CN107677651B - 一种单波长激发双信号增强的Hg2+荧光比率法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种单波长激发双信号增强的Hg2+荧光比率法，属于化学/生物传感及分析检测技术领域，具体地，向含有Mg2+的缓冲溶液中加入单链DNA分子A、单链DNA分子B、NMM和DAPI，得混合液Ⅰ，其中，分子A由Ⅰ和Ⅱ两部分组成，分子B由Ⅲ和Ⅳ两部分组成，分子A的部分Ⅰ和分子B的部分Ⅲ是含有T‑T碱基错配的部分互补序列，分子A的部分Ⅱ和分子B的部分Ⅳ是能形成四链体的富G序列；向混合液Ⅰ中加入Hg2+，振荡，测定荧光强度；其中，测量范围为400‑700 nm，激发波长为380 nm。该方法是一种双信号增强的新型Hg2+比率型荧光分析法，用于对样品中Hg2+的检测，选择性、准确度和可靠性都较高。
Description
技术领域
本发明属于化学/生物传感及分析检测技术领域，具体地涉及一种单波长激发双信号增强的Hg2+荧光比率法。
背景技术
Hg2+是一种重金属离子，Hg2+污染不仅影响环境，也严重威胁人类健康，因此，Hg2+的定量分析具有重要意义。荧光传感器具有灵敏度高、择性好、方法简便、快速响应、无损伤、实时检测等特点，与化学发光法、比色法和电化学分析方法相比，荧光分析法在Hg2+定量分析中具有明显的优势。
在过去几十年里，人们开发出许多的Hg2+荧光传感体系。这些传感器大多都是单一波长激发，最大发射波长不发生移动，以单一波长处荧光强度变化作为定量分析参数，虽然其操作简单、直观、可视化强，但是定量检测时很容易受到探针浓度、试样所处环境以及荧光漂白、散射和背景光等的干扰，所以单波长检测方法在复杂样品中准确测定方面还面临巨大挑战。比率型荧光分析法，又称荧光比率法，是根据两个不同波长处的荧光强度比值来测定目标物，具有自校正作用。因此，可排除受体及被检测物种的环境干扰，并扩大检测范围，提高对复杂体系进行定量分析的准确度。
近年来也已经报道了许多比率型荧光探针并广泛应用于各种分析物的检测。常见的构建比率型荧光检测体系的方法有荧光共振能量转移(FRET)、二聚体形成、激发态质子转移、纳米粒子等。现有的探针普遍存在着水溶性差、生物相容性差等缺点，而DNA具有水溶性好、生物相容性好等特点，广泛应用于荧光传感器的构建。例如，Huang等利用DNA 修饰的AuNPs和双荧光团标记的i-motif序列DNA探针设计了一种基于FRET的比率型荧光探针并用于活细胞内pH值的传感。虽然该类标记型方法灵敏度高、响应速度快，但是通常需要繁琐的功能化或标记过程，同时也提高了成本。而基于DNA荧光染料的免标记DNA 生物传感器方法简单、成本低，已成为生物化学和环境分析的研究热点。DNA荧光染料主要有两类。一是能与dsDNA结合并且荧光信号大大增强的染料。二是能够嵌入G-四链体后荧光信号大大增强的染料。例如，汪尔康院士课题组利用Cu2+与NMM的结合作用发展了一种可以同时检测组氨酸(His)和半胱氨酸(Cys)的免标记传感方法。Chen等基于Tb3+诱导ThT/G-四链体构型转换释放出ThT染料实现了Tb3+的高灵敏度检测。2016年，Cheng等基于K+置换Na+-PPIX的G-四链体中Na+成功应用于检测活体老鼠脑部细胞、肿瘤细胞中的K+和PPIX。相比于双波长检测方法，这些单波长荧光检测方法容易受干扰，准确度不高。 2017年，Guo等利用DAPI和NMM两种DNA结构特异性染料构建了一种新型的免标记比率型荧光传感器。这两种染料的激发光谱相互重叠，可以在同一激发波长处测定双波长信号，测量简单方便。但是检测过程中DAPI信号增强而NMM的信号降低，相对于荧光猝灭，人们更乐意开发荧光增强型的分析方法。但由于技术的局限性，两个波长处的荧光同时增强的比率型荧光分析法难以实现。
发明内容
针对上述Hg2+检测的现状和比率型荧光分析法面临的问题和技术瓶颈，本发明提供一种单波长激发双信号增强的Hg2+荧光比率法，该方法是基于NMM和DAPI两种DNA结构特异性染料构建的一种双信号增强的新型Hg2+比率型荧光分析法，提高了基于G-四链体 /dsDNA自组装结构开关传感体系的选择性和准确度。
