ES2953017T3 - Dispositivo de tira de inmunoensayo de flujo lateral - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a un dispositivo de ensayo de flujo lateral para la detección de un péptido diana en una muestra líquida, que comprende: (a) un soporte sólido, (b) una almohadilla de muestra para recibir inicialmente y opcionalmente pretratar la muestra en un primer extremo. del soporte sólido, (c) una almohadilla absorbente en un segundo extremo del soporte sólido, (d) una almohadilla conjugada que comprende en estado seco un conjugado movilizable de una partícula y el péptido diana, en donde el péptido diana conjugado con dicha partícula está biotinilada y la partícula comprende en su superficie una proteína de unión a biotina, (e) una membrana de reacción del péptido diana que comprende, (i) una región de captura que comprende un primer reactivo de captura inmovilizado contra el péptido diana, y (ii) opcionalmente una región de control que comprende un segundo reactivo de captura inmovilizado contra el conjugado de control de partículas, en el que la almohadilla de muestra, la almohadilla de conjugado, la membrana de reacción y la almohadilla absorbente están montadas en el soporte sólido para permitir el flujo capilar desde la almohadilla de muestra a la membrana de reacción a través de la almohadilla de conjugado, y en el que la carga de la partícula con el péptido diana es de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 55 % de la capacidad de carga máxima de la partícula. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Dispositivo de tira de inmunoensayo de flujo lateral
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de los métodos y dispositivos de diagnóstico y en particular a inmunoensayos de flujo lateral.
Antecedentes de la invención
Los ensayos de flujo lateral (EFL) son formatos específicos de ensayos de diagnóstico que son fáciles de usar, relativamente baratos y rápidos. Se pueden usar, por ejemplo, en diagnósticos de consultorio y proporcionan detección cualitativa o cuantitativa de analitos, tales como polipéptidos y ácidos nucleicos, en muestras biológicas, medioambientales o de alimentos.
Los ensayos de flujo lateral están compuestos de un sistema cromatográfico en los que los componentes de una muestra, tales como sangre u orina, son transportados a través de fuerzas capilares a una membrana de reacción. Las reacciones inmunoquímicas (es decir, anticuerpo-antígeno) se usan frecuentemente para la detección. La muestra se mueve a través de la membrana por fuerza capilar. Los ensayos de flujo lateral convencionales tienen al menos las cuatro partes siguientes: una almohadilla de muestra, es decir, el área sobre la que se aplica la muestra de líquido; una almohadilla de conjugado que comprende etiquetas marcadas combinadas con reactivos de captura (por ejemplo, anticuerpos); una membrana de reacción (normalmente una membrana de nitrocelulosa) que contiene una línea de prueba y una línea de control para la interacción antígeno diana-anticuerpo; y una almohadilla absorbente, que reserva la muestra restante (véanse Bahadir & Sezgintiirk, Trends in Analytical Chemistry (2016) 82, 286-306; Sajid et al., J. Saudi Chem. Soc. (2015) 19, 689-705; Koczula & Gallotta, Essays in Biochemistry (2016) 60, 111-120, para artículos de revisión).
Las configuraciones típicas de EFL incluyen inmunoensayos de tipo sandwich que utilizan dos anticuerpos diferentes contra el analito que va a detectarse e inmunoensayos competitivos que comprenden moléculas de analito marcadas que compiten con las moléculas de analito no marcadas en la muestra. Las marcas usadas para este fin incluyen nanopartículas, tales como nanopartículas de oro o carbono, y perlas de látex. Los ensayos de flujo lateral están disponibles para varios analitos diferentes, que incluyen antígenos bacterianos (por ejemplo, véanse los documentos de patente WO 2014/059274 A1, WO 99/05524 A1) y biomarcadores de proteína, tales como troponina cardíaca I, mioglobina (por ejemplo, véase Zhu et al., Clinical Chemistry (2011) 57:12, 1732-1738) y telopéptidos de colágeno (por ejemplo, véase Lee et al., Sensors (2013) 13, 165-174).
Los telopéptidos N- y carboxiterminales de colágeno (NTX y CTX, respectivamente) son marcadores de recambio óseo (Lee et al., loc. cit.)). Se sabe, por ejemplo, que CTX-II, el telopéptido reticulado carboxiterminal humano de colágeno de tipo II, es un marcador de la degradación del cartílago, por ejemplo, en enfermedades de las articulaciones, tales como osteoartritis (OA) y artritis reumatoide (AR) (Christgau et al., Bone (2001) 29(3):209-15; Garnero et al., Ann. Rheum. Dis. (2001) 60:619-626; Mouritzen et al., Ann. Rheum. Dis. (2003) 62:332-336).
El documento de patente CN 106370844 se refiere a una tira reactiva de oro coloidal doble para probar marcadores del metabolismo óseo humano.
El documento de patente US 2008/0138842 A1 proporciona inmunoensayos de tipo sandwich de flujo lateral, en los que el analito diana se une a un reactivo específico de analito.
El documento de patente CN 107688090 describe una tira reactiva para NTX.
Lee et al. (Sensors 2013, 13, 165-174) se refiere a inmunoensayos de flujo lateral para la detección de CTX y NTX.
El documento de patente US 2005/0196875 A1 se refiere a un inmunoensayo de flujo lateral para detectar dos o más analitos. Rivas et al. (Gold Particles in Analytical Chemistry (editado por Valcarcel y Lopez-Lorente) (2014) vol. 66, Capítulo 14, p. 569-605) es una revisión de biosensores de flujo lateral basados en nanopartículas de oro.
Gong et al. informa de inmunoensayos de flujo lateral para la detección altamente sensible de BNP en el consultorio.
El documento de patente WO 2017/131546 A1 se refiere a composiciones de ácido hialurónico y para el tratamiento de enfermedades de las articulaciones y trastornos del tejido blando.
El documento de patente EP 3156801 A1 se refiere a la molécula de adhesión intercelular-1 soluble (sICAM-1) como un biomarcador de la intensidad del dolor y a inmunoensayos respectivos.
Los inmunoensayos para la detección de CTX-II están comercialmente disponibles, por ejemplo, un EIA competitivo y kit de ELISA de sandwich de LifeSpan Biosciences, Inc. (Seattle, WA, EE. UU.).
Sin embargo, los ensayos disponibles tienen una sensibilidad relativamente baja y/o no se pueden usar en el consultorio (POC).
Sumario de la invención
La presente invención proporciona métodos y dispositivos de inmunoensayo de flujo lateral con una alta sensibilidad, un alto intervalo dinámico y que se pueden usar en el POC, tal como en la consulta del médico durante la visita del paciente. Esto contrasta con los métodos disponibles en la técnica, en los que las pruebas se confinan al laboratorio médico, que implica enviar los especímenes fuera del consultorio y entonces esperar horas o días para saber los resultados, tiempo durante el cual el cuidado debe continuar sin la información deseada o se suspende hasta que los resultados estén disponibles.
