CN107389568A - 一种检测卡那霉素的比色检测探针及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测卡那霉素的比色检测探针，其制备方法包括如下步骤：(1)将氨基化适配体Apt与氨基化的磁珠MB在偶联剂的作用下结合成捕获探针；(2)将单链DNA结合蛋白SSB修饰到合成好的金属有机框架MOF‑Pt复合材料的表面来形成信号探针；(3)将步骤1的捕获探针和步骤2的信号探针通过单链DNA结合蛋白和适配体Apt之间的亲和性形成复合探针，还提供了该探针在检测卡那霉素的方法，该检测方法不需要依赖大型仪器设备，且具有较低的检测限，同时，该比色检测探针还表现出良好的特异性和选择性，该方法操作简单快速，借助手持型比色计就可以实现卡那霉素残留的现场检测，并且实验结果肉眼可视。
Description
技术领域
本发明涉及环境科学、检验化学及分析化学领域，具体涉及一种基于无酶催化的比色方法检测牛奶中卡那霉素残留的比色检测探针及其检测方法。
背景技术
卡那霉素(KANA)作为一种小分子药物，敏感菌所致的肠道感染及用作肠道手术前准备，并有减少肠道细菌产生氨的作用，对肝硬化消化道出血病人的肝昏迷有一定防止作用。但是当人体内的KANA累积到一定程度的时候就会产生一定的副作用，比如红斑皮疹，听力减退、耳鸣或耳部饱满感(耳毒性)以及肾毒症等，并且长期体内积累的KANA会让人产生抗药性从而对人体健康构成巨大的威胁。
目前，已经开发了许多检测KANA的方法，常见的有比色法，荧光法(FL)，电化学法(EC)，电化学发光法(ECL)以及高效液相色谱法(HPLC)。其中比色法由于其简单的构建方式以及可以快速反馈结果的优势得到了许多研究者的青睐。更重要的是该方法还具有结果肉眼可视性的优点，利用肉眼就可辨别实验结果，使得实验结果更简单、直观。并且在测定过程中不需要使用大型仪器非常容易推广，有很好的普遍性，在现场快速检测方面具有很好的应用和发展前景。但是常见的比色方法是通过辣根过氧化酶来催化一些底物显色实现目标物检测，但是酶的活性非常容易受到外界条件的干扰。因此，建立一种无酶催化底物显色的比色方法是非常有必要的。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种无酶快速检测卡那霉素的比色检测探针。
本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种利用上述比色检测探针快速检测牛奶中卡那霉素的方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：本检测卡那霉素的比色检测探针，其特征在于：其制备方法包括如下步骤：
(1)将氨基化适配体Apt与氨基化的磁珠MB在偶联剂的作用下结合成捕获探针MB-Apt；所述氨基化适配体Apt的序列为5’-NH2(CH2)6-AGA TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA-3’；
(2)将单链DNA结合蛋白SSB修饰到合成好的金属有机框架MOF-Pt复合材料的表面来形成信号探针MOF-Pt-SSB；
(3)将步骤1的捕获探针和步骤2的信号探针通过单链DNA结合蛋白和适配体Apt之间的亲和性形成复合探针MB-Apt-SSB-MOF-Pt。
进一步地，所述步骤(2)中的金属有机框架MOF-Pt复合材料的合成步骤为：
(1)先合成含铁金属有机骨架化合物Fe-MIL-88；
(2)再合成PVP功能化的Pt NPs；
(3)最后将步骤(2)的Pt NPs-PVP滴入步骤(1)中的Fe-MIL-88溶液中反应2～7h，Pt NPs-PVP与Fe-MIL-88的配比为1:2～4:1，最后离心收集MOF-Pt复合材料；
所述步骤(1)中合成含铁金属有机骨架化合物Fe-MIL-88的方法为：分别称取0.118～0.354g对苯二甲酸和0.187～0.561g FeCl3 .6H2O溶于15～45mL N，N-二甲基甲酰胺中，之后加入3.45～7.9mmol醋酸溶液，油浴110～120℃反应3～4h，冷却到室温收集沉淀；
所述步骤(2)中合成PVP功能化的Pt NPs的方法为：16.6～33.2mg PVP溶解在45～60mL乙醇中，之后将5～10mL氯铂酸逐滴加入，然后在室温下搅拌反应2～5min，最后回流3～7h收集沉淀得Pt NPs-PVP，最后，将Pt NPs-PVP在剧烈搅拌下逐滴加入到Fe-MIL-88溶液中，在室温下反应2～7h，最后离心收集沉淀得到MOF-Pt复合材料。
