CN106706575A - 一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法 - Google Patents

一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法，属分析检测技术领域，包括以下步骤：首先选两条长度不等且同时富含T和G两种碱基的非标记单链DNA分子，分别配制成溶液，水浴处理后备用；将所得两种溶液、硫代黄素溶液和Tris‑HNO3缓冲液进行混合，得混合液；在混合液中加入Hg2+，室温震荡30min，在450 nm下测定荧光强度值，根据测定的荧光强度值计算Hg2+的浓度。该方法是基于Hg2+诱导的免标记DNA分子的双链/ G‑四链体自组装及ThT嵌入双链DNA和G‑四链体后荧光剧烈增强，不仅避免了复杂的DNA荧光标记过程，实现荧光信号双重放大，操作简单，成本低廉，特异性好且灵敏度高。

Description

一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法
技术领域
本发明属于化学/生物传感及分析检测技术领域，具体地涉及一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法。
背景技术
Hg2+是一种毒性很大、不能生物降解的重金属离子。随着工业的不断发展，环境中的汞也不断增加，汞被动植物吸收后，通过食物链的传递和生物的富集作用，汞离子对环境的影响，会逐步转化为为对人类健康的影响。当人体体内的汞离子含量积累到一定程度时，会导致脑、肝脏和肾脏功能下降，严重时甚至死亡。
传统检测Hg2+的分析方法主要有电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、原子吸收/荧光光谱、冷原子荧光光谱，高效液相色谱（HPLC）、离子色谱法等。虽然这些方法灵敏度高，选择性好，但是其仪器设备昂贵，样品前处理复杂、检测费力、费时、成本高。
荧光传感器是一种方便的分子识别光化学传感器，具有选择性好、灵敏度高、容易操作等特点，成为检测Hg2+的一种非常重要的方法。目前，常用于Hg2+检测的荧光材料主要有荧光量子点和有机小分子探针，但是现有的探针普遍存在着水溶性差、生物相容性差的缺点，这在很大程度上阻碍了它们的实际应用。作为生物相容材料，DNA 的结构和性能对金属离子的影响非常灵敏，因此已经广泛应用于Hg2+的检测。例如，DNA分子在特殊情况下会形成双链配位结构，作为探针的DNA分子通常通过染料分子标记制得，但标记过程操作复杂，且成本较高。又如，G-四链体是一种富含G碱基的特殊结构的DNA，他具有与相关物质结合而发出荧光的特性，由于其结构的特殊性，它可以选择性地与一些目标分子相互结合而产生荧光信号的变化，因此已经被应用于多种生物传感器的设计中，但是，这些设计中大多存在结构不稳定，荧光信号不灵敏、成本高等问题。
发明内容
针对目前Hg2+测定操作复杂，费时、费力，成本较高的现状，本发明的目的在于提供一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法，该方法是基于：没有Hg2+存在时，免标记单链DNA分子A和免标记单链DNA分子B在溶液中处于自然的无规则卷曲状态，此时单链DNA分子A和单链DNA分子B两端的富G序列距离较远，无法折叠成G-四链体结构。而Hg2+存在时，单链DNA分子A和单链DNA分子B两端的富胸腺嘧啶（T）部分，可以特异性地结合Hg2+形成稳定的T-Hg2+-T结构（类双链DNA结构），这拉近了单链DNA分子A和单链DNA分子B两端的富G序列，使其可以折叠形成G-四链体结构，选择的荧光染料硫代黄素（ThT）不仅能与双链结合，而且还能嵌入G-四链体性中，实现荧光信号双重放大，荧光强度大大增加。本方法不仅避免了复杂的DNA荧光标记过程，操作简单，成本低廉，而且保持了对Hg2+检测的高特异性和高灵敏度。
