CN102061332A - 果糖定量检测试剂盒及其用途和精浆果糖定量检测方法 - Google Patents

Abstract

果糖定量检测试剂盒，含去无机酸蛋白液A、无机碱去蛋白液B、果糖校准液、含0.001～0.1mol/L腺嘌呤核苷三磷酸钠盐的试剂1、含1～100KU/L已糖激酶、1～100KU/L葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂2、含0.001～0.1mol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的试剂3。检测精浆果糖：去蛋白精浆和果糖校准液中分别加入试剂1、试剂2混匀；在10～40℃温度下反应5～120分钟后，280～400nm波长下分别读取吸光度；再分别加入试剂3混匀；同样反应并读取吸光度；计算前后吸光度之差，将精浆标本与果糖校准液的吸光度相比较或计算，可得精浆果糖浓度。该试剂盒和方法可用于血清、血浆、体液、食品、固形物提取液内的果糖定量测定，方法学特异、清洁环保、能实现手工操作和自动化批量检测、易于临床推广应用。

Description

果糖定量检测试剂盒及其用途和精浆果糖定量检测方法

技术领域

本发明涉及果糖定量检测试剂盒及其用途，以及涉及利用这种试剂盒体外检测人体精浆标本中精浆果糖浓度的方法。

背景技术

男性双侧射精管梗阻、先天性精囊缺如或发良不良，果糖测定为阴性。精囊炎、不完全射精或射精过频时，果糖含量降低。果糖结合其它检测指标(如：精浆中性α-葡糖苷酶)，可对梗阻性无精子症患者梗阻部位进行定位。精浆果糖是精囊分泌功能的评价功能指标。睾酮的水平影响精囊果糖的分泌，雄激素不足可造成果糖含量降低。精囊分泌功能降低可导致精液量降低。精囊分泌的果糖是精子能量的主要来源，精液中果糖量减少时可导致精子供能不足而影响活动力。目前在实验室对精浆进行定量测量的方法有吲哚显色法、间苯二酚显色法、酶法等。吲哚法为世界卫生组织推荐的方法学，但操作过程中需使用到浓盐酸，对操作者、环境产生危害；间苯二酚法灵敏度低，需使用到浓盐酸，对操作者、环境产生危害，且在90℃温育显色，临床使用不方便。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种方法学特异、能实现手工操作和自动化批量检测、清洁环保、且操作简单、易于临床推广应用的果糖定量检测试剂盒，同时，本发明还提供其用途，以及一种利用该试剂盒的性能稳定、特异性强、能实现手工操作和自动化批量检测、便于临床常规应用推广的人体精浆标本中果糖浓度的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提供一种果糖定量检测试剂盒，其特征在于，包括去蛋白液A、去蛋白液B、果糖校准液、试剂1、试剂2、试剂3；所述去蛋白液A为将待测标本中蛋白质变性、沉淀的浓度为0.001～1mol/L的无机酸溶液；所述去蛋白液B为中和去蛋白液A的酸性的浓度为0.001～1mol/L的无机碱溶液；所述果糖校准液为已知浓度的果糖校准液；所述试剂1为含0.001～0.1mol/L腺嘌呤核苷三磷酸钠盐、1～20克/L氯化钠的缓冲液或该溶液制成的冻干粉；试剂2为含1～100KU/L已糖激酶、1～100KU/L葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的缓冲液或该溶液制成的冻干粉；试剂3为含0.001～0.1mol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的缓冲液或该溶液制成的冻干粉。

所述去蛋白液A为硫酸溶液或盐酸溶液或碳酸溶液或硼酸溶液或硝酸溶液或其中至少两种的混合溶液；所述去蛋白液B为氢氧根盐溶液或碳酸根盐溶液或碳酸氢根盐溶液或铵根盐溶液或其中至少两种的混合溶液；所述果糖校准液为已知浓度为2～10mmol/L的果糖溶液。

