CN104792999A - 一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片 - Google Patents

一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片 Download PDF

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刘慧颖
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Abstract

本发明涉及一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片，由含有捕获抗体的蛋白芯片、标记检测抗体和DNA探针1的检测探针以及标有DNA探针2的信号探针组成。本发明40min内可对多种蛋白进行高灵敏联合检测，敏感快捷、成本低、小型化、不需要复杂的光学组件、所用样本量极少，在生物医学及化学分析等方面均有广阔的应用前景。

Description

一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片
技术领域
本发明属于生物传感器检测领域，特别涉及一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片。
背景技术
急性心肌梗死(AMI)是冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)的严重类型。据世界卫生组织(2012)统计每年大约有1.75亿人死于心血管疾病，占全球非传染性疾病死亡人数的46％。AMI是目前全世界范围内男女发病、致死的主要原因之一，早期诊断对病人的分类管理和预后至关重要。目前对疑似急性冠脉综合征(ACS)的初步评价主要是结合病史、心电图改变及生化指标测定。心电图是一种简单快捷的方法，但在AMI早期仅有50％-60％患者显示有特征性改变。人群中尤其是老年人或合并其他疾病如糖尿病、充血性心力衰竭等由于ACS症状不典型造成误诊率、漏诊率的现象时有发生。因此，心肌损伤标志物在AMI早期诊断、监控、预后和危险分层方面发挥着基础性的作用。
为满足疾病诊断需求、节省医疗成本，目前已研制出多种生物传感器检测心肌损伤标志物，包括光电二极管芯片、荧光技术检测、表面等离子体共振等[Vittorini S.,Clerico A.,ClinicalChemistry and Laboratory Medicine[J],2008,46(6),748-763]、[Gobi K.V.,Tanaka H.,Shoyama Y.,Miura N.,Sensors and Actuators B:Chemical[J],2005,111,562-571]、[Nakamura H.,KarubeI.,Analytical and bioanalytical chemistry[J],2003,377(3),446-468]，而实验室诊断则主要依赖ECLIA。前三种方法检测灵敏度高，但仪器设备复杂、光学组件昂贵、所需条件严格，限制了其应用推广[Mohammed M.I.,Desmulliez M.P.Y.,Biosensors and Bioelectronics[J],2014,61,478-484]、[Gul O.,Calay E.,Sezerman U.,Basaga H.,Gurbuz Y.,Sensors and Actuators B:Chemical[J],2007,125(2),581-588]、[Matveeva E.G.,Gryczynski Z.,Lakowicz J.R.,Journal ofimmunological methods[J],2005,302(1),26-35]。后者为目前临床上检测心肌标志物最常用的方法，该体系需要精密的分析技术如基于脉冲式的伏安法以及电化学阻抗谱方能实现高灵敏检测，另外由于相邻电极活化性能的干扰导致其无法对多种标志物进行联合检测[Han K.N.,LeT.H.,Pham X.H.,Huynh-Nguyen B.C.,Kim J.H.,Ko E.,Kwon H.T.,Seong G.H.,Sensors andActuators B:Chemical[J],2015,207,470-476]。