一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法，包括以下步骤：
步骤一、选取两条长度不等且均富含T和G两种碱基的非标记单链DNA分子A和B，分别配制成溶液A和溶液B，将两种溶液分别于90℃水浴5 min，冷却至室温，备用；所述非标记单链DNA分子A和B均在分子链的一端富T，另一端富G；
步骤二、将所得溶液A、溶液B与硫代黄素溶液进行混合，得混合物Ⅰ；将混合液Ⅰ与Tris-HNO3缓冲液进行混合，得混合液Ⅱ；其中混合液Ⅱ中非标记单链DNA分子A的摩尔浓度为0.5-1.5μmol/L，非标记单链DNA分子B的摩尔浓度为0.5-1.5μmol/L，硫代黄素的摩尔浓度为2.0μmol/L；
步骤三、向混合液Ⅱ中加入Hg2+，使混合液Ⅱ中Hg2+浓度为0.3 - 4µmol/L；将加入Hg2+的混合液Ⅱ置于室温下震荡30min，然后在450 nm激发波长下测定荧光强度值，根据测定的荧光强度值计算Hg2+的浓度。
进一步的，步骤一所述非标记单链DNA分子A和B中的G碱基比为4:8。
进一步的，所述非标记单链DNA分子A和B的匹配长度为9个T碱基。
进一步的，步骤二所述Tris-HNO3缓冲液中包含20mmol/L的Mg2+。
进一步的，步骤二所述混合液Ⅰ中非标记单链DNA分子A和B的摩尔数相等。
进一步的，所述步骤二的具体操作步骤为：将10μL摩尔浓度为100μmol/L的溶液A、10μL摩尔浓度为100μmol/L的溶液B 和 10μL 摩尔浓度为200μmol/L的硫代黄素溶液进行混合，得混合液Ⅰ；再将混合液Ⅰ溶于 970μL 摩尔浓度为10mmol/L的Tris-HNO3缓冲液混合均匀，得混合液Ⅱ。
有益效果：
1、本发明采用环境友好的DNA作为检测探针，DNA分子采用两条长度不同的非标记单链DNA，均富含碱基T和G，在适宜的条件下，Hg2+能与DNA中胸腺嘧啶（T）高度特异性结合形成稳定的“T-Hg2+-T”配位结构，形成的“T-Hg2+-T”配位结构使两条非标记单链DNA分子相互接近并折叠成G-四链体结构，硫代黄素同时嵌入双链和四链中，实现荧光强度双重扩大，荧光强度最高增强约16倍，使检测灵敏度更高、对Hg2+选择性更好。
2、本发明采用的荧光染料，一方面能诱导G-四链体结构的形成，另一方面在没有Hg2+时，荧光背景信号非常低，当加入Hg2+时，荧光强度增强，且荧光强度与Hg2+浓度成正比；操作中，首先将DNA分子与荧光染料进行混合，可增加形成DNA分子结构的诱导作用。在此过程中，无需对核酸分子进行标记，直接置于荧光分光光度计中进行检测，操作简单有效，采用的荧光染料价格便宜，成本较低。
附图说明
图1是实施例1、实施例2、实施例3和实施例4所述四种方法所测荧光强度对比图；
图2是非标记单链DNA分子A和B的含量比对荧光分析的影响图；
图3是硫代黄素浓度对荧光强度影响图；
图4是Tris-HNO3缓冲液中Mg2+浓度对荧光强度影响图；
图5是实施例9 中Hg2+浓度与荧光曲线关系图；
图6是Hg2+浓度与荧光强度线性关系图；
图7是实施例10中对不同金属离子的选择性检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的解释和说明。
实施例1 一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法
选取两条长度不等且同时富含T和G两种碱基的非标记单链DNA分子A和B，分别配制成浓度均为100µmol/L的溶液A和溶液B，将两种溶液分别于90℃水浴5 min，冷却至室温后，以1:1的体积比进行混合，得混合液，备用；其中，非标记单链DNA分子A的核苷酸序列为5’-TTTTTTTGTGGGT-3’，如SEQ ID NO：1所示；所述非标记单链DNA分子B的核苷酸序列为5’-GGGTGGGTGGTTATTTA -3’ ，如SEQ ID NO：2所示；非标记单链DNA分子A和B的匹配长度为7个T碱基。
