CN109540995A - 检测转基因成分dna的方法及其使用的电化学传感器 - Google Patents

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Abstract

一种检测转基因成分DNA的方法及其使用的电化学传感器，该传感机制是基于Fe3O4‑Au@Ag催化的H2O2还原电流的变化，由于形成夹心型DNA复合物，Fe3O4‑Au@Ag修饰的第三条DNA链与目标DNA杂交后被定量引入到电极表面上且与目标DNA的浓度相关。电化学信号主要来源于Fe3O4‑Au@Ag对H2O2的催化作用，应用DPV响应记录电化学信号，其随目标DNA浓度的增加信号增大。在最佳条件下，制备的生物传感器在DNA检测中具有1.0×10‑17至1.0×10‑10M宽线性范围和2.43×10‑18M的低检测限。该方法在对于DNA的检测中显示出了良好的特异性，且具有极高的灵敏度，稳定性好，操作简单方便且成本极低。

Description

检测转基因成分DNA的方法及其使用的电化学传感器
技术领域
本发明属于食品检测及电化学传感器技术领域，具体涉及一种检测转基因成分DNA的方法及其使用的电化学传感器。
背景技术
DNA是遗传信息的载体，具有储存和传递遗传信息的功能。因此当今时代DNA的序列分析尤为重要。DNA检测分析技术可以定性和定量检测特异性DNA和RNA序列片段、可以应用于肿瘤和传染病的检测、食品质量与安全检测、遗传疾病的早期诊断和基因分子识别及重组DNA的筛选。近年来，随着转基因食品的出现，转基因食品的安全问题成为公正担心的问题。转基因食品特定碱基序列的检测成为目前研究热点。因此目前研究出集快速、准确、简便、价廉等优点于一身的DNA检测分析技术是关键所在。DNA生物传感器可以将电化学、光学、分子生物学及微电子学等结合在一起，而且它快速、简单、便捷、无污染、可定性又可定量、灵敏度高、选择性好等优点成为目前DNA检测分析的重要手段。现已广泛应用于法医鉴定、遗传疾病早期诊断及治疗、转基因食品中DNA的检测等。
电化学传感检测方法凭借检测设备简单、使用方便、能耗低、检测快速和易微型化等特点受到研究者广泛的关注，其检测原理主要是利用共价键或化学吸附将寡核酸单链探针 (ssDNA)固定到电极表面，电化学活性分子通过特异性识别目标DNA序列与固定探针序列互补杂交反应后引起电信号的改变，通过监测电流响应信号的改变实现目标物质的定量定性分析。常见的电化学定量检测扫描方式有：循环伏安法(CV)、差分脉冲伏安法(DPV)和交流阻抗测量方法等。
发明内容
本发明目的在于提供一种检测转基因成分DNA的方法及其使用的电化学传感器。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种电化学传感器，包括三电极体系和检测池，该三电极体系包括工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极，所述工作电极为修饰的玻碳电极，该玻碳电极的修饰方法包括下列步骤：
第一步：将多壁碳纳米管复合物修饰到预处理后的玻碳电极表面，干燥后电沉积金纳米粒子，蒸馏水洗涤后得到AuNPs/MWCNTs/GCE电极；
第二步：将捕获DNA溶液修饰到所述AuNPs/MWCNTs/GCE电极表面，在3～5℃条件下自组装过夜，然后用0.1M的PB缓冲溶液淋洗，以除去未结合的捕获DNA，即得到 pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极；
第三步：将pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极在35～39℃下用牛血清白蛋白溶液封闭25～35min，得到BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极；
第四步：将第三步得到的BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极浸入不同浓度的目标DNA溶液，35～38℃温育0.8～1.2h，然后用0.1M的PB缓冲溶液淋洗，随后再将电极浸入Fe3O4-Au@Ag-sDNA溶液，35～38℃温育0.8～1.2h，用0.1M的PB缓冲溶液淋洗，得到不同浓度的目标DNA修饰的Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极；
所述检测池内容纳有电活性指示剂与缓冲液组成的检测底液，所述电活性指示剂为20 mM的过氧化氢溶液，所述缓冲液为pH 7.4的0.1M磷酸盐缓冲溶液；在检测过程中，始终保持检测池中通入氮气；
不同浓度的目标DNA修饰的 Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极作为工作电极、Ag/AgCl 参比电极和铂丝对电极构成三电极体系插入检测池的检测底液中，即为电化学传感器；
用0.1M的TE缓冲溶液将硫醇修饰的捕获DNA和信号DNA分别配制成浓度为1μM的pDNA溶液和sDNA溶液，用0.1M的TE缓冲溶液将捕获DNA和信号DNA的互补序列配制不同浓度的目标DNA溶液。
优选的技术方案为：所述玻碳电极的预处理是指依次用粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm 的Al2O3粉末抛光打磨，使玻碳电极表面至镜面，再用无水乙醇和双蒸水超声清洗后，氮气吹干备用。
优选的技术方案为：捕获DNA可以与目标DNA部分序列杂交，目标DNA剩余部分序列可以和信号DNA杂交。
优选的技术方案为：所述Fe3O4-Au@Ag-sDNA的制备是将200μL的1μM硫醇修饰的信号DNA与1mL浓度为2.5mg/mL的Fe3O4-Au@Ag混合，并在3～5℃下搅拌过夜得到。
优选的技术方案为：所述Fe3O4-Au@Ag的制备方法包括下列步骤：
S1、通过搅拌将六水合三氯化铁溶于乙二醇中，随后加入聚乙二醇并搅拌0.8～1.2h以形成澄清溶液，然后加入醋酸钠，磁力搅拌0.4～0.6h得到混合溶液，接着将混合溶液转移到具有特氟隆衬里的不锈钢高压釜中，在190～210℃保持9～11h，将获得的黑色产物用磁铁收集，用去离子水和乙醇分别洗涤数次，干燥后即得Fe3O4颗粒；
