CN107121464A - 一种磁性双功能纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种磁性双功能纳米探针及其制备方法和应用。本申请合成的双功能纳米探针是以羧基化Fe3O4磁性纳米粒子作为纳米载体,同时固定萘啶衍生物和二茂铁衍生物。其中萘啶衍生物能够识别CGG三核苷酸重复序列,二茂铁衍生物具有电化学活性,因此上述双功能纳米探针同时具备核酸识别功能和电化学活性,可应用于电化学传感器的构建识别CGG三核苷酸重复序列。

Description

一种磁性双功能纳米探针及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及一种磁性双功能纳米探针及其制备方法和应用,属于化学检测及生物技术领域。
背景技术
随着现代基因技术的快速发展,研究人员发现许多人类疾病与核酸分子中的碱基序列变化、折叠、以及它们在表达数量、表达位置和修饰状态上发生的变化密切相关。致病基因内三核苷酸重复序列(如CGG,CAG,CTG和GAA)的不稳定异常增多而导致的遗传病称作三核苷酸重复序列动态突变性遗传疾病。例如在FMR1基因的5'-非翻译区存在的CGG三核苷酸重复序列与脆性X综合症相关,GAA三核苷酸重复序列突变引起了弗里德赖希共济失调,CAG三核苷酸重复序列的异常增加导致了亨廷顿舞蹈疾病,因此对三核苷酸重复序列的识别和检测一直是研究人员面临的严峻挑战。目前,常用的三核苷酸重复序列的检测方法有:聚合酶链式反应,重复扩增检测,DNA印记,纳米技术,蛋白质印记,琼脂糖凝胶电泳技术等。近年来DNA生物传感器发展迅速,鉴于该方法的优越性,如快速灵敏、免标记、低成本、易操作、高效选择性和无污染等,因此它们被广泛应用于疾病标记、DNA损伤、碱基识别以及功能性适体核酸等,是生命科学研究的前沿热门领域。纳米材料(如金纳米粒子,磁性纳米粒子,量子点等)常常作为捕获探针、信号分子、目标标记物或者电极载体等在电化学检测体系中发挥着重要的作用。相比传统的电化学材料,纳米材料拥有优异的生物相容性,高的结合位点和信号强度,其中磁性纳米粒子由于其易分离,无毒和高的生物相容性有着广泛的应用。电活性物质(如二茂铁,亚甲基蓝和三氯化六氨合钌等)、纳米粒子以及量子点标记的核酸都被用来提供电化学信号。目前大多数电化学核酸传感器是建立在DNA杂交基础上的,所以我们把磁性纳米粒子、二茂铁衍生物与前期研究的核酸识别分子结合起来,设计合成了一种新型磁性双功能纳米探针,并将其应用于电化学传感器中检测CGG三核苷酸重复序列,为与CGG三核苷酸重复酸序列相关的神经性疾病的早期诊断和治疗提供了一种可行性方案。
发明内容
本申请的目的之一在于提供一种磁性双功能纳米探针。
为了实现上述目的,本申请采用如下技术方案:
一种磁性双功能纳米探针,其特征在于,所述探针以以羧基化Fe3O4磁性纳米粒子作为纳米载体,同时固定萘啶衍生物和二茂铁衍生物;同时具有两种作用:一是表面的修饰的二茂铁提供电信号;二是表面修饰的萘啶衍生物具有识别核酸序列的功能。
一种磁性双功能纳米探针,所述磁性双功能纳米探针按照以下方法制备:
将羧基化Fe3O4磁性纳米粒子分散到PBS缓冲溶液中,同时加入萘啶衍生物溶液和二茂铁衍生物溶液,在25~37℃下超声反应1~1.5h,得到反应后的溶液;
将所述的反应后溶液进行磁分离,得到下层的磁性纳米粒子,再用PBS缓冲溶液洗涤,之后分散到PBS缓冲溶液中,得到所述的磁性双功能纳米探针。
优选地,所述的羧基化Fe3O4磁性纳米粒子,按照如下方法得到:
将羧基化Fe3O4磁性纳米粒子粗品分散在水中,得到羧基化Fe3O4磁性纳米粒子的悬浮液;取出所述悬浮液加入到MES缓冲溶液中,同时加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺,然后在超声条件下进行反应得到反应后的溶液;将反应后的溶液进行磁分离和洗涤得到所述的羧基化Fe3O4磁性纳米粒子。
