에서 인큐베이팅하고, 마이크로입자를 세척하여 과잉의 비오티닐화된 BNP Fab를 제거하고, BNP 코팅된 마이크로입자를 BNP 분석-특이적 희석제를 사용하여 1.0 mg/mL로 희석하여 적용하였다.
본 발명에 따른 비-포화된 마이크로입자는 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA를 Dynal(등록상표) AKT-100 토실활성화된 PMP에 공유 부착시키고 (여기서, BSA는 1몰 BSA에 대한 4몰 비오틴의 몰 투입비에서 비오티닐화됨), 비오틴-BSA 마이크로입자를 Pluronic(등록상표) F108로 차단하고, 차단된 비오틴-BSA 마이크로입자를 Pluronic(등록상표) F108에 분산시키고, 마지막으로 비오틴-BSA 마이크로입자를 SA로 코팅하여 제조하였다. 비오티닐화된 모노클로날 항체의 투입비는 통상적인 코팅된 마이크로입자와 비-포화된 마이크로입자에 대해 동일하였다. 비오티닐화된 OMINCLONAL Fab는 BNP에 대해 작용하였다. 통상적인 코팅된 마이크로입자 및 비-포화된 마이크로입자를 동일한 마이크로입자 농도 (1.0 mg/mL)에서 평가하였고, 동일한 시약, 대조 샘플, 및 환자 샘플을 사용하여 동일한 Access(등록상표) 분석 포맷 (베크만 컬터, 인크.)로 시험하였다. 그 결과를 표 5에 제시하였다.
2개의 분석 플랫폼 (베크만 컬터, 인크.), 즉 UniCel(등록상표) DxI 800 Access(등록상표) Immunoassay System (비교적 더 높은 처리량 시스템) 및 Access(등록상표) 2 Immunoassay System (비교적 더 낮은 처리량 시스템) 각각에서 통상적인 마이크로입자 및 비-포화된 마이크로입자에 대해 신호 대 노이즈 비를 측정하였다. 교정 물질 반응은 일정 범위의 교정 물질 수준에 걸쳐 13개의 별개의 환자 샘플에 대해 측정하였다. 그 결과를 통상적인 마이크로입자 (표 5의 "대조군") 및 비-포화된 마이크로입자 (표 5의 "Dev 3")에 대해 RLU로 제시하였다. "% 바이어스"로 표현된 분석 플랫폼 바이어스 (bias)는 대조군과 비-포화된 마이크로입자 모두에 대해 동일한 방식으로 결정하였다. 용어 "바이어스"는 두 플랫폼이 동일한 시약 및 공급량을 사용함에도 불구하고 하드웨어, 디자인 및 처리량 차이 (즉, Access(등록상표) 2 Immunoassay System은 100 시험/시간을 완료할 수 있고, UniCel(등록상표) DxI 800 Access(등록상표) Immunoassay System은 400 시험/시간을 완료할 수 있음) 때문에 Access(등록상표) 2 Immunoassay System 및 UniCel(등록상표) DxI 800 Access(등록상표) Immunoassay System을 포함하는 임의의 분석 시스템 사이에 발생할 수 있는 분석 용량 차이를 의미한다. 임의의 바이어스는 각각의 플랫폼이 마이크로입자 시약을 초음파 처리하고, 혼합하고, 세척하고, 인큐베이팅하는 방식의 차이에 의해 발생할 수 있다. 평균 용량을 통상적인 마이크로입자 및 비-포화된 마이크로입자에 대해 계산하였다.
표 5에 제시된 바와 같이, 본 발명에 따른 마이크로입자의 바이어스 측정치가 전반적으로 통상적인 마이크로입자보다 더 우수하였다. 또한, 표 5는 비-포화된 마이크로입자에 있어서, (1) 배경은 더 낮았고 (S0을 S1-S5와 비교하라), (2) 신호 대 배경은 모든 교정 물질 수준 및 모든 환자 샘플에 걸쳐서 보다 유리하였고, (3) 감도는 모든 교정 물질 수준 및 모든 환자 샘플에 대해서 더 높았음을 보여준다. 따라서, 비-포화된 마이크로입자는 분석 신호의 증가 (예를 들어, DxI 플랫폼 사용시에, 통상적인 마이크로입자의 경우 S5에서의 13 x 106 RLU에 비해, 본 발명의 비-포화된 마이크로입자는 S5에서 23 x 106 RLU임), 및 분석 노이즈 또는 배경의 유의한 감소 (예를 들어, DxI 플랫폼 사용시에, 통상적인 마이크로입자의 경우 S0에서의 10 x 103 RLU에 비해, 본 발명의 비-포화된 마이크로입자는 S0에서 7 x 103 RLU임)를 제공하였다.
Figure 112009026310173-pct00005
본 발명에 따른 마이크로입자 및 상업적으로 입수가능한 결합 마이크로입자에 대한 다른 비교를 수행하였다 (마이크로입자의 설명에 대해서는 표 2 참조). 상기 비교에서, Dynal(등록상표) AKT-100 토실활성화된 PMP를 재조합 SA로 1차 코팅하여 제조한 상업적으로 입수가능한 Dynal(등록상표) 마이크로입자 (인비트로겐 코퍼레이션)를 얻었다. 상업적으로 입수가능한 SA-코팅된 마이크로입자의 성능을, Dynal(등록상표) AKT-100 토실활성화된 PMP를 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA로 코팅하고, 비오틴-BSA 마이크로입자를 Pluronic(등록상표) F108로 차단하고, 차단된 비오틴-BSA 마이크로입자를 Pluronic(등록상표) F108에 분산시킨 후, 마지막으로 비오틴-BSA 마이크로입자를 SA로 코팅하여 생산한 본 발명에 따른 마이크로입자와 비교하였다. 상업적으로 입수가능한 마이크로입자와 비-포화된 마이크로입자 모두를 포획 모이어티로서 TnI에 대한 비오티닐화된 항체를 사용하는 트로포닌 I 분석 (Access(등록상표) AccuTnI Assay; 베크만 컬터, 인크.)에 사용하였다. 본 발명의 상업적으로 입수가능한 마이크로입자 및 비-포화된 마이크로입자 모두를 동일한 마이크로입자 농도에서 평가하고, 동일한 시약, 대조 샘플, 및 환자 샘플을 사용하여 동일한 분석 포맷으로 시험하였다. 그 결과를 표 6에 제시하였다.
