CN111220803A

CN111220803A - 一种新型冠状病毒抗体检测试剂及其制备方法、新型冠状病毒抗体检测卡

Info

Publication number: CN111220803A
Application number: CN202010158081.3A
Authority: CN
Inventors: 王志增; 马远方; 王宣策; 郑植; 魏寅祥; 王耀辉; 张海龙; 李霞; 张军
Original assignee: Henan University
Current assignee: Shenzhen Wenwen Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-03-09
Filing date: 2020-03-09
Publication date: 2020-06-02
Anticipated expiration: 2040-03-09
Also published as: CN111220803B

Abstract

本发明涉及一种新型冠状病毒抗体检测试剂及其制备方法、新型冠状病毒抗体检测卡，属于新型冠状病毒检测技术领域。本发明的新型冠状病毒抗体检测试剂，包括分散介质和分散在所述分散介质中的纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白；所述纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白由纳米硒和重组蛋白结合得到，所述重组蛋白由新型冠状病毒核蛋白和标签蛋白构成，所述新型冠状病毒核蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的新型冠状病毒抗体检测试剂，通过纳米硒粒子和新型冠状病毒核蛋白的结合构建纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白，该标记物的稳定性好、特异性高，可方便、高效地用作SARS‑CoV‑2的感染检测。

Description

一种新型冠状病毒抗体检测试剂及其制备方法、新型冠状病毒抗体检测卡

技术领域

本发明涉及一种新型冠状病毒抗体检测试剂及其制备方法、新型冠状病毒抗体检测卡，属于新型冠状病毒检测技术领域。

背景技术

新型冠状病毒即严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(serve acute respiratorysyndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)和2003年的SARS冠状病毒以及2012年的MERS冠状病毒同属于冠状病毒科β属，同时该病毒也被世界卫生组织列为感染人的第七个冠状病毒。该病毒感染后，潜伏期7-14天，发病后均伴有肺炎情况，常见症状为发热、咳嗽和肌痛或疲劳；较不常见的症状有痰、头痛、咯血、腹泻、呼吸困难等。该症状与普通感冒相似，如不及时诊治会有呼吸困难并最终死亡的情况。

SARS-CoV-2通过飞沫、空气传播，同时具有粪口和母婴传播的可能。该病毒感染不存在年龄偏好性，无论是老人(98岁)还是婴儿(30小时)均有确诊病例；同时存在家庭聚集性爆发和无症状传染者等情况。由于是新病毒，因此尚且没有特效药，所以尽早的诊断则更加的重要。

2020年2月18日，国家卫生健康委员会办公厅印发《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)》指出SARS-CoV-2感染主要通过实验室检查、胸部影像学、PCR及基因测序等方法进行检查。这些筛查手段需要在医疗机构进行，SARS-CoV-2所引起的疾病具有一定的潜伏期、且有无症状传染者，因此需要便携、快捷、实时的筛查方法对SARS- CoV-2引起的感染进行防控，侧向免疫层析技术则可以满足该要求。

侧向免疫层析(Lateral flow immunoassays，LFIA)(图2)具有快速、简便、准确、稳定、便携等优点。其主要有样品垫、结合垫、NC膜(反应垫)、底板以及吸水垫构成。其中，T检测线和C质控线固定在NC膜上，纳米标记物固定在结合垫上。将样品滴加到样品垫上，随着毛细管作用，检测样品从样品垫向吸水垫方向流动，当样品流经结合垫时，使结合垫上的纳米粒子-抗体复合物复溶，并与之发生反应；当样品-纳米粒子-抗体复合物流经 NC膜时，又分别与NC膜上的T检测线与C质控线发生反应，最终根据T检测线与C质控线的显色进行结果判断。

LFIA应用的关键是获取特异性识别目标抗原或抗体的标志物，标志物的选取不合理，会直接影响检测结果的成功率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒抗体检测试剂，其以纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白为标记探针，具有稳定性好，特异性好等优点，可用于新型冠状病毒的快速准确筛查。

本发明的第二个目的在于提供上述新型冠状病毒抗体检测试剂的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供一种新型冠状病毒抗体检测卡。

为实现上述目的，本发明的新型冠状病毒抗体检测试剂的技术方案是：

一种新型冠状病毒抗体检测试剂，包括分散介质和分散在所述分散介质中的纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白；所述纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白由纳米硒和重组蛋白结合得到，所述重组蛋白由新型冠状病毒核蛋白和标签蛋白构成，所述新型冠状病毒核蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SARS-CoV-2的基因组编码4种结构蛋白：棘突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核蛋白。其相对于变异性强的刺突蛋白更加稳定，特异性好，经试验证实对SARS-CoV-2感染产生的IgG、IgM有高特异性识别，可用于新型冠状病毒感染的检测。该重组蛋白由新型冠状病毒核蛋白和标签蛋白构成。所述标签蛋白可以为His标签、Fc标签、CST标签等。

