RU2331075C2 - СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К КАПСУЛЬНОМУ ПОЛИСАХАРИДУ Haemophilus influenzae ТИПА b - Google Patents
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К КАПСУЛЬНОМУ ПОЛИСАХАРИДУ Haemophilus influenzae ТИПА b Download PDFInfo
- Publication number
- RU2331075C2 RU2331075C2 RU2006133787/15A RU2006133787A RU2331075C2 RU 2331075 C2 RU2331075 C2 RU 2331075C2 RU 2006133787/15 A RU2006133787/15 A RU 2006133787/15A RU 2006133787 A RU2006133787 A RU 2006133787A RU 2331075 C2 RU2331075 C2 RU 2331075C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibodies
- capsular polysaccharide
- influenzae type
- conjugate
- incubated
- Prior art date
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и касается способа определения антител к капсульному полисахариду Haemophilus influenzae типа b. Сущность изобретения заключается в том, что на твердый носитель с сорбированным на нем высокоочищенным капсульным полисахаридом Haemophilus influenzae типа b наносят рабочие разведения исследуемой и контрольной сывороток, а также калибровочные пробы, представляющие собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к капсульному полисахариду - полирибозилрибитолфосфату Haemophilus influenzae, инкубируют, удаляют избыток антител, вносят конъюгат в рабочем разведении, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратную смесь, содержащую тетраметилбензидин и перекись водорода в заданных значениях, инкубируют в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемой и контрольной сывороток на содержание антител, строят график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах и по графику зависимости определяют количество антител в условных единицах в исследуемых пробах. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности способа. 2 табл., 1 ил.
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки поствакцинального иммунитета при вакцинации существующими (АКТ-ХИБ) и разрабатываемыми форсифицированными вакцинами.
Haemophilus influenzae типа b (Hib) является наиболее частой причиной бактериальных менингитов, поражающих детей до 6-летнего возраста, особенно детей от 3 до 12 месяцев. При инфицировании этим видом бактерий у человека формируется иммунный ответ к трем основным антигенам: капсульному полисахариду, белкам наружной мембраны и липоолигосахаридам. Капсульный полисахарид - полирибозилрибитолфосфат (ПРФ) - является основой современных вакцинных препаратов. Для формирования Т-клеточного иммунитета его конъюгируют с различными бактериальными белками, такими как столбнячный и дифтерийный анатоксины и др. Для профилактики заболеваний, вызываемых Hib, за рубежом созданы вакцинирующие препараты. Одна из таких вакцин «АКТ-ХИБ» (Авентис Пастер, Франция), представляющая собой конъюгат ПРФ со столбнячным анатоксином, сертифицирована и разрешена к применению на территории России. Доказана ее высокая эффективность и безопасность. Разрабатываются подобные вакцины и в нашей стране. Для оценки эффективности разрабатываемых отечественных форсифицированных вакцин необходимы тесты, регистрирующие уровень поствакцинального иммунитета.
Известен способ выявления антител к олигосахариду капсульного полисахарида Hib с помощью ИФА. В качестве иммуносорбента используют 96-луночный полистироловый планшет, на котором сорбирован олигосахарид, конъюгированный с альбумином человека [Clin. And Diagn. Labor. Immunol., 1996, Jan., p.84-88]. Анализируемые образцы сывороток титруют с 1:50 в фосфатно-солевом буфере с добавлением твина и ЭДТА. После инкубации и отмывания вносят моноклональный конъюгат. Полученное соединение антиген-антитело-конъюгат проявляют субстратной смесью с последующей детекцией на спектрофотометре. Для калибровочной кривой используют аффинноочищенные антитела.
Однако при использовании иммуносорбента, содержащего альбумин человека, есть вероятность определения аутоантител к нему в анализируемых пробах.
Технический результат заявленного способа заключается в повышении эффективности определения антител к капсульному полисахариду H.influenzae за счет использования высокоочищенного полисахарида, не требующего конъюгации, а также за счет использования поликлонального конъюгата, представляющего собой кроличьи антитела против иммуноглобулинов G (H+L) человека, меченные пероксидазой, и калибровочных проб, представляющих собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к ПРФ Hib.
Для достижения указанного технического результата способ определения антител к капсульному полисахариду Haemophilus influenzae типа b заключается в том, что на твердый носитель с сорбированным на нем высокоочищенным капсульным полисахаридом Haemophilus influenzae типа b наносят рабочие разведения исследуемой и контрольной сывороток, а также калибровочные пробы, представляющие собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к капсульному полисахариду - полирибозилрибитолфосфату Haemophilus influenzae: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 усл. Ед./мл, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 30 минут, удаляют избыток антител, вносят конъюгат в рабочем разведении, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратную смесь, содержащую тетраметилбензидин и перекись водорода в заданных значениях, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 15-20 минут в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемой и контрольной сывороток на содержание антител, строят график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах и по графику зависимости определяют количество антител в условных единицах в исследуемых пробах.
