CN110951832B - 一种利用磁性纳米微球对喷施雾滴飘失或沉积特性检测的试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利用磁性纳米微球对喷施雾滴飘失或沉积特性检测的试剂盒及检测方法，本发明试剂盒含有连接有固定探针的磁性纳米微球、能够与固定探针特异结合的过渡探针、能够与过渡探针特异结合且生物素标记的显色探针。将过渡探针加到喷施液中作为示踪剂，喷施后过渡探针与磁性纳米微球上的固定探针特异性结合；将带有生物素标记的显色探针通过杂交技术结合在过渡探针上，经过显色处理后，通过紫外可见分光光度计读出吸光度后，经标准曲线换算后，可精确计算雾滴的飘失或沉积值。本发明方法利用不同特征序列的脱氧核糖核酸结合的特异性，以及磁性纳米微球可以快速高效的富集收集到的示踪剂，从而实现精准、高效地检测喷施雾滴飘失或沉积特性。

Description

一种利用磁性纳米微球对喷施雾滴飘失或沉积特性检测的试 剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及喷施雾滴检测技术领域，具体地，涉及利用磁性纳米微球对喷施雾滴飘失或沉积特性检测的试剂盒及检测方法。
背景技术
在农业生产中，浇水、施肥、施药是保证丰收不可或缺的部分。食品安全更加严格的今天，人们对食物的要求从过去的解决温饱上升到追求安全、无毒、绿色的食物。从2016年起，“化学肥料和农药的双减增效”被提出，说明我们在使用肥料、农药等保证丰收的同时，也要考虑到其在环境中的残留对环境的影响。“精准化“地施肥用药成为“双减”重要方案之一，农用喷施过程中雾滴的飘失和沉积量检测是对整个喷施过程监控的指标之一。传统的喷施雾滴的飘失和沉积量检测的方法分为定量和半定量的方法。其中定量方法有直接测定法和示踪剂法，半定量方法有纸卡显色法。
直接测定法是指直接将农作物作为喷施药液雾滴的接收器，在喷施后，通过取样收集农作物样本，再经过提取、纯化、富集等步骤，最后利用HPLC-MS、GC-MS等仪器直接检测靶标上的肥料或农药原药量，最后计算出农业雾滴的飘失或者沉积量。该方法精度高，但是所用的仪器高昂，测试流程繁琐、速度慢，采集的样品需要低温保存，不利于远距离测试。
示踪剂法是指在农业喷施液中添加示踪剂，通过在喷施后，收集样品，通过仪器检测洗涤后收集的示踪剂，推算出靶标上的农业雾滴沉积量。常用的示踪剂包括柠檬黄、诱惑红等水溶性染料以及 Brilliant sulphoflavine(BSF)、Pyranin等荧光示踪剂，该方法测试快速，费用低，对药品保存要求不高，是目前农药雾滴沉积检测的常用方法之一，但该方法检测准确性受到示踪剂性质的影响，精准度差，且由于示踪剂为有色染料，喷施过程中易对农作物和检测人员造成颜色污染。
纸卡显色是通过水敏纸、油敏纸、卡罗米特纸卡等作为雾滴接收靶标，然后通过仪器扫描、拍照等方法储存图片格式后计算出纸卡上的覆盖率和覆盖面积，从而推算出雾滴飘失和沉积量。但是该方法存在的无法计算雾滴重复覆盖、弹跳和滚落的情况。
磁性纳米微球是指一类粒径在纳米级带有磁性的微球材料，其核心一般是四氧化三铁或三氧化二铁等超顺磁性材料构成，在磁性内核外层包裹着聚苯乙烯或葡聚糖等高分子材料，再通过化学键连的方式在高分子外层修饰氨基或羧基，使其与生物活性大分子偶联后，接着由于其超顺磁性，利用外加强磁场，可以轻易地对捕获的分子进行富集，对生物大分子实现分析检测、生物识别、蛋白纯化等。磁性纳米微球也广泛应用于化学小分子的分析检测中，利用其超顺磁性的特点实现化学小分子的富集。特征序列的脱氧核糖核酸的结合具有高特异性特点，仅有基因完全互补的两条单链才能完美结合。利用特征序列的单链脱氧核糖核酸作为示踪剂添加到喷施液中，喷施后，利用含有与示踪剂互补的特征序列的单链脱氧核糖核酸修饰的磁性纳米微球对采集样品中的示踪剂进行富集，最后进行显色后，通过简单的荧光检测推算雾滴的飘失和沉积量。
发明内容
本发明涉及一种利用特征序列的单链脱氧核糖核酸作为示踪剂，与示踪剂互补的特征序列的单链脱氧核糖核酸修饰的磁性纳米微球作为富集材料，富集后推算其喷施雾滴的飘失或沉积特性的检测方法。