优选的，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

合适标记物是侧向免疫层析技术应用的关键，理想的标记物应具备性能稳定、生物相容性好等要求，经验证，纳米硒与上述新型冠状病毒核蛋白具有良好的匹配性，不仅稳定性好，而且重悬性、悬浮稳定性好，非常适于用作侧向免疫层析的标记物。

本发明提供的新型冠状病毒抗体检测试剂，通过纳米硒粒子和新型冠状病毒核蛋白的结合构建纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白，该标记物的稳定性好、特异性高，可方便、高效用作的SARS-CoV-2的感染检测。

从重悬、性能稳定性方面进一步优选，所述纳米硒的粒径为35-50nm。

分散介质能够保证硒标记的新型冠状病毒核蛋白均匀、稳定分散即可。在侧向免疫层析技术中，该蛋白试剂常被用作结合垫的包被液，相应的分散介质为满足结合垫正常工作的工作液，该该种情形下，优选的，所述分散介质由pH为7-9的Tris-HCl缓冲液(Tris即为三羟甲基氨基甲烷)、Tween-20、蔗糖、海藻糖和BSA组成，Tween-20的体积终浓度为0.05-0.25％，蔗糖的质量终浓度为10-11％，海藻糖的质量终体积为4-10％，BSA的质量终体积为0.5-1.5％。Tris-HCl缓冲液的配制方法如下：配制质量浓度为0.2-1.2％的三羟甲基氨基甲烷溶液，然后加盐酸调pH为7-9。质量终体积指的是每毫升溶液中对应的质量分数，即BSA的质量终体积为0.5-1.5％中“0.5-1.5％”的单位为g/mL。该种工作液的优点在于可以减少临床样本中的非特异性干扰，降低检测结果的假阳性率。

本发明的新型冠状病毒抗体检测试剂的制备方法所采用的技术方案是：

一种新型冠状病毒抗体检测试剂的制备方法，包括以下步骤：在碱性条件下，将所述重组蛋白分散在纳米硒溶液中，使纳米硒溶液中纳米硒和重组蛋白结合，再加入封闭剂进行封闭处理，离心，弃去上清后用分散介质重悬，即得。

本发明的新型冠状病毒抗体检测试剂的制备方法，制备工艺简单，条件温和，所得纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白具有对电解质不敏感，对SARS-CoV-2抗体检测的特异性好，灵敏度高。

纳米硒溶液的制备可参考现有技术，为得到规整度好的纳米硒粒子，优选的，所述纳米硒溶液由包括以下步骤的方法得到：亚硒酸、抗坏血酸、模板剂在水中反应，即得。

为获得形貌规整、一致性好的纳米硒粒子，优选的，所述模板剂为聚乙二醇和十二烷基硫酸钠，聚乙二醇和十二烷基硫酸钠的摩尔比为(10-40):1。

为进一步改善纳米硒粒子的重悬性、悬浮稳定性等特性，优选的，反应时亚硒酸在反应体系中的浓度为2-4mM，抗坏血酸在反应体系中的浓度为8-32mM，聚乙二醇在反应体系中的浓度为25-100mM，十二烷基硫酸钠在反应体系中的浓度为1.25-5mM。

为更好的实现纳米硒和新型冠状病毒核蛋白的结合，优选的，步骤2)中，所述碱性条件为pH＝8-10。

纳米硒和新型冠状病毒核蛋白的相对用量满足检测要求即可，从成本和新型冠状病毒核蛋白充分结合方面考虑，优选的，所述结合时，每3μmol硒元素形成的纳米硒颗粒对应重组蛋白的标记量为(10-40)μg。

为方便反应的快速、均匀进行，更优选的，纳米硒溶液中硒元素的浓度为2-4mM，每毫升纳米硒溶液对应加入(2.5-80)μL重组蛋白稀释液，重组蛋白稀释液的浓度为(0.5-4)mg/mL。

本发明的新型冠状病毒抗体检测卡所采用的技术方案是：

一种新型冠状病毒抗体检测卡，包括样品垫和吸水垫，还包括设置在样品垫和吸水垫之间的结合垫、反应垫，所述结合垫、反应垫沿层析方向依次设置，结合垫上固定有纳米硒标记的，所述纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白由纳米硒和重组蛋白结合得到，所述重组蛋白由新型冠状病毒核蛋白和标签蛋白构成，所述新型冠状病毒核蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；反应垫上沿层系方向依次包被有检测线和质控线。

样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫为侧向免疫层析试纸条的典型设计，相关处理液以及相应材料的选择可参考相关现有技术。

本发明提供的新型冠状病毒抗体检测卡，采用纳米硒粒子和新冠病毒重组蛋白结合，作为新冠病毒抗体检测用的显色标记物，能够满足对新冠病毒早期感染和无症状感染者的筛查，检测的特异性好，灵敏度高。

