CN110320356B - 一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法 - Google Patents

一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法 Download PDF

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Abstract

一种牛奶中多重抗生素残留(氧四环素和卡那霉素)的比色检测方法，属于分析化学技术领域。本发明首先将抗生素适体(APT)与生物素标记的探针CP退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面；探针SP和HP修饰在金纳米颗粒(AuNPs)表面。在抗生素存在时，抗生素与APT的特异性结合并使APT脱离SDB，紧接着CP则与AuNPs修饰的HP杂交形成SDB‑AuNPs体系；AuNPs表面修饰的SP结合SAv‑HRP后可催化SAv‑HRP后催化TMB‑H2O2或OPD‑H2O2溶液变色，利用370nm或450nm处紫外吸光度的变化与抗生素浓度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品的紫外吸光度，即可实现抗生素含量的灵敏检测。该方法具有高灵敏度，低成本，易操作等特点，可实现样品中多重抗生素的灵敏测定。

Description

一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法
技术领域
本发明是一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，特别是牛奶中多重抗生素的检测方法，属于分析化学领域。
背景技术
抗生素是一类药物，广泛用于预防和治疗许多引起传染病的细菌。抗生素通常通过合成，半合成或天然的方式生产。然而，由于转化的恶性循环和长期不利影响，食品或环境中的抗生素残留已经成为一个严重的问题。不同类型的抗生素残留物可被人体吸收，对人体健康构成严重威胁，因此，为避免这种后果，应建立食品源抗生素残留的实用的抗生素分析方法，对实际生产生活具有重大意义。
金纳米颗粒因其独特的物理和化学性质，被广泛用于信号放大的纳米材料之一。可在其表面偶联其他许多功能分子，成功保持其原有生物特性的同时，拥有更好的稳定性。快速和简化操作的显着优点。磁珠由于其独特的优势，已经成为分离生物技术的优秀工具，磁珠分离技术与其他分离技术(如色谱分离，离心分离和膜分离)相比具有高通量，低成本，因此，建立一种专一性强、操作简便、假阳性误差小，同时，快速、简易、灵敏的抗生素检测方法显得尤为重要。
现今，检测抗生素常见技术主要有色谱法和其联用技术、酶免疫分析法、毛细管电泳法、电化学方法与比色法等。这些方法中的大多数都有一定的缺陷，繁琐的样本预处理程序、免疫化学方法的试剂昂贵、检测时间长、复杂的仪器。因此，通过磁珠分离和金纳米颗粒信号放大可建立一种灵敏高效，价格低廉、假阳性误差小、简便快捷的卡那霉素的检测方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是将磁珠快速分离收集与金纳米颗粒的信号放大的优势结合起来，建立一种简单、成本低廉，极高灵敏度且简便的应用于实际样品中多重抗生素含量的检测方法。
本发明的技术方案：本发明是一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，首先将抗生素适体(APT)与生物素标记的探针CP退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面，探针SP和HP修饰在金纳米颗粒(AuNPs)表面；在抗生素存在时，抗生素与APT的特异性结合并使APT脱离SDB，紧接着CP则与AuNPs修饰的HPKNA杂交形成SDB-AuNPs体系；AuNPs表面修饰的SP结合SAv-HRP后可催化TMB-H2O2或OPD- H2O2溶液变色，利用370nm或450nm处紫外吸光度的变化与抗生素浓度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品的紫外吸光度，即可实现抗生素含量的灵敏检测。该方法具有高灵敏度，低成本，易操作等特点，可实现样品中多重抗生素的灵敏测定。
方法包括以下步骤：SDB的预处理、探针修饰SDB的制备、金纳米颗粒的制备、探针修饰AuNPs的制备、样品孵育，紫外分光光度计检测。
(1)磁珠的预处理
取10mg/mL的链霉亲和素偶联磁珠(SDB)原液于EP管中，加入含有1mM EDTA， 2MNaCl的10mM Tris-HCl(pH 7.5)冲洗磁珠3次，最后用10mM PBS(pH 7.0)重悬SDB，得到2mg/mL干净磁珠备用。
(2)探针修饰SDB的制备