La invención se explica en el conjunto adjunto de las reivindicaciones. En particular, la presente invención se refiere a un dispositivo de ensayo de flujo lateral para la detección de telopéptido reticulado carboxiterminal de colágeno de tipo II (CTX-II) en una muestra líquida, que comprende:
(a) un soporte sólido,
(b) una almohadilla de muestra para recibir inicialmente y pretratar opcionalmente la muestra en un primer extremo del soporte sólido,
(c) una almohadilla absorbente en un segundo extremo del soporte sólido,
(d) una almohadilla de conjugado que comprende en un estado seco un conjugado movilizable de una partícula y el péptido diana, en donde la partícula es una nanopartícula de oro coloidal, y en donde el péptido diana conjugado con dicha partícula se biotinila y la partícula comprende sobre su superficie una proteína de unión a biotina,
(e) una membrana de reacción de péptido diana que comprende,
(i) una región de captura que comprende un primer reactivo de captura inmovilizado contra el péptido diana, y
(ii) opcionalmente una región de control que comprende un segundo reactivo de captura inmovilizado contra un conjugado de control,
en donde la almohadilla de muestra, la almohadilla de conjugado, la membrana de reacción y la almohadilla absorbente están montadas en el soporte sólido para permitir el flujo capilar de la almohadilla de muestra a través de la almohadilla de conjugado a la membrana de reacción, y en donde
la carga de la partícula con el péptido diana es desde aproximadamente el 20 % hasta aproximadamente el 55 % de la capacidad de carga máxima de la partícula.
El dispositivo es un dispositivo inmunocromatográfico para su uso en un inmunoensayo y está ventajosamente en un formato de tira. Este dispositivo se puede usar en particular para la detección cuantitativa de un péptido diana en una muestra líquida.
La invención se refiere además a un método para la detección, particularmente la detección cuantitativa, de un péptido diana en una muestra líquida, que comprende las etapas de
(a) aplicar dicha muestra líquida a la almohadilla de muestra del dispositivo según la invención, para permitir el flujo de la muestra de la almohadilla de muestra a través de la almohadilla de conjugado a la membrana de reacción,
(b) detectar la presencia o cantidad de conjugado en la región de captura, y
(c) opcionalmente detectar la presencia o cantidad de conjugado de control en la región de control, en donde la presencia o ausencia o la cantidad detectada de conjugado en la región de captura es indicativa de la ausencia o presencia o la cantidad del péptido diana, respectivamente, en la muestra líquida.
El dispositivo y método de la presente invención se usan para la detección de CTX-II. El dispositivo y método se pueden usar en métodos de diagnóstico y pronóstico, así como en métodos de estratificación de sujetos y/o durante la monitorización de la terapia. En caso de detección de CTX-II, el dispositivo y método de la invención se pueden usar, por ejemplo, para diagnosticar o pronosticar pacientes con osteoartritis.
Descripción de las figuras
La Figura 1 muestra una configuración a modo de ejemplo de un inmunoensayo de flujo lateral de la invención. 1: muestra; 10: soporte sólido; 11: almohadilla de muestra; 12: almohadilla de conjugado; 13: almohadilla absorbente; 20: membrana de reacción; 21: línea de prueba; 22: línea de control.
La Figura 2 muestra una configuración a modo de ejemplo pero típica y la evolución del EFL competitivo de la invención. A: antes del comienzo de la prueba; B: prueba negativa; C: prueba positiva. 1: Muestra. 12: almohadilla de conjugado. 21: línea de prueba; 22: línea de control.
La Figura 3 muestra un conjugado de la presente invención que se carga al 50 % con CTX-II.
La Figura 4 ilustra las intensidades de la línea de prueba en diferentes cargas (10 %, 30 %, 50 %, 100 %) con CTX-II sobre la partícula y diferentes concentraciones de CTX-II en la muestra.
La Figura 5 muestra la intensidad (como se lee por el lector) en unidades para diferentes concentraciones de CTX-II en la muestra y en diferentes cargas de CTX-II del conjugado (escala logarítmica).
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un dispositivo de ensayo de flujo lateral, particularmente en formato de tira, para la detección de telopéptido reticulado carboxiterminal de colágeno de tipo II (CTX-II) en muestras líquidas, especialmente en muestras biológicas, tales como orina o sangre. El ensayo es un inmunoensayo competitivo que usa partículas detectables que están conjugadas con el péptido diana. En el conjugado, el péptido diana se biotinila y la partícula comprende una proteína de unión a biotina sobre su superficie de manera que el resto de biotina del péptido diana se conjugue con las partículas por la interacción de la biotina con la proteína de unión a biotina. Las partículas son nanopartículas de oro y las proteínas de unión a biotina adecuadas incluyen neutravidina, estreptavidina y avidina.
La presente invención se refiere a un dispositivo de ensayo de flujo lateral para la detección de telopéptido reticulado carboxiterminal de colágeno de tipo II (CTX-II) en una muestra líquida, que comprende:
(a) un soporte sólido,
(b) una almohadilla de muestra para recibir inicialmente y pretratar opcionalmente la muestra en un primer extremo del soporte sólido,
(c) una almohadilla absorbente en un segundo extremo del soporte sólido,
(d) una almohadilla de conjugado que comprende en un estado seco un conjugado movilizable de una partícula y el péptido diana, en donde la partícula es una nanopartícula de oro coloidal, y en donde el péptido diana conjugado con dicha partícula se biotinila y la partícula comprende sobre su superficie una proteína de unión a biotina,
(e) una membrana de reacción de péptido diana que comprende
(i) una región de captura que comprende un primer reactivo de captura inmovilizado contra el péptido diana, y
(ii) opcionalmente una región de control que comprende un segundo reactivo de captura inmovilizado contra un conjugado de control,
en donde la almohadilla de muestra, la almohadilla de conjugado, la membrana de reacción y la almohadilla absorbente están montadas en el soporte sólido para permitir el flujo capilar de la almohadilla de muestra a la membrana de reacción a través de la almohadilla de conjugado, en donde
la carga de la partícula con el péptido diana es ventajosamente desde aproximadamente el 20 % hasta aproximadamente el 55 % de la capacidad de carga máxima de la partícula.
El dispositivo es un dispositivo para su uso en un inmunoensayo y está ventajosamente en un formato de tira. Este dispositivo se puede usar en particular para la detección cuantitativa de un péptido diana en una muestra líquida. La región de prueba y la región de control (si está presente) están normalmente en forma de una línea. Por tanto, en el presente documento también se podría denominar “línea de prueba” y “línea de control”, respectivamente.
El “conjugado de control” puede ser, por ejemplo, un conjugado de una nanopartícula de oro con un péptido de control que entonces se une sobre la región de control. El péptido de control se puede unir ventajosamente (“conjugar”) no covalentemente a la partícula. La región de control comprende un reactivo de captura, por ejemplo un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, contra dicho péptido de control o una proteína de unión capaz de unir el péptido de control. Ventajosamente, en el presente documento, el péptido de control es un péptido de control biotinilado y la región de control comprende una proteína de unión a biotina, tal como neutravidina. Un péptido de control a modo de ejemplo es albúmina de suero bovino (BSA), que se biotinila ventajosamente. Es ventajoso que el péptido de control no aparezca normalmente en la muestra que va a detectarse. El conjugado de control —si está presente— está sobre la almohadilla de conjugado como el conjugado del péptido diana (“conjugado diana” o “conjugado de péptido diana”). El conjugado de péptido diana y el conjugado de péptido de control se pueden mezclar, por ejemplo, antes de la adición a la almohadilla de conjugado del dispositivo. Un conjugado de control particular comprende, por lo tanto, una nanopartícula, tal como una nanopartícula de oro coloidal y un péptido de control biotinilado, tal como BSA.
