CN106093173A - 一种电化学传感器、制备方法及其在快速检测黄曲霉毒素b1中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种电化学传感器、制备方法及其在快速检测黄曲霉毒素B1中的应用，该电化学传感器包括三电极体系和检测池，三电极体系包括工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极，所述工作电极为修饰的金电极；所述检测池内装有电活性指示剂与缓冲液组成的检测底液，利用DNA修饰电极对AFB1进行电化学检测，不需要昂贵的单克隆AFB1抗体，解决了一般色谱法、免疫学检测方法操作复杂、成本昂贵、进样量高、耗时长等问题，实现了AFB1的即时检测，具有方便快捷、检测的灵敏度高，检测限低至10 ng/mL、需要样品量少、检测成本极低、干扰小等优点，可以实现对AFB1快速、简便、准确的定量检测。

Description

一种电化学传感器、制备方法及其在快速检测黄曲霉毒素B1 中的应用

技术领域

本发明属于食品检测及生物传感技术领域，具体涉及一种电化学传感器、制备方法及其在快速检测黄曲霉毒素B1中的应用。

背景技术

据估计，每年全世界有25％的粮食作物受到霉菌毒素的污染。联合国粮农组织估算，全世界每年由此造成的经济损失有数千亿美元。因而，饲料霉菌毒素感染己成为饲料工业和畜牧业生产中不可忽视的问题。

饲料在自然条件下污染所产生的毒素有很多种，其中黄曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是饲料中最具代表性的霉菌毒素，且以黄曲霉毒素B1（AFB1）的毒性最为厉害。黄曲霉毒素属剧毒物质，由有毒的黄曲霉和寄生曲霉所产生，所有的家畜和人类对黄曲霉毒素都是敏感的，当饲料中黄曲霉毒素含量大于1000 μg/kg时可导致畜禽死亡。此外，黄曲霉毒素及其代谢产物能残留在动物体脏器（肝脏、肾脏）中，并且随乳汁、蛋排出。由于黄曲霉毒素有耐高温的特性，常规烹饪条件下并不能使黄曲霉毒素分解，因此食用黄曲霉毒素污染的禽类产品（肝脏、蛋制品）会对人体造成危害。

电化学传感器通过与被测物质发生作用并产生与物质浓度成一定比例的电信号来工作的。目前用于检测AFB的电化学传感器多电化学免疫传感器，如Rameil S.,Schubert P., Grundmann P., et al. Use of 3-(4-hydroxyphenyl)propionic acid aselectron donating compound in a potentiometric aflatoxin M1-immunosensor.Anal. Chim. Acta, 2010, 661: 122-127，采用苏木精和槲皮素修饰的铅笔芯电极在AFB1的检测中取得了良好的效果。但是这些基于免疫学的方法都需要对电极进行长时间的预处理，利用抗原-抗体免疫亲和的方法，抗体的制备成本高，对环境要求较为严苛，不利于长时间保存。

发明内容

本发明的目的是提供一种电化学传感器、制备方法及其在快速检测黄曲霉毒素B1中的应用。通过对DNA修饰电极与样品底液中的黄曲霉毒素B1（AFB1）之间反应后导致DNA损伤，电流信号降低与AFB1浓度成比例关系，进一步得到样品中AFB1的含量，提供一种灵敏度高、特异性好、操作方法简便的检测方法。

本发明公开了一种电化学传感器，包括三电极体系和检测池，所述三电极体系包括工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极，所述工作电极为修饰的金电极；所述检测池内装有电活性指示剂与缓冲液组成的检测底液。

优选的是，所述电活性指示剂与缓冲液的体积比为1:9。

上述任一方案优选的是，所述电活性指示剂为亚甲基蓝溶液，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲溶液。

上述任一方案优选的是，所述电活性指示剂为60 µM的亚甲基蓝溶液，所述的缓冲液为0.2 M、pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液。

本发明还公开了一种上述电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）用0.2 M PB将HS-ssDNA配制成浓度为100 µM的HS-ssDNA溶液，用0.2 M PB缓冲溶液将HS-ssDNA的互补序列配制成4 µM的目标DNA溶液；HS-ssDNA序列为AGT TGC AGG GATAGG CAG GTG GCT AGA GAG，可由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；

（2）修饰金电极的制备：

将修饰过的金电极浸入50 μL步骤（1）配制的100 µM的HS-ssDNA溶液中，在4 ℃自组装过夜，用二次水充分淋洗，即得到ssDNA修饰的金电极ssDNA/GE；

