CN113933280B - 一种检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针及其制备方法和应用。检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针的制备方法：将包括柠檬酸、乙二胺和水在内的原料进行第一混合，加热进行第一反应，然后进行第一分离得到碳点溶液；将所述碳点溶液、鸟苷单磷酸酯溶液、六水硝酸铈溶液和缓冲溶液进行第二混合，进行第二反应后通过第二分离得到所述探针。检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针，使用所述制备方法制得。探针的应用，用于检测四环素。本申请提供的探针，对四环素具有荧光和共振瑞利散射光双重信号响应，且该双元信号可由单一仪器荧光光谱仪测得，因而用于四环素检测时可以实现快速双元信号交叉验证。
Description
技术领域
本申请涉及食品安全分析领域，尤其涉及一种检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针及其制备方法和应用。
背景技术
四环素是一类广谱抗生素，属于多环并四苯羧基酰胺母核的衍生物，对病原微生物具有良好的抗菌活性。四环素因其成本低、优异的抗菌性能和良好的治疗效果，被广泛应用于畜牧业中。然而，四环素很难降解，可能会在土壤、水、肉类、鸡蛋和牛奶等食品中不断积累。过量的四环素使用会导致牲畜和人类对四环素产生抗药性，这对生态系统和人类健康都有着极大的不良影响。研究发现，经常摄入四环素会对人体造成肝、肾损害，尤其是孕妇对四环素肝毒性更为敏感。食品中四环素的残留对人体健康具备极大的威胁，越来越受到人们关注。现今，四环素常见的检测方法包括微生物法、高效液相色谱法、免疫分析法、毛细管电泳法、液相色谱-质谱联用法等。然而这些检测方法成本高，操作复杂，难以满足快速检测的要求。灵敏度高、操作简便、准确度好的四环素检测方法具有强烈的社会和市场需求。光谱分析方法如荧光法、比色法等在食品安全快速检测中被广泛利用，其中，光学探针是光谱分析中的关键因素。
研发一种能够高效、灵敏、快速、低成本检测四环素的探针，成为人们研究的重点。
发明内容
本申请的目的在于提供一种检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针及其制备方法和应用，以解决上述问题。
为实现以上目的，本申请采用以下技术方案：
一种检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针的制备方法，包括：
将包括柠檬酸、乙二胺和水在内的原料进行第一混合，加热进行第一反应，然后进行第一分离得到碳点溶液；
将所述碳点溶液、鸟苷单磷酸酯溶液、六水硝酸铈溶液和缓冲溶液进行第二混合，进行第二反应后通过第二分离得到所述检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针。
优选地，所述第一混合包括：将所述柠檬酸、所述乙二胺和所述水混合，至所述柠檬酸溶解。
优选地，所述第一反应的温度为150-200℃，时间为4-6h。
优选地，所述第一分离使用透析袋进行。
优选地，所述第二混合包括：将所述鸟苷单磷酸酯溶液和所述碳点溶液搅拌均匀，然后依次加入所述六水硝酸铈溶液和所述缓冲溶液。
优选地，所述第二分离为离心分离，所述离心分离的速度为5000-15000rpm，时间为1-10min。
优选地，所述第二分离之后还包括：
将所述第二分离得到的固体物用水洗涤2-3次。
优选地，所述探针用超纯水定容得到溶液，于4℃下保存。
本申请还提供一种检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针，使用所述的检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针的制备方法制得。
本申请还提供一种所述的检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针的应用，用于检测四环素。
与现有技术相比，本申请的有益效果包括：
本申请提供的检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针的制备方法，制备过程简单，成本低，原料易得，方便规模化生产；