Un “péptido” en el contexto de la presente invención es una cadena de monómeros de aminoácido unidos por enlaces peptídicos (amida). El término “péptidos” en el presente documento comprende oligopéptidos, polipéptidos y proteínas.
Un “oligopéptido” en el contexto de la presente invención es una única cadena (normalmente) lineal de normalmente 2 a 9 restos de aminoácidos mantenidos juntos por enlaces amida. Un “polipéptido” en el contexto de la presente invención es una única cadena (normalmente) lineal de muchos (normalmente 10 o más, y particularmente 10 a aproximadamente 100) restos de aminoácidos, mantenidos juntos por enlaces amida. Por lo tanto, las proteínas son péptidos en el sentido de la presente invención. Tienen normalmente al menos 50 aminoácidos de longitud y pueden comprender más de una cadena de polipéptidos. Mientras que los péptidos en la mayoría de los casos son lineales como se indica anteriormente, en algunos casos también pueden estar ramificados o reticulados. Dichos péptidos también están englobados por el término “péptido” en el contexto de la invención.
Una configuración típica del dispositivo de ensayo de flujo lateral se muestra en la Figura 1. El dispositivo tiene un soporte sólido (10) sobre el que están montados la almohadilla de muestra (11), la almohadilla de conjugado (12), la almohadilla absorbente (13) y la membrana de reacción (20). El soporte sólido (“tarjeta de soporte”) proporciona soporte para las almohadillas y membranas del ensayo real, pero por lo demás no está implicado en la reacción o flujo de la muestra y analito. Las tarjetas de soporte están hechas, por ejemplo, de poli(cloruro de vinilo) (PVC). El ensamblaje de almohadillas y membranas sobre la tarjeta de soporte estará normalmente en una carcasa de plástico, aunque esto no se requiere. La carcasa tiene normalmente al menos una abertura (“puerto de muestra”) sobre la almohadilla de muestra para la aplicación de la muestra. Las líneas de control y de prueba son visibles (por ejemplo, por una abertura o ventana) para detectar o medir la marca unida. La carcasa previene que el usuario aplique la muestra en cualquier lado, excepto la almohadilla de muestra. La carcasa también sirve para proteger la tira de salpicaduras involuntarias sobre la membrana. También se puede usar marcado externo sobre la carcasa para indicar la posición de las líneas de prueba y de control y proporcionar otra información. Las carcasas se pueden obtener como casetes disponibles para venta o ser diseñados de forma personalizada para ajustarse alrededor de la tira. La decisión entre estas opciones requiere equilibrar el coste de la unidad, los costes de diseño, la compatibilidad del tamaño con la tira, y requisitos de marcado externo. Se pueden usar clavijas y barras internas para mantener la tira en su lugar con respecto al puerto de muestra y la ventana de visualización. Mantienen los materiales en contacto íntimo entre sí mientras que la tira reactiva está en funcionamiento.
Los materiales usados para las almohadillas incluyen matrices porosas. Lo más comúnmente, se usan materiales celulósicos (es decir, papeles de filtro), tales como línter de algodón, para las almohadillas. También se pueden usar filtros de fibra de vidrio, sin embargo, más comúnmente para la almohadilla de conjugado.
La “almohadilla de muestra” recibe la muestra tras la aplicación y promueve la distribución homogénea de la muestra sobre la almohadilla de conjugado. También puede influir en la tasa a la que el líquido entra en la almohadilla de conjugado, previniendo la inundación del dispositivo. Además, la almohadilla de muestra también puede comprender componentes adicionales, tales como proteínas, detergentes, potenciadores de la viscosidad y sales tampón para procesar la muestra (por ejemplo, separación de componentes de muestra en el caso de muestras de sangre, retirada de interferencias, ajuste del pH, aumento de la viscosidad, solubilización de componentes y/o prevención de la unión no específica entre conjugado y analito u otros componentes o a la membrana de reacción).
La “almohadilla de conjugado” comprende el conjugado secado y movilizable de la partícula y el péptido diana. Cuando la muestra fluye en la almohadilla de conjugado, el conjugado levanta el material de la almohadilla, y se mueve con el frente de la muestra en la membrana de reacción. La almohadilla de muestra suministra así el conjugado (partícula -péptido diana) sobre la membrana de reacción en un volumen coherente de muestra sobre cada tira reactiva. Si procede, la almohadilla de conjugado también comprenderá el conjugado de control secado y movilizable.
El dispositivo de la presente invención tiene una “almohadilla absorbente”. La almohadilla absorbente se coloca en el extremo distal de la tira reactiva y reserva la muestra restante. Absorbe el fluido a través de la membrana y recoge el líquido procesado. Además, aumenta el volumen total de muestra que entra en la tira reactiva.
La “membrana de reacción” une irreversiblemente reactivos de captura en las líneas de prueba y de control. Normalmente, la membrana de reacción está hecha de un polímero, tal como nitrocelulosa, poli(fluoruro de vinilideno), nailon o poliétersulfona. La nitrocelulosa es con creces la opción más adecuada para la membrana de reacción. Las membranas de nitrocelulosa unen proteínas (tales como anticuerpos o proteínas de unión a biotina) electrostáticamente a través de la interacción del dipolo fuerte de los ésteres de nitrato con dipolos fuertes de los enlaces peptídicos dentro de la proteína.
Las almohadillas y en particular la membrana de reacción se pueden proteger por una cinta protectora. La cinta protectora debe ser transparente al menos en el área de las líneas de prueba y de control.
El “reactivo de captura” (también llamado “molécula de biorreconocimiento” en el presente documento) en el presente documento se refiere a moléculas que son capaces de reconocer específicamente el péptido diana o en el caso de la región de control, el péptido de control. Lo más comúnmente, es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, tal como un fragmento Fab. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales.
El “primer reactivo de captura” es específico del péptido diana (independiente de si está libre en la muestra (es decir, el analito sin marcar) o conjugado con la partícula (es decir, el péptido diana que compite “marcado”). El “segundo reactivo de captura” opcional se une al conjugado de control (péptido, por ejemplo neutravidina como molécula de captura contra un péptido de control biotinilado, tal como BSA), es decir, es un control positivo.
El término “analito” en el presente documento se refiere a la molécula diana que va a detectarse o medirse en la muestra. Es un péptido, tal como una proteína o un oligopéptido más corto. El péptido tiene al menos un epítope que puede ser unido específicamente por el primer reactivo de captura.
La “muestra” puede ser una muestra biológica, una muestra medioambiental o una muestra de alimento o similares. Muestras biológicas, tales como líquidos corporales, como orina, sangre completa, saliva, sudor, plasma o suero son las muestras más comunes. La orina es la muestra típica en el presente documento. En el caso de una muestra de sangre, el dispositivo puede comprender una matriz de filtración para separar glóbulos sanguíneos de suero o plasma.
La muestra se puede diluir con un tampón de dilución antes de la adición a la almohadilla de muestra. Una dilución típica es 1:2 (muestra:tampón de dilución). Los tampones de dilución típicos pueden comprender, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS), BSA y/o un tensioactivo no iónico, tal como Triton™ X-100.