再将ssDNA-Au电极浸入50 μL步骤（1）配制的4 μM目标DNA溶液，37 ℃温育，用0.2 M的PB缓冲溶液充分淋洗，得到杂交后的dsDNA修饰的金电极dsDNA/GE；

（3）检测底液的制备：分别取4.5 mL的0.2 M PB缓冲溶液和0.5 mL 60 µM的亚甲基蓝溶液加入到检测池中，混合均匀即得到检测底液；

（4）将步骤（2）得到的dsDNA/GE作为工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成三电极体系插入步骤（3）制备的检测底液中，即为电化学传感器。

优选的是，在步骤2之前还包括电极预处理，即分别用1.0，0.3和0.05 µm的Al₂O₃粉末抛光打磨电极至镜面，再用无水乙醇和双蒸水超声清洗后N₂吹干备用。

上述任一方案优选的是，步骤1）中0.2 M PB采用0.2 M的K₂HPO₄溶液和0.2 M的KH₂PO₄溶液混合后调节pH至7.0得到。

上述任一方案优选的是，步骤3）中0.5 mL的亚甲基蓝溶液的配制方法为称取0.0224 g MB固体样品，用5 mM的PB溶液溶解，定容至100 mL，即得0.6 mM的亚甲基蓝溶液。

上述任一方案优选的是，所述5 mM PB为 5 mM的K₂HPO₄溶液和5 mM的KH₂PO₄溶液混合后调节pH至7.0获得。

本发明还公布了一种上述的电化学传感器或采用上述制备方法制备得到的电化学传感器在检测黄曲霉毒素B1中的应用，包括以下步骤：

（1）AFB1溶液的制备：取1 mg AFB1固体，溶于1 mL甲醇水混合溶液中，振荡、混匀，得浓度为1 mg mL^-1的AFB1母液，使用0.2 M PB缓冲溶液按比例稀释为不同浓度的AFB1标准溶液；

（2）不同浓度AFB1对dsDNA的损伤实验：将dsDNA/GE浸入50 μL的不同浓度的AFB1标准溶液中，温育后，用0.2 M的PB缓冲溶液充分淋洗，得到不同浓度AFB1损伤后的dsDNA/GE备用；

（3）AFB1标准曲线的建立：

将dsDNA/GE作为工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成的三电极体系插入检测底液中，检测得到未经损伤的电流信号1；

再将经步骤（2）得到的由不同浓度AFB1损伤后的dsDNA/GE作为工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成的三电极体系插入检测底液中，检测得到损伤后的电流信号2；

以电流信号1与电流信号2的差值作为纵坐标，AFB1浓度的常用对数值为横坐标，绘制得到AFB1的标准曲线；

（4）样品的处理：取饲料样品5 g，加入100 mL甲醇水溶液中，搅拌后超声萃取，快速抽滤、摇匀，浓缩至5 mL，再用甲醇水溶液定容至10 mL，最后离心，取上清液，用0.2 M pH 7.0的PB缓冲溶液稀释，即得到待测AFB1溶液；

（5）待测样品中AFB1对dsDNA的损伤实验：取50 μL由步骤（4）得到的待测AFB1溶液，将dsDNA/GE浸入该溶液中，方法同步骤（2），得到待测样品中AFB1损伤后的dsDNA/GE；

（6）样品检测：将由步骤（5）得到待测样品中AFB1损伤后的dsDNA/GE按照步骤（3）的方法操作，得到电流信号2。

本发明公开了一种电化学传感器，包括三电极体系和检测池，三电极体系包括工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极，所述工作电极为修饰的金电极；所述检测池内装有电活性指示剂与缓冲液组成的检测底液，利用DNA修饰电极对AFB1进行电化学检测，不需要昂贵的单克隆AFB1抗体，解决了一般色谱法、免疫学检测方法操作复杂、成本昂贵、进样量高、耗时长等问题，实现了AFB1的即时检测，具有方便快捷、检测的灵敏度高，检测限低至10 ng/mL、需要样品量少、检测成本极低、干扰小等优点。

附图说明

图1为本发明中的电化学传感器的组装及对AFB1的检测示意图；

图2为采用本发明电化学传感器检测AFB1时其DPV响应电流差值与浓度的对数关系标准曲线；图中a为dsDNA-Au电极的扫描信号曲线，b、c分别为经300 ng mL-1AFB1溶液损伤时、经700 ng mL-1AFB1溶液损伤时的扫描信号曲线；