所述试剂1为冻干粉，所述试剂盒还包括试剂1溶解液，所述试剂1溶解液为pH6～7、浓度为0.01～1mol/L的磷酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液或碳酸盐缓冲或醋酸盐缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液。

所述试剂1中腺嘌呤核苷三磷酸钠盐的浓度为0.01mol/L；所述试剂2中已糖激酶浓度为10KU/L，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶浓度为10KU/L；所述试剂3中的，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为0.01mol/L。

所述试剂盒中还包括微孔板条。

所述果糖定量检测试剂盒，用于血清或血浆或体液或食品或固形物提取液内的果糖浓度定量测定。

同时，本发明所述的果糖定量检测试剂盒进行精浆果糖定量检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)分别取去蛋白精浆和已知浓度的果糖校准液，分别加入试剂1，混匀，其中，试剂1与去蛋白精浆标本的体积比为10～100；

2)在上述液体内分别加入试剂2，混匀，其中，试剂2与去蛋白精浆标本的体积比为0.5～10；

3)在10～40℃温度下反应5～120分钟后，在280～380nm波长下读取并记录各自的第一次吸光度；

4)在上述液体内再加入试剂3，混匀，其中，试剂3与去蛋白精浆标本的体积比为0.1～10；

5)在10～40℃温度下反应5～120分钟后，在280～380nm波长下读取并记录各自的第二次吸光度；

6)分别以各自的第二次吸光度减去第一次吸光度，为精浆标本中果糖参与反应的吸光度ΔA_标本和果糖校准液中果糖参与反应的吸光度ΔA_校准；

7)将精浆标本与果糖校准液的吸光度相比较或计算，得出精浆果糖浓度C_标本。

当所述步骤1)中只有一种浓度C_标本的所述果糖校准液，则所述步骤7)中按照如下公式计算精浆果糖浓度，C_标本＝ΔA_标本÷ΔA_校准×C_校准×标本稀释倍数；

当所述步骤1)中所述果糖校准液有多种不同浓度分别检测，则所述步骤7)中将分别检测不同浓度的果糖校准液得到的ΔA_校准拟合成校准曲线，读取ΔA_标本的值在校准曲线上对应的浓度值并乘以标本的稀释倍数，即为精浆果糖浓度C_标本；

所述步骤3)和步骤5)中在37℃温度下反应15分钟，在340nm波长下读取吸光度。

所述步骤1)之前还包括精浆标本去蛋白步骤：

a)在待检精浆标本中加入去蛋白液A，混匀，用量为0.0004mol/L～20mol/L无机酸/ml精浆；

b)再在步骤a)得到的上述液体内加入去蛋白液B，混匀，用量为0.0002mmol～8mmol无机碱/ml精浆；

c)室温静置后取得上清液即为步骤1)所述的去蛋白精浆。

所述步骤a)中待检精浆标本与去蛋白液A的体积比为5∶2～1∶10；所述待检精浆标本与去蛋白液B的体积比为5∶1～1∶4。

本发明为酶法检验，所述的试剂1、试剂2、试剂3为含已糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、腺嘌呤核苷三磷酸钠盐(ATP钠盐)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的缓冲液，检验原理是已糖激酶能分解果糖为果糖-6-磷酸，后者可变构为葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化葡萄糖-6-磷酸和NAD⁺生成NADH，NADH在340nm处有最大吸收峰，通过监测340nm波长处NADH的吸光度值，可检测出标本中果糖的浓度。本发明酶法试剂配方环保，操作简单，灵敏度高，特异性强，适合临床使用，突出的技术效果在于：

