CN111505266A - 基于双色荧光分析法定量检测氯霉素的试剂盒及方法 - Google Patents

基于双色荧光分析法定量检测氯霉素的试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于双色荧光分析法定量检测氯霉素的试剂盒及方法，所述的试剂盒包括标记荧光基团的氯霉素核酸适配体A、标记猝灭基团并与A互补的寡核苷酸B以及SYBR Green I核酸染料，根据SYBR Green I荧光减弱的程度和荧光基团的荧光增强程度可实现对氯霉素的高灵敏定量检测。与现有技术中单独使用某一种荧光染料相比，本发明利用两种染料荧光强度变化之和对氯霉素进行检测，能显著地提高氯霉素检测的灵敏度，降低检出限，适合低浓度的痕量检测。

Description

基于双色荧光分析法定量检测氯霉素的试剂盒及方法
技术领域
本发明属于化学传感器及分析技术领域，具体涉及一种基于双色荧光分析法高灵敏定量检测氯霉素的试剂盒及方法。
背景技术
抗生素类药物自研发以来就在医药领域和很多的养殖业中广泛应用，但抗生素大量无节制的使用，随之而来的就是大量含超标药物的废水排放，造成水体的污染。以氯霉素(CAP)为例，CAP具有良好的杀菌消炎作用，并且广普适用、价格便宜，在生产和生活中被大量使用。排放的含CAP废水隶属于有机废水，自然状态下难以降解，且容易被水生生物富集，然后通过食物链传递回到人体，最终对人体造成伤害。长期食用含有CAP的食物将引起机体免疫力下降，身体对病原体的抗性降低，使得部分致病菌产生抗药疾病难以治愈，严重时会导致肝肾损伤。
现有的对于CAP的定性定量检测方法，检测过程过于繁琐，费时费力，成本也相对较高。荧光检测方法因其高的灵敏度而被广泛地应用于目标物的检测中。赵秋伶和张振宇(参见文献《无标记型核酸适体荧光传感器检测氯霉素的含量》)结合无标记CAP核酸适配体及核酸染料SYBR GreenI，建立了一种简单的CAP荧光定量检测法。这种方法操作简单、检测时间短、检测成本低，而且由于引入了CAP的核酸适配体，所以方法的选择性非常好。但是这种方法具有两个明显的不足：一是只用了一种核酸染料SYBR GreenI作为荧光响应信号，其灵敏度相对较低；二是由于灵敏度不高，线性范围不宽，方法检出限相对较高(6μmol/L)，不适合低浓度的痕量检测。
本发明在此基础上进行了改进，在两条互补单链DNA上分别连接有荧光基团和猝灭基团，再结合核酸染料SYBR Green I实现对氯霉素的双色荧光定量检测。对氯霉素的双色荧光定量检测的原理如图1所示。SYBR Green I本身的荧光信号很弱，与单链DNA也几乎不发生作用，但它与双链DNA有很强的亲和性，且与双链DNA结合后，其荧光强度会显著增强。在没有氯霉素时，连有荧光基团的氯霉素适配体与连有猝灭基团的互补短链DNA杂交形成双链，连接在氯霉素适配体一端的荧光基团与连接在互补短链DNA一端的猝灭基团相互靠近，发生荧光共振能量转移，荧光基团的荧光被猝灭基团猝灭，荧光基团的荧光信号很弱；与此同时，核酸染料SYBR Green I与杂交反应形成的双链DNA作用，荧光信号很强。当氯霉素存在时，连有荧光基团的氯霉素适配体与氯霉素结合形成一定的空间结构，导致其不能再与连有猝灭基团的互补短链DNA杂交形成双链，荧光基团的荧光不能被猝灭基团猝灭，其荧光信号恢复；另外，由于没有双链DNA，核酸染料SYBR Green I又不能与单链DNA作用，其荧光信号很弱。这样，通荧光基团荧光增强和核酸染料SYBR Green I减弱的程度，即可实现对氯霉素的双色荧光定量检测。
基于上述研究背景，本发明基于核酸荧光适配体和SYBR Green I核酸染料，开发了一种高灵敏度、高选择性的CAP的双色荧光定量检测方法，实现较低成本并且快速检测氯霉素药物的目的。在本发明中，我们利用两种染料荧光强度变化之和对目标进行检测，与单独使用某一种荧光染料相比，能显著地提高氯霉素检测的灵敏度(标准曲线的斜率显著增大)；另外，与单独使用某一种荧光染料相比，由于检测灵敏度的提高，方法的线性范围也显著增加，且检出限显著降低。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于双色荧光法高灵敏定量检测氯霉素的试剂盒及方法，利用两条分别标记有荧光基团和猝灭基团的DNA以及核酸染料SYBR Green I共同构成了一个氯霉素的检测传感器，从而实现对CAP的高灵敏及高选择检测。该方法降低了原有的检测方法的检出限，检测过程方便快捷，所需反应时间短，并且在不同抗生素存在的条件下仍可实现高灵敏、高选择性的检测。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于双色荧光分析法定量检测氯霉素的试剂盒，包括标记荧光基团的氯霉素核酸适配体A，标记猝灭基团并与A互补的寡核苷酸B，SYBR Green I核酸染料，氯霉素标准品以及缓冲液；