本发明还提供一种利用比色检测探针检测卡那霉素的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)构建含有已知卡那霉素浓度的检测体系，绘制标准曲线；
(2)将捕获探针MB-Apt与信号探针MOF-Pt-SSB混匀孵育，制备出复合探针MB-Apt-SSB-MOF-Pt，所述捕获探针MB-Apt与信号探针MOF-Pt-SSB按1:2～1:4的比例混匀，并在4～20℃下反应12～24h形成复合探针；
(3)将步骤(2)的复合探针与待测的目标物卡那霉素混匀孵育之后磁性分离取出上清液，所述复合探针与待测的目标物卡那霉素按1:1～1:4的比例混匀；
(4)向步骤(3)中的上清液中加入50～70μL 2～7M双氧水H2O2和50～70μL 5～10mM3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB，测定混合溶液在650nm处吸光度值，并通过步骤(1)中的标准曲线来判断待测的目标物卡那霉素的含量。
进一步地，所述步骤(1)中的检测体系通过以下步骤制备得到：
①制备已知浓度的氯霉素检测体系：取5～10只离心管，各离心管分别加入等体积的复合探针和不同浓度的卡那霉素标准液，充分混匀后置于25-35℃条件下孵育20-40min，之后磁性分离取出上清液；
②制备空白对照体系溶液，取1支离心管将卡那霉素标准液用磷酸缓冲溶液PBS替代，其他按步骤①处理后作为空白对照体系溶液。
本发明的原理在于：本发明采用的试剂主要包括氨基化的适配体序列，对苯二甲酸、氯化铁、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、氯铂酸、PVP、双氧水(H2O2)和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)等。Fe-MIL-88和Pt均具有类过氧化物酶活性，在H2O2存在下可催化一定量TMB生成蓝色产物在650nm左右展现出显著的特征吸收峰。当MOF和Pt结合后会发生协同作用，其类过氧化物酶活性显著增强，使得催化活性更高，颜色变化更加明显，因此使检测方法具有更低的检出限。因此我们利用具有协同作用的MOF-Pt作为信号标签构建了复合探针(MB-AptSSB-MOF-Pt)，当体系中存在卡那霉素时，由于卡那霉素和适配体的亲和性强于适配体和SSB之间的亲和性，因此，KANA/Apt-MOF-Pt复合物会离开复合探针进入到上清液中。由于MOF-Pt可以催化TMB显色，因此反应产物在650nm处有很强的吸光度。由于KANA浓度与上清液中信号标签的浓度是成比例的，所以与测得650nm处的吸光值同样成正比，所以通过测定产物吸光值或通过观察颜色深浅，可以判定KANA的含量。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：该检测方法不需要依赖大型仪器设备，且具有较低的检测限，同时，该比色检测探针还表现出良好的特异性和选择性，该方法操作简单快速，借助手持型比色计就可以实现氯霉素残留的现场检测，并且实验结果肉眼可视。此外，我们还可以通过改变适配体的序列来实现不同抗生素的检测，因而在现场快速检测方面具有很好的应用和发展前景。
附图说明
图1为本发明实施例一中检测卡那霉素的可行性的结果图，图中：a.复合探针+PBSb.复合探针+KANA，其中，复合探针+KANA在650nm处的吸光度最强。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
如图1所示，本实施例包括以下步骤：
(1)制备MOF-Pt复合材料：首先合成Fe-MIL-88，分别称取0.118g对苯二甲酸和0.187g FeCl3 .6H2O溶于15mLDMF中，之后加入3.45mmol醋酸溶液，油浴110℃反应3h，冷却到室温收集沉淀；合成功能化的Pt NPs，16.6mg PVP溶解在45mL乙醇中，之后将5mL氯铂酸逐滴加入，然后在室温下搅拌反应2min，最后回流3h收集沉淀得Pt NPs-PVP；最后，将Pt NPs-PVP在剧烈搅拌下逐滴加入到Fe-MIL-88溶液中，Pt NPs-PVP与Fe-MIL-88的配比为1:2，在室温下反应2h，最后离心收集沉淀得到MOF-Pt复合材料。
(2)制备复合探针溶液：将Apt与MB通过偶联剂结合形成捕获探针，磁性分离去掉多余的Apt和偶联剂。将SSB加入到MOF-Pt溶液中通过偶联剂结合形成信号探针，同样离心去掉未结合的Apt和多余的偶联剂，之后将捕获探针和信号探针按1：2的比例混合在4℃下反应12h形成复合探针。