将20μL 10μM APT和20μL 10μM CP加入到210μL含0.3M NaCl，10mM PBS(pH 7.0)溶液中，得到总体积250μL的混合液，将该混合液于90℃加热2min后缓慢降至室温。在250μL的混合液加入上述(1)中预处理的50μL磁珠溶液混匀，在37℃孵育90min，用 10mM PBS(pH7.0)洗涤3次后，加入500μL 2％BSA室温孵育1h后，将CPOTC/APTOTC修饰好的SDB和CPKAN/APTKAN修饰好的SDB分别重悬于50μL 10mM PBS(pH 7.0)中，最后，将得到的CPOTC/APTOTC和CPKAN/APTKAN修饰的两种SDB等体积混合，用于识别 OTC和KAN。
上述APTOTC的序列为：5′-CGT ACG GAA TTC GCT AGC GGG CGG GGG TGC TGG GGGAAT GGA GTG CTG CGT GCT GCG GGG ATC CGA GCT CCA CGT G-3′
上述CPOTC的序列为：5′-Biotin-ATA TAT ATA TCA CGT GGA GCT CGG ATC CCCGCA GCA CGC AGC ACT CCA TTC CCC CAG CAC CCC CGC CCG CTA GCG AAT TCC GTA CG-3′
上述APTKNA的序列为：5′-AGA TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA-3′
上述CPKNA的序列为：5′-Biotin-ATA TAT ATA TTC GGC TTA GCC TCA ACC CCCATC T-3′
(3)金纳米颗粒的制备
制备所需的所有玻璃器皿必须在新配置王水(HNO3∶HCl＝3∶1)中浸泡30min后，用大量的双蒸水冲洗并在烘烤箱中烘干备用。金纳米颗粒的制备过程如下：配制100mL0.01％的氯金酸加入三颈瓶中，搅拌并加热至沸腾。待其煮沸后，在剧烈搅拌下迅速加入3.5 mL 1％的柠檬酸三钠，继续加热搅拌15min后待溶液变成酒红色关闭加热器，继续搅拌30 min，关闭搅拌器，待溶液冷却至室温后，将制备好的金纳米颗粒(AuNPs)存放于棕色试剂瓶中并放置在4℃冰箱保存。
(4)探针修饰AuNPs的制备
取100μL上述(3)中制备的金纳米颗粒加入4μL 10μM的HP、40μL 10μM的SP 和356μL 10mM PBS(pH 7.0)制成500μL混合液，将该混合液于37℃孵育1h后，12000rpm， 4℃离心20min，弃上清485μL后，加485μL 10mM PBS(pH 7.0)重悬(重复离心洗涤3 次)，得到HPOTC/SPOTC修饰金纳米颗粒和HPKNA/SPKNA修饰的金纳米颗粒。
上述HPOTC的序列为：5′-SH-AAA AAA CGT ACG GAA TTC-3′
上述SPOTC的序列为：5′-Biotin-ATA TAT ATA TCA CGT GGA GCT CGG AAA AAA A-SH-3′
上述HPKNA的序列为：5′-SH-AAA AAA AGA TGG GGG TTG-3′
上述SPKNA的序列为：5′-Biotin-ATA TAT ATA TTC GGC TTA GCC TCA AAA AA-SH-3′
(5)样品孵育
将上述(2)中制备的2mg/mL CPOTC/APTOTC和CPKAN/APTKAN修饰的两种SDB混合液4μL与4μL含不同浓度的OTC和KNA的牛奶样品和2μL含0.1M NaCl的10mM PBS (pH 7.4)制成混合液于37℃孵育1h，用10mM PBS(pH 7.0)清洗3次并重悬。
(6)紫外分光光度计检测
对于OTC分析，将上述(5)中溶液的一半磁性分离，弃去上清液，加入12.5μL上述(4)中制备的HPOTC/SPOTC修饰的金纳米颗粒于37℃孵育1h，用100μL 10mM PBS(pH 7.0)清洗3次后重悬，加入0.5μL的SAv-HRP(0.01mg/mL)在37℃下孵育1h，用200μL 10mM PBS(pH6.0)清洗5次后加600μL TMB-H2O2溶液重悬磁珠，37℃孵育30min后观察颜色变化并检测370nm处的紫外吸光度。
对于KNA分析，使用上述(5)中溶液的另一半磁性分离，弃去上清液，加入12.5μL上述(4)中制备的HPKNA/SPKNA修饰的金纳米颗粒于37℃孵育1h，用100μL 10mM PBS (pH7.0)清洗3次并重悬，加入0.5μL的SAv-HRP(0.01mg/mL)在37℃下孵育1h，用 200μL 10mMPBS(pH 6.0)清洗5次后加600μL OPD-H2O2(含7.4mM OPD和5.9mM H2O2的20mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，pH 5.0)重悬磁珠于37℃孵育30分钟后观察颜色变化并检测450nm处紫外吸光度。
氧四环素的浓度在10-6至105pg/mL时，溶液颜色从透明逐渐变为深蓝色，在370nm处的吸光度随着氧四环素浓度的升高而增加，吸光度与浓度存在良好线形关系，符合定量要求。卡那霉素的浓度在10-6至105pg/mL的时，溶液颜色从透明逐渐变为深黄色，在450nm处的吸光度随卡那霉素浓度的升高而增加，吸光度与浓度存在良好线形关系，符合定量要求。