本申请的磁性双功能纳米探针,将羧基化Fe3O4磁性纳米粒子、具有可逆电化学性质的二茂铁衍生物和能够特异性识别CGG三核苷酸重复序列的萘啶衍生物结合在一起,合成了一种具有核酸识别和电化学活性的磁性双功能纳米探针,利用上述探针构建电化学生物传感器对CGG三核苷酸重复序列进行识别检测。
本申请的目的之二在于提供一种磁性双功能纳米探针的制备方法。
为了实现上述目的,本申请采用如下技术方案:
一种磁性双功能纳米探针的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
将羧基化Fe3O4磁性纳米粒子分散到PBS缓冲溶液中,同时加入萘啶衍生物溶液和二茂铁衍生物溶液,在25~37℃下超声反应1~1.5h,得到反应后的溶液;
将所述的反应后溶液进行磁分离,再用PBS缓冲溶液洗涤,之后分散到PBS缓冲溶液中,得到所述的双功能纳米探针。
优选地,所述的羧基化Fe3O4磁性纳米粒子,按照如下方法得到:
将羧基化Fe3O4磁性纳米粒子粗品分散在水中,得到羧基化Fe3O4磁性纳米粒子的悬浮液;取出所述悬浮液加入到MES缓冲溶液中,同时加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺,然后在超声条件下进行反应得到反应后的溶液;将反应后的溶液进行磁分离和洗涤得到所述的羧基化Fe3O4磁性纳米粒子。
优选地,所述的制备方法具体包括:
将羧基化Fe3O4磁性纳米粒子重新分散到2mL PBS缓冲溶液,同时加入80μL浓度为1mM的萘啶衍生物溶液和100μL浓度为1mM的二茂铁衍生物溶液,在37℃下超声反应90min,将反应得到的溶液进行磁分离,用PBS缓冲溶液洗涤3次,之后分散到120μL PBS缓冲溶液中,得到所述的双功能纳米探针。
优选地,所述的羧基化Fe3O4磁性纳米粒子,按照如下方法得到:
将羧基化Fe3O4磁性纳米粒子粗品分散在50mL超纯水中,取出20μL上述制备好的悬浮液加入到2mL MES缓冲溶液中,再同时加入76mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和46mg N-羟基琥珀酰亚胺,在37℃下超声反应40min,将反应后的溶液进行磁分离,用超纯水洗涤3次,即得到所述的羧基化Fe3O4磁性纳米粒子。
优选地,所述二茂铁衍生物的制备包括以下步骤:
a)将二茂铁甲酸在苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)作用下,与N-Boc-乙二胺反应得到二茂铁衍生物Boc-AFFA;
b)将二茂铁衍生物Boc-AFFA在4M盐酸乙酸乙酯溶液中脱保护得二茂铁衍生物AFFA。
优选地,所述MES缓冲溶液为0.1M,pH=6.0并含有0.5M NaCl的吗啉乙磺酸缓冲溶液。
优选地,所述PBS缓冲溶液为10mM,pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液。
作为优选方案,二茂铁衍生物(AFFA)的制备方法选择为:将二茂铁甲酸在HBTU和DIPEA作用下,与N-Boc-乙二胺反应得到二茂铁衍生物(Boc-AFFA);将二茂铁衍生物(Boc-AFFA)在4M盐酸乙酸乙酯溶液中脱保护得二茂铁衍生物(AFFA)。
反应过程如下:
本申请的目的之三在于提供该磁性双功能纳米探针在识别CGG三核苷酸重复序列中的应用。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
通过构建一种电化学检测体系,在磁性双功能纳米探针的作用下,这种电化学传感能够选择识别CGG三核苷酸重复序列。
本申请中,羧基化Fe3O4磁性纳米粒子简称为CMNPs,萘啶衍生物简称为NC-linker,二茂铁衍生物简称为AFFA。
本申请的双功能纳米探针用UV-vis进行了表征,结果表明二茂铁衍生物和萘啶衍生物成功修饰到磁性纳米粒子表面。同时也采用方波伏特安培测量法(SWV)对本申请合成的双功能纳米探针的电化学性能进行了研究,结果表明本申请合成的双功能纳米探针有明显的电信号。
