CN104181301A - 基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检的方法和试剂盒 - Google Patents

基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检的方法和试剂盒，该试剂盒由具有富集抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体功能的抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠、多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG抗体纳米探针、质控品以及PBST缓冲液所组成；质控品包括阳性质控品以及阴性质控品；阳性质控品为人流感嗜血杆菌感染者的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体分别为阳性的血清；阴性质控品是抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG均为阴性的人血清。本发明具有简便、快速、高灵敏度的优点，可实现对抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体的同步检测。

Description

基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检的检测方法及检测试剂盒，以及该检测试剂盒的制备及使用方法。
背景技术
流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae，Hi)是感染人类的一种重要的呼吸道病原微生物，该菌由波兰细菌学家费佛博士在1892年的一次流行性感冒瘟疫中发现的，在随后的时间里被研究者们广泛研究。现仅知人是该病原体的宿主。免疫力较差的老人和儿童为易感人群，特别是5岁以下的婴幼儿。Hi可引发肺炎、结膜炎、中耳炎、脑膜炎和菌血症等，在全球每年至少有300万严重病例发生，可造成患儿致残甚至死亡。Hi分为有荚膜的a、b、c、d、e、f共6个血清型和无荚膜的不可分型流感嗜血杆菌(Nontypeable Haemophilus influenzae，NTHi)，一度以荚膜b型Hi最为流行。目前我国开展的Hi血清学检查大多也只针对侵袭力较强的荚膜b型。而由于该型菌株荚膜多糖疫苗的成功研发与应用，其流行已被有效控制。近来的研究多显示，在感染Hi的患者中最常见的菌株是NTHi，其分离率已达50％以上。
临床上由于Hi与其他呼吸道病原体引起的感染症状类似，因此常难以根据临床表现、x-射线检查等得出结论，确诊往往依赖于实验室诊断。婴幼儿疾病的特点是起病急、转归快，因此敏感、快速、实用的Hi检测对及早进行有效的临床干预具有非常重要的意义。
在人流感嗜血杆菌感染的实验室诊断上，被检者血清中抗人Hi抗体指标则是诊断结果的重要依据之一。
免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)和免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)是人体内最重要的两种抗体。当人流感嗜血杆菌进入机体后，最早出现的免疫球蛋白是IgM抗体，之后出现IgG，通过检测体内特异性IgM、IgG抗体的存在，可诊断人体对人流感嗜血杆菌的免疫反应状态。若检测出特异性IgM抗体，表明有近期感染的发生，但IgM抗体半衰期较短，IgM的检测阴性并不能证明机体未受感染，还需要检测半衰期较长，含量最高的IgG抗体，以明确诊断。
目前，血清中特异性IgM及IgG抗体的检测方法主要有冷凝集实验、明胶颗粒凝集实验、酶联免疫吸附实验、金标免疫斑点法及金标免疫层析法。冷凝集实验的特异度和敏感度均为最低，因此其临床诊断价值不大；金标免疫斑点法及金标免疫层析法虽操作简便快捷，但敏感度略低，对抗体水平较低的患者有漏诊的可能；明胶凝集实验试剂准备与操作过程较为繁琐，且需要专业操作人员。酶联免疫吸附法具有特异、敏感等优点，已用于检查各种抗体或抗原，但此方法存在以下问题：(1)每一批试验从加样、温浴、洗版等步骤较多，操作繁琐，时间较长(总共需要2-4小时)；(2)检测中需分别加入显色成分A液与B液，且还要在规定时间内完成读数，一定程度上增加了劳动强度和操作失误的可能性；(3)该法无法做到对IgM及IgG两种抗体的同时检测。虽然单独检测IgM和IgG抗体后，再综合分析检测结果对疾病的诊断并无影响，但操作过程繁琐，检测不够方便快捷，检测成本较共检亦会增加。
因此，建立具备高灵敏度、能对抗人流感嗜血杆菌的特异性IgM、IgG抗体进行快速同步共检的检测方法显得十分必要。
发明内容
针对背景技术中存在的这些技术问题，本发明提供了一种基于磁性分离和多色量子点标记的能简便、快速、高灵敏度的同步共检抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体的检测方法和试剂盒，以及该试剂盒的制备及使用方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1)重组人流感嗜血杆菌P6膜蛋白抗原的制备；
2)将步骤1)制备得到的重组人流感嗜血杆菌P6膜蛋白抗原与纳米磁珠通过共价偶联，制得抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠；
3)将鼠抗人IgM单克隆抗体与发射波长为520nm的纳米量子点通过共价偶联，制备量子点标记的抗人IgM纳米探针；将鼠抗人IgG单克隆抗体与发射波长为600nm的纳米量子点通过共价偶联，制备量子点标记的抗人IgG纳米探针；将量子点标记的抗人IgM纳米探针与量子点标记的抗人IgG纳米探针等量混合即制得多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针；
4)取人血清样本，用PBSA缓冲液适当稀释后，分别向血清稀释液中加入步骤2)制备得到的抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠以及步骤3)制备得到的多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针，充分混合，反应5-45min后进行磁分离，以PBST缓冲液洗涤2遍后，使用荧光酶标仪，在发射波长(Em)分别为520nm及600nm下分别读取荧光值；所述PBSA缓冲液中各组分含量分别为8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，5g/L BSA(牛血清白蛋白)，所述PBSA缓冲液的pH＝7.4；所述PBST缓冲液中各组分含量分别为8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，5g/L BSA(牛血清白蛋白)，0.3g/L NaN3，0.5ml/L Tween-20，所述PBST缓冲液的pH＝7.4；
5)根据步骤4)的方法分别检测至少30份经临床各种方法均确定为抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清样本，分别读取发射波长(Em)分别为520nm及600nm下的荧光值；所述抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清样本简称人流感嗜血杆菌抗体阴性对照样品；所述人流感嗜血杆菌抗体阴性对照样品在发射波长(Em)为520nm的荧光值的平均值与3倍标准差之和记为CUT-OFF1值；所述人流感嗜血杆菌抗体阴性对照样品在发射波长(Em)为600nm的荧光值的平均值与3倍标准差之和记为CUT-OFF2值；若步骤4)中人血清样本在发射波长(Em)为520nm的检测荧光值大于CUT-OFF1值，则判断为人血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgM抗体为阳性；若步骤4)中人血清样本在发射波长(Em)为520nm的检测荧光值小于CUT-OFF1值，则判断为人血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgM抗体为阴性；若步骤4)中人血清样本在发射波长(Em)为600nm的检测荧光值大于CUT-OFF2值，则判断为人血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgG抗体为阳性；若步骤4)中人血清样本在发射波长(Em)为600nm的检测荧光值小于CUT-OFF2值，则判断为人血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgG抗体为阴性。