S2、在超声条件下将聚醚酰亚胺分散于去离子水中得到聚醚酰亚胺溶液，随后，在超声超声下将Fe3O4颗粒分散在聚醚酰亚胺溶液中，反应后将产物用磁力分离并用去离子水漂洗，得Fe3O4@PEI磁性纳米粒子；
S3、将四氯金酸三水合物在搅拌下加入到蒸馏水中，加热至煮沸，然后后加入柠檬酸钠水溶液，接着加入含有硼氢化钠的柠檬酸钠溶液，将该溶液继续煮沸4～6min，得到直径3nm 的AuNPs溶液；
S4、用去离子水稀释AuNPs溶液，加热至沸腾，然后在搅拌条件下，将4柠檬酸钠溶液和硝酸银溶液依次加入到溶液中，继续沸腾40～50min，直至得到直径5nm的Au@AgNPs 胶体溶液；
S5、将Fe3O4@PEI磁性纳米粒子与直径5nm的Au@AgNPs胶体溶液混合并超声处理以生成Fe3O4-Au@Ag磁性纳米粒子，将Fe3O4-Au@Ag磁性纳米粒子与过量的Au@AgNPs 胶体溶液磁性分离，并用去离子水冲洗，得到Fe3O4-Au@Ag磁性纳米粒子。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种检测转基因成分DNA的方法，包括下列步骤：
第一步：将Ag/AgCl参比电极、铂丝对电极和不同浓度的目标DNA修饰的 Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极构成的三电极体系浸入到含有20mM H2O2溶液的5.0mL的0.1M PB缓冲溶液中，通入氮气4～6min后采用差分脉冲伏安法进行电化学检测，得到不同浓度的目标DNA修饰的 Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极催化H2O2的DPV信号响应，以差分脉冲伏安法测得的峰电流作为纵坐标，目标DNA浓度的常用对数值为横坐标，绘制得到目标DNA的标准曲线；
第二步：使用Trizol试剂提取待检测样品中转基因成分总RNA，然后用逆转录方法获得 DNA；
第三步：将样品中获得的DNA作为目标DNA，采用权利要求2所述的方法修饰到电极上，以得到的Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极作为工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成三电极体插入到预先准备好的检测底液中，通入氮气5min后利用DPV进行电化学检测。
附图说明
图1：本发明电化学传感器的组装以及对DNA的检测示意图。
图2：本发明电化学传感器检测DNA其DPV响应电流与浓度的关系曲线。
图3：DPV峰值电流响应(a)空白对照，(b)阴性实际样品的PCR产物，(c)初始提取总DNA和(d)阳性实际样品的PCR产物。插图：标记的凝胶电泳(泳道1)，阳性实际样品(泳道2)，阴性实际样品(泳道3)和空白对照(泳道4)的PCR产物。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明的电化学传感器、制备方法及其在快速检测食品中转基因成分DNA(花椰菜花叶病毒35S启动子，CaMV35S)的应用。通过对DNA修饰电极与检测底液中的过氧化氢之间反应后产生DPV响应电流，电流信号与目标DNA浓度的对数值成线性比例关系，进一步得到目标DNA浓度的检测限，提供一种灵敏度高、特异性好、操作方法简便的检测方法。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
参见图1-3所示，须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
本发明提供一种快速、简便、价廉的检测DNA的生物传感器，实现对目标DNA的快速检测。该传感机制是基于Fe3O4-Au@Ag催化的H2O2还原电流的变化，由于形成夹心型DNA 复合物，Fe3O4-Au@Ag修饰的第三条DNA链与目标DNA杂交后被定量引入到电极表面上且与目标DNA的浓度相关。电化学信号主要来源于Fe3O4-Au@Ag对H2O2的催化作用，应用DPV响应记录电化学信号，其随目标DNA浓度的增加信号增大。以20mM H2O2为电化学活性指示剂，pH7.4，0.1M磷酸盐缓冲溶液为底液，该方法对DNA的线性检测范围为 1.0×10-17～1.0×10-10M，检测限低至2.43×10-18M。可以实现对DNA快速、简便、准确的定量检测。由图2可见，DNA浓度在1.0×10-17～1.0×10-10M之间时，峰电流I值随DNA浓度的增大而增大，且I值与log(CDNA)之间的关系满足线性关系方程：I(μA)＝21.51+0.93log(CDNA)，线性相关系数R＝0.9970。线性检测范围为1.0×10-17～1.0×10-10M，最低检测限为2.43×10-18M。
实施例1：一种检测转基因成分DNA的方法及其使用的电化学传感器
样品来自转基因拟南芥植物，提取转基因拟南芥植物中的DNA靶序列。通过使用Trizol 试剂(Invitrogen)提取的总RNA应用逆转录方法获得目标DNA。RNA提取：取1g左右的拟南芥植物新鲜的幼嫩组织，加液氯研磨充分呈粉末状，及时转移到10mL离心管中，加入1mL Trizol。裂解后的样品室温放置，使核蛋白和核酸完全分离。加入200μL氯仿震荡15s，室温孵育5min。4℃，13000rpm离心15min，样品分成水样层和有机层。将上清液转移至干净的离心管中，加入500μL异丙醇，混匀之后室温孵育10min，再温度4℃，13000rpm 离心15min收集RNA。去掉上清液，室温干燥10min。加入40μL RNA-Free DDH2O,65℃下水浴溶解，将所得的RNA在-80℃保存。RT-PCR合成cDNA：在冰上依次加入1μL digo dT，0.1μg总的RNA，加DEPC处理液至12μL，离心混合后，70℃金属浴5min；将上述 PCR管放于冰上，加入以下成分：5μL反应buffer，10mM dNTP，1μL RI，1μL RT，混匀，分别于金属浴中42℃反应6min，70℃反应5min，将反转录的cDNA置于-20℃保存。