1、本试剂采用工具酶，使酶促反应形成NADH产物，NADH可通过分析仪直接检测，清洁环保，克服以往果糖检测试剂需直接使用强酸的弱点。

2、增加了精浆去蛋白步骤，除掉了会引起非特异性反应的蛋白类干扰物；采用二点法，第一次孵育可除去精浆标本内其他能导致非特异性吸光度变化的影响因素，使检测更加特异。

3、待测精浆果糖与果糖校准液同步反应，避免因实验条件波动导致检测错误，增强的检测的准确性。

4、由于操作简单、采用即用型试剂且性能稳定、无需特殊检测仪器，便于临床常规应用与推广。

具体实施方式

实施例1

一、制备本实施例1的果糖定量检测试剂盒

1.配制去蛋白液A：

1)称取硼酸6.183克，置于烧杯内，加入适量纯化水搅拌溶解后，用纯化水定容至1L，混匀后保存。(硼酸浓度为0.1mol/L。)

2.配制去蛋白液B：

称取氢氧化钠4克，置于烧杯内，加入适量纯化水搅拌溶解后，用纯化水定容至1L，混匀后保存。(氢氧化钠浓度为0.1mol/L。)

3.配制试剂1：

(1)称取12水磷酸氢二钠17.728克，磷酸二氢钾6.94克，加入适量纯化水搅拌溶解后，在pH计监测下，用浓盐酸或浓氢氧化钠溶液调整pH值至6～7，得到本实施例1的磷酸盐缓冲液。(磷酸盐浓度为0.1mol/L。)

(2)称取ATP钠盐6.0519克，氯化钠9克，加入适量的步骤(1)配制的磷酸盐缓冲液搅拌溶解后，用磷酸盐缓冲液定容至1L。(ATP钠盐浓度为0.01mmol/L，氯化钠浓度为9克/L。)

(3)将步骤(2)配制的溶液分装至小瓶，放真空冷冻干燥机内真空冷冻干燥成冻干粉。

4.配制试剂1冻干粉的溶解液：

配制方法与步骤3(1)相同。

5.配制试剂2：

称取已糖激酶10KU、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶10KU，加入适量的步骤3)配制的磷酸盐缓冲液搅拌溶解后，用磷酸盐缓冲液定容至1L。

6.配制试剂3：

称取烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)7.434克，加入适量的步骤3(1)配制的磷酸盐缓冲液搅拌溶解后，用磷酸盐缓冲液定容至1L。(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度为0.01mol/L。)

7.配制5mmol/L的果糖校准液：

称取果糖0.9008g，加入适量纯化水搅拌溶解后，用纯化水定容至1L，混匀后保存。

8.准备8孔/条的微孔板条共20条，购于深圳市金灿华实业有限公司，产品型号：106-002。

从以上步骤可进一步量取、封装得到本实施例1的试剂盒：

去蛋白液A    1瓶    12ml

去蛋白液B    1瓶    5ml

试剂1(R1)        2瓶        冻干粉    (使用时6ml/瓶的溶解液复溶)

试剂1溶解液      1瓶        12.5ml

试剂2(R2)        1瓶        0.6ml

试剂3(R3)        1瓶        0.3ml

果糖校准液       1瓶        4ml        5mmol/L

微孔板条         20条       8孔/条

二、用上述试剂盒进行精浆果糖定量检测

(一)标本准备

1.受试者禁欲2-7天后，通过手淫法(或用特制的精液采集套以性交方式)留取全部精液标本，记录受检者一次射精的精液总量为2.3ml。新鲜精液标本完全液化后，3000g离心10分钟，留取精浆，待检测(或将精浆置于-20℃储存也可。勿反复冻融标本。)

2.检测前将待测精浆去蛋白：在微型离心管(Eppendorf管)中，加入精浆50μl和去蛋白液A 250μl，混匀，再加入去蛋白液B 100μl，混匀，室温静置10min后，取上清液作为待检精浆标本，这时精浆标本1∶8稀释。其中去蛋白液A用量为0.5mmol无机酸/ml精浆；去蛋白液B用量为0.2mmol无机碱/ml精浆。

