CN109324191A - 间接标记纳米颗粒的抗体检测捕获法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种纳米颗粒的抗体检测捕获法,纳米颗粒类标记物与标记抗原之间的标记是通过抗原上的标签和标记在纳米颗粒标记物上的可特异性识别该标签的配体相结合来完成的间接标记,其中的标记抗原为基因工程重组抗原。采用此种间接标记的方式,可以显著提高纳米颗粒的抗体检测捕获法的灵敏度并改善特异性。
Description
本申请是申请号为200810216401.5,申请日为2008年09月24日,发明创造名称为“间接标记纳米颗粒的抗体检测捕获法及其试剂盒”的分案申请。
技术领域
本发明涉及免疫检测领域,具体地说,是涉及一种间接标记纳米颗粒的抗体检测捕获法,以及采用此方法制备的免疫检测试剂盒。
背景技术
对于如人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV,CMV)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)、甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)等传染病及其他病原体或微生物等的检测,有必要利用免疫学的方法进行检测其IgM。而现在较为广泛使用的几种方法是:放射免疫法、免疫荧光法、ELISA法等,但他们都存在不同程度的缺点和不足。
放射免疫法存在放射性污染,检测时间长,需要专业仪器设备及专业人员操作,无法实现单人份检测;免疫荧光法检测时间长,需要专业的设备及专业人员操作,容易受干扰物质干扰产生假阳性;酶联免疫吸附试验(ELISA)具有灵敏度高、特异性好的优势,已经成为很多项目检测的主流方法,但也存在检测时间长,需要专业的设备及专业人员操作等问题。而胶体金或乳胶免疫层析法等纳米颗粒法虽在准确率上相对较差,但其具有快捷、方便、操作简单、无需专业设备或专业人员操作、可实现家庭自检等优势,能对ELISA检测方法起到很好的补充作用,已经应用得越来越广泛。
纳米颗粒法以胶体金或乳胶免疫层析法为例,始于上世纪90年代,是以免疫学技术为基础,以胶体金为标记物,结合纳米材料标记技术,通过高分子材料的层析作用,对目的蛋白、激素、分泌物等进行检测的方法。从反应原理上,有双抗原夹心法、双抗体夹心法、间接法、捕获法等。
血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在,后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法,先将所有血清IgM(包括异性IgM和非特异性IgM)固定在固相上,在去除IgG后再测定特异性IgM。捕获法操作步骤如下:将抗人IgMμ链抗体连接在固相载体上,形成固相抗人IgMμ链抗体,加入稀释的血清标本和特异性抗原-标记物,最终形成“抗人IgMμ链抗体-目的IgM抗体-特异性抗原-标记物”的复合物,然后借助一定的手段将信号放大,得出最终的判定结果。捕获法是很多项目检测IgM的首选方法。
抗原-标记物的活性对捕获法检测的灵敏度有着决定性的影响,现有技术一般都是直接标记的方式,很多抗原在和标记物直接标记之后,活性很低,如下文所述。
公开号为CN1866019A的中国专利文献中曾提出一种“梅毒螺旋体抗原快速检测试剂及其制备方法”,该试剂采用的是直接标记的纳米颗粒双抗原夹心法,以及公开号为CN101021532A的中国专利文献中曾提出一种“联合检测特异性IgM、IgG抗体的胶体金层析条及其制备方法”,采用的也是直接标记的纳米颗粒双抗原夹心法,公开号为CN101013133A的中国专利文献中曾提出一种“检测特异性IgM抗体的胶体金层析条及其制备方法”,采用的是直接标记的纳米颗粒的抗体检测捕获法,这种方法是目前纳米颗粒捕获法的主流方法,采用的是标记物和标记抗原直接标记的方法,其存在的固有缺陷如下:
1.标记物为纳米颗粒时,理论上是抗原和纳米颗粒的物质的量比例(即标记比例)越低,标记复合物的灵敏度越高,当标记比例为理想状态的1:1时,标记复合物的灵敏度最高。但是,由于直接标记时,标记抗原用量过低会导致纳米颗粒发生沉淀,致使标记失败,因此直接标记的标记比例相对于间接标记无法降的更低,所以标记复合物灵敏度偏低。同时,直接标记时,标记比例相对较高,即抗原使用浓度也偏高,导致标记复合物特异性降低以及生产成本的升高;
2.标记物为纳米颗粒时,采用直接标记时,由于标记物的颗粒大小比标记抗原的体积大很多倍,使得标记抗原的活性表位受到不同程度的空间位阻、遮盖等不利影响,导致标记复合物灵敏度降低,间接标记由于相当于在纳米颗粒和标记抗原之间加了一个手臂——配体,所以对抗原表位的暴露更有好处;
3.由于标记抗原一般会含有一定量的杂蛋白,标记过程中杂蛋白也与目的蛋白一起标记到标记物上,从而导致标记复合物特异性降低;
4.直接标记的缓冲液、pH、离子强度等条件并不能保证是标记抗原的最佳活性条件,标记时的剧烈搅拌、离心、封闭等因素也容易对标记抗原的活性表位造成影响,导致最终检测的灵敏度降低。
在申请号为200610027230.2的中国专利文献中曾提出一种“小分子间接标记的双抗原夹心法测定丙型肝炎病毒总抗体”,该专利是在我们申请号为EP20050714754的PCT专利之后提出申请的,这两个发明的出发点一致,目的均在于解决HCV抗原本身直接标记容易失活的问题。而且,上述两个专利并没有深入的研究间接标记在纳米颗粒类标记物如胶体金方面的应用。因为,纳米颗粒类标记物和酶、发光类标记物等相对的小分子标记物最大的不同之处在于:纳米颗粒的颗粒比较大,标记物最终的形态是以纳米颗粒标记物为核心的,一个纳米颗粒标记物表面偶联多个抗原;而酶、发光类标记物标记抗原后的最终形态是以抗原为核心的,一个抗原表面偶联多个标记物。正是由于这种形态的差别,抗原标记纳米颗粒类标记物时,抗原和纳米颗粒类标记物的比例应该是越小越好,理想状态是1:1,即标记比例越低灵敏度越高,特异性越好。但是,在常规的直接标记过程中,标记抗原用量过低会导致标纳米颗粒发生沉淀,致使标记失败;而抗原标记酶、发光类等相对的小分子标记物时,抗原和酶、发光类标记物的比例应该是越大越好。所以在酶联免疫或发光免疫等相对小分子标记物方面,间接标记并不是用来提高灵敏度并改善特异性,而主要是用来解决抗原标记失活的问题,是直接标记无法进行时迫不得已的选择,例如HCV抗原直接标记就容易失活。而对于标记不容易失活的抗原,如艾滋病、梅毒等,目前均采用直接标记的标记方法,对于艾滋病、梅毒的直接标记的灵敏度和特异性的综合效果要明显好于间接标记。而在纳米颗粒类标记物,如胶体金方面,间接标记由于是先用胶体金标记配体,如亲和素,再向标记后的标记物中加入微量的生物素化抗原来完成的,这样就可以随意控制并减少标记抗原的使用量,达到提高灵敏度的同时改善特异性的好处,不论抗原直接标记是否容易失活,采用间接标记的效果都好于直接标记。从上面的阐述来讲,纳米颗粒标记物与酶联免疫或发光免疫等相对小分子标记物二者应用间接标记解决问题的出发点、思路、针对的标记对象以及结果是完全不同的,对于这个道理,上述两个专利没有深入研究,也没有提出相应的应用方向。
目前有些采用纳米颗粒标记物的项目,如HAV、TORCH系列部分项目,也有人采用间接标记,这些项目用的都是天然病毒裂解液作为标记抗原,因为抗原量少且杂,为了减少纯化的难度,所以采用一个针对目的抗原的单抗进行间接标记。这种方法主要是用在使用天然抗原的捕获法项目上,而且其间接标记物的配体——抗体只能针对目的抗原。目前,还没有涉及这种抗体表位筛选的资料报道,当抗体所针对的表位距离标记抗原核心表位较近或对核心表位有影响的话,必然导致标记复合物的灵敏度降低。即使是经过筛选的抗体,也是针对目的抗原的,所以必然没有本专利所提及的针对非目的蛋白对标记复合物的灵敏度影响小。上述使用天然抗原的捕获法项目,是为了减少纯化的难度而采用间接标记,并且没有对抗体针对的目的抗原表位进行筛选;而本发明是为了提高检测灵敏度和改善特异性的针对重组抗原非目的抗原的间接标记的捕获法,二者要解决的技术问题,所采用的技术方案均有明显的差别,也不是本专业技术人员能够轻易联想到的。
目前,放射免疫、酶联免疫或发光免疫针对天然抗原的捕获法也基本上采用间接标记的方法,其原因也如上述两段所讲的,主要是解决1、直接标记容易失活的抗原;2、天然抗原过杂、表达量过少,为了减少纯化的难度而采用的间接标记,与本发明所述的为了提高检测灵敏度和改善特异性的针对重组抗原非目的抗原的间接标记的捕获法检测得出,二者要解决的技术问题,所采用的技术方案均有明显的差别,也不是本专业技术人员能够轻易联想到的。