一种单波长激发双信号增强的Hg2+荧光比率法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、向含有Mg2+的Tris-HNO3缓冲溶液中加入单链DNA分子A、单链DNA分子B、N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，得混合液Ⅰ，使混合液Ⅰ中DNA分子A的浓度为0.25-1.5μmol/L，DNA分子B的浓度为0.25-1.5μmol/L， NMM的浓度为0.25-0.75μmol/L，DAPI的浓度为0.05-0.5μmol/L；其中，单链DNA分子A 由部分Ⅰ和部分Ⅱ两部分组成，单链DNA分子B由部分Ⅲ和部分Ⅳ两部分组成，所述单链 DNA分子A的部分Ⅰ和单链DNA分子B的部分Ⅲ是含有T-T碱基错配的部分互补序列，所述单链DNA分子A的部分Ⅱ和单链DNA分子B的部分Ⅳ是能形成G-四链体的富G序列；
步骤二、向混合液Ⅰ中加入含有Hg2+的样品，得混合液Ⅱ；
步骤三、将混合液Ⅱ在22-25℃条件下振荡25-30min，随即对混合液Ⅱ进行荧光强度测定；其中，测量范围为400-700nm，激发波长为380nm，荧光激发狭缝宽度为10nm，荧光发射狭缝宽度为10nm，扫描速度为240nm/min。
作为进一步的优化，对混合液Ⅱ进行荧光强度测定时，测量455nm和610nm处的荧光强度，然后计算两波长处荧光强度的比值。
作为进一步的优化，所述Tris-HNO3缓冲溶液的浓度为10mmol/L，pH值为7.4，其中含有的Mg2+的浓度为20mmol/L。
作为进一步的优化，所述混合液Ⅰ中，单链DNA分子A和单链DNA分子B的浓度比为1:1。
作为进一步的优化，所述混合液Ⅱ中，Hg2+的浓度为0.05-3μmol/L。
作为更进一步的优化，混合液Ⅰ中，单链DNA分子A和单链DNA分子B的浓度均为0.5μmol/L，NMM的浓度为0.5μmol/L，DAPI的浓度为0.2μmol/L；混合液Ⅱ中， Hg2+的浓度为2μmol/L。
本发明的有益效果：
1、本发明所述方法为比率型Hg2+荧光分析法，是基于单一波长激发的双信号同时增强的荧光分析法，突破了现有技术中大多基于一个波长处的荧光增强而另一波长处的荧光猝灭(或不变)的比率型荧光分析法的技术瓶颈，本发明基于NMM和DAPI两种DNA结构特异性染料以及ThT/G-四链体，在380nm单一波长激发下，455nm和610nm处出现荧光双信号同时增强，体系中加入的Hg2+与相对荧光强度呈线性关系，△DAPI*△NMM＝4.26C/μ M+0.64105，r＝0.998)，检出限为10nM(S/N＝3)，与传统单波长传感体系相比，灵敏度更高，线性范围更宽。
2、本发明所述方法对Hg2+的选择性良好，向本发明方法体系中加入其它干扰性金属离子，与Hg2+相比，干扰离子的荧光信号非常低，干扰非常小，更进一步的，通过竞争试验，体系中同时加入Hg2+和干扰离子，与只存在Hg2+的体系相比，含干扰离子的检测体系对Hg2+的响应无显著变化，说明本发明方法对Hg2+具有较好的选择性。另外，通过胎牛血清试验也证实，本发明方法对实际样品中Hg2+的检测，准确性高，可靠性强。
附图说明
图1是本发明所述传感体系对不同双链长度DNA的荧光响应图；
图2是本发明所述传感体系对不同pH的缓冲溶液的荧光响应图；
图3是本发明传感体系对NMM浓度的荧光响应图；
图4是本发明传感体系对DAPI浓度的荧光响应图；
图5是本发明传感体系对不同比例的两种单链DNA分子的荧光响应图；
图6是本发明传感体系对DNA浓度的荧光响应图；
图7是Hg2+对荧光强度的响应图；
图8是本发明传感体系对梯度浓度的Hg2+的荧光响应光谱图；
图9是本发明所述方法的传感机理图；
图10是本发明传感体系对不同单一金属离子的荧光响应图；
图11是不含或含有干扰离子的检测体系对Hg2+的响应差异。