在含有1μL cDNA，0.4μL 10μM上下游引物，0.2μL Premix Taq和15.5μL水的终体积 20μL溶液中进行PCR。首先在94℃预变性5min，按以下条件进行40个循环：94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸40s，40个循环结束后，在72℃延伸5min。PCR反应结束后，将反应管取出，直接进行凝胶电泳。通过在1％琼脂糖凝胶中运行10μL PCR混合物 30min并在紫外光下观察来鉴定PCR产物。PCR产物通过在水浴中100℃加热7min变性，立即在冰中冷却5min以获得变性的ssDNA用于下一步检测。
将样品中提取的DNA通过杂交修饰到电极上，以修饰的 Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极作为工作电极、Ag/AgCl 参比电极和铂丝对电极构成三电极体插入到预先准备好的检测底液中，通入氮气5min后利用DPV进行电化学检测。初始电位为-0.2V，终止电位为-1.0V，出峰位置约在-0.5V。通过峰电流和已经得到标准曲线计算样品中的DNA含量。DNA为1.8×10-13M。
实施例2：一种检测转基因成分DNA的方法及其使用的电化学传感器
样品来自转基因大豆植物，提取转基因大豆植物中的DNA靶序列。通过使用Trizol试剂 (Invitrogen)提取的总RNA应用逆转录方法获得目标DNA。RNA提取：取1g左右的大豆新鲜的幼嫩组织，加液氯研磨充分呈粉末状，及时转移到10mL离心管中，加入1mL Trizol。裂解后的样品室温放置，使核蛋白和核酸完全分离。加入200μL氯仿震荡15s，室温孵育5min。4℃，13000rpm离心15min，样品分成水样层和有机层。将上清液转移至干净的离心管中，加入500μL异丙醇，混匀之后室温孵育10min，再温度4℃，13000rpm离心15min 收集RNA。去掉上清液，室温干燥10min。加入40μL RNA-Free DDH2O,65℃下水浴溶解，将所得的RNA在-80℃保存。RT-PCR合成cDNA：在冰上依次加入1μL digo dT，0.1μg 总的RNA，加DEPC处理液至12μL，离心混合后，70℃金属浴5min；将上述PCR管放于冰上，加入以下成分：5μL反应buffer，10mM dNTP，1μL RI，1μL RT，混匀，分别于金属浴中42℃反应6min，70℃反应5min，将反转录的cDNA置于-20℃保存。
在含有1μL cDNA，0.4μL 10μM上下游引物，0.2μL Premix Taq和15.5μL水的终体积 20μL溶液中进行PCR。首先在94℃预变性5min，按以下条件进行40个循环：94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸40s，40个循环结束后，在72℃延伸5min。PCR反应结束后，将反应管取出，直接进行凝胶电泳。通过在1％琼脂糖凝胶中运行10μL PCR混合物 30min并在紫外光下观察来鉴定PCR产物。PCR产物通过在水浴中100℃加热7min变性，立即在冰中冷却5min以获得变性的ssDNA用于下一步检测。
将样品中提取的DNA通过杂交修饰到电极上，以修饰的 Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极作为工作电极、Ag/AgCl 参比电极和铂丝对电极构成三电极体插入到预先准备好的检测底液中，通入氮气5min后利用DPV进行电化学检测。初始电位为-0.2V，终止电位为-1.0V，出峰位置约在-0.5V。通过峰电流和已经得到标准曲线计算样品中的DNA含量。DNA为1.2×10-15M。
实施例3：一种检测转基因成分DNA的方法及其使用的电化学传感器
样品来自转基因玉米植物，提取转基因玉米植物中的DNA靶序列。通过使用Trizol试剂 (Invitrogen)提取的总RNA应用逆转录方法获得目标DNA。RNA提取：取1g左右的玉米新鲜的幼嫩组织，加液氯研磨充分呈粉末状，及时转移到10mL离心管中，加入1mL Trizol。裂解后的样品室温放置，使核蛋白和核酸完全分离。加入200μL氯仿震荡15s，室温孵育5min。4℃，13000rpm离心15min，样品分成水样层和有机层。将上清液转移至干净的离心管中，加入500μL异丙醇，混匀之后室温孵育10min，再温度4℃，13000rpm离心15min 收集RNA。去掉上清液，室温干燥10min。加入40μL RNA-Free DDH2O,65℃下水浴溶解，将所得的RNA在-80℃保存。RT-PCR合成cDNA：在冰上依次加入1μL digo dT，0.1μg 总的RNA，加DEPC处理液至12μL，离心混合后，70℃金属浴5min，将上述PCR管放于冰上，加入以下成分：5μL反应buffer，10mM dNTP，1μL RI，1μL RT，混匀，分别于金属浴中42℃反应6min，70℃反应5min；将反转录的cDNA置于-20℃保存。
在含有1μL cDNA，0.4μL 10μM上下游引物，0.2μL Premix Taq和15.5μL水的终体积 20μL溶液中进行PCR。首先在94℃预变性5min，按以下条件进行40个循环：94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸40s，40个循环结束后，在72℃延伸5min。PCR反应结束后，将反应管取出，直接进行凝胶电泳。通过在1％琼脂糖凝胶中运行10μL PCR混合物 30min并在紫外光下观察来鉴定PCR产物。PCR产物通过在水浴中100℃加热7min变性，立即在冰中冷却5min以获得变性的ssDNA用于下一步检测。
将样品中提取的DNA通过杂交修饰到电极上，以修饰的 Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极作为工作电极、Ag/AgCl 参比电极和铂丝对电极构成三电极体插入到预先准备好的检测底液中，通入氮气5min后利用DPV进行电化学检测。初始电位为-0.2V，终止电位为-1.0V，出峰位置约在-0.5V。通过峰电流和已经得到标准曲线计算样品中的DNA含量。
实施例4：一种检测转基因成分DNA的方法及其使用的电化学传感器