将20μL混合液和 10μL 200μmol/L的硫代黄素溶液进行混合，得混合物Ⅰ；将混合物Ⅰ和 970μL 10mmol/L的Tris-HNO3缓冲液进行混合，得混合液Ⅱ；向1mL混合液Ⅱ中加入一定体积的10mmol/L的Hg(NO3 )2溶液，使Hg2+的终浓度为4.0 µmol/L，室温下振荡30min，然后在450nm激发波长下测其荧光强度值。
实施例2 一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法
选取两条长度不等且同时富含T和G两种碱基的非标记单链DNA分子A和B，分别配制成浓度均为100µmol/L的溶液A和溶液B，将两种溶液分别于90℃水浴5 min，冷却至室温后，以1:1的体积比进行混合，得混合液Ⅰ，备用；其中，非标记单链DNA分子A的核苷酸序列为5’-TTTTTTTTGTGGGT-3’，如SEQ ID NO：3所示；所述非标记单链DNA分子B的核苷酸序列为5’-GGGTGGGTGGTTATTTAT -3’， 如SEQ ID NO：4所示； 非标记单链DNA分子A和B的匹配长度为8个T碱基。
将20μL混合液和 10μL 200μmol/L的硫代黄素溶液进行混合，得混合物Ⅰ；将混合物Ⅰ和 970μL 10mmol/L的Tris-HNO3缓冲液进行混合，得混合液Ⅱ；向1mL混合液Ⅱ中加入一定体积的10mmol/L的Hg(NO3 )2溶液，使Hg2+的终浓度为4.0µmol/L，室温下振荡30min，然后在450nm激发波长下测其荧光强度值。
实施例3 一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法
选取两条长度不等且同时富含T和G两种碱基的非标记单链DNA分子A和B，分别配制成浓度均为100µmol/L的溶液A和溶液B，将两种溶液分别于90℃水浴5min，冷却至室温后，以1:1的体积比进行混合，得混合液Ⅰ，备用；其中，非标记单链DNA分子A的核苷酸序列为5’-TTTTTTTTTGTGGGT-3’， 如SEQ ID NO：5所示；所述非标记单链DNA分子B的核苷酸序列为5’-GGGTGGGTGGTTATTTATT-3’， 如SEQ ID NO：6所示； 非标记单链DNA分子A和B的匹配长度为9个T碱基。
将20μL混合液和 10μL 200μmol/L的硫代黄素溶液进行混合，得混合物Ⅰ；将混合物Ⅰ和 970μL 10mmol/L的Tris-HNO3缓冲液进行混合，得混合液Ⅱ；向1mL混合液Ⅱ中加入一定体积的10mmol/L的Hg(NO3 )2溶液，使Hg2+的终浓度为4.0µmol/L，室温下振荡30min，然后在450nm激发波长下测其荧光强度值。
实施例4 一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法
选取两条长度不等且同时富含T和G两种碱基的非标记单链DNA分子A和B，分别配制成浓度均为100µmol/L的溶液A和溶液B，将两种溶液分别于90℃水浴5min，冷却至室温后，以1:1的体积比进行混合，得混合液Ⅰ，备用；其中，非标记单链DNA分子A的核苷酸序列为5’-TTTTTTTTTTGTGGGT -3’， 如SEQ ID NO：7所示；所述非标记单链DNA分子B的核苷酸序列为5’- GGGTGGGTGGTTATTTATTA -3’，如SEQ ID NO：8所示； 非标记单链DNA分子A和B的匹配长度为10个T碱基。
将20μL混合液和 10μL 200μmol/L的硫代黄素溶液进行混合，得混合物Ⅰ；将混合物Ⅰ和 970μL 10mmol/L的Tris-HNO3缓冲液进行混合，得混合液Ⅱ；向1mL混合液Ⅱ中加入一定体积的10mmol/L的Hg(NO3 )2溶液，使Hg2+的终浓度为4.0µmol/L，室温下振荡30min，然后在450nm激发波长下测其荧光强度值。