本发明并非本专业技术人员可以轻易通过上述几个对比文件进行组合能联想到的,本发明和对比文件的原理和解决方案都不同,这也正是目前还没有针对本专利所述重组抗原间接标记提高灵敏度并改善特异性的解决方案的报道和产品出现的原因所在。
综上所述,基于重组抗原纳米颗粒的抗体检测捕获法检测试剂盒所用的标记物,目前都是采用直接标记法,存在方法上的缺陷,因此,亟需在此基础上做进一步的改进,提高试剂盒检测的灵敏度并改善特异性。
发明内容
发明目的:
本发明的目的就是为了解决上述问题,提供一种间接标记纳米颗粒的抗体检测捕获法,以及采用此方法制备的免疫检测试剂盒。
术语解释:
本发明中使用的术语除非另有说明,否则具有以下含义:
标记:本发明中使用的术语“标记”是指配体跟标记物的偶联。
标记物:本发明中使用的术语“标记物”指在免疫检测中可被检测到的物质。所述标记物可选自任何纳米颗粒类标记物,也可指包含该标记物的“标记复合物”。
纳米颗粒:本发明中使用的术语“纳米颗粒”包括胶体银、胶体硒、乳胶、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒、稀土络合物纳米颗粒,以及它们各自的衍生物,或者两者以上的组合物。
融合蛋白:本发明中使用的术语“融合蛋白”是指与标记抗原融合表达成融合抗原的蛋白,此融合抗原与标记物偶联,用于检测IgM抗体。
标记抗原:本发明中使用的术语“标记抗原”为免疫检测中与待测IgM抗体结合的抗原,也可叫标记蛋白。
胶体:本发明中使用的术语“胶体”可为任何合适的胶体,包括但不限于胶体金、胶体硒、胶体银。
胶体金:colloidal gold,也称金溶胶goldsol,本专利可以简称为Au。
间接标记:本发明中使用的术语“间接标记”是指标记抗原和标记物不是直接结合,而是通过标记抗原上面的标签与其对应配体特异性识别,由配体直接标记标记物。
配体:本发明中使用的术语“配体”为可以与标签特异性识别的分子,例如抗体,亲和素等。
标签:本发明中使用的术语“标签”包括但不限于多肽或蛋白、生物素或者为它们与肽或蛋白的组合物。
生物素:Biotin,下文可以简称为Bio。
链霉亲和素:Streptavidin,下文可以简称为亲和素或SA。
发明详述:
本发明发现,纳米颗粒的抗体检测捕获法免疫检测中普通的标记方法,由于标记物和标记抗原的结合方式是直接结合,其存在的固有缺陷就是:
1.标记物为纳米颗粒时,理论上是抗原和纳米颗粒的物质的量比例(即标记比例)越低,标记复合物的灵敏度越高,当标记比例为理想状态的1:1时,标记复合物的灵敏度最高。但是,由于直接标记时,标记抗原用量过低会导致纳米颗粒发生沉淀,致使标记失败,因此直接标记的标记比例相对于间接标记无法降的更低,所以标记复合物灵敏度偏低。同时,直接标记时,标记比例相对较高,即抗原使用浓度也偏高,导致标记复合物特异性降低以及生产成本的升高;
2.标记物为纳米颗粒时,采用直接标记时,由于标记物的颗粒大小比标记抗原的体积大很多倍,使得标记抗原的活性表位受到不同程度的空间位阻、遮盖等不利影响,导致标记复合物灵敏度降低;
3.由于标记抗原一般会含有一定量的杂蛋白,标记过程中杂蛋白也与目的蛋白一起标记到标记物上,从而导致标记复合物特异性降低;
4.直接标记的缓冲液、pH、离子强度等条件并不能保证是标记抗原的最佳活性条件,标记时的剧烈搅拌、离心、封闭等因素也容易对标记抗原的活性表位造成影响,导致最终检测的灵敏度降低。
本发明经过大量实验,发现采用间接标记的方式可以有助于解决上述问题。因此,本发明提供一种采用纳米颗粒类标记物用于检测IgM抗体的快速检测试剂盒,纳米颗粒类标记物与标记抗原之间的标记是通过抗原上的标签和标记在纳米颗粒标记物上的可特异性识别该标签的配体相结合来完成的间接标记,其中的标记抗原为基因工程重组抗原,其所采用的抗体检测方法为捕获法。
本发明的间接标记是通过标记物与配体直接结合,配体与标记抗原上的标签特异性识别来完成的。这里所说的标签包括但不限于多肽或蛋白生物素或者为它们与肽或蛋白的组合物。
为了保证标记抗原的活性,标签为多肽或蛋白时,应距离目的抗原核心表位尽量远,或者对目的抗原核心表位影响尽量小,这样可以避免由于标签或者配体与标签相结合之后的复合物对标记抗原的表位造成空间位阻、遮盖等不利影响。
本发明可以应用于整个纳米颗粒类标记物的快速检测领域,包括层析法、渗滤法以及其他可以用于快速检测的方法。
优选方案:
本发明的间接标记纳米颗粒的抗体检测捕获法,其检测对象优选为人巨细胞病毒(以下可以简称为HCMV,或CMV)IgM抗体、戊型肝炎病毒(以下可以简称为戊肝,或HEV)IgM抗体。
对于标签的选择,本领域普通技术人员可以根据以上原则按照现有实验方法去推导,在此不再详述。
本发明优选的标记抗原与标签的结合方法为:标记抗原的生物素化;标记抗原与肽的嵌合表达。
在本发明的一个优选方案中,所选择的标签为生物素或其衍生物、生物素或其衍生物与肽或蛋白的组合物,其所对应的配体为亲和素、亲和素的衍生物或同功物。本发明所述的生物素类标签,其与标记抗原的偶联方式可以是标记抗原的生物素化,包括体内酶促生物素化、体外生物素化、间接生物素化、氨基酸的生物素化。在本发明进一步的优选实施方案中,所述体内酶促生物素化的方法为:
使编码标记抗原与生物素接合蛋白的嵌合基因(简称X)同编码生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶的基因(简称Y)共同在宿主体内表达,在表达宿主体内利用表达的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶通过体内酶促反应使嵌合基因X编码蛋白的特定赖氨酸结合上生物素,具体表达方法包括:
1)多顺反子表达;2)共转化表达;3)多启动子表达;4)单顺反子表达;5)与宿主的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶基因共表达。
在本发明其它优选实施方案中,所述体外生物素化为通过偶联活化生物素或体外酶促反应来完成对标记抗原的生物素化。
在本发明的优选实施方案中,所述生物素接合蛋白为生物素羧基载体蛋白家族或其功能区段、多肽或其功能类似物。
在本发明的优选实施方案中,所述生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶是分类号为EC6.3.4.15的酶或其功能区段、功能类似物。
1、标记抗原的生物素化
标记抗原生物素化的具体方法包括:a)体内酶促生物素化;b)体外生物素化;c)间接生物素化;d)氨基酸的生物素化。
1.1体内酶促生物素化
本发明主要是使编码生物素接合蛋白与编码标记抗原的嵌合基因X同编码生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶的基因Y共同在宿主体内表达,在表达宿主体内利用生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶通过体内酶促反应使嵌合基因X编码蛋白的特定赖氨酸结合上生物素,制成生物素化标记抗原。
天然的生物素接合蛋白主要存在于生物素羧基载体蛋白家族中,其核心部分是含有与生物素结合的特定位点赖氨酸的蛋白或肽。
具有催化蛋白生物素化的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶来源广泛,包括但不限于细菌,如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、流感杆菌(Haemophilus influenzae)、根瘤菌(Rhizobium)、乳酸菌(Lactobacillus)、伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、粘囊菌(Synechocystis sp.)、链球菌(streptococcus)和脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificane)的BirA基因编码产物,伤寒立克次氏体(Rickettsiamooseri)的BirA基因编码产物,甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的MJ1619基因编码产物,梅毒螺旋体(Treponema Pallidum)的TP0357基因编码产物;酵母,如分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)的SPBC30D10.07c基因编码产物、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的BPL1基因编码产物;植物,如拟南芥(Arabidopsis thaliana)的BirA基因编码产物;动物,如人(Homo sapiens)或小鼠(Mus musculus)的HLCS基因编码产物等。生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶还包括上述酶的功能区段或其功能类似物。本发明选取大肠杆菌ER2566的BirA基因编码产物进行说明。