Figure 112009026310173-pct00006
본 발명의 비-포화된 마이크로입자는 상업적으로 입수가능한 마이크로입자에 비해 분석 신호의 유의한 증가 (예를 들어, S5: 9.6 x 106 RLU로부터 12.4 x 106 RLU로 증가), 및 분석 노이즈 또는 배경의 유의한 감소 (예를 들어, S0: 13 x 103 RLU로부터 8 x 103 RLU로 감소)를 유발하였다. 따라서, 본 발명의 비-포화된 마이크로입자는 마이크로입자 결합 표면 상의 SA의 비-포화된 성질 및 배향에 의한 증가된 분석 신호-대-노이즈 비 및 후속적으로 첨가된 비오티닐화된 항체에 대한 그의 누적적인 비-포화 및 배향 효과를 보였다. 상기 Dynal(등록상표) 방법 및 BCI 방법 비교는 최적화된 (시판되는 제품, Dynal(등록상표) DYNABEADS MyOne 스트렙타비딘 T1; 인비트로겐 코퍼레이션) Dynal(등록상표) 방법을 사용하였지만, BCI 방법은 최적화되지 않은 방법을 사용하였음을 유의해야 한다. 최적화된 BCI 방법을 사용하여 수행한, 비-포화된 마이크로입자에 대한 후속적인 TnI 시험 (Access(등록상표) AccuTnI Assay)은 분석 신호의 훨씬 더 유의한 증가 (즉, S1 = 80,000 RLU, S5 = 18,300,000 RLU), 유사한 분석 노이즈 또는 배경 (즉, S0 = 8,500 RLU), 및 증가된 곡선비 (즉, S1/S0 = 9.4, S5/S0 = 2,130)를 보여주었다.
실시예 5
비-특이적 결합의 감소
비특이적 결합은 많은 분석 포맷에서 바람직하지 않은 현상이기 때문에, 본 발명에 따라 제조된 마이크로입자를 사용하여 비특이적 결합의 감소를 보여주는 연구를 수행하였다. 비특이적 결합은 비-제한적인 예로서 신호 대 노이즈 비를 포함하여 분석 성능 파라미터에 유해한 효과를 줄 수 있는 바람직하지 않은 부산물을 생성시키는, 그의 성분 및/또는 지지체 표면을 수반하는 면역분석에서의 인위적인 결합 사건을 나타낸다. 비특이적 결합은 고상 지지체 표면 자체 및/또는 지지체 표면 상에 코팅된 리간드::지지체 커플러 복합체에 대한 결합을 포함할 수 있다. BSA를 지지체 커플러로서 이용하는 마이크로입자의 특정 실시태양을 조사하였다.
BSA는 알부민 (소 혈청 알부민)이고, 알부민은 갑상선 호르몬에 결합할 수 있다. BSA는 갑상선 호르몬 T3 및 T4에 대한 결합 단백질로서 확인되었다. 고상 지지체 표면이 BSA로 코팅되면, 결합 표면은 성공적으로 차단되지 않으면 상기 갑상선 호르몬을 포획하거나 결합할 것이다.
비-포화된 SA 마이크로입자는 마이크로입자를 비오티닐화된 BSA로 코팅하고, 표면을 Pluronic(등록상표) F108로 차단하고, 비오틴-BSA 표면을 SA로 코팅함으로써 생산되기 때문에, 비-포화된 SA 마이크로입자는 그 표면이 충분히 차단되지 않는다면 갑상선 호르몬, 예를 들어 T3 및 T4에 결합할 잠재력을 갖는다. 특히, 비-포화된 SA 마이크로입자를 T3 알칼린 포스파타제 컨쥬게이트와 함께 인큐베이팅할 경우, 마이크로입자는 표면이 차단되어 비특이적 결합이 완화 또는 제거되지 않으면 T3-컨쥬게이트에 결합하고 분석에서 비-특이적 결합 (NSB) 신호를 생성시킬 수 있다. 증가된 배경에 추가하여, 교정 물질 신호의 증가가 T3 컨쥬게이트의 비특이적 결합으로부터 발생할 수 있다. Pluronic(등록상표) F108이 0.4% 내지 0.6% (w/v)의 농도에서 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA로 코팅된 마이크로입자를 차단하였음이 실험에 의해 결정되었다.
초기 차단 연구는 비오티닐화된 BSA로 코팅된 토실활성화된 상자성 마이크로입자에 대한 차단제로서 0.1 M Tris (pH 8.0) 중의 0.1% (w/v) BSA, 및 0.1 M Tris (pH 8.0) 중의 0.4% (w/v) Pluronic(등록상표) F108을 평가하였다. 비오틴-BSA 마이크로입자를 0.1% (w/v) BSA 또는 0.4% (w/v) Pluronic(등록상표) F108 차단 버퍼와 함께 18시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하고, 비오틴-BSA 마이크로입자를 몰 과량의 SA 내로 느리게 적정함으로써 SA로 코팅하였다. 비오틴-BSA 마이크로입자를 다음 버퍼 중의 하나를 사용하여 차단 전에 3회 세척하고, 차단 후에도 3회 세척하였다: PBS (pH 7.4), 0.1% (w/v) TRITON X-100 (pH 7.4)가 존재하는 PBS, 0.4% (w/v) Pluronic(등록상표) F108 (pH 7.4)가 존재하는 PBS, TBS (7.4), 0.1% (w/v) TRITON X-100 (pH 7.4)가 존재하는 TBS, 또는 0.4% (w/v) Pluronic(등록상표) F108이 존재하는 TBS. 분석 성능 시험 (Access(등록상표) AccuTnI Assay; 베크만 컬터, 인크.)의 결과는 0.4% (w/v) Pluronic(등록상표) F108 차단 버퍼, 및 TBS (pH 7.4) 세척이 최저 배경 신호 (최저 S0 RLU), 최고 교정 물질 신호 (최고 S1 및 S5 RLU), 최대 분석 동적 범위, 및 최고 신호 대 노이즈 비를 생성시켰음을 보여주었다.