La “partícula” del conjugado según la invención sirve de marca detectable (por ejemplo, marca coloreada) del péptido diana que compite. En particular, la partícula es una nanopartícula de oro coloidal. Las nanopartículas de oro coloidal son particularmente adecuadas en el contexto de la presente invención. Dichas nanopartículas de oro están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.
Normalmente, la partícula en el contexto de la presente invención es esencialmente esférica y tiene un diámetro de desde 10 hasta 100 nm, ventajosamente 20 a 60 nm, lo más ventajosamente 40 nm. Las nanopartículas de oro de 40 nm de diámetro son las más ventajosas.
La “proteína de unión a biotina” en el contexto de la presente invención se puede seleccionar del grupo que consiste en avidina, estreptavidina y avidina desglucosilada. La avidina desglucosilada se conoce como neutravidina, que también es la proteína de unión a biotina más adecuada en el presente documento. Estas proteínas de unión a biotina están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Thermo Fisher Scientific.
El péptido diana y el péptido de control a conjugar con partículas de oro se puede biotinilar usando reactivos de biotinilación convencionales (por ejemplo, una biotina-éster de n-hidroxisuccinimida (biotina-NHS)) que están comercialmente disponibles (por ejemplo, de Thermo Fisher Scientific).
Durante la producción del conjugado de péptido diana, las nanopartículas de oro se conjugan completamente con la proteína de unión a biotina, es decir, la superficie de la partícula se satura con la proteína de unión a biotina. Se puede añadir albúmina de suero bovino (BSA) para bloquear interacciones no específicas. Por tanto, la partícula puede comprender además albúmina de suero bovino (BSA) sobre su superficie. Las proteínas de unión a biotina, tales como neutravidina, son normalmente capaces de unir cuatro moléculas de biotina. Esta capacidad se puede usar para conjugar péptido diana biotinilado indirectamente con las partículas y ajustar la carga (es decir, recubrimiento) de las partículas con el péptido diana. Después de añadir el péptido diana biotinilado al complejo de partícula y proteína de unión a biotina, se puede añadir opcionalmente biotina libre a la disolución para saturar los sitios de unión a biotina libres de la proteína de unión a biotina.
Los presentes inventores han descubierto que una carga (recubrimiento) submáxima de las partículas con el péptido diana biotinilado conduce a los mejores resultados en términos de sensibilidad e intervalo dinámico. Por lo tanto, es adecuado en el presente documento que la carga (recubrimiento) de la partícula con el péptido diana sea desde aproximadamente el 20 % hasta aproximadamente el 55 % de la capacidad de carga (recubrimiento) máxima de la partícula, normalmente desde aproximadamente el 25 % hasta aproximadamente el 50 % de la capacidad de carga (recubrimiento) máxima de la partícula, más normalmente desde aproximadamente el 25 % hasta aproximadamente el 45 % de la capacidad de carga (recubrimiento) máxima de la partícula, incluso más normalmente desde aproximadamente el 25 % hasta aproximadamente el 40 % de la capacidad de carga (recubrimiento) máxima de la partícula, más adecuadamente aproximadamente del 25 % a aproximadamente al 35 % de la capacidad de carga (recubrimiento) máxima de la partícula y lo más adecuadamente aproximadamente el 30 % de la capacidad de carga (recubrimiento) máxima de la partícula. Como las proteínas de unión a biotina, tales como neutravidina, se pueden unir normalmente a un máximo de cuatro moléculas de biotina, la carga de las partículas con el péptido diana en términos de números absolutos se puede calcular basándose en los porcentajes anteriores. Por ejemplo, una disolución de 1 ml de nanopartículas de oro de 40 nm de DO 1 (a 526 nm) tiene una capacidad de unión máxima de aproximadamente 4,17*10-11 moles de neutravidina sobre su superficie. Esto corresponde a aproximadamente 1,67*10-10 moles de biotina (o péptido diana biotinilado) por ml de disolución de partículas de oro de 40 nm. Por lo tanto, una carga del 30 % con el péptido diana biotinilado correspondería, por ejemplo, a aproximadamente 5,2*10-11 moles de péptido diana biotinilado por ml de disolución de partículas de oro de 40 nm (DO 1 a 526 nm).
Los reactivos, tales como los conjugados diana y opcionalmente los conjugados de control, así como las moléculas de captura, se pueden dispensar a las almohadillas o a la membrana de reacción, por ejemplo, usando plataformas dispensadoras adecuadas. Por ejemplo, los conjugados se pueden pulverizar a la almohadilla de conjugado y entonces
se deja que las almohadillas se sequen dando como resultado un conjugado secado pero movilizable sobre la almohadilla de conjugado.
La presente invención también se refiere a un método para la detección de un péptido diana en una muestra líquida, que comprende las etapas de
(a) aplicar dicha muestra líquida a la almohadilla de muestra del dispositivo según la invención, para permitir el flujo de la muestra de la almohadilla de muestra a través de la almohadilla de conjugado a la membrana de reacción,
(b) detectar la presencia o cantidad de conjugado en la región de captura, y
(c) opcionalmente detectar la presencia o cantidad de conjugado de control en la región de control,
en donde la presencia o ausencia o la cantidad detectada de conjugado en la región de captura es indicativa de la ausencia o presencia o la cantidad de péptido diana, respectivamente, en la muestra líquida.
El método es particularmente útil para la cuantificación del péptido diana en la muestra.
Por lo tanto, cuando se realiza el método de la presente invención y/o cuando se usa el dispositivo de la invención para detectar o cuantificar un péptido diana, la muestra (o la muestra diluida según lo requiera el caso) se añade a la almohadilla de muestra (por ejemplo, a través del puerto de muestra en caso de usar una carcasa). La muestra se transportará entonces a través de la almohadilla de conjugado a la membrana de reacción. Sobre la almohadilla de conjugado, los conjugados se solubilizarán y transportarán a la membrana de reacción. La intensidad de la línea de prueba depende de la concentración de analito (es decir, el péptido diana) en la muestra original. Cuanto menor sea la concentración en la muestra, más intensa será la intensidad debido a la competición entre el péptido diana conjugado y el péptido diana en la muestra. La Figura 2 adjunta ilustra el ensayo.
La intensidad en la línea de prueba (y en la línea de control según lo requiera el caso) se puede detectar usando un lector apropiado que está comercialmente disponible, por ejemplo, de opTricon GmbH, Berlín, Alemania. El dispositivo de la invención se puede adaptar para lectores específicos, por ejemplo, teniendo una forma y dimensión particulares.
Además, la invención se refiere a un kit para la detección de un péptido diana en una muestra líquida que comprende un dispositivo de la invención. El kit puede comprender además uno o más recipientes que comprenden tampón de dilución para diluir la muestra antes de la adición al dispositivo y/o pipetas para añadir la muestra o muestra diluida a la almohadilla de muestra. El kit también puede comprender instrucciones para su uso.