新型冠状病毒核蛋白上带有His标签，质控线上对应包被抗His抗体。可通过两者的特异性结合，来检验检测卡的有效性。

为提高检测的有效性，优选的，所述检测线有一条，包被抗人IgM抗体或抗人IgG抗体；或者所述检测线有二条，分别包被抗人IgM抗体和抗人IgG抗体。病毒侵入人体后，免疫系统会产生免疫应答并产生抗体，免疫球蛋白M(IgM)是最早产生的抗体，可以预示新冠病毒的早期感染，IgG提示既往感染。抗人IgM抗体和抗人IgG抗体的配合使用，可实现一张检测卡同时确定血清中的IgM抗体和IgG抗体情况，有利于结果判读，进一步提高检测的有效性。

附图说明

图1为本发明中新型冠状病毒核蛋白纯化过程的电泳比较图；

图2为实施例11中制得的检测卡示意图，图中，1为底板，2为样品垫，3为结合垫， 4为反应垫，5为吸水垫，T为检测线，C为质控线；箭头方向为层析方向；

图3为实施例11制得的检测卡检测结果对比图，图中，A为阳性结果，即被检样品中含有灵敏度以上的新冠病毒抗体时的结果；B为阴性结果，即被检样品中不含或者含有灵敏度以下的新冠病毒抗体的结果；C为无效结果；

图4为本发明制备的纳米硒的外观、离心及重悬效果图；

图5为本发明中纳米硒与新型冠状病毒核蛋白在不同pH下结合对应的检测卡的检测结果图；

图6为本发明中不同重组蛋白标记浓度和不同检测线包被浓度对应的检测卡的检测结果图；

图7为本发明中不同检测线包被浓度对应的检测卡的检测结果图；

图8为本发明中IgM检测卡的临床检测结果图；

图9为本发明中IgG检测卡检测结果图；

图10为本发明中所用分散介质与常规PBS分散介质检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

本发明实施例及对比例中，抗人IgG抗体和抗IgM抗体购自广州菲鹏，抗His抗体购自洛阳佰奥通生物技术有限公司。聚乙二醇为PEG4000，购自北京百灵威科技有限公司(货号：939758)。

以下实施例中，由广东省实验动物监测所丛锋课题组获得“SARS-CoV-2核蛋白表达菌株”，然后通过保种、扩大、蛋白纯化得到目的蛋白。现将纯化过程简述如下：

(一)菌液扩增，诱导表达，收集菌液并超声

a)将转化有pet-28a-SARS-CoV-2-NP质粒的BL21大肠杆菌菌种(即SARS-CoV-2核蛋白表达菌株)划板，37℃培养过夜。

b)挑取单克隆到5ml含卡那抗性的2YT培养基中，37℃、220rpm培养过夜。

c)将菌液按1:500扩大到1L，37℃、150rpm培养至OD值为0.4-0.6，加入1ml 0.1MIPTG，30℃、150rpm培养6h。

d)将菌液12000rpm离心2min，分批收集到3个50ml离心管中，弃掉上清，沉淀用30ml PBS重悬后，12000rpm离心2min，弃掉上清，沉淀用40ml结合缓冲液(20mM咪唑，3.78mMNaH₂PO₄·2H₂O，16.20mM Na₂HPO₄，200mM NaCl，pH7.4)重悬，置于冰上超声，功率300W，超声10s，停10s，50次。超声后的菌液12000rpm离心10min，上清经 0.22μm滤膜过滤。

(二)蛋白纯化

利用AKTApure对超声后的上清进行纯化，纯化柱为GE公司HisTrap HP 5ml预装柱，流速为5ml/min。纯化所用试剂均过0.45μm滤膜并超声20min脱气。

e)柱平衡：用10个柱体积的结合缓冲液平衡柱子。

f)上样：将过滤后的菌液上清上样。

g)除杂：将88％的结合缓冲液和12％的洗脱缓冲液(500mM咪唑，3.78mM NaH₂PO₄·2H₂O，16.20mM Na₂HPO₄，200mM NaCl，pH7.4)混合，洗10个柱体积用于去除非特异性结合的蛋白。

h)洗脱：将50％的结合缓冲液和50％的洗脱缓冲液混合，洗5个柱体积用于洗脱目的蛋白，洗脱过程中暂停3-5min进行孵育以便更好地洗脱目的蛋白。

(三)蛋白透析及储存

i)洗脱后的蛋白透析到2×PBS，透析3次，第1次透析过夜，第2次、第3次各透析4h。

j)透析后的蛋白经无菌0.22μm滤膜过滤，分装到无菌EP管中。以上纯化过程的电泳图如图1所示。以上目的蛋白的表达、纯化步骤不限于以上具体操作，目的蛋白的纯度能够满足常规血清抗体的检测即可。

转化有pet-28a-SARS-CoV-2-NP质粒的BL21大肠杆菌菌种也可自行合成，采用以下步骤：

1)在基因合成服务公司合成新型冠状病毒核蛋白编码基因(如SEQ ID NO.3所示，编码SARS-CoV-2的N蛋白)，基因5’端和3’端分别加上酶切位点，如EcoRI和XhoI酶切位点，连接到载体(例如pUC57)上。