Наличие гуморального иммунитета может быть оценено с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В основе метода лежит иммуносорбент, представляющий собой стрипированный 96-луночный планшет, сорбированный высокоочищенным капсульным полисахаридом Hib, принадлежность которого к ПРФ доказана с помощью ядерно-магнитно-резонансной спектроскопии и химического анализа, а специфическая активность - в различных серологических тестах.
При выполнении анализа образцы сывороток и калибровочные пробы вносят в лунки иммуносорбента в рабочем разведении. После инкубации и отмывки во все лунки иммуносорбента вносят конъюгат в рабочем разведении. Проявка реакции осуществляется субстратной смесью, содержащей тетраметилбензидин (ТМБ) и перекись водорода.
Калибровочные пробы - сыворотки с относительным содержанием IgG антител к ПРФ Hib: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 усл. ед./мл. На их основе строится график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах (см. чертеж).
По калибровочному графику определяют относительное количество IgG антител к ПРФ Hib в анализируемых сыворотках крови человека.
Используемые реагенты:
(1) иммуносорбент - планшет полистирольный разборный, состоящий из 128-луночных стрипов, сорбированных капсульным полисахаридом Hib, - 1 шт.;
(2) калибровочные пробы (8) - сыворотки с относительным содержанием IgG антител к ПРФ Hib: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 усл. ед./мл. Каждая проба содержит 0,2 мл раствора, во флаконе;
(3) отрицательный контроль (К-) - сыворотка крови человека, содержащая <0,5 усл. ед./мл, жидкая - 1 фл., 0,1 мл;
(4) положительный контроль (К+) - сыворотка крови человека, содержащая >2,0 усл. ед./мл, жидкая - 1 фл., 0,1 мл;
(5) конъюгат (КГ) - антитела кроличьи против IgG (H+L) человека, меченные пероксидазой, жидкий, концентрированный - 1 фл., 0,2 мл;
(6) субстратная смесь, содержащая тетраметилбензидин (ТМБ) - 1 фл., 12 мл;
(7) промывающий и разводящий фосфатно-солевой буферный раствор, десятикратный концентрат с детергентом (ФСБ-Д)к - 1 фл., 50 мл;
(8) стоп-реагент - 0,9 М H2SO4.
Приготовление растворов для проведения анализа:
1) (ФСБ-Д)к перед применением разводят дистиллированной водой в 10 раз. Полученный раствор ФСБ-Д хранят не более 3 недель при 4-8°С. Раствор предназначен для отмывки планшета от непрореагировавших компонентов, разведения сывороток и конъюгата;
2) контроли (К+ и К-), а также анализируемые сыворотки перед проведением анализа разводят раствором ФСБ-Д до соотношения 1:100 (10 мкл на 1000 мкл ФСБ-Д.) Рабочее разведение сывороток хранению не подлежит;
3) рабочее разведение конъюгата готовят непосредственно перед использованием, разводя исходный раствор до соотношения 1:200 ФСБ-Д (50 мкл на 10 мл ФСБ-Д).
Последовательность операций
Отмывка иммуносорбента. Во все лунки планшета вносят ФСБ-Д в объеме не менее 0,2 мл. Выдерживают планшет при комнатной температуре в течение 2-3 мин. Содержимое лунок удаляют вытряхиванием. Отмывку повторяют еще 3 раза.
Внесение образцов. В лунки первого ряда планшета последовательно вносят калибровочные пробы №№1-8. Далее последовательно вносят рабочие растворы (1:100) контролей (К+ и К-) в дублях и анализируемые сыворотки. Объем вносимых проб - 100 мкл.
Инкубация. Выдерживают планшет с растворами сывороток в течение 30 мин при 18-22°С.
Отмывка от избытка антител. Жидкость из лунок планшета удаляют вытряхиванием и трехкратно отмывают раствором ФСБ-Д, как указано в п.1.
Внесение рабочего раствора конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл рабочего раствора КГ.
Инкубация. Как в п.3.
Отмывка от избытка КГ. Как в п.1.
Внесение субстратного раствора ТМБ. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора ТМБ.
Инкубация. 15-20 мин в темноте при температуре 18-22°С.
В каждую лунку вносят по 50 мкл стоп-реагента.
Учет результатов
Вывести спектрофотометр на нулевой уровень («blank») по воздуху.
Измерить оптическую плотность в лунках планшета при 450 нм в течение 10 минут после остановки реакции.
Построить график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах.