El dispositivo de la presente invención o el kit de la presente invención se puede usar para la cuantificación de un péptido diana en una muestra líquida. Dependiendo de la naturaleza del péptido diana, el dispositivo y los kits se pueden usar en el diagnóstico o pronóstico de una enfermedad o afección. Por ejemplo, biomarcadores (por ejemplo, hormonas peptídicas, proteínas marcadoras) que son indicativas de una enfermedad, afección o pronóstico particular se pueden determinar en el contexto de la presente invención. En particular, el dispositivo, kit y método de la invención se puede usar para el diagnóstico, pronóstico, evaluación del riesgo, estratificación del riesgo, monitorización y/o control de la terapia de un sujeto. El término “sujeto” en el presente documento se refiere a un animal humano o no humano, tal como un mamífero, especialmente un humano. El sujeto es lo más adecuadamente un paciente. El término “paciente”, como se usa en el presente documento, se refiere a un animal humano o no humano (normalmente un humano) que está recibiendo cuidado médico o que debe recibir cuidado médico debido a una enfermedad o afección médica. Esto incluye personas con enfermedades no definidas que están siendo investigadas para signos de patología. Por lo tanto, los métodos y ensayos descritos en el presente documento son aplicables a tanto enfermedad humana como veterinaria.
“Diagnóstico”, en el contexto de la presente invención, se refiere al reconocimiento y la detección (precoz) de una enfermedad o estado clínico en un sujeto y también puede comprender diagnóstico diferencial. También la evaluación de la intensidad de una enfermedad o estado clínico puede estar englobada en ciertas realizaciones por el término “diagnóstico”.
“Pronóstico” se refiere a la predicción de un desenlace o un riesgo específico de un sujeto que padece una enfermedad o estado clínico particular. Esto puede incluir una estimación de la probabilidad de recuperación o la probabilidad de un desenlace adverso para dicho sujeto.
“Monitorizar” o “monitorización de la terapia” se refiere a hacer un seguimiento de una enfermedad, trastorno, complicación o riesgo ya diagnosticado, por ejemplo, para analizar la progresión de la enfermedad o la influencia de un tratamiento particular sobre la progresión de la enfermedad o trastorno. En la presente invención, el término “estratificación del riesgo” se refiere a la agrupación de sujetos en diferentes grupos de riesgo según su pronóstico posterior. La estratificación del riesgo también se refiere a la estratificación para aplicar medidas preventivas y/o terapéuticas.
El término “atención al paciente” en el contexto de la presente invención se refiere a:
• la decisión de ingreso en el hospital o unidad de cuidados intensivos,
• la decisión de reubicación del paciente en un hospital especializado o una unidad del hospital especializado,
• la evaluación de un alta temprana de la unidad de cuidados intensivos u hospital, y/o
• la asignación de recursos (por ejemplo, personal médico y/o de enfermería, diagnósticos, terapéuticos, cirugía).
El término “evaluación de la gravedad de la enfermedad” se refiere a la evaluación del estado de la enfermedad en un paciente que incluye la progresión de la enfermedad, la probabilidad de acontecimientos adversos, la probabilidad de altos costes ambulatorios y la probabilidad de hospitalización prolongada o rehabilitación.
Por lo tanto, la presente invención en un aspecto se refiere a un método de diagnóstico o pronóstico de una enfermedad o afección, que comprende las etapas de
(a) aplicar dicha muestra líquida a la almohadilla de muestra del dispositivo según la invención, para permitir el flujo de la muestra de la almohadilla de muestra a través de la almohadilla de conjugado a la membrana de reacción,
(b) detectar la presencia o cantidad de conjugado en la región de captura, y
(c) opcionalmente detectar la presencia o cantidad de conjugado de control en la región de control, en donde la presencia o ausencia o la cantidad detectada de conjugado en la región de captura es indicativa de la ausencia o presencia o la cantidad de péptido diana, respectivamente, en la muestra líquida, y
en donde la ausencia o presencia o la cantidad de péptido diana en la muestra líquida es indicativa del diagnóstico o pronóstico de dicha enfermedad o afección.
Dada la limitación de las investigaciones actualmente disponibles para medir la destrucción de osteoartritis (por ejemplo, la evaluación radiográfica del estrechamiento del espacio articular es solo un índice indirecto de la pérdida de cartílago), los marcadores biológicos para la degradación de cartílago son muy apreciados. Por ejemplo, el péptido diana puede ser telopéptido reticulado carboxiterminal de colágeno de tipo II (CTX-II), que es un marcador de la degradación del cartílago y del diagnóstico de enfermedades articulares, tales como osteoartritis (OA) y artritis reumatoide (AR), particularmente OA.
El colágeno de tipo II es el colágeno predominante en el cartílago y es degradado por enzimas proteolíticas secretadas por el condrocito y sinoviocitos. Los péptidos de CTX-II, liberados de la acción de estas enzimas, se eliminan en la orina. El CTX-II en orina es, por lo tanto, un marcado sensible bioquímico de la degradación temprana de cartílago normalmente para sujetos que tienen osteoartritis o artritis reumatoide (Garnero et al., 2000; loc. cit.).
Por tanto, el dispositivo se puede usar para detectar degradación de cartílago en un sujeto (normalmente un paciente que padece osteoartritis, particularmente de la rodilla o la cadera, más particularmente osteoartritis de rodilla) y, dependiendo de la presencia o grado de enfermedad del cartílago, se puede tomar una decisión de tratar el sujeto con una cierta medicación.
Un medicamento adecuado para el tratamiento de enfermedades asociadas a la degradación del cartílago, particularmente osteoartritis (por ejemplo, de la rodilla o la cadera, normalmente osteoartritis de rodilla) y especialmente el tratamiento de dolor asociado a osteoartritis son viscosuplementos que comprenden ácido hialurónico (también denominado hialuronano (HA)) o sales farmacéuticamente aceptables o derivados del mismo, tales como hialuronano de sodio. El HA se modifica frecuentemente, por ejemplo, por reticulación. Los viscosuplementos basados en HA se administran normalmente por vía intrarticular, por ejemplo, inyectados en el espacio intrarticular de una articulación de la rodilla. Un hialuronano particular es “hylan G-F 20” que está comprendido en productos tales como Synvisc® y Synvisc-One® (Sanofi). Dichos viscosuplementos y dosis y esquemas de administración correspondientes se describen, por ejemplo, en los documentos de patente US 7.931.030 B1 y WO 2006/073835 A2.
El HA puede ser de origen animal, por ejemplo, derivado de crestas de gallo o cordones umbilicales, u origen no animal, por ejemplo, fermentado bacterianamente. El HA fermentado bacterianamente se puede producir como se describe en, por ejemplo, Cooney et al. (1999) Biotechnol. Prog., 15:898-910. El HA fermentado bacterianamente también está disponible comercialmente (por ejemplo, Shiseido, Japón; Sigma-Aldrich, EE. UU.). Como se ha establecido anteriormente, el HA se puede derivatizar (por ejemplo, reticular o modificar o estabilizar de otro modo) o no derivatizar. Los ejemplos de reticulantes incluyen aldehído, epóxido, poliazirilo, glicidil éter (por ejemplo, diglicidil éter de 1,4-butanodiol) y divinil sulfona.
Por tanto, en el contexto de la presente invención, los términos “ácido hialurónico”, “hialuronano” y “HA” también engloban sales farmacéuticamente aceptables o derivados de ácido hialurónico y en particular “hylan G-F 20” y más en particular los productos Synvisc® y Synvisc-One® (Sanofi).