2)利用EcoRI和XhoI双酶切，将目的基因从载体上切下，同时利用EcoRI和XhoI双酶切将pET28a载体切开，将目的基因连接到pET28a载体上，转化酶连产物到大肠杆菌 (如DH5α，Top10等)，挑取单克隆扩增并进行测序，序列正确的质粒用于后续实验。

3)将pET28a-SARS-CoV-2-N转化到BL21大肠杆菌中，挑取单克隆到5ml含卡纳抗性的2YT培养基中，37℃、220rpm培养14h。将菌液1：1000扩大到100ml 2YT培养基中， 37℃、220rpm培养至OD值为0.4-0.6，加入终浓度0.1mM IPTG，30℃、220rpm培养6h。

4)分别吸取1ml诱导前和诱导后的菌液，离心后弃上清，菌液用100μl 2×loading重悬，煮10min。诱导后的菌液离心收集到50ml离心管中，用20ml PBS重悬。再次离心，弃掉上清，用20ml PBS重悬菌液后，300W超声10s，停10s，重复50次。取1ml超声后的菌液离心，取上清200μl加5×loading，沉淀加100μl 2×loading重悬，煮10min。

5)制备好的样品用于SDS-PAGE，随后考马斯亮蓝染色，鉴定目的蛋白是否表达。若目的蛋白正常表达，则该菌液可作为菌株，加入40％无菌甘油冻存。

一、本发明的新型冠状病毒抗体检测试剂的具体实施例如下：

实施例1

本实施例的新型冠状病毒抗体检测试剂，包括分散介质和分散在分散介质中的纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白。

纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白由纳米硒和重组蛋白结合得到。重组蛋白由新型冠状病毒核蛋白和标签蛋白构成，新型冠状病毒核蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。标签蛋白为His标签。

每3μmol纳米硒(以硒元素计)对应重组蛋白的标记量为20μg。以重组蛋白计，其在分散介质中的浓度为200μg/mL(200μg/mL对应核蛋白在工作液重悬后的浓度)。

分散介质由pH为8的Tris-HCl缓冲液、Tween-20、蔗糖、海藻糖和BSA组成，分散介质中各组分的终浓度为：Tris的质量终浓度为0.4％，Tween-20的体积终浓度为0.1％，蔗糖的质量终浓度为10％，海藻糖的质量终体积为5％，BSA的质量终体积为1％。

实施例2

本实施例的新型冠状病毒抗体检测试剂，与实施例1的区别在于：每3μmol纳米硒(以硒元素计)对应重组蛋白的标记量为15μg，对应核蛋白标记量15μg/mL。以重组蛋白计，其在分散基质中的浓度为150μg/mL。

实施例3

本实施例的新型冠状病毒抗体检测试剂，与实施例1的区别在于：每3μmol纳米硒(以硒元素计)对应重组蛋白的标记量为10μg，对应核蛋白标记量10μg/m。以重组蛋白计，其在分散基质中的浓度为100μg/mL。

实施例4

本实施例的新型冠状病毒抗体检测试剂，与实施例1的区别在于：

分散介质由pH为8的Tris-HCl缓冲液、Tween-20、蔗糖、海藻糖和BSA组成，分散介质中各组分的终浓度为：Tris的质量终浓度为0.2％，Tween-20的体积终浓度为0.2％，蔗糖的质量终浓度为10％，海藻糖的质量终体积为7％，BSA的质量终体积为0.8％。

实施例5

二、本发明的新型冠状病毒抗体检测试剂的制备方法的具体实施例如下：

实施例6

本实施例的新型冠状病毒抗体检测试剂的制备方法，制得的是实施例1的新型冠状病毒抗体检测试剂，步骤如下：

(1)用于新冠病毒抗体检测的纳米硒溶液的制备

取80mL超纯水置于250mL小烧杯中，加入5mL的1M的PEG，和5mL的0.05M的 SDS室温搅拌20min，得模板溶液。

将5mL的0.32M的抗坏血酸溶于模板溶液中，室温搅拌20min，分散均匀，得抗坏血酸模板溶液。

将5mL的0.06M的亚硒酸溶于上述抗坏血酸模板溶液中，室温搅拌20min，分散均匀，即得纳米硒溶液，其中纳米硒粒子的粒径为45nm。

(2)新型冠状病毒抗体检测试剂的制备

取1mL步骤(1)制得的纳米硒溶液，用碳酸钾溶液调节pH为10，室温混匀5min，然后加入10μL的重组蛋白稀释液(以pH＝9.6的10mM PBS稀释，浓度为2mg/mL；针对 1mL纳米硒溶液，重组蛋白的标记浓度为20μg/mL)，室温混匀30min，使核蛋白充分地结合到纳米硒颗粒上。