一种电化学传感器，包括三电极体系和检测池，所述三电极体系包括工作电极、Ag/AgCl 参比电极和铂丝对电极，所述工作电极为修饰的玻碳电极；所述检测池内装有电活性指示剂与缓冲液组成的检测底液。
所述电活性指示剂为20mM的过氧化氢溶液，所述的缓冲液为0.1M、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液。
检测时始终保持检测液中通入氮气。
所用的检测方法为示差脉冲伏安法(differential pulse voltammetry,DPV)
该传感机制是基于四氧化三铁-金@银(Fe3O4-Au@Ag)催化的H2O2还原电流的变化，由于形成夹心型DNA复合物，Fe3O4-Au@Ag修饰的第三条DNA链与目标DNA杂交后被定量引入到电极表面上且与目标DNA的浓度相关。电化学信号主要来源于Fe3O4-Au@Ag对过氧化氢(H2O2)的催化作用，应用DPV电流响应记录电化学信号，其随目标DNA浓度的增加而增大。
一种电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)用0.1M TE缓冲溶液将硫醇修饰的捕获DNA(pDNA)和信号DNA(sDNA)分别配制成浓度为1μM的pDNA和sDNA溶液，用0.1M TE缓冲溶液将pDNA和sDNA的互补序列配制不同浓度的目标DNA(tDNA)溶液；捕获探针:5'-SH-TCT CTC ATA A-3'；目标DNA: 5'-GCATGACGTTATTTATGAGAGA-3'；信号探针：5'-ATAACG TCA TGC-SH-3'；
(2)修饰玻碳电极的制备：
取5.0μL浓度为1mg/mL多壁碳纳米管(MWCNTs)复合物准确修饰到预处理后的玻碳电极表面，室温干燥。然后在电极上电沉积金纳米粒子(AuNPs)，完毕后用蒸馏水洗涤，观察在电极表面形成一层致密的金纳米粒子膜。即得到修饰电极AuNPs/MWCNTs/GCE；
取5.0μL步骤(1)配制的1μM的捕获DNA溶液修饰到AuNPs/MWCNTs/GCE电极表面，在4℃自组装过夜，用0.1M的PB缓冲溶液充分淋洗，以除去未结合的pDNA，即得到修饰的电极pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE；
然后将修饰电极在37℃下用10μL 1％BSA封闭30min以防止非特异性吸附；再将所得电极BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE浸入20μL步骤(1)配制的不同浓度的tDNA溶液， 37℃温育1h，用0.1M的PB缓冲溶液充分淋洗，随后再将修饰电极浸入20μL的 Fe3O4-Au@Ag-sDNA溶液，37℃温育1h，用0.1M的PB缓冲溶液充分淋洗，以除去未杂交的DNA，最终得到我们所要制备的电极 Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE。
(3)检测底液的制备：取含有20mM的过氧化氢溶液的5.0mL的0.1M PB缓冲溶液(pH 7.4)加入到检测池中，混合均匀即得到检测底液；
(4)将步骤(2)得到的Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs修饰的GCE电极作为工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成三电极体系插入步骤(3) 制备的检测底液中，即为电化学传感器。
在步骤(2)之前还包括电极预处理，即分别用1.0，0.3和0.05μm的Al2O3粉末抛光打磨至镜面，再用无水乙醇和双蒸水超声清洗后N2吹干备用。
步骤(1)中0.1M PB采用0.1M的K2HPO4溶液和0.1M的KH2PO4溶液混合后调节pH 至7.4得到。
步骤(1)中0.1M TE缓冲溶液的配制方法是用电子天平准确称取0.242g的三(羟甲基) 氨基甲烷(Tris)固体，溶于50mL蒸馏水中，得到0.02M的Tris溶液，然后加入29.2mL 浓度为0.02M的盐酸(HCl)溶液，之后加入蒸馏水稀释至100mL，得到浓度为10mM，pH 为8.0的Tris-HCl缓冲溶液，最后用电子天平称取0.0143g的乙二胺四乙酸加入其中，配制得到TE缓冲溶液。
步骤(2)中1mg/mL多壁碳纳米管溶液的配制方法为称取2mg多壁碳纳米管固体样品，分散在2mL 0.2wt％的壳聚糖溶液中，超声分散即得1mg/mL多壁碳纳米管溶液。
步骤(2)中在电极上电沉积AuNPs的制备是将电极浸入在含有0.1M硝酸钾的0.1wt％氯金酸(HAuCl4)溶液中进行电沉积，电势为-0.2V，沉积时间50s。
步骤(2)中模拟酶Fe3O4-Au@Ag的制备，包括以下步骤：
(1)Fe3O4磁性纳米球的制备：首先，通过搅拌将六水合三氯化铁(1.35g，5mM)溶于40mL乙二醇中，随后加入1.0g聚乙二醇并搅拌1h以形成澄清溶液，然后加入醋酸钠(3.6 g，44mM)磁力搅拌0.5h。将混合溶液转移到50mL特氟隆衬里的不锈钢高压釜中在200℃保持10h。最后，将被称为Fe3O4的黑色产物用磁铁收集，用去离子水和乙醇洗涤数次，接着在60℃下干燥6h；
(2)四氧化三铁@聚乙烯亚胺(Fe3O4@PEI)磁性纳米粒子的制备：首先，在超声条件下将0.4g PEI溶于50mL去离子水中15min。随后，在超声下将0.2g制备的Fe3O4颗粒分散在PEI溶液中1h，在此期间PEI逐渐自组装在Fe3O4上。最后，将Fe3O4@PEI用磁力分离并用去离子水漂洗五次；
(3)AuNPs的制备：将1mL 1％的四氯金酸三水合物(HAuCl4·3H2O)在剧烈搅拌下加入到100mL蒸馏水中，加热至煮沸，1min后加入1mL1％的柠檬酸钠水溶液，再过1min 后，加入1mL含有0.075％硼氢化钠的1％柠檬酸钠溶液，将该溶液继续煮沸5min，得到直径3nm的AuNPs，然后在4℃下储存备用；
(4)Au@Ag NPs的制备：用400mL去离子水稀释100mL AuNPs(3nm)溶液，重新加热至沸腾。然后，在剧烈搅拌下，将4mL1％柠檬酸钠溶液和1mL 10mM硝酸银溶液依次加入到溶液中，继续沸腾45min，直至得到直径5nm的Au@Ag NPs溶液；