本发明提供的一种用于农业喷施雾滴飘失和沉积量的检测方法，具体流程如图1所示，采用“三段式”的策略，首先将“固定探针”通过化学键连接的方式固定在磁性纳米微球上，接着将“过渡探针”加入到喷施药箱中，利用培养皿作为雾滴接收器，待喷施过后，用去离子水洗脱培养皿中的雾滴，收集每个培养皿中的洗脱液，然后利用含有固定探针的磁性纳米微球对“过渡探针”示踪剂进行富集，再通过加入对应的显色探针后进行显色后，计算推导出雾滴的飘失或沉积特性。
具体地，本发明提供的一种利用磁性纳米微球检测喷施雾滴飘失或沉积特性的方法，包括以下步骤：
(1)将过渡探针加到喷施液中作为示踪剂；
(2)磁性纳米微球分散放置于待喷施的靶标表面，喷施液喷施后，利用磁性纳米微球富集过渡探针；所述磁性微球上键合有固定探针，该固定探针能够与作为示踪剂的过渡探针特异性结合；
(3)将带有生物素标记的显色探针通过杂交技术结合在对应的过渡探针上，显色处理后，通过紫外可见分光光度计读出吸光值，标准曲线换算后，计算雾滴飘失或沉积特性；
所述过渡探针不经生物素修饰，具有能够分别与上述固定探针和显色探针互补配对的核苷酸序列，并且固定探针与显色探针不特异结合。
本发明的方法中，所述过渡探针和固定探针均为特征序列的单链脱氧核糖核酸；其中过渡探针的长度为24-50nt，固定探针的长度为12-25nt，固定探针的一端加氨基或者羧基修饰，另一端与磁性纳米微球表面键合。
其中，显色探针与过渡探针的互补配对碱基为15-40nt；若固定探针是5’标记，则显色探针为3’生物素标记，若固定探针是3’标记，则显色探针为5’生物素标记。
固定探针的长度为18-20nt，过渡探针与固定探针的互补配对碱基为15-25nt。
本发明磁性纳米微球处理过程中用的的试剂为：10-20％(优选为15％)EDC溶液(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、 0.025-0.2μM(优选为0.03μM)固定探针溶液、NaCl溶液(优选为0.1 M)、1-6M NaOH溶液(优选为5M)。
本发明方法中，步骤(2)所述磁性纳米微球，是通过以下方式制备得到的：磁性纳米微球用纯水和DMF(N,N-二甲基甲酰胺)分别利用超声清洗3次后，加入0.02-0.15M NaCl溶液，磁性纳米微球改性剂溶液，1-6M NaOH溶液，并调节pH至6-8，25℃反应3-5 h，用无水DMF洗涤，接着向体系中加入无水DMF和10-20％EDC 后，25℃反应3-5h,再用无水DMF洗涤、无水DMAC(N,N-二甲基乙酰胺)洗涤，加入含有0.025-0.2mM固定探针的NaHCO3溶液中浸泡1-3h；再加入的1-6M的NaOH溶液浸泡膜1-3h，清洗，晾干后即得带有固定探针的磁性纳米微球。
所述磁性纳米微球其磁核为三氧化二铁、四氧化三铁、氧化亚铁或铁钡合金带有超顺磁性的金属材料；其表面修饰为氨基或羧基；磁性纳米微球粒径为10-200nm，优选为100nm。
所述磁性纳米微球改性剂溶液为长链的双羧酸酸酐溶液如丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、顺丁烯二酸酐等；所述喷施雾滴为农药、液体肥料或其他液体制剂。
在喷施液配制流程中，喷施液中主要含有：0-60％的农药制剂或液体肥料(也可直接使用水)，0.025-0.1μM(优选为0.60μM)的过渡探针，0-0.045mol/L的离子缓冲液，0-0.15％的表面活性剂(若是使用农药或肥料制剂，由于本身含有表面活性剂和离子缓冲液，直接添加过渡探针即可；若是直接用水作为喷施液，则需添加一定量的离子缓冲液和表面活性剂)，主要剂型为水基制剂和油基制剂。
所述的农药剂型包括水剂、油剂、可湿性粉剂、微胶囊剂、水悬浮剂、油悬浮剂等；其中农药类型包括杀虫剂、杀菌剂、除草剂、杀螨剂、杀线虫剂等。
所述的液体肥料包括清液型、悬浮型、叶面肥料等；其中肥料类型为氮肥、磷肥、钾肥中的一种或者两种、多种复合肥料。
所述的过渡探针为24-50nt(优选为36-40nt)的特征序列的单链脱氧核糖核酸。