По калибровочному графику определить относительное количество IgG антител к ПРФ Hib в анализируемых пробах.
Пример исследования сывороток детей в возрасте до 3 лет, подвергшихся иммунизации вакциной «АКТ-ХИБ» (Авентис Пастер, Франция), на наличие антител к капсульному полисахариду Hib
| №№ п/п | ОП 450 нм | Усл. ед./мл | ||
| до иммунизации | через месяц после иммунизации | до иммунизации | через месяц после иммунизации | |
| 1 | 0,76 | 0,65 | 1,3 | 1,04° |
| 2 | 0,83 | 0,94 | 1,6 | 1,9* |
| 3 | 1,02 | 0,55 | 2,3 | 0,8° |
| 4 | 0,71 | 1,36 | 1,2 | 5,2** |
| 5 | 0,61 | 0,36 | 0,9 | 0,4° |
| 6 | 0,55 | 0,56 | 0,8 | 0,8- |
| 7 | 0,94 | 0,99 | 1,9 | 2,0* |
| 8 | 0,93 | 1,05 | 1,8 | 2,4* |
| 9 | 0,27 | 0,70 | 0,3 | 1,2** |
| 10 | 0,70 | 1,25 | 1,2 | 3,9* |
| 11 | 0,52 | 0,56 | 0,7 | 0,8* |
| 12 | 0,65 | 0,86 | 1,0 | 1,6* |
| 13 | 0,33 | 0,52 | 0,4 | 0,7* |
| 14 | 0,28 | 1,48 | 0,3 | 6,7** |
| 15 | 0,34 | 0,75 | 0,4 | 1,3* |
| 16 | 1,32 | 1,73 | 4,7 | 14,8** |
| 17 | 0,84 | 1,79 | 1,6 | 17,9** |
Из 17 детей у 13 (*) уровень IgG AT после вакцинации вырос (из них - в 4 и более раз - только у 5 человек (**)). У 3 детей произошло понижение уровня AT после вакцинации (°), а у одного уровень AT не изменился (-).
Пример определения антител капсульному полисахариду в сыворотках вакцинированных детей с помощью набора «Fuller Laboratories» и предложенного способа.
| №№ сыворотки | Набор «Fuller» | Предложенный способ | ||
| до вакцинациим кг/мл | после вакцинациим кг/мл | до вакцинации усл.ед./мл | после вакцинации усл.ед./мл | |
| 1 | 0,7 | 21,1 | 1,58 | 1,87 |
| 2 | 0,5 | 22,4 | 1,2 | 5,17 |
| 3 | 0,5 | 21,9 | 0,27 | 1,09 |
| 4 | 0,4 | 21,8 | 1,17 | 3,87 |
| 5 | 0,4 | 22,6 | 0,28 | 6,68 |
| 6 | 0,2 | 11,4 | 0,38 | 1,32 |
| 7 | 1,7 | 22,2 | 4,71 | 14,75 |
| 8 | 1,6 | 22,4 | 1,6 | 17,88 |
Claims (1)
- Способ определения антител к капсульному полисахариду Haemophilus influenzae типа b, заключающийся в том, что на твердый носитель с сорбированным на нем высокоочищенным капсульным полисахаридом Haemophilus influenzae типа b наносят рабочие разведения исследуемой и контрольной сывороток, а также калибровочные пробы, представляющие собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к капсульному полисахариду - полирибозилрибитолфосфату Haemophilus influenzae: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 условных единиц/мл, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 30 мин, удаляют избыток антител, вносят конъюгат в рабочем разведении, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратную смесь, содержащую тетраметилбензидин и перекись водорода в заданных значениях, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 15-20 мин в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемой и контрольной сывороток на содержание антител, строят график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах и по графику зависимости определяют количество антител в условных единицах в исследуемых пробах.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006133787/15A RU2331075C2 (ru) | 2006-09-22 | 2006-09-22 | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К КАПСУЛЬНОМУ ПОЛИСАХАРИДУ Haemophilus influenzae ТИПА b |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006133787/15A RU2331075C2 (ru) | 2006-09-22 | 2006-09-22 | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К КАПСУЛЬНОМУ ПОЛИСАХАРИДУ Haemophilus influenzae ТИПА b |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006133787A RU2006133787A (ru) | 2008-03-27 |
| RU2331075C2 true RU2331075C2 (ru) | 2008-08-10 |
Family
ID=39746564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006133787/15A RU2331075C2 (ru) | 2006-09-22 | 2006-09-22 | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К КАПСУЛЬНОМУ ПОЛИСАХАРИДУ Haemophilus influenzae ТИПА b |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2331075C2 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2465316C1 (ru) * | 2011-10-05 | 2012-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "ГРИТВАК" | Штамм бактерий haemophilus influenzae в №326, стабильный продуцент капсульного полисахарида |
| CN104181301A (zh) * | 2014-08-18 | 2014-12-03 | 湖北工业大学 | 基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检的方法和试剂盒 |
-
2006
