CN107340245A - 一种检测食品中土霉素的比色检测探针及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测土霉素的比色检测探针，其制备方法包括如下步骤：(1)将氨基化适配体Apt与氨基化的磁珠MB在偶联剂的作用下结合成捕获探针；(2)将单链DNA结合蛋白SSB修饰到合成好的金属有机框架MOF‑Pt复合材料的表面来形成信号探针；(3)将步骤1的捕获探针和步骤2的信号探针通过单链DNA结合蛋白和适配体Apt之间的亲和性形成复合探针，还提供了该探针在检测土霉素的方法，该检测方法不需要依赖大型仪器设备，且具有较低的检测限，同时，该比色检测探针还表现出良好的特异性和选择性，该方法操作简单快速，借助手持型比色计就可以实现土霉素残留的现场检测，并且实验结果肉眼可视。

Description

一种检测食品中土霉素的比色检测探针及其检测方法
技术领域
本发明涉及环境科学、检验化学及分析化学领域，具体涉及一种基于大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ辅助的目标物循环放大比色策略来检测食品中的土霉素的比色检测探针及其检测方法。
背景技术
土霉素(OTC)作为一种广谱抑菌剂，许多立克次体属、支原体属、衣原体属、螺旋体、阿米巴原虫和某些疟原虫也对该品敏感，该品作用机制为药物能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成。用于痢疾、沙眼、结膜炎、肺炎、中耳炎、皮肤化脓感染等，亦用于治疗阿米巴肠炎及肠道感染。但是当人体内的土霉素累积到一定程度的时候就会产生一定的副作用，比如红斑皮疹，听力减退、耳鸣或耳部饱满感(耳毒性)以及肾毒症等，并且长期体内积累的OTC会让人产生抗药性从而对人体健康构成巨大的威胁。
目前，已经开发了许多检测OTC的方法，常见的有比色法，荧光法(FL)，电化学法(EC)，电化学发光法(ECL)以及高效液相色谱法(HPLC)。其中比色法由于其简单的构建方式以及可以快速反馈结果的优势得到了许多研究者的青睐。更重要的是该方法还具有结果肉眼可视性的优点，使得实验结果更简单、直观。并且在测定过程中不需要使用大型仪器非常容易推广，有很好的普遍性，在现场快速检测方面具有很好的应用和发展前景。但是常见的比色方法是通过辣根过氧化酶来催化一些底物显色实现目标物检测，但是酶的活性非常容易受到外界条件的干扰。因此，建立一种无酶催化底物显色的比色方法是非常有必要的，同时在实际样品的检测中存在许多检测难点，痕量存在并且基质干扰严重，因此构建一种信号放大且特异性强的比色策略依然是非常必要的。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种无酶快速检测土霉素的比色检测探针。
本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种利用上述比色检测探针快速检测食品中土霉素的方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：本检测土霉素的比色检测探针，其特征在于：其制备方法包括如下步骤：
(1)将氨基化适配体Apt与氨基化的磁珠MB在偶联剂的作用下结合成捕获探针MB-Apt；所述氨基化适配体Apt的序列为5’-NH2(CH2)6-GGA ATT CGC TAG CAC GTT GAC GCTGGT GCC CGG TTG TGG TGC GAG TGT TGT GTG GAT CCG AGC TCC ACG TG-3’；
(2)将单链DNA结合蛋白SSB修饰到合成好的金属有机框架MOF-Pt复合材料的表面来形成信号探针MOF-Pt-SSB；