(3)制备已知卡那霉素浓度的检测体系：取8支1.5mL刻度离心管，分别加入50μL复合探针溶液(复合探针适配体Apt的序列为5’-NH2(CH2)6-AGA TGG GGG TTG AGG CTA AGCCGA-3’和50μL不同浓度的卡那霉素标准液，使得整个检测体系中的卡那霉素含量维持在20ng/mL。上述溶液充分混匀后置于38℃条件下孵育15min，充分反应后磁性分离取上清液留作以下测定用。
(4)另取1支按(1)方法制备的检测溶液，加入50μLPBS缓冲液替代卡那霉素标准液，处理后作为空白对照体系溶液。
(5)分别向步骤(3)和步骤(4)制备的上清液中加入50μL 2M H2O2与50μL 5mM TMB溶液，混匀反应10min，用紫外分管光光度计进行波长扫描，扫描范围为550-750nm，获得其吸收光谱，测定650nm波长处吸光值，其中复合探针+KANA在650nm处的吸光度最强，如图1所示；
(6)以不同浓度的卡那霉素测定的650nm处吸光度作图，绘制标准曲线，可以求得不同样品中卡那霉素的含量，得到线性范围为0.003～20ng/mL，其最低检测限为0.001ng/mL的回归方程为y＝0.6916lgX+0.1787(R2＝0.993)，其中x指卡那霉素浓度(ng/mL)。
(7)制备实际样品检测体系：取50μL随机购买的不同牛奶(分别命名为样品-1和样品-2)样本，按步骤(1)方法制备的复合探针溶液，充分混匀后按步骤(3)方法测定其650nm处吸收峰值。
(8)根据样品测得的吸光度值，查标准曲线，可以求得不同样品中卡那霉素的含量。
(9)实际样本检测效果验证：如表1所示，用本发明方法测定2份随机购买的牛奶样品-1和样品-2，分别往样品中加入0.05ng/mL，1.00ng/mL和1.5ng/mL的卡那霉素，样品-1得到的回收率分别为96.5％，102％和112％，样品-2得到的回收率分别为97.6％，105％和108％，并且RSD均小于2.06％，证明本发明的可靠性。
表1
(10)本发明方法可以测定卡那霉素的浓度范围为0.003～20ng/mL，其最低检测限为0.001ng/mL。
实施例2
本实施例包括以下步骤：
(1)制备MOF-Pt复合材料：首先合成Fe-MIL-88，分别称取0.354g对苯二甲酸和0.561g FeCl3 .6H2O溶于45mLDMF中，之后加入7.90mmol醋酸溶液，油浴120℃反应4h，冷却到室温收集沉淀；合成Pt-PVP，33.2mg PVP溶解在60mL乙醇中，之后将8mL氯铂酸逐滴加入，然后在室温下搅拌反应5min，最后回流5h收集沉淀得Pt NPs-PVP；最后，将Pt NPs-PVP在剧烈搅拌下逐滴加入到Fe-MIL-88溶液中，Pt NPs-PVP与Fe-MIL-88的配比为4:1，在室温下反应6h，最后离心收集沉淀得到MOF-Pt复合材料。
(2)制备复合探针溶液：将Apt与MB通过偶联剂结合形成捕获探针，磁性分离去掉多余的Apt和偶联剂。将SSB加入到MOF-Pt溶液中通过偶联剂结合形成信号探针，同样离心去掉未结合的Apt和多余的偶联剂，之后将捕获探针和信号探针按1：4的比例混合在20℃下反应24h形成复合探针。
(3)制备已知卡那霉素浓度的检测体系：取8支1.5mL刻度离心管，分别加入30μL复合探针溶液(复合探针适配体Apt的序列为5’-NH2(CH2)6-AGA TGG GGG TTG AGG CTA AGCCGA-3’和30μL不同浓度的卡那霉素标准液，使得整个检测体系中的卡那霉素含量维持在10ng/mL。上述溶液充分混匀后置于37℃条件下孵育30min，充分反应后磁性分离取上清液留作以下测定用。
(4)另取1支按(1)方法制备的检测溶液，加入30μLPBS缓冲液替代卡那霉素标准液，处理后作为空白对照体系溶液。
(5)分别向步骤(3)和步骤(4)制备的上清液中加入60μL 7M H2O2与60μL 10mM TMB溶液，混匀反应10min，用紫外分光光度计进行波长扫描，扫描范围为550～750nm，获得其吸收光谱，测定650nm波长处吸光值，其中复合探针+KANA在650nm处的吸光度最强；
(6)以不同浓度的卡那霉素测定的650nm处吸光度作图，绘制标准曲线，可以求得不同样品中卡那霉素的含量，得到线性范围为0.005～20ng/mL，其最低检测限为0.002ng/mL的回归方程为y＝0.7216lgX+0.1026(R2＝0.985)，其中x指卡那霉素浓度(ng/mL)。
(7)制备实际样品检测体系：取50μL随机购买的不同牛奶(分别命名为样品-1和样品-2)样本，按步骤(1)方法制备的复合探针溶液，充分混匀后按步骤(3)方法测定其650nm处吸收峰值。
(8)根据样品测得的吸光度值，查标准曲线，可以求得不同样品中卡那霉素的含量。