1.1.1多顺反子表达
即基因X、Y在表达载体同一启动子作用下以多顺反子形式在宿主体内表达以完成生物素化的方法。
操纵元是原核基因表达调控的一种重要组织形式,大肠杆菌基因多数以操纵元形式组成基因表达调控的单元。操纵元中被调控的编码蛋白质的基因可称为结构基因。一个操纵元中含有2个以上的结构基因,多的可达十几个。每个结构基因是一个连续的开放读框,5′端有翻译起始码,3′端有翻译终止码。各结构基因头尾衔接、串连排列,组成结构基因群。至少在第一个结构基因5′侧具有核糖体结合位点,因而当这段含多个结构基因的DNA被转录成多顺反子mRNA,就能被核糖体所识别结合,并起始翻译。核糖体沿mRNA移动;在合成完第一个编码的多肽后,核糖体可以不脱离mRNA而继续翻译合成下一个基因编码的多肽,直至合成完这条多顺反子mRNA所编码的全部多肽。
上述多顺反子表达形式在多种生物体内均存在,根据以上原理,我们将X、Y以双顺反子的形式连接到表达载体上,转入表达宿主后利用宿主体内的物质和环境并通过Y表达出的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶将已加入培养基中的生物素添加至与标记抗原嵌合表达的生物素接合蛋白的特定赖氨酸位点上,从而完成对标记抗原的定点生物素化。
这里所讲的多顺反子,可以将X放在N端或C端,也可以是一个X与几个Y,一个Y与几个X,几个X与几个Y等所有排列组合形式的多顺反子。
在本发明的所有抗原生物素化方法中,“多顺反子表达”为最稳定、最方便、成本最低的方法,我们以此方法作为生物素化抗原及本发明标记抗原与标签结合的优选方法。
1.1.2共转化表达
即将分别克隆有基因X和Y的两个不同表达载体共同转入表达宿主内进行共表达以完成生物素化的方法。
将X、Y分别克隆到两个不同的表达载体中,这两个表达载体可以具有相同或不同的性质,只要在相应的抗性选择压力下可以分别表达出嵌合有生物素接合蛋白的标记抗原和生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶,并保证生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶可以将标记抗原最大程度的生物素化即可。
1.1.3多启动子表达
即基因X、Y分别利用同一表达载体的不同启动子启动转录进而在表达宿主内共表达以完成生物素化的方法。
将基因X和基因Y克隆到同一表达载体的不同操纵元件调控的两个启动子下进行有效的转录和翻译,以实现嵌合有生物素接合蛋白的标记抗原和生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶在同一宿主中的共表达并完成标记抗原的生物素化。
1.1.4单顺反子表达
即将基因X、Y以单顺反子的形式进行不同方式的嵌合表达以完成生物素化的方法。
将基因X、Y以不同的方式进行嵌合表达,表达的嵌合蛋白既有合成酶的功能又有生物素接受能力,可以在嵌合蛋白之间完成其相互的生物素化。这里所讲的不同方式,可以将X放在N端或C端,也可以是一个X与几个Y,一个Y与几个X,几个X与几个Y等所有排列组合的形式。
1.1.5与宿主的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶基因共表达
即利用表达宿主体内的与基因Y功能类似的基因表达出的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶将基因X编码蛋白最大程度地生物素化。
我们可以利用基因工程方法将内源或外源的编码生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶的基因整合到表达宿主体内或将表达宿主体内原始存在的类似生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶的基因以一定的方式活化以提高其表达水平,使其表达出的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶将标记抗原与生物素接合蛋白的融合蛋白达到最大程度的生物素化。或者利用表达宿主体内原有的与Y功能类似的基因表达出的生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶完成对标记抗原的部分生物素化,一般情况下宿主体内原有的与Y功能类似的基因表达水平很低,以至于未经改造的该类原始宿主只能低效率地对可结合生物素的蛋白或多肽进行体内生物素化,所以后一种方法在纯化抗原时需要将大部分未生物素化抗原去除,以便尽可能消除作为标记抗原参加反应时未生物素化抗原对已生物素化抗原的竞争,其它生物素化方法也最好将未生物素化抗原去除干净以提高灵敏度。
1.2体外生物素化
1.2.1活化生物素标记标记抗原
通过偶联的方法将活化生物素直接偶联到标记抗原上,与标记抗原的何种基团偶联及具体活化生物素的选择和偶联方法可参考美国PIERCE公司产品目录。
1.2.2利用体外酶促反应将生物素添加到标记抗原上
体外酶促反应主要指将X编码产物与生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶在体外混合并提供一定的酶促反应环境,使生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶在体外通过酶促反应完成对标记抗原的生物素化。
1.3间接生物素化
间接生物素化指将标记抗原与物质A相连,用物质B去结合物质A,再用物质C去结合物质B,依此类推可以实现对A的一级或多级识别,在最后一级的结合物质上利用上述生物素化方法连接生物素,最终以标记抗原-A(-B-C......)-生物素的形式实现标记抗原的间接生物素化。
1.4氨基酸的生物素化
氨基酸的生物素化是将某种或某几种氨基酸经过生物素化(沈宗旋等,合成化学,10(4):359-361,2002)后作为宿主培养基成分加入表达体系中,利用宿主的蛋白质翻译过程将生物素添加到标记抗原的肽链中制成生物素化标记抗原。
在本发明的另一个优选方案中,所选择的标签为含有包括但不限于以下物质:HisTag、T7Tag、S Tag、Flag Tag、HA Tag、GST融合蛋白、TRX融合蛋白、CKS融合蛋白、DSBA融合蛋白、MBP融合蛋白、CBD融合蛋白、包被抗原不含有的其他目的蛋白区段或者他们的组合、嵌合体,其所对应的配体为他们各自的抗体,其配体的制备方式,可以按照单克隆抗体的一般制备流程来实现,本专业的技术人员应该熟知。
本发明引入标签及其结合配偶体来完成对标记抗原的间接标记,在选择标签时的一个重要标准是标签尽可能小以减小对标记抗原活性的损伤。标签可以是一个、几个或几个的组合,可以结合在标记抗原的N端、C端、两端或内部。
标签可以是肽或者蛋白、生物素或者为它们与肽或蛋白的组合物。总之,只要技术人员可以制备出它们的配体,均可以看作是本发明特指的标签。
本发明的配体包括但不限于针对标签的特异性抗体、与标签有亲和力的物质如链霉亲和素,或其类似物。
本发明所用的捕获法试剂盒是以“支持物-抗人IgMμ链单抗-所有IgM抗体-标记抗原-标签-配体-标记物-可识别信号”形式完成检测,标记抗原与标记物之间为间接标记。其主要制备及检测方法如下:
包被:将抗人IgMμ链包被到固相支持物上。
加样:加入待测样品、标记抗原、配体结合的标记物,形成“抗人IgMμ链-待测IgM抗体-标记抗原-标签-配体-标记物”的结构。
检测:利用标记物来实现检测信号的呈现。
发明优点:
1、试剂盒检测时的灵敏度比直接标记高,主要因为:(1)间接标记的方法,可以保证标记抗原和纳米标记物的摩尔比例更接近1:1的最佳状态,此时的标记物灵敏度最高;(2)间接标记的方法,可以避免标记物对标记抗原的表位造成空间位阻、遮盖等不利影响而导致检测的灵敏度降低;(3)间接标记的方法,可以避免标记过程对标记抗原的活性影响,从而保证了标记物灵敏度。
2、试剂盒检测时的特异性比直接标记高,主要因为:(1)多了一步标签-配体的特异性识别,由于杂蛋白不会与配体结合,所以即使标记抗原纯度不高的时候,也不影响检测的特异性;(2)间接标记的标记抗原用量远低于直接标记,降低了标记抗原非特异性结合的可能性,从而保证了试剂盒的特异性。
