CN101892290A - 苯丙氨酸定量检测试剂盒(酶定量法) - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于苯丙氨酸脱氢酶检测新生儿苯丙酮尿症的筛查试剂,该发明所属技术领域:生物、医药和医疗器械。本发明的目的:1、新生儿苯丙酮尿症筛查的酶定量法检测试剂盒,克服细菌抑制法半定量、荧光法试剂易受自然物质中荧光素干扰缺点。2、创新技术a、利用冷冻真空干燥技术将L-苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)由液态转变为固态从而提高了试剂盒的有效期。该项技术指标达到国外先进水平。b、利用冷冻真空干燥技术,将辅酶(NAD+)由液态转变为固态,从而大大提高了试剂盒的稳定性。c、利用波长450nm下进行读数,适用于所有的酶标仪,改变了国外进口试剂必须使用570nm的滤光片的局限。此项技术处于国际领先水平。
Description
技术领域
本发明涉及临床化学诊断试剂应用设备技术领域,属于一种基于利用高比活性和高得率的L-苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)的新技术而进行开发生产的用于新生儿苯丙酮尿症检测项目的筛查试剂盒。
背景技术
目前,公知的现在国内用于检测新生儿血中苯丙氨酸浓度最广泛的实验方法是细菌抑制法和荧光法、酶法。
细菌抑制法存在的不足,该方法是一种半定量方法,主观性强,灵敏度低,实验时间较长等,另外,人工处理检验数据,手工登记检验记录,不利于数据的存储和备查,给新生儿疾病中心规范化管理带来潜在风险。而荧光法试剂易受自然物质中存在的荧光干扰并且需额外添置昂贵试验检测设备的缺点。
介于上述两种方法的不足,我们在国内首次成功开发出用于新生儿苯丙酮尿症筛查的酶法定量检测试剂盒,成功的克服了细菌抑制法、荧光法在筛查工作中的诸多缺点,以利于使用单位更好的、更准确开展新生儿筛查工作。
发明内容
1、将球形芽孢杆菌的pdh基因克隆到大肠杆菌pET系统并进行表达,通过活性蓝4纯化获得高比活性和高得率的L-苯丙氨酸脱氢酶(PheDH),基于该酶开发的新生儿苯丙酮尿症筛查试剂的技术指标达到国外先进水平,其(与美国Bio-Rad公司试剂方法学比较r>0.9)。
2、筛选出的底物显色系统,生成的产物可以在波长450nm下进行读数,适用于所有医院常规使用的酶标仪,而无须更换滤光片,改变了国外进口试剂必须使用570nm的滤光片的局限。此项技术处于国外先进水平。
3、利用冷冻真空干燥技术,将L-苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)和辅酶(NAD+)由液态转变为固态,从而大大提高了试剂盒的有效期及稳定性。
本发明的目的是提供一种结果准确可靠、无创伤性、安全、灵敏度高、无需添置大型检测设备,使用成本低的新生儿筛查试剂盒。该试剂盒实验机理是采用三氯醋酸(TCA)从滤纸干血片中萃取苯丙氨酸。苯丙氨酸被苯丙氨酸脱氢酶转化成苯丙酮酸。这个反应伴随着反应混合物中存在的辅酶NAD+减少,生成NADH,这个氧化还原反应中把添加的黄色四唑盐转化成黄色物质Formazane。Formazane的量与样本中苯丙氨酸的量成正比。使用酶标仪检测其光密度值,即可换算成其对应的苯丙氨酸浓度值,酶标仪波长使用450nm。另外该试剂盒的成本只是进口试剂盒的四分之三。能够促进我国新生儿苯丙酮尿症筛查项目的大规模开展。让每个新生儿都能接受检查。减少国家和社会的压力,为提高全民人口素质做出我们的贡献。