(3)将步骤1的捕获探针和步骤2的信号探针通过单链DNA结合蛋白和适配体Apt之间的亲和性形成复合探针MB-Apt-SSB-MOF-Pt。
进一步地，所述步骤(2)中的金属有机框架MOF-Pt复合材料的合成步骤为：
(1)先合成含铁金属有机骨架化合物Fe-MIL-88；
(2)再合成PVP功能化的Pt NPs；
(3)最后将步骤(2)的Pt NPs-PVP滴入步骤(1)中的Fe-MIL-88溶液中反应2～5h，Pt NPs-PVP与Fe-MIL-88的配比为1:1～1:2，最后离心收集MOF-Pt复合材料；
所述步骤(1)中合成含铁金属有机骨架化合物Fe-MIL-88的方法为：分别称取0.118～0.354g对苯二甲酸和0.187～0.561g FeCl3·6H2O溶于15～45mLN，N-二甲基甲酰胺中，之后加入3.45～7.20mmol醋酸溶液，油浴110～120℃反应3～4h，冷却到室温收集沉淀；
所述步骤(2)中合成PVP功能化的Pt NPs的方法为：16.6～33.2mg PVP溶解在45～60mL乙醇中，之后将5～10mL氯铂酸逐滴加入，然后在室温下搅拌反应2～5min，最后回流3～5h收集沉淀得Pt NPs-PVP。
本发明还提供一种利用比色检测探针检测土霉素的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)构建含有已知土霉素浓度的检测体系，绘制标准曲线；
(2)将捕获探针MB-Apt与信号探针MOF-Pt-SSB混匀孵育，制备出复合探针MB-Apt-SSB-MOF-Pt，所述捕获探针MB-Apt与信号探针MOF-Pt-SSB按1:6～2:1的比例混匀，在3～4℃下反应10～14h；
(3)将步骤(2)的复合探针与待测的目标物土霉素和大肠杆菌核酸外切酶I Exo I混匀孵育之后磁性分离取出上清液，其中复合探针与待测的目标物土霉素按1:1的比例混匀，大肠杆菌核酸外切酶I Exo I的添加量介于0.5～5μL之间；
(4)向步骤(3)中的上清液中加入50～70μL1-5M双氧水H2O2和50～70μL2-7mM 3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB，测定混合溶液在650nm处吸光度值，并通过步骤(1)中的标准曲线来判断待测的目标物土霉素的含量。
进一步地，所述步骤(1)中的检测体系通过以下步骤制备得到：
①制备已知浓度的土霉素检测体系：取5～10只离心管，各离心管分别加入等体积的复合探针和不同浓度的土霉素标准液，大肠杆菌核酸外切酶I Exo I的添加量介于0.5～5μL之间，充分混匀后置于25-35℃条件下孵育20-40min，之后磁性分离取出上清液；
②制备空白对照体系溶液，取1支离心管将土霉素标准液用磷酸缓冲溶液PBS替代，其他按步骤①处理后作为空白对照体系溶液。
本发明的原理在于：本发明采用的试剂主要包括氨基化的适配体序列，对苯二甲酸、氯化铁、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、氯铂酸、PVP、大肠杆菌核酸外切酶I(Exo I)、双氧水(H2O2)和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)等。Fe-MIL-88和Pt均具有类过氧化物酶活性，在H2O2存在下可催化一定量TMB生成蓝色产物在650nm左右展现出显著的特征吸收峰。当MOF和Pt结合后会发生协同作用，其类过氧化物酶活性显著增强，使得催化活性更高，颜色变化更加明显。同时，当适配体捕获了目标物后使得适配体的3’端暴露出来，此时，Exo I可以将适配体剪碎从而释放出目标物来参加下一轮反应，这样实现了一个目标物循环，这种双重放大信号的策略使检测方法具有更低的检出限。