(5)Fe3O4-Au@Ag NPs的制备：将上述制备好的Fe3O4@PEI磁性纳米粒子与直径5nm的Au@Ag胶体溶液混合并超声1h以形成Fe3O4-Au@Ag磁性纳米粒子溶液。随后，将磁性的Fe3O4-Au@Ag纳米粒子与过量的Au@Ag胶体溶液磁性分离，并用去离子水冲洗三次。最后将产品在60℃下真空干燥5h以供将来使用。
制备方法，步骤(2)中Fe3O4-Au@Ag-sDNA复合物是将200μL的1μM硫醇修饰的sDNA与1mL所制备的浓度为2.5mg/mL的Fe3O4-Au@Ag混合，并在4℃下轻轻搅拌过夜得到的。
检测包括以下步骤：
(1)不同浓度的目标DNA对过氧化氢的响应实验：将不同浓度的目标DNA修饰的Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极作为工作电极、Ag/AgCl 参比电极和铂丝对电极构成三电极体系，浸入到含有20mM H2O2溶液的5.0mL的0.1M PB 缓冲溶液(pH 7.4)中，通入氮气5min后利用DPV进行电化学检测，得到不同浓度的目标 DNA修饰的电极催化H2O2的DPV信号响应；
(2)目标DNA标准曲线的建立：以DPV峰电流作为纵坐标，目标DNA浓度的常用对数值为横坐标，绘制得到目标DNA的标准曲线。
本发明公开了一种电化学传感器，包括三电极体系和检测池，所述三电极体系包括工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极，所述工作电极为修饰的玻碳电极；所述检测池内装有电活性指示剂与缓冲液组成的检测底液。
(1)电极预处理：分别用1.0，0.3和0.05μm的Al2O3粉末抛光打磨至镜面，再用无水乙醇和双蒸水超声清洗后N2吹干备用。
(2)PBS缓冲液的制备：称取一定量的K2HPO4和KH2PO4分别配置成0.1M的溶液，混合两种溶液并调节pH至7.4，储藏备用。
(3)检测底液的制备：取含有20mM的过氧化氢溶液的5.0mL的0.1M PB缓冲溶液(pH 7.4)加入到检测池中，混合均匀。
(4)样品的处理：通过使用Trizol试剂(Invitrogen)提取的食品中转基因成分总RNA 应用逆转录方法获得目标DNA(CaMV35S)。RNA提取：取样品加液氯研磨充分呈粉末状，及时转移到10mL离心管中，加入1mL Trizol。裂解后的样品室温放置，使核蛋白和核酸完全分离。加入200μL氯仿震荡15s，室温孵育5min。4℃，13000rpm离心15min，样品分成水样层和有机层。将上清液转移至干净的离心管中，加入500μL异丙醇，混匀之后室温孵育10min，再温度4℃，13000rpm离心15min收集RNA。去掉上清液，室温干燥10min。加入40μLRNA-FreeDDH2O,65℃下水浴溶解，将所得的RNA在-80℃保存。RT-PCR合成 cDNA：在冰上依次加入1μLdigo dT，0.1μg总的RNA，加DEPC处理液至12μL，离心混合后，70℃金属浴5min；将上述PCR管放于冰上，加入以下成分：5μL反应buffer，10mM dNTP，1μL RI，1μL RT，混匀，分别于金属浴中42℃反应6min，70℃反应5min，将反转录的cDNA置于-20℃保存。
在含有1μL cDNA，0.4μL 10μM上下游引物，0.2μLPremix Taq和15.5μL水的终体积20μL溶液中进行PCR。首先在94℃预变性5min，按以下条件进行40个循环：94℃变性 30s，51℃退火30s，72℃延伸40s，40个循环结束后，在72℃延伸5min。PCR反应结束后，将反应管取出，直接进行凝胶电泳。通过在1％琼脂糖凝胶中运行10μL PCR混合物30min 并在紫外光下观察来鉴定PCR产物。PCR产物通过在水浴中100℃加热7min变性，立即在冰中冷却5min以获得变性的ssDNA用于下一步检测。
(5)样品检测：将样品中提取的DNA通过杂交修饰到电极上，以修饰的 Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极作为工作电极、Ag/AgCl 参比电极和铂丝对电极构成三电极体插入到预先准备好的检测底液中，通入氮气5min后利用DPV进行电化学检测。初始电位为-0.2V，终止电位为-1.0V，出峰位置约在-0.5V。通过峰电流和已经得到标准曲线计算样品中的DNA含量，本实施例具体含量为1.3×10-12M。
将所提出的DNA生物传感器与一系列不同浓度的目标DNA进行电化学检测。测定其DPV电流值，发现电流值与目标基因浓度的对数之间存在良好线性关系，线性回归方程为：I(μA)＝21.51+0.93log(CDNA)，将未知浓度的待测样品DNA进行电化学检测，可以得到这一待测样品DNA的DPV电流值，代入线性方程中，计算出该待测样品的浓度是多少。
本实施例中，为了评估我们所构造的DNA生物传感器对实际样品检测的可行性，我们选择转基因番茄作为实际样品，先对转基因番茄总的DNA进行提取，然后对转基因番茄的CaMV35S基因的特定序列(442bp)进行PCR扩增反应，其PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测显示如下图3插图所示，当使用基因组DNA作为模板时，可以观察到在泳道2位于250bp 到500bp之间存在一明显的条带。然而，当使用阴性样品(泳道3)和空白样品(泳道4) 时，在电泳图像中并没有观察到明显的迁移带。电泳结果表明，模板成功扩增了CaMV35S 基因长度为442bp片段的PCR产物。将不同的PCR扩增产物在100℃水浴中加热，然后用冰冷却以获得ssDNA序列。如下图3所示，用所构建的生物传感器对不同的PCR扩增产物的 ssDNA序列进行电化学分析，可以观察到阴性样品的DPV峰值电流(曲线b)几乎与空白(曲线a)相同，这表明阴性PCR扩增产物中没有CaMV35S基因片段，这与琼脂糖凝胶电泳分析结果一致。此外，当检测初始总提取DNA时(曲线c)，与空白对照相比发现DPV响应明显增加，将得到的电流值代入标准曲线计算，得出总DNA的初始提取浓度约为52.14 aM。然而，当使用CaMV35S基因序列作为模板时，PCR产物的DPV响应(曲线d)比初始总提取DNA的DPV响应更高(曲线c)，并且计算得出实际样品PCR扩增产物的DNA浓度约为93.32pM。因此，这种电化学DNA生物传感器可以有效地用于检测实际样品中的 CaMV35S，在转基因的食品检测中具有潜在的应用价值。