후속적인 차단 최적화 연구는 술포-NHS-LC-비오틴, 술포-HHS-LC-LC-비오틴, 또는 PFP 비오틴으로 비오티닐화된 BSA로 제조되고, TBS (pH 7.4)로 3회 세척하고, 0.1% (w/v) BSA 또는 0.4% (w/v) Pluronic(등록상표) F108 차단 버퍼로 4시간 동안 37℃에서 또는 18시간 동안 37℃에서 차단하고, TBS (pH 7.4)로 3회 세척하고, 비오틴-BSA 마이크로입자를 몰 과량의 SA 또는 뉴트라비딘 내로 느리게 적정함으로써 SA 또는 뉴트라비딘으로 코팅한 비오틴-BSA 마이크로입자의 성능을 평가하였다. 분석 성능 시험 (Access(등록상표) AccuTnI Assay; 베크만 컬터, 인크.)의 결과는 0.4% (w/v) Pluronic(등록상표) F108로 4시간 동안 37℃에서 차단되고 SA 또는 뉴트라비딘으로 코팅된 술포-NHS-LC-비오틴 BSA 마이크로입자, 및 PFP-비오틴 BSA 마이크로입자가 최저 배경 신호 (S0), 최고 교정 물질 신호 (S1 및 S5), 최대 분석 동적 범위, 및 최고 신호 대 노이즈 비를 생성시켰음을 보여주었다.
최종적인 Pluronic(등록상표) F108 차단 최적화 연구는 낮은 투입비 술포-NHS-LC-비오틴 컨쥬게이팅된 BSA (40 마이크로그램 비오틴-BSA/mg 마이크로입자)를 0.1 M 보레이트 (pH 9.5) 중에서 Dynal(등록상표) MyOne 토실활성화된 마이크로입자 (Dynal(등록상표) DYNABEADS MyOne 토실활성화된, 1.0 미크론 직경, 인비트로겐 코퍼레이션) 상에 4O℃에서 18시간 동안 코팅하여 제조한 비오틴-BSA 마이크로입자를 사용하였다. 비오틴-BSA 마이크로입자를 TBS (pH 7.4)로 3회 세척하고, TBS (pH 7.4) 중의 0.2%, 0.4%, 0.6%, 또는 0.8% (w/v) Pluronic(등록상표) F108로 2, 4, 또는 24시간 동안 4O℃에서 차단하고, TBS (pH 7.4)로 3회 세척하고, 비오틴-BSA 마이크로입자를 0.4% (w/v) Pluronic(등록상표) F108 (pH 7.4)이 존재하는 TBS에 분산시켜 SA로 코팅한 후, 35 마이크로그램의 SA/mg 마이크로입자를 첨가하였다. 분석 성능 시험 (Access(등록상표) Free T4 및 Access(등록상표) AccuTnI 분석; 베크만 컬터, 인크.), 및 비오티닐화된 IgG 결합능 시험의 결과는 0.4% 내지 0.6% (w/v) Pluronic(등록상표) F108로 4시간 동안 차단한 마이크로입자가 최저 배경 신호, 최고 교정 물질 신호, 최대 분석 동적 범위, 최고 신호 대 노이즈 비, 및 재현가능한 비오티닐화된 IgG 결합능을 생성시켰음을 보여주었다.
비-포화된 SA-코팅된 마이크로입자의 비특이적 결합을 평가하기 위해, 많은 비-포화된 SA-코팅된 마이크로입자를 4℃ 또는 37℃에서 3일 동안 인큐베이팅하고, Access(등록상표) Free T4 교정 물질 및 Access(등록상표) Free T4 시약 팩 (Reagent Pack) (베크만 컬터, 인크.)을 사용하여 Free T4 면역분석으로 시험하였다. 비오티닐화된 Free T4-특이적 항체를 사용하지 않고 시험한 샘플 ("No AB")은 T3-컨쥬게이트의 마이크로입자 표면에 대한 비특이적 결합을 평가할 것이다. SA로 코팅된 비오티닐화된 BSA를 갖는 본 발명의 마이크로입자에 대한 결과를, 오발부민 및 비오티닐화된 항체를 사용하는 상업적으로 입수가능한 마이크로입자 분석 (Access(등록상표) Free T4), 및 인비트로겐 코퍼레이션의 Dynal(등록상표) DYNABEADS M-280 스트렙타비딘 마이크로입자 (2.8 미크론 마이크로입자)로부터 생성된 신호와 비교하여 표 7에 제시하였다.
Figure 112009026310173-pct00007
결과는 비오티닐화된 Free T4-특이적 항체를 시약 팩으로부터 제거할 때 (No Ab) S0 분석 신호가 4℃ 및 37℃ 비-포화된 샘플 모두에서 < 8,500 RLU이었기 때문에 컨쥬게이트 비특이적 결합이 발생하지 않았음을 보여주었다. SA 표면이 비오티닐화된 Free T4-특이적 항체를 포획하고 상기 포획된 Free T4-특이적 항체는 T3-컨쥬게이트에 결합하지 않기 때문에 (즉, S0 > 1.5 x 106 RLU), 분석 신호는 비특이적 결합이 발생하거나, 또는 비오티닐화된 Free T4-특이적 항체가 분석물에 존재할 경우에만 발생하여야 한다. 상업적으로 입수가능한 마이크로입자는 비특이적 결합을 감소시키기 위해서 오발부민 (BSA가 아니라)을 갖는 SA 마이크로입자를 이용하였다. 비-포화된 마이크로입자가 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA를 이용하지만, 이들은 보다 우수한 성능을 보여주었다. 종합적으로, 결과는 연장된 기간 동안 승온에서도 (3일 동안 37℃) 비특이적 결합이 관찰되지 않았음을 보여주었고, 이것은 Pluronic(등록상표) F108이 상기 조건 하에서 비-포화된 마이크로입자로부터 대체되지 않음을 시사하였다. 따라서, Pluronic(등록상표) F108로 차단된 비오틴-BSA-코팅된, SA-코팅된 결합 표면은 승온에서 시간이 경과한 경우에도 T3 알칼린 포스페이트 컨쥬게이트의 감소된 또는 최소화된 비특이적 결합을 야기하였다.
