CN107402249B - 一种基于杂交链式反应信号放大技术检测金属离子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于杂交链式反应信号放大技术检测重金属银离子的方法，属于分析化学或环境监测技术领域。利用自组装技术，将富含C碱基的核酸链S1通过Au‑S键固定到金包裹的磁性纳米粒子表面。银离子（Ag⁺）存在时，二茂铁标记的富含C碱基的核酸链S2通过C‑Ag⁺‑C结构与S1形成双链DNA。当加入二茂铁标记的发夹结构DNA H1和H2后，在S2的诱导作用下H1和H2发夹结构打开并在磁性纳米粒子表面发生交杂链式反应，形成的复合物在金磁电极表面通过磁性富集实现电化学响应信号的放大。根据电化学信号的增强实现溶液中的Ag⁺浓度的测定，该法具有高灵敏度、高选择性、简单、快速等特点。

Description

一种基于杂交链式反应信号放大技术检测金属离子的方法

技术领域

本发明属于分析化学或环境监测技术领域，具体涉及一种基于磁性纳米粒子和杂交链式反应信号放大技术检测重金属银离子的电化学方法。

背景技术

银作为一种贵金属有着极好的光学、电学和杀菌特性，因而广泛地应用于能源、摄像、医药等各个行业。因此，必然会有一些含银的残留物被排放到水体环境中，对水生生物和人类健康产生潜在的威胁。银离子（Ag⁺）能通过食物链或者饮用水进入人体，导致机体内的含硫酶失活，还可以与胺、咪唑等各种代谢产物结合而导致各种疾病，如肠胃炎、神经紊乱、精神疲劳、风湿、软骨打结、成纤维细胞等对人体健康造成危害。因此，发展快速测定微量Ag⁺的方法十分重要。研究表明，金属离子能选择性的结合到天然或人工合成的DNA碱基上，形成以金属介导的碱基对，通过寡核苷酸结构的变化来检测金属离子。类似地，Ag⁺能特异性识别胞嘧啶（C）-胞嘧啶（C）错配，形成稳定的C-Ag⁺-C 结构，这促使了Ag⁺传感检测方法的快速发展。

磁性纳米粒子是近年来发展起来的一种新型纳米材料，由于磁性纳米粒子具有特殊的磁导向性、超顺磁性、易清洗、易分离，以及表面可连接生化活性功能基团等特性，使其在核酸分析、临床诊断、靶向药物、细胞分离和酶固定化等领域的应用得到了广泛的发展。磁性纳米粒子的这些特性可以显著地提高生物传感器检测的灵敏度，缩短生化反应时间，提高检测通量，为生物传感器领域的应用开辟了广阔的前景。杂交链式反应（hybridization chain reaction）是一种仅依靠一对交叉互补的寡核苷酸发夹探针便可对目标核酸进行放大检测的方法，且不依赖蛋白酶。

本发明利用磁性纳米粒子和杂交链式反应作为信号放大技术，基于Ag⁺能特异性识别胞嘧啶（C）-胞嘧啶（C）错配并形成稳定的C-Ag⁺-C 结构，再用电化学手段作为检测方法，实现对痕量重金属Ag⁺高灵敏度、高选择性的检测。为了增加分析速率和稳定性，磁纳米粒子表面发生杂交链式反应形成的长链DNA复合物采用磁性金电极吸附固定，该方法具有简单、快速、灵敏度高等优点。

发明内容

本发明的目的之一是设计不同序列的DNA，构建一种快速、灵敏的电化学传感器。

本发明的目的之二是提供一种基于磁性纳米粒子和杂交链式反应放大技术联用构建电化学传感器的制备方法。

本发明的目的之三是将构建的电化学传感器用于重金属离子的高灵敏、快速检测。

本发明的技术方案如下：

1. 一种基于磁性纳米粒子和杂交链式反应放大技术联用构建重金属离子电化学传感器

首先制备Fe₃O₄@Au核-壳磁性纳米粒子，将富含C碱基的核酸链S1通过Au-S键固定到磁性纳米粒子表面，在目标物银离子Ag⁺存在下，二茂铁标记的另一条富含C碱基的核酸链S2通过C-Ag⁺-C结构在磁性粒子表面与S1形成双链DNA。当加入二茂铁标记的发夹结构DNA H1和H2后，在S2的诱导作用下H1和H2在磁性纳米粒子表面发生交杂链式反应，形成的长链DNA复合物通过磁性富集在磁性金电极表面实现电化学响应信号的放大。根据电化学信号的增强实现对标准溶液或样品溶液中Ag⁺浓度的定量测定。