具体实施方式
在含有Mg2+的Tris-HNO3缓冲溶液中加入单链DNA分子A、单链DNA分子B、NMM和DAPI，得混合液Ⅰ，使混合液Ⅰ中DNA分子A的浓度为0.25-1.5μmol/L，DNA 分子B的浓度为0.25-1.5μmol/L，NMM的浓度为0.25-0.75μmol/L，DAPI的浓度为0.05- 0.5μmol/L；其中，单链DNA分子A由部分Ⅰ和部分Ⅱ两部分组成，单链DNA分子B由部分Ⅲ和部分Ⅳ两部分组成，所述单链DNA分子A的部分Ⅰ和单链DNA分子B的部分Ⅲ是含有T-T碱基错配的部分互补序列，所述单链DNA分子A的部分Ⅱ和单链DNA分子B的部分Ⅳ是能形成G-四链体的富G序列；
向混合液Ⅰ中加入含有Hg2+的样品，得混合液Ⅱ；
将混合液Ⅱ在22-25℃条件下振荡25-30min，随即对混合液Ⅱ进行荧光强度测定；其中，测量范围为400-700nm，激发波长为380nm，荧光激发狭缝宽度为10nm，荧光发射狭缝宽度为10nm，扫描速度为240nm/min。
下面结合试验例和实施例对本发明作进一步的解释说明。
试验例1-5采用多水平法对影响本发明方法的单因素进行条件优化。
试验例1双链DNA分子的长度对荧光强度的影响
本发明所用的单链DNA分子A和单链DNA分子B由于其特定的分子结构，在Hg2+作用下，可以选择性地结合两段DNA中的T碱基，使得这些T-T碱基错配性成稳定的“T-Hg2+- T”结构，从而形成dsDNA，对不同的碱基对数进行考察，分别选择7、8、9、10对碱基，碱基序列如下表1所示。连接成7对碱基的两条单链的碱基序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；连接成8对碱基的两条单链的碱基序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4 所示；连接成9对碱基的两条单链的碱基序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；连接成10对碱基的两条单链的碱基序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。体系中其它条件不变，结果如图1所示，当dsDNA中错配碱基对为7或8时，对荧光的响应不强，说明dsDNA很短的时候，聚集体不稳定，而当dsDNA中错配碱基对为10时，即dsDNA 较长的时候，背景信号比较高。当碱基对数为9时，一方面背景信号相对(F0)低，另一方面荧光信号强(F/F0＝16.2)，因此，dsDNA的长度选为9nt。
表1碱基序列表
| 名称 | 碱基序列(5’-3’) |
| DNA1-7 | TTTTTTT GTGGGT |
| DNA2-7 | GGGTGGGTGG TTATTTA |
| DNA1-8 | TTTTTTTT GTGGGT |
| DNA2-8 | GGGTGGGTGG TTATTTAT |
| DNA1-9 | TTTTTTTTT GTGGGT |
| DNA2-9 | GGGTGGGTGG TTATTTATT |
| DNA1-10 | TTTTTTTTTT GTGGGT |
| DNA2-10 | GGGTGGGTGG TTATTTATTA |
试验例2缓冲溶液中Mg2+浓度以及溶液pH值对荧光强度的影响
本发明所述方法的传感体系主要是依据Hg2+诱导形成dsDNA，进而使DNA结构发生变化，产生荧光检测信号。Mg2+浓度是影响dsDNA形成的一个关键因素，在含有单链DNA分子和荧光染料而不含Mg2+的10mmol/L Tris-HNO3(pH 7.4)缓冲溶液中，背景信号很弱；加入4mmol/L Mg2+后，荧光信号可以增加2倍，这表明有分裂式G-四链体/dsDNA自组装的形成；当体系中存在有10mmol/L Mg2+时，荧光信号缓慢增加6倍，这说明是体系中产生了更多的G-四链体/dsDNA聚集体；当缓冲溶液中Mg2+浓度达到20mmol/L荧光信号最强 (约16倍)，更高浓度时可能由于静电作用荧光反而开始猝灭。因此，缓冲溶液中Mg2+的适宜浓度为20mmol/L。