本申请提供的检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针，具有蓝色荧光发射，同时具有强烈的共振瑞利散射光特性，可实现对四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号检测；该探针选择性高、灵敏度好、检测速度快，仅对四环素类物质有响应。对青霉素、氯西林钠一水合物、羟氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、丝氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、Ca2+、K+、Na+、Cl-、NO3 -、SO4 2-、Mg2+、PO4 3-等可能干扰物的响应很低，说明该探针具有很好的选择性和特异性。
采用本申请提供的探针可有效的定量检测牛奶中四环素残留，并且更加高效、灵敏、快速、节约成本，对控制食品质量安全和保障人们身体健康具有重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对本申请范围的限定。
图1为本发明用于检测四环素的探针与不同浓度四环素作用的荧光(A)和共振瑞利散射光(B)响应示意图；
图2为本发明用于检测四环素的探针与不同浓度四环素作用的荧光(A)和共振瑞利散射光(B)强度线性关系示意图；
图3为本发明用于检测四环素(TC)的探针与青霉素(penicillin G)、氯西林钠(cloxacillin)、羟氨苄青霉素(amoxicillin)、氯霉素(chloramphenicol)、卡那霉素(kanamycin)、丝氨酸(aspartic acid)、天冬氨酸(serine)、甘氨酸(glycine)、Ca2+、K+、Na+、Cl-、NO3 -、SO4 2-、Mg2+、PO4 3-等可能干扰物的荧光(A)和共振瑞利散射光(B)响应示意图。
图4为本发明用于检测四环素的探针制备方法中是否使用碳点的荧光光谱对比图(A)和是否使用鸟苷单磷酸酯的共振瑞利散射光谱对比图(B)。
具体实施方式
如本文所用之术语：
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。
本申请提供一种检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针的制备方法，包括：
将包括柠檬酸、乙二胺和水在内的原料进行第一混合，加热进行第一反应，然后进行第一分离得到碳点溶液；
将所述碳点溶液、鸟苷单磷酸酯溶液、六水硝酸铈溶液和缓冲溶液进行第二混合，进行第二反应后通过第二分离得到所述检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针。
在一个优选的实施方式中，所述第一混合包括：将所述柠檬酸、所述乙二胺和所述水混合，至所述柠檬酸溶解。
在一个优选的实施方式中，所述第一反应的温度为150-200℃，时间为4-6h。
可选的，所述第一反应的温度可以为150℃、160℃、170℃、180℃、190℃、200℃或者150-200℃之间的任意值，时间可以为4h、5h、6h或者4-6h之间的任意值。
在一个优选的实施方式中，所述第一分离使用透析袋进行。
在一个优选的实施方式中，所述第二混合包括：将所述鸟苷单磷酸酯溶液和所述碳点溶液搅拌均匀，然后依次加入所述六水硝酸铈溶液和所述缓冲溶液。
在一个优选的实施方式中，所述第二分离为离心分离，所述离心分离的速度为5000-15000rpm，时间为1-10min。
可选的，所述离心分离的速度可以为5000rpm、10000rpm、15000rpm或者5000-15000rpm，时间可以为1min、5min、10min或者1-10min。
在一个优选的实施方式中，所述第二分离之后还包括：
将所述第二分离得到的固体物用水洗涤2-3次。
在一个优选的实施方式中，所述探针用超纯水定容得到溶液，于4℃下保存。
本申请还提供一种检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针，使用所述的检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针的制备方法制得。
本申请还提供一种所述的检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针的应用，用于检测四环素。
下面将结合具体实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种用于检测四环素的荧光与共振瑞利散射双元信号探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)碳点的制备：称取柠檬酸1.2670g到烧杯中，加入1608μL的乙二胺和30mL的水使柠檬酸完全溶解。然后将其转至高压釜中，在200℃条件下保持5h。取出冷却至室温后，用透析袋(1000Da)透析24h得到碳点溶液(0.064mg/mL)，并于4℃下保存。