本发明的有益效果：①本方法利用氧四环素和卡那霉素适体设计不同的DNA探针，磁珠的分离和AuNPs介导的信号放大和选择性生物比色传感器的优势，实现了牛奶中抗生素的灵敏检测，对牛奶中氧四环素和卡那霉素宽范围线性范围内定量检测、灵敏检测具有重要意义；②在方法学上具有普遍借鉴意义，通过替换DNA序列，就可以设计出多种抗生素检测的高灵敏度成本低，操作方便，无需繁琐的程序分析方法。
附图说明
图1为一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法的原理图
图2为一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法的专一性图
图3为不同浓度氧四环素和卡那霉素存在下，紫外吸光度与氧四环素和卡那霉素的浓度关系图
具体实施方式
实施例1.一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法的专一性检测
在最佳实验条件下，进行了体系专一性验证。将上述方法步骤(2)中制备的4μLSDB 与4μL不同种类的抗生素和2μL含0.1M NaCl的10mM PBS(pH 7.0)制成混合液于37℃孵育1h，10mM PBS(pH 7.4)清洗后加入12.5μL上述步骤(4)中SP/HP修饰的AuNPs 于37℃孵育1h，用10mM PBS(pH 7.0)清洗并重悬，然后加入0.5μL的SAv-HRP(0.01mg /mL)在37℃下孵育1h后用200μL 10mM PBS(pH 6.0)清洗，加入600μL TMB-H2O2或OPD-H2O2重悬磁珠于37℃孵育30分钟后观察颜色变化并检测370nm或450nm处紫外吸光度。测得的扫描结果如图2A-D所示，该检测方法对抗生素有很好的选择性。
实施例2.不同浓度氧四环素和卡那霉素存在下，紫外吸光度与氧四环素和卡那霉素的浓度的测定
将上述方法步骤(2)中制备的4μL CPOTC/APTOTC和CPKAN/APTKAN修饰的两种 SDB混合液与4μL不同浓度的氧四环素和卡那霉素和2μL含0.1M NaCl，PH值为7.0的10 mM PBS制成混合液于37℃孵育1h，10mM PBS(pH 7.0)清洗。对于加入12.5μL上述步骤(4)中SP/HP修饰的AuNPs于37℃孵育1h，用10mM PBS(pH 7.0)清洗并重悬，对于氧四环素的检测将上述(5)中溶液的一半磁性分离，弃去上清液，加入12.5μL上述(4) 中制备的表面修饰了HPOTC/SPOTC的金纳米颗粒于37℃孵育1h，用100μL 10mM PBS(pH 7.0)清洗3次后重悬，加入0.5μL的SAv-HRP(0.01mg/mL)在37℃下孵育1h，用200μL 10mM PBS(pH 6.0)清洗5次后加600μLTMB-H2O2溶液重悬磁珠，37℃孵育30min后观察颜色变化并检测370nm处的紫外吸光度。检测的结果如图3A、3C和3E 所示，当氧四环素的浓度在10-6至105pg/mL时，溶液颜色从透明逐渐变为深蓝色，370nm 处的吸光度(Abs370nm)与OTC浓度分别显示出良好的线性关系，两者符合Abs370nm＝0.0845 logcOTC+0.6718(R2＝0.997)，其中Abs代表吸光度值，c代表OTC(pg/mL)的浓度。
对于KNA分析，使用上述(5)中溶液的另一半磁性分离，弃去上清液，加入12.5μL上述(4)中制备的表面修饰了HPKNA/SPKNA的金纳米颗粒于37℃孵育1h，用100μL 10mM PBS(pH 7.0)清洗3次并重悬，加入0.5μL的SAv-HRP(0.01mg/mL)在37℃下孵育1h，用200μL10mM PBS(pH 6.0)清洗5次后加600μL OPD-H2O2(含7.4mM OPD和5.9mM H2O2的20mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，pH 5.0)重悬磁珠于37℃孵育30分钟后观察颜色变化并检测450nm处紫外吸光度。检测结果如图3B、3D和3F所示，当卡那霉素的浓度在10-6至105pg/mL，溶液颜色从透明逐渐变为深黄色，450nm处的吸光度(Abs450nm) 与KNA浓度分别显示出良好的线性关系，两者符合Abs450nm＝0.0850logcKAN+0.6650(R2＝ 0.997)，其中Abs代表吸光度值，c代表KNA(pg/mL)的浓度。
往牛奶中添加标准浓度氧四环素和卡那霉素制备人工污染牛奶的方法获得氧四环素或卡那霉素的牛奶样品替代上述不同浓度的氧四环素或卡那霉素标准溶液，实验结果(表1) 所示，证明了该体系具有实际的操作性，很好的可信度和重复性。
表1.牛奶样品实测结果
Figure BSA0000161817140000051
Figure ISA0000161817160000011