纳米金作为比色分析指标因独特的光学特性、良好的化学稳定性、生物相容性、无毒性等备受关注，其能够与多肽、蛋白质、适配体、核酸、肽核酸(PNAs)等多种生物分子共价或非共价结合，从而实现对目的成分的检测[Zhu Z.,Ravelet C.,Perrier S.,Guieu V.,Fiore E.,Peyrin E.,Analytical chemistry[J],2012,84(16),7203-7211]。然而比色技术由于缺乏合适的信号放大策略灵敏度低限制了检测微量蛋白的能力。近来Peyrin等人[Liu J.,Wang C.,Jiang Y.,HuY.,Li J.,Yang S.,Huang C.Z.,Analytical chemistry[J],2013,85(3),1424-1430]用单链结合蛋白(SSB)作为小分子荧光偏振分析的信号增强器，YANG等人[Tabakman S.M.,Chen Z.,Casalongue H.S.,Wang H.,Dai H.,Small[J],2011,7(4),499-505]用石墨烯辅助信号放大提高ATP检测灵敏度。这些方法在带来高灵敏度的同时加大了非特异蛋白质的吸附，使背景信号增强、假阳性率升高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片，该芯片40min内可对多种蛋白进行高灵敏联合检测，敏感快捷、成本低、小型化、不需要复杂的光学组件、所用样本量极少，在生物医学及化学分析等方面均有广阔的应用前景。
本发明的一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片，由含有捕获抗体的蛋白芯片、标记检测抗体和DNA探针1的检测探针以及标有DNA探针2的信号探针组成；其中，所述捕获抗体、检测抗体为TnI、MYO、HFABP相应的捕获抗体、检测抗体，DNA探针1(检测探针)的序列为5’-SH-(CH2)3TTTTTTTTTTGCACAGGAGCAACAG-3’，DNA探针2(信号探针)的序列为5’-SH-(CH2)3TTTTTTTTTTCTGTTGCTCCTGTGC-3’。
所述蛋白芯片的制备方法为：将cTnI、MYO、HFABP捕获抗体及羊抗鼠IgG抗体与蛋白点样液混合，通过芯片点样仪点样；点样完毕后将芯片晾干，经微阵列稳定液处理固定，干燥后真空包装保存备用。
所述检测探针的制备方法为：取AuNPs，用K2CO3调整pH；依次加入cTnI检测抗体、MYO检测抗体、HFABP检测抗体；恒温振荡，然后加入DNA探针1，充分混匀，离心、重悬，保存备用。
所述信号探针的制备方法为：取AuNPs，离心，取DNA探针2，加入去离子水重悬纳米金，静置，加入PB和NaCl，充分混匀静置；再加入PB/NaCl混合液离心，加入PB/NaCl混合液重悬，保存备用。
所述信号探针使用时的加入量为6μL。
本发明构建的蛋白微阵列体系基纳米技术与核酸杂交于一体，人工合成的寡核苷酸链遵循严格的碱基互补配对原则，借助于纳米金成核反应原理，将两种纳米金探针高效、特异性的结合从而提高蛋白检测的灵敏度。构建的放大体系与目前相关资料报道结果相比，背景信号弱，反应时间短，检测灵敏度升高1～2个数量级。同时操作所需设备简单、成本低、短时间内可同时对多种蛋白进行快速、高灵敏度检测，为临床疾病的诊治和预后开辟了新道路。
有益效果
本发明40min内可对多种蛋白进行高灵敏联合检测，其中肌钙蛋白I(cTnI)检测限为10pg/mL，与临床电化学发光法(ECLIA)灵敏度相当；肌红蛋白(MYO)与新型脂肪酸结合蛋白(HFABP)检测限分别为640pg/mL和10pg/mL，与ECLIA及酶联免疫吸附法(ELISA)相比，灵敏度大大提高；敏感快捷、成本低、小型化、不需要复杂的光学组件、所用样本量极少，在生物医学及化学分析等方面均有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明的检测过程及原理图；