(2)碳点@鸟苷单磷酸酯/铈(CDs@GMP/Ce)探针的制备：分别配制六水硝酸铈溶液(25mmol/L)，鸟苷单磷酸酯溶液(20mmol/L)各10mL，然后将鸟苷单磷酸酯溶液与(1)中所述碳点通过磁力搅拌器混匀，再取配制好的六水硝酸铈溶液加入其中，与HEPEs缓冲溶液一起混合后，用磁力搅拌器在25℃的条件下搅拌1h以达到充分混匀的效果。最后，将混匀的溶液以10000rpm/min的速度离心5min，取沉淀水洗2-3次，并用超纯水重新定容得到CDs@GMP/Ce溶液(0.42g/mL)，于4℃下保存。
实施例2
本实施例提供了一种用于检测四环素的荧光与共振瑞利散射双元信号探针的制备方法，与实施例1不同的是，碳点的制备条件采用150℃条件下保持6h，碳点@鸟苷单磷酸酯/铈(CDs@GMP/Ce)探针的制备采用以8000rpm/min的速度离心10min。可以理解，碳点的制备还可以为其它温度和时间条件，碳点@鸟苷单磷酸酯/铈(CDs@GMP/Ce)探针的制备还可以是其它离心速度和时间条件。
实施例3
本实施例公开了一种用于检测四环素的荧光与共振瑞利散射双元信号探针测定四环素的线性范围和灵敏度。
使用实施例1中制得的探针CDs@GMP/Ce与四环素作用的荧光与共振瑞利散射光谱测试：
取0.42g/mL的CDs@GMP/Ce 100μL到1.5mL的离心管中，加入一系列不同浓度(0、0.1、1.0、5.0、8.0、10、12、15、18、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100μmol/L)的四环素50μL，最后加入350μL PBS缓冲液(pH 7.4)在25℃下反应5min后。以激发波长为350nm的条件下测定445nm处的荧光强度为F，不加四环素测得的荧光强度为F0；以激发波长为350nm的条件下测定705nm处的共振瑞利散射光强度为S，共振瑞利散射光强度为S0。探针CDs@GMP/Ce与四环素作用后的荧光和共振瑞利散射光光谱响应图分别如图1中A和B所示。该实验结果表明，随着四环素浓度的增加(0-100μmol/L)，CDs@GMP/Ce探针在445nm处的荧光强度不断减少，同时705nm处的二级共振瑞利散射光强度也不断减弱。以ΔF/F、ΔS/S(此处的ΔF＝F0-F，ΔS＝S0-S)为纵坐标，四环素浓度为横坐标作图，最后做ΔF/F与四环素浓度、ΔS/S与四环素浓度之间的线性拟合图。如图2中A所示，当四环素的浓度为0.1-80μmol/L时，ΔF/F与四环素浓度线性关系良好，可得到荧光法检测四环素的线性方程为(ΔF/F)＝0.0322C四环素+0.0184，R2＝0.9960，检出限为43nmol/L；如图2中B所示，当四环素的浓度为0.1-40μmol/L时，ΔS/S与四环素浓度线性关系良好，可得到共振瑞利散射法检测四环素的线性方程为(ΔS/S)＝0.0397C四环素+0.0833，R2＝0.9933,检出限为77nmol/L。
随着四环素浓度的增加，CDs@GMP/Ce的荧光和共振瑞利散射光强度皆会降低。根据这一响应现象构建检测四环素的荧光和共振瑞利散射二元信号检测方法，也就是说探针CDs@GMP/Ce的荧光和共振瑞利散射光强度变化跟四环素的浓度变化呈线性关系，从而可以实现食品中四环素的高灵敏、高选择性、快速的荧光和共振瑞利散射光二元信号定量检测。
实施例4
本实施例公开了一种用于检测四环素的荧光与共振瑞利散射双元信号探针检测四环素的选择性。
使用实施例1中制得的探针CDs@GMP/Ce用于与非四环素抗生素和常见化学物质作用情况分析：
取100μmol/L牛奶中常见的物质100μL到1.5mL的离心管中，往里加入探针CDs@GMP/Ce 100μL，再加PBS缓冲液(pH 7.4)定容至500μL，于25℃下反应5min后测其荧光和共振瑞利散射光强度。其中，青霉素(penicillin G)、氯西林钠(cloxacillin)、羟氨苄青霉素(amoxicillin)、氯霉素(chloramphenicol)、卡那霉素(kanamycin)、丝氨酸(asparticacid)、天冬氨酸(serine)、甘氨酸(glycine)、Ca2+、K+、Na+、Cl-、NO3 -、SO4 2-、Mg2+、PO4 3-以及所有干扰物混合在一起的浓度分别为100μmol/L，四环素(TC)的浓度为50μmol/L，荧光强度比值(ΔF/F0)和共振瑞利散射光强度的比值(ΔS/S0)结果分别如图3中A和B所示。结果表明，探针CDs@GMP/Ce对四环素具有良好的特异性。