실시예 6
코팅 공정 재현성
SA 코팅을 위한 공정 밸리데이션을 본 발명에 따른 비-포화되고 배향된 마이크로입자에 대해 수행하였다. 그 결과를 표 8과 도 12 및 도 13에 나타낸다. 공정 밸리데이션을 위한 마이크로입자를 본 발명에 따라 제조하였다. 간단히 설명하면, Dynal(등록상표) AKT-100 토실활성화된 PMP (인비트로겐 코퍼레이션)를 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA로 코팅하고, 비오틴-BSA 마이크로입자를 Pluronic(등록상표) F108로 차단하고, 차단된 비오틴-BSA 마이크로입자를 Pluronic(등록상표) F108 내에 분산시키고, 비오틴-BSA 마이크로입자를 SA로 코팅하였다.
분석을 독립적으로 제조된 SA 코팅 ("공정"), 마이크로입자 로트 ("토실활성화된 PMP 로트"), 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA 로트 ("Low Input Ratio Biotinylated BSA Lot"), Pluronic(등록상표) F108 로트 (Block Copolymer Pluronic(등록상표) F108 로트"), 및 SA 로트 ("SA Lot")의 다양한 조합을 사용하여 수행하였다. 표 8에서, 용어 "공정"은 낮은 투입비 비오티닐화된 BSA를 사용하여 마이크로입자를 코팅하고, 마이크로입자를 Pluronic(등록상표) F108로 차단하고, 마이크로입자를 Pluronic(등록상표) F108 내에 분산시키고, SA를 비오틴-BSA 마이크로입자 상에 코팅하는 것을 나타내고; "조작자"는 SA 코팅 또는 "공정"이 4명의 상이한 인간 조작자 중의 한 명에 의해 수행되었음을 나타낸다.
Figure 112009026310173-pct00008
5개의 별개의 상업적으로 입수가능한 대조군 ("Bio-Rad Liquid 1", "Bio-Rad Liquid 2", "Bio-Rad 1", "Bio-Rad 2" 및 "Bio-Rad 3"; 바이오-라드 래보래토리즈, 인크. (Bio-Rad Laboratories, Inc.)) 및 수집한 환자 혈청의 2개의 샘플 ("환자 풀 1" 및 "환자 풀 2") 및 3개의 개개의 샘플 ("샘플 1", "샘플 2" 및 "샘플 3")을 사용한, 11개의 밸리데이션 로트에 대한 Free T4 분석을 사용한 추가의 밸리데이션 연구 결과 (도 12 참조)는 CV가 약 5% 이하로서 잘 일치함을 보여주었다. 이와 대조적으로, 통상적으로 제조된 마이크로입자 (예를 들어, DYNABEADS M-280 SA 마이크로입자)의 CV는 적어도 약 10%이었다.
항원을 혈청 내로 스파이킹한 3개 세트의 대조군 (대조군 A, B, 및 C), 및 3개의 환자 혈청 대조군 (QC 환자 1, 2, 및 3)을 사용한, BPH-A 마커를 이용한 10개의 밸리데이션 로트에 대한 추가의 밸리데이션 연구 (도 13 참조)는 유사한 결과를 제시하였다.
SA 코팅 공정 밸리데이션 결과는 모든 밸리데이션 항목이 모든 로트에 대해 충족되었음을 보여준다. 추가로, 결과는 본 발명에 따른 마이크로입자를 제조하는 공정이 낮은 수준의 변동을 보이고, 재현가능하고, 신뢰할 수 있음을 제시한다.
실시예 7
비- 포화된 마이크로입자의 향상된 안정성
교정 물질 또는 샘플에서 T4의 회복에 의해 측정된 향상된 안정성 시험을, Access(등록상표) Free T4 분석 (베크만 컬터, 인크.)에서 Access(등록상표) Free T4 교정 물질을 사용하여 비오티닐화된 항-T4 항체를 함유하는 비-포화된 SA-코팅된 마이크로입자의 다수의 밸리데이션 로트에 대해 4℃ 및 37℃에서 4일 동안, 및 4℃ 및 37℃에서 127일 동안 수행하였다. 그 결과를 표 9와 도 14A 및 14B에 나타낸다.
Figure 112009026310173-pct00009
표 9는 4℃에서 4일 동안에 비해 37℃에서 4일 동안 인큐베이팅된 비-포화된 SA-코팅된 마이크로입자의 밸리데이션 로트의 평균 교정 물질, 대조군 용량, 및 환자 용량 회복을 보여준다. 표 9로부터 알 수 있는 바와 같이, 모든 로트에 대한 평균 회복은 100%이거나 100% 부근이었다.
도 14A 및 14B에서, 회복은 4℃에서 127일 후에 FT4에 대해 분석함으로써 측정한 RLU와 비교할 때, 37℃에서 127일 후에 FT4에 대해 분석함으로써 측정한 RLU의 %로서 표현된다 ("회복"). 교정 물질 수준은 S0 = 0.0 ng/mL, S1 = 0.54 ng/mL, S2 = 1.01 ng/mL, S3 = 1.98 ng/mL, S4 = 3.00 ng/mL, S5 = 6.11 ng/mL이었다. 교정 물질 이외에, 분석된 다른 샘플은 Bio-Rad 대조군 1 = 0.64 ng/mL, Bio-Rad 대조군 2 = 2.18 ng/mL, 및 Bio-Rad 대조군 3 = 4.19 ng/mL ("Bio-Rad lypho"), 및 환자 1 = 1.02 ng/mL, 환자 2 = 1.12 ng/mL, 환자 3 = 1.83 ng/mL, 환자 4 = 2.74 ng/mL, 및 환자 5 = 3.80 ng/mL인 5개의 별개의 환자 샘플 ("환자 #")을 포함하였다. 종합적으로, 회복은 100%이거나 100% 부근이었고, 이것은 승온에서 연장된 기간의 처리가 비-포화된 마이크로입자의 성능에 유해한 영향을 주지 않음을 나타낸다. 비교 목적으로, 상업적으로 입수가능한 SA-코팅된 마이크로입자를 사용하는 유리 T4 분석 (Access(등록상표) Free T4 분석; 베크만 컬터, 인크.)의 항목이 도 14A 및 14B에 포함된다 ("현재 시행되는 FT4 분석 항목"). 비-포화된 마이크로입자는 상업적으로 입수가능한 유리 T4 분석의 항목에 포함되었다.