再加入0.015g BSA，室温混匀30min，以封闭纳米硒纳米颗粒上的裸露位点。

在4℃下，8000rpm的转速下离心10min，小心弃去上清，用0.1mL工作液重悬沉淀。工作液即为实施例1中的分散介质。

实施例7

本实施例的新型冠状病毒抗体检测试剂的制备方法，制得的是实施例2的新型冠状病毒抗体检测试剂，与实施例6的区别在于：

步骤2)中，加入7.5μL的重组蛋白稀释液(以pH＝9.6的10mM PBS稀释，浓度为2mg/mL，以15μg/mL的重组蛋白标记浓度使纳米硒与重组蛋白结合。

实施例8

本实施例的新型冠状病毒抗体检测试剂的制备方法，制得的是实施例3的新型冠状病毒抗体检测试剂，与实施例6的区别在于：

步骤2)中，加入5μL的重组蛋白稀释液(以pH＝9.6的10mM PBS稀释，浓度为 2mg/mL，以10μg/mL的重组蛋白标记浓度使纳米硒与重组蛋白结合。

实施例9

本实施例的新型冠状病毒抗体检测试剂的制备方法，制得的是实施例4的新型冠状病毒抗体检测试剂，与实施例6的区别在于：

步骤1)中：取80mL超纯水置于250mL小烧杯中，加入5mL的0.8M的PEG，和 5mL的0.03M的SDS室温搅拌20min，得模板溶液。

将5mL的0.06M的亚硒酸溶于上述抗坏血酸模板溶液中，室温搅拌20min，分散均匀，即得纳米硒溶液。

实施例10

本实施例的新型冠状病毒抗体检测试剂的制备方法，制得的是实施例5的新型冠状病毒抗体检测试剂，与实施例6的区别在于：

步骤1)中：取80mL超纯水置于250mL小烧杯中，加入5mL的1.2M的PEG，和 5mL的0.06M的SDS室温搅拌20min，得模板溶液。

三、本发明的新型冠状病毒抗体检测卡的具体实施例如下：

实施例11

本实施例的新型冠状病毒抗体检测卡，包括样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫，结合垫上固定有实施例1中的纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白，反应垫上包被有检测线和质控线。

检测线有一条，包被抗人IgM抗体。质控线上包被有抗His抗体。

新型冠状病毒抗体检测卡由以下方法制备得到：

(1)结合垫的制备：将实施例6制备的新型冠状病毒抗体检测试剂均匀的铺在GF-06 玻璃纤维膜上(2.8mm×85mm)；在温度为37℃的鼓风干燥箱中干燥3h，使抗体检测试剂中纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白固化在玻璃纤维膜上，取出放入自封袋，加入干燥剂，密封保存。

(2)样品垫的制备：把GF-06玻璃纤维膜裁剪成(22mm×200mm)，浸泡在样品垫处理液中5min，弃去多余液体，置于37℃鼓风干燥箱中干燥12h，取出，放入自封袋中备用。样品垫处理液为摩尔浓度为0.01M(pH 7.2)的磷酸盐缓冲液，血清体积终浓度为 10％，抗人IgM抗体终浓度为0.5％，Tween-20体积终浓度为1％。样品垫处理液中含抗人 IgM抗体，其可消除血液、血清、血浆样本中人IgM的干扰。

(3)硝酸纤维素膜的制备：把NC膜裁剪为25mm×100mm的规格，贴在PVC板的中间位置；用PBS(pH为7.2)把抗人IgM抗体(1.5mg/mL)(广州菲鹏生物技术有限公司) 作为T线包被原，用PBS(pH为7.2)把抗His抗体稀释为1mg/mL；作为C线包被原；用喷金划膜仪以1μL/cm划膜，置于37℃鼓风干燥箱干燥3h，取出放入自封袋，备用。

(4)检测卡的制备：将制备好的结合垫贴在已制好的反应垫的前端，压反应垫1mm，同时将结合垫固定在检测卡底板上；再将样品垫贴在结合垫的前端，压住结合垫2mm，同时将样品垫固定在检测卡底板上；最后将吸水纸(17mm×100mm)贴在PVC板的末端，压住反应垫2mm，同时将吸水纸固定在检测卡地板上，得到的检测卡的示意图如图2所示，1 为底板(PVC板)；2为样品垫；3为结合垫，4为反应垫，T为检测线，C为质控线，5为吸水垫；将组装好的检测卡放入切条机中，切成4mm宽的试剂条，放入卡壳中，即得IgM 检测卡。

实施例12

本实施例的新型冠状病毒抗体检测卡，与实施例11的不同之处仅在于，检测线包被抗人IgG抗体，其余均同实施例11。相应地，由以下方法制备得到：

(2)样品垫的制备：把GF-06玻璃纤维膜裁剪成(22mm×200mm)，浸泡在样品垫处理液中5min，弃去多余液体，置于37℃鼓风干燥箱中干燥12h，取出，放入自封袋中备用。样品垫处理液为摩尔浓度为0.01M(pH 7.2)的磷酸盐缓冲液，血清体积终浓度为 10％，Tween-20体积终浓度为1％。