为实现上述目的,本发明技术方案为:一种用于检测新生儿血中苯丙氨酸浓度的酶定量法检测试剂盒,其特征在于:所述试剂盒由酶稀释液(Triton X-100缓冲液)、底物(四唑盐)、中和液(碳酸盐缓冲液)、三氯醋酸溶液、酶、辅酶、96孔微孔板、标准血片、质控血片、盖膜组成。
所述酶稀释液包括:Triton X-100、三乙醇胺、碳酸钠、无水碳酸氢钠,其配制方法:
1、Triton X-100溶液:用加样器吸取Triton X-100若干加入少量0.1M碳酸缓冲液溶解,用0.1M碳酸缓冲液定溶。2~8℃冰箱保存备用。
2、三乙醇胺溶液:用加样器取三乙醇胺液若干加0.1M碳酸缓冲液。定溶。
3、按规程向试剂瓶中加三乙醇胺溶液,再向瓶内等量加入TritonX-100溶液,混匀,将配制好的酶稀释液瓶盖拧死,放入2~8℃冰箱保存备用,可保存18个月。
所述底物液其配制方法为:
1、取四唑盐纯品。按规程向瓶内加入双蒸水若干,充分溶解待用;
2、取出配制好的溶液若干再按规程加入双蒸水若干,混匀,分装,拧紧瓶盖后放入2~8℃冰箱备用,可保存18个月。溶解后剩余的四唑盐溶液放入-20℃保存。
该试剂的配制方法创新点在于,用规定量四唑盐纯品与相应量的双蒸水进行配制获得底
物,利用筛选出的底物显色系统在与一定浓度和特定Ph值的中和液反应时生成的产物可以
在波长450nm下进行读数,适用于所有的酶标仪,而无须更换滤光片,改变了国外进口试
剂必须使用570nm的滤光片的局限。此项技术处于国际领先水平。
所述的中和液其配制方法:
1、用分析天平准确称取碳酸钠若干,无水碳酸氢钠若干;加少量双蒸水溶解后定溶,pH10.6。获得0.1M碳酸缓冲液;
2、用量筒量取0.1M碳酸缓冲液若干毫升,用0.1M氢氧化钠将pH调至11.7,按照规定进行中和液分装,拧紧瓶盖放入2~8℃,可保存18个月。
所述的三氯醋酸溶液配制方法:
用分析天平准确称取三氯醋酸若干,一定量双蒸水溶解后,定溶于1000ml。按照规定量进行三氯醋酸溶液的分装,拧紧瓶盖放入2~8℃冰箱,可保存18个月。
所述酶(苯丙氨酸脱氢酶)配制方法:
1)将球形芽孢杆菌的pdh基因克隆到大肠杆菌pET系统并进行表达,通过活性蓝4纯化获得高比活性和高得率的L-苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)液体。
2)取50ml烧杯一只,将瓶内的苯丙氨酸脱氢酶液全部转移到烧杯内。向原瓶内加入25mMPB若干,将瓶子轻轻旋转后将瓶内液体尽量吸出,转移到烧杯内,重复以上程序3次,最后将瓶内液体吸干净。
3)向烧杯内再加入25mM PB若干,轻轻摇匀,避免泡沫。
4)取清洗干净的2ml玻璃瓶,用移液器向每只瓶内加苯丙氨酸脱氢酶溶液0.5ml,放入冷冻干燥机预冻(-40~-45℃)2小时后冷冻干燥24小时。干燥后放-20℃储存可保存18个月。
该试剂的配制方法与国外试剂不同点在于:将球形芽孢杆菌的pdh基因克隆到大肠杆菌
pET系统并进行表达,通过活性蓝4纯化获得高比活性和高得率的L-苯丙氨酸脱氢酶
(PheDH),利用冷冻真空干燥技术,将L-苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)液体转变为固体,从
而
大大提高了试剂盒的有效期和稳定性。而且该试剂的配制创新发明不仅仅只限于运用到新
生儿筛查试剂盒中,鉴于其基因表达的高特异性、高灵敏度、高活性,还可以将其使用到与
之相关的其它产品内。基于该酶开发的试剂的技术指标目前达到国外先进水平。