(二)试剂准备

每瓶试剂1冻干粉加6ml试剂1溶解液溶解，蔽光保存。溶解后的试剂1(R1)，4℃保存可使用1周，-20℃保存可用至试剂盒有效期限(勿反复冻融)。

(三)校准品准备

在3个试管中，将本实施例1试剂盒中的5mmol/L果糖校准液以纯化水连续对倍稀释为2.5mmol/L、1.25mmol/L和0.625mmol/L三个浓度，以纯化水作为0mmol/L校准液，因此得到5个不同浓度的果糖校准液，以便以5mmol/L、2.5mmol/L、1.25mmol/L、0.625mmol/L和0mmol/L的5个校准品的检验数据拟合标谁曲线。稀释方法如下：分别在3个试管中加入纯化水150μl，在第1管内加入5mmol/L果糖校准液150μl，混匀后将第1管内的液体150μl转移至第2管，混匀后将第2管内的液体150μl转移至第3管，这3个试管中的果糖校准液浓度依次为2.5mmol/L、1.25mmol/L、0.625mmol/L。

(四)检测

表一

振荡混匀，37℃反应15min后，340nm读取吸光度(A1)

参照表一所示，在微孔内完成检测，检测步骤为：

1.分别取去蛋白精浆10μl和5种不同校准浓度的果糖校准液10μl，分别加入试剂1(R1)200μl，混匀；

2)在上述液体内分别加入试剂2(R2)10μl，振荡混匀；

3)37℃反应15min后，用酶标比色仪在340nm波长下读取并记录各自的第一次吸光度A1；

4)在上述液体内再分别加入试剂3(R3)5μl，振荡混匀；

5)37℃反应15min后，用酶标比色仪在340nm波长下读取并记录各自的第二次吸光度A2；

6)计算ΔA(ΔA＝A2-A1)：分别以各自的第二次吸光度A2减去第一次吸光度A1，得到精浆标本中果糖参与反应的吸光度ΔA_标本为0.567，并得到各不同浓度果糖校准液中果糖参与反应的吸光度ΔA_{校准5 mmol/L}＝1.172、ΔA_{校准2.5mmol/L}＝0.597、ΔA_{校准1.25mmol/L}＝0.334、ΔA_{校准0.625 mmol/L}＝0.128和ΔA_{校准0mmol/L}＝0.025；

7)将以上5个ΔA_校准数值拟合成二次方程方式(平滑曲线)校准曲线(按现有技术常规方法)，x轴为果糖浓度，y轴为ΔA_校准，读取ΔA_标本的值在校准曲线上对应的浓度值，即为精浆果糖浓度C_标本＝标本在校准曲线上对应的浓度值×标本稀释系数8＝18.989mmol/L。

8)精浆果糖浓度C_标本乘以一次射精的精液体积，得到每次射出的精液中果糖的总量，即：

一次射精果糖量(μmol)＝精浆果糖浓度(mmol/L)×一次射精的精液总体积(ml)＝18.989×2.3＝43.6747umol/一次射精。

实施例2

一、制备本实施例2的果糖定量检测试剂盒

1.配制去蛋白液A：

取适量纯化水加入烧杯，量取硫酸0.544ml，沿烧杯壁缓缓倾入并不断搅拌混匀，用纯化水定容至1L，混匀后保存。(硫酸浓度为0.001mol/L。)

2.配制去蛋白液B：

称取碳酸钠0.106克，置于烧杯内，加入适量纯化水搅拌溶解后，用纯化水定容至1L，混匀后保存。(碳酸钠浓度为0.001mol/L。)

3.配制试剂1：

(1)先配制0.01mol/L柠檬酸缓冲液：称取1水柠檬酸2.1014克，加入适量纯化水搅拌溶解后，在pH计监测下，用浓氢氧化钠溶液调整pH值至6～7，得到本实施例2的柠檬酸缓冲液。

(2)称取ATP钠盐0.60519克，氯化钠1克，加入适量的步骤(1)配制的柠檬酸缓冲液搅拌溶解后，用柠檬酸缓冲液定容至1L。(此处ATP钠盐为0.001mmol/L、氯化钠1克/L。)