3、试剂盒的成本低,主要因为:(1)间接标记的标记抗原用量远低于直接标记,虽然需要加入配体,但很多配体如单抗的生产纯化工艺相对都很成熟,成本也比较好控制,对于一些标记抗原难于重组表达,尤其是必须利用真核系统来表达的项目,成本就远低于直接标记;(2)间接标记由于多了一步配体与标签的特异性识别,对标记抗原纯度的要求也大为降低,这方面也大大节省了标记抗原的精细纯化成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1:载体P2的图谱。
图2:带有X融合蛋白的载体P2-X的构建过程。
具体实施方式
本发明的目的、特征及优点将结合实施例作进一步详细阐述。应当理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如文献(萨姆布鲁克,EF弗里奇,T曼尼阿蒂斯,等.金冬雁,黎孟枫等译.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社,1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。本发明人曾经在申请号为CN101160413的中国专利中提到一种P2载体,以其作为起始载体来进行说明本发明的实施例。载体P2的图谱见附图1,也就是本发明所使用的克隆载体,在实施本发明的过程中P2并不是必须表达载体,其上游的增强子在本发明中也不起实质作用,构建此载体只是为了克隆方便,其它许多表达载体如pET-24a(+)(美国Novagen公司,货号69749-3)均可用于实施本发明。该申请整体并入本文引作参考。
实施例1 HCMV IgM抗体的间接标记纳米颗粒的抗体检测捕获法检测
1.1HCMV重组抗原的制备
1.1.1HCMV标记抗原的制备
参照NCBI上的HCMV AD169毒株的基因序列,辅以生物软件DNAstar分析巨细胞病毒的优势表位基因,用oligo软件设计下列引物,交由上海英骏生物技术有限公司合成。引物序列为:
UL32基因,951F:GGG GGA TCC TCG TCT ACG GCC AAAAG,带有BamH I酶切位点;1048R:CCC GAA TTC TTA AGA TCT TTC CTC CGT GTT CTT AAT CTT带有EcoR I和Bgl II酶切位点;
UL44基因,240F:GGT GGA TCC TGC ACG TTG CGT ATA GTT AC,带有BamH I酶切位点;404R:GGG GAA TTC TTA AGA TCT ATT GCC GGA GTT GCG带有EcoR I和Bgl II酶切位点;
UL80a基因,136F:TTT GGA TCC CGG CGC GAC TCT CC,带有BamH I酶切位点,249R:CCC GAA TTC TTA AGA TCT CCG CGC AGC AAA CA,带有EcoR I和Bgl II酶切位点;
UL83基因,361F:TTT GGATCC CCT CAG TAC AGC GAG CAC,带有BamH I酶切位点,480R:GGG GAA TTC TTA AGA TCT GGC CGG ATT GTG GAT T,带有EcoR I和Bgl II酶切位点。
采用病毒DNA提取试剂盒从HCMV阳性病人血清中提取病毒总DNA。以提取的DNA作为模板,分别以上述的引物,进行PCR扩增,产物经过电泳鉴定,大小正确,切胶回收。
PCR产物回收之后,连接PGEX-4T-1载体(以下简称p4T),转化大肠杆菌ER2566感受态细胞(美国New England Biolabs公司),铺板于100ug/ml氨苄西林钠(上海生工生物工程公司,以下简称生工,货号A0339)抗性的LB琼脂平板上,置于37℃恒温培养箱培养过夜,次日挑取单菌落,PCR鉴定,阳性克隆转接于2mL LB培养基中,IPTG诱导4h之后,12%SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达结果,正确的克隆委托上海英骏生物技术有限公司测序。
测序正确的进行多表位嵌合抗原表达质粒的构建:p4T-UL32质粒用Bgl II和EcoRI双酶切之后,回收载体,连接上p4T-UL44质粒经过BamH I和EcoR I双酶切之后的UL44片段,得到p4T-UL32-UL44克隆。余下的UL80a、UL83片段也依此方法嵌和克隆进去,最后获得表达质粒p4T-UL32-UL44-UL80a-UL83。
选取p4T-UL32-UL44-UL80a-UL83正确克隆的菌株,接种于含有100mg/L氨苄西林钠的500mL LB培养基中,置于37℃恒温摇床200rpm培养过夜,加入IPTG诱导4h,收集菌液,5000rpm离心20min,弃上清,沉淀用10mL裂解液裂解,超声破碎菌体,12000rpm离心20min之后,经SDS-PAGE鉴定后,大部分目的蛋白分布在裂解液上清,弃沉淀,上清通过硫酸铵饱和梯度(20%-40%)沉淀、浓缩目的蛋白,收集沉淀,用10ml平衡缓冲液(pH 7.3PBS,140mMNaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,1.8mM Na2HPO4)溶解。用10倍柱床体积的平衡缓冲液平衡GSTrap亲和柱之后,加入蛋白样,用10倍介质体积的平衡缓冲液洗去未结合的蛋白,再用5倍体积洗脱缓冲液洗脱目的蛋白,测定蛋白浓度,-20℃保存备用,此蛋白命名为GST-HCMV。
1.1.2免疫原和杂交瘤细胞筛选抗原(GST蛋白)的制备
以PGEX-2T(Phamacia公司,货号:27-4801-01)、PGEX-6P-1、PGEX-5X-1(Phamacia公司,货号:27-4584-01)、pET-41a(Novagen公司,货号:70556-3)质粒转化大肠杆菌ER2566,根据质粒所带的抗生素基因,选择涂布于含100ug/ml氨苄西林钠或者100ug/ml硫酸卡那霉素的LB平板上,37℃过夜培养,挑取单克隆,用含同一浓度氨苄西林钠或者硫酸卡那霉素的500ml LB培养基37℃振荡培养至OD600 1.0左右,用终浓度为0.5mM的IPTG诱导4小时。之后,4℃,5000g离心20分钟收集菌体,每升菌液的菌体用20ml裂解缓冲液重悬,超声破碎,4℃12000g离心20分钟,经SDS-PAGE电泳鉴定后,大部分蛋白分布在裂解液上清中,缓慢加入饱和硫酸铵溶液同时快速搅拌均匀,使硫酸铵终浓度为30%,4度静置30分钟,12000g离心20分钟,收集上清,缓慢加入饱和硫酸铵溶液同时快速搅拌均匀,使硫酸铵累积浓度为60%,4℃静置30分钟,12000g离心20分钟,收集沉淀,用10ml平衡缓冲液溶解。用10倍柱床体积的平衡缓冲液平衡GSTrap亲和柱之后,加入蛋白样,用10倍介质体积的平衡缓冲液洗去未结合的蛋白,再用5倍体积洗脱缓冲液洗脱目的蛋白,测定蛋白浓度,-20℃保存备用。
1.2抗GST杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体的制备
1.2.1重组GST蛋白免疫小鼠
将PGEX-2T表达的GST蛋白溶液用PBS透析之后,用PBS稀释到1.0mg/ml,与福氏完全佐剂(Sigma-Aldrich公司,货号:F5881)等体积混合,并充分乳化,背皮下注射免疫6周龄的纯系BALB/c小鼠,剂量50μg/只。2周后,将GST蛋白与福氏不完全佐剂(Sigma公司,货号:F5506)等体积混合,并充分乳化,腹腔注射,剂量50μg/只。2周后,将GST蛋白不加佐剂,腹腔注射,剂量50μg/只。第三次免疫后7天,取小鼠尾血,分离血清,用间接ELISA法测定效价,效价高于1∶10000即可用于融合。融合前4天,第四次免疫,将GST蛋白不加佐剂,尾静脉注射,50μg/只。
1.2.2杂交瘤细胞株制备
准备融合前12天提前复苏骨髓瘤细胞Sp2/0(ATCC,货号:CRL-1581),用含10%胎牛血清(HyClone公司,货号:SH30406.01)的1640培养基(GIBCO公司,货号:23400-021)培养。融合前24h把细胞浓度调至3×105/mL。次日收集骨髓瘤细胞,1200g离心5min,用无血清培养基洗涤3次,细胞计数。处死免疫小鼠,取出脾脏,制备成细胞悬液,细胞计数,取108脾细胞,和2×107骨髓瘤细胞混合,用50%PEG1500(Roche产品,货号:12809400)融合,在HAT培养基(GIBCO公司,货号:400639)上选择培养杂交瘤。
1.2.3杂交瘤细胞株的筛选与克隆