图3为不同浓度的AFB1溶液损伤前后的DPV电流值差值的线性关系图。

具体实施方式

下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。

本发明提供一种快速、简便、价廉的检测黄曲霉毒素B1（AFB1）的新型电化学DNA生物传感器，实现对AFB1的快速检测。DNA在裸金电极上自组装得到DNA-Au电极，以60 μM亚甲基蓝为电化学活性指示剂，pH 7.0，0.2 M磷酸盐缓冲溶液配制的铁氰化钾溶液为缓冲底液，37 ℃下含有AFB1样品溶液对电极的损伤时间为22 min。该方法对AFB1的线性检测范围为10 ~ 500 ng/mL，加标回收率在95.99 % ~ 104.57 %。可以实现对AFB1快速、简便、准确的定量检测。

实施例1

本发明的电化学传感器的组装及对AFB1的检测流程示意图，如图1所示；详细实施方式如下：

（1）电极预处理：分别用1.0，0.3和0.05 µm的Al₂O₃粉末将金电极抛光打磨至镜面，再用无水乙醇和双蒸水超声清洗后N₂吹干备用。

（2）缓冲液的制备：分别配制0.2 M和5 mM的K₂HPO₄溶液和0.2 M和5 mM的KH₂PO₄溶液，混合相同浓度的两种溶液并调节pH至7.0，制备0.2 M的PB和5 mM的PB储藏备用。

（3）亚甲基蓝（MB）溶液的制备：称取0.0224 g MB固体样品，用步骤（2）所配制的5mM的PB溶液溶解，定容至100 mL，即得0.6 mM的MB储备溶液。

（4）ssDNA溶液的制备：HS-ssDNA用步骤（2）所配制的0.2 M PB配制成浓度为100 µM的HS-ssDNA溶液；其互补序列用步骤（2）所配制的0.2 M PB缓冲溶液配制成浓度为4 µM的目标DNA溶液。

（5）修饰金电极的制备：将步骤（1）处理的金电极浸入50 μL步骤（4）配制的100 µM的HS-ssDNA溶液中，在4 ℃自组装过夜，接着用双蒸水充分淋洗，除去电极表面多余的未组装的ssDNA，即得到ssDNA修饰的金电极（ssDNA-Au）。再将ssDNA-Au电极浸入50 μL步骤（4）配制的4 μM目标DNA溶液，37 ℃温育1 h，随后用0.2 M的PB缓冲溶液充分淋洗以除去表面未杂交的目标DNA，得到杂交后的dsDNA修饰的金电极(dsDNA/GE)。

（6）样品的处理：取猪饲料样品 5g (舒克贝塔牌清洁级猪料，购买于江苏省协同医药生物工程有限责任公司)；加入100 mL甲醇水溶液（体积比1:1），搅拌后超声萃取10min，快速抽滤、摇匀，取滤液旋转蒸发浓缩至5 mL，再用甲醇水溶液（体积比1:1）定容至10mL，最后经10000 r min^-1，4 ℃离心15 min，取其上清液，置于4 ℃保存备用。用步骤（2）配制的0.2 M pH 7.0 的PB缓冲溶液稀释，即可得到待测AFB1溶液。

（7）检测底液的制备：分别取4.5 mL的步骤（2）所得的0.2 M PB缓冲液和0.5mL的步骤（3）所得电活性指示剂加入到检测池中，混合均匀；

（8）未经损伤的dsDNA/GE上电流信号1的测定：将得到的dsDNA/GE作为工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成的三电极体系插入步骤（7）所得的检测底液中，采用示差脉冲伏安法进行检测，得到未经损伤的电流信号1为7 μA。扫描的初始电位为0 V，终止电位为-0.3 V，出峰位置为-0.17 V。

（9）不同浓度AFB1对dsDNA的损伤实验：37 ℃条件下，将由步骤（5）得到的dsDNA/GE浸入50 μL的由步骤（6）配制的待测样品AFB1溶液中，温育22 min后，取出用0.2 M的PB缓冲溶液充分淋洗，得到由待测样品中AFB1损伤后的dsDNA/GE备用。

（10）样品检测：将由步骤（9）得到的修饰电极按照步骤（8）操作，扫描的初始电位为0 V，终止电位为-0.3 V，出峰位置为-0.17 V，得到电流信号2为16.8 μA。通过电流信号1和电流信号2的差值以及已经得到的标准曲线计算样品中的AFB1含量为19.2 ng mL^-1。