(3)硝酸纤维素膜的制备：把NC膜裁剪为25mm×100mm的规格，贴在PVC板的中间位置；用PBS(pH为7.2)把抗人IgG抗体(2mg/mL)(广州菲鹏生物技术有限公司)作为T线包被原，用PBS(pH为7.2)把抗His抗体稀释为1mg/mL；作为C线包被原；用喷金划膜仪以1μL/cm划膜，置于37℃鼓风干燥箱干燥3h，取出放入自封袋，备用。

(4)检测卡的制备：将制备好的结合垫贴在已制好的反应垫的前端，压反应垫1mm，同时将结合垫固定在检测卡底板上；再将样品垫贴在结合垫的前端，压住结合垫2mm，同时将样品垫固定在检测卡底板上；最后将吸水纸(17mm×100mm)贴在PVC板的末端，压住反应垫2mm，同时将吸水纸固定在检测卡地板上；将组装好的检测卡放入切条机中，切成4mm宽的试剂条，放入卡壳中，即得IgG检测卡。

实施例13

本实施例的新型冠状病毒抗体检测卡，与实施例11的不同之处仅在于，检测线有两条，沿层析方向依次包被抗人IgM抗体和抗人IgG抗体，其余均同实施例11。相应地，由以下方法制备得到：

(1)结合垫的制备：将实施例6制备的重组蛋白试剂均匀的铺在GF-06玻璃纤维膜上 (2.8mm×85mm)；在温度为37℃的鼓风干燥箱中干燥3h，使抗体检测试剂中纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白固化在玻璃纤维膜上，取出放入自封袋，加入干燥剂，密封保存。

(2)样品垫的制备：把GF-06玻璃纤维膜裁剪成(22mm×200mm)，浸泡在样品垫处理液中5min，弃去多余液体，置于37℃鼓风干燥箱中干燥12h，取出，放入自封袋中备用。样品垫处理液为摩尔浓度为0.01M(pH 7.2)的磷酸盐缓冲液，血清体积终浓度为 10％，抗人IgM抗体终浓度为0.5％，Tween-20体积终浓度为1％。

(3)硝酸纤维素膜的制备：把NC膜裁剪为25mm×100mm的规格，贴在PVC板的中间位置；用PBS(pH为7.2)把抗人IgM抗体(1.5mg/mL)和抗人IgG抗体(2mg/mL) (广州菲鹏生物技术有限公司)作为T线包被原，用PBS(pH为7.2)把抗His抗体稀释为 1mg/mL；作为C线包被原；用喷金划膜仪以1μL/cm划膜，置于37℃鼓风干燥箱干燥3h，取出放入自封袋，备用。

(4)检测卡的制备：将制备好的结合垫贴在已制好的反应垫的前端，压反应垫1mm，同时将结合垫固定在检测卡底板上；再将样品垫贴在结合垫的前端，压住结合垫2mm，同时将样品垫固定在检测卡底板上；最后将吸水纸(17mm×100mm)贴在PVC板的末端，压住反应垫2mm，同时将吸水纸固定在检测卡地板上；将组装好的检测卡放入切条机中，切成4mm宽的试剂条，放入卡壳中，即得。

在有两条检测线的实施情形下，包被抗人IgM抗体的检测线和包被抗人IgG抗体的检测线位置可调换，其检测效果相当。

四、相关试验例

试验例1检测卡结果判定

以实施例11为例，制得的检测卡结果判定方法如图3所示，其中，质控线在上，检测线在下；A显示两条线均显色，则被检样品中含有灵敏度以上的新冠病毒抗体；B显示质控线显色，检测线不显色，被检样品中不含或者含有灵敏度以下的新冠病毒抗体；C显示质控线不显色的情况，则检测卡失效。

试验例2纳米硒溶液的状态

对实施例6制备得到的纳米硒进行观察，得到的照片如图4所示，图4中，A、B为制得的纳米硒溶液的照片，C为离心后的照片，D为重悬后的照片。

由图4可知，采用SDS和PEG为模板制得的纳米硒(图4A和4B)清澈透明，且离心后(如图4C所示)上清清澈透明，无红色，固液分离完全，重悬后(如图4D所示)溶液均匀，说明重悬性较好。

试验例3纳米硒与新型冠状病毒核蛋白结合时pH的选择

为了制备性能优异的纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白，利用碳酸钾调整纳米硒溶液 pH分别至6.5、7、7.5、8、9和10(均以实施例8的方法为基础)，以重组蛋白终浓度为 10μg/mL进行标记，以2mg/mL的浓度进行检测线的包被，以1mg/mL浓度进行质控线的包被，得到纳米硒在不同pH下与重组蛋白结合所对应的检测卡的检测结果，具体如图5所示。

重组蛋白与纳米硒粒子的高效结合至关重要，其直接决定了是否能进行抗体检测，是否可以达到临床判断的显色以及灵敏度要求。在实验时发现，重组蛋白与纳米硒粒子结合时，当pH为6.5、7、7.5时，有挂壁且难以重悬，表明其结合效果欠佳，不能满足检测要求。