一种基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒，其特征在于：所述基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒由具有富集抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体功能的抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠、多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG抗体纳米探针、质控品以及PBST缓冲液所组成；所述质控品包括阳性质控品以及阴性质控品；所述阳性质控品由两份人流感嗜血杆菌感染者的抗人流感嗜血杆菌IgM抗体阳性的血清及两份抗人流感嗜血杆菌IgG抗体为阳性的血清组成；所述阴性质控品是四份抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清。
一种用于制备基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1)抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠的制备：
1.1)重组P6-His融合蛋白的制备、纯化：
1.1.1)对人流感嗜血杆菌外膜蛋白P6进行生物信息学分析，获取人流感嗜血杆菌P6蛋白胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到其对应的基因序列；
1.1.2)在步骤1.1.1)中所得到的基因序列的5’端及3’端分别引入酶切位点并化学合成全基因序列，同时标记记为P6；其序列参见序列表；
1.1.3)将步骤1.1.2)中所得到的P6按分子生物学方法克隆入表达载体pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组P6-His融合蛋白；所述重组P6-His融合蛋白以可溶性表达形式存在于基因工程菌体中；
1.1.4)用镍柱纯化步骤1.1.3)所得到的重组P6-His融合蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后，用PBS缓冲液透析过夜；收集透析液，经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，用PBS缓冲液调整浓度为1mg/mL；所述PBS缓冲液中各成分含量如下：8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，所述PBS缓冲液的pH＝7.4；
1.2)纳米磁珠的包被：
1.2.1)取5mg磁珠，用1ml MES缓冲液洗涤三次，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清；所述磁珠是以超顺磁性Fe3O4为内核、粒径为1150nm的羧基磁珠；所述MES缓冲液是质量浓度是2g/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸；所述MES缓冲液的pH＝6.0；所述纳米磁分离器的磁性强度是0.4T；
1.2.2)依次加入用步骤1.2.1)中的MES缓冲液配制的浓度是8-12mg/ml的EDC溶液以及用步骤1.2.1)中的MES缓冲液配制的浓度是6-10mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml，以10-40rpm/min于旋转混合仪中活化1hr，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，用1ml步骤1.2.1)中的MES缓冲液重悬，得到活化后的磁珠；
1.2.3)取5个离心管，在每个离心管中加入200μL步骤1.2.2)所得到的活化后的磁珠，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，向各离心管中加入用PBS缓冲液稀释的浓度为50-200μg/ml的由步骤1.1.4)所制备的重组P6-His融合蛋白溶液各1ml，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应2-6h，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清后，各加入1ml含1mg/ml乙醇胺的上述PBS缓冲液，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应2h以封闭磁珠上未与抗体反应的羧基；所述PBS缓冲液中各成分含量如下：8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，所述PBS缓冲液的pH＝7.4；
1.2.4)封闭反应完成后，将该5个离心管置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，各用1ml洗涤缓冲液洗涤三遍；所述洗涤缓冲液中各成分含量如下：8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，0.5ml/L Tween-20，所述洗涤缓冲液的pH＝7.4；
1.2.5)向各个离心管中分别加入1ml保存缓冲液重悬磁珠，置于4℃保存备用；至此制得抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠；所述保存缓冲液中各成分含量如下：8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，0.3g/L NaN3，5g/L牛血清白蛋白(BSA)，所述保存缓冲液的pH＝7.4；
2)多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针的制备：
其具体制备方法包括：
2.1)向微量离心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子点、300nmol N-羟基琥珀酰亚胺sulfo-NHS以及300nmol碳二亚胺EDC，以磷酸盐缓冲液定容为5ml，混合溶液，37℃反应30min后，透析去除过量的作为活化剂的sulfo-NHS及EDC，得到活化后的量子点；所述羧基水溶性量子点的发射波长是520nm；所述磷酸盐缓冲液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠；所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.4；
2.2)在步骤2.1)所得到的活化的量子点中，加入2-12nmol的鼠抗人IgM单克隆抗体，避光反应2h，加入单端氨基化聚乙二醇PEG2000-NH2至终浓度为1％，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h；
2.3)用0.2μm PES滤器过滤除去步骤2.2)中的抗体聚集物，然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物；
2.4)收集步骤2.3)中超滤离心管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐洗涤液中，再将此溶液转移到一个新的50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，收集超滤离心管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于1ml磷酸盐保存液中，置于4℃保存备用，至此制得量子点标记的抗人IgM纳米探针；所述磷酸盐洗涤液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠，5ml/L吐温-20，0.3g/L叠氮钠，所述磷酸盐洗涤液的pH＝7.4；所述磷酸盐保存液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，10g/L牛血清白蛋白，0.3g/L叠氮钠；所述磷酸盐保存液的pH＝7.4；
2.5)按与步骤2.1)-2.4)相同的方法利用鼠抗人IgG单克隆抗体与发射波长为600nm的羧基水溶性量子点制得量子点标记的抗人IgG纳米探针；将上述两种量子点标记的纳米探针溶液按体积比1:1混合，即制得多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针；
3)PBST缓冲液的配制：
其具体配制方法包括：
取8g NaCL，0.2g KCl，0.24KH2PO4，1.44g Na2HPO4，5g BSA，0.3g NaN3，0.5ml Tween-20溶解于900ml蒸馏水中，用5M NaOH调整pH至7.4，再定容至1000ml；
4)质控品的制备：
4.1)阳性质控品：
4.1.1)抗人流感嗜血杆菌IgM抗体阳性质控品：由0.5ml人流感嗜血杆菌感染者的已确定抗人流感嗜血杆菌IgM抗体为阳性的血清构成；