En el presente documento se describe, pero no es parte de la invención, un método de tratamiento de dolor asociado a una enfermedad del cartílago (es decir, que alivia el dolor asociado a una enfermedad del cartílago), particularmente con osteoartritis, más en particular con osteoartritis de la cadera o la rodilla y especialmente con osteoartritis de la rodilla, en un sujeto que comprende determinar la concentración de CTX-II en una muestra de orina de dicho sujeto usando el dispositivo de la presente invención, en donde dependiendo de la concentración de CTX-II en la muestra de orina, el paciente se trata con ácido hialurónico, tal como hylan G-F 20, por ejemplo Synvisc® o Synvisc-One®, o no, o en donde la pauta de tratamiento con ácido hialurónico, tal como hylan G-F 20, por ejemplo Synvisc® o Synvisc-One®, se determina basándose en la concentración de CTX-II en dicha muestra. Los medicamentos que contienen ácido hialurónico, tales como hylan G-F 20, por ejemplo Synvisc® o Synvisc-One®, se inyectan normalmente en la articulación afectada, particularmente la rodilla o la cadera. Similarmente, en el presente documento se describe, pero no es parte de la invención, ácido hialurónico, tal como hylan G-F 20, por ejemplo Synvisc® o Synvisc-One®, para su uso en el tratamiento de dolor asociado a enfermedad del cartílago, particularmente con osteoartritis, más en particular con osteoartritis de la cadera o la rodilla y especialmente con osteoartritis de la rodilla, en un sujeto, en donde la concentración de CTX-II se determina en una muestra de orina de dicho sujeto usando el dispositivo de la presente invención, y en donde dependiendo de la concentración de CTX-II en la muestra de orina, el paciente se trata con ácido hialurónico, tal como hylan G-F 20, por ejemplo Synvisc® o Synvisc-One®, o no, o en donde la pauta de tratamiento con ácido hialurónico, tal como hylan G-F 20, por ejemplo Synvisc® o Synvisc-One®, se determina basándose en la concentración de CTX-II en dicha muestra.
Por lo tanto, en el presente documento se describe, pero no es parte de la invención, un método de diagnóstico o pronóstico de una enfermedad o afección, que comprende la etapa adicional de
(d) prescribir a dicho sujeto un viscosuplemento que comprende ácido hialurónico o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado del mismo, tal como hylan G-F 20, si se detecta la presencia de CTX-II por encima de un umbral predeterminado en la muestra.
También se describe en el presente documento, pero no es parte de la invención, un método de diagnóstico o pronóstico de una enfermedad o afección, que comprende la etapa adicional de
(d) administrar a dicho sujeto un viscosuplemento que comprende ácido hialurónico o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado del mismo, tal como hylan G-F 20, si se detecta la presencia de CTX-II por encima de un umbral predeterminado en la muestra.
Por consiguiente, en el presente documento se describe, pero no es parte de la invención, un viscosuplemento que comprende ácido hialurónico o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado del mismo, tal como hylan G-F 20, para su uso en el tratamiento de dolor asociado a una enfermedad del cartílago, tal como osteoartritis, en un sujeto, en donde la concentración de CTX-II se determina en una muestra de orina de dicho sujeto usando el dispositivo de ensayo de flujo lateral según la invención, y en donde, dependiendo de la concentración de CTX-II en la muestra de orina, el viscosuplemento se administra a dicho sujeto.
En otras palabras, en el presente documento se describe, pero no es parte de la invención, una composición farmacéutica que comprende ácido hialurónico o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado del mismo, tal como hylan G-F 20, para su uso en el tratamiento de dolor asociado a una enfermedad del cartílago, tal como osteoartritis en un sujeto, en donde la concentración de CTX-II se determina en una muestra de orina de dicho sujeto usando el dispositivo de ensayo de flujo lateral según la invención, y en donde dependiendo de la concentración de CTX-II en la muestra de orina, la composición farmacéutica se administra a dicho sujeto.
Por consiguiente, y como se explica en el presente documento anteriormente, en el presente documento se describe, pero no es parte de la invención, un método de tratamiento de dolor asociado a una enfermedad del cartílago, tal como osteoartritis en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto un viscosuplemento que comprende ácido hialurónico o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado del mismo, tal como hylan G-F 20 (por ejemplo Synvisc® o Synvisc-One®), si se detecta la presencia de CTX-II por encima de un umbral predeterminado en una muestra, particularmente una muestra de orina, de dicho sujeto con un dispositivo de ensayo de flujo lateral según la presente invención.
La presente invención en un aspecto se refiere a un dispositivo de ensayo lateral para la detección de CTX-II en una muestra de orina, que comprende:
(a) un soporte sólido,
(b) una almohadilla de muestra para recibir inicialmente y pretratar opcionalmente la muestra en un primer extremo del soporte sólido,
(c) una almohadilla absorbente en un segundo extremo del soporte sólido,
(d) una almohadilla de conjugado que comprende en un estado seco un conjugado movilizable de una nanopartícula de oro y CTX-II, en donde el conjugado de CTX-II con dicha partícula se biotinila y la partícula comprende sobre su superficie una proteína de unión a biotina (particularmente neutravidina),
(e) una membrana de reacción que comprende,
(i) una región de captura que comprende un primer reactivo de captura inmovilizado (particularmente un anticuerpo) contra el péptido diana, y
(ii) opcionalmente una región de control que comprende un segundo reactivo de captura inmovilizado (particularmente neutravidina) contra un conjugado de control (particularmente BSA biotinilado),
en donde la almohadilla de muestra, la almohadilla de conjugado, la membrana de reacción y la almohadilla absorbente están montadas en el soporte sólido para permitir el flujo capilar de la almohadilla de muestra a la membrana de reacción a través de la almohadilla de conjugado, y en donde la carga (recubrimiento) de la partícula (particularmente una nanopartícula de oro) con el CTX-II es desde aproximadamente el 20 % hasta aproximadamente el 55 % de la capacidad de carga (recubrimiento) máxima de la partícula, normalmente desde aproximadamente el 25 % hasta aproximadamente el 50 % de la capacidad de carga (recubrimiento) máxima de la partícula, más normalmente desde aproximadamente el 25 % hasta aproximadamente el 45 % de la capacidad de carga (recubrimiento) máxima de la partícula, incluso más normalmente desde aproximadamente el 25 % hasta aproximadamente el 40 % de la capacidad de carga (recubrimiento) máxima de la partícula, más adecuadamente aproximadamente del 25 % a aproximadamente al 35 % de la capacidad de carga (recubrimiento) máxima de la partícula y lo más adecuadamente aproximadamente el 30 % de la capacidad de carga (recubrimiento) máxima de la partícula.
Los anticuerpos policlonales contra CTX-II se pueden producir inmunizando un animal, tal como un conejo. Los anticuerpos se pueden purificar entonces, por ejemplo, del suero del animal, por ejemplo, usando cromatografía de afinidad. Los métodos para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales se conocen bien en la técnica.
Cuando se determina la concentración de un péptido diana en una muestra de orina, la concentración de creatinina en dicha muestra se puede determinar además como un calibrador, puesto que la creatinina urinaria es (en ausencia de enfermedades renales) relativamente constante en un individuo. Para estos fines, el dispositivo puede comprender además un área de reacción (“área de reacción de creatinina”) para un ensayo colorimétrico o fluorimétrico para la determinación de creatinina. Una parte de la muestra (o la muestra diluida según lo requiera el caso) se puede añadir al ensayo de creatinina para determinar la concentración de creatinina. En particular, esto se aplica al dispositivo y método para la detección de CTX-II según la presente invención.