- 2006-09-22 RU RU2006133787/15A patent/RU2331075C2/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MADORE D.V. et al. Interlaboratory study evaluating quantitation of antibodies to Haemophilus influenzae type b polysaccharide by enzyme-linked immunosorbent assay, Clin. Diagn. Lab. Immunol, 1996, Jan., 3(1), 84-88. MITCHELL J., HILL S.L. Immune response to Haemophilus parainfluenzae in patients with chronic obstructive lung disease. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunol., 2000, Jan. 7(1), 25-30. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2465316C1 (ru) * | 2011-10-05 | 2012-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "ГРИТВАК" | Штамм бактерий haemophilus influenzae в №326, стабильный продуцент капсульного полисахарида |
| CN104181301A (zh) * | 2014-08-18 | 2014-12-03 | 湖北工业大学 | 基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检的方法和试剂盒 |
| CN104181301B (zh) * | 2014-08-18 | 2016-01-06 | 湖北工业大学 | 基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检的方法和试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2006133787A (ru) | 2008-03-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Raoult et al. | Line blot and western blot immunoassays for diagnosis of Mediterranean spotted fever | |
| Konradsen et al. | A modified enzyme-linked immunosorbent assay for measuring type-specific anti-pneumococcal capsular polysaccharide antibodies | |
| Ciocchini et al. | A bacterial engineered glycoprotein as a novel antigen for diagnosis of bovine brucellosis | |
| Ren et al. | A brief review of diagnosis of small ruminants brucellosis | |
| Baldi et al. | Diagnosis of canine brucellosis by detection of serum antibodies against an 18 kDa cytoplasmic protein of Brucella spp. | |
| Czerkinsky et al. | The detection and specificity of class specific antibodies to whole bacterial cells using a solid phase radioimmunoassay. | |
| RU2331075C2 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К КАПСУЛЬНОМУ ПОЛИСАХАРИДУ Haemophilus influenzae ТИПА b | |
| Kumar et al. | Improvement in the diagnosis of Brucella abortus infections in naturally infected water buffaloes (Bubalus bubalis) using an ELISA with a Protein-G-based indicator system | |
| Goldsmith | A highly sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for human immunoglobulin E: comparison of microtiter plate and disk methodologies | |
| Savage et al. | Radioimmunosorbent assay for Botrytis cinerea | |
| Nguyen et al. | Rapid method for detection of Coxiella burnetii antibodies using high-density particle agglutination | |
| Keysary et al. | Use of enzyme-linked immunosorbent assay techniques with cross-reacting human sera in diagnosis of murine typhus and spotted fever | |
| Estein et al. | Comparison of serological tests based on outer membrane or internal antigens for detecting antibodies to Brucella ovis in infected flocks | |
| Kahane et al. | Detection of IgG antibodies specific for measles virus by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) | |
| Kuno-Sakai et al. | A simple and sensitive ELISA of antibodies to pertussis antigens | |
| Minas et al. | Validation of a competitive ELISA for diagnosis of Brucella melitensis infection in sheep and goats | |
| Wilkinson et al. | Detection of cell-associated or soluble antigens of Legionella pneumophila serogroups 1 to 6, Legionella bozemanii, Legionella dumoffii, Legionella gormanii, and Legionella micdadei by staphylococcal coagglutination tests | |
| KR20160075964A (ko) | 돼지 콜레라 바이러스의 e2 단백질 및 이에 특이적인 단일클론항체를 이용한 돼지 콜레라 감염여부를 진단하는 방법 및 이를 구현하기 위한 진단키트 | |
| Witkowski et al. | Development of ELISA test for determination of the level of antibodies against Rhodococcus equi in equine serum and colostrum | |
| Ruths et al. | ELISA procedures for the measurement of IgG subclass antibodies to bacterial antigens | |
| Vojdani | Cross-reactivity of Aspergillus, Penicillium, and Stachybotrys antigens using affinity-purified antibodies and immunoassay | |
| MXNL06000077A (es) | Un antigeno modificado para deteccion de anticuerpos contra brucella y metodo de uso. | |
| WO1997046883A1 (en) | Elisa serodiagnosis of pig pleuropneumonia serotypes 4 and 7 | |
| Choi et al. | Enzyme-linked immunosorbent assay for detecting anti-pertussis toxin antibody in mouse | |
| Noya et al. | Improvements and variants of the multiple antigen blot assay-MABA: an immunoenzymatic technique for simultaneous antigen and antibody screening |