因此我们利用具有协同作用的MOF-Pt作为信号标签构建了复合探针(MB-Apt-SSB-MOF-Pt)，当体系中存在土霉素时，由于土霉素和适配体的亲和性强于适配体和SSB之间的亲和性，因此，SSB-MOF-Pt复合物会离开复合探针进入到上清液中，同时MB-Apt/OTC在溶液中形成，当Exo I存在在体系中时可以将适配体从3’到5’消化掉从而将目标物释放出来参加下一个循环反应。由于MOF-Pt可以催化TMB显色，因此反应产物在650nm处有很强的吸光度。由于OTC浓度与上清液中信号标签的浓度是成比例的，所以与测得650nm处的吸光值同样成正比，所以通过测定产物吸光值或通过观察颜色深浅，可以判定OTC的含量。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：该检测方法不需要依赖大型仪器设备，且具有较低的检测限，同时，该比色检测探针还表现出良好的特异性和选择性，该方法操作简单快速，借助手持型比色计就可以实现土霉素残留的现场检测，并且实验结果肉眼可视。此外，我们还可以通过改变适配体的序列来实现不同抗生素的检测，因而在现场快速检测方面具有很好的应用和发展前景。
附图说明
图1为本发明检测方法的示意图；
图2为本发明实施例中检测土霉素的可行性的结果图，图中：a.复合探针 b.复合探针+OTC c.复合探针+OTC+Exo I，其中，复合探针+OTC+Exo I在650nm处的吸光度最强；
图3为本发明实施例一中不同浓度土霉素与650nm吸光度对应关系。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
如图1所示，本实施例包括以下步骤：
(1)制备MOF-Pt复合材料：首先合成Fe-MIL-88，分别称取0.118g对苯二甲酸和0.187g FeCl3·6H2O溶于15mLDMF中，之后加入3.45mmol醋酸溶液，油浴110℃反应3h，冷却到室温收集沉淀；合成Pt-PVP，16.6mg PVP溶解在45mL乙醇中，之后将5mL氯铂酸逐滴加入，然后在室温下搅拌反应2min，最后回流3h收集沉淀得Pt NPs-PVP；最后，将Pt NPs-PVP在剧烈搅拌下逐滴加入到Fe-MIL-88溶液中，Pt NPs-PVP与Fe-MIL-88的配比为1:1，在室温下反应2h，最后离心收集沉淀得到MOF-Pt复合材料。
(2)制备复合探针溶液：将Apt与MB通过偶联剂结合形成捕获探针，磁性分离去掉多余的Apt和偶联剂。将SSB加入到MOF-Pt溶液中通过偶联剂结合形成信号探针，同样离心去掉未结合的Apt和多余的偶联剂，之后将捕获探针和信号探针按1：6的比例混合在4℃下反应10h形成复合探针。
(3)制备已知土霉素浓度的检测体系：取8支1.5mL刻度离心管，分别加入50μL复合探针溶液(复合探针适配体Apt的序列为5’-NH2(CH2)6-ACG TTG ACG CTG GTG CCC GGT TGTGGT GGG AGT GTT GTG T-3’)和50μL不同浓度的土霉素标准液和3μL Exo I，使得整个检测体系中的OTC含量维持在30ng/mL。上述溶液充分混匀后置于37℃条件下孵育30min，充分反应后磁性分离取上清液留作以下测定用。
(4)另取1支按(1)方法制备的检测溶液，加入50μLPBS缓冲液替代土霉素标准液，再加入3μLExo I，处理后作为空白对照体系溶液。
(5)分别向步骤(3)和步骤(4)制备的上清液中加入50μL 2M H2O2与50μL 5mM TMB溶液，混匀反应10min，用紫外分管光光度计进行波长扫描，扫描范围为550-750nm，获得其吸收光谱，测定650nm波长处吸光值，其中复合探针+OTC+Exo I在650nm处的吸光度最强，如图2所示；