종합적으로, 가속화 안정성 시험은 독립적으로 생산된 SA-코팅된 마이크로입자 로트가 매우 안정함을 확인하였다. 4℃에서 3일 또는 37℃에서 3일 인큐베이팅한 밸리데이션 로트 사이에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 교정 물질 신호는 매우 유사하였고 (교정 물질 회복: 99.1% 내지 113.5%), 평균 대조군 및 환자 용량 회복은 모두 97.2% 내지 102.9%이었다.
단일 로트를 4℃ 또는 37℃에서 127일 동안 인큐베이팅할 때, 성능의 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 교정 물질 신호는 매우 유사하였고 (교정 물질 회복: 95.1% 내지 109.6%), 곡선 비는 매우 유사하였고 (% 회복: 91.3% 내지 105.1%), 평균 대조군 및 환자 용량 회복은 모두 93.7% 내지 107.6%이었다.
실시예 8
비- 포화된 마이크로입자의 탈락 분석
본 발명에 따라 제조된 비-포화된 마이크로입자의 탈락 연구를 수행하였다. 비오틴-BSA을 사용하고 SA로 코팅된 본 발명에 따라 제조한 마이크로입자에는 약 8.7-14.0 ㎍ 비오틴-BSA/mg PMP, 및 5.6-7.8 ㎍ SA/mg PMP가 존재한다 (실시예 11 참조). 1%의 단백질이 10 mg의 총 PMP로부터 탈락될 경우, 약 0.7-1.0 ㎍의 단백질이 용액에 존재할 것이다. 탈락 분석을 상기 SA-코팅된 마이크로입자에 대해 수행하였다. HPLC 상의 크기 배제 크로마토그래피 (SEC-HPLC)의 결과는 210 nm에서 검출가능한 SA 또는 BSA가 없거나, 1% 미만의 탈락이 존재함을 보여준다. SA 및/또는 비오틴-BSA가 용액 중에 존재하지 않으면, 이들은 SEC-HPLC 방법의 검출 한계 미만이다 (도 15A 및 15B 참조). 도 15B에서, 감마 글로불린 및 오발부민 SEC 표준 피크 (피크 높이 ~1,400 mAU)는 210 nm에서 83.5 ㎍의 총 단백질을 나타낸다. 5 mAU (밀리-흡수 단위)의 피크 높이는 0.3 ㎍의 단백질을 나타낼 것이다. 210 nm에서의 크기 배제 HPLC 분석은 마이크로입자에 대해 3일 동안 37℃에서 스트레스를 가한 후에 용액 내에 검출가능한 비오틴-BSA 또는 SA 분자가 존재하지 않음 (예를 들어, 마이크로입자 표면으로부터 단백질 탈락의 미발생)을 보여주었다. 따라서, 탈락은 본 발명에 따라 제조된 마이크로입자에 대해 문제를 야기하지 않는다. 상기 제시된 안정성 데이타는, 마이크로입자에 대해 37℃에서 127일까지 스트레스를 가한 경우에 분석 신호, 및 아마도 비오티닐화된 IgG 결합이 영향을 받지 않기 때문에, SEC-HPLC SA 탈락 분석 결과를 지지한다 (도 14A-B).
실시예 9
오발부민의 낮은 투입비 비오티닐화
본 발명에 따른 마이크로입자를 비오틴과 커플링된 BSA 대신 비오틴과 커플링된 오발부민을 사용하여 제조하였다. 오발부민을 술포-NHS-LC-비오틴 (술포숙신이미딜-6-[비오틴아미도]헥사노에이트, 피어스 바이오테크놀로지 인크./써모 사이언티픽)으로 실시예 1에서 BSA에 대해 설명된 바와 같은 오발부민에 대한 비오틴의 다양한 몰 투입비에서 (표 10 참조) 비오티닐화하였다. 간단히 설명하면, 보레이트 버퍼 (pH 8.2) 및 DMF 중에서 오발부민 (1.253 mL 중의 20 mg)을 다양한 투입비에서 술포-NHS-LC-비오틴으로 비오티닐화하기 위한 4개의 별개의 비오티닐화 로트를 표 10에 나타낸 바와 같이 제조하였다.
Figure 112009026310173-pct00010
비오티닐화에 대한 수율 (%)은 투입비 2에서 75.6%이고; 투입비 4에서 83.3%이고; 투입비 6에서 85.1%이고; 투입비 8에서 79.1%이었다. HABA (4'-히드록시아조벤젠-2-카르복실산) 분석을 각각의 투입비에 대해 수행하였다. 그 결과를 표 11에 나타낸다.