所述的离子缓冲液是一种或多种无机盐、有机盐配成的缓冲溶液，其中溶液阴离子为碳酸根、碳酸氢根、磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、柠檬酸根、柠檬酸二氢根等的一种或几种，阳离子为钾离子、钠离子、锂离子、钙离子等的一种或几种。
所述的表面活性剂是烷基磺酸钠、拉开粉、茶枯粉、皂角粉、 SDS(十二烷基硫酸钠)、Morwet EFW(丁基萘磺酸钠)、Morwet 1004 等的一种或几种。
所述的显色流程中，使用的试剂有：杂交液、洗液、0.05-0.20μM (0.20μM)显色探针溶液、过氧化氢酶液、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺
(TMB)单组分液。
所述的杂交液主要成分为0.02-0.045mol/L的离子缓冲液，
0.06-0.15％的表面活性剂。
所述的洗液主要成分为5.0-10.0mol/L的离子缓冲液，0.02-0.20％的表面活性剂。
所述的离子缓冲液是一种或多种无机盐、有机盐配成的缓冲溶液，其中溶液阴离子为碳酸根、碳酸氢根、磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、柠檬酸根、柠檬酸二氢根等的一种或几种，阳离子为钾离子、钠离子、锂离子、钙离子等的一种或几种。
所述的表面活性剂是烷基磺酸钠、拉开粉、茶枯粉、皂角粉、 SDS(十二烷基硫酸钠)、Morwet EFW(丁基萘磺酸钠)、Morwet 1004 等的一种或几种。
所述的显色探针为12-25nt(优选为18-20nt)的特征序列的单链脱氧核糖核酸。
所述的TMB单组分液的主要成分为：0.5-2.0mM(优选为1.0 mM)TMB，0.5-2.0mM(优选为1.0mM)氧化剂，150-300mM(优选为200mM)离子缓冲液，0.1-0.5mM稳定剂。具体配置如下：a 液：称取TMB和稳定剂，加入DMSO将其溶解；b液：用去离子水溶解配成离子缓冲液，加入氧化剂后,用盐酸调节pH至4.0-6.0。配置好后，使用前按一定比例将a、b两液配制得到TMB单组分液。
所述的氧化剂是过氧化氢、尿素过氧化氢、过氧乙酸、叔丁基过氧化氢、二甲基二氧杂环丙烷等一种或几种。
所述的离子缓冲液是一种或多种无机盐、有机盐配成的缓冲溶液，其中溶液阴离子为碳酸根、碳酸氢根、磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、柠檬酸根、柠檬酸二氢根等的一种或几种，阳离子为钾离子、钠离子、锂离子、钙离子等的一种或几种。
所述的稳定剂是硼氢化钠、氰基硼氢化钠、四丁基硼氢化铵 (TBABH)、三仲丁基硼氢化锂、硼氢化锂等的一种或几种。
本发明检测方法的各个具体流程如下：
1)含有固定探针磁性纳米微球的制备流程：
磁性纳米微球的制备流程：磁性纳米微球用纯水和DMF分别利用超声清洗3次后，加入0.15M NaCl溶液，磁性纳米微球改性剂溶液，用3M NaOH溶液调节pH至6-8(优选为7.5)，25℃反应3-5 h。用无水DMF洗涤5次，分别加入无水DMF、EDC后，25℃反应3-5h,再用无水DMF洗涤1次、无水DMAC洗涤4次，加入含有 0.125mM固定探针的NaHCO3溶液中浸泡1-3h；再加入的1M NaOH溶液浸泡膜1-3h，清洗，晾干后得带有固定探针的磁性纳米微球。
2)、喷施流程：喷施液配制，在药箱中加入农药制剂、液体肥料或者水，然后加入过渡探针，是其最终浓度为0.6μM，加水后将其混匀，最后根据农药制剂或喷施设备需要，加入表面活性剂和离子缓冲液配制成过渡探针喷施液。经过喷施后，将培养皿中的喷施雾滴用清水转移到离心管中储存待测。