融合后培养第10天,用ELISA法检测各孔融合细胞上清中的抗体活性。各取200ul的融合细胞培养上清液,加入到96孔ELISA板(深圳金灿华实业有限公司辐照酶标板)孔中,其中每孔包被有10ug/ml的不同GST蛋白,分别是:PGEX-2T、PGEX-6P-1、PGEX-5X-1、pET-41a。反应在37℃进行1小时,然后用含有0.05%的Tween20的PBS(洗涤液)洗涤5次,在各孔中加入1:5000稀释的HRP标记的抗小鼠IgG(Sigma-Aldrich公司,货号:A4416)。反应在37度进行1小时,用上述洗涤液洗板5次,然后每孔加入含0.5‰过氧化氢尿素(生工,货号UB1753)、4.76‰三水合乙酸钠、0.9‰冰醋酸的显色剂A及含0.32‰TMB(生工,货号TB0514)、5mM柠檬酸、0.5mM EDTA-2Na、5%甲醇、2‰二甲基甲酰氨的显色剂B各50ul,37℃避光显色30分钟。每孔加50ul,含2M硫酸的终止液终止反应,酶标仪检测每孔450nm波长。共检测有杂交瘤细胞的384孔,其中同时对上述4个GST蛋白有反应的阳性孔为52个。经过三次有限稀释克隆,最后获得12株稳定分泌抗GST蛋白的细胞株,其中抗体活性最高的一株细胞,其分泌的抗体命名为6F8。
1.2.4GST单抗腹水的制备与纯化
取8周龄BALB/c小鼠,腹腔注射液体石蜡(国药集团化学试剂,货号:30139828)0.5mL/只。1周后腹腔注射1×107个6F8杂交瘤细胞。接种细胞7天后采集腹水,3000g离心10min,取上清用0.01M pH7.4的PBS稀释3倍。按照Pharmacia公司提供的单克隆抗体纯化方案,样品经FPLC系统上Protein A免疫亲和层析柱,pH2.8甘氨酸洗脱。收集特异性蛋白峰流出液,立即用pH9.0的Tris溶液矫正至pH7.0,过滤除菌后分装,于-80℃保存。
1.3HCMV间接标记的IgM胶体金试剂盒的制备
1.3.1胶体金制备
在三角烧瓶中加入100ml超纯水,磁力加热搅拌器上加热至沸腾,加入1ml 1%氯金酸(Sigma-Aldrich公司,货号:16961-25-4)溶液,沸腾后立刻加入1ml 1%柠檬酸三钠(Sigma-Aldrich公司,货号:6132-04-3)水溶液,继续沸腾10分钟,然后自然冷却即可。
1.3.2胶体金标记
取10ml上述胶体金放入烧杯中,搅拌中加入150ul的0.2M K2CO3调节pH至7.0,继续搅拌20秒;加入一定量的6F8单抗,继续搅拌10分钟;加入0.1ml 10%BSA,继续搅拌5分钟;5000g离心10分钟,吸出上清,将沉淀收集至一合适容器;对上清再用10000g离心15分钟,重复第一次离心的操作;对上清再用12000g离心30分钟,弃掉上清,将三次离心的沉淀收集到同一离心管中,用胶体金稀释液(20mM PB,150mM NaCl,1%BSA,0.1%TritonX-100,2%Sucrose,0.01%Proclin300)定容至1ml;最后在该1ml胶体金标记6F8单抗复合物中加入一定量的HCMV抗原GST-HCMV,充分混匀后放-4℃保存。该间接标记金标复合物命名为GST-HCMV-6F8-Au。
1.3.3金标垫制备
将上述金标复合物用胶体金稀释液10倍稀释后浸泡玻璃纤维(Watman公司),冻干,即制成金标垫。
1.3.4硝酸纤维素膜(NC)膜包被
用检测线稀释液(10mM PBS+2%蔗糖)稀释抗人IgMμ链至0.8mg/ml制成检测线工作液,用同一稀释液稀释羊抗鼠IgM单抗至0.5mg/ml制成对照线工作液,用点膜仪将这两种工作液划到硝酸纤维素膜(Millipore公司,货号:HF135002)的相应位置上,37度干燥1小时。
1.3.5HCMV检测试剂盒组装
将上述金标垫、包被好的硝酸纤维素膜以及吸水纸、聚酯板、样品垫等辅料组装成HCMV金标检测试剂盒。
1.3.6检测方法
加100ul待测样品(例如:血清)到样品垫处,室温放置20分钟之后,判定结果。结果判定标准如下:
①仅质控区出现一条带,在测试区内无条带出现,为阴性(-);
②有两条条带出现,其中一条位于质控区,另一条位于测试区,表示阳性(+);
③质控区未出现条带,表明不正确的操作过程或检测卡已变质损坏。在此情况下,应再次仔细阅读说明书,并用新的试纸条重新测试。
1.4普通的HCMV直接标记的IgM纳米颗粒检测试剂盒的制备
1.4.1HCMV-Au标记复合物的制备
取10ml上述胶体金放入烧杯中,搅拌中加入150ul的0.2M K2CO3调节pH至7.0,继续搅拌20秒;加入一定量的GST-HCMV抗原,继续搅拌10分钟;加入0.1ml 10%BSA,继续搅拌5分钟;5000g离心10分钟,吸出上清,将沉淀收集至一合适容器;对上清再用10000g离心15分钟,重复第一次离心的操作;对上清再用12000g离心30分钟,弃掉上清,将三次离心的沉淀收集到同一离心管中,用胶体金稀释液(20mM PB,150mM NaCl,1%BSA,0.1%TritonX-100,2%Sucrose,0.01%Proclin300)定容至1ml,该金标复合物命名为GST-HCMV-Au。
1.4.2HCMV直接标记的胶体金试剂盒组装
参见实施例1.3.5,组装HCMV直接标记的胶体金检测试纸条。
1.5HCMV间接标记与直接标记的最佳标记比例、标记抗原最佳用量的比较
用实施例1.3、1.4的方法,在相同的条件下,采用同样包被好的NC膜,调试间接标记与直接标记的最佳标记比例、标记抗原最佳用量,以比较间接标记与直接标记的抗原用量。调试原则是:在保证标记成功(也就是胶体金不沉淀)的基础上,尽量使检测的灵敏度和特异性达到最佳效果。
1.5.1HCMV直接标记的抗原用量
分别用2、5、7.5、10、15、20、30、40ug/ml的GST-CMV抗原进行直接标记考察,结果发现,在标记抗原的量少于7.5ug/ml时,标记过程因出现沉淀而失败,其它条件可以标记成功。把标记成功的抗原-胶体金(GST-HCMV-Au),分别制备成试剂盒,通过检测发现直接标记10~20ug/ml标记时灵敏度最高,为最适标记用量。
1.5.2HCMV间接标记的抗原用量
分别用2、5、7.5、10、15、20、30、40ug/ml的6F8单抗进行标记考察,结果跟直接标记类似,也是在抗体量少于7.5ug/ml时,标记过程因出现沉淀而失败,其它条件可以标记成功。把标记成功的抗体-胶体金(6F8-Au),在GST-HCMV抗原用量相同的条件下,分别制备成试剂盒,通过检测发现抗体20ug/ml标记时灵敏度最高,为抗体的最适标记用量。
在抗体20ug/ml标记时,将GST-HCMV抗原用量分别设定为0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2、4ug/ml,比较制备的试剂盒灵敏度和特异性,结果发现,抗原用量为0.25~0.5ug/ml时,试剂盒为最佳条件。
此结果表明,间接标记的抗原用量是直接标记的抗原用量的1/40-1/20左右。
1.6HCMV间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒检测效果的比较
以意大利Sorin公司的IgM检测试剂盒作为对照,分别比较了间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒检测HCMV IgM阳性血清和阴性血清的效果。结果显示本发明的试剂盒用于检测HCMV IgM抗体,其灵敏度、特异性等指标均显著优于直接标记的试剂盒。
1.6.1灵敏度
用间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒,在同样的条件下对100份系列稀释比例的血清进行检测,得到了表1-1的结果,而且对于所有稀释倍数的可检出血清,也基本上是间接标记法的灵敏度要明显高于直接标记法,此结果表明,间接标记试剂盒的灵敏度要显著高于直接标记的试剂盒灵敏度。
表1-1间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒检测HCMV IgM抗体的灵敏度比较
1.6.2特异性
用间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒,在同样的条件下对3000份HCMVIgM临床阴性血清进行检测,结果是,间接标记试剂盒的特异性为99.8%,假阳率为0.2%,直接标记试剂盒的特异性为98.5%,假阳率为1.5%,此结果表明,间接标记试剂盒的特异性要显著好于直接标记的试剂盒特异性。
1.6.3稳定性
将本发明的GST-HCMV-Au标记物放在37℃考核7天,取出后与同时4℃存放的标记物,制备成间接标记的试剂盒,在同一条件下检测相同的阴、阳性血清,以考察标记物的稳定性,结果如表1-2所示。
将本发明的成品试剂盒,在37℃考核7天,取出后与同时4℃存放的试剂盒,在同一条件下检测相同的阴、阳性血清,以考察试剂盒的稳定性,结果如表1-3所示。
表1-2 GST-HCMV-Au标记物稳定性实验结果