所述辅酶冻干粉,包括辅酶NAD+和心肌黄酶,其配制方法:
辅酶NAD+的稀释方法:
1)辅酶NAD+纯品若干。向瓶内加入25mM PB 1ml,浓度为10g/ml,待充分溶解。
2)取200ml烧杯一只,先将瓶内的辅酶NAD+尽量吸出到烧杯内。向原瓶内加25mM PB1ml,将瓶子轻轻旋转后将瓶内液体尽量吸出到烧杯内,重复以上程序3次,最后将瓶内液体吸干净。
3)向烧杯内再加入25mM PB若干,摇匀,避免泡沫。放入2~8℃冰箱备用。
心肌黄酶的稀释:
1)心肌黄酶纯品若干。向瓶内加入25mM PB 1ml,浓度为100IU/ml,待充分溶解。
2)取出溶解液若干转移到200ml烧杯中,再加入25mM PB若干,混匀,放入2~8℃冰箱备用。
辅酶冻干粉配制
取清洗干净的2ml玻璃瓶若干,用移液器先向每只瓶内加辅酶NAD+溶液250ul,再向瓶内加入心肌黄酶250ul,将全部分装好的玻璃瓶放入冷冻干燥机预冻(-40~-45℃)2小时后冷冻干燥24小时。干燥后放-20℃可保存18个月。
该试剂的配制方法与国外试剂不同点在于:利用冷冻真空干燥技术,将辅酶(NAD+)由液
态转变为固态,从而大大提高了试剂盒的有效期及稳定性。
所述的标准、质控血片制备方法:
1、将全血用4~8层纱布过滤,然后离心3000转20分钟,弃取血浆;
2、再用生理盐水洗3次,3000转离心20分钟,弃取上清,最后一次离心4000转30分钟;
3、将血球倒入量筒内量一下体积,记下毫升数;
4、用一定浓度的牛血清白蛋白与血球混合调好比例,混匀,测血球压积,(血球压积55-65%为宜)可进行下一步工作;
5、分别不同浓度的将配制好TSH标准液与血球混匀,在分析天平上称取血球重量并平均分配到标记好的试管中,待滴定;
6、60g/L BSA配制
柠檬酸钠若干
浓盐酸若干
牛血清白蛋白若干
生理盐水定容若干
7、血片滴定
1)将配制混匀好的血滴制在903#滤纸上(每个血斑50ul左右为宜)
2)室温晾干48小时
3)将晾干的血片收在铝箔袋内,放干燥剂,-18~-20℃保存
苯丙氨酸测定:
1.检测前所有的试剂、样本和微孔板条达到室温(18~25℃);
2.配制酶和辅酶储存液
分别向酶和辅酶冻干粉瓶内加双蒸水0.5ml,轻摇,避免产生泡沫,稀释后可在2~8℃储存2天。
3.配制酶和辅酶应用液
另取2只干净的烧杯,分别加入酶和辅酶储存液0.5ml,再各加入酶稀释液5ml,在18~25℃可保持稳定8小时。在2~8℃不能延长稳定性。
4.用打孔器打下直径3mm标准品、质控品、样本血斑放入96微孔板相应微孔中;
5.每孔加150μl三氯醋酸溶液,室温振荡(300~500U/分)60分钟;
6.加50μl的中和液到另一块新的微孔板孔中;
7.吸取130μl的标准品、质控品、样本萃取液到另一微孔板相应的微孔中,轻微振荡;
8.加50μl的酶应用液到每个孔中;
9.加50μl的辅酶应用液到每个孔中;
10.在室温(18~25℃)下振荡温育60分钟(300转/分);
11.每孔加100μl底物,混匀,在3~5分钟内读取OD值,酶标仪使用波长450nm(参考波长640nm)。
12.结果计算:
a)坐标纸上以标准品的荧光值和与其相对应的标准品浓度绘制标准曲线。OD值为纵轴或Y轴,浓度为横轴或X轴。
b)定质控品和每个样品的苯丙氨酸浓度值:首先在Y轴上查找OD值,横向延伸至标准曲线,以标准曲线上的点拉垂直线与X轴相交,得出苯丙氨酸浓度值,判断结果。
c)计算公式:Y=aX+b
d)单位转换:1mg/dl=60.6μmol/L
产品性能指标
1.剂量-反应曲线的线性范围1.1~17.3mg/d1