4.1.2)抗人流感嗜血杆菌IgG抗体阳性质控品：由0.5ml人流感嗜血杆菌感染者的已确定抗人流感嗜血杆菌IgG抗体为阳性的血清构成；
4.2)阴性质控品：由0.5ml抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清构成。
作为优选，本发明在步骤1.2.2)中，依次加入用步骤1.2.1)中的MES缓冲液配制的浓度是10mg/ml的EDC溶液以及用步骤1.2.1)中的MES缓冲液配制的浓度是8mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml，以15rpm/min于旋转混合仪中活化1hr，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，用1ml步骤1.2.1)中的MES缓冲液重悬，得到活化后的磁珠；
所述步骤1.2.3)中，向各离心管中加入用PBS缓冲液稀释的浓度为100μg/ml的由步骤1.1.4)所制备的重组P6-His融合蛋白溶液各1ml，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应3h，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清后，各加入1ml含1mg/ml乙醇胺的上述PBS缓冲液；
所述步骤2.2)中，在步骤2.1)所得到的活化的量子点中，加入6nmol的鼠抗人IgM单克隆抗体，避光反应2h。
作为优选，本发明所采用的量子点是羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点。
作为优选，本发明所采用的磁珠是以超顺磁性Fe3O4为内核、壳材料为聚苯乙烯、表面官能团为羧基、粒径为1150nm的羧基磁珠。
一种基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒的使用方法，其特征在于：所述使用方法包括以下步骤：
1)取待检血清样本5μl用995μl PBSA缓冲液稀释后将稀释液转入1.5ml普通离心管中；所述PBSA缓冲液中各成分含量如下：8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，5g/L BSA；所述PBSA缓冲液的pH＝7.4；
2)向步骤1)中的离心管中依次加入基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒中的抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠10-100μl及基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒中的多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针40μl，室温下以10rpm/min于旋转混合仪上反应5-25min后取下，将离心管插入纳米磁分离器磁分离3min，用移液器吸出上清；
3)添加基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒中的PBST缓冲液1ml洗涤两遍，采用纳米磁分离器磁分离后吸出洗涤液，最后用0.2ml PBS缓冲液重悬磁珠，制得纳米磁珠-流感嗜血杆菌抗体-量子点“三明治”复合物；所述PBS缓冲液中各成分含量如下：8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4；所述PBS缓冲液的pH＝7.4；
4)将步骤3)得到的纳米磁珠-流感嗜血杆菌抗体-量子点复合物载于酶标板中，使用荧光酶标仪在激发波长(Ex)同为365nm，发射波长(Em)分别为520nm及600nm的参数下分别对其荧光值进行分别读数；
5)按上述同样的方法检测至少30份经临床各种方法均确定为抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清样本，分别读取发射波长(Em)分别为520nm及600nm下的荧光值；所述经临床各种方法均确定为抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清样本在发射波长(Em)为520nm的荧光值的平均值与3倍标准差之和记为CUT-OFF1值；所述经临床各种方法均确定为抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清样本在发射波长(Em)为600nm的荧光值的平均值与3倍标准差之和记为CUT-OFF2值；同时检测试剂盒中提供的四份阴性质控品样品及四份阳性质控品样品，分别读取发射波长(Em)分别为520nm及600nm下的荧光值；四份阴性质控品样品在发射波长(Em)为520nm的荧光值的平均值记为NCX1；四份阴性质控品样品在发射波长(Em)为600nm的荧光值的平均值记为NCX2值；两份抗人流感嗜血杆菌IgM抗体阳性质控品样品在发射波长(Em)为520nm的荧光平均值为PCX1；两份抗人流感嗜血杆菌IgG抗体阳性质控品样品在发射波长(Em)为及600nm下的荧光值记为PCX2；若步骤4)中待检血清样本在发射波长(Em)为520nm的检测荧光值大于CUT-OFF1值且PCX1/NCX1≥2.1,则判断为待检血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgM抗体为阳性；若步骤4)中待检血清样本在发射波长(Em)为520nm的检测荧光值小于CUT-OFF1值且PCX1/NCX1≥2.1，则判断为人待检血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgM抗体为阴性；若步骤4)中待检血清样本在发射波长(Em)为600nm的检测荧光值大于CUT-OFF2值且PCX2/NCX2≥2.1，则判断为待检血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgG抗体为阳性；若步骤4)中待检血清样本在发射波长(Em)为600nm的检测荧光值小于CUT-OFF2值且PCX2/NCX2≥2.1，则判断为待检血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgG抗体为阴性；若PCX1/NCX1＜2.1或PCX2/NCX2＜2.1，均表明试剂盒失效。
作为优选，本发明所提出的步骤2)中，向步骤1)中的离心管中依次加入基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒中的抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠15μl及基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒中的多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针40μl，室温下以10rpm/min于旋转混合仪上反应15min后取下，将离心管插入纳米磁分离器磁分离3min，用移液器吸出上清。
本发明所需的羧基水溶性纳米量子点、1150nm羧基磁珠，鼠抗人IgM单克隆抗体、鼠抗人IgG单克隆抗体等可到相关专业的研究单位、公司购买或定制；所需的仪器、设备、药品均有市售。
本发明相比现有技术具有如下优点：
1、本发明利用了纳米磁珠对样品的可富集性、分离的速度快、效率高等优点，同时结合量子点光化学稳定性高、荧光强度高等特性，使得检测体系具备多重信号协同放大的效果，从而具有超高的检测灵敏度与准确度。
2、本发明所用的捕获抗原是包含有所有血清型人流感嗜血杆菌共有的特异性P6蛋白抗原胞外区富含抗原表位的重组抗原，病人血清中针对其产生的抗体水平高，因此捕获效果好。
3、本发明所用的捕获抗原特异性高，与其他常见的呼吸道病原体(如甲、乙型人流感病毒、人肺炎链球菌、卡他莫拉菌、人肺炎支原体、人肺炎衣原体等)的抗体之间无抗原抗体交叉反应。
4、本发明所用抗原为基因工程重组抗原，蛋白质表达量高，且为可溶性表达，无需复性，故较为廉价易得。
5、本发明检测方法简单，检测快速(30min之内)，易于判定，检测成本低廉，克服了现有技术检测阳性率低、成本高、操作复杂繁琐、耗时长、临床应用不便的不足。
6、本发明可实现抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体的同步检测，解决了分项检测所带来的操作过程繁琐，检测不够方便快捷，检测成本较高等问题，而目前市面上还未曾见到抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体同步检测的产品或者相关科学报道的出现。
具体实施方式
本发明是根据免疫学中的抗体抗原反应原理，利用纳米磁珠对样品的可富集性、分离的速度快、效率高等优点，结合量子点光化学稳定性高、荧光强度高等特性，建立的一套具备多重信号协同放大、具有超高灵敏度及高度特异性的快速同步检测抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体的新方法，具有广阔的市场应用前景。