对缓冲溶液中Mg2+浓度优化之后，为了进一步探究该传感体系的实际应用性能，对缓冲溶液的pH值也进行了优化。缓冲溶液的pH值直接影响着DNA的带电性和聚集状态，因此，考察pH的影响非常必要。在含有相同浓度的DNA分子和荧光染料不同pH值的10 mmol/LTris-HNO3，20mmol/L Mg2+缓冲溶液中加入相同浓度的Hg2+(4μmol/L)后，荧光信号响应如图2所示。从图中可以看出，缓冲溶液的pH值从7变到8的过程中，体系的荧光强度相对稳定，说明本传感体系在中性pH条件下非常稳定。因此，我们选择缓冲溶液的pH值为7.4，以利于在复杂生物体系中更广泛的应用。
试验例3NMM和DAPI对荧光强度的影响
首先考察了NMM浓度对传感体系的影响。从图3中可以看出，体系中NMM的浓度对传感体系的荧光强度比值△NMM(F/F0)影响很大，△NMM(F/F0)表示在加入2μmol/L Hg2+之后与加入Hg2+之前体系在610nm处的荧光强度比值。当NMM的浓度在0.25- 0.75μmol/L体系的荧光响应达到最大，为保证体系的灵敏度和荧光强度相对稳定，我们选择NMM的浓度为0.5μmol/L。
其次，为了考察DAPI浓度对传感体系的影响，分别在含有不同浓度的DAPI体系中加入相同浓度的Hg2+(2μmol/L)，观察其荧光强度变化△DAPI(F/F0)，△DAPI(F/F0) 表示在加入Hg2+前后体系在455nm处的荧光强度比值。结果如图4所示，当DAPI的浓度达到0.2μmol/L的时候，△DAPI(F/F0)最大，即灵敏度达到最高。因此，DAPI的最优浓度为0.2μmol/L。
试验例4两种单链DNA分子的浓度和比例对荧光强度的影响
首先对体系中单链DNA分子A和单链DNA分子B的比例进行优化，结果如图5所示，当单链DNA分子A与单链DNA分子B的比例大于1时，体系的线性范围非常短，而当比例小于1时，体系的灵敏度差，综合考虑，体系中单链DNA分子A与单链DNA分子B的比例选为1。
在上述1:1的比例条件下，对单链DNA分子A和单链DNA分子B的浓度进行探讨优化，结果如图6所示。当两种DNA分子的浓度均为0.5μmol/L时，体系的灵敏度最高，而当浓度小于或大于0.5μmol/L时，体系的灵敏度都明显降低，因此，体系中两种 DNA分子的浓度最优为0.5μmol/L。
试验例5Hg2+浓度对荧光强度的影响
如图7所示，Hg2+浓度在0.05μmol/L-3μmol/L范围内，Hg2+的浓度与相对荧光强度△ DAPI*△NMM呈线性关系。其中，△DAPI*△NMM表示加入Hg2+前后体系在455nm处、 610nm处的荧光强度比值乘积。线性关系为：△DAPI*△NMM＝4.26C/μM+0.64105， r＝0.998)，检出限为10nM(S/N＝3)，在此浓度范围内，与单波长传感体系相比，灵敏度更高，线性范围更宽。
实施例1本发明所述传感体系对Hg2+的荧光响应
在含有Mg2+的Tris-HNO3缓冲溶液中加入单链DNA分子A、单链DNA分子B、NMM和DAPI，得混合液Ⅰ，使混合液Ⅰ中DNA分子A的浓度为0.5μmol/L，DNA分子B的浓度为0.5μmol/L，NMM的浓度为0.5μmol/L，DAPI的浓度为0.2μmol/L；其中，单链DNA分子A的碱基序列为5’-TTTTTTTTT GTGGGT-3’，单链DNA分子B的碱基序列为5’- GGGTGGGTGG TTATTTATT-3’，其中，单链DNA分子A和单链DNA分子B能形成具有 9个T-T错配碱基的dsDNA。向混合液Ⅰ中分别加入含有不同浓度Hg2+的样品，得14种混合液Ⅱ，使14种混合液Ⅱ中Hg2+的浓度分别为0、0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.2、 1.5、1.7、2.0、2.2、2.5、3.0μmol/L；