Figure 112009026310173-pct00011
비오티닐화된 오발부민의 4개의 독립적인 비오티닐화 로트의 안정성 분석은 25 mg/mL 토실활성화된 PMP (Dynal(등록상표) DYNABEADS MyOne 토실활성화된, 1.0 미크론 직경, 인비트로겐 코퍼레이션)를 오발부민-비오틴으로 18-24시간 동안 37℃에서 0.1 M 보레이트 버퍼 (pH 9.5) (0.050 mg 오발부민-비오틴/mg PMP) 내에서 코팅하고, 마이크로입자를 TBS (pH 7.4)로 3회 세척하고, 오발부민-비오틴 코팅된 마이크로입자 표면을 TBS (pH 7.4) 중의 0.4% (w/v) Pluronic(등록상표) F108로 4시간 동안 37℃에서 차단하고, 마이크로입자를 TBS (pH 7.4)로 3회 세척하고, 오발부민-비오틴 마이크로입자를 TBS (pH 7.4) 중의 0.4% (w/v) Pluronic(등록상표) F108에 분산시키고, 오발부민-비오틴 마이크로입자를 TBS (pH 7.4) 중의 SA로 30분 동안 실온에서 코팅하고 (0.035 mg SA/mg 오발부민-비오틴 PMP), 마이크로입자를 나트륨 아지드 (0.1% w/v)가 존재하는 TBS (pH 7.4)로 3회 세척하고, 마이크로입자를 Access(등록상표) Free T4 분석-특이적 마이크로입자 버퍼로 3회 세척하고, 마이크로입자를 Access(등록상표) Free T4 분석-특이적 마이크로입자 버퍼로 25 mg/mL로부터 0.35 mg/mL로 희석하고, 오발부민-비오틴-SA-코팅된 마이크로입자를 4℃ 또는 37℃에서 3일 동안 인큐베이팅하고, Access(등록상표) Free T4 Assay (베크만 컬터, 인크.)으로 오발부민-비오틴-SA 마이크로입자가 비오티닐화된 항-Free T4 항체에 결합하는 능력을 시험함으로써 수행하였다. 안정성은 개개의 유리 T4 교정 물질 RLU 회복의 평균을 계산함으로써 결정하였다. Access(등록상표) Free T4 Assay은 항원 수준이 0 ng/mL 내지 6 ng/mL (표 4 참조)인 6개의 상이한 교정 물질 (S0, S1, S2, S3, S4, 및 S5)을 이용한다. 회복은 37℃ 교정 물질 RLU 반응을 4℃ 교정 물질 RLU 반응으로 나누고, 그 결과에 100%를 곱하여 계산하였다. 안정성은 6개의 모든 교정 물질에 대한 회복을 평균하여 계산하였다. 그 결과를 표 11에 제시하였다.
안정성은 고상을 4℃ 또는 37℃에서 3일 동안 인큐베이팅한 후에 SA 결합능 변화를 표시하였다. 안정성의 감소는 오발부민-비오틴 컨쥬게이트로부터 수동적으로 결합된 비오틴 또는 비오틴 시약의 탈락 또는 해리, 및 시간이 흐르면서 SA에 의한 유리 비오틴 또는 비오틴 시약의 후속적인 포획에 의한 것이다.
표 11은 BSA 이외의 다른 단백질, 예를 들어 오발부민이 본원에 설명된 바와 같이 낮은 투입비 비오티닐화를 사용하여 효과적으로 제조될 수 있음을 입증한다. 오발부민-비오틴 안정성 시험의 결과는 앞서 설명된 비오틴-BSA 안정성 결과 (표 1 참조)와 매우 유사하다. 이 결과는 높은 몰 투입비 (즉, 8:1)에서 제조된 오발부민-비오틴이 감소된 안정성을 보이는 것을 보여주었다. 오발부민에 대한 비오틴 시약의 몰 투입비가 8:1에서 2:1로 감소함에 따라, 안정성은 82%에서 97%로 개선된다 (표 11 참조).
실시예 10
친화도 분석을 위한 마이크로입자의 표면 상의
비오틴, SA , 및 면역글로불린의 밀도
본 발명에 따른 PMP를 지지체 커플러로서 BSA를, 리간드로서 비오틴을 사용하여 제조하였다. SA를 포획 모이어티로서 비오티닐화된 IgG에 결합하도록 사용하였다.
간단히 설명하면, Dynal(등록상표) PMP (인비트로겐 코퍼레이션)를 실시예 1의 절차에 따라 제조하였다. 즉, PMP를 실시예 1의 프로토콜에 따라 제조된 낮은 투입비 비오틴-BSA로 코팅하였다. 마이크로입자를 본 발명에 따라 제조하고, 본 발명에 따라 낮은 투입비 비오틴-BSA로, 이어서 SA로 코팅하였다. 그 후, SA-코팅된 PMP를 비오티닐화된 IgG로 처리하였다. 다음 IgG를 사용하였다: Access(등록상표) AccuTnI Assay (베크만 컬터, 인크.)에서 검출기 항체 (즉, 알칼린 포스파타제에 컨쥬게이팅됨)로서 사용되는 Mc x Access(등록상표) AccuTnI 모노클로날 항체인 비오티닐화된 M06 IgG, 및 Access(등록상표) Free PSA Assay (베크만 컬터, 인크.)에서 포획 항체 (즉, 염소 항-비오틴 PMP 상에 코팅됨)로서 사용되는 Mc x FPSA 모노클로날 항체인 비오티닐화된 399.4 IgG. 본 발명에 따라 제조된 SA PMP의 다양한 로트를 상기한 바와 같은 125I-표지된 비오티닐화된 IgG 방법을 사용하여 SA PMP 로트의 비오티닐화된 IgG 결합능을 평가하기 위해 M06 IgG 또는 399.4 IgG로 코팅하였다. 마이크로입자의 설명 및 결과를 표면 성분의 표면 밀도의 면에서 표 12에 제시하였다.
Figure 112009026310173-pct00012
표 12의 데이타는 몰 값으로 전환될 수 있고, 전환에 따르면 제시된 예 (A 참조)에서 약 2.46 x 10-4 (μmol 비오틴)/(mg PMP)이 존재한다. 직경이 약 1미크론이고 표면적이 7.7 x 10-3 m2/(PMP의 mg)인 마이크로입자의 경우, 약 3.19 x 10-2 (μmol 비오틴)/(m2 PMP)이 존재한다.
상기 설명된 로트에 추가로, 비오티닐화된 PMP를 본 발명에 따라 제조하였고, 표면적이 7.7 m2/g인 1.10 미크론 PMP의 경우 밀도가 15.1 (㎍ 비오틴-BSA)/(mg PMP)인 것으로 밝혀졌다.