备注:+为弱阳,++为中阳,+++为强阳,-为阴性。
表1-3间接标记成品试剂盒稳定性实验结果
此实验表明,本发明的标记物和试剂盒的稳定性较好。
1.6.4精密性
用间接标记的试剂盒检测同一份已知HCMV IgM阳性标本,做10次重复检测,得到各检测条的结果均为阳性,且各检测条的显色程度也无显著差异,说明本试剂盒精密性较好。
1.7HCMV间接生物素化标记抗原的间接标记纳米颗粒检测试剂盒制备
1.7.1HCMV标记抗原的生物素化
以PinpointTM Xa-1质粒(美国Promega公司,货号V2031)为模板,设计一对引物,上游引物为GGG GGATCC ATG AAA CTG AAG GTA ACA GTC AA,带有BamHI酶切位点,下游引物为GGG GAA TTC TTA AGA TCT TTC GAT GAG CTC GAG ATC C,带有EcoRI、BglII位点和TAA终止密码子,扩增出PinpointTM Xa-1中的生物素结合多肽基因序列X,回收之后,连接到P2载体,阳性克隆为P2-X,提质粒,用BglII和EcoRI酶切之后,接上实施例1.1.1中的UL32-UL44-UL80a-UL83基因片段,得到的阳性克隆,称为P2-X-UL32-UL44-UL80a-UL83,此克隆提质粒之后,用EcoRI和HindIII双酶切。提取大肠杆菌ER2566总基因组,以其作为模板对大肠杆菌K12生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶BirA基因Y进行PCR扩增。扩增引物如下:
引物1:5′-CCC GAA TTC ATG AAG GAT AAC ACC GTG CC-3′,引物2:5′-GGG AAGCTT TTA TTT TTC GGC ACT ACG CAG GGA TAT TTC ACC-3′。
其上游引物带有EcoRI位点,下游引物带有终止密码子和HindIII位点。扩增出的基因片段Y经EcoRI/HindIII酶切后克隆到经同样酶切处理的质粒P2-X-UL32-UL44-UL80a-UL83之上,得到的阳性克隆为P2-X-UL32-UL44-UL80a-UL83-Y。
将P2-X-UL32-UL44-UL80a-UL83-Y转化入表达宿主菌株ER2566中,用含100ug/ml卡那霉素且含终浓度20uM D-生物素(美国Sigma-Aldrich公司,货号B-4501)的500ml LB培养基37℃振荡培养至OD600 1.0左右,用终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导,诱导条件为:37℃,200rpm,4小时。离心收集菌体,每升菌液的菌体用10ml裂解缓冲液重悬,超声破碎,4℃12000rpm离心20分钟的上清经10%-30%饱和硫酸铵沉淀,用PB缓冲液(100mM,pH7.0)复溶,4℃12000rpm离心10分钟除去不溶物后,再经过含SoftLink Soft Release Avidin树脂的亲和素层析柱纯化(纯化过程详见美国Promega公司,货号V2012说明书),以含有5mM D-生物素的PB缓冲液(100mM,pH7.0)洗脱即得纯化的生物素化抗原,然后对100倍体积的PB缓冲液透析以去除游离生物素,换液3次,离心上清测定蛋白浓度,4℃或-20℃保存备用,蛋白命名为HCMV-Bio。
1.7.2标记物与链霉亲和素的偶联
取10ml实施例1.3.1中制备的胶体金放入烧杯中,搅拌中加入150ul的0.2M K2CO3调节pH至7.0,继续搅拌20秒;加入一定量的链霉亲和素(生工,货号SE497),继续搅拌10分钟;加入0.1ml 10%BSA,继续搅拌5分钟;5000g离心10分钟,吸出上清,将沉淀收集至一合适容器;对上清再用10000g离心15分钟,重复第一次离心的操作;对上清再用12000g离心30分钟,弃掉上清,将三次离心的沉淀收集到同一离心管中,用胶体金稀释液(20mM PB,150mMNaCl,1%BSA,0.1%TritonX-100,2%Sucrose,0.01%Proclin300)定容至1ml,此标记金标复合物命名为SA-Au。
1.7.3试剂盒的制备
按照跟上面实施例相同的方式组装金标试纸条,调试HCMV-Bio和SA-Au的最佳用量,用此最佳条件组装成一套试剂盒。
1.8HCMV间接生物素化标记抗原的间接标记纳米颗粒检测试剂盒的检测和验证
以意大利Sorin公司的IgM检测试剂盒作为对照,分别比较了生物素系统的间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒检测HCMV IgM阳性血清和阴性血清的效果。结果显示本发明的生物素系统的间接标记试剂盒用于检测HCMV IgM抗体,其灵敏度、特异性等指标均显著优于直接标记的试剂盒。
1.8.1灵敏度
用生物素系统的间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒,在同样的条件下对100份系列稀释比例的HCMV IgM血清进行检测,得到了表1-4的结果,而且对于所有稀释倍数的可检出血清,也基本上是生物素系统的间接标记的灵敏度要明显高,此结果表明,生物素系统的间接标记试剂盒的灵敏度要显著高于直接标记的试剂盒灵敏度。
表1-4生物素系统的间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒检测HCMV IgM抗体的灵敏度比较
1.8.2特异性
用生物素系统的间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒,在同样的条件下对3000份HCMV IgM临床阴性血清进行检测,结果是,生物素系统的间接标记试剂盒的特异性为99.7%,假阳率为0.3%,直接标记试剂盒的特异性为98.5%,假阳率为1.5%,此结果表明,生物素系统的间接标记试剂盒的特异性要显著好于直接标记的试剂盒特异性。
1.8.3稳定性
将本发明的HCMV-Bio-SA-Au标记物放在37℃考核7天,取出后与同时4℃存放的标记物,制备成生物素系统的间接标记的试剂盒,在同一条件下检测相同的阴、阳性血清,以考察生物素系统的标记物的稳定性,结果如表1-5所示。
将本发明的生物素系统的成品试剂盒,在37℃考核7天,取出后与同时4℃存放的生物素系统的试剂盒,在同一条件下检测相同的阴、阳性血清,以考察试剂盒的稳定性,结果如表1-6所示。
表1-5 HCMV-Bio-SA-Au标记物稳定性实验结果
备注:+为弱阳,++为中阳,+++为强阳,-为阴性。
表1-6生物素系统的间接标记成品试剂盒稳定性实验结果
此实验表明,本发明的生物素系统的标记物和试剂盒的稳定性较好。
1.8.4精密性
用生物素系统的间接标记的试剂盒检测同一份已知HCMV IgM阳性标本,做10次重复检测,得到各检测条的结果均为阳性,且各检测条的显色程度也无显著差异,说明本发明的生物素系统的试剂盒精密性较好。
实施例2HEV IgM抗体的间接标记纳米颗粒的抗体检测捕获法检测
2.1HEV重组抗原的制备
2.1.1HEV标记抗原的制备
PCR扩增HEV ORF全长390-660aa所对应的DNA区段,其上游引物带有BamHI位点,下游引物带有EcoRI位点且EcoRI位点之前带有6个His氨基酸的编码序列以及终止密码TAA。PCR的片段经回收之后,用BamHI和EcoRI酶切,连接到用BamHI和EcoRI酶切之后的PGEX-4T-1载体(以下简称p4T),转化大肠杆菌ER2566感受态细胞(美国New England Biolabs公司),铺板于100ug/ml氨苄西林钠(生工,货号A0339)抗性的LB琼脂平板上,置于37℃恒温培养箱培养过夜,次日挑取单菌落,PCR鉴定,阳性克隆转接于2mL LB培养基中,IPTG诱导4h之后,12%SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达结果,正确的克隆委托上海英骏生物技术有限公司测序。