将该14种混合液Ⅱ分别在22℃条件下振荡30min，随即对混合液Ⅱ进行荧光强度测定；其中，测量范围为400-700nm，激发波长为380nm，荧光激发狭缝宽度为10nm，荧光发射狭缝宽度为10nm，扫描速度为240nm/min。
结果如图8所示，该图清楚地显示了在Tris-HNO3缓冲溶液中加入不同浓度的Hg2+后荧光强度的变化情况，随着体系中Hg2+浓度的增加，DAPI与NMM的荧光强度逐渐增强。当加入3μmol/L Hg2+时，荧光大约增强14倍。当Hg2+浓度大于3μmol/L时，DAPI 的荧光强度继续增加，但是NMM的荧光缓慢猝灭(图中数据未显示)。这不仅表明Hg2+与 T-T错配碱基对的配位结合形成了dsDNA结构，也证明了在Hg2+作用下dsDNA结构诱导形成分裂式G-四链体，进而决定了该体系在单一波长380nm激发下，455nm和610nm处较为明显地双信号均增强。
该实施例1基于单链DNA分子A和单链DNA分子B的特殊结构以及特定的反应和测量条件，传感机理如图9所示，即当体系中没有Hg2+时，两条DNA链以单链形式存在，体系无荧光信号；当体系中存在Hg2+时，Hg2+可以选择性地与T-T错配碱基结合，形成“T- Hg2+-T”双链结构，而DAPI能够插入该dsDNA结构中，455nm处荧光强度增强。另外， dsDNA的形成拉近了富G序列的距离，使之折叠形成分裂式G-四链体，NMM嵌入G-四链体中，610nm处的荧光强度增强。因此，理论上说明了双信号增强型Hg2+比率荧光检测法的可行性，为利用该方法进行样品中Hg2+的检测奠定了很好的基础。
实施例2本发明所述传感体系对其他金属离子的选择性
与实施例1相似，在最优条件下考察了本发明所述传感体系对一些金属离子(Na+、K+、 Ca2+、Fe3+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Ag+、Cr3+、Mn2+、Cd2+、Ni2+、Pb2+)的响应。如图10，向体系中加入相同浓度的Hg2+或干扰金属离子(2μmol/L)，与Hg2+相比，干扰离子的荧光信号非常低，干扰非常小。为进一步了解本方法的选择性，进行了竞争实验(如图11所示)，向体系中一同加入相同浓度的Hg2+和干扰离子(2μmol/L)，与只存在Hg2+的体系相比，含干扰金属离子的检测体系对Hg2+的响应无显著变化，表明该传感体系对Hg2+的选择性良好。
实施例3胎牛血清中Hg2+含量的检测
采用加标回收法检测胎牛血清中Hg2+的含量，首先对胎牛血清进行预处理，预处理方法为：把胎牛血清与乙醇以1:1的比例混合振荡，放于冰箱冷藏(0-4℃)过夜，第二天取出， 15,000r/min离心10min，取上清液于超滤离心管，分子截留量(Amicon Ultra-0.5mL，Millipore)3kDa，13,000r/min 4℃冷冻离心20min后取过滤液，并冷冻于冰箱中待用。向经预处理的胎牛血清中分别加入一定量的Hg2+，得4种样品，4种样品中Hg2+的浓度分别为0、0.5、1.0和2.0μmol/L，然后采用实施例1所述最优传感体系对胎牛血清样品中的 Hg2+进行检测，结果如下表2所示。
表2胎牛血清中Hg2+的加标回收实验
| 样品 | 加入量/μmol*L<sup>-1</sup> | 检出值<sup>a</sup>/μmol*L<sup>-1</sup> | 回收率(％) | 相对标准偏差(％) |
| 1 | 0 | nd<sup>b</sup> | — | — |
| 2 | 0.5 | 0.51+0.02 | 102 | 4.10 |
| 3 | 1.0 | 0.98+0.05 | 98 | 3.98 |
| 4 | 2.0 | 2.12+0.07 | 106 | 4.72 |
注：a表示3次测定结果的平均值；b表示没有检测到。
一般分析化学上认为，回收率在95％～105％之间说明检测方法的准确性高。由表2 可知，回收率为98％-106％，平均相对标准偏差RSD为4.28％，符合要求，这表明本传感体系可以应用于实际样品中Hg2+的检测，准确性高而且可靠性强。