将实施例1、实施例2、实施例3和实施例4所测荧光强度值进行对比，如图1，当两条链匹配长度为9个T碱基时，荧光强度比值优于其他匹配长度的荧光强度。
实施例5 小牛血清中Hg2+的检测
一、样品处理
把小牛血清与乙醇以1:1的体积比混合振荡，置于冰箱冷藏(0-4℃)过夜，次日取出，15,000 rpm离心10min，取上清液置于3 KD截留分子量的超滤管中，13,000rpm 4 ℃冷冻离心20min，取过滤液，进行溶液配制。
二、溶液配制
溶液1：取400µL过滤液与600µL摩尔浓度为10mmol/L 的Tris-HNO3（20mmol/L Mg2+, pH7.4）缓冲溶液混合均匀，备用；
溶液2：取400µL过滤液、100 µL 1.0mmol/L Hg2+和500µL 10mmol/L Tris-HNO3（20mmol/L Mg2+，pH=7.4）缓冲溶液，混合均匀，得到含有0.1mmol/L Hg2+的小牛血清处理液。
三、测定
选取两条长度不等且同时富含T和G两种碱基的非标记单链DNA分子A和B，分别配制成浓度均为100µmol/L的溶液A和溶液B，将两种溶液分别于90℃水浴5min，冷却至室温后，以1:1的体积比进行混合，得混合液，备用；其中，非标记单链DNA分子A的核苷酸序列为5’-TTTTTTTTTGTGGGT-3’， 如SEQ ID NO：5所示； 所述非标记单链DNA分子B的核苷酸序列为5’-GGGTGGGTGGTTATTTATT-3’， 如SEQ ID NO：6所示。
将20μL混合液和 10μL 200μmol/L的硫代黄素溶液进行混合，得混合物Ⅰ；将混合物Ⅰ和 970μL 10mmol/L的Tris-HNO3缓冲液进行混合，得混合液Ⅱ；向1mL混合液Ⅱ中分别加入（1）10µL溶液1；（2）：2.5µL溶液2；（3）5µL溶液2；（4）10µL溶液2； 室温下振荡30min，在450 nm激发波长下分别测其荧光强度值，本发明对小牛血清中Hg2+浓度进行测定和回收，测定结果与AFS（原子荧光光谱）方法所得的值吻合较好，且在文献报道的正常范围之内，回收率在100%~107%，表明该体系能够很好的用于小牛血清中Hg2+的测定。
实施例6 两条非标记单链DNA分子的含量比对荧光分析的影响
选取两条长度不等且同时富含T和G两种碱基的非标记单链DNA分子A和B，分别配制成浓度均为100µmol/L的溶液A和溶液B，将两种溶液分别于90℃水浴5min，冷却至室温，备用；其中，非标记单链DNA分子A的核苷酸序列为5’- TTTTTTTTGTGGGT -3’， 如SEQ ID NO：5所示； 所述非标记单链DNA分子B的核苷酸序列为5’- GGGTGGGTGG TTATTTAT -3’， 如SEQ IDNO：6所示。
将20μL溶液A+B、10μL 200μmol/L的硫代黄素溶液和 970μL 10mmol/L的Tris-HNO3缓冲液进行混合，使混合液中非标记单链DNA分子B和A的摩尔数比分别为1:3、1:2、1:1、2:1和3:1，得五种混合液，向1mL混合液中分别加入不同体积的10mmol/L的Hg(NO3 )2溶液，使Hg2+的终浓度为4.0µmol/L，室温下振荡30min，然后在450 nm激发波长下测其荧光强度值。
结果如图2，当比值为3:1或2:1时，灵敏度较低；当比值为1:2或1:3时，线性范围太大，不利于计算汞离子浓度；所以，非标记单链DNA分子A和B的作用比例为1:1时，效果最佳。
实施例7 硫代黄素浓度对荧光分析的影响
选取两条长度不等且同时富含T和G两种碱基的非标记单链DNA分子A和B，分别配制成浓度均为100µmol/L的溶液A和溶液B，将两种溶液分别于90℃水浴5min，冷却至室温后，以1:1的体积比进行混合，得混合液Ⅰ，备用；其中，非标记单链DNA分子A的核苷酸序列为5’-TTTTTTTTGTGGGT -3’， 如SEQ ID NO：5所示； 所述非标记单链DNA分子B的核苷酸序列为5’- GGGTGGGTGGTTATTTAT -3’， 如SEQ ID NO：6所示。