本发明通过以下实施例作进一步具体描述。
各种试剂的配制及所需材料的说明
1.PBSA缓冲液：称取1.44g磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾,8g氯化钠，0.2g氯化钾，5g牛血清白蛋白溶解于900ml的去离子水中，用1mol/L NaOH调pH至7.4后用去离子水定容至1000ml。
2.PBS缓冲液：称取1.44g磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾,8g氯化钠，0.2g氯化钾溶解于900ml的去离子水中，用1mol/L NaOH调pH至7.4后用去离子水定容至1000ml。
3.重组P6-His融合蛋白：为本发明自制，用PBS缓冲液稀释，摇匀，使溶液中重组蛋白的重量百分比浓度为0.2mg/ml。
4.鼠抗人IgM单克隆抗体：为Abcam公司产品，货号ab99741，用PBS缓冲液稀释，摇匀，使溶液中单克隆抗体重量百分比浓度为1mg/ml。
5.鼠抗人IgG单克隆抗体：为Abcam公司产品，货号ab99757，用PBS缓冲液稀释，摇匀，使溶液中单克隆抗体重量百分比浓度为1mg/ml。
6.量子点：本发明中所用的两种量子点均为羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点，其发射波长分别为520nm及600nm，自武汉珈源量子点技术开发有限公司购买，产品名称为羧基水溶性量子点-520及羧基水溶性量子点-600。
7.磁珠：本发明中所用磁珠是以超顺磁性Fe3O4为内核、壳材料为聚苯乙烯、表面官能团为羧基、粒径为分别为50nm、180nm、350nm、1150nm、3μm的羧基磁珠，可从陕西北美基因股份有限公司、上海奥润微纳新材料科技有限公司购买。
实施例1重组人流感嗜血杆菌P6蛋白的制备与纯化
1.相关基因的克隆
对人流感嗜血杆菌膜蛋白P6(其NCBI蛋白质数据库中的accession number为AAA24994)进行生物信息学分析，获取其胞外保守结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到其对应的DNA编码序列，同时在序列5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点XhoI后化学合成全基因序列(全序列合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成，交货时人工合成的基因片段连于载体pUC57上)，记为P6。其基因全序列如序列表所示。具体的说，P6基因编码的蛋白质序列为天然人流感嗜血杆菌膜蛋白P6(accession number:AAA24994)的48-153aa。将含有该段人工合成的DNA片段的载体pUC57用NdeI及XhoI进行双酶切后按常规方法回收目的片段，备用。同时采用NdeI及XhoI对载体pET-28a(+)进行双酶切，并按常规方法将经双酶切后获得的P6基因连入pET-28a(+)载体中，并转化大肠杆菌TOP10，构建pET-P6表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误。该载体表达重组P6-His融合蛋白。
2.重组P6-His融合蛋白的表达与纯化
将鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E.coliBL21(DE3)plysS中，转化完成后将菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达菌株。挑取pET-P6转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入100mL LB培养基中，于30℃培养过夜。取出菌液后，按1：100接种于100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于30℃培养至OD600＝0.6时，加入1mol/L IPTG至终浓度为1mmol/L，于30℃摇菌培养，诱导融合蛋白表达。诱导4h后于8000r/min下离心10min收集菌体。将此菌体用20mL磷酸盐缓冲液(8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4pH＝7.4)洗涤3次并用10mL上样缓冲液(20mM Na3PO4，0.5M NaCl；30mM咪唑，pH7.4)重悬后进行超声破碎，操作条件为：50HZ，200W，超声3S，间歇5S，工作100次。超声完成后，12000g离心15min分别收集沉淀和上清后进行电泳检测。发现重组P6-His融合蛋白以可溶性表达方式存在于菌体中。
将上述获得的超声破碎上清液用0.45μm的滤膜进行过滤后用His Trapaffinity columns(GE healthcare公司产品)，按照说明书的方法进行重组P6-His融合蛋白的纯化。具体方法如下：
1)用5mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器连接上，以1mL/min流速洗柱。
2)用10mL上样缓冲液平衡，1mL/min流速。
3)将融合蛋白上样，1mL/min流速。
4)用10mL上样缓冲液，以1mL/min流速洗柱。
5)用10mL洗脱缓冲液(20mM Na3PO4，0.5M NaCl，300mM咪唑，pH7.4)，以1mL/min流速洗脱，分管收集，每管1ml，12％SDS-PAGE检测，合并洗脱组分中含有目的蛋白的样品，用PBS缓冲液透析过夜。收集透析液经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，用PBS缓冲液调整浓度为0.2mg/mL，供纳米磁珠的包被用。
实施例2抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠的制备
1.重组P6-His融合蛋白偶联磁珠反应条件的优化：
以偶联了重组人P6-His融合蛋白的磁珠作为固相载体，量子点标记的鼠抗人IgM单克隆抗体作为检测抗体，检测抗人流感嗜血杆菌IgM抗体阳性血清，观察磁珠与重组蛋白的偶联情况。分别对磁珠的粒径，以及EDC/NHS活化剂浓度、偶联抗体浓度、偶联时间、封闭剂种类等偶联条件进行了一系列的优化选择。
1.1磁珠粒径的选择
选择粒径为50nm、180nm、350nm、1150nm、3μm的羧基纳米磁珠，均加入含4mg/ml EDC及4mg/ml NHS的PBS缓冲液进行活化反应后，分别与重组P6-His融合蛋白偶联反应。分别将制备好的羧基纳米磁珠检测抗人流感嗜血杆菌IgM抗体阳性血清，荧光显微镜下观察结果，选择荧光强度大，背景荧光干扰少，以及在磁场作用下分离速度较快者为最适磁珠粒径。结果表明粒径1150nm的磁珠最符合本发明的要求，确定最适羧基磁珠粒径为1150nm。
1.2EDC/NHS活化剂浓度的选择
将反应体系中EDC和NHS浓度各自设为l～10mg/ml后进行浓度梯度组合，分别活化粒径1150nm的羧基纳米磁珠。将制备好的羧基纳米磁珠检测抗人流感嗜血杆菌IgM抗体阳性血清，选择荧光最强者为EDC和NHS溶液的最适活化浓度。结果表明当EDC浓度为5mg/ml、NHS浓度为4mg/ml时偶联效果最好。
1.3偶联抗原浓度的选择
将10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg的重组P6-His融合蛋白分别与1mg按上述最优方法活化的粒径为1150nm的磁珠进行偶联。将制备好的羧基纳米磁珠分别检测抗人流感嗜血杆菌IgM抗体阳性血清，结果发现，当重组蛋白的投放量小于100μg/mg时，荧光强度随着抗体的浓度增加而增加，而当重组蛋白的投放量大于100μg/mg时，荧光强度基本不变甚至略有减小，因此本实施例选择重组P6-His重组蛋白的偶联量为100μg/mg。
1.4偶联时间的选择
确定磁珠的粒径、EDC/NHS活化剂浓度及抗体偶联量后，将重组P6-His融合蛋白与磁珠的偶联反应时间分别设为0.5h、1h、2h、3h、4h、5h。将制备好的羧基纳米磁珠分别检测抗人流感嗜血杆菌IgM抗体阳性血清，结果发现，当偶联时间>3h时，荧光强度趋于稳定，此后再延长偶联时间，荧光不再增强。因此，确定重组P6-His融合蛋白与磁珠的最适偶联反应时间为3h。偶联时间远少于传统ELISA法的24h。
1.5封闭剂的选择
按照上述确定的最优条件选择磁珠的粒径、EDC/NHS活化剂浓度、抗体偶联量及偶联时间后进行偶联反应。偶联结束后，选择BSA，乙醇胺，Tris和D-氨基葡萄糖盐酸盐作为纳米磁珠封闭剂，制得成品羧基纳米磁珠。将制备好的纳米磁珠分别检测抗人流感嗜血杆菌IgM抗体阳性血清，结果发现，采用乙醇胺作为封闭剂的纳米磁珠的检测荧光值最高。推测由于乙醇胺的分子较小，可以较好的消耗由于空间位阻未与抗体结合的表面羧基，使封闭更为完全，并且有效减少空间位阻效应对已连接抗体的结构影响。