实施例5：一种检测转基因成分DNA的方法及其使用的电化学传感器
一种电化学传感器，包括三电极体系和检测池，该三电极体系包括工作电极、Ag/AgCl 参比电极和铂丝对电极，所述工作电极为修饰的玻碳电极，该玻碳电极的修饰方法包括下列步骤：
第一步：将多壁碳纳米管复合物修饰到预处理后的玻碳电极表面，干燥后电沉积金纳米粒子，蒸馏水洗涤后得到AuNPs/MWCNTs/GCE电极；
第二步：将捕获DNA溶液修饰到所述AuNPs/MWCNTs/GCE电极表面，在4℃条件下自组装过夜，然后用0.1M的PB缓冲溶液淋洗，以除去未结合的捕获DNA，即得到 pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极；
第三步：将pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极在37℃下用牛血清白蛋白溶液封闭30min，得到BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极；
第四步：将第三步得到的BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极浸入不同浓度的目标DNA溶液，36℃温育1h，然后用0.1M的PB缓冲溶液淋洗，随后再将电极浸入Fe3O4-Au@Ag-sDNA溶液，36℃温育1h，用0.1M的PB缓冲溶液淋洗，得到不同浓度的目标DNA修饰的Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极；
所述检测池内容纳有电活性指示剂与缓冲液组成的检测底液，所述电活性指示剂为20 mM的过氧化氢溶液，所述缓冲液为pH 7.4的0.1M磷酸盐缓冲溶液；在检测过程中，始终保持检测池中通入氮气；
不同浓度的目标DNA修饰的 Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极作为工作电极、Ag/AgCl 参比电极和铂丝对电极构成三电极体系插入检测池的检测底液中，即为电化学传感器；
用0.1M的TE缓冲溶液将硫醇修饰的捕获DNA和信号DNA分别配制成浓度为1μM的pDNA溶液和sDNA溶液，用0.1M的TE缓冲溶液将捕获DNA和信号DNA的互补序列配制不同浓度的目标DNA溶液。
所述玻碳电极的预处理是指依次用粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光打磨，使玻碳电极表面至镜面，再用无水乙醇和双蒸水超声清洗后，氮气吹干备用。捕获DNA可以与目标DNA部分序列杂交，目标DNA剩余部分序列可以和信号DNA杂交。捕获探针:5'-SH-CAT CGT TGA A-3'。目标DNA:5'-GGC AGA GGC ATC TTC AAC GAT G-3'。信号探针：5'-GAT GCCTCT GCC-SH-3'。
所述Fe3O4-Au@Ag-sDNA的制备是将200μL的1μM硫醇修饰的信号DNA与1mL浓度为2.5mg/mL的Fe3O4-Au@Ag混合，并在4℃下搅拌过夜得到。
5所述Fe3O4-Au@Ag的制备方法包括下列步骤：
S1、通过搅拌将六水合三氯化铁溶于乙二醇中，随后加入聚乙二醇并搅拌1h以形成澄清溶液，然后加入醋酸钠，磁力搅拌0.5h得到混合溶液，接着将混合溶液转移到具有特氟隆衬里的不锈钢高压釜中，在200℃保持10h，将获得的黑色产物用磁铁收集，用去离子水和乙醇分别洗涤数次，干燥后即得Fe3O4颗粒；
S2、在超声条件下将聚醚酰亚胺分散于去离子水中得到聚醚酰亚胺溶液，随后，在超声超声下将Fe3O4颗粒分散在聚醚酰亚胺溶液中，反应后将产物用磁力分离并用去离子水漂洗，得Fe3O4@PEI磁性纳米粒子；
S3、将四氯金酸三水合物在搅拌下加入到蒸馏水中，加热至煮沸，然后后加入柠檬酸钠水溶液，接着加入含有硼氢化钠的柠檬酸钠溶液，将该溶液继续煮沸5min，得到直径3nm 的AuNPs溶液；
S4、用去离子水稀释AuNPs溶液，加热至沸腾，然后在搅拌条件下，将4柠檬酸钠溶液和硝酸银溶液依次加入到溶液中，继续沸腾45min，直至得到直径5nm的Au@AgNPs胶体溶液；
S5、将Fe3O4@PEI磁性纳米粒子与直径5nm的Au@AgNPs胶体溶液混合并超声处理以生成Fe3O4-Au@Ag磁性纳米粒子，将Fe3O4-Au@Ag磁性纳米粒子与过量的Au@AgNPs 胶体溶液磁性分离，并用去离子水冲洗，得到Fe3O4-Au@Ag磁性纳米粒子。
检测转基因成分DNA的方法，包括下列步骤：
第一步：将Ag/AgCl参比电极、铂丝对电极和不同浓度的目标DNA修饰的 Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极构成的三电极体系浸入到含有20mM H2O2溶液的5.0mL的0.1M PB缓冲溶液中，通入氮气4～6min后采用差分脉冲伏安法进行电化学检测，得到不同浓度的目标DNA修饰的 Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极催化H2O2的DPV信号响应，以差分脉冲伏安法测得的峰电流作为纵坐标，目标DNA浓度的常用对数值为横坐标，绘制得到目标DNA的标准曲线；
第二步：使用Trizol试剂提取待检测样品中转基因成分总RNA，然后用逆转录方法获得 DNA；
第三步：将样品中获得的DNA作为目标DNA，采用权利要求2所述的方法修饰到电极上，以得到的Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极作为工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成三电极体插入到预先准备好的检测底液中，通入氮气5min后利用DPV进行电化学检测。
实施例6：一种检测转基因成分DNA的方法及其使用的电化学传感器