在MB溶液中考察组装完成的dsDNA-Au电极未经AFB1溶液损伤时、经300 ng mL^-1AFB1溶液损伤时、经700 ng mL^-1 AFB1溶液损伤时的示差脉冲伏安响应，结果如图2所示。图中a为dsDNA-Au电极的扫描信号曲线，b、c分别为经300 ng mL^-1 AFB1溶液损伤时、经700 ngmL^-1 AFB1溶液损伤时的扫描信号曲线。从图2可以得出经300 ng mL^-1 AFB1溶液损伤后的DPV图峰电流值明显要比未经损伤的峰电流值要小，经700 ng mL^-1 AFB1溶液损伤后的DPV图峰电流值明显要比经300 ng mL^-1 AFB1溶液损伤后的DPV图峰电流值小。

图3为不同浓度的AFB1溶液损伤前后的DPV电流值差值的线性关系图，由图3可见，在10 ~ 500 ng mL^-1之间时，Δi _P值随AFB1浓度的增大而增大，且Δi _P值与lg(C _AFB1)之间的关系满足线性关系方程：Δi _P = (-0.11982 ± 0.01476) + (0.24917 ± 0.00693) lg(C _AFB1) ，线性相关系数R = 0.9970。线性检测范围为10 ~ 500 ng mL^-1，最低检测限为10ng mL^-1。

实施例2

（1）电极预处理：分别用1.0，0.3和0.05 µm的Al₂O₃粉末抛光打磨至镜面，再用无水乙醇和双蒸水超声清洗后N₂吹干备用。

（2）缓冲液的制备：分别配制0.2 M和5 mM的K₂HPO₄溶液和0.2 M和5 mM的KH₂PO₄溶液，混合相同浓度的两种溶液并调节pH至7.0，制备0.2 M的PB和5 mM的PB储藏备用。

（3）亚甲基蓝（MB）溶液的制备：称取0.0224 g MB固体样品，用步骤（2）所配制的5mM的PB溶液溶解，定容至100 mL，即得0.6 mM的MB储备溶液。

（4）ssDNA溶液的制备：HS-ssDNA用步骤（2）所配制的0.2 M PB配制成浓度为100 µM的HS-ssDNA溶液；其互补序列用步骤（2）所配制的0.2 M PB缓冲溶液配制成浓度分别为4µM的目标DNA溶液。

（5）修饰金电极的制备：将用步骤（1）处理的金电极浸入50 μL步骤（4）配制的100µM的HS-ssDNA溶液中，在4 ℃自组装过夜，接着用二次水淋洗充分淋洗，除去电极表面多余的未组装的ssDNA，即得到ssDNA修饰的金电极（ssDNA/GE）。再将ssDNA-Au电极浸入50 μL步骤（4）配制的4 μM目标DNA溶液，37 ℃温育1 h，随后用0.2 M的PB缓冲溶液充分淋洗以除去表面未杂交的目标DNA，得到杂交后的dsDNA修饰的金电极(dsDNA/GE)。

（6）样品的处理：取小鼠饲料样品5 g (舒克贝塔牌SPF级大小鼠粮，购买于江苏省协同医药生物工程有限责任公司)；加入100 mL甲醇水溶液（体积比1:1），搅拌后超声萃取10 min，快速抽滤、摇匀，取滤液旋转蒸发浓缩至5 mL，再用甲醇水溶液定容至10 mL，最后经10000 r min^-1，4 ℃离心15 min，取其上清液，置于4 ℃保存备用。用步骤（2）配制的0.2M pH 7.0 的PB缓冲溶液稀释，即可得到待测AFB1溶液。

（7）检测底液的制备：分别取4.5 mL的步骤（2）所得的0.2 M PB缓冲液和0.5 mL的步骤（3）所得电活性指示剂加入到检测池中，混合均匀；

（8）未经损伤的dsDNA/GE上电流信号1的测定：将得到的dsDNA/GE将作为工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成的三电极体系插入步骤（7）所得的检测底液中，采用示差脉冲伏安法进行检测，得到未经损伤的电流信号1为7.2 μA。扫描的初始电位为0V，终止电位为-0.3 V，出峰位置为-0.17 V。