进一步地，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲溶液，更进一步，为pH为7.5-8.0的Tris-HCl缓冲溶液，最佳为0.2mol/L的pH为7.7的Tris-HCl缓冲溶液；
进一步地，上述氯霉素核酸适配体A的序列为5'-ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACGGTC GGC GAG TCG GTG GTA GCC C-3'(SEQ ID NO.1)，寡核苷酸B的序列为5'-GGG CTA CCACCG ACT CGC CG-3'(SEQ ID NO.2)。
进一步地，所述的荧光基团是ROX，所述的猝灭基团是BHQ-2。
基于上述试剂盒用于定量检测氯霉素的方法，包括以下步骤：
1)将标记荧光基团的氯霉素核酸适配体A溶液分别与不同浓度的氯霉素标准溶液、待测样品完全反应，然后分别加入寡核苷酸B溶液、SYBR Green I核酸染料，室温反应；
上述溶液均采用所述缓冲液配置而成；
2)反应完成后，将上述混合液分别进行同步荧光分析，获得荧光基团及SYBRGreen I核酸染料的同步荧光扫描光谱图，分别得到它们最大发射波长处的荧光强度；
3)以荧光基团与SYBR Green I最大发射波长处的荧光强度变化值之和为纵坐标，氯霉素浓度为横坐标制作标准曲线，得荧光强度与氯霉素浓度之间回归方程；最后计算待测样品的浓度；
进一步地，所述的标记荧光基团的氯霉素核酸适配体A溶液与寡核苷酸B溶液的物质的量之比为1:1。
优选的，标记荧光基团的氯霉素核酸适配体A与氯霉素的反应温度为37℃，反应时间为30min。
在本发明中，当体系中不存在CAP时，氯霉素核酸适配体A会与加入的寡核苷酸B形成双链结构，猝灭基团与荧光基团靠近，荧光基团的荧光被猝灭基团所猝灭，荧光信号减弱；与此同时，SYBR Green I核酸染料会与双链结合，SYBR Green I发出较强荧光。当体系中存在CAP时，核酸适配体A因CAP适配体结构的存在，会与CAP形成特异性空间结构，此时加入的寡核苷酸B无法与其形成双链结构，SYBR Green I核酸染料也无法结合，SYBR Green I的荧光很弱；另外，猝灭基团与荧光基团相距较远，荧光基团的荧光不能被猝灭基团所猝灭，荧光基团发出较强荧光。根据SYBR Green I的荧光减弱的程度和荧光基团的荧光增强程度即可实现对氯霉素的双色荧光定量检测。
相对于现有技术，本发明具有以下优点及效果：
(1)高选择性：由于构建的CAP检测传感中引入了CAP的适配体结构，使得传感器对CAP具有极高的选择性；
(2)抗干扰力强：对于荧光强度的检测使用的是同步荧光分析方法，同步荧光分析可以避免散射光的干扰，即使是样品中存在粒径较小的难溶颗粒，也不会对结果的测定产生干扰；
(3)高灵敏度：本发明中引入了SYBR Green I核酸染料，可实现对CAP的双色定量检测，体系的荧光信号有两个，且两个信号峰互不干扰，在目标物浓度发生变化时，两种荧光信号同时发生变化，因此利用两种染料荧光强度变化之和对目标进行检测，与改进前单色荧光定量检测CAP相比，可显著提高检测的灵敏度(表1)；
(4)低检出限：构建的传感平台中SYBR Green I核酸染料的最大激发波长为498nm，最大发射波长为524nm，在同步荧光扫描图谱上显示为在524nm处有很强的SYBRGreen I荧光信号响应；连接在长单链DNA上的ROX基团，其最大激发波长为583nm，在最大发射波长为613nm时，在同步荧光扫描图谱上显示为在613nm处有很强的荧光信号响应；对于长单链DNA的3'端连接的ROX基团，利用短单链DNA的5'端连接的BHQ-2基团和三个连续的G碱基实现对其双重猝灭，其背景信号很弱；对于SYBR Green I核酸染料，在其未与双链DNA结合时其荧光信号也很弱，因此本法所构建的传感器的背景荧光较低；另外由于该传感器灵敏度高(标准曲线斜率大)，所以本发明所建立的方法与改进前单色荧光定量检测CAP相比，检出限显著降低(表1)；