3)、将按步骤1)制好的磁性纳米微球加入到喷施液储存的离心管中，涡旋5min后，在34-37℃下孵育60min，用磁力架吸住磁性微球，移除上清液后，用洗液清洗磁珠3次后，加入含有0.15μM 显色探针的杂交液中30-40℃条件下反应5-15min；用磁力架吸住磁性微球，移除上清液后，用洗液清洗磁珠3次后，取15uL过氧化氢酶液加入到杂交液中配置酶液，37℃酶联反应15-20min；用磁力架吸住磁性微球，移除上清液后，用杂交液清洗磁珠3次后，加入TMB单组分液进行显色反应。最后利用紫外可见分光光度仪读出吸光值。
4)标准曲线建立：取5个离心管，分别加入1μL，2μL，4μL， 8μL，16μL的过氧化氢酶，加入TMB单组分液进行显色反应。最后利用紫外可见分光光度仪读出吸光值。最后以过氧化氢酶体积作为横坐标，总吸光值作为纵坐标，绘制标准曲线，并计算出相应的线性方程。
基于本发明的上述检测方法，本发明还提供了一种检测喷施雾滴飘失或沉积特性的试剂盒，含有磁性纳米微球，过渡探针、显色探针；所述磁性纳米微球为键合有固定探针的磁性纳米微球，固定探针长度为12-25nt，其一端加氨基或羧基修饰，另一端与磁性纳米微球的羧基或氨基键合；所述过渡探针的长度为24-50nt；所述显色探针3’或5’端标记生物素，且显色探针能够与过渡探针特异结合，不能与固定探针特异结合。
本发明利用“三段式”反向斑点杂交技术的策略，将特征序列的单链脱氧核糖核酸作为示踪剂加入到喷施液中，在喷施收集样品后，利用磁性纳米微球对收集到的过渡探针进行富集，然后通过显色，推算得到喷施雾滴中的飘失和沉积量。本发明检测方法的有益效果主要体现在：(1)、本发明以特征序列的单链脱氧核糖核酸作为示踪剂，避免了现有荧光性示踪剂易光解、易造成污染缺点步骤；(2)、解决了现有示踪剂在洗脱、富集等前处理上的繁琐操作；(3)现有的荧光示踪剂在检测过程中，精确性差，难以实现精准检测，通过利用互补特征序列的单链脱氧核糖核酸的传递显色，可以实现农业喷施雾滴飘失和沉积量的高精度检测。
总而言之，相较常规方法而言，本发明以无污染、快速、方便、易操作的方式成功实现对农业喷施雾滴本的飘失或沉积特性的精准检测，帮助提高农药利用率，减少环境污染，完善施药技术体系，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1为本发明利用磁性纳米微球检测喷施雾滴飘失或沉积特性的技术原理流程图。
图2为本发明检测方法标准曲线建立结果。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1检测喷施雾滴飘失或沉积特性的方法
本发明检测喷施雾滴飘失或沉积特性方法的流程图见图1。具体为：利用不同特征序列的脱氧核糖核酸结合具有的特异性，设计出一系列不同的特征序列的单链脱氧核糖核酸作为固定探针与磁性纳米微球键合，将与能够与固体探针互补配对的特征序列的单链脱氧核糖核酸(过渡探针)作为示踪剂加入到喷施液中，在喷施后，通过磁性纳米微球收集过渡探针，显色后，通过紫外可见分光光度计读出吸光度后，经标准曲线换算后，可得到喷施液的雾滴沉积量等信息。最后通过计算机图像处理软件处理即可计算出对应的沉积量。
1、探针的确定
固定探针的长度为12-25nt，优选18-20nt，固定探针的一端加氨基或羧基修饰，另一端与基底材料的羧基或氨基裸露端共价结合。
过渡探针为24-50nt(优选为36-40nt)的特征序列的单链脱氧核糖核酸，不经生物素修饰。过渡探针与固定探针的互补配对碱基为 15-25nt。
显色探针为12-25nt(优选为18-20nt)的特征序列的单链脱氧核糖核酸。显色探针与过渡探针的互补配对碱基为15-40nt；若固定探针是5’标记，则显色探针为3’生物素标记，若固定探针是3’标记，则显色探针为5’生物素标记。
显色探针能够与过渡探针特异结合，不能与固定探针特异结合。表1中的三种探针序列为示例，除了表1中探针的核苷酸序列外，凡是能满足上述要求的单链脱氧核糖核酸序列都可以用于本申请中的探针。
表1 5’-氨基修饰的固定探针序列及其配套的两种探针简单实例
Figure BDA0001811185960000091
Figure BDA0001811185960000101
2、制备键合有固定探针的磁性纳米微球