将混合液Ⅰ、200μmol/L的硫代黄素溶液和 10mmol/L的Tris-HNO3缓冲液进行混合，混合液总体积为1mL，混合液中硫代黄素的摩尔浓度分别为0.2μmol/L、0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、3.0μmol/L和5.0μmol/L，得五种混合液；分别向五种混合液中加入Hg2+，室温下振荡30min，然后在450 nm激发波长下测其荧光强度值。
结果如图3所示，当硫代黄素的作用浓度小于2μmol/L时，灵敏度较低；大于2μmol/L时，荧光强度变化不明显；当硫代黄素的作用浓度为2μmol/L时，效果最佳又避免浪费，节约成本。
实施例8 Tris-HNO3缓冲液中Mg2+的浓度对荧光分析的影响
选取两条长度不等且同时富含T和G两种碱基的非标记单链DNA分子A和B，分别配制成浓度均为100µmol/L的溶液A和溶液B，将两种溶液分别于90℃水浴5 min，冷却至室温后，以1:1的体积比进行混合，得混合液Ⅰ，备用；其中，非标记单链DNA分子A的核苷酸序列为5’-TTTTTTTTGTGGGT -3’， 如SEQ ID NO：5所示； 所述非标记单链DNA分子B的核苷酸序列为5’- GGGTGGGTGGTTATTTAT -3’， 如SEQ ID NO：6所示。
将20μL混合液Ⅰ、10μL 200μmol/L的硫代黄素溶液和 970μL 10mmol/L的五种不同的Tris-HNO3缓冲液进行混合，得五种混合液，其中，五种不同的Tris-HNO3缓冲液中Mg2+的浓度分别为0mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、25mmol/L和30mmol/L；分别向五种混合液中加入一定体积的10mmol/L的Hg(NO3 )2溶液，使Hg2+的终浓度分别为4.0µmol/L，室温下振荡30min，然后在450 nm激发波长下测其荧光强度值。
结果如图4所示，当Tris-HNO3缓冲液中Mg2+的浓度为20mmol/L时，效果最佳。
实施例9不同浓度Hg2+对荧光分析的影响
选取两条长度不等且同时富含T和G两种碱基的非标记单链DNA分子A和B，分别配制成浓度均为100µmol/L的溶液A和溶液B，将两种溶液分别于90℃水浴5 min，冷却至室温后，以1:1的体积比进行混合，得混合液Ⅰ，备用；其中，非标记单链DNA分子A的核苷酸序列为5’-TTTTTTTTTGTGGGT -3’， 如SEQ ID NO：5所示； 所述非标记单链DNA分子B的核苷酸序列为5’-GGGTGGGTGGTTATTTATT -3’， 如SEQ ID NO：6所示。
将20μL混合液Ⅰ、10μL 200μmol/L的硫代黄素溶液和 970μL 10mmol/L的Tris-HNO3缓冲液进行混合，得混合液Ⅱ；向1mL混合液Ⅱ中加入不同体积的10mmol/L的Hg(NO3 )2溶液，使Hg2+的终浓度分别为0、0.3、0.5、0.7、1.0、 1.3、1.5、1.8、2.0、2.2、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0和7.0µmol/L，室温下振荡30min，然后450 nm激发波长下分别测其荧光强度值。
结果如图5所示，Hg2+浓度小于5µmol/L时，随着Hg2+浓度的增加，荧光强度也增强；Hg2+浓度大于5µmol/L时，荧光强度达到稳定的平台。
Hg2+浓度在0.3–4.0µmol/L范围内，相对荧光强度（F/F0）与Hg2+浓度成线性关系，如图6所示，线性方程为：F/F0 = 4.286 C/(μmol/L) -1.0584, r = 0.996。
实施例10测定本发明所述方法对不同金属离子的选择性