(3)将步骤(2)配制的溶液分装至小瓶，放真空冷冻干燥机内真空冷冻干燥成冻干粉。

4.配制试剂1冻干粉的溶解液：

配制方法与本实施例2的步骤3(1)相同。

5.配制试剂2：

称取已糖激酶1KU、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1KU，加入适量的步骤3)配制的柠檬酸缓冲液搅拌溶解后，用柠檬酸缓冲液定容至1L。

6.配制试剂3：

称取烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)0.7434克，加入适量的步骤3(1)配制的柠檬酸缓冲液搅拌溶解后，用柠檬酸缓冲液定容至1L。(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.001mol/L。)

7.配制2mmol/L的果糖校准液：

称取果糖0.3603g，加入适量纯化水搅拌溶解后，用纯化水定容至1L，混匀后保存。

8.准备8孔/条的微孔板条共20条(同实施例1的厂家型号)。

从以上步骤可进一步量取、封装得到本实施例1的试剂盒：

去蛋白液A      1瓶      12ml

去蛋白液B      1瓶      5ml

试剂1(R1)      2瓶      冻干粉    (使用时复溶至6ml/瓶)

试剂1溶解液    1瓶      12.5ml

试剂2(R2)      1瓶      0.6ml

试剂3(R3)      1瓶      0.3ml

果糖校准液     1瓶      4ml        2mmol/L

微孔板条       20条     8孔/条

二、用上述试剂盒进行精浆果糖定量检测

(一)标本准备

1.受试者禁欲2-7天后，通过手淫法(或用特制的精液采集套以性交方式)留取全部精液标本，记录受检者一次射精的精液总量为4.6ml。新鲜精液标本完全液化后，3000g离心10分钟，留取精浆，待检测(或将精浆置于-20℃储存也可。勿反复冻融标本。)

2.检测前将待测精浆去蛋白：在Eppendorf管中，加入精浆50μl和去蛋白液A20μl，混匀，再加入去蛋白液B10μl，混匀，室温静置10min后，取上清液作为待检精浆标本，这时精浆标本1∶3稀释。其中去蛋白液A用量为0.0004mmol无机酸/ml精浆；去蛋白液B用量为0.0002mmol无机碱/ml精浆。

(二)试剂准备

每瓶试剂1冻干粉加6ml试剂1溶解液溶解，蔽光保存。溶解后的试剂1(R1)，4℃保存可使用1周，-20℃存可用至试剂盒有效期限(勿反复冻融)。

(三)校准品准备

在3个试管中，将本实施例2试剂盒中的2mmol/L果糖校准液以纯化水连续对倍稀释为1mmol/L、0.5mmol/L和0.25mmol/L三个浓度，以纯化水作为0mmol/L校准液，因此得到5个不同浓度的果糖校准液，以便以2mmol/L、1mmol/L、0.5mmol/L、0.25mmol/L和0mmol/L的5个校准品的检验数据拟合标谁曲线。稀释方法如下：分别在3个试管中加入纯化水150μl，在第1管内加入2mmol/L果糖校准液150μl，混匀后将第1管内的液体150μl转移至第2管，混匀后将第2管内的液体150μl转移至第3管，这3个试管中的果糖校准液浓度依次为2mmol/L、1mmol/L、0.25mmol/L。

(四)检测

表二

参照表二所示，在微孔内完成检测，检测步骤为：

1.分别取去蛋白精浆10μl和5种不同校准浓度的果糖校准液各10μl，分别加入试剂1(R1)200μl，混匀；

2)在上述液体内分别加入试剂2(R2)10μl，振荡混匀；

3)10℃反应120min后，用酶标比色仪在280nm波长下读取并记录各自的第一次吸光度A1；

4)在上述液体内再分别加入试剂3(R3)5μl，振荡混匀；

5)10℃反应120min后，用酶标比色仪在340nm波长下读取并记录各自的第二次吸光度A2；

6)计算ΔA(ΔA＝A2-A1)：分别以各自的第二次吸光度A2减去第一次吸光度A1，得到精浆标本中果糖参与反应的吸光度ΔA_标本为0.423，并得到各不同浓度果糖校准液中果糖参与反应的吸光度ΔA_{校准2 mmol/L}＝0.512、ΔA_{校准1mmol/L}＝0.278、ΔA_{校准0.5mmol/L}＝0.146、ΔA_{校准0.25mmol/L}＝0.083和ΔA_{校准0mmol/L}＝0.019；