其中，N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)购于Sigma-Aldrich公司；
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购于百灵威科技有限公司(中国，北京)；
荧光测定所用仪器为日立F-7000荧光光谱仪。
需要说明的是，上述试验例和实施例应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，对本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 商丘师范学院
<120> 一种单波长激发双信号增强的Hg2+荧光比率法
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<170> PatentIn version 3.3
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gggtgggtgg ttatttatta 20
Claims (6)
1.一种单波长激发双信号增强的Hg2+荧光比率法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、向含有Mg2+的Tris-HNO3缓冲溶液中加入单链DNA分子A、单链DNA分子B、N-甲基卟啉二丙酸IX和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，得混合液Ⅰ，使混合液Ⅰ中DNA分子A的浓度为0.25-1.5µmol/L，DNA分子B的浓度为0.25-1.5µmol/L，N-甲基卟啉二丙酸 IX的浓度为0.25-0.75µmol/L，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚的浓度为0.05-0.5µmol/L；其中，单链DNA分子A由部分Ⅰ和部分Ⅱ两部分组成，单链DNA分子B由部分Ⅲ和部分Ⅳ两部分组成，所述单链DNA分子A的部分Ⅰ和单链DNA分子B的部分Ⅲ是含有T-T碱基错配的部分互补序列，所述单链DNA分子A的部分Ⅱ和单链DNA分子B的部分Ⅳ是能形成G-四链体的富G序列；
所述含有Mg2+的Tris-HNO3缓冲溶液的pH为7-8；
步骤二、向混合液Ⅰ中加入含有Hg2+的样品，得混合液Ⅱ；
步骤三、将混合液Ⅱ在22-25℃条件下振荡25-30 min，随即对混合液Ⅱ进行荧光强度测定；其中，测量范围为400-700 nm，激发波长为380 nm，荧光激发狭缝宽度为10nm，荧光发射狭缝宽度为10 nm ，扫描速度为240 nm/min。
2.如权利要求1所述的荧光比率法，其特征在于：对混合液Ⅱ进行荧光强度测定时，测量455nm和610nm处的荧光强度，然后计算两波长处荧光强度的比值。
3.如权利要求1所述的荧光比率法，其特征在于：所述Tris-HNO3缓冲溶液的浓度为10mmol/L，pH值为7.4，其中含有的Mg2+的浓度为20mmol/L。
4.如权利要求1所述的荧光比率法，其特征在于：所述混合液Ⅰ中，单链DNA分子A和单链DNA分子B的浓度比为1:1。
5.如权利要求1所述的荧光比率法，其特征在于：所述混合液Ⅱ中，Hg2+的浓度为0.05 -3.0 µmol/L。
6.如权利要求1-5任意一种所述的荧光比率法，其特征在于：混合液Ⅰ中，单链DNA分子A和单链DNA分子B的浓度均为0.5 μmol/L，N-甲基卟啉二丙酸IX的浓度为0.5 μmol/L，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚的浓度为0.2 μmol/L；混合液Ⅱ中，Hg2+的浓度为2 µmol/L。
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