图2为标记前后的吸收光谱；
图3为纳米金探针标记的电泳表征结果；
图4为检测探针(A)与信号探针(B)的加入量的优化结果；
图5为蛋白芯片信号放大前(上)和信号放大后(下)的结果；
图6为蛋白芯片检测心肌损伤标志物的特异性；其中，A加入样品为PBS，B加入样品为HFABP抗原标准品，C加入样品为cTnI抗原标准品，D加入样品为MYO抗原标准品；
图7为HFABP、cTnI、MYO抗原标准品的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
cTnI、MYO、HFABP相应捕获抗体、检测抗体及抗原购自Hytest公司；15nm胶体金溶液(AuNPs)购自上海水源生物公司；4-吗啉乙磺酸(MES)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，乙二胺四乙酸(EDTA)，四氯金酸，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，牛血清白蛋白(BSA)，Tween-20购自Sigma-Aldrich公司；微阵列稳定液(microarray stabilizer)购自SurModics公司；磷酸盐缓冲液(10mmol/L PBS，pH7.4)，PBST洗液(10mmol/L PBS，0.05％Tween20，pH7.4)；杂交液(1mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl)；胶体金重悬液(0.1mmol/LPB，2.5％蔗糖，0.4％BSA，0.1％PVP，0.3％Tween20，pH7.4)；金染液(100mmol/L四氯金酸，30％H2O2，25mmol/L MES)。配制以上溶液所需试剂K2CO3，NaCl，KCl，Na2HPO4.12H2O，KH2PO4，HCl，蔗糖购自上海凌峰化学试剂有限公司。实验用水为Milli-Q超纯水(18.2MΩ/cm)，醛基片购自上海百奥科技有限公司，Human HFABP ELISA试剂盒购自荷兰Hycult biotech公司，两条互补DNA探针由TaKaRa公司合成。
实施例1
(1)蛋白芯片的制备：将cTnI、MYO、HFABP捕获抗体及羊抗鼠IgG抗体(质控点)与蛋白点样液按体积比1:1混合，通过芯片点样仪固定在醛基化修饰的玻片上，点样间距400μm，点样直径80μm，点样量0.5μL，每种蛋白重复点样6次，共点样3排。点样完毕后将芯片置于25℃12h晾干，经微阵列稳定液处理固定，干燥后真空包装4℃保存备用。
(2)检测探针制备：取1mL 15nmAuNPs三管，用0.2mol/L K2CO3调整pH分别为8.0、8.0、8.5；依次加入cTnI检测抗体1.0μL(浓度为6.9mg/mL)，MYO 1.0μL(浓度为7.8mg/mL)，HFABP1.5μL(浓度为4.8mg/mL)；恒温混匀仪25℃，300r/min，振荡1h；各加入3μL100μmol/LDNA探针1，充分混匀4℃静置12h；9000r/min，离心50min，移去上清；100μL胶体金重悬液重悬，4℃保存备用。
(3)信号探针制备：取1mL 15nm AuNPs，9000r/min，离心50min，弃上清；取3μL 100μmol/LDNA探针2，加入97μL去离子水补足至100μL重悬纳米金，4℃静置12h；分3次加入0.1mol/LPB(pH＝7.4)和1mol/L NaCl至终浓度分别为10mmol/L、0.1mmol/L，每次间隔2h，充分混匀4℃静置48h；用PB/NaCl混合液(PB、NaCl、H2O比例为1:1:8)将上述液体补足至1mL；9000r/min，离心50min，移去上清；加入100μLPB/NaCl混合液重悬，4℃保存备用。
(4)反应流程：1％BSA封闭芯片5min后氮气吹干；将待检样本15μL、检测探针12μL、杂交液12μL和信号探针6μL混匀后加入芯片，分子杂交仪中37℃孵育30min；PBST洗液洗2次，各30s，氮气吹干；将25mmol/L MES(pH＝6.0)、30％H2O2和0.1mol/L四氯金酸按体积比5:3:2加入方阵中染色5min，去离子水冲洗终止反应(整个过程在暗盒中进行)，检测过程及原理如图1所示。