同时，以偶联了重组P6-His融合蛋白的羧基纳米磁珠作为固相载体，对应的量子点标记的鼠抗人IgG单克隆抗体作为检测抗体，建立抗人流感嗜血杆菌IgG抗体的检测体系，对相应的检测体系中的重组蛋白偶联磁珠的反应条件进行优化。结果发现，该检测体系中的最佳偶联条件均与上述步骤1.1-1.5所给出的结果完全一致。
2.偶联过程：
取5mg磁珠(以超顺磁性Fe3O4为内核、粒径为1150nm的羧基磁珠)于1.5ml普通离心管中，用1ml MES缓冲液(2g/L MES，pH6.0)洗涤三次，置于纳米磁分离器中进行磁分离(0.4T)后移除上清，依次加入用上述MES缓冲液配制的浓度为10mg/ml的EDC溶液及用上述MES缓冲液配制的浓度为8mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml，以15rpm/min于旋转混合仪中活化1hr，磁分离后移除上清，用1ml上述的MES缓冲液重悬；取5个离心管，每个离心管中加入200μL上述活化的磁珠，磁分离后吸出上清，向各管中加入用PBS缓冲液(8g/L NaCL，0.2g/LKCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，pH7.4)稀释的浓度为100μg/ml的实施例1所制备的重组P6-His融合蛋白溶液各1ml，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应3h，磁分离移除上清后，各加入1ml含1mg/ml乙醇胺的上述PBS缓冲液，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应2h以封闭磁珠上未与抗体反应的羧基。磁分离后移除各管上清，各用1ml洗涤缓冲液(8g/L NaCL，0.2g/LKCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，0.5ml/L Tween-20，pH7.4)洗涤三遍,最后各用1ml保存缓冲液(8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，0.3g/L NaN3，5g/L BSA，pH7.4)重悬磁珠，置于4℃保存备用，至此制得抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠。
实施例3多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针的制备
1.纳米羧基量子点标记鼠抗人IgM单克隆抗体反应条件的优化：
1.1、羧基量子点标记抗体探针最佳标记pH的确定
将标记反应中磷酸盐缓冲液pH分别设为5，6，7，8，9，对标记产物利用全光谱仪进行荧光强度测定，观察不同pH值对偶联反应的影响，确定了量子点标记单抗反应的最佳pH为7.0-8.0。本实验选择pH7.4。
1.2、羧基量子点标记抗体探针最佳标记量的确定
将量子点摩尔浓度与单抗浓度之比分别设置为1:1，1:2，1:3及1:4，进行标记反应后，对标记产物利用全光谱仪进行荧光强度测定，观察二者不同浓度比对偶联反应的影响，确定量子点标记鼠抗人IgM单克隆抗体反应的最佳摩尔浓度比为量子点与抗体摩尔比为1:3。本实验选择该最优浓度比来确定标记量。
1.3、羧基量子点标记抗体探针最佳封闭剂种类的确定
以乙醇胺、Tris、PEG2000-NH2或者BSA作为封闭剂，按步骤1.1及1.2确定的条件进行标记反应后，对标记产物利用全光谱仪进行荧光强度测定，观察不同的封闭剂对于标记反应的影响，结果发现，PEG2000-NH2为最佳封闭剂，其可显著提高标记复合物的胶体稳定性及免疫活性。
纳米羧基量子点标记鼠抗人IgG单克隆抗体反应的条件优化结果与步骤1.1-1.3描述的纳米羧基量子点标记鼠抗人IgM单克隆抗体反应相关条件的优化结果均完全一致。
2.标记过程：
向微量离心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子点(发射波长520nm)、300nmol N-羟基琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)和300nmol碳二亚胺(EDC)，以磷酸盐缓冲液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠，pH7.4)定容为2ml，不停地混合溶液，37℃反应30min后，透析去除过量的作为活化剂的sulfo-NHS与EDC。在活化的量子点中，加入6nmol的鼠抗人IgM单克隆抗体，避光反应2h，加入单端氨基化聚乙二醇(PEG2000-NH2)至终浓度为1％，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h。用0.2μm PES滤器过滤除去抗体聚集物，然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物。收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐洗涤液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠，5ml/L吐温-20，0.3g/L叠氮钠，pH7.4)中，再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于1ml磷酸盐保存液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，10g/L BSA，0.3g/L叠氮钠，pH7.4)中，至此制得量子点标记的抗人IgM纳米探针，置于4℃保存备用。
按上述相同方法利用鼠抗人IgG单克隆抗体与发射波长为600nm的羧基水溶性量子点制得量子点标记的抗人IgG纳米探针。将上述两种量子点标记的纳米探针溶液按体积比1:1混合，即制得多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针；
实施例4羧基纳米磁珠对人流感嗜血杆菌抗原进行免疫捕获条件的优化
以偶联了重组P6-His融合蛋白的磁珠作为固相载体，多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针作为检测抗体，建立人流感嗜血杆菌抗体的检测体系。分别对检测体系中羧基纳米磁珠的用量，捕获时间等条件进行了一系列的优化选择。
实验1.羧基纳米磁珠加入量的选择
将5μl、10μl、15μl、20μl、30μl、50μl、70μl的由实施例2所制备好的抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠分别加入到0.5ml含抗人流感嗜血杆菌IgG抗体的人血清稀释液中，进行免疫捕获，再由实施例3所描述的多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针进行检测，记录荧光值。结果发现，随着羧基纳米磁珠加入量的增加，荧光值逐渐增大，当羧基纳米磁珠加入量达到15μl时，荧光值达到最大。再继续增加羧基纳米磁珠的量，荧光值反而降低。故本实验选择15μl作为纳米磁珠的最佳加入量。
实验2.免疫捕获时间的选择
确定磁珠的加入量后，取四份实施例2所制备好的纳米磁珠，在室温下以10r/min，对抗人流感嗜血杆菌IgM抗体阳性血清进行5min、10min、15min、20min、30min及40min的免疫捕获，再由实施例3所描述的量子点标记探针进行检测，记录荧光值。结果发现，荧光值在免疫捕获15min时表现出最大值，随着时间的延长，数值基本不变。故本实验选择15min作为免疫捕获的最佳时间。
同时，以偶联了重组P6-His融合蛋白的羧基纳米磁珠作为固相载体，对应的量子点标记的鼠抗人IgG单克隆抗体作为检测抗体，建立抗人流感嗜血杆菌IgG抗体的检测体系，对相应的检测体系中的捕获条件进行优化。结果发现，上述检测体系中的最佳捕获条件均与上述实验1及实验2所给出的结果完全一致。
实施例5PBST缓冲液的配制
取8g NaCL，0.2g KCl，0.24KH2PO4，1.44g Na2HPO4，5g BSA，0.3g NaN3，0.5ml Tween-20溶解于900ml蒸馏水中，用5M NaOH调整pH至7.4，再定容至1000ml。
实施例6质控品的制备
6.1)阳性质控品：
6.1.1)抗人流感嗜血杆菌IgM抗体阳性质控品：由0.5ml人流感嗜血杆菌感染者的已确定抗人流感嗜血杆菌IgM抗体为阳性的血清构成；
6.1.2)抗人流感嗜血杆菌IgG抗体阳性质控品：由0.5ml人流感嗜血杆菌感染者的已确定抗人流感嗜血杆菌IgG抗体为阳性的血清构成；
6.2)阴性质控品：由0.5ml抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清构成。
实施例7试剂盒的制备