磁性纳米微球的制备流程：磁性纳米微球用纯水和DMF分别利用超声清洗3次后，加入0.15M NaCl溶液，磁性纳米微球改性剂溶液，用3M NaOH溶液调节pH至6-8(优选为7.5)，25℃反应3-5 h。用无水DMF洗涤5次，分别加入无水DMF、EDC后，25℃反应3-5h,再用无水DMF洗涤1次、无水DMAC洗涤4次，加入含有 0.125mM固定探针的NaHCO3溶液中浸泡1-3h；再加入的1M NaOH溶液浸泡膜1-3h，清洗，晾干后得带有固定探针的磁性纳米微球。
3、喷施液的配制和喷施
在喷施液配制流程中，喷施液中主要含有：0-60％的农药制剂或液体肥料(也可直接使用水)，0.025-0.1μM(优选为0.60μM)的过渡探针，0-0.045mol/L的离子缓冲液，0-0.15％的表面活性剂(若是使用农药或肥料制剂，由于本身含有表面活性剂和离子缓冲液，直接添加过渡探针即可；若是直接用水作为喷施液，则需添加一定量的离子缓冲液和表面活性剂)。最后根据农药制剂或喷施设备需要，加入表面活性剂和离子缓冲液配制成过渡探针喷施液。经过喷施后，将培养皿中的雾滴用清水洗脱后转移到离心管中储存待测。
4、本发明标准曲线的建立
标准曲线建立：取5个离心管，分别加入1μL，2μL，4μL，8 μL，16μL的过氧化氢酶，加入50ml TMB单组分液进行显色反应。最后利用紫外可见分光光度仪读出吸光值。最后以过氧化氢酶体积作为横坐标，总吸光值作为纵坐标，绘制标准曲线，并计算出相应的线性方程。具体结果见图2，其线性方程为y＝0.1198x+0.091,线性相关系数为0.99，达到作为定量检测的标准曲线要求。
5、显示方法、计算飘失或沉积特性数值
将制好的磁性纳米微球加入到喷施液收集储存的离心管中，涡旋5min后，在34-37℃下孵育60min，用磁力架吸住磁性微球，移除上清液后，用洗液清洗磁珠3次后，加入含有0.15μM显色探针的杂交液中30-40℃条件下反应5-15min；用磁力架吸住磁性微球，移除上清液后，用洗液清洗磁珠3次后，取15μL过氧化氢酶液加入到杂交液中配置酶液，37℃酶联反应15-20min；用磁力架吸住磁性微球，移除上清液后，用杂交液清洗磁珠3次后，加入TMB单组分液进行显色反应。最后利用紫外可见分光光度仪读出吸光值，在将吸光值带入到标准曲线中换算得出沉积量。
实施例2农药喷施雾滴沉积量测定实验
在喷雾天车运行轨迹下方的铁架台上放置2个培养皿，设A、B 两个平行对照组。处于喷雾天车运行轨迹正中间。在压力3bar下，使用喷雾天车(速度：5km/h、高度：0.5m)安装Lechler ST110-03 常规扇形雾喷头进行喷雾(喷施液配制参见实施例1)。待喷雾结束后分别收集实验样本，按照实施例1的显色方法对样本进行显色。通过紫外可见分光光度仪读出对应的吸光值后，经过标曲换算得到沉积量(具体结果见表2)。
在喷雾天车运行轨迹下方的铁架台上放置培养皿，一个培养皿中放置直径9厘米的滤纸，一个为空的培养皿，间隔放置，共放置8 个培养皿。处于喷雾天车运行轨迹正中间。在压力3bar下，使用喷雾天车(速度：5km/h、高度：0.5m)安装Lechler ST110-03常规扇形雾喷头进行喷雾(喷雾液为含有1g/L BSF的过渡探针喷施液)。待喷雾结束后分别收集实验材料。用去离子水(10ml)洗涤空培养皿，溶液倒入自封袋中，10min后使用荧光光谱仪测试每个自封袋内溶液的荧光值；将每段滤纸分装到自封袋中，向自封袋中添加去离子水(10ml)，摇匀10min后使用荧光光谱仪测试每个自封袋内溶液的荧光值。带入标准曲线后计算出沉积量(具体结果见表2)。
结果显示，同传统的BSF方法相比，磁性纳米微球同样可以已高平行性对沉积雾滴进行检测。但是，本发明的方法的灵敏度较高、检出限和定量限低，所以喷施液中的示踪剂(过渡探针)的量大大下降，降低污染；同时本发明采取的磁性纳米微球富集的方式在操作上更加简单便捷，重复率高。
表2农药喷施雾滴沉积量测定实验结果
平行组 A B BSF
吸光值 0.37 0.36 -
沉积量μL/cm<sup>2</sup> 2.29 2.23 2.15
理论沉积量μL/cm<sup>2</sup> 2.86 2.86 2.86