（9）不同浓度AFB1对dsDNA的损伤实验：37 ℃条件下，将由步骤（5）得到的dsDNA/GE浸入50 μL的由步骤（6）配制的待测样品AFB1溶液中，温育22 min后，取出用0.2 M的PB缓冲溶液充分淋洗，得到由待测样品中AFB1损伤后的dsDNA/GE备用。

（10）样品检测：将由步骤（9）得到的修饰电极按照步骤（8）操作，扫描的初始电位为0 V，终止电位为-0.3 V，出峰位置为-0.17 V，得到电流信号2 为6.85 μA。通过电流信号1和电流信号2的差值以及已经得到标准曲线计算样品中的AFB1含量为76.8 ng mL^-1。

实施例3

（1）电极预处理：分别用1.0，0.3和0.05 µm的Al₂O₃粉末抛光打磨至镜面，再用无水乙醇和双蒸水超声清洗后N₂吹干备用。

（2）缓冲液的制备：分别配制0.2 M和5 mM的K₂HPO₄溶液和0.2 M和5 mM的KH₂PO₄溶液，混合相同浓度的两种溶液并调节pH至7.0，制备0.2 M的PB和5 mM的PB储藏备用。

（3）亚甲基蓝（MB）溶液的制备：称取0.0224 g MB固体样品，用步骤（2）所配制的5mM的PB溶液溶解，定容至100 mL，即得0.6 mM的MB储备溶液。

（4）ssDNA溶液的制备：HS-ssDNA用步骤（2）所配制的0.2 M PB配制成浓度为100 µM的HS-ssDNA溶液；其互补序列用步骤（2）所配制的0.2 M PB缓冲溶液配制成浓度分别为4µM的目标DNA溶液。

（5）修饰金电极的制备：将用步骤（1）处理的金电极浸入50 μL步骤（4）配制的100µM的HS-ssDNA溶液中，在4 ℃自组装过夜，接着用双蒸水充分淋洗，除去电极表面多余的未组装的ssDNA，即得到ssDNA修饰的金电极（ssDNA/GE）。再将ssDNA-Au电极浸入50 μL步骤（4）配制的4 μM目标DNA溶液，37 ℃温育1 h，随后用0.2 M的PB缓冲溶液充分淋洗以除去表面未杂交的目标DNA，得到杂交后的dsDNA修饰的金电极(dsDNA/GE)。

（6）样品的处理：取鸡饲料样品 5 g (舒克贝塔牌清洁级鸡饲料，购买于江苏省协同医药生物工程有限责任公司)；加入100 mL甲醇水溶液（体积比1:1），搅拌后超声萃取10min，快速抽滤、摇匀，取滤液旋转蒸发浓缩至5 mL，再用甲醇水溶液定容至10 mL，最后经10000 r min^-1，4 ℃离心15 min，取其上清液，置于4 ℃保存备用。用步骤（2）配制的0.2 MpH 7.0 的PB缓冲溶液稀释，即可得到待测AFB1溶液。

（7）检测底液的制备：分别取4.5 mL的步骤（2）所得的0.2 M PB缓冲液和0.5 mL的步骤（3）所得电活性指示剂加入到检测池中，混合均匀；

（8）未经损伤的dsDNA/GE上电流信号1的测定：将得到的dsDNA/GE将作为工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成的三电极体系插入步骤（7）所得的检测底液中，采用示差脉冲伏安法进行检测，得到未经损伤的电流信号1为6.9 μA。扫描的初始电位为0 V，终止电位为-0.3 V，出峰位置为-0.17 V。

（9）不同浓度AFB1对dsDNA的损伤实验：37 ℃条件下，将由步骤（5）得到的dsDNA/GE浸入50 μL的由步骤（6）配制的待测样品AFB1溶液中，温育22 min后，取出用0.2 M的PB缓冲溶液充分淋洗，得到由待测样品中AFB1损伤后的dsDNA/GE备用。

（10）样品检测：将由步骤（9）得到的修饰电极按照步骤（8）操作，扫描的初始电位为0V，终止电位为-0.3 V，出峰位置为-0.17 V，得到电流信号2为6.4 μA。通过电流信号1和电流信号2的差值以及已经得到标准曲线计算样品中的AFB1含量为 307.25 ng mL^-1。

Claims (10)

1.一种电化学传感器，其特征在于，包括三电极体系和检测池，所述三电极体系包括工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极，所述工作电极为修饰的金电极；所述检测池内装有电活性指示剂与缓冲液组成的检测底液。