在pH为8-10时，试剂的重悬性、均一性满足要求，进一步考察其显色性。图5中，通过用血清检测，无论是IgG检测检测卡还是IgM检测检测卡，pH为8、9、10时，均没有假阳性产生，但pH为8时，对应显色效果稍差；结合核蛋白等电点预测，最终选择pH为 10作为纳米硒标记新型冠状病毒核蛋白的最佳标记酸碱值。

试验例4重组蛋白标记浓度和检测线包被浓度的选择

为了得到灵敏度高的检测卡，将纳米硒溶液pH调节至10，分别选择不同重组蛋白标记浓度(5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL)和不同检测线包被浓度(1mg/mL、2mg/mL、 4mg/mL)进行检测卡制备，并检测相应检测卡对应的灵敏度，得到的不同标记浓度和不同包被浓度对应的检测卡的检测结果如图6所示。由图6可知，当重组蛋白标记浓度为5 μg/mL、检测线包被浓度为1mg/mL时，IgM检测卡在检测带位置有浅色条带产生，为假阳性，因此排除5μg/mL的标记条件，其他均未出现假阳性。

鉴于新冠抗体筛查检测卡对灵敏度要求高，因此选取重组蛋白标记浓度为20μg/mL，对不同的检测线包被浓度进行临床验证，得到的不同检测线包被浓度(如2mg/mL、 4mg/mL)对应的检测卡的检测结果如图7所示，观察是否有假阳性产生。由图7可知，选取2例阴性样本检测，发现当包被浓度为4mg/mL时，无论是IgG还是IgM检测，2例均出现假阳性，当包被浓度为2mg/mL时，IgG检测没有出现假阳性，IgM检测有一次出现了弱阳性；当包被浓度为1.5mg/mL时，IgM检测没有出现假阳性；因此，选取1.5mg/mL为 IgM的检测线包被浓度，2.0mg/mL为IgG的检测线包被浓度。

试验例5新型冠状病毒抗体检测卡临床验证

基于试验例3和试验例4选择的条件制备检测卡进行临床标本验证。共收集60份样本(部分展示)，其中41份临床判定均为新冠肺炎阴性，通过新冠肺炎IgM检测卡检测，得到的IgM检测卡检测结果如图8所示。共检测到40份为阴性判定，与临床判定符合率为97.56％。

通过新冠肺炎IgG检测卡检测，得到的IgG检测卡检测结果如图9所示。IgG检测卡检测结果与IgM检测卡检测结果一致，符合率为97.56％。

阳性样本检测19例，18例检出，符合率94.74％。

在新型冠状病毒感染病人血清中会存在IgM和/或IgG，因此无论是IgG检测卡、IgM检测卡其中之一判定为阳性即视为阳性结果。采用两条检测线的检测卡，可实现一个检测卡同时检测IgM和IgG，检测结果判定更加简便、准确(图8、图9中，每个病人血清中抗体含量不同，显色结果有差异，但不影响结果判读)。

试验例6不同分散介质的效果比较

在实施例11的基础上，仅更改分散介质的成分，考察不同分散介质对判定结果的影响。

作为对比的PBS分散介质为含质量终浓度为0.4％的Na₂HPO₄·12H₂O，质量终浓度为 0.06％的NaH₂PO₄·2H₂O，质量终浓度为0.4％的氯化钠，体积终浓度为0.05％的Tween-20，质量终浓度为10％的蔗糖，质量终体积为5％的海藻糖，质量终体积为0.5％的BSA，溶剂为水。

将实施例11制得的检测卡和利用PBS分散介质制备的检测卡对同样的阴性样本进行检测，得到的结果如图10所示，由图10可知，作为对比的PBS分散介质在进行不同阴性样本检测时，出现了假阳性(1和2号样本)，而用本发明所用Tris分散介质则不存在假阳性。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 河南大学