结果观察分析用显微镜对结果进行观察分析，阳性表现为黑褐色点出现，根据待检样本浓度不同，灰度不一。阴性结果为空白(羊抗鼠抗体IgG结果除外)。通过Gray analysis 5.0软件对结果进行灰度值测定从而实现对待检样本的定量分析。
统计学处理：
采用SPSS17.0软件进行数据处理及统计学分析，计数资料比较采用X2检验。以α＝0.05为检验水准，P<0.05表示差异有显著性。
纳米金探针标记结果表征：
蛋白质的氨基酸残基与胶体金表面配体(羧基)通过静电及氢键作用使其很容易吸附到胶体金表面形成稳定的核壳结构。巯基修饰的DNA探针通过Au-S键高效率组装到纳米金表面经杂交使信号放大。大量文献研究表明紫外吸收光谱分析广泛应用于纳米金生物分子标记技术中，可用来表征纳米金颗粒的大小及分散性。本实施例中检测探针共三种，分别标记HFABP、cTnI、MYO相应检测抗体和DNA探针1，信号探针标记有DNA探针2。用紫外分光光度仪分别测试标记前后的吸收光谱如图2所示，纳米金原液最大吸收峰对应波长在518nm处，而标记抗体、DNA探针后的纳米金颗粒直径增大，紫外可见吸收光谱最大吸收峰向长波段红移了7nm为525nm。电泳表征纳米金探针标记结果如图3所示，由于三种蛋白分子量不同(HFABP15kDa、cTnI23.5kDa、MYO 18kDa)导致迁移速率不等(HFABP最快，MYO次之，cTnI最慢)；纳米金原液由于电泳液中盐离子作用发生聚集而沉积在加样孔中。综上所述，纳米金探针标记成功。
纳米金探针加入量优化：
平行做8组实验，将信号探针的加入量固定为4μL，3种蛋白检测探针各自的加入量分别设为1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL共8个反应体系。如图4所示，HFABP、MYO检测探针加入量在1μL～4μL时，随着检测探针加入量的增加检测信号(灰度值)不断增加，4μL时信号最强，4μL以后检测信号开始下降，同时背景信号及非特异性信号增强。cTnI检测探针加入量在1μL～3μL时，随着加入量的增加信号不断增加，3μL时信号最强，大于3μL检测信号开始减弱，背景信号及非特异信号开始增强。然后分别固定3种蛋白检测探针的最佳加入量，重新设8组平行试验，调整信号探针的加入量从1μL依次增至8μL，同理可得出信号探针的最佳加入量为6μL。
探针杂交放大前后结果对比：
分别构建芯片上单独标记抗体的单一纳米金反应与在此基础上通过双纳米金杂交放大体系，两者结果对比如图5所示，单纳米金反应时3种蛋白标准品浓度在1ng/mL时检测信号不明显，与空白对照结果无明显差别。双纳米金探针杂交体系在1ng/mL时检测信号较前者明显增强，后者3种蛋白标准品浓度在32ng/mL时的检测信号远远大于前者。可见本实施例构建的基于双纳米金探针杂交的蛋白芯片技术较前者相比极大提高了同一浓度反应检测的灵敏度。
蛋白芯片标志物特异性检测：
平行做4组实验，其中HFABP、MYO检测探针各3μL、cTnI检测探针4μL、信号探针6μL加入分液管中，共4管。然后往每个管中分别加入PBS、HFABP、cTnI、MYO标准品各15μL，混匀后移入芯片的四个方阵，37℃分子杂交仪中孵育30min,染色后终止反应观察结果如图6所示。图左侧一列点有羊抗鼠IgG抗体作为阳性参照，第1排、第2排、第3排分别点有HFABP、cTnI、MYO捕获抗体。图6(A)加入样品为PBS，作为空白对照组无明显检测信号。图6(B)加入样品为HFABP抗原标准品，第1排检测信号明显，余2排无明显检测信号(阴性对照)。图6(C)加入样品为cTnI抗原标准品，第2排检测信号明显，余2排无明显检测信号。图6(D)加入样品为MYO抗原标准品，第3排检测信号明显，余2排无明显检测信号。综上可得各蛋白之间无交叉反应，特异性良好。
绘制标准曲线：
该方法检测HFABP、cTnI、MYO抗原标准品后绘制的标准曲线见图7，HFABP浓度在10pg/mL～165ng/mL间拟合曲线关系良好R2＝0.995；cTnI浓度在10pg/mL～330ng/mL之间拟合曲线关系良好，R2＝0.994；MYO浓度在640pg/mL～1300ng/mL之间拟合曲线关系良好，R2＝0.990。