(6)以不同浓度的土霉素测定的650nm处吸光度作图，绘制标准曲线，如图3所示。得到线性范围0.0005～30ng/mL，其对应的回归方程为y＝0.6916lgX+0.1787(R2＝0.993)，其中x指土霉素浓度(ng/mL)。
(7)制备实际样品检测体系：如表1所示，取50μL随机购买的不同牛奶(分别命名为样品-1和样品-2)样本，按步骤(1)方法制备的复合探针溶液，充分混匀后按步骤(3)方法测定其650nm处吸收峰值。
(8)根据样品测得的吸光度值，查标准曲线，可以求得不同样品中土霉素的含量。
(9)实际样本检测效果验证：如表1所示，用本发明方法测定2份随机购买的牛奶样品-1和样品-2，分别往样品中加入0.05ng/mL，0.5ng/mL和5ng/mL的土霉素，样品1得到的回收率分别为96％，104％和101.2％，样品2得到的回收率分别为90％，82％和95.6％证明本发明的可靠性。
表1
(10)本发明方法可以测定土霉素的浓度范围为0.0005～30ng/mL，其最低检测限为0.0002ng/mL。
实施例2
如图1所示，本实施例包括以下步骤：
(1)制备MOF-Pt复合材料：首先合成Fe-MIL-88，分别称取0.354g对苯二甲酸和0.561g FeCl3 6H2O溶于45mLDMF中，之后加入7.20mmol醋酸溶液，油浴120℃反应4h，冷却到室温收集沉淀；合成Pt-PVP，33.2mg PVP溶解在60mL乙醇中，之后将10mL氯铂酸逐滴加入，然后在室温下搅拌反应5min，最后回流5h收集沉淀得Pt NPs-PVP；最后，将Pt NPs-PVP在剧烈搅拌下逐滴加入到Fe-MIL-88溶液中，Pt NPs-PVP与Fe-MIL-88的配比为1:2，在室温下反应5h，最后离心收集沉淀得到MOF-Pt复合材料。
(2)制备复合探针溶液：将Apt与MB通过偶联剂结合形成捕获探针，磁性分离去掉多余的Apt和偶联剂。将SSB加入到MOF-Pt溶液中通过偶联剂结合形成信号探针，同样离心去掉未结合的Apt和多余的偶联剂，之后将捕获探针和信号探针按2：1的比例混合在3℃下反应12h形成复合探针。
(3)制备已知土霉素浓度的检测体系：取8支1.5mL刻度离心管，分别加入30μL复合探针溶液(复合探针适配体Apt的序列为5’-NH2(CH2)6-GGA ATT CGC TAG CAC GTT GAC GCTGGT GCC CGG TTG TGG TGC GAG TGT TGT GTG GAT CCG AGC TCC ACG TG-3’)和30μL不同浓度的土霉素标准液和5μL Exo I，使得整个检测体系中的OTC含量维持在20ng/mL。上述溶液充分混匀后置于37℃条件下孵育30min，充分反应后磁性分离取上清液留作以下测定用。
(4)另取1支按(1)方法制备的检测溶液，加入50μLPBS缓冲液替代土霉素标准液，再加入5μLExo I，处理后作为空白对照体系溶液。
(5)分别向步骤(3)和步骤(4)制备的上清液中加入70μL 2M H2O2与70μL 5mM TMB溶液，混匀反应10min，用紫外分管光光度计进行波长扫描，扫描范围为550-750nm，获得其吸收光谱，测定650nm波长处吸光值，其中复合探针+OTC+Exo I在650nm处的吸光度最强；
(6)以不同浓度的土霉素测定的650nm处吸光度作图，绘制标准曲线，如图3所示。得到线性范围0.0005～30ng/mL，其对应的回归方程为y＝0.5498lgX+0.1025(R2＝0.925)，其中x指土霉素浓度(ng/mL)。
(7)制备实际样品检测体系：取50μL随机购买的不同牛奶(分别命名为样品-1和样品-2)样本，按步骤(1)方法制备的复合探针溶液，充分混匀后按步骤(3)方法测定其650nm处吸收峰值。
(8)根据样品测得的吸光度值，查标准曲线，可以求得不同样品中土霉素的含量。