双功能纳米探针在CGG三核苷酸重复序列中的应用。本申请所提供的双功能纳米探针既具有识别功能又具有电信号,可应用于电化学传感器中检测CGG三核苷酸重复序列,有较高的选择性,同时具有快速、操作简便、灵敏及环境友好等优点。
附图说明
图1:双功能纳米探针的制备示意图。
图2:双功能纳米探针的(A)紫外吸收图和(B)方波伏安法图。其中(a):羧基化Fe3O4磁性纳米粒子(b):NC-linker修饰的羧基化Fe3O4磁性纳米粒子;(c)AFFA修饰的羧基化Fe3O4磁性纳米粒子;(d):双功能纳米探针。
图3A和图3B分别为不同修饰电极的电化学阻抗图和循环伏安图。其中(a):裸金电极;(b)裸金电极+SH-DNA;(c):裸金电极+SH-DNA+MCH;(d)裸金电极+SH-DNA+MCH+CGG;(e)裸金电极+SH-DNA+MCH+CGG+双功能纳米探针。
图4A和图4B分别为不同三核苷酸重复序列修饰的电化学传感器与双功能纳米探针的磷酸盐缓冲溶液培育后的方波伏安氧化峰曲线及相应的柱状图。
具体实施方式
下述实施例是对于本申请内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释,但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述,本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本申请所要求的保护范围。
实施例1双功能纳米探针的制备
(1)羧基化Fe3O4磁性纳米粒子粗品的制备:将4.05g FeCl3·6H2O溶解在75mL超纯水中,转移到三口烧瓶中之后加热至70℃,在搅拌下加入2.3074g FeSO4·7H2O,之后快速加入9mL质量分数为25%的浓氨水,反应1min之后逐滴加入2.5g油酸,继续在70℃下搅拌1h,溶液中出现黑色溶胶状物质,待溶液冷却至室温后用乙醇反复洗涤,再用超纯水洗涤至中性。随后加入80mL浓度为10mg/mL的KMnO4溶液,在室温下持续超声震荡反应4h。将上述溶液进行磁分离后用超纯水洗涤3次,得到羧基化Fe3O4磁性纳米粒子粗品。
(2)二茂铁衍生物(AFFA)的制备:将345mg二茂铁甲酸、1.1377g HBTU和1.0451mLDIPEA一起溶解在30mL干燥的CH2Cl2中并在冰浴下持续搅拌1h,然后加入315.4μL N-Boc-乙二胺,在30℃下搅拌反应12h。反应混合液经旋转蒸发仪蒸干后,溶于CH2Cl2,分别用饱和Na2CO3溶液和H2O洗涤,用无水Na2SO4干燥,过滤之后旋干得到Boc-AFFA的粗产物,柱色谱纯化(Rf=0.6,VCHCl3/VCH3OH=8:1)得到橘黄色固体化合物(Boc-AFFA)253mg,产率为45%。1HNMR和MS的表征结果,1H NMR(CDCl3,600MHz)δ:1.46(s,9H),3.37(t,2H),3.49(t,2H),4.20(s,5H),4.34(s,2H),4.69(s,2H),and 6.61(s,1H)。化合物分子式为C18H24FeN2O3,分子量理论值m/z:373.25,检测值m/z:373.11。
取9.3mg Boc-AFFA溶于4mL CHCl3中,在冰浴搅拌下逐滴加入2.0mL,4M HCl/EtOAc进行脱保护,然后在室温下反应0.5h,旋干后用少量CHCl3洗涤得到二茂铁衍生物(AFFA)。AFFA的分子式为C13H16FeN2O,分子量理论值m/z:273.13,检测值ESI-MS m/z:273.06。