7)将以上5个ΔA_校准数值拟合成二次方程方式(平滑曲线)校准曲线(按现有技术常规方法)，x轴为果糖浓度，y轴为ΔA_校准，读取ΔA_标本的值在校准曲线上对应的浓度值，即为精浆果糖浓度C_标本＝标本在校准曲线上对应的浓度值×标本稀释系数1.6＝2.595mmol/L。

8)精浆果糖浓度C_标本乘以一次射精的精液体积，得到每次射出的精液中果糖的总量，即：

一次射精果糖量(μmol)＝精浆果糖浓度(mmol/L)×一次射精的精液总体积(ml)＝2.595×4.6＝11.937umol/一次射精。

实施例3

一、制备本实施例3的果糖定量检测试剂盒

1.配制去蛋白液A：

量取盐酸82.117ml，置于烧杯内，加入适量纯化水搅拌溶解后，用纯化水定容至1L，混匀后保存。(盐酸浓度为1mol/L。)

2.配制去蛋白液B：

称取碳酸氢钠84.01克，置于烧杯内，加入适量纯化水搅拌溶解后，用纯化水定容至1L，混匀后保存。(碳酸氢钠浓度为1mol/L。)

3.配制试剂1：

(1)量取取醋酸57.234ml，加入适量纯化水搅拌溶解后，在pH计监测下，用浓盐酸或浓氢氧化钠溶液调整pH值至6～7，得到本实施例3的醋酸盐缓冲液。(醋酸浓度1mol/l。)

(2)称取ATP钠盐60.519克，氯化钠20克，加入适量的本实施例3步骤3(1)配制的醋酸盐缓冲液搅拌溶解后，用醋酸盐缓冲液定容至1L。

(3)将步骤(2)配制的溶液分装至小瓶、避光放2-8℃保存待用。

4.配制试剂2：

称取已糖激酶100KU、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶100KU，加入适量的本实施例3步骤3(1)配制的醋酸盐缓冲液搅拌溶解后，用醋酸盐缓冲液定容至1L。

5.配制试剂3：

称取烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)74.34克，加入适量的步骤3(1)配制的醋酸盐缓冲液搅拌溶解后，用醋酸盐缓冲液定容1L。(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度为0.1mol/L。)

6.配制10mmol/L的果糖校准液：

称取果糖1.8016g，加入适量纯化水搅拌溶解后，用纯化水定容至1L，混匀后保存。

7.准备8孔/条的微孔板条共20条(厂家型号同实施例1)。

从以上步骤可进一步量取、封装得到本实施例1的试剂盒：

去蛋白液A        1瓶        12ml

去蛋白液B        1瓶        5ml

试剂1(R1)        2瓶        6ml/瓶

试剂2(R2)        1瓶        0.6ml

试剂3(R3)        1瓶        0.3ml

果糖校准液       1瓶        4ml    10mmol/L

微孔板条         20条       8孔/条

二、用上述试剂盒进行精浆果糖定量检测

(一)标本准备

1.受试者禁欲2-7天后，用特制的精液采集套以性交方式留取全部精液标本，记录受检者一次射精的精液总量为2.7ml。新鲜精液在体外60分钟后仍然不能完全液化时，加入2.7ml培养液或洗涤液并以吸管反复吹打促进完全液化，3000g离心10分钟，留取精浆，待检测(或将精浆置于-20℃储存也可。勿反复冻融标本。)