2. 一种基于磁性纳米粒子和杂交链式反应放大技术联用构建重金属离子电化学传感器的制备方法

（1）Fe₃O₄@Au核-壳磁性纳米粒子的制备

首先采用共沉淀法制备Fe₃O₄，将FeCl₂、FeCl₃和浓HCl溶于水中，超声脱氧。将上述溶液滴加到NaOH溶液中，80℃搅拌下通N₂气保护，得到Fe₃O₄磁性纳米粒子。在Fe₃O₄/乙醇溶液中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，对Fe₃O₄粒子表面进行氨基化。在上述溶液中加入HAuCl₄水溶液，以柠檬酸钠为还原剂，得到Fe₃O₄@Au核-壳磁性纳米粒子。

（2）双链DNA标记Fe₃O₄@Au粒子的制备

将步骤（1）得到的Fe₃O₄@Au磁性纳米粒子与活化的富含C碱基的核酸链S1在25℃下反应12 h，孵化，磁分离，得到S1标记的Fe₃O₄@Au粒子。通过琥珀酰亚胺耦联（EDC-NHS）方法对富含C碱基的核酸链S2的NH₂基端标记二茂铁。然后在Ag⁺存在下，加入核酸链S2，S2通过C-Ag⁺-C结构与Fe₃O₄@Au粒子表面的S1杂交形成双链DNA，得到双链DNA标记的Fe₃O₄@Au磁性纳米粒子。

（3）Fe₃O₄@Au偶联HCR反应

在步骤（2）得到的双链DNA标记的Fe₃O₄@Au PBS缓冲液中加入二茂铁标记的发夹结构DNA H1和H2，37℃下进行杂交，反应2 h后得到长链DNA复合物。

（4）Ag⁺电化学传感器的制备

将工作电极磁性金电极在piranha溶液中浸泡1 h，超纯水清洗。然后分别用0.3um和0.05um的Al₂O₃抛光粉打磨，依次在超纯水、无水乙醇、超纯水中超声清洗。最后在0.5 MH₂SO₄溶液中，以50 mV/s的扫速在-0.2~1.6 V之间进行循环伏安扫描30圈，活化电极。N₂气吹干备用。步骤（3）得到的长链DNA复合物通过磁性富集作用修饰到活化的磁性金电极表面，构建重金属Ag⁺电化学传感器。

3. Ag⁺离子的检测方法

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，修饰的金磁电极为工作电极，在0.1 M pH 7.4的PBS缓冲溶液（包含0.2 MNaCl和0.1 M NaClO₄）中进行测试；

（2）用微分脉冲伏安法（DPV）对重金属离子进行检测，设置扫描电位范围为-0.2~0.6 V，扫描速率为0.1 V/S，扫描完成后记录峰电流的大小，并保存数据；

（3）根据所得DPV峰电流的大小与Ag⁺离子浓度的关系，绘制工作曲线；

（4）采用标准加入法，在水样溶液中加入不同浓度的Ag⁺离子标准溶液，按照工作曲线的绘制方法对不同浓度的Ag⁺离子进行检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益成果

（1）本发明利用磁性纳米粒子和杂交链式反应双重信号放大技术联用构建重金属离子电化学传感器。

（2）本发明将Fe₃O₄@Au核-壳磁性纳米粒子引入到电化学传感器的构建中，利用磁性金电极，从而增加了修饰电极的稳定性。

（3）本发明利用C-Ag⁺-C结构，设计特定序列的DNA，从而增强了电极对重金属离子的选择性，增加了传感器的特异性。

（4）本发明制备的电化学传感器用于重金属Ag⁺离子的检测，具有较高的选择性和抗干扰能力，线性范围宽，检测限低，可用于实际水样中超痕量Ag⁺离子的测定。

附图说明

图1是基于磁性纳米粒子和杂交链式反应放大技术联用检测重金属Ag⁺离子的原理示意图。

图2是Ag⁺的标准曲线，横坐标是Ag⁺的浓度，单位是pM或M，纵坐标是DPV峰电流，单位是uA。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明，但不构成对发明的进一步限制。