상기 설명된 로트에 추가로, 3개의 추가의 밸리데이션 로트를 동일한 방식으로 제조하였다. 상기 추가의 로트를 표 13에 제시하였다.
Figure 112009026310173-pct00013
표 13의 데이타를 몰 측면에서 볼 때, 약 6.1 (㎍ SA)/(mg PMP)가 존재하는 것을 감안하고 56 kDa의 SA의 분자량을 사용하면, 약 1.41 x 10-2 (μmol SA)/(m2 PMP)가 존재한다. 따라서, 표 12의 데이타와 비교하면, 비오틴의 대략 1/2의 많은 SA가 마이크로입자 상에 존재하는 것으로 보인다.
실시예 11
상기 설명된 실시예에서 제조된 로트에 대한 BSA, 비오틴, SA, 및 IgG의 표면 밀도 계산을 수행하였다. 양호한 안정성을 보이는 표 1의 낮은 투입 비오티닐화 로트 (13개의 로트)를 사용하여 마이크로입자의 표면 밀도를 생성하였다. 마이크로입자, 및 비-입자형 지지체 (마이크로입자 데이타를 기초로 함)에 대한 실제 표면 밀도 계산을 도 16A 및 16B 및 아래 표 14에 나타낸다. 평탄한 표면을 가정한 마이크로입자 및 비-입자형 지지체 ("평탄한" 마이크로입자 데이타를 기초로 함)에 대한 표면 밀도 계산을 도 16A, 16C, 16D와 아래 표 15에 나타낸다.
표면 밀도 계산은 물리적 시험 파라미터를 기초로 하였다. 간단히 설명하면, 코팅 단계 동안 표면 상에 코팅된 BSA 및 SA의 양은 단백질 농도 결정의 BCA 방법 (BCA Protein Assay [비신코닌산 (bicinchoninic acid)]; 피어스 바이오테크놀로지 인크./써모 사이언티픽) 및/또는 280 nm에서의 흡광도 (BSA 및 SA에 대해)를 사용하여 코팅 단계 후에 상등액 분석에 의해 측정하였다. BSA 상의 비오틴의 양을 정량하기 위해 HABA 분석을 사용하였다. 비오틴-IgG의 결합능을 평가하기 위해 125I 결합을 사용하였다. 간단히 설명하면, TBS 중의 마이크로입자를 공지량의 BSA에 첨가하고, 인큐베이팅하고, 마이크로입자를 상등액으로부터 분리하였다. 상등액 내에 남아있는 단백질을 측정하고, 첨가된 단백질의 양으로부터 뺐다. 마이크로입자를 세척하고 단백질 함량에 대해 분석하였다. TRIS-완충 염수 (pH 7.4)를 커플링을 위해 및 마이크로입자에 대한 항체의 결합을 위해 사용하였다. 계산은 (a) 마이크로입자 제조사에 의해 제공된 실제 측정된 표면적, 및 (b) 마이크로입자 직경 및 평탄도 가정을 기초로 하여 계산된 표면적을 기초로 하여 이루어졌다.
표 14에 제시된 표면 밀도 측정을 위해, 마이크로입자 표면적 (건조 고체 중량을 사용하는 계산을 기초로 함)은 최소 7.4 m2/g에서부터 최대 8.4 m2/g까지이고, 중간 범위는 7.7 m2/g이었다.
Figure 112009026310173-pct00014
표 14 (상업적으로 입수가능한 마이크로입자 (Dynal(등록상표) DYNABEADS MyOne 토실활성화된, 1.0 미크론 직경; 인비트로겐 코퍼레이션)의 측정을 기초로 함)에서 볼 수 있는 바와 같이, 일단 리간드 (예를 들어, 비오틴)가 비-포화되면, 결합 표면의 후속층도 비-포화될 것이다. 특정 실시태양에서, 표면적이 약 0.0077 m2/mg이고 지시된 양의 비오티닐화된 BSA 및 SA로 코팅된 1 미크론 마이크로입자는 2.1 x 10-5 μmol 비오틴-IgG/mg PMP로 결합하였다.
표 15에 제시된 표면 밀도 측정을 위해, 마이크로입자 표면적 (평탄도 가정, 마이크로입자 직경: 0.90 내지 1.10 ㎛, 및 마이크로입자 밀도: 1.4 내지 1.8 g/cm3을 기초로 함)은 최소 0.0030 m2/mg으로부터 최대 0.0048 m2/mg까지이었다.
Figure 112009026310173-pct00015
표 15는 평탄한 표면을 가정한다. 다시, 표 15에서 알 수 있는 바와 같이, 일단 리간드 (예를 들어, 비오틴)가 비-포화되면, 결합 표면의 후속층도 비-포화될 것이다. 그러나, 평탄도 가정으로 인해, 표면 밀도 계산시에 평탄도 가정을 하지 않은 표면 밀도 계산 (표 14 참조)보다 더 큰 μmol의 리간드 (비오틴)/제곱미터, 더 큰 μmol의 지지체 커플러 (BSA)/제곱미터, 더 큰 μmol의 리간드 바인더 (SA)/제곱미터, 및 더 큰 μmol의 포획 모이어티 (비오틴-IgG)/제곱미터가 얻어진다. 표면 밀도의 증가는, 비오틴, BSA, SA, 또는 비오틴-IgG의 μmol/mg은 일정하지만, 평탄도 가정 하의 마이크로입자 표면의 총 표면적이 평탄도 보정이 없는 마이크로입자의 총 표면적보다 더 작다는 사실에 기인한다. 예를 들어, 2개의 마이크로입자가 동일한 직경 및 형상이지만, 하나의 마이크로입자가 다공성이고 다른 마이크로입자가 완전히 평탄하면, 다공성 마이크로입자는 평탄한 마이크로입자보다 더 큰 이용가능한 표면적/단위 질량 (m2/mg)을 가질 것이다. 두 마이크로입자가 리간드에 결합할 수 있고, 둘 모두 동일한 양의 리간드를 제공한다면, 다공성 마이크로입자는 평탄한 마이크로입자보다 제곱미터당 더 적은 리간드에 결합할 것이다.