比率(计算值/理论值) 0.80 0.78 0.75
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种利用磁性纳米微球对喷施雾滴飘失或沉积特性检测的试剂盒及检测方法
<130> KHP181113903.7
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (7)

1.一种利用磁性纳米微球检测喷施雾滴飘失或沉积特性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将过渡探针加到喷施液中作为示踪剂；
（2）步骤（1）的喷施液喷施后，收集待喷施的靶标表面的喷施液，将磁性纳米微球加到收集的喷施液中，利用磁性纳米微球富集过渡探针；所述磁性微球上键合有固定探针，该固定探针能够与作为示踪剂的过渡探针特异性结合；
（3）将带有生物素或者酶标记的显色探针加入到步骤（2）含有磁性纳米微球的收集的喷射液中，通过杂交技术结合在对应的过渡探针上，显色处理后，通过紫外可见分光光度计读出吸光值，标准曲线换算后，计算雾滴飘失或沉积量；
所述过渡探针、固定探针和显色探针均为特征序列的单链脱氧核糖核酸；所述过渡探针不经生物素修饰，具有能够分别与上述固定探针和显色探针互补配对的核苷酸序列，并且固定探针与显色探针不特异结合，若固定探针是5’氨基修饰，则显色探针为3’生物素标记，若固定探针是3’氨基修饰，则显色探针为5’生物素标记；
所述过渡探针的长度为24-50 nt，固定探针的长度为12-25 nt，显色探针的长度为12-25nt。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述磁性纳米微球，是通过以下方式制备得到的：磁性纳米微球用纯水和DMF分别利用超声清洗3次后，加入0.02-0.15 M NaCl溶液，磁性纳米微球改性剂溶液，1-6 M NaOH溶液, 并调节pH至6-8，25℃反应3-5 h，用无水DMF洗涤，接着向体系中加入无水DMF和10-20% EDC后，25℃反应3-5h,再用无水DMF洗涤、无水DMAC洗涤，加入含有0.025-0.2 mM固定探针的NaHCO3溶液中浸泡1-3 h；再加入的1-6M的NaOH溶液浸泡膜1-3 h，清洗，晾干后即得带有固定探针的磁性纳米微球。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述磁性纳米微球其磁核为三氧化二铁、四氧化三铁、氧化亚铁或铁钡合金带有超顺磁性的金属材料；其表面修饰为氨基或羧基；磁性纳米微球粒径为10-200 nm。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述磁性纳米微球粒径为100 nm。
5.如权利要求2所述的检测喷施雾滴飘失或沉积特性方法，其特征在于，所述磁性纳米微球改性剂溶液为长链的双羧酸酐溶液；所述喷施雾滴为农药、液体肥料或其他液体制剂。
6.如权利要求1所述的检测喷施雾滴飘失或沉积特性方法，其特征在于，步骤（1）喷施液中过渡探针的最终浓度为0.025-0.1 μM。
7.一种检测喷施雾滴飘失或沉积量的试剂盒，其特征在于，含有磁性纳米微球，过渡探针、显色探针；所述磁性纳米微球为键合有固定探针的磁性纳米微球，所述过渡探针、固定探针和显色探针均为特征序列的单链脱氧核糖核酸；固定探针长度为12-25 nt，其一端加氨基或羧基修饰，能够与磁性纳米微球的羧基或氨基键合；若固定探针是5’标记，则显色探针为3’生物素标记，若固定探针是3’标记，则显色探针为5’生物素标记；
所述过渡探针的长度为24-50 nt；所述显色探针的长度为12-25nt，能够与过渡探针特异结合，不能与固定探针特异结合。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5499198A (en) * 1993-08-31 1996-03-12 The Dow Chemical Company Method for predicting spray drift