实施例1 一种基于磁性纳米粒子和杂交链式反应放大技术联用检测重金属Ag⁺离子的方法

本发明基于磁性纳米粒子和杂交链式反应放大技术联用检测重金属Ag⁺离子的方法原理如图1所示。富含C碱基的核酸链S1通过Au-S键固定到Fe₃O₄@Au核-壳磁性纳米粒子表面，在目标物银离子Ag⁺存在下，二茂铁标记的另一条富含C碱基的核酸链S2通过C-Ag⁺-C结构与磁性粒子表面的S1形成双链DNA。当加入二茂铁标记的发夹结构DNA H1和H2后，在S2的诱导作用下发夹状的H1和H2打开并在磁性纳米粒子表面发生杂交链式反应，形成的长链DNA复合物通过磁性富集在磁性金电极表面实现电化学响应信号的放大。根据电化学信号的增强实现对溶液中Ag⁺浓度的定量测定。

实施例2 寡核苷酸序列设计

本发明所设计的寡核苷酸序列由中国上海Sangon生物工程有限公司合成，并通过HPLC纯化检验，冻干。本发明设计的寡核苷酸序列如下：

S1：5’-SH-CAC TTC TCT CTT CTC TTC CCT CTC-3’；

S2：5’-AGG AGT AGA CTA GAT CGG ACA CAC ACC CAA CAC AAC ACA CAA CTC-NH₂-3’；

H1：5’-TGT CCG ATC TAG TCT ACT CCT ACT GTG AGG AGT AGA CAT GAT-NH₂-3’；

H2：5’-AGG AGT AGA CTA GAT CGG ACA ATC TAG TCT ACT CCT CAC AGT-NH₂-3’；

将寡核苷酸溶解在超纯灭菌水中，-18℃保存备用。

实施例3 Fe₃O₄@Au核-壳磁性纳米粒子的制备

取1 g FeCl₂ 4H₂O、2.6 g FeCl₃6H₂O和0.425 mL浓HCl溶于100 mL水中，超声脱氧。将上述混合液滴加到125 mL 0.75 M NaOH溶液中，N₂保护下80℃搅拌，得到Fe₃O₄磁性纳米粒子。配制5 g/L的Fe₃O₄乙醇溶液25 mL，超声分散，滴加0.4 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温搅拌7 h，稀释至1 g/L，分别加入14 mL 0.6 M HAuCl₄3H₂O和0.3 mL 0.2 M柠檬酸钠溶液，室温下超声处理，溶液颜色由浅黄变为黑色，得到Fe₃O₄@Au核-壳磁性纳米粒子，磁分离并清洗，干燥保存。

实施例4 寡核苷酸S1和 S2杂交双链标记Fe₃O₄@Au核-壳磁性纳米粒子

取1 mL 0.2 uM的S1与1 mg Fe₃O₄@Au粒子在 25℃恒温水浴混合12 h，PBS缓冲液清洗，制得S1标记的Fe₃O₄@Au粒子。取100 uL S1标记的Fe₃O₄@Au、100 uL 1 uM S2和100 uL不同浓度的Ag⁺在37℃恒温水浴中混合4 h，磁分离并缓冲液清洗，重新分散制得S1和S2双链DNA标记的Fe₃O₄@Au核-壳磁性纳米粒子。

实施例5 Fe₃O₄@Au偶联HCR反应

取100uL实施例4制得的双链DNA标记Fe₃O₄@Au核-壳磁性纳米粒子，加入100 uL1uM H1和100uL 1 uM H2，混合，在Fe₃O₄@Au粒子表面发生杂交链式反应，缓冲液清洗，制得长链DNA复合物修饰的Fe₃O₄@Au粒子。

实施例6 电化学传感器制备

将磁性金电极在piranha溶液中浸泡1 h，超纯水清洗。然后分别用0.3um和0.05um的Al₂O₃抛光粉打磨，依次在超纯水、无水乙醇中超声清洗。在0.5 M H₂SO₄溶液中，以50mV/s的扫速在-0.2~1.6 V之间进行循环伏安扫描30圈，活化电极。N₂气吹干备用。将处理后的磁性金电极浸入实施例5制得的长链DNA复合物修饰Fe₃O₄@Au粒子溶液中，利用磁性富集作用将其固定在金磁电极表面，制得Ag⁺电化学传感器。