(9)实际样本检测效果验证：如表2所示，用本发明方法测定2份随机购买的牛奶样品-1和样品-2，分别往样品中加入0.05ng/mL，1.00ng/mL和1.5ng/mL的卡那霉素，样品-1得到的回收率分别为106％，95.5％和90％，样品-2得到的回收率分别为112％，108％和96％，并且RSD均小于2.15％，证明本发明的可靠性。
表2
(10)本发明方法可以测定卡那霉素的浓度范围为0.005～20ng/mL，其最低检测限为0.002ng/mL。
实施例3
本实施例包括以下步骤：
(1)制备MOF-Pt复合材料：首先合成Fe-MIL-88，分别称取0.253g对苯二甲酸和0.341g FeCl3 .6H2O溶于30mLDMF中，之后加入5.00mmol醋酸溶液，油浴115℃反应4h，冷却到室温收集沉淀；合成Pt-PVP，22.2mg PVP溶解在50mL乙醇中，之后将8mL氯铂酸逐滴加入，然后在室温下搅拌反应3min，最后回流4h收集沉淀得Pt NPs-PVP；最后，将Pt NPs-PVP在剧烈搅拌下逐滴加入到Fe-MIL-88溶液中，Pt NPs-PVP与Fe-MIL-88的配比为2:1，在室温下反应5h，最后离心收集沉淀得到MOF-Pt复合材料。
(2)制备复合探针溶液：将Apt与MB通过偶联剂结合形成捕获探针，磁性分离去掉多余的Apt和偶联剂。将SSB加入到MOF-Pt溶液中通过偶联剂结合形成信号探针，同样离心去掉未结合的Apt和多余的偶联剂，之后将捕获探针和信号探针按1：3的比例混合在14℃下反应20h形成复合探针。
(3)制备已知卡那霉素浓度的检测体系：取8支1.5mL刻度离心管，分别加入40μL复合探针溶液(复合探针适配体Apt的序列为5’-NH2(CH2)6-AGA TGG GGG TTG AGG CTA AGCCGA-3’和40μL不同浓度的卡那霉素标准液，使得整个检测体系中的卡那霉素含量维持在15ng/mL。上述溶液充分混匀后置于35℃条件下孵育20min，充分反应后磁性分离取上清液留作以下测定用。
(4)另取1支按(1)方法制备的检测溶液，加入40μLPBS缓冲液替代卡那霉素标准液，处理后作为空白对照体系溶液。
(5)分别向步骤(3)和步骤(4)制备的上清液中加入70μL 5M H2O2与70μL 6mM TMB溶液，混匀反应10min，用紫外分管光光度计进行波长扫描，扫描范围为550-750nm，获得其吸收光谱，测定650nm波长处吸光值，其中复合探针+KANA在650nm处的吸光度最强；
(6)以不同浓度的卡那霉素测定的650nm处吸光度作图，绘制标准曲线，可以求得不同样品中卡那霉素的含量，得到线性范围为0.005～20ng/mL，其最低检测限为0.002ng/mL的回归方程为y＝0.6251lgX+0.1513(R2＝0.892)，其中x指卡那霉素浓度(ng/mL)。
(7)制备实际样品检测体系：取50μL随机购买的不同牛奶(分别命名为样品-1和样品-2)样本，按步骤(1)方法制备的复合探针溶液，充分混匀后按步骤(3)方法测定其650nm处吸收峰值。
(8)根据样品测得的吸光度值，查标准曲线，可以求得不同样品中卡那霉素的含量。
(9)实际样本检测效果验证：如表3所示，用本发明方法测定2份随机购买的牛奶样品-1和样品-2，分别往样品中加入0.05ng/mL，1.00ng/mL和1.5ng/mL的卡那霉素，样品-1得到的回收率分别为90.2％，98.6％和103％，样品-2得到的回收率分别为108％，111％和96.3％，并且RSD均小于2.58％，证明本发明的可靠性。
表3
(10)本发明方法可以测定卡那霉素的浓度范围为0.005～20ng/mL，其最低检测限为0.002ng/mL。
Claims (4)
1.一种检测卡那霉素的比色检测探针，其特征在于：其制备方法包括如下步骤：
(1)将氨基化适配体Apt与氨基化的磁珠MB在偶联剂的作用下结合成捕获探针MB-Apt；所述氨基化适配体Apt的序列为5’-NH2(CH2)6-AGA TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA-3’；
(2)将单链DNA结合蛋白SSB修饰到合成好的金属有机框架MOF-Pt复合材料的表面来形成信号探针MOF-Pt-SSB；
(3)将步骤1的捕获探针和步骤2的信号探针通过单链DNA结合蛋白和适配体Apt之间的亲和性形成复合探针MB-Apt-SSB-MOF-Pt。
2.根据权利要求1中的检测卡那霉素的比色检测探针，其特征在于：所述步骤(2)中的金属有机框架MOF-Pt复合材料的合成步骤为：
(1)先合成含铁金属有机骨架化合物Fe-MIL-88；
(2)再合成PVP功能化的Pt NPs；