一种电化学传感器，包括三电极体系和检测池，该三电极体系包括工作电极、Ag/AgCl 参比电极和铂丝对电极，所述工作电极为修饰的玻碳电极，该玻碳电极的修饰方法包括下列步骤：
第一步：将多壁碳纳米管复合物修饰到预处理后的玻碳电极表面，干燥后电沉积金纳米粒子，蒸馏水洗涤后得到AuNPs/MWCNTs/GCE电极；
第二步：将捕获DNA溶液修饰到所述AuNPs/MWCNTs/GCE电极表面，在3℃条件下自组装过夜，然后用0.1M的PB缓冲溶液淋洗，以除去未结合的捕获DNA，即得到 pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极；
第三步：将pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极在35℃下用牛血清白蛋白溶液封闭25min，得到BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极；
第四步：将第三步得到的BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极浸入不同浓度的目标DNA溶液，35℃温育0.8h，然后用0.1M的PB缓冲溶液淋洗，随后再将电极浸入 Fe3O4-Au@Ag-sDNA溶液，35℃温育0.8h，用0.1M的PB缓冲溶液淋洗，得到不同浓度的目标DNA修饰的Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极；
所述检测池内容纳有电活性指示剂与缓冲液组成的检测底液，所述电活性指示剂为20 mM的过氧化氢溶液，所述缓冲液为pH 7.4的0.1M磷酸盐缓冲溶液；在检测过程中，始终保持检测池中通入氮气；
不同浓度的目标DNA修饰的 Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极作为工作电极、Ag/AgCl 参比电极和铂丝对电极构成三电极体系插入检测池的检测底液中，即为电化学传感器；
用0.1M的TE缓冲溶液将硫醇修饰的捕获DNA和信号DNA分别配制成浓度为1μM的pDNA溶液和sDNA溶液，用0.1M的TE缓冲溶液将捕获DNA和信号DNA的互补序列配制不同浓度的目标DNA溶液。
所述玻碳电极的预处理是指依次用粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光打磨，使玻碳电极表面至镜面，再用无水乙醇和双蒸水超声清洗后，氮气吹干备用。
捕获DNA是固定在电极上的DNA，它可以与目标DNA部分序列杂交，目标DNA剩余部分序列可以和信号DNA杂交，形成夹心型复合物，本发明中的信号DNA是用 Fe3O4-Au@Ag纳米粒子修饰的DNA，信号DNA可以催化检测溶液中的H2O2产生电化学信号。捕获探针:5'-SH-AGAGGC ATCT-3'；目标DNA:5'-GGC CAT CGT TGA AGA TGC CTC T-3'；信号探针：5'-TCAACGATG GCC-SH-3'。
(1)所述Fe3O4-Au@Ag-sDNA的制备是将200μL的1μM硫醇修饰的信号DNA与1mL 浓度为2.5mg/mL的Fe3O4-Au@Ag混合，并在3℃下搅拌过夜得到。
所述Fe3O4-Au@Ag的制备方法包括下列步骤：
S1、通过搅拌将六水合三氯化铁溶于乙二醇中，随后加入聚乙二醇并搅拌0.8～1.2h以形成澄清溶液，然后加入醋酸钠，磁力搅拌0.4h得到混合溶液，接着将混合溶液转移到具有特氟隆衬里的不锈钢高压釜中，在190℃保持9h，将获得的黑色产物用磁铁收集，用去离子水和乙醇分别洗涤数次，干燥后即得Fe3O4颗粒；
S2、在超声条件下将聚醚酰亚胺分散于去离子水中得到聚醚酰亚胺溶液，随后，在超声超声下将Fe3O4颗粒分散在聚醚酰亚胺溶液中，反应后将产物用磁力分离并用去离子水漂洗，得Fe3O4@PEI磁性纳米粒子；
S3、将四氯金酸三水合物在搅拌下加入到蒸馏水中，加热至煮沸，然后后加入柠檬酸钠水溶液，接着加入含有硼氢化钠的柠檬酸钠溶液，将该溶液继续煮沸4min，得到直径3nm 的AuNPs溶液；
S4、用去离子水稀释AuNPs溶液，加热至沸腾，然后在搅拌条件下，将4柠檬酸钠溶液和硝酸银溶液依次加入到溶液中，继续沸腾40～50min，直至得到直径5nm的Au@AgNPs 胶体溶液；
S5、将Fe3O4@PEI磁性纳米粒子与直径5nm的Au@AgNPs胶体溶液混合并超声处理以生成Fe3O4-Au@Ag磁性纳米粒子，将Fe3O4-Au@Ag磁性纳米粒子与过量的Au@AgNPs 胶体溶液磁性分离，并用去离子水冲洗，得到Fe3O4-Au@Ag磁性纳米粒子。
检测转基因成分DNA的方法，其特征在于：包括下列步骤：
第一步：将Ag/AgCl参比电极、铂丝对电极和不同浓度的目标DNA修饰的 Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极构成的三电极体系浸入到含有20mM H2O2溶液的5.0mL的0.1M PB缓冲溶液中，通入氮气4～6min后采用差分脉冲伏安法进行电化学检测，得到不同浓度的目标DNA修饰的 Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极催化H2O2的DPV信号响应，以差分脉冲伏安法测得的峰电流作为纵坐标，目标DNA浓度的常用对数值为横坐标，绘制得到目标DNA的标准曲线；
第二步：使用Trizol试剂提取待检测样品中转基因成分总RNA，然后用逆转录方法获得 DNA；
第三步：将样品中获得的DNA作为目标DNA，采用权利要求2所述的方法修饰到电极上，以得到的Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极作为工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成三电极体插入到预先准备好的检测底液中，通入氮气5min后利用DPV进行电化学检测。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (6)