(9)实际样本检测效果验证：如表2所示，用本发明方法测定2份随机购买的牛奶样品-1和样品-2，分别往样品中加入0.05ng/mL，0.5ng/mL和5ng/mL的土霉素，样品1得到的回收率分别为104％，96％和101.6％，样品2得到的回收率分别为120％，86％和96.8％证明本发明的可靠性。
表2
(10)本发明方法可以测定土霉素的浓度范围为0.0005～30ng/mL，其最低检测限为0.0002ng/mL。
实施例3
如图1所示，本实施例包括以下步骤：
(1)制备MOF-Pt复合材料：首先合成Fe-MIL-88，分别称取0.251g对苯二甲酸和0.356g FeCl3 6H2O溶于30mLDMF中，之后加入5.20mmol醋酸溶液，油浴115℃反应4h，冷却到室温收集沉淀；合成Pt-PVP，20.2mg PVP溶解在45mL乙醇中，之后将6mL氯铂酸逐滴加入，然后在室温下搅拌反应3min，最后回流3h收集沉淀得Pt NPs-PVP；最后，将Pt NPs-PVP在剧烈搅拌下逐滴加入到Fe-MIL-88溶液中，Pt NPs-PVP与Fe-MIL-88的配比为1:1.5，在室温下反应3h，最后离心收集沉淀得到MOF-Pt复合材料。
(2)制备复合探针溶液：将Apt与MB通过偶联剂结合形成捕获探针，磁性分离去掉多余的Apt和偶联剂。将SSB加入到MOF-Pt溶液中通过偶联剂结合形成信号探针，同样离心去掉未结合的Apt和多余的偶联剂，之后将捕获探针和信号探针按1：2的比例混合在4℃下反应14h形成复合探针。
(3)制备已知土霉素浓度的检测体系：取8支1.5mL刻度离心管，分别加入60μL复合探针溶液(复合探针适配体Apt的序列为5’-NH2(CH2)6-GGA ATT CGC TAG CAC GTT GAC GCTGGT GCC CGG TTG TGG TGC GAG TGT TGT GTG GAT CCG AGC TCC ACG TG-3’)和60μL不同浓度的土霉素标准液和0.5μL Exo I，使得整个检测体系中的OTC含量维持在15ng/mL。上述溶液充分混匀后置于37℃条件下孵育30min，充分反应后磁性分离取上清液留作以下测定用。
(4)另取1支按(1)方法制备的检测溶液，加入50μLPBS缓冲液替代土霉素标准液，再加入0.5μL Exo I，处理后作为空白对照体系溶液。
(5)分别向步骤(3)和步骤(4)制备的上清液中加入60μL 2M H2O2与60μL5mM TMB溶液，混匀反应10min，用紫外分管光光度计进行波长扫描，扫描范围为550-750nm，获得其吸收光谱，测定650nm波长处吸光值，其中复合探针+OTC+Exo I在650nm处的吸光度最强，如图2所示；
(6)以不同浓度的土霉素测定的650nm处吸光度作图，绘制标准曲线，得到线性范围0.0005～30ng/mL，其对应的回归方程为y＝0.6732lgX+0.1032(R2＝0.953)，其中x指土霉素浓度(ng/mL)。
(7)制备实际样品检测体系：如表1所示，取50μL随机购买的不同牛奶(分别命名为样品-1和样品-2)样本，按步骤(1)方法制备的复合探针溶液，充分混匀后按步骤(3)方法测定其650nm处吸收峰值。
(8)根据样品测得的吸光度值，查标准曲线，可以求得不同样品中土霉素的含量。
(9)实际样本检测效果验证：如表3所示，用本发明方法测定2份随机购买的牛奶样品-1和样品-2，分别往样品中加入0.05ng/mL，0.5ng/mL和5ng/mL的土霉素，样品1得到的回收率分别为106％，98％和99.6％，样品2得到的回收率分别为122％，94％和99.4％证明本发明的可靠性。
表3
(10)本发明方法可以测定土霉素的浓度范围为0.0005～30ng/mL，其最低检测限为0.0002ng/mL。