(3)最后将步骤(2)的Pt NPs-PVP滴入步骤(1)中的Fe-MIL-88溶液中反应2～7h，PtNPs-PVP与Fe-MIL-88的配比为1:2～4:1，最后离心收集MOF-Pt复合材料；
所述步骤(1)中合成含铁金属有机骨架化合物Fe-MIL-88的方法为：分别称取0.118～0.354g对苯二甲酸和0.187～0.561g FeCl3 6H2O溶于15～45mL N，N-二甲基甲酰胺中，之后加入3.45～7.90mmol醋酸溶液，油浴110～120℃反应3～4h，冷却到室温收集沉淀；
所述步骤(2)中合成PVP功能化的Pt NPs的方法为：16.6～33.2mg PVP溶解在45～60mL乙醇中，之后将5～10mL氯铂酸逐滴加入，然后在室温下搅拌反应2～5min，最后回流3～7h收集沉淀得Pt NPs-PVP。
3.一种利用如权利要求1所述的比色检测探针检测卡那霉素的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)构建含有已知卡那霉素浓度的检测体系，绘制标准曲线；
(2)将捕获探针MB-Apt与信号探针MOF-Pt-SSB混匀孵育，制备出复合探针MB-Apt-SSB-MOF-Pt，所述捕获探针MB-Apt与信号探针MOF-Pt-SSB按1:2～1:4的比例混匀；并在4～20℃下反应12～24h形成复合探针；
(3)将步骤(2)的复合探针与待测的目标物卡那霉素混匀孵育之后磁性分离取出上清液，所述复合探针与待测的目标物卡那霉素按1:1～1:4的比例混匀；
(4)向步骤(3)中的上清液中加入50～70μL 2～7M双氧水H2O2和50～70μL 5～10mM3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB，测定混合溶液在650nm处吸光度值，并通过步骤(1)中的标准曲线来判断待测的目标物卡那霉素的含量。
4.根据权利要求3所述的比色检测探针检测卡那霉素的方法，其特征在于所述步骤(1)中的检测体系通过以下步骤制备得到：
①制备已知浓度的氯霉素检测体系：取5～10只离心管，各离心管分别加入等体积的复合探针和不同浓度的卡那霉素标准液，充分混匀后置于25～35℃条件下孵育20～40min，之后磁性分离取出上清液；
②制备空白对照体系溶液，取1支离心管将卡那霉素标准液用磷酸缓冲溶液PBS替代，其他按步骤①处理后作为空白对照体系溶液。
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|---|---|
| CN (1) | CN107389568B (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108008128A (zh) * | 2017-12-21 | 2018-05-08 | 江南大学 | 核酸适配体识别和功能化磁性微球分离预处理的卡那霉素快速检测试纸及其制备和应用 |
| CN108548800A (zh) * | 2018-03-16 | 2018-09-18 | 华侨大学 | 一种检测食品中卡那霉素残留量的试剂盒及检测方法 |
| CN110320204A (zh) * | 2018-03-29 | 2019-10-11 | 南京农业大学 | 一种牛奶中卡那霉素残留的比色检测方法 |
| CN110320356A (zh) * | 2018-03-29 | 2019-10-11 | 南京农业大学 | 一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法 |
| CN110618265A (zh) * | 2019-09-12 | 2019-12-27 | 广东省药品检验所（广东省药品质量研究所、广东省口岸药品检验所） | 一种沙丁胺醇的可视化检测方法 |
| CN110702758A (zh) * | 2019-09-27 | 2020-01-17 | 广西师范大学 | 一种增强鳞状细胞癌抗原在电化学发光检测时的发光强度的方法 |
| CN112730323A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-04-30 | 上海交通大学 | 一种新型杂化金属纳米材料，其制备方法及其在基质辅助激光解吸离子化质谱中的应用 |
| CN114460072A (zh) * | 2022-02-11 | 2022-05-10 | 江南大学 | 一种基于纳米酶的比色检测卡那霉素的方法及其应用 |