El ensayo de creatinina puede ser, por ejemplo, un ensayo de flujo lateral en formato de tira que está dispuesta en el dispositivo en paralelo al inmunoensayo de flujo lateral de la presente invención. Por tanto, el ensayo de creatinina puede comprender una almohadilla de muestra y un área de reacción (similar a la membrana de reacción del inmunoensayo de flujo lateral).
El ensayo de creatinina es normalmente una prueba “química seca”, es decir, el ensayo comprende un colorante indicador movilizable (o una composición colorante) en estado seco, por ejemplo, secada sobre una almohadilla de muestra adicional. Una composición de colorante típica para la detección de creatinina comprende un colorante oxidable (tal como quinolina), iones Cu2+ e hidroxiperóxido. Cuando la creatinina está presente en la muestra, se formará un complejo entre los iones cúpricos y la creatinina. Este complejo Cu2+-creatinina oxidará el colorante, particularmente la quinolina, en presencia del hidroxiperóxido. La oxidación del colorante da como resultado un cambio en el color que se puede detectar usando un lector. Ensayos adecuados para la detección de creatinina se describen, por ejemplo, en los documentos de patente US 5.374.561 y US 6.001.656.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Producción del conjugado de CTX-II-neutravidina-oro
Todas las etapas de incubación (acoplamiento, bloqueo, saturación, etc.) se realizan en un agitador de volteo a temperatura ambiente.
Etapa 1 - Conjugado de neutravidina-oro:
Se acoplaron 7,5 μg de neutravidina por 1 ml de disolución de oro coloidal de 40 nm de DO526 nm 1 en tampón borato de sodio 5 mM durante 2 h. Posteriormente, la disolución se bloqueó con 1 % de BSA durante 30 min. Después de la centrifugación (incluyendo una etapa de lavado con 1 % de BSA), el sedimento de conjugado se resuspendió en tampón borato 2 mM con 1 % de BSA y se filtró en 0,22 μm. El resultado fue un conjugado de neutravidina-oro. Se supone que el conjugado de neutravidina-oro tiene una carga de 2,5 μg de neutravidina por ml de partículas de oro. Teniendo en cuenta el peso molecular de la neutravidina (60000 g/mol), esto corresponde a una carga molar de 4,17*10-11 moles de neutravidina por ml de disolución de oro. Puesto que una molécula de neutravidina tiene cuatro sitios de unión para la biotina, teóricamente 1,67*10-10 moles de moléculas de biotina (y, por consiguiente, el péptido diana, tal como CTX-II) se pueden unir en el conjugado de neutravidina-oro por ml de disolución. Esto corresponde a una carga del 100 % en el presente documento.
Se usan 7,5 μg de oro para el acoplamiento para trabajar en exceso de oro y dar como resultado carga reproducible.
Etapa 2 - Conjugado de CTX-II-neutravidina-oro:
Se acoplaron 5,2*10-11 moles de CTX-II biotinilado por ml de disolución de conjugado de neutravidina-oro de DO526 nm 1 durante 1 h en tampón borato 2 mM con 1 % de BSA. Posteriormente, se saturaron los sitios de unión a biotina libres durante 1 h con 2,5*10-4 moles de biotina por ml de conjugado de neutravidina-oro DO526 nm 1. Después de la centrifugación, el sedimento de conjugado se resuspendió en tampón de resuspensión y se filtró en 0,22 μm. El resultado fue un conjugado de CTX-II-neutravidina-oro.
1 ml de neutravidina-conjugado de DO526 nm 1 puede unir teóricamente 1,67*10-10 moles de biotina. El antígeno de CTX-II se biotiniló sintéticamente, tal que 1 mol de CTX-II se uniera a 1 mol de biotina. Por tanto, en teoría, 1,67*10-10 moles de CTX-II biotinilado se unen a 1 ml de conjugado de neutravidina-oro, que corresponde a una carga del 100 % en el presente documento. Añadiendo solo 5,2*10-11 moles de CTX-II biotinilado a 1 ml de conjugado de neutravidinaoro, solo se poblarán aproximadamente el 30 % de los sitios de unión; por lo tanto, esto se denomina una carga del 30 %. En este caso, el 70 % restante de los sitios de unión se saturará con biotina añadida en exceso.
Ejemplo 2 : Inmunoensayo de CTX-II
Principio del ensayo
El dispositivo de flujo lateral (LFD) de CTX-II es un inmunoensayo competitivo (véanse las Figuras 1 y 2) con los siguientes componentes:
- Muestra: orina humana con CTX-II como analito (diluida 1:2 con PBS que comprende Triton™ X-100;
- Almohadilla de conjugado: conjugado de nanopartícula de oro coloidal y CTX-II y conjugado de control de nanopartícula de oro coloidal y BSA biotinilado
- Línea de prueba: anticuerpo anti-CTX-II.
El CTX-II en la muestra y el conjugado de oro-CTX-II compiten por la unión a la línea de prueba (anticuerpos anti-CTX-II). Cuando el conjugado de oro se une a la línea de prueba, la línea de prueba aparece roja (en caso de concentraciones de CTX-II relativamente bajas en la muestra). Las partículas de oro sirven de marca coloreada. Cuanto más CTX-II esté en la muestra, menor es la intensidad de la línea de prueba. La intensidad de color de la línea de prueba se lee usando un lector y se convierte en una concentración usando una curva de calibración previamente registrada. La línea de control (control positivo) sirve para validar la prueba.
Las nanopartículas de oro se conjugan completamente con neutravidina (y BSA para bloquear interacciones no específicas) para asegurar la reproducibilidad y estabilidad. La neutravidina es capaz de unirse a cuatro moléculas de biotina. Esta capacidad se usa para conjugar CTX-II biotinilado indirectamente con las nanopartículas de oro y ajustar la carga de CTX-II de las nanopartículas de oro (véase la Figura 3).
Materiales y métodos
Se ensambló el conjugado de oro-CTX-II del siguiente modo: se conjugaron partículas de oro de 40 nm con neutravidina (5 μg de neutravidina por ml de suspensión de nanopartículas de oro DO 1 (Sigma-Aldrich o BBI Solutions)), luego se bloqueó con albúmina de suero bovino (BSA). (DO: densidad óptica (DO 1 = densidad óptica de 1)). Entonces se cargó la neutravidina conjugada con CTX-II biotinilado. Después de la incubación con CTX-II, se añadió biotina libre a la disolución para saturar los sitios de unión a biotina libres de la neutravidina.
Para calcular la cantidad de CTX-II para la carga, se supuso que 2,5 μg de neutravidina se unían en realidad por ml de suspensión de partículas de oro y 1 mol de neutravidina se unía a 4 moles de biotina.
Resultados (véanse también las Figuras 4 y 5):
a) Una carga del 100 % (CTX-II en exceso para la conjugación):
- baja intensidad de la línea de prueba a una concentración de CTX-II en la muestra de 0 μg/l
- reducción no visualmente reconocible de la intensidad de la línea de prueba a una concentración de CTX-II en la muestra de 10 μg/l (la competición solo fue detectable visualmente a 100 μg/l de CTX-II).