Claims (4)

1.一种检测土霉素的比色检测探针，其特征在于：其制备方法包括如下步骤：
(1)将氨基化适配体Apt与氨基化的磁珠MB在偶联剂的作用下结合成捕获探针MB-Apt；所述氨基化适配体Apt的序列为5’-NH2(CH2)6-GGA ATT CGC TAG CAC GTT GAC GCT GGTGCC CGG TTG TGG TGC GAG TGT TGT GTG GAT CCG AGC TCC ACG TG-3’；
(2)将单链DNA结合蛋白SSB修饰到合成好的金属有机框架MOF-Pt复合材料的表面来形成信号探针MOF-Pt-SSB；
(3)将步骤1的捕获探针和步骤2的信号探针通过单链DNA结合蛋白和适配体Apt之间的亲和性形成复合探针MB-Apt-SSB-MOF-Pt。
2.根据权利要求1中的检测土霉素的比色检测探针，其特征在于：所述步骤(2)中的金属有机框架MOF-Pt复合材料的合成步骤为：
(1)先合成含铁金属有机骨架化合物Fe-MIL-88；
(2)再合成PVP功能化的Pt NPs；
(3)最后将步骤(2)的Pt NPs-PVP滴入步骤(1)中的Fe-MIL-88溶液中反应2～5h，其中Pt NPs-PVP与Fe-MIL-88的配比为1:1～1:2，最后离心收集MOF-Pt复合材料；
所述步骤(1)中合成含铁金属有机骨架化合物Fe-MIL-88的方法为：分别称取0.118～0.354g对苯二甲酸和0.187～0.561gFeCl3·6H2O溶于15～45mL N，N-二甲基甲酰胺中，之后加入3.45～7.20mmol醋酸溶液，油浴110～120℃反应3～4h，冷却到室温收集沉淀；
所述步骤(2)中合成PVP功能化的Pt NPs的方法为：16.6～33.2mg PVP溶解在45～60mL乙醇中，之后将5～10mL氯铂酸逐滴加入，然后在室温下搅拌反应2～5min，最后回流3～5h收集沉淀得Pt NPs-PVP。
3.一种利用如权利要求1所述的比色检测探针检测土霉素的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)构建含有已知土霉素浓度的检测体系，绘制标准曲线；
(2)将捕获探针MB-Apt与信号探针MOF-Pt-SSB混匀孵育，制备出复合探针MB-Apt-SSB-MOF-Pt，所述捕获探针MB-Apt与信号探针MOF-Pt-SSB按1:6～2:1的比例混匀在3～4℃下反应10～14h；
(3)将步骤(2)的复合探针与待测的目标物土霉素和大肠杆菌核酸外切酶I Exo I混匀孵育之后磁性分离取出上清液，其中复合探针与待测的目标物土霉素按1:1的比例混匀，大肠杆菌核酸外切酶I Exo I的添加量介于0.5～5μL之间；
(4)向步骤(3)中的上清液中加入50～70μL 1～5M双氧水H2O2和50～70μL 2～7mM 3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB，测定混合溶液在650nm处吸光度值，并通过步骤(1)中的标准曲线来判断待测的目标物土霉素的含量。
4.根据权利要求3所述的比色检测探针检测土霉素的方法，其特征在于所述步骤(1)中的检测体系通过以下步骤制备得到：
①制备已知浓度的土霉素检测体系：取5～10只离心管，各离心管分别加入等体积的复合探针和不同浓度的土霉素标准液，大肠杆菌核酸外切酶I Exo I的添加量介于0.5～5μL之间，充分混匀后置于25-35℃条件下孵育20-40min，之后磁性分离取出上清液；
②制备空白对照体系溶液，取1支离心管将土霉素标准液用磷酸缓冲溶液PBS替代，其他按步骤①处理后作为空白对照体系溶液。
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