选取两条长度不等且同时富含T和G两种碱基的非标记单链DNA分子A和B，分别配制成浓度均为100µmol/L的溶液A和溶液B，将两种溶液分别于90℃水浴5min，冷却至室温后，以1:1的体积比进行混合，得混合液Ⅰ，备用；其中，非标记单链DNA分子A的核苷酸序列为5’-TTTTTTTTTGTGGGT-3’， 如SEQ ID NO：5所示； 所述非标记单链DNA分子B的核苷酸序列为5’-GGGTGGGTGGTTATTTATT-3’， 如SEQ ID NO：6所示。
将20μL混合液Ⅰ、10μL 200μmol/L的硫代黄素溶液和 970μL 10mmol/L的Tris-HNO3缓冲液进行混合，得混合液Ⅱ；向1mL混合液Ⅱ中分别加入：（1）：3µmol/L Hg2+以及什么都不加作为对比参照；(2)：相同浓度（3µmol/L）的不同金属离子，包括Na+， K+， Ca2+， Fe3+，Zn2+， Co2+，Cu2+， Ba2+， Ag+， Cr3+， Mn2+，Cd2+， Ni2+， Pb2+以及这些金属离子的混合液；(3)：Hg2+（3µmol/L）和相同浓度（3µmol/L）的不同金属离子，包括Na+， K+， Ca2+， Fe3+，Zn2+，Co2+，Cu2+， Ba2+， Ag+， Cr3+， Mn2+，Cd2+， Ni2+， Pb2+以及这些金属离子的混合液， 室温下振荡30min，在450nm激发波长下分别测其荧光强度值，结果见图7。
由图7可知，此检测方法对Hg2+的响应信号非常高，而对其他金属离子的响应信号低，说明本发明所述方法对Hg2+的选择性非常好。
其中，非标记单链DNA分子均购自生工生物工程（上海）有限公司。
本发明所述实施例应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明不局限于所采用的DNA序列，对本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 商丘师范学院
<120> 一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法
<130> 1
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (6)

1.一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、选取两条长度不等且均富含T和G两种碱基的非标记单链DNA分子A和B，分别配制成溶液A和溶液B，将两种溶液分别于90℃水浴5 min，冷却至室温，备用；所述非标记单链DNA分子A和B均在分子链的一端富T，另一端富G；
步骤二、将所得溶液A、溶液B与硫代黄素溶液进行混合，得混合物Ⅰ；将混合液Ⅰ与Tris-HNO3缓冲液进行混合，得混合液Ⅱ；其中混合液Ⅱ中非标记单链DNA分子A的摩尔浓度为0.5-1.5μmol/L，非标记单链DNA分子B的摩尔浓度为0.5-1.5μmol/L，硫代黄素的摩尔浓度为2μmol/L；
步骤三、向混合液Ⅱ中加入Hg2+，使混合液Ⅱ中Hg2+浓度为0.3 - 4µmol/L；将加入Hg2+的混合液Ⅱ置于室温下震荡30min，然后在450 nm激发波长下测定荧光强度值，根据测定的荧光强度值计算Hg2+的浓度。
2.如权利要求1所述的一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法，其特征在于：步骤一所述非标记单链DNA分子A和B中的G碱基数的比为4:8。
3.如权利要求1所述的一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法，其特征在于：所述非标记单链DNA分子A和B的匹配长度为9个连续的T碱基。
4.如权利要求1所述的一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法，其特征在于：步骤二所述Tris-HNO3缓冲液中包含20mmol/L的