2.检测前将待测精浆去蛋白：在Eppendorf管中，加入精浆50μl和去蛋白液A 500μl，混匀，再加入去蛋白液B200μl，混匀，室温静置10min后，取上清液作为待检精浆标本，这时精浆标本1∶30稀释。其中去蛋白液A用量为20mmol无机酸/ml精浆；去蛋白液B用量为8mmol无机碱/ml精浆。

(注：本实施例3中试剂1为液态所以无需复溶，只用一个浓度校准品)

(二)检测

表三

参照表三所示，在微孔内完成检测，检测步骤为：

1.分别取去蛋白精浆10μl和10mmol/L的果糖校准液各10μl，分别加入试剂1(R1)200μl，混匀；

2)在上述液体内分别加入试剂2(R2)10μl，振荡混匀；

3)25℃反应30min后，用酶标比色仪在380nm波长下读取并记录各自的第一次吸光度A1；

4)在上述液体内再分别加入试剂3(R3)5μl，振荡混匀；

5)25℃反应30min后，用酶标比色仪在380nm波长下读取并记录各自的第二次吸光度A2；

6)计算ΔA(ΔA＝A2-A1)：分别以各自的第二次吸光度A2减去第一次吸光度A1，得到精浆标本中果糖参与反应的吸光度ΔA_标本为0.576，并得到果糖校准液中果糖参与反应的吸光度ΔA_{校准10mmol/L}＝2.341；

7)按照如下公式计算精浆果糖浓度：

C_标本＝ΔA_标本÷ΔA_{校准10mmol/L}×C_校准×标本稀释倍数

＝0.576÷2.341×10×30＝78.815mmol/L；

8)精浆果糖浓度C_标本乘以一次射精的精液体积，得到每次射出的精液中果糖的总量，即：

一次射精果糖量(μmol)＝精浆果糖浓度(mmol/L)×一次射精的精液总体积(ml)＝78.815×2.7＝212.8umol/一次射精。

另外，需要说明的是，本发明的所述去蛋白液A不仅可以是实施例中的盐酸溶液或碳酸溶液或硼酸溶液，还可以为硫酸溶液或硝酸溶液或其中至少两种的混合溶液，只要是浓度在0.001mol/L～1mol/L的无机酸溶液、能够使标本内的蛋白质进行变行与沉淀，用量为0.005mmol～5mmol无机酸/ml精浆。

所述去蛋白液B不仅可以是氢氧根盐溶液或碳酸根盐溶液或碳酸氢根盐溶液，还可以为铵根盐溶液或其中至少两种的混合溶液，只要是能中和去蛋白液A的酸性，使标本的酸碱度趋于中性、0.001mol/L～1mol/L的无机碱溶液，用量为0.002mmol～2mmol无机碱/ml精浆。

而缓冲液或者试剂1溶解液，不仅可以是实施例中的磷酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液或醋酸盐缓冲液还可以为碳酸盐缓冲或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液。

本发明的果糖定量检测试剂盒，还可用于血清或血浆或体液或食品或固形物(比如水果)提取液内的果糖浓度定量测定，方法和步骤类似，不再赘述。

Claims (10)

1.一种果糖定量检测试剂盒，其特征在于，包括去蛋白液A、去蛋白液B、果糖校准液、试剂1、试剂2、试剂3；所述去蛋白液A为将待测标本中蛋白质变性、沉淀的浓度为0.001～1mol/L的无机酸溶液；所述去蛋白液B为中和去蛋白液A的酸性的浓度为0.001～1mol/L的无机碱溶液；所述果糖校准液为已知浓度的果糖校准液；所述试剂1为含0.001～0.1mol/L腺嘌呤核苷三磷酸钠盐、1～20克/L氯化钠的缓冲液或该溶液制成的冻干粉；试剂2为含l～100KU/L已糖激酶、1～100KU/L葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的缓冲液或该溶液制成的冻干粉；试剂3为含0.001～0.1mol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的缓冲液或该溶液制成的冻干粉。