测序正确的菌株,接种于含有100mg/L氨苄西林钠的500mL LB培养基中,置于37℃恒温摇床200rpm培养过夜,加入IPTG诱导4h,收集菌液,5000rpm离心20min,弃上清,沉淀用10mL裂解液裂解,超声破碎菌体,12000rpm离心20min之后,经SDS-PAGE鉴定后,发现大部分目的蛋白分布在裂解液沉淀。每升菌液的菌体用10ml裂解缓冲液(50mM Tirs-HCl,pH8.0,1mM EDTA,100mM NaCl)重悬,超声破碎,4℃12000rpm离心20分钟收集包涵体,用含2%Triton X-100(生工货号T0694)的溶液I(20mM Tirs-HCl,pH8.5,5mM EDTA,100mM NaCl)重悬,4℃12000rpm离心20分钟收集包涵体,用溶液I配制的6M尿素溶解后对100倍体积的PB缓冲液(pH7.0,20mM)透析,换液3次,4℃12000rpm离心20分钟去除沉淀后制成粗抗原,用同一PB缓冲液平衡Sephacryl S-200凝胶柱(美国Amersham Biosciences公司)后将上述粗抗原过柱,收集并合并含目的蛋白的溶液,用5ml平衡缓冲液(10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,140mM NaCl,2.7mM KCl,25mM咪唑(美国Sigma-Aldrich公司,货号I5513),pH8.0)溶解。用10倍柱床体积的平衡缓冲液平衡Ni-NTA亲和柱(Qiagen公司,货号30210)之后,加入蛋白样,用10倍介质体积的平衡缓冲液洗去未结合的蛋白,再用5倍体积洗脱缓冲液(20mMNa2HPO4,300mM NaCl,250mM咪唑,pH8.0),洗脱目的蛋白,测定蛋白浓度,4℃或-20℃保存备用,此蛋白命名为GST-HEV。
2.1.2免疫原和杂交瘤细胞筛选抗原(GST蛋白)的制备
采用实施例1.1.2中的GST抗原。
2.2抗GST杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体的制备
采用实施例1.2中的6F8单克隆抗体。
2.3HEV间接标记的IgM胶体金试剂盒的制备
2.3.1胶体金制备
参见实施例1.3.1,制备合适的胶体金。
2.3.2胶体金标记
参见实施例1.3.2,制备,抗原-胶体金复合物,该间接标记金标复合物命名为GST-HEV-6F8-Au。
2.3.3金标垫制备
将上述金标复合物用胶体金稀释液10倍稀释后浸泡玻璃纤维(Watman公司),冻干,即制成金标垫。
2.3.4硝酸纤维素膜(NC)膜包被
用检测线稀释液(10mM PBS+2%蔗糖)稀释抗人IgMμ链至0.8mg/ml制成检测线工作液,用同一稀释液稀释羊抗鼠IgM单抗至0.5mg/ml制成对照线工作液,用点膜仪将这两种工作液划到硝酸纤维素膜(Millipore公司,货号:HF135002)的相应位置上,37度干燥1小时。
2.3.5HEV检测试剂盒组装
将上述金标垫、包被好的硝酸纤维素膜以及吸水纸、聚酯板、样品垫等辅料组装成HEV金标检测试剂盒。
2.3.6检测方法
加100ul待测样品(例如:血清)到样品垫处,室温放置20分钟之后,判定结果。结果判定标准如下:
①仅质控区出现一条带,在测试区内无条带出现,为阴性(-);
②有两条条带出现,其中一条位于质控区,另一条位于测试区,表示阳性(+);
③质控区未出现条带,表明不正确的操作过程或检测卡已变质损坏。在此情况下,应再次仔细阅读说明书,并用新的试纸条重新测试。
2.4普通的HEV直接标记的IgM纳米颗粒检测试剂盒的制备
2.4.1HEV-Au标记复合物的制备
取10ml实施例2.3.1中制备的胶体金放入烧杯中,搅拌中加入150ul的0.2M K2CO3调节pH至7.0,继续搅拌20秒;加入一定量的GST-HEV抗原,继续搅拌10分钟;加入0.1ml10%BSA,继续搅拌5分钟;5000g离心10分钟,吸出上清,将沉淀收集至一合适容器;对上清再用10000g离心15分钟,重复第一次离心的操作;对上清再用12000g离心30分钟,弃掉上清,将三次离心的沉淀收集到同一离心管中,用胶体金稀释液(20mM PB,150mM NaCl,1%BSA,0.1%TritonX-100,2%Sucrose,0.01%Proclin300)定容至1ml,该金标复合物命名为GST-HEV-Au。
2.4.2HEV直接标记的胶体金试剂盒组装
参见实施例1.3.5,组装HEV直接标记的胶体金检测试纸条。
2.5HEV间接标记与直接标记的最佳标记比例、标记抗原最佳用量的比较
用实施例1.3、1.4的方法,在相同的条件下,采用同样包被好的NC膜,调试间接标记与直接标记的最佳标记比例、标记抗原最佳用量,以比较间接标记与直接标记的抗原用量。调试原则是:在保证标记成功(也就是胶体金不沉淀)的基础上,尽量使检测的灵敏度和特异性达到最佳效果。
2.5.1HEV直接标记的抗原用量
分别用2、5、7.5、10、15、20、30、40ug/ml的GST-HEV抗原进行直接标记考察,结果发现,在标记抗原的量少于7.5ug/ml时,标记过程因出现沉淀而失败,其它条件可以标记成功。把标记成功的抗原-胶体金(GST-HEV-Au),分别制备成试剂盒,通过检测发现直接标记10~20ug/ml标记时灵敏度最高,为最适标记用量。
2.5.2HEV间接标记的抗原用量
分别用2、5、7.5、10、15、20、30、40ug/ml的6F8单抗进行标记考察,结果跟直接标记类似,也是在抗体量少于7.5ug/ml时,标记过程因出现沉淀而失败,其它条件可以标记成功。把标记成功的抗体-胶体金(6F8-Au),在GST-HEV抗原用量相同的条件下,分别制备成试剂盒,通过检测发现抗体20ug/ml标记时灵敏度最高,为抗体的最适标记用量。
在抗体20ug/ml标记时,将GST-HEV抗原用量分别设定为0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2、4ug/ml,比较制备的试剂盒灵敏度和特异性,结果发现,抗原用量为0.25~0.5ug/ml时,试剂盒为最佳条件。
此结果表明,间接标记的抗原用量是直接标记的抗原用量的1/40-1/20左右。
2.6HEV间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒检测效果的比较
分别比较了间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒检测HEV IgM阳性血清和阴性血清的效果。结果显示本发明的试剂盒用于检测HEV IgM抗体,其灵敏度、特异性等指标均显著优于直接标记的试剂盒。
2.6.1灵敏度
用间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒,在同样的条件下对100份系列稀释比例的血清进行检测,得到了表2-1的结果,而且对于所有稀释倍数的可检出血清,也基本上是间接标记法的灵敏度要明显高于直接标记法,此结果表明,间接标记试剂盒的灵敏度要显著高于直接标记的试剂盒灵敏度。
表2-1间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒检测HEV IgM抗体的灵敏度比较
2.6.2特异性
用间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒,在同样的条件下对3000份HEVIgM临床阴性血清进行检测,结果是,间接标记试剂盒的特异性为99.7%,假阳率为0.3%,直接标记试剂盒的特异性为98.7%,假阳率为1.3%,此结果表明,间接标记试剂盒的特异性要显著好于直接标记的试剂盒特异性。
2.6.3稳定性
将本发明的GST-HEV-Au标记物放在37℃考核7天,取出后与同时4℃存放的标记物,制备成间接标记的试剂盒,在同一条件下检测相同的阴、阳性血清,以考察标记物的稳定性,结果如表2-2所示。
将本发明的成品试剂盒,在37℃考核7天,取出后与同时4℃存放的试剂盒,在同一条件下检测相同的阴、阳性血清,以考察试剂盒的稳定性,结果如表2-3所示。
表2-2 GST-HEV-Au标记物稳定性实验结果
备注:+为弱阳,++为中阳,+++为强阳,-为阴性。
表2-3间接标记成品试剂盒稳定性实验结果
此实验表明,本发明的标记物和试剂盒的稳定性较好。
2.6.4精密性
用间接标记的试剂盒检测同一份已知HEV IgM阳性标本,做10次重复检测,得到各检测条的结果均为阳性,且各检测条的显色程度也无显著差异,说明本试剂盒精密性较好。
2.7HEV间接生物素化标记抗原的间接标记纳米颗粒检测试剂盒制备
2.7.1HEV标记抗原的生物素化
采用实施例1.7.1中的载体P2-X,提质粒,用BglII和EcoRI酶切之后,接上2.1.1中的HEV基因片段,得到的阳性克隆,称为P2-X-HEV,此克隆提质粒之后,用EcoRI和HindIII双酶切。提取大肠杆菌ER2566总基因组,以其作为模板对大肠杆菌K12生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶BirA基因Y进行PCR扩增。扩增引物如下:
引物1:5′-CCC GAA TTC ATG AAG GAT AAC ACC GTG CC-3′,引物2:5′-GGG AAGCTT TTA TTT TTC GGC ACT ACG CAG GGA TAT TTC ACC-3′。