(5)线性范围宽：与已有相近的单色荧光定量检测CAP相比，本发明所用的方法线性范围更宽(表1)；
(6)具有荧光检测方法的常见优点，如成本低、操作简单、检测时间短、荧光信号稳定、没有复杂的前处理过程等；另外本发明所设计的CAP检测传感器在进行测定时无需将加入的过量的传感器去除，且不会对测定结果产生不利影响。
附图说明
图1是本发明所述的双色荧光分析法的检测原理图。
图2是实施例中不同浓度CAP溶液的同步荧光扫描光谱图，氯霉素的浓度a→j分别为：0、0.28、0.56、1.12、2.24、4.48、6.72、8.96、11.2、14nmol/L。
图3A是实施例中传感器用于检测CAP时SYBR Green I的荧光强度与CAP浓度间的工作曲线，图3B是实施例中传感器用于检测CAP时ROX的荧光强度与CAP浓度间的工作曲线，图3C是实施例中传感器用于检测CAP时SYBR Green I与ROX的总荧光强度变化值之和与CAP浓度间的线性工作曲线。
图4为选择性分析实验的结果，氯霉素浓度为14nmol/L，其它抗生素浓度均为140mmol/L。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所描述内容并不局限于此。
标记有荧光基团的CAP适配体荧光探针由DNA合成仪合成，所使用长单链DNA的3'端连接的荧光基团为ROX，碱基序列为5'-ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAGTCG GTG GTA GCC C-3'(SEQ ID NO.1)；短单链DNA的5'端连接的猝灭基团为BHQ-2，碱基序列为5'-GGG CTA CCA CCG ACT CGC CG-3'(SEQ ID NO.2)，适配体探针经由高效液相色谱纯化，并使用质谱检测其序列正确性。
1检测最佳条件优化
本发明对氯霉素核酸适配体与氯霉素反应的最佳温度、反应时间、反应的最佳pH及双链DNA与核酸染料与SYBR Green I结合时间进行了优化。优化的结果为氯霉素核酸适配体与氯霉素反应的最佳温度为37℃，反应时间为30min，反应的最佳pH为7.7，双链DNA与核酸染料与SYBR Green I结合时间为10min。实施例中所有的实验均在该优化条件下完成。
2具体检测方法
(1)将标记有荧光基团ROX的长单链DNA和标记有猝灭基团BHQ-2的短单链DNA分别溶于0.2mol/L的pH为7.7的Tris-HCl缓冲溶液中，配制浓度为1.2×10-7mol/L反应液A和B。
(2)将氯霉素溶解于0.2mol/L的pH为7.7的Tris-HCl缓冲溶液中，配制为浓度为0.28、0.56、1.12、2.24、4.48、6.72、8.96、11.20、14.00nmol/L的氯霉素标准液，为反应液C。
(3)将10000×SYBR Green I核酸染料二氯亚砜浓缩原液用0.2mol/L的pH为7.7的Tris-HCl缓冲溶液稀释10000倍，配制为反应液D。
(4)取反应液A、C各50μL混合均匀，37℃下加热反应30min使其完全反应，然后加入B、D各50μL，补充0.2mol/L的pH为7.7的Tris-HCl缓冲溶液至总体积为500μL，室温下反应10min。
(5)待步骤(4)中的反应完成后，将500μL混合液转移至微量比色皿中，同步扫描的固定波长差设置为28nm(因为荧光基团ROX的斯托克斯位移为30nm，核酸染料SYBR Green I的斯托克斯位移26nm，所以同步扫描的波长差设置为28nm)，激发起始波长设置为372nm，并在400-700nm范围内进行同步荧光扫描，所得光谱曲线如图2所示。
(6)根据图2的结果，在CAP浓度为0.28nmol/L-14nmol/L范围内，拟合体系荧光强度与CAP浓度的之间的回归方程。SYBR Green I和ROX在最大发射波长处的荧光强度变化值与浓度之间拟合的回归方程分别为ΔF1＝42.307C+0.244(R1 2＝0.9992)，ΔF2＝59.967C+4.459(R2 2＝0.9988)。以SYBR Green I的荧光强度变化值与ROX的荧光强度变化值之和为纵坐标，其对应的CAP浓度值为横坐标轴，得到相应的荧光强度与浓度之间的回归方程ΔF3＝102.275C+4.703(R3 2＝0.9993)，其中ΔF1与ΔF2分别为加入CAP后和加入CAP前传感器中SYBR Green I的荧光强度变化值和ROX的荧光强度变化值，ΔF3为加入CAP后和加入CAP前传感器中SYBR Green I的荧光强度变化值与ROX的荧光强度变化值之和，C为CAP的浓度，单位为nmol/L。根据回归方程ΔF3的斜率和11次空白样品测量的相对标准偏差(RSD)计算得到检出限为0.16nmol/L。与已有相近的单色荧光定量检测CAP相比，本发明所用的方法线性范围更宽，灵敏度更高，检出限更低(表1)。