实施例7 重金属离子的检测

使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，金磁电极为工作电极。采用微分脉冲伏安法测定重金属Ag⁺离子，以0.1 M PBS(pH 7.4, 0.2 M NaCl，0.1 M NaClO₄) 为缓冲液，电位范围为-0.2~0.6 V，电位增幅为4mV，脉冲周期为0.5 s。微分脉冲曲线峰电流与Ag⁺浓度的标准曲线如图2所示，峰电流与Ag⁺浓度在1 fM~100 pM范围内呈现良好的线性关系，相关系数R为0.9970，线性方程为i _pc (uA)= 0.5042lgc (M) + 7.4889，检出限为0.5 fM。本发明提出的传感器相比较其他传感器，具有更宽的线性范围和更低的检出限，采用磁性纳米粒子和杂交链式反应放大技术可实现Ag⁺的超痕量检测。

实施例8 样品测定

将待测样品溶液代替Ag⁺离子标准溶液，采用标准加入法，按照标准曲线方法对样品溶液中的Ag⁺进行测定。测定结果表明，检测结果与加入的Ag⁺标准溶液浓度一致，具有满意的回收率和相对标准偏差，本发明制备的电化学传感器能用于实际样品中Ag⁺的测定。

上面结合附图对本发明实施例进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明基于磁性纳米粒子和杂交链式反应放大技术联用构建重金属离子电化学传感器的制备方法，超痕量重金属离子电化学测定方法及应用的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种基于杂交链式反应信号放大技术检测金属银离子的电化学方法，其特征是将富含C碱基的核酸链S1通过Au-S键固定到金包裹的磁性纳米粒子表面，在目标物银离子（Ag⁺）存在时，二茂铁（Fc）标记的富含C碱基的核酸链S2通过C-Ag⁺-C结构与S1形成双链DNA；当加入二茂铁（Fc）标记的发夹结构DNA H1和H2后，S2作为引发链使得H1和H2的发夹打开并在磁性纳米粒子表面发生杂交链式反应，形成的复合物通过磁性富集在金磁电极表面来实现电化学响应信号的放大；根据电化学信号的增强实现溶液中的Ag⁺浓度的测定，包括以下步骤：

（1）Fe₃O₄@Au核-壳磁性纳米粒子的制备

首先采用共沉淀法在碱性条件下制备Fe₃O₄磁性纳米粒子，通过3-氨丙基三乙氧基硅烷对其表面进行氨基化；之后利用柠檬酸钠还原HAuCl₄×3H₂O水溶液，在Fe₃O₄粒子表面形成金壳，得到Fe₃O₄@Au核-壳磁性纳米粒子；

（2）基于C-Ag⁺-C结构所形成双链DNA标记Fe₃O₄@Au粒子的制备

将Fe₃O₄@Au粒子与活化的富含C碱基的核酸链S1在25℃下反应12 h，磁分离并清洗，得到S1标记的Fe₃O₄@Au；在Ag⁺存在下，加入二茂铁标记的富含C碱基的另一条核酸链S2，S2通过C-Ag⁺-C结构与Fe₃O₄@Au粒子表面的S1杂交形成双链DNA，得到dsDNA标记的Fe₃O₄@Au粒子；

（3）Fe₃O₄@Au偶联HCR反应

在dsDNA标记的Fe₃O₄@Au溶液中，加入二茂铁标记的发夹结构DNA H1和H2后，在S2的诱导作用下，H1和H2的发夹结构打开并在Fe₃O₄@Au磁性粒子表面发生杂交链式反应，形成的DNA长链复合物通过磁性富集固定到金磁电极表面实现电化学响应信号的放大；

（4）分析检测

使用电化学工作站进行电化学响应信号的检测，根据电化学响应信号的强度对标准溶液或样品溶液中Ag⁺浓度进行定量测定。

2.根据权利要求1所述的一种基于杂交链式反应信号放大技术检测金属银离子的电化学方法，其特征在于，所述的电化学方法为微分脉冲伏安法。

3.根据权利要求1所述的一种基于杂交链式反应信号放大技术检测金属银离子的电化学方法，其特征在于，所述的DNA序列如下：

S1：5’-SH-CAC TTC TCT CTT CTC TTC CCT CTC-3’；

S2：5’-AGG AGT AGA CTA GAT CGG ACA CAC ACC CAA CAC AAC ACA CAA CTC-NH₂-3’；

H1：5’-TGT CCG ATC TAG TCT ACT CCT ACT GTG AGG AGT AGA CAT GAT-NH₂-3’；

H2：5’-AGG AGT AGA CTA GAT CGG ACA ATC TAG TCT ACT CCT CAC AGT-NH₂-3’。