灵敏度检测：将3种蛋白抗原标准品从10μg/mL开始进行等比稀释，然后分别对不同浓度的标准品进行检测。随着抗原标准品浓度的降低，显色后各方阵灰度逐渐减弱。HFABP、cTnI抗原标准品浓度在10pg/mL以下时检测结果与空白对照无明显差别，MYO抗原标准品浓度在640pg/mL以下时检测结果与空白对照无明显差别，即HFABP、cTnI灵敏度为10pg/mL，MYO为640pg/mL，与临床ECLIA法(cTnI 20pg/mL，MYO 21ng/mL)以及ELISA法(HFABP360pg/mL)相比，cTnI检测灵敏度相当，其余2种蛋白检测灵敏度大大提高。标准曲线建立后，未知样本通过本体系反应所得灰度值代入曲线即可求出该样本浓度。一个反应玻片可预先设置多个方阵，即可同时检测多个样本。每个方阵中可预点几种蛋白(每种蛋白点一横列)，即可检测同一样本中的不同成分。每一横列重复点样6次，最后求6个点的平均灰度值，大大提高了所得结果的准确性、时效性。
不同检测方法样本检测结果对比：
本方法检测血清102例，其中急性心肌梗死42例，不稳定性心绞痛30例，正常体检者30例，三组检测结果分别与ECLIA及ELISA试剂盒(HFABP)比较(表2，表3)，cTnI敏感性为73.81％、MYO88.10％、HFABP92.86％。cTnI与MYO联合检测敏感性为89.05％，cTnI与HFABP联合检测敏感性为93.10％，三者同时检测敏感性为93.56％，该体系与ECLIA及ELISA检测结果整体一致(P>0.05)。
表2
表3
同一方法各组间比较，差异有显著性(P<0.05)，进一步证实了心肌损伤标志物在心血管疾病早期诊断及分类管理中的重要性，尤其是HFABP作为一种新型的心肌标志物，Okamonto等人研究在症状发作的12h内HFABP对急性心肌梗死的临床诊断敏感性及特异性均优于MYO，但缺乏完全心肌特异性。因此联合检测HFABP、MYO、cTnI可极大程度上提高AMI的检出率。
序列表

Claims (5)

1.一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片，其特征在于：由含有捕获抗体的蛋白芯片、标记检测抗体和DNA探针1的检测探针以及标有DNA探针2的信号探针组成；其中，所述捕获抗体、检测抗体为TnI、MYO、HFABP相应的捕获抗体、检测抗体，DNA探针1的序列为5’-SH-(CH2)3TTTTTTTTTTGCACAGGAGCAACAG-3’，DNA探针2的序列为5’-SH-(CH2)3TTTTTTTTTTCTGTTGCTCCTGTGC-3’。
2.根据权利要求1所述的一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片，其特征在于：所述蛋白芯片的制备方法为：将cTnI、MYO、HFABP捕获抗体及羊抗鼠IgG抗体与蛋白点样液混合，通过芯片点样仪点样；点样完毕后将芯片晾干，经微阵列稳定液处理固定，干燥后真空包装保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片，其特征在于：所述检测探针的制备方法为：取AuNPs，用K2CO3调整pH；依次加入cTnI检测抗体、MYO检测抗体、HFABP检测抗体；恒温振荡，然后加入DNA探针1，充分混匀，离心、重悬，保存备用。
4.根据权利要求1所述的一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片，其特征在于：所述信号探针的制备方法为：取AuNPs，离心，取DNA探针2，加入去离子水重悬纳米金，静置，加入PB和NaCl，充分混匀静置；再加入PB/NaCl混合液离心，加入PB/NaCl混合液重悬，保存备用。
5.根据权利要求1所述的一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片，其特征在于：所述信号探针使用时的加入量为6μL。
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