Claims (59)

  1. a) 마이크로입자 지지체;
    b) 상기 마이크로입자 지지체 표면에 공유 커플링된, 단백질을 포함하는 적어도 하나의 지지체 커플러;
    c) 상기 단백질에 커플링된 리간드; 및
    d) 상기 마이크로입자 지지체의 표면과 접촉하는 블록 공중합체
    를 포함하고,
    여기서, 상기 리간드는 지지체의 제곱미터당 1 x 10-2 내지 5 x 10-1 마이크로몰의 리간드의 밀도로 존재하고, 상기 리간드는 비오틴이며, 비오틴은 5:1 이하의 비오틴 대 단백질의 몰비로 존재하고;
    상기 블록 공중합체 분자는 적어도 2개의 친수성 테일기에 인접하는 소수성 헤드기를 포함하고, 소수성 헤드기는 마이크로입자 지지체와 접촉하는 것인 친화도 분석을 위한 비-포화된 결합 표면을 갖는 마이크로입자.
  2. 제1항에 있어서, 리간드가
    (a) 지지체의 제곱미터당 2 x 10-2 내지 2 x 10-1 마이크로몰의 리간드, 또는
    (b) 지지체의 제곱미터당 1.9 x 10-2 내지 1.6 x 10-1 마이크로몰의 리간드, 또는
    (c) 지지체의 제곱미터당 1.9 x 10-2 내지 6.6 x 10-2 마이크로몰의 리간드, 또는
    (d) 지지체의 제곱미터당 1.6 x 10-2 내지 6.6 x 10-2 마이크로몰의 리간드
    의 밀도로 존재하는 것인 마이크로입자.
  3. 제1항에 있어서, 블록 공중합체에서, 2개 이상의 친수성 테일의 길이가 각각 독립적으로 소수성 헤드기의 길이의 2 내지 2.5배일 수 있는 것인 마이크로입자.
  4. 제1항에 있어서, 마이크로입자 지지체가, 소수성인 유기 중합체 또는 공중합체를 포함하는 것인 마이크로입자.
  5. 제1항에 있어서, 마이크로입자 지지체가 상자성(paramagnetic) 또는 초상자성 물질을 포함하는 것인 마이크로입자.
  6. 제1항에 있어서, 단백질이 소 혈청 알부민 (BSA), 오발부민, BSA의 단편, 오발부민의 단편, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 마이크로입자.
  7. 제6항에 있어서, 단백질이 BSA이고, 리간드가 비오틴이며,
    비오틴이 지지체의 제곱미터당 1.9 x 10-2 내지 6.6 x 10-2 마이크로몰의 비오틴의 밀도로 존재하고,
    BSA가 지지체의 제곱미터당 1.6 x 10-2 내지 2.9 x 10-2 마이크로몰의 BSA의 밀도로 존재하는 것인 마이크로입자.
  8. 제3항에 있어서, 비오틴과 커플링된 적어도 2가인 리간드 바인더를 추가로 포함하는 마이크로입자.
  9. 제8항에 있어서, 리간드 바인더가 아비딘, 스트렙타비딘 (SA), 뉴트라비딘, SA의 단편, 아비딘의 단편, 뉴트라비딘의 단편, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 마이크로입자.
  10. 제8항에 있어서, 리간드 바인더와 회합된 포획 모이어티를 추가로 포함하는 마이크로입자.
  11. 제10항에 있어서, 포획 모이어티가 비오티닐화되는 것인 마이크로입자.
  12. 제3항에 있어서, 블록 공중합체 분자가 각각 중합체를 포함하고, 소수성 헤드기가 폴리프로필렌 옥시드 블록이며, 친수성 테일기가 각각 폴리에틸렌 옥시드 블록인 것인 마이크로입자.
  13. 적어도 2개의 친수성 테일기에 인접하는 소수성 헤드기를 갖는 블록 공중합체와 수용액에 분산된 복수의 제3항의 마이크로입자를 포함하는 마이크로입자 분산액.
  14. 제13항에 있어서, 마이크로입자 지지체가, 소수성인 유기 중합체 또는 공중합체를 포함하는 것인 마이크로입자 분산액.
  15. 제13항에 있어서, 마이크로입자 지지체가 상자성 또는 초상자성 물질을 포함하는 것인 마이크로입자 분산액.
  16. 제13항에 있어서, 단백질이 BSA, 오발부민, BSA의 단편, 오발부민의 단편, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 마이크로입자 분산액.
  17. 제13항에 있어서, 비오틴과 커플링된 적어도 2가인 리간드 바인더를 추가로 포함하는 마이크로입자 분산액.
  18. 제17항에 있어서, 리간드 바인더가 아비딘, SA, 뉴트라비딘, SA의 단편, 아비딘의 단편, 뉴트라비딘의 단편, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 마이크로입자 분산액.
  19. 제17항에 있어서, 리간드 바인더와 회합된 포획 모이어티를 추가로 포함하는 마이크로입자 분산액.
  20. 제19항에 있어서, 포획 모이어티가 비오티닐화되는 것인 마이크로입자 분산액.
  21. 제9항에 있어서, 리간드 바인더가 스트렙타비딘인 것인 마이크로입자.
  22. 제18항에 있어서, 리간드 바인더가 스트렙타비딘인 것인 마이크로입자 분산액.
  23. 제1항에 있어서, 블록 공중합체가 하기 일반식 I의 구조를 포함하는 것인 마이크로입자.
    HO(C2H4O)x(C3H6O)y(C2H4O)zH (I)
    (식에서, x는 100 내지 135이고, y는 40 내지 75이고, z는 100 내지 135임)
  24. 제1항에 있어서, 블록 공중합체의 평균 분자량이 9,000 내지 18,000 Da인 마이크로입자.
  25. 제8항에 있어서, 리간드 바인더가 지지체의 제곱미터당 1.0 x 10-2 내지 5.0 x 10-2 마이크로몰의 밀도로 존재하는 마이크로입자.
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