2.批内精密度 不大于10%
3.批间精密度 不大于15%
4.准确性 回收率为85%~119%
5.灵敏度 最低可检出限小于1.55mg/dl
6.特异性 与酪氨酸、组氨酸和甘氨酸无交叉反应
注意事项:
1、不同批号的试剂不能混用;
2、本产品为一次性使用产品;
3、超出有效期的试剂不可再用;
4、所有的试剂和样本在使用前要达到室温(18~26℃);
5、当从标准品、质控品上打孔时,注意从低浓度到高浓度。
6、实验结束所有物品,采用高温、过氧乙酸或84液等浸泡处理(生物制品应视为有潜在危害性)。
7、试剂盒中标准、质控品的浓度如有改变,将随试剂盒送通知单同时电话告知。
8、试剂盒于2~8℃、避光、干燥贮存,不得冻存。
说明书附图说明:
1、图1:整体试剂盒外观图;
2、图2:试剂盒俯视图;
3、图3-图8:试剂溶液承载瓶;
4、图9-图10:检测用微孔板;
5、图11:标准血片。
Claims (13)
1.一种用于检测新生儿血中苯丙氨酸浓度的酶定量法筛查试剂盒,其特征在于:所述试剂盒由酶稀释液(Triton X-100缓冲液)、底物(四唑盐)、中和液(碳酸盐缓冲液)、酶、辅酶、96孔微孔板、标准血片、质控血片、盖膜组成。
2.如权利要求1所述的苯丙氨酸定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述酶稀释液包括:Triton X-100、三乙醇胺、碳酸钠、无水碳酸氢钠配制方法:
(1)Triton X-100溶液:用加样器吸取Triton X-100若干加入少量0.1M碳酸缓冲液溶解,用0.1M碳酸缓冲液定溶。2~8℃冰箱保存备用。
(2)三乙醇胺溶液:用加样器取三乙醇胺液若干加0.1M碳酸缓冲液。定溶。
(3)按规程向试剂瓶中加三乙醇胺溶液,再向瓶内等量加入Triton X-100溶液,混匀,将配制好的酶稀释液瓶盖拧死,放入2~8℃冰箱保存备用,可保存18个月。
3.如权利要求2所述苯丙氨酸定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述底物配制方法:
(1)取四唑盐纯品。按规程向瓶内加入双蒸水若干,充分溶解待用;
(2)取出配制好的溶液若干再按规程加入双蒸水若干,混匀,分装,拧紧瓶盖后放入2~8℃冰箱备用,可保存18个月。溶解后剩余的四唑盐溶液放入-20℃保存。
该试剂的配制方法创新点在于,用规定量四唑盐纯品与相应量的双蒸水进行配制获得底
物,利用筛选出的底物显色系统在与一定浓度和特定Ph值的中和液反应时生成的产物可以
在波长450nm下进行读数,适用于所有的酶标仪,而无须更换滤光片,改变了国外进口试
剂必须使用570nm的滤光片的局限。此项技术处于国际领先水平。
4.如权利要求3所述苯丙氨酸定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述中和液,配制方法为:
(1)、用分析天平准确称取碳酸钠若干,无水碳酸氢钠若干;加少量双蒸水溶解后定溶,pH 10.6。获得0.1M碳酸缓冲液;
(2)、用量筒量取0.1M碳酸缓冲液若干毫升,用0.1M氢氧化钠将pH调至11.7,按照规定进行中和液分装,拧紧瓶盖放入2~8℃,可保存18个月。
5.如权利要求4所述苯丙氨酸定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述三氯醋酸溶液,其配制方法为:
用分析天平准确称取三氯醋酸若干,一定量双蒸水溶解后,定容于1000ml。按照规定量进行三氯醋酸溶液的分装,拧紧瓶盖放入2~8℃冰箱可保存18个月。