由实施例2所描述的抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠1.5ml、实施例3所描述的多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针4ml、实施例5所描述的PBST缓冲液200ml、实施例6所描述的质控品一套共同组成基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒。
实施例8待检血清稀释度的确定
用临床各种方法均确定为抗人流感嗜血杆菌IgM抗体分别为阴性及阳性的人血清样本各20份，用PBSA缓冲液分别进行1：50、l：lOO、1：200、l：400、1：800，1：1600倍稀释，选择阳性血清与阴性血清的检测荧光数值之比>3的最高稀释度作为待检血清的最适工作浓度。结果发现，200倍稀释的效果最佳。
同样，用临床各种方法均确定为抗人流感嗜血杆菌IgG抗体分别为阴性及阳性的人血清样本各20份，用PBSA缓冲液分别进行1：50、l：lOO、1：200、l：400、1：800，1：1600倍稀释，选择阳性血清与阴性血清的检测荧光数值之比>3的最高稀释度作为待检血清的最适工作浓度。结果亦发现，200倍稀释的效果最佳。
实施例9试剂盒的使用方法
1)取待检血清样本5μl用995μl PBSA缓冲液稀释(200倍稀释)后将稀释液转入1.5ml普通离心管中；
2)向步骤1)中的离心管中依次加入基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒中的抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠15μl及基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒中的多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针40μl，室温下以10rpm/min于旋转混合仪上反应15min后取下，将离心管插入纳米磁分离器磁分离3min，用移液器吸出上清；
3)添加基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒中的PBST缓冲液1ml洗涤两遍，采用纳米磁分离器磁分离后吸出洗涤液，最后用0.2ml PBS缓冲液重悬磁珠，制得纳米磁珠-流感嗜血杆菌抗体-量子点“三明治”复合物；
4)将步骤3)得到的0.2ml纳米磁珠-流感嗜血杆菌抗体-量子点复合物载于酶标板中，使用荧光酶标仪在激发波长(Ex)同为365nm，发射波长(Em)分别为520nm及600nm的参数下分别对其荧光值进行分别读数；
5)CUT-OFF值的确定：按与上述步骤1)-4)同样的方法检测100份经临床各种方法均确定为抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清样本，分别读取发射波长(Em)分别为520nm及600nm下的荧光值；所述100份经临床各种方法均确定为抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清样本在发射波长(Em)为520nm的荧光值的平均值(68.2)与3倍标准差(13.66)之和记为CUT-OFF1值(109.18)；所述100份经临床各种方法均确定为抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清样本在发射波长(Em)为600nm的荧光值的平均值(52.6)与3倍标准差(11.8)之和记为CUT-OFF2值(88.0)；
6)按与上述步骤1)-4)相同的方法同时检测试剂盒中提供的四份阴性质控品样品及四份阳性质控品样品，分别读取发射波长(Em)分别为520nm及600nm下的荧光值；四份阴性质控品样品在发射波长(Em)为520nm的荧光值的平均值记为NCX1；四份阴性质控品样品在发射波长(Em)为600nm的荧光值的平均值记为NCX2值；两份抗人流感嗜血杆菌IgM抗体阳性质控品样品在发射波长(Em)为520nm的荧光平均值为PCX1；两份抗人流感嗜血杆菌IgG抗体阳性质控品样品在发射波长(Em)为及600nm下的荧光值记为PCX2；若步骤4)中待检血清样本在发射波长(Em)为520nm的检测荧光值大于CUT-OFF1值(109.18)且PCX1/NCX1≥2.1,则判断为待检血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgM抗体为阳性；若步骤4)中待检血清样本在发射波长(Em)为520nm的检测荧光值小于CUT-OFF1值(109.18)且PCX1/NCX1≥2.1，则判断为人待检血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgM抗体为阴性；若步骤4)中待检血清样本在发射波长(Em)为600nm的检测荧光值大于CUT-OFF2值(88.0)且PCX2/NCX2≥2.1，则判断为待检血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgG抗体为阳性；若步骤4)中待检血清样本在发射波长(Em)为600nm的检测荧光值小于CUT-OFF2值(88.0)且PCX2/NCX2≥2.1，则判断为待检血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgG抗体为阴性；若PCX1/NCX1＜2.1或PCX2/NCX2＜2.1，均表明试剂盒失效。
实施例10试剂盒的特异性试验
用呼吸道常见病原体如人呼吸道合胞病毒、人肺炎支原体、人肺炎衣原体、人腺病毒3型、人腺病毒7型、人甲型流感病毒、人乙型流感病毒、人肺炎链球菌、卡他莫拉菌感染者的相应病原体抗体呈阳性的血清来代替人流感嗜血杆菌抗体阳性血清用实施例7所述的试剂盒按实施例9所述的方法进行检测，发现检测结果均为阴性。
实施例11临床测试例
应用本发明制备的基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆IgM、IgG抗体快速共检试剂盒对临床诊断明确的抗人流感嗜血杆菌IgM抗体阳性血清样本50份和阴性血清样本50份进行了检测，检测结果如表1。
表1抗人流感嗜血杆菌IgM抗体临床血清检验结果
应用本发明制备的基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒对临床诊断明确的抗人流感嗜血杆菌IgG抗体阳性血清样本70份和阴性血清样本50份进行了检测，检测结果如表2。
表2抗人流感嗜血杆菌IgG抗体临床血清检验结果
需要指出的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明精神和原则之内所做的任何修改、等同替换等均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1)重组人流感嗜血杆菌P6膜蛋白抗原的制备；
2)将步骤1)制备得到的重组人流感嗜血杆菌P6膜蛋白抗原与纳米磁珠通过共价偶联，制得抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠；
3)将鼠抗人IgM单克隆抗体与发射波长为520nm的纳米量子点通过共价偶联，制备量子点标记的抗人IgM纳米探针；将鼠抗人IgG单克隆抗体与发射波长为600nm的纳米量子点通过共价偶联，制备量子点标记的抗人IgG纳米探针；将量子点标记的抗人IgM纳米探针与量子点标记的抗人IgG纳米探针等量混合即制得多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针；
4)取人血清样本，用PBSA缓冲液适当稀释后，分别向血清稀释液中加入步骤2)制备得到的抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠以及步骤3)制备得到的多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针，充分混合，反应5-45min后进行磁分离，以PBST缓冲液洗涤2遍后，使用荧光酶标仪，在发射波长分别为520nm及600nm下分别读取荧光值；所述PBSA缓冲液中各组分含量分别为8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，5g/L BSA，所述PBSA缓冲液的pH＝7.4；所述PBST缓冲液中各组分含量分别为8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/LKH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，5g/L BSA，0.3g/L NaN3，0.5ml/L Tween-20，所述PBST缓冲液的pH＝7.4；