2.根据权利要求1所述的一种电化学传感器，其特征在于，所述电活性指示剂与缓冲液的体积比为1:9。

3.根据权利要求1或2所述的一种电化学传感器，其特征在于，所述电活性指示剂为亚甲基蓝溶液，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲溶液。

4.根据权利要求3所述的一种电化学传感器，其特征在于，所述电活性指示剂为60 µM的亚甲基蓝溶液，所述的缓冲液为0.2 M、pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液。

5.一种权利要求1-4任一项所述电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）用0.2 M PB将HS-ssDNA配制成浓度为100 µM的HS-ssDNA溶液，用0.2 M PB缓冲溶液将HS-ssDNA的互补序列配制成4 µM的目标DNA溶液；

（2）修饰金电极的制备：

将修饰过的金电极浸入50 μL步骤（1）配制的100 µM的HS-ssDNA溶液中，在4 ℃自组装过夜，用二次水充分淋洗，即得到ssDNA修饰的金电极ssDNA/GE；

再将ssDNA-Au电极浸入50 μL步骤（1）配制的4 μM目标DNA溶液，37 ℃温育，用0.2 M的PB缓冲溶液充分淋洗，得到杂交后的dsDNA修饰的金电极dsDNA/GE；

（3）检测底液的制备：分别取4.5 mL的0.2 M PB缓冲溶液和0.5mL 60 µM的亚甲基蓝溶液加入到检测池中，混合均匀即得到检测底液；

（4）将步骤（2）得到的dsDNA/GE作为工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成三电极体系插入步骤（3）制备的检测底液中，即为电化学传感器。

6.根据权利要求5所述的一种电化学传感器的制备方法，其特征在于，在步骤2之前还包括电极预处理，即分别用1.0，0.3和0.05 µm的Al₂O₃粉末抛光打磨电极至镜面，再用无水乙醇和双蒸水超声清洗后N₂吹干备用。

7.根据权利要求5所述的一种电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤1）中0.2 MPB采用0.2 M的K₂HPO₄溶液和0.2 M的KH₂PO₄溶液混合后调节pH至7.0得到。

8.根据权利要求5所述的一种电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤3）中0.5mL的亚甲基蓝溶液的配制方法为称取0.0224 g MB固体样品，用5 mM的PB溶液溶解，定容至100 mL，即得0.6 mM的亚甲基蓝溶液。

9.根据权利要求5所述的一种电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述5 mM PB为5 mM的K₂HPO₄溶液和5 mM的KH₂PO₄溶液混合后调节pH至7.0获得。

10.一种权利要求1-4任一项所述的电化学传感器或者由权利要求5-9任一项所述的制备方法制备得到的电化学传感器在快速检测黄曲霉毒素B1中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）AFB1溶液的制备：取1 mg AFB1固体，溶于1 mL甲醇水混合溶液中，振荡、混匀，得浓度为1 mg mL^-1的AFB1母液，使用0.2 M PB缓冲溶液按比例稀释为不同浓度的AFB1标准溶液；

（2）不同浓度AFB1对dsDNA的损伤实验：将dsDNA/GE浸入50 μL的不同浓度的AFB1标准溶液中，温育后，用0.2 M的PB缓冲溶液充分淋洗，得到不同浓度AFB1损伤后的dsDNA/GE备用；

（3）AFB1标准曲线的建立：

将dsDNA/GE作为工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成的三电极体系插入检测底液中，检测得到未经损伤的电流信号1；

再将经步骤（2）得到的由不同浓度AFB1损伤后的dsDNA/GE作为工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成的三电极体系插入检测底液中，检测得到损伤后的电流信号2；

以电流信号1与电流信号2的差值作为纵坐标，AFB1浓度的常用对数值为横坐标，绘制得到AFB1的标准曲线；

（4）样品的处理：取饲料样品5 g，加入100 mL甲醇水溶液中，搅拌后超声萃取，快速抽滤、摇匀，浓缩至5 mL，再用甲醇水溶液定容至10 mL，最后离心，取上清液，用0.2 M pH 7.0的PB缓冲溶液稀释，即得到待测AFB1溶液；

（5）待测样品中AFB1对dsDNA的损伤实验：取50 μL由步骤（4）得到的待测AFB1溶液，将dsDNA/GE浸入该溶液中，方法同步骤（2），得到待测样品中AFB1损伤后的dsDNA/GE；

（6）样品检测：将由步骤（5）得到待测样品中AFB1损伤后的dsDNA/GE按照步骤（3）的方法操作，得到电流信号2。