(7)对于实际样品的测定：将实际样品中的氯霉素提取后，将浓度调整到步骤(6)所述的线性范围内(稀释或浓缩)，然后按步骤(4)和(5)进行操作，结合步骤(6)中所得到的工作曲线，实现对实际样品中CAP的定量检测。
(8)加标回收率的测定：将实际样品中的氯霉素提取后，取4份相同的样品提取液，其中1份不加CAP标准溶液，另外3份分别加入不同浓度的CAP标准溶液(表2)，然后按步骤(7)的操作，对每个样品中的CAP进行定量检测，分别计算每个样品的加标回收率，结果如表2所示，回收率在96.8％-98％之间，证明本发明所述的双色荧光定量检测方法准确可靠，可用于实际样品中微量的CAP的含量检测(表2)。
(9)方法选择性分析：选择与氯霉素结构相似的卡那霉素(Kanamycin)、甲砜霉素(Sulfomycin)、土霉素(Oxytetracycline)、四环素(Tetracycline)、链霉素(Streptomycin)这几种抗生素进行方法选择性分析，氯霉素浓度为14nmol/L，其它抗生素浓度均为140nmol/L。结果(图4)表明，氯霉素所产生的荧光信号远大于其它抗生素所产生的荧光信号，说明该方法具有很好的选择性。
表1本发明与改进前的单色荧光检测氯霉素方法的比较
Figure BDA0002441655050000071
表2实际样品中氯霉素含量的测定及加标回收实验
Figure BDA0002441655050000072
序列表
<110> 湖北民族大学
<120> 基于双色荧光分析法定量检测氯霉素的试剂盒及方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acttcagtga gttgtcccac ggtcggcgag tcggtggtag ccc 43
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggctaccac cgactcgccg 20

Claims (5)

1.一种基于双色荧光分析法定量检测氯霉素的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括标记荧光基团的氯霉素核酸适配体A，标记猝灭基团并与A互补的寡核苷酸B，SYBR GreenI核酸染料，氯霉素标准品以及缓冲液。
2.根据权利要求1所述的基于双色荧光分析法定量检测氯霉素的试剂盒，其特征在于，氯霉素核酸适配体A的序列如SEQ ID NO.1所示，寡核苷酸B的序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的基于双色荧光分析法定量检测氯霉素的试剂盒，其特征在于，所述的荧光基团是ROX，所述的猝灭基团是BHQ-2。
4.基于权利要求1所述的试剂盒定量检测氯霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将标记荧光基团的氯霉素核酸适配体A溶液分别与不同浓度的氯霉素标准溶液、待测样品完全反应，然后分别加入寡核苷酸B溶液、SYBR Green I核酸染料，室温反应；
2)反应完成后，将上述混合液分别进行同步荧光分析，获得荧光基团及SYBR Green I核酸染料的同步荧光扫描光谱图，分别得到它们最大发射波长处的荧光强度；
3)以荧光基团与SYBR GreenI核酸染料最大发射波长处的荧光强度变化值之和为纵坐标，氯霉素浓度为横坐标制作标准曲线，得荧光强度与氯霉素浓度之间回归方程；最后计算待测样品的浓度。
5.根据权利要求4所述的定量检测氯霉素的方法，其特征在于，标记荧光基团的氯霉素核酸适配体A与氯霉素的反应温度为37℃，反应时间为30min。
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