5)根据步骤4)的方法分别检测至少30份经临床各种方法均确定为抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清样本，分别读取发射波长分别为520nm及600nm下的荧光值；所述抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清样本简称人流感嗜血杆菌抗体阴性对照样品；所述人流感嗜血杆菌抗体阴性对照样品在发射波长为520nm的荧光值的平均值与3倍标准差之和记为CUT-OFF1值；所述人流感嗜血杆菌抗体阴性对照样品在发射波长为600nm的荧光值的平均值与3倍标准差之和记为CUT-OFF2值；
若步骤4)中人血清样本在发射波长为520nm的检测荧光值大于CUT-OFF1值，则判断为人血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgM抗体为阳性；
若步骤4)中人血清样本在发射波长为520nm的检测荧光值小于CUT-OFF1值，则判断为人血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgM抗体为阴性；
若步骤4)中人血清样本在发射波长为600nm的检测荧光值大于CUT-OFF2值，则判断为人血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgG抗体为阳性；
若步骤4)中人血清样本在发射波长为600nm的检测荧光值小于CUT-OFF2值，则判断为人血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgG抗体为阴性。
2.一种基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒，其特征在于：所述基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒由具有富集抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体功能的抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠、多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG抗体纳米探针、质控品以及PBST缓冲液所组成；所述质控品包括阳性质控品以及阴性质控品；所述阳性质控品由两份人流感嗜血杆菌感染者的抗人流感嗜血杆菌IgM抗体阳性的血清及两份抗人流感嗜血杆菌IgG抗体为阳性的血清组成；所述阴性质控品是四份抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清。
3.一种用于制备如权利要求2所述的基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1)抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠的制备：
1.1)重组P6-His融合蛋白的制备、纯化：
1.1.1)对人流感嗜血杆菌外膜蛋白P6进行生物信息学分析，获取人流感嗜血杆菌P6蛋白胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到其对应的基因序列；
1.1.2)在步骤1.1.1)中所得到的基因序列的5’端及3’端分别引入酶切位点并化学合成全基因序列，同时标记记为p6；
1.1.3)将步骤1.1.2)中所得到的P6按分子生物学方法克隆入表达载体pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组P6-His融合蛋白；所述重组P6-His融合蛋白以可溶性表达形式存在于基因工程菌体中；
1.1.4)用镍柱纯化步骤1.1.3)所得到的重组P6-His融合蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后，用PBS缓冲液透析过夜；收集透析液，经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，用PBS缓冲液调整浓度为1mg/mL；所述PBS缓冲液中各成分含量如下：8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，所述PBS缓冲液的pH＝7.4；
1.2)纳米磁珠的包被：
1.2.1)取5mg磁珠，用1ml MES缓冲液洗涤三次，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清；所述磁珠是以超顺磁性Fe3O4为内核、粒径为1150nm的羧基磁珠；所述MES缓冲液是质量浓度是2g/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸；所述MES缓冲液的pH＝6.0；所述纳米磁分离器的磁性强度是0.4T；
1.2.2)依次加入用步骤1.2.1)中的MES缓冲液配制的浓度是8-12mg/ml的EDC溶液以及用步骤1.2.1)中的MES缓冲液配制的浓度是6-10mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml，以10-40rpm/min于旋转混合仪中活化1hr，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，用1ml步骤1.2.1)中的MES缓冲液重悬，得到活化后的磁珠；
1.2.3)取5个离心管，在每个离心管中加入200μL步骤1.2.2)所得到的活化后的磁珠，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，向各离心管中加入用PBS缓冲液稀释的浓度为50-200μg/ml的由步骤1.1.4)所制备的重组P6-His融合蛋白溶液各1ml，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应2-6h，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清后，各加入1ml含1mg/ml乙醇胺的上述PBS缓冲液，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应2h以封闭磁珠上未与抗体反应的羧基；所述PBS缓冲液中各成分含量如下：8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，所述PBS缓冲液的pH＝7.4；
1.2.4)封闭反应完成后，将该5个离心管置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，各用1ml洗涤缓冲液洗涤三遍；所述洗涤缓冲液中各成分含量如下：8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，0.5ml/L Tween-20，所述洗涤缓冲液的pH＝7.4；
1.2.5)向各个离心管中分别加入1ml保存缓冲液重悬磁珠，置于4℃保存备用；至此制得抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠；所述保存缓冲液中各成分含量如下：8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，0.3g/L NaN3，5g/L BSA，所述保存缓冲液的pH＝7.4；
2)多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针的制备：
其具体制备方法包括：
2.1)向微量离心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子点、300nmol N-羟基琥珀酰亚胺sulfo-NHS以及300nmol碳二亚胺EDC，以磷酸盐缓冲液定容为5ml，混合溶液，37℃反应30min后，透析去除过量的作为活化剂的sulfo-NHS及EDC，得到活化后的量子点；所述羧基水溶性量子点的发射波长是520nm；所述磷酸盐缓冲液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠；所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.4；
2.2)在步骤2.1)所得到的活化的量子点中，加入2-12nmol的鼠抗人IgM单克隆抗体，避光反应2h，加入单端氨基化聚乙二醇PEG2000-NH2至终浓度为1％，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h；
2.3)用0.2μm PES滤器过滤除去步骤2.2)中的抗体聚集物，然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物；