其上游引物带有EcoRI位点,下游引物带有终止密码子和HindIII位点。扩增出的基因片段Y经EcoRI/HindIII酶切后克隆到经同样酶切处理的质粒P2-X-HEV之上,得到的阳性克隆为P2-X-HEV-Y。
将P2-X-HEV-Y转化入表达宿主菌株ER2566中,用含100ug/ml卡那霉素且含终浓度20uM D-生物素(美国Sigma-Aldrich公司,货号B-4501)的500ml LB培养基37℃振荡培养至OD600 1.0左右,用终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导,诱导条件为:37℃,200rpm,4小时。离心收集菌体,每升菌液的菌体用10ml裂解缓冲液重悬,超声破碎,4℃12000rpm离心20分钟的沉淀部分目的蛋白分布在裂解液沉淀。每升菌液的菌体用10ml裂解缓冲液(50mM Tirs-HCl,pH8.0,1mM EDTA,100mM NaCl)重悬,超声破碎,4℃12000rpm离心20分钟收集包涵体,用含2%Triton X-100(生工货号T0694)的溶液I(20mM Tirs-HCl,pH8.5,5mM EDTA,100mMNaCl)重悬,4℃12000rpm离心20分钟收集包涵体,用溶液I配制的4M尿素溶解后对100倍体积的PB缓冲液(pH7.0,20mM)透析,换液3次,4℃12000rpm离心20分钟去除沉淀后制成粗抗原,用同一PB缓冲液平衡Sephacryl S-200凝胶柱(美国Amersham Biosciences公司)后将上述粗抗原过柱,收集并合并含目的蛋白的溶液,用5ml平衡缓冲液(10mM Na2HPO4,1.8mMKH2PO4,140mM NaCl,2.7mM KCl,25mM咪唑(美国Sigma-Aldrich公司,货号I5513),pH8.0)溶解。用10倍柱床体积的平衡缓冲液平衡Ni-NTA亲和柱(Qiagen公司,货号30210)之后,加入蛋白样,用10倍介质体积的平衡缓冲液洗去未结合的蛋白,再用5倍体积洗脱缓冲液(20mMNa2HPO4,300mM NaCl,250mM咪唑,pH8.0),洗脱目的蛋白,测定蛋白浓度,4℃或-20℃保存备用,此蛋白命名为蛋白命名为CMV-Bio。
2.7.2标记物与链霉亲和素的偶联
参见实施例1.7.2制备SA-Au偶联物。
2.7.3试剂盒的制备
按照跟实施例2.5相同的方式组装金标试纸条,调试HEV-Bio和SA-Au的最佳用量,用此最佳条件组装成一套试剂盒。
2.8HEV间接生物素化标记抗原的间接标记纳米颗粒检测试剂盒的检测和验证
分别比较了生物素系统的间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒检测HEVIgM阳性血清和阴性血清的效果。结果显示本发明的生物素系统的间接标记试剂盒用于检测HEV IgM抗体,其灵敏度、特异性等指标均显著优于直接标记的试剂盒。
2.8.1灵敏度
用生物素系统的间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒,在同样的条件下对100份系列稀释比例的HEV IgM血清进行检测,得到了表2-4的结果,而且对于所有稀释倍数的可检出血清,也基本上是生物素系统的间接标记的灵敏度要明显高,此结果表明,生物素系统的间接标记试剂盒的灵敏度要显著高于直接标记的试剂盒灵敏度。
表2-4生物素系统的间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒检测HEV IgM抗体的灵敏度比较
2.8.2特异性
用生物素系统的间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒,在同样的条件下对3000份HEV IgM临床阴性血清进行检测,结果是,生物素系统的间接标记试剂盒的特异性为99.5%,假阳率为0.5%,直接标记试剂盒的特异性为98.4%,假阳率为1.6%,此结果表明,生物素系统的间接标记试剂盒的特异性要显著好于直接标记的试剂盒特异性。
2.8.3稳定性
将本发明的HEV-Bio-SA-Au标记物放在37℃考核7天,取出后与同时4℃存放的标记物,制备成生物素系统的间接标记的试剂盒,在同一条件下检测相同的阴、阳性血清,以考察生物素系统的标记物的稳定性,结果如表2-5所示。
将本发明的生物素系统的成品试剂盒,在37℃考核7天,取出后与同时4℃存放的生物素系统的试剂盒,在同一条件下检测相同的阴、阳性血清,以考察试剂盒的稳定性,结果如表2-6所示。
表2-5 HEV-Bio-SA-Au标记物稳定性实验结果
备注:+为弱阳,++为中阳,+++为强阳,-为阴性。
表2-6生物素系统的间接标记成品试剂盒稳定性实验结果
此实验表明,本发明的生物素系统的标记物和试剂盒的稳定性较好。
2.8.4精密性
用生物素系统的间接标记的试剂盒检测同一份已知HEV IgM阳性标本,做10次重复检测,得到各检测条的结果均为阳性,且各检测条的显色程度也无显著差异,说明本发明的生物素系统的试剂盒精密性较好。
Claims (10)
1.一种纳米颗粒的抗体检测捕获法,所述方法包括步骤(i)将抗IgM抗体连接在固相载体上,形成固相抗IgM抗体,(ii)标记抗原与纳米颗粒类标记物标记成标记复合物,(iii)加入待检样品,样品中的待检抗体与标记抗原和抗IgM抗体在固相支持物上结合形成可检测的复合物;其特征在于,纳米颗粒类标记物与标记抗原之间的标记是通过抗原上的标签和标记在纳米颗粒标记物上的可特异性识别该标签的配体相结合来完成的间接标记,从而使纳米颗粒类标记物与标记抗原以比例可控的方式进行标记;其中的标记抗原为基因工程重组抗原。
2.根据权利要求1的纳米颗粒的抗体检测捕获法,其中待检抗体包括但不限于艾滋病毒IgM抗体、甲型肝炎病毒IgM抗体、乙型肝炎病毒IgM抗体、丙型肝炎病毒IgM抗体、丁型肝炎病毒IgM抗体、戊型肝炎病毒IgM抗体、庚型肝炎病毒IgM抗体、风疹病毒IgM抗体、人巨细胞病毒IgM抗体、单纯疱疹病毒1型IgM抗体、单纯疱疹病毒2型IgM抗体、狂犬病毒IgM抗体、人类T淋巴细胞白血病病毒IgM抗体、登革热病毒IgM抗体、人乳头瘤病毒IgM抗体、西尼罗河病毒IgM抗体、森林脑炎病毒IgM抗体、麻疹病毒IgM抗体、流感病毒IgM抗体、副流感病毒IgM抗体、水痘病毒IgM抗体、艾柯病毒IgM抗体、柯萨奇病毒IgM抗体、乙型脑炎病毒IgM抗体、EB病毒IgM抗体、腮腺炎病毒IgM抗体、梅毒螺旋体IgM抗体、包柔氏螺旋体IgM抗体、沙眼衣原体IgM抗体、肺炎衣原体IgM抗体、鹦鹉热衣原体IgM抗体、解脲脲原体IgM抗体、肺炎支原体IgM抗体、结核分枝杆菌IgM抗体、幽门螺旋杆菌IgM抗体、淋球菌IgM抗体、疟原虫IgM抗体、枯氏锥虫IgM抗体、弓形虫IgM抗体。
3.根据权利要求1的纳米颗粒的抗体检测捕获法,其中所述的纳米颗粒类标记物为纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒、稀土络合物纳米颗粒,以及它们各自的衍生物,或者两者以上的组合物。
4.根据权利要求3的纳米颗粒的抗体检测捕获法,其中所述的胶体包括胶体金属、分散型染料和染料标记的微球、乳胶。
5.根据权利要求4的纳米颗粒的抗体检测捕获法,其特征在于所述的胶体金属为胶体金、胶体银、胶体硒。
6.根据权利要求1的纳米颗粒的抗体检测捕获法,其中所述的标签为多肽或蛋白、生物素,以及它们各自的衍生物,或者两者以上的组合物。
7.根据权利要求6的纳米颗粒的抗体检测捕获法,其中所述的多肽或蛋白包括但不限于His Tag、T7Tag、S Tag、Flag Tag、HA Tag、GST融合蛋白、Trx融合蛋白、SOD融合蛋白、CKS融合蛋白、DsbA融合蛋白、MBP融合蛋白、CBD融合蛋白,或者他们的截取部分、组合体、嵌合体。
8.根据权利要求6的纳米颗粒的抗体检测捕获法,其中所述标签为生物素的标记方法包括体内酶促生物素化、体外生物素化、间接生物素化、氨基酸的生物素化。
9.根据权利要求1的纳米颗粒的抗体检测捕获法,其中所述的配体包括但不限于针对标签的特异性抗体、与标签有亲和力的物质如链霉亲和素,或其类似物。
10.一种应用根据权利要求1-9的纳米颗粒的抗体检测捕获法的检测试剂盒,所述试剂盒包含:固定在固相支持物上的抗IgM抗体;标记抗原以及与之缀合的标签;纳米颗粒标记物以及标记在其上的可特异性识别该标签的配体;其特征在于,所述配体与标签特异性结合,从而使纳米颗粒类标记物与标记抗原以比例可控的方式进行标记;其中所述标记抗原为基因工程重组抗原。
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