- Por tanto, la carga de CTX-II se debe disminuir para la sensibilidad.
b) Una carga del 50 %:
- sensibilidad similar al 100 % de carga pero línea de prueba a 0 μg/l de CTX-II más intensa.
c) Una carga del 30%:
- fuerte intensidad de la línea de prueba a 0 μg/l de CTX-II;
- reducción visualmente reconocible de la intensidad de la línea de prueba a 10 μg/l de CTX-II.
d) Una carga del 10 %:
- fuerte intensidad de la línea de prueba; reducción no visualmente detectable en la intensidad debido a CTX-II en la muestra.
Conclusión:
El acoplamiento indirecto (por ejemplo, por neutravidina) permite en general el ajuste de la carga de la partícula con CTX-II para optimizar el ensayo y, en particular, reducir la carga hasta la carga óptima del 30 % en el presente caso. A esta carga, la tinción de la línea de prueba es pronunciada a bajas concentraciones de CTX-II en la muestra y es baja a altas concentraciones de CTX-II. La inspección visual (Fig. 4) se verificó usando un lector (Fig. 5). Dicha optimización permite una alta sensibilidad con respecto a un amplio intervalo de concentración que no es posible usando los métodos del estado de la técnica.
Una carga del 100 % requiere la reducción de la concentración de conjugado global en el ensayo de forma que la intensidad de la línea de prueba era muy débil, incluso a bajas concentraciones de CTX-II y la intensidad de la señal estaba fuera del intervalo lineal del lector.
También se probó una configuración inversa (es decir, un ensayo no competitivo; anticuerpos anti-CTX-II conjugados de las nanopartículas de oro, CTX-II en la línea de prueba). Sin embargo, produjo una sensibilidad insuficiente, puesto que se requirió una carga del 100 %. Además, esta configuración inversa es más cara que la configuración competitiva.
Claims (15)
1. Un dispositivo de ensayo de flujo lateral para la detección de un péptido diana en una muestra líquida, en donde el péptido diana es telopéptido reticulado carboxiterminal de colágeno de tipo II (CTX- II), comprendiendo el dispositivo: (a) un soporte sólido,
(b) una almohadilla de muestra para recibir inicialmente y pretratar opcionalmente la muestra en un primer extremo del soporte sólido,
(c) una almohadilla absorbente en un segundo extremo del soporte sólido,
(d) una almohadilla de conjugado que comprende en un estado seco un conjugado movilizable de una partícula y el péptido diana,
en donde la partícula es una nanopartícula de oro coloidal, y
en donde el péptido diana conjugado con dicha partícula se biotinila y la partícula comprende sobre su superficie una proteína de unión a biotina,
(e) una membrana de reacción de péptido diana que comprende
(i) una región de captura que comprende un primer reactivo de captura inmovilizado contra el péptido diana, y
(ii) opcionalmente una región de control que comprende un segundo reactivo de captura inmovilizado contra un conjugado de control de partículas,
en donde la almohadilla de muestra, la almohadilla de conjugado, la membrana de reacción y la almohadilla absorbente están montadas en el soporte sólido para permitir el flujo capilar de la almohadilla de muestra a la membrana de reacción a través de la almohadilla de conjugado, y en donde la carga de la partícula con el péptido diana es desde aproximadamente el 20 % hasta aproximadamente el 55 % de la capacidad de carga máxima de la partícula.
2. El dispositivo de ensayo de flujo lateral de la reivindicación 1, en donde el dispositivo es un dispositivo de tira, particularmente un dispositivo de tira inmunocromatográfico.
3. El dispositivo de ensayo de flujo lateral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la partícula es esencialmente esférica y tiene un diámetro de desde 10 hasta 100 nm, ventajosamente 20 a 60 nm, lo más ventajosamente 40 nm.
4. El dispositivo de ensayo de flujo lateral de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteína de unión a biotina se selecciona del grupo que consiste en avidina, estreptavidina y avidina desglucosilada.
5. El dispositivo de ensayo de flujo lateral de la reivindicación 4, en donde la avidina desglucosilada es neutravidina.
6. El dispositivo de ensayo de flujo lateral de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la carga de la partícula con el péptido diana es desde aproximadamente el 20 % hasta aproximadamente el 35 % de la capacidad de carga máxima de la partícula.
7. El dispositivo de ensayo de flujo lateral de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha partícula comprende además albúmina de suero bovino (BSA) sobre su superficie.
8. El dispositivo de ensayo de flujo lateral de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la muestra líquida es un líquido corporal seleccionado del grupo que consiste en orina, suero del plasma, sangre completa, sudor y saliva, normalmente orina.
9. Un método para la detección, ventajosamente la detección cuantitativa, de un péptido diana en una muestra líquida, en donde el péptido diana es telopéptido reticulado carboxiterminal de colágeno de tipo II (CTX-II), comprendiendo el método las etapas de
(a) aplicar dicha muestra líquida a la almohadilla de muestra del dispositivo según las reivindicaciones 1 a 8, para permitir el flujo de la muestra de la almohadilla de muestra a través de la almohadilla de conjugado a la membrana de reacción,
(b) detectar la presencia o cantidad de conjugado en la región de captura, y
(c) opcionalmente detectar la presencia o cantidad de conjugado de control en la región de control, en donde la presencia o ausencia o la cantidad detectada de conjugado en la región de captura es indicativa de la ausencia o presencia o la cantidad de péptido diana, respectivamente, en la muestra líquida.
10. Uso in vitro del dispositivo según las reivindicaciones 1 a 8 para la cuantificación de un péptido diana en una muestra líquida, en donde el péptido diana es telopéptido reticulado carboxiterminal de colágeno de tipo II (CTX-II).
11. Uso in vitro del dispositivo según las reivindicaciones 1 a 8 para el diagnóstico o pronóstico de una enfermedad o afección.
12. Uso in vitro del dispositivo según las reivindicaciones 1 a 8 para la determinación de degradación de cartílago en un sujeto, normalmente un sujeto que tiene osteoartritis.
13. Un método de diagnóstico o pronóstico de una enfermedad o afección, que comprende las etapas de
(a) aplicar dicha muestra líquida o muestra líquida diluida a la almohadilla de muestra del dispositivo según las reivindicaciones 1 a 8, para permitir el flujo de la muestra de la almohadilla de muestra a través de la almohadilla de conjugado a la membrana de reacción,
(b) detectar la presencia o cantidad de conjugado de una partícula y un péptido diana, en la región de captura, en donde la partícula es una nanopartícula de oro coloidal y el péptido diana es telopéptido reticulado carboxiterminal de colágeno de tipo II (CTX-II), y
(c) opcionalmente detectar la presencia o cantidad de conjugado de control en la región de control, en donde la presencia o ausencia o la cantidad detectada de conjugado en la región de captura es indicativa de la ausencia o presencia o la cantidad de péptido diana, respectivamente, en la muestra líquida, y
en donde la ausencia o presencia o la cantidad de péptido diana en la muestra líquida es indicativa de diagnóstico o pronóstico de dicha enfermedad o afección.
14. El método según la reivindicación 13, en donde la enfermedad es osteoartritis.
15. El método según la reivindicación 14, que comprende la etapa adicional de
(d) prescribir a dicho sujeto un viscosuplemento que comprende ácido hialurónico o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado del mismo, tal como hylan G-F 20, si se detecta la presencia de CTX-II por encima de un umbral predeterminado o la cantidad de CTX-II en la muestra está por encima de un umbral predeterminado en la muestra.
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