(3)双功能纳米探针的制备:将羧基化Fe3O4磁性纳米粒子粗品分散在50mL超纯水中,取出20μL上述制备好的悬浮液加入到2mL MES缓冲溶液中,再同时加入76mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和46mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),在37℃下超声反应40min,将反应后的溶液进行磁分离,用超纯水洗涤3次;将上述反应后的羧基化Fe3O4磁性纳米粒子重新分散到2mL PBS缓冲溶液,同时加入80μL浓度为1mM的萘啶衍生物(NC-linker)溶液和100μL浓度为1mM的二茂铁衍生物(AFFA)溶液,在37℃下超声反应90min,将反应得到的溶液进行磁分离,用PBS缓冲溶液洗涤3次,之后分散到120μL PBS缓冲溶液中,得到双功能纳米探针,如图1所示。
实施例2双功能纳米探针的结构和性能表征
(1)双功能纳米探针的紫外表征:分别检测双功能纳米探针、羧基化Fe3O4磁性纳米粒子、萘啶衍生物(NC-linker)和二茂铁衍生物(AFFA)的磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)的紫外吸收光谱。如图2A所示,萘啶衍生物(NC-linker)在225,319和320nm处有很强的紫外吸收,二茂铁衍生物(AFFA)在260nm处有最大吸收峰,双功能纳米探针在225,319,320和260nm处有很强的紫外吸收,结果表明萘啶衍生物(NC-linker)和二茂铁衍生物(AFFA)成功修饰到羧基化羧基化Fe3O4磁性纳米粒子表面。
(2)双功能纳米探针的电化学性能表征:将裸金电极分别检测双功能纳米探针、羧基化Fe3O4磁性纳米粒子、萘啶衍生物(NC-linker)和二茂铁衍生物(AFFA)的磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)的方波伏安曲线图。如图2B所示,双功能纳米探针和只修饰了二茂铁衍生物(AFFA)的羧基化Fe3O4磁性纳米粒子的磷酸盐缓冲溶液在0.46V左右有明显的电信号,此结果说明我们设计合成的这种新型双功能纳米探针具有良好的电活性。
实施例3:基于磁性双功能探针的电化学传感器的构建和制备
将抛光过的金电极在0.5M H2SO4中进行活化,然后将其浸泡在2μM的SH-DNA(5'-HS-(CH2)6-GGC CAC GAG TTG ACA-3')中13小时后取出,清洗,再用0.1mM 6-巯基己醇封闭金电极表面空出的电化学活性位点。然后将该金电极浸入4μM的d(CGG)10(5'-CGG CGG CGGCGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG TGT CAA CTC GTG GCC-3')中培养7小时,使得d(CGG)10的3'端与SH-DNA碱基杂化,最终得到CGG三核苷酸重复序列修饰的电化学传感器。通过电化学交流阻抗和循环伏安法进行表征,如图3所示,经DNA修饰后的电化学交流阻抗逐渐增大,峰电流的逐渐降低,表明SH-DNA和CGG三核苷酸重复序列成功组装到金电极上。
实施例4:电化学传感器对CGG三核苷酸重复序列的选择性识别
将制备好的电化学传感器在本发明中的新型双功能纳米探针的磷酸盐缓冲溶液(10mM,pH=7.4)中培育3h,而后用磷酸盐缓冲溶液清洗以除去非特异性吸附的探针分子。培育后的传感器通过SWV来表征本发明中双功能纳米探针对三核苷酸重复序列CGG的选择性识别。如图4所示,CGG传感器在0.46V左右表现出在明显的电化学信号,然而其它三核苷酸重复序列(TGG,CCG,GAA,CAG,CTG,ATT和CGG)修饰的电化学传感器却没有明显的电化学信号。这些结果说明本发明中的新型双功能纳米探针能够应用于电化学传感器中选择性识别CGG三核苷酸重复序列。
以上所述,仅是本申请的几个实施例,并非对本申请做任何形式的限制,虽然本申请以较佳实施例揭示如上,然而并非用以限制本申请,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本申请技术方案的范围内,利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例,均属于技术方案范围内。