CN1693411A (zh) * 2005-04-29 2005-11-09 同济大学 一种荧光微球及其喷雾干燥制备方法和应用
CN103207196A (zh) * 2013-03-21 2013-07-17 中国农业大学 一种观测农药雾滴在靶标表面沉积状态的方法
EP2644703A1 (en) * 2012-03-26 2013-10-02 ETH Zurich Molecular code system
CN103969322A (zh) * 2014-05-04 2014-08-06 江苏省农业科学院 利用过渡金属配合物的农药沉积量测定方法
CN107340245A (zh) * 2017-05-23 2017-11-10 宁波大学 一种检测食品中土霉素的比色检测探针及其检测方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5499198A (en) * 1993-08-31 1996-03-12 The Dow Chemical Company Method for predicting spray drift
CN1693411A (zh) * 2005-04-29 2005-11-09 同济大学 一种荧光微球及其喷雾干燥制备方法和应用
EP2644703A1 (en) * 2012-03-26 2013-10-02 ETH Zurich Molecular code system
CN103207196A (zh) * 2013-03-21 2013-07-17 中国农业大学 一种观测农药雾滴在靶标表面沉积状态的方法
CN103969322A (zh) * 2014-05-04 2014-08-06 江苏省农业科学院 利用过渡金属配合物的农药沉积量测定方法
CN107340245A (zh) * 2017-05-23 2017-11-10 宁波大学 一种检测食品中土霉素的比色检测探针及其检测方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A DNA Tracer System for Hydrological Environment Investigations;Renkuan Liao et al.;《ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY》;20180223;第1695-1703页 *
Spray Droplet Characterization from a Single Nozzle by High Speed Image Analysis Using an In-Focus Droplet Criterion;Sofija Vulgarakis Minov et al.;《sensors》;20160206;第1-19页 *
Ultrasensitive Quantification of Pesticide Contamination and Drift Using Silica Particles with Encapsulated DNA;Carlos A. Mora, Wendelin J. Stark, et al.;《ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY LETTERS》;20151104;第3卷(第1期);第19-20页 *
几种喷雾效果检测技术的对比分析;刘定平，陈沛东;《自动化仪表》;20120831;第33卷(第8期);第1-4页 *
喷雾作业效果检测方法的研究;张宁;《南方农业》;20150630;第9卷(第18期);第62-63页 *
水稻田农药喷雾分布与雾滴沉积量的试验分析;宋淑然等;《农业机械学报》;20041130;第35卷(第6期);第90-93页 *

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