| CN117571982A (zh) * | 2024-01-09 | 2024-02-20 | 德州学院 | 低背景检测卡那霉素的免标记荧光适配体传感器及其应用 |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060160093A1 (en) * | 2002-12-20 | 2006-07-20 | Willson Richard C Iii | Introduction of structural affinity handles as a tool in selective nucleic acid separations |
| WO2007117444A2 (en) * | 2006-03-31 | 2007-10-18 | Yinghe Hu | Protein detection by aptamers |
| CN101115832A (zh) * | 2004-11-26 | 2008-01-30 | 协和发酵工业株式会社 | 工业上有用的微生物 |
| CN101188942A (zh) * | 2005-03-04 | 2008-05-28 | 生命扫描有限公司 | 成年胰衍生的基质细胞 |
| CN101349670A (zh) * | 2007-07-18 | 2009-01-21 | 宁波大学 | 一种快速测定痕量铝含量的装置及方法 |
| CN101451270A (zh) * | 2008-12-11 | 2009-06-10 | 常振宇 | 一种大批量制备贵金属纳米线的方法 |
| CN102348501A (zh) * | 2009-01-14 | 2012-02-08 | 巴斯夫欧洲公司 | 具有吸气材料的真空绝缘单元 |
| CN104792999A (zh) * | 2015-03-24 | 2015-07-22 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片 |
| CN105056915A (zh) * | 2015-08-07 | 2015-11-18 | 兴义民族师范学院 | 一种核酸适配体修饰磁性金属有机骨架介质的制备及应用 |
| CN109100411A (zh) * | 2018-06-14 | 2018-12-28 | 中国矿业大学 | 一种针对煤可溶有机质的化学计量学分析方法 |
-
2017
- 2017-05-23 CN CN201710370563.3A patent/CN107389568B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060160093A1 (en) * | 2002-12-20 | 2006-07-20 | Willson Richard C Iii | Introduction of structural affinity handles as a tool in selective nucleic acid separations |
| CN101115832A (zh) * | 2004-11-26 | 2008-01-30 | 协和发酵工业株式会社 | 工业上有用的微生物 |
| CN101188942A (zh) * | 2005-03-04 | 2008-05-28 | 生命扫描有限公司 | 成年胰衍生的基质细胞 |
| WO2007117444A2 (en) * | 2006-03-31 | 2007-10-18 | Yinghe Hu | Protein detection by aptamers |
| CN101349670A (zh) * | 2007-07-18 | 2009-01-21 | 宁波大学 | 一种快速测定痕量铝含量的装置及方法 |
| CN101451270A (zh) * | 2008-12-11 | 2009-06-10 | 常振宇 | 一种大批量制备贵金属纳米线的方法 |
| CN102348501A (zh) * | 2009-01-14 | 2012-02-08 | 巴斯夫欧洲公司 | 具有吸气材料的真空绝缘单元 |
| CN104792999A (zh) * | 2015-03-24 | 2015-07-22 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片 |
| CN105056915A (zh) * | 2015-08-07 | 2015-11-18 | 兴义民族师范学院 | 一种核酸适配体修饰磁性金属有机骨架介质的制备及应用 |