Claims (7)

1.一种磁性双功能纳米探针,其特征在于,所述探针以以羧基化Fe3O4磁性纳米粒子作为纳米载体,同时固定萘啶衍生物和二茂铁衍生物;同时具有两种作用:一是表面的修饰的二茂铁提供电信号;二是表面修饰的萘啶衍生物具有识别核酸序列的功能。
2.根据权利要求1所述磁性双功能纳米探针,按照以下方法制备:
将羧基化Fe3O4磁性纳米粒子表面的羧基通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺进行活化。把羧基化Fe3O4磁性纳米粒子粗品分散在50mL超纯水中,取出20μL上述制备好的悬浮液加入到2mL MES缓冲溶液中,再同时加入76mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和46mg N-羟基琥珀酰亚胺,在37℃下超声反应40min,将反应后的溶液进行磁分离,用超纯水洗涤3次,即得到羧基化Fe3O4磁性纳米粒子表面羧基的活化产物;
将上面制备的活化产物重新分散到2mL PBS缓冲溶液,同时加入80μL浓度为1mM的萘啶衍生物溶液和100μL浓度为1mM的二茂铁衍生物溶液,在25~37℃下超声反应1~1.5h,将反应得到的溶液进行磁分离,用PBS缓冲溶液洗涤3次,之后分散到一定量的PBS缓冲溶液(如120μL)中,得到所述的双功能纳米探针。
3.一种制备权利要求1或2中任意一项所述磁性双功能纳米探针的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
将羧基化Fe3O4磁性纳米粒子表面的羧基通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺进行活化。把羧基化Fe3O4磁性纳米粒子粗品分散在50mL超纯水中,取出20μL上述制备好的悬浮液加入到2mL MES缓冲溶液中,再同时加入76mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和46mg N-羟基琥珀酰亚胺,在37℃下超声反应40min,将反应后的溶液进行磁分离,用超纯水洗涤3次,即得到羧基化Fe3O4磁性纳米粒子表面羧基的活化产物;
将上面制备的活化产物重新分散到2mL PBS缓冲溶液,同时加入80μL浓度为1mM的萘啶衍生物溶液和100μL浓度为1mM的二茂铁衍生物溶液,在25~37℃下超声反应1~1.5h,将反应得到的溶液进行磁分离,用PBS缓冲溶液洗涤3次,之后分散到一定量的PBS缓冲溶液(如120μL)中,得到所述的双功能纳米探针。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述二茂铁衍生物的制备包括以下步骤:
a)将二茂铁甲酸在苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)作用下,与N-Boc-乙二胺反应得到二茂铁衍生物Boc-AFFA;
b)将二茂铁衍生物Boc-AFFA在4M盐酸乙酸乙酯溶液中脱保护得二茂铁衍生物AFFA。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述MES缓冲溶液为0.1M,pH=6.0并含有0.5M NaCl的吗啉乙磺酸缓冲溶液。
6.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述PBS缓冲溶液为10mM,pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液。
7.如权利要求1或2所述的磁性双功能纳米探针或者按照权利要求3-6任意一项所述的制备方法所制备的磁性双功能纳米探针用于选择性的识别CGG三核苷酸重复序列方面的用途。
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