2.根据权利要求1所述的果糖定量检测试剂盒，其特征在于，所述去蛋白液A为硫酸溶液或盐酸溶液或碳酸溶液或硼酸溶液或硝酸溶液或其中至少两种的混合溶液；所述去蛋白液B为氢氧根盐溶液或碳酸根盐溶液或碳酸氢根盐溶液或铵根盐溶液或其中至少两种的混合溶液；所述果糖校准液为已知浓度为2～10mmol/L的果糖溶液。

3.根据权利要求1所述的果糖定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1为冻干粉，所述试剂盒还包括试剂1溶解液，所述试剂1溶解液为pH6～7、浓度为0.01～1mol/L的磷酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液或碳酸盐缓冲或醋酸盐缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液。

4.根据权利要求1所述的果糖定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1中腺嘌呤核苷三磷酸钠盐的浓度为0.01mol/L；所述试剂2中已糖激酶浓度为10KU/L，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶浓度为10KU/L；所述试剂3中的，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为0.01mol/L。

5.根据权利要求1所述的果糖定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括微孔板条。

6.权利要求1-5任一项所述的果糖定量检测试剂盒，用于血清或血浆或体液或食品或固形物提取液内的果糖浓度定量测定。

7.利用权利要求1-5任一项所述的果糖定量检测试剂盒进行精浆果糖定量检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)分别取去蛋白精浆和已知浓度的果糖校准液，分别加入试剂1，混匀，其中，试剂1与去蛋白精浆标本的体积比为10～100；

2)在上述液体内分别加入试剂2，混匀，其中，试剂2与去蛋白精浆标本的体积比为0.5～10；

3)在10～40℃温度下反应5～120分钟后，在280～380nm波长下读取并记录各自的第一次吸光度；

4)在上述液体内再加入试剂3，混匀，其中，试剂3与去蛋白精浆标本的体积比为0.1～10；

5)在10～40℃温度下反应5～120分钟后，在280～380nm波长下读取并记录各自的第二次吸光度；

6)分别以各自的第二次吸光度减去第一次吸光度，为精浆标本中果糖参与反应的吸光度ΔA_标本和果糖校准液中果糖参与反应的吸光度ΔA_校准；

7)将精浆标本与果糖校准液的吸光度相比较或计算，得出精浆果糖浓度C_标本。

8.根据权利要求7所述的精浆果糖定量检测的方法，其特征在于，当所述步骤1)中只有一种浓度C_标本的所述果糖校准液，则所述步骤7)中按照如下公式计算精浆果糖浓度，C_标本＝ΔA_标本÷ΔA_校准×C_校准×标本稀释倍数；

当所述步骤1)中所述果糖校准液有多种不同浓度分别检测，则所述步骤7)中将分别检测不同浓度的果糖校准液得到的ΔA_校准拟合成校准曲线，读取ΔA_标本的值在校准曲线上对应的浓度值并乘以标本的稀释倍数，即为精浆果糖浓度C_标本；

所述步骤3)和步骤5)中在37℃温度下反应15分钟，在340nm波长下读取吸光度。

9.根据权利要求7所述的精浆果糖定量检测的方法，其特征在于，所述步骤1)之前还包括精浆标本去蛋白步骤：

a)在待检精浆标本中加入去蛋白液A，混匀，用量为0.0004mol/L～20mol/L无机酸/ml精浆；

b)再在步骤a)得到的上述液体内加入去蛋白液B，混匀，用量为0.0002mmol～8mmol无机碱/ml精浆；

c)室温静置后取得上清液即为步骤1)所述的去蛋白精浆。

10.根据权利要求9所述的精浆果糖定量检测的方法，其特征在于，所述步骤a)中待检精浆标本与去蛋白液A的体积比为5∶2～1∶10；所述待检精浆标本与去蛋白液B的体积比为5∶1～1∶4。