实施例5
本实施例公开了一种用于检测四环素的荧光与共振瑞利散射双元信号探针应用检测牛奶中的四环素残留。使用实施例1中制得的探针CDs@GMP/Ce用于牛奶中四环素的双元信号检测及加标回收率分析：
测试的牛奶随机购自某超市、某品牌的纯牛奶，牛奶样品去蛋白以及前处理按如下方法进行：取牛奶5mL，加入100μL的三氯乙酸(10％)溶液，超声20min再离心(转速10000rpm/min)15min后，取上清液用0.22μm的膜过滤以除去杂质。通过用不同体积的四环素储备溶液“加标”来制备一系列含有不同四环素浓度的牛奶样品，然后将这些加标样品添加到探针CDs@GMP/Ce体系中，将所得溶液充分混匀并孵育5min。最后，记录它们的发射光谱(λem＝445nm)和二级共振瑞利散射光谱(λem＝705nm)。根据四环素浓度与荧光强度比值(ΔF/F)、共振瑞利散射光强度比值(ΔS/S)之间的线性关系方程，得到牛奶中四环素检测的加标回收率结果如表1所示，荧光方法检测牛奶样品中四环素的加标回收率为91.4-109.6％，相对标准偏差(RSD)为0.1-1.0％；共振瑞利散射方法检测牛奶样品中四环素的加标回收率为89.1-121.8％，RSD为0.3-1.0％。因此，该试验结果可说明具备荧光和共振瑞利散射双元信号的探针CDs@GMP/Ce对牛奶中四环素的检测具有令人满意的重复性和准确性。
表1 牛奶中四环素检测及加标回收率
注:N.D.a，未检出。
对比例1
与实施例1不同的是，碳点@鸟苷单磷酸酯/铈(CDs@GMP/Ce)探针制备过程中不加入碳点。
通过检测表明，对比例1所得材料无荧光性能(图4A所示)。
对比例2
与实施例1不同的是，碳点@鸟苷单磷酸酯/铈(CDs@GMP/Ce)探针制备过程中不加入鸟苷单磷酸酯。
通过检测表明，对比例2所得材料无较强的共振瑞利散射性能(图4B所示)。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本申请的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本申请的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
Claims (8)
1.一种检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针的应用，其特征在于，所述检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针的制备方法包括：
将包括柠檬酸、乙二胺和水在内的原料进行第一混合，加热进行第一反应，然后进行第一分离得到碳点溶液；
将所述碳点溶液、鸟苷单磷酸酯溶液、六水硝酸铈溶液和缓冲溶液进行第二混合，进行第二反应后通过第二分离得到所述检测四环素的荧光和共振瑞利散射光双元信号探针。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一混合包括：将所述柠檬酸、所述乙二胺和所述水混合，至所述柠檬酸溶解。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一反应的温度为150-200℃，时间为4-6h。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一分离使用透析袋进行。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二混合包括：将所述鸟苷单磷酸酯溶液和所述碳点溶液搅拌均匀，然后依次加入所述六水硝酸铈溶液和所述缓冲溶液。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二分离为离心分离，所述离心分离的速度为5000-15000rpm，时间为1-10min。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二分离之后还包括：
将所述第二分离得到的固体物用水洗涤2-3次。
8.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述探针用超纯水定容得到溶液，于4℃下保存。
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