2.4)收集步骤2.3)中超滤离心管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐洗涤液中，再将此溶液转移到一个新的50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，收集超滤离心管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于1ml磷酸盐保存液中，置于4℃保存备用，至此制得量子点标记的抗人IgM纳米探针；所述磷酸盐洗涤液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠，5ml/L吐温-20，0.3g/L叠氮钠，所述磷酸盐洗涤液的pH＝7.4；所述磷酸盐保存液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，10g/L牛血清白蛋白，0.3g/L叠氮钠；所述磷酸盐保存液的pH＝7.4；
2.5)按与步骤2.1)-2.4)相同的方法利用鼠抗人IgG单克隆抗体与发射波长为600nm的羧基水溶性量子点制得量子点标记的抗人IgG纳米探针；将上述两种量子点标记的纳米探针溶液按体积比1:1混合，即制得多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针；
3)PBST缓冲液的配制：
其具体配制方法包括：
取8g NaCL，0.2g KCl，0.24KH2PO4，1.44g Na2HPO4，5g BSA，0.3g NaN3，0.5ml Tween-20溶解于900ml蒸馏水中，用5M NaOH调整pH至7.4，再定容至1000ml；
4)质控品的制备：
4.1)阳性质控品：
4.1.1)抗人流感嗜血杆菌IgM抗体阳性质控品：由0.5ml人流感嗜血杆菌感染者的已确定抗人流感嗜血杆菌IgM抗体为阳性的血清构成；
4.1.2)抗人流感嗜血杆菌IgG抗体阳性质控品：由0.5ml人流感嗜血杆菌感染者的已确定抗人流感嗜血杆菌IgG抗体为阳性的血清构成；
4.2)阴性质控品：由0.5ml抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清构成。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1.2.2)中，依次加入用步骤1.2.1)中的MES缓冲液配制的浓度是10mg/ml的EDC溶液以及用步骤1.2.1)中的MES缓冲液配制的浓度是8mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml，以15rpm/min于旋转混合仪中活化1hr，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，用1ml步骤1.2.1)中的MES缓冲液重悬，得到活化后的磁珠；
所述步骤1.2.3)中，向各离心管中加入用PBS缓冲液稀释的浓度为100μg/ml的由步骤1.1.4)所制备的重组P6-His融合蛋白溶液各1ml，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应3h，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清后，各加入1ml含1mg/ml乙醇胺的上述PBS缓冲液；
所述步骤2.2)中，在步骤2.1)所得到的活化的量子点中，加入6nmol的鼠抗人IgM单克隆抗体，避光反应2h。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述量子点是羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述磁珠是以超顺磁性Fe3O4为内核、壳材料为聚苯乙烯、表面官能团为羧基、粒径为1150nm的羧基磁珠。
7.一种基于如权利要求2所述的基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒的使用方法，其特征在于：所述使用方法包括以下步骤：
1)取待检血清样本5μl用995μl PBSA缓冲液稀释后将稀释液转入1.5ml普通离心管中；所述PBSA缓冲液中各成分含量如下：8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，5g/L BSA；所述PBSA缓冲液的pH＝7.4；
2)向步骤1)中的离心管中依次加入基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒中的抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠10-100μl及基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒中的多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针40μl，室温下以10rpm/min于旋转混合仪上反应5-25min后取下，将离心管插入纳米磁分离器磁分离3min，用移液器吸出上清；
3)添加基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒中的PBST缓冲液1ml洗涤两遍，采用纳米磁分离器磁分离后吸出洗涤液，最后用0.2ml PBS缓冲液重悬磁珠，制得纳米磁珠-流感嗜血杆菌抗体-量子点“三明治”复合物；所述PBS缓冲液中各成分含量如下：8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4；所述PBS缓冲液的pH＝7.4；
4)将步骤3)得到的纳米磁珠-流感嗜血杆菌抗体-量子点复合物载于酶标板中，使用荧光酶标仪在激发波长同为365nm，发射波长分别为520nm及600nm的参数下分别对其荧光值进行分别读数；
5)按上述同样的方法检测至少30份经临床各种方法均确定为抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清样本，分别读取发射波长分别为520nm及600nm下的荧光值；
所述经临床各种方法均确定为抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清样本在发射波长为520nm的荧光值的平均值与3倍标准差之和记为CUT-OFF1值；所述经临床各种方法均确定为抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体均为阴性的人血清样本在发射波长为600nm的荧光值的平均值与3倍标准差之和记为CUT-OFF2值；
同时检测试剂盒中提供的四份阴性质控品样品及四份阳性质控品样品，分别读取发射波长分别为520nm及600nm下的荧光值；
所述四份阴性质控品样品在发射波长为520nm的荧光值的平均值记为NCX1；所述四份阴性质控品样品在发射波长为600nm的荧光值的平均值记为NCX2值；
两份抗人流感嗜血杆菌IgM抗体阳性质控品样品在发射波长为520nm的荧光平均值为PCX1；两份抗人流感嗜血杆菌IgG抗体阳性质控品样品在发射波长为及600nm下的荧光值记为PCX2；
若步骤4)中待检血清样本在发射波长为520nm的检测荧光值大于CUT-OFF1值且PCX1/NCX1≥2.1,则判断为待检血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgM抗体为阳性；
若步骤4)中待检样本在发射波长为520nm的检测荧光值小于CUT-OFF1值且PCX1/NCX1≥2.1，则判断为人待检血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgM抗体为阴性；
若步骤4)中待检血清样本在发射波长为600nm的检测荧光值大于CUT-OFF2值且PCX2/NCX2≥2.1，则判断为待检血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgG抗体为阳性；
若步骤4)中待检血清样本在发射波长为600nm的检测荧光值小于CUT-OFF2值且PCX2/NCX2≥2.1，则判断为待检血清样本中抗人流感嗜血杆菌IgG抗体为阴性；
若PCX1/NCX1＜2.1或PCX2/NCX2＜2.1，均表明试剂盒失效。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，向步骤1)中的离心管中依次加入基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒中的抗人流感嗜血杆菌抗体捕获纳米磁珠15μl及基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检试剂盒中的多色量子点分别标记的抗人IgM、IgG纳米探针40μl，室温下以10rpm/min于旋转混合仪上反应15min后取下，将离心管插入纳米磁分离器磁分离3min，用移液器吸出上清。
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