<120> 一种新型冠状病毒抗体检测试剂及其制备方法、新型冠状病毒抗体检测卡

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 419

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<221> 新型冠状病毒核蛋白

<400> 1

MSDNGPQNQR NAPRITFGGP SDSTGSNQNG ERSGARSKQR RPQGLPNNTA SWFTALTQHG 60

KEDLKFPRGQ GVPINTNSSP DDQIGYYRRA TRRIRGGDGK MKDLSPRWYF YYLGTGPEAG 120

LPYGANKDGI IWVATEGALN TPKDHIGTRN PANNAAIVLQ LPQGTTLPKG FYAEGSRGGS 180

QASSRSSSRS RNSSRNSTPG SSRGTSPARM AGNGGDAALA LLLLDRLNQL ESKMSGKGQQ 240

QQGQTVTKKS AAEASKKPRQ KRTATKAYNV TQAFGRRGPE QTQGNFGDQE LIRQGTDYKH 300

WPQIAQFAPS ASAFFGMSRI GMEVTPSGTW LTYTGAIKLD DKDPNFKDQV ILLNKHIDAY 360

KTFPPTEPKK DKKKKADETQ ALPQRQKKQQ TVTLLPAADL DDFSKQLQQS MSSADSTQA 419

<211> 455

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 重组蛋白

<400> 2

MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MASMTGGQQM GRGSEFMSDN GPQNQRNAPR ITFGGPSDST 60

GSNQNGERSG ARSKQRRPQG LPNNTASWFT ALTQHGKEDL KFPRGQGVPI NTNSSPDDQI 120

GYYRRATRRI RGGDGKMKDL SPRWYFYYLG TGPEAGLPYG ANKDGIIWVA TEGALNTPKD 180

HIGTRNPANN AAIVLQLPQG TTLPKGFYAE GSRGGSQASS RSSSRSRNSS RNSTPGSSRG 240

TSPARMAGNG GDAALALLLL DRLNQLESKM SGKGQQQQGQ TVTKKSAAEA SKKPRQKRTA 300

TKAYNVTQAF GRRGPEQTQG NFGDQELIRQ GTDYKHWPQI AQFAPSASAF FGMSRIGMEV 360

TPSGTWLTYT GAIKLDDKDP NFKDQVILLN KHIDAYKTFP PTEPKKDKKK KADETQALPQ 420

RQKKQQTVTL LPAADLDDFS KQLQQSMSSA DSTQA 455

<211> 1260

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<221> 新型冠状病毒核蛋白编码基因

<400> 3

atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60

tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120

cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180

aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240

gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300

atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360

cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420

acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480

cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540

caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600

agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660

ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720

caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780

aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840

caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900

tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960

ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020

gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080

aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140

gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200

gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260

Claims

1.一种新型冠状病毒抗体检测试剂，其特征在于，包括分散介质和分散在所述分散介质中的纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白；所述纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白由纳米硒和重组蛋白结合得到，所述重组蛋白由新型冠状病毒核蛋白和标签蛋白构成，所述新型冠状病毒核蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的新型冠状病毒抗体检测试剂，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的新型冠状病毒抗体检测试剂，其特征在于，所述纳米硒的粒径为35-50nm。

4.如权利要求1-3中任一项所述的新型冠状病毒抗体检测试剂，其特征在于，所述分散介质由pH为7-9的Tris-HCl缓冲液、Tween-20、蔗糖、海藻糖和BSA组成，Tween-20的体积终浓度为0.05-0.25％，蔗糖的质量终浓度为10-11％，海藻糖的质量终体积为4-10％，BSA的质量终体积为0.5-1.5％。

5.一种如权利要求1-4中任一项所述的新型冠状病毒抗体检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在碱性条件下，将所述重组蛋白分散在纳米硒溶液中，使纳米硒溶液中纳米硒和重组蛋白结合，再加入封闭剂进行封闭处理，离心，弃去上清后用分散介质重悬，即得。

6.如权利要求5所述的新型冠状病毒抗体检测试剂的制备方法，其特征在于，所述纳米硒溶液由包括以下步骤的方法得到：亚硒酸、抗坏血酸、模板剂在水中反应，即得。

7.如权利要求6所述的新型冠状病毒抗体检测试剂的制备方法，其特征在于，所述模板剂为聚乙二醇和十二烷基硫酸钠，聚乙二醇和十二烷基硫酸钠的摩尔比为(10-40):1。

8.如权利要求7所述的新型冠状病毒抗体检测试剂的制备方法，其特征在于，反应时亚硒酸在反应体系中的浓度为2-4mM，抗坏血酸在反应体系中的浓度为8-32mM，聚乙二醇在反应体系中的浓度为25-100mM，十二烷基硫酸钠在反应体系中的浓度为1.25-5mM。

9.如权利要求5所述的新型冠状病毒抗体检测试剂的制备方法，其特征在于，所述碱性条件为pH＝8-10。

10.如权利要求5-9中任一项所述的新型冠状病毒抗体检测试剂的制备方法，其特征在于，所述结合时，每3μmol硒元素形成的纳米硒颗粒对应重组蛋白的标记量为(10-40)μg。

11.如权利要求10所述的新型冠状病毒抗体检测试剂的制备方法，其特征在于，纳米硒溶液中硒元素的浓度为2-4mM，每毫升纳米硒溶液对应加入(2.5-80)μL重组蛋白稀释液，重组蛋白稀释液的浓度为(0.5-4)mg/mL。

12.一种新型冠状病毒抗体检测卡，包括样品垫和吸水垫，其特征在于，还包括设置在样品垫和吸水垫之间的结合垫、反应垫，所述结合垫、反应垫沿层析方向依次设置，结合垫上固定有纳米硒标记的，所述纳米硒标记的新型冠状病毒核蛋白由纳米硒和重组蛋白结合得到，所述重组蛋白由新型冠状病毒核蛋白和标签蛋白构成，所述新型冠状病毒核蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；反应垫上沿层系方向依次包被有检测线和质控线。

13.如权利要求12所述的新型冠状病毒抗体检测卡，其特征在于，所述检测线有一条，包被抗人IgM抗体或抗人IgG抗体；或者所述检测线有二条，分别包被抗人IgM抗体和抗人IgG抗体。