Claims (5)

1.一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，首先将20μL 10μM抗生素适体APT与20μL 10μM生物素标记的探针CP在90℃退火杂交形成双链DNA修饰在50μL 10mg/mL链霉亲和素偶联磁珠SDB表面，探针40μL 10μM的SP和4μL 10μM的HP修饰在100μL金纳米颗粒AuNPs表面；在一系列标准浓度的氧四环素存在时，溶液颜色从透明逐渐变为深蓝色，利用370nm处紫外吸光度的变化与氧四环素浓度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品的紫外吸光度，即可实现氧四环素含量的灵敏检测；在一系列标准浓度的卡那霉素存在时，溶液颜色从透明逐渐变为深黄蓝色，利用450nm处紫外吸光度的变化与卡那霉素浓度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品的紫外吸光度，即可实现卡那霉素含量的灵敏检测。
2.根据权利要求1所述的一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，其特征是将抗生素适体APT与生物素标记的探针CP退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠SDB表面，将20μL 10μM APT和20μL 10μM CP加入到210μL含0.3M NaCl，pH值为7.0的10mM PBS中，90℃加热2min后缓慢降至室温，之后加入50μL SDB，37℃孵育90min，用pH值为7.0的10mM PBS洗涤3次后，加入500μL 2％BSA室温孵育1h后，将CPOTC/APTOTC修饰的SDB和CPKAN/APTKAN修饰的SDB分别重悬于50μL pH值为7.0的10mM PBS溶液中，最后将得到的CPOTC/APTOTC修饰的SDB和CPKAN/APTKAN修饰的SDB等体积混匀。
3.根据权利要求2所述的一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，其特征是生物素修饰的探针SP和HP通过巯基修饰在AuNPs表面，将制备的AuNPs 100μL加入4μL 10μM的HP、40μL 10μM的SP和356μL pH值为7.0的10mM PBS于37℃孵育1h，12000rpm，4℃离心20min，用pH值为7.0的10mM PBS重复离心洗涤3次得到HPOTC/SPOTC修饰的AuNPs和HPKNA/SPKNA修饰的AuNPs。
4.根据权利要求3所述的一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，其特征是当体系中存在抗生素即氧四环素和卡那霉素时，抗生素与APT的特异性结合并使APT脱离SDB，紧接着CP则与AuNPs修饰的HP杂交形成SDB-AuNPs体系，将上述权利要求3中CPOTC/APTOTC修饰的SDB和CPKAN/APTKAN修饰的SDB混合物4μL、4μL不同浓度氧四环素或卡那霉素和2μL含0.1MNaCl，pH值为7.4的10mM PBS制成混合液并于37℃孵育1h，用pH值为7.0的10mM PBS洗涤后加入12.5μL上述权利要求3中HPOTC/SPOTC修饰的AuNPs或HPKNA/SPKNA修饰的AuNPs于37℃孵育1h，用100μL pH值为7.0的10mM PBS清洗3次并重悬形成SDB-AuNPs体系。
5.根据权利要求4所述的一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，其特征是AuNPs表面修饰的SP结合SAv-HRP后可催化TMB-H2O2或OPD-H2O2溶液变色，利用370nm或450nm处紫外吸光度的变化与抗生素浓度的关系，测定一系列标准浓度抗生素的紫外吸光度的大小绘制标准曲线，通过测量待测样品的紫外吸光度，即可实现抗生素含量的灵敏检测，将上述权利要求4中形成SDB-AuNPs体系中加入0.5μL 0.01mg/mL的SAv-HRP于37℃下孵育1h，用200μL pH值为6.0的10mM PBS清洗5次，加600μL TMB-H2O2或OPD-H2O2溶液重悬磁珠于37℃孵育30min后观察颜色变化并检测370nm或450nm处紫外吸光度，测定一系列标准浓度抗生素的紫外吸光度的大小绘制标准曲线，绘制标准曲线，用人工污染牛奶的方法获得氧四环素或卡那霉素的牛奶样品替代上述不同浓度的氧四环素或卡那霉素标准溶液，得到紫外吸光度通过标准曲线可计算出实际牛奶中抗生素的浓度。
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