1.一种电化学传感器，其特征在于：包括三电极体系和检测池，该三电极体系包括工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极，所述工作电极为修饰的玻碳电极，该玻碳电极的修饰方法包括下列步骤：
第一步：将多壁碳纳米管复合物修饰到预处理后的玻碳电极表面，干燥后电沉积金纳米粒子，蒸馏水洗涤后得到AuNPs/MWCNTs/GCE电极；
第二步：将捕获DNA溶液修饰到所述AuNPs/MWCNTs/GCE电极表面，在3～5℃条件下自组装过夜，然后用0.1M的PB缓冲溶液淋洗，以除去未结合的捕获DNA，即得到pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极；
第三步：将pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极在35～39℃下用牛血清白蛋白溶液封闭25～35min，得到BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极；
第四步：将第三步得到的BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极浸入不同浓度的目标DNA溶液，35～38℃温育0.8～1.2h，然后用0.1M的PB缓冲溶液淋洗，随后再将电极浸入Fe3O4-Au@Ag-sDNA溶液，35～38℃温育0.8～1.2h，用0.1M的PB缓冲溶液淋洗，得到不同浓度的目标DNA修饰的Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极；
所述检测池内容纳有电活性指示剂与缓冲液组成的检测底液，所述电活性指示剂为20mM的过氧化氢溶液，所述缓冲液为pH 7.4的0.1M磷酸盐缓冲溶液；在检测过程中，始终保持检测池中通入氮气；
不同浓度的目标DNA修饰的Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极作为工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成三电极体系插入检测池的检测底液中，即为电化学传感器；
用0.1M的TE缓冲溶液将硫醇修饰的捕获DNA和信号DNA分别配制成浓度为1μM的pDNA溶液和sDNA溶液，用0.1M的TE缓冲溶液将捕获DNA和信号DNA的互补序列配制不同浓度的目标DNA溶液。
2.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于：所述玻碳电极的预处理是指依次用粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光打磨，使玻碳电极表面至镜面，再用无水乙醇和双蒸水超声清洗后，氮气吹干备用。
3.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于：捕获DNA可以与目标DNA部分序列杂交，目标DNA剩余部分序列可以和信号DNA杂交。
4.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于：所述Fe3O4-Au@Ag-sDNA的制备是将200μL的1μM硫醇修饰的信号DNA与1mL浓度为2.5mg/mL的Fe3O4-Au@Ag混合，并在3～5℃下搅拌过夜得到。
5.根据权利要求4所述的电化学传感器，其特征在于：所述Fe3O4-Au@Ag的制备方法包括下列步骤：
S1、通过搅拌将六水合三氯化铁溶于乙二醇中，随后加入聚乙二醇并搅拌0.8～1.2h以形成澄清溶液，然后加入醋酸钠，磁力搅拌0.4～0.6h得到混合溶液，接着将混合溶液转移到具有特氟隆衬里的不锈钢高压釜中，在190～210℃保持9～11h，将获得的黑色产物用磁铁收集，用去离子水和乙醇分别洗涤数次，干燥后即得Fe3O4颗粒；
S2、在超声条件下将聚醚酰亚胺分散于去离子水中得到聚醚酰亚胺溶液，随后，在超声超声下将Fe3O4颗粒分散在聚醚酰亚胺溶液中，反应后将产物用磁力分离并用去离子水漂洗，得Fe3O4@PEI磁性纳米粒子；
S3、将四氯金酸三水合物在搅拌下加入到蒸馏水中，加热至煮沸，然后后加入柠檬酸钠水溶液，接着加入含有硼氢化钠的柠檬酸钠溶液，将该溶液继续煮沸4～6min，得到直径3nm的AuNPs溶液；
S4、用去离子水稀释AuNPs溶液，加热至沸腾，然后在搅拌条件下，将4柠檬酸钠溶液和硝酸银溶液依次加入到溶液中，继续沸腾40～50min，直至得到直径5nm的Au@AgNPs胶体溶液；
S5、将Fe3O4@PEI磁性纳米粒子与直径5nm的Au@AgNPs胶体溶液混合并超声处理以生成Fe3O4-Au@Ag磁性纳米粒子，将Fe3O4-Au@Ag磁性纳米粒子与过量的Au@AgNPs胶体溶液磁性分离，并用去离子水冲洗，得到Fe3O4-Au@Ag磁性纳米粒子。
6.一种检测转基因成分DNA的方法，其特征在于：包括下列步骤：
第一步：将Ag/AgCl参比电极、铂丝对电极和不同浓度的目标DNA修饰的Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极构成的三电极体系浸入到含有20mM H2O2溶液的5.0mL的0.1M PB缓冲溶液中，通入氮气4～6min后采用差分脉冲伏安法进行电化学检测，得到不同浓度的目标DNA修饰的Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极催化H2O2的DPV信号响应，以差分脉冲伏安法测得的峰电流作为纵坐标，目标DNA浓度的常用对数值为横坐标，绘制得到目标DNA的标准曲线；
第二步：使用Trizol试剂提取待检测样品中转基因成分总RNA，然后用逆转录方法获得DNA；
第三步：将样品中获得的DNA作为目标DNA，采用权利要求2所述的方法修饰到电极上，以得到的Fe3O4-Au@Ag-sDNA/tDNA/BSA/pDNA/AuNPs/MWCNTs/GCE电极作为工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成三电极体插入到预先准备好的检测底液中，通入氮气5min后利用DPV进行电化学检测。
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