6.如权利要求5所述苯丙氨酸定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述酶(苯丙氨酸脱氢酶)的配制方法为:
(1)将球形芽孢杆菌的pdh基因克隆到大肠杆菌pET系统并进行表达,通过活性蓝4纯化获得高比活性和高得率的L-苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)液体。
(2)取50ml烧杯一只,将瓶内的苯丙氨酸脱氢酶液全部转移到烧杯内。向原瓶内加入25mM PB若干,将瓶子轻轻旋转后将瓶内液体尽量吸出,转移到烧杯内,重复以上程序3次,最后将瓶内液体吸干净。
(3)向烧杯内再加入25mM PB若干,轻轻摇匀,避免泡沫。
(4)取清洗干净的2ml玻璃瓶,用移液器向每只瓶内加苯丙氨酸脱氢酶溶液0.5ml,放入冷冻干燥机预冻(-40~-45℃)2小时后冷冻干燥24小时。干燥后放-20℃储存可保存18个月。
该试剂的配制方法创新点在于:将球形芽孢杆菌的pdh基因克隆到大肠杆菌pET系统并
进行表达,通过活性蓝4纯化获得高比活性和高得率的L-苯丙氨酸脱氢酶(PheDH),利用冷
冻真空干燥技术,将L-苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)液体转变为固体,从而大大提高了试剂盒
的有效期和稳定性。而且该试剂的配制创新发明不仅仅只限于运用到新生儿筛查试剂盒中,
鉴于其基因表达的高特异性、高灵敏度、高活性,还可以将其使用到与之相关的其它产品内。
基于该酶开发的试剂的技术指标目前达到国外先进水平。
7.如权利要求6所述苯丙氨酸定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述辅酶冻干粉,包括辅酶NAD+和心肌黄酶的制备方法为:
辅酶NAD+的稀释方法:
1)辅酶NAD+纯品若干。向瓶内加入25mM PB 1ml,浓度为10g/ml,待充分溶解。
2)取200ml烧杯一只,先将瓶内的辅酶NAD+尽量吸出到烧杯内。向原瓶内加25mM PB1ml,将瓶子轻轻旋转后将瓶内液体尽量吸出到烧杯内,重复以上程序3次,最后将瓶内液体吸干净。
3)向烧杯内再加入25mM PB若干,摇匀,避免泡沫。放入2~8℃冰箱备用。
心肌黄酶的稀释:
1)心肌黄酶纯品若干。向瓶内加入25mM PB 1ml,浓度为100IU/ml,待充分溶解。
2)取出溶解液若干转移到200ml烧杯中,再加入25mM PB若干,混匀,放入2~8℃冰箱备用。
辅酶冻干粉配制
取清洗干净的2ml玻璃瓶若干,用移液器先向每只瓶内加辅酶NAD+溶液250ul,再向瓶内加入心肌黄酶250ul,将全部分装好的玻璃瓶放入冷冻干燥机预冻(-40~-45℃)2小时后冷冻干燥24小时。干燥后放-20℃可保存18个月。
该试剂的配制方法与国外试剂不同点在于:利用冷冻真空干燥技术,将辅酶(NAD+)由
液态转变为固态。从而大大提高了试剂盒的有效期及稳定性。
8.如权利要求7所述苯丙氨酸定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述所述的标准、质控血片制备方法:
1)将全血用4~8层纱布过滤,然后离心3000转20分钟,弃取血浆;
2)再用生理盐水洗3次,3000转离心20分钟,弃取上清,最后一次离心4000转30分钟;
3)将血球倒入量筒内量一下体积,记下毫升数;
4)用一定浓度的牛血清白蛋白与血球混合调好比例,混匀,测血球压积,(血球压积55-65%为宜)可进行下一步工作;