| CN109100411A (zh) * | 2018-06-14 | 2018-12-28 | 中国矿业大学 | 一种针对煤可溶有机质的化学计量学分析方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| MIAO YANG BAO: "A homogeneous and "off-on" fluorescence aptamer-based assay for chloramphenicol using vesicle quantum dot-gold colloid composite probes", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》 * |
| 吴彩叶 等: "基于磁性金属有机框架化合物—适配体探针的氯霉素", 《分析化学》 * |
| 栾倩: "基于单链DNA结合蛋白标记的比色方法检测食品中残留氯霉素", 《中国化学会第30届学术年会论文集》 * |
| 秦晓丽: "基于碳基纳米复合材料的电化学适配体传感器的构建及应用", 《CNKI优秀硕士论文》 * |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108008128A (zh) * | 2017-12-21 | 2018-05-08 | 江南大学 | 核酸适配体识别和功能化磁性微球分离预处理的卡那霉素快速检测试纸及其制备和应用 |
| CN108008128B (zh) * | 2017-12-21 | 2020-03-31 | 江南大学 | 核酸适配体识别和功能化磁性微球分离预处理的卡那霉素快速检测试纸及其制备和应用 |
| CN108548800A (zh) * | 2018-03-16 | 2018-09-18 | 华侨大学 | 一种检测食品中卡那霉素残留量的试剂盒及检测方法 |
| CN110320356A (zh) * | 2018-03-29 | 2019-10-11 | 南京农业大学 | 一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法 |
| CN110320204A (zh) * | 2018-03-29 | 2019-10-11 | 南京农业大学 | 一种牛奶中卡那霉素残留的比色检测方法 |
| CN110320356B (zh) * | 2018-03-29 | 2021-10-12 | 南京农业大学 | 一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法 |
| CN110618265A (zh) * | 2019-09-12 | 2019-12-27 | 广东省药品检验所（广东省药品质量研究所、广东省口岸药品检验所） | 一种沙丁胺醇的可视化检测方法 |
| CN110702758A (zh) * | 2019-09-27 | 2020-01-17 | 广西师范大学 | 一种增强鳞状细胞癌抗原在电化学发光检测时的发光强度的方法 |
| CN112730323A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-04-30 | 上海交通大学 | 一种新型杂化金属纳米材料，其制备方法及其在基质辅助激光解吸离子化质谱中的应用 |
| CN112730323B (zh) * | 2020-12-18 | 2022-04-29 | 上海交通大学 | 一种新型杂化金属纳米材料，其制备方法及其在基质辅助激光解吸离子化质谱中的应用 |
| CN114460072A (zh) * | 2022-02-11 | 2022-05-10 | 江南大学 | 一种基于纳米酶的比色检测卡那霉素的方法及其应用 |
| CN114460072B (zh) * | 2022-02-11 | 2023-11-03 | 江南大学 | 一种基于纳米酶的比色检测卡那霉素的方法及其应用 |
| CN117571982A (zh) * | 2024-01-09 | 2024-02-20 | 德州学院 | 低背景检测卡那霉素的免标记荧光适配体传感器及其应用 |
| CN117571982B (zh) * | 2024-01-09 | 2024-04-09 | 德州学院 | 低背景检测卡那霉素的免标记荧光适配体传感器及其应用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107389568B (zh) | 2020-11-10 |
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