5)分别不同浓度的将配制好TSH标准液与血球混匀,在分析天平上称取血球重量并平均分配到标记好的试管中,待滴定;
6)60g/L BSA配制
柠檬酸钠若干
浓盐酸若干
牛血清白蛋白若干
生理盐水定容若干
7)血片滴定
(1)将配制混匀好的血滴制在903#滤纸上(每个血斑50ul左右为宜)
(2)室温晾干48小时
(3)将晾干的血片收在铝箔袋内,放干燥剂,-18~-20℃保存
9.如权利要求1所述的苯丙氨酸定量检测试剂盒的使用方法,其特征在于:所述使用方法包括以下步骤:
苯丙氨酸测定:
1、检测前所有的试剂、样本和微孔板条达到室温(18~25℃);
2、配制酶和辅酶储存液
分别向酶和辅酶冻干粉瓶内加双蒸水0.5ml,轻摇,避免产生泡沫,稀释后可在2℃~8℃储存2天。
3、配制酶和辅酶应用液
另取2只干净的烧杯,分别加入酶和辅酶储存液0.5ml,再各加入酶稀释液5ml,在18℃~25℃可保持稳定8小时,在2℃~8℃不能延长稳定性。(若做1/2板,取0.25ml储存液加酶稀释液2.5ml)。
4、用打孔器打下直径3mm标准品、质控品、样本血斑放入96微孔板相应微孔中;
5、每孔加150μl三氯醋酸溶液,室温振荡(300~500转/分)60分钟;
6、加50μl的中和液到另一块新的微孔板孔中;
7、吸取130μl的标准品、质控品、样本萃取液到另一微孔板相应的微孔中,轻微振荡;
8、加50μl的酶应用液到每个孔中;
9、加50μl的辅酶应用液到每个孔中;
10.在室温(18℃~25℃)下振荡温育60分钟(300转/分);
11.每孔加100μl底物,混匀,在3~5分钟内读取OD值,酶标仪使用波长450nm(参考波长640nm)。
12.结果计算:酶标仪附带软件自动计算样品浓度值。或按照下面方法手工计算:
a)坐标纸上以标准品的荧光值和与其相对应的标准品浓度绘制标准曲线。OD值为纵轴或Y轴,浓度为横轴或X轴。
b)确定质控品和每个样品的苯丙氨酸浓度值:首先在Y轴上查找OD值,横向延伸至标准曲线,以标准曲线上的点拉垂直线与X轴相交,得出苯丙氨酸浓度值,判断结果。
c)计算公式:Y=aX+b
d)单位转换:1mg/dl=60.6μmol/L
13.产品性能指标
(1)试剂盒外观整洁,文字符号标识清晰
(2)血制品经检测HIV、HbsAg、HCV、梅毒抗体阴性
(3)剂量-反应曲线的线性范围1.1mg/dl~17.3mg/dl(不同批次有一定误差),剂量-反应曲线经数学公式Y=aX+b拟合,其相关系数R值应不低于0.99。
(4)批内精密度 不大于10%
(5)批间精密度 不大于15%
(6)准确性 回收率为85%~119%
(7)灵敏度 最低可检出限小于1.55mg/dl
(8)特异性 与酪氨酸、组氨酸和甘氨酸无交叉反应。
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CN2009101428646A CN101892290A (zh) | 2009-05-19 | 2009-05-19 | 苯丙氨酸定量检测试剂盒(酶定量法) |
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CN2009101428646A CN101892290A (zh) | 2009-05-19 | 2009-05-19 | 苯丙氨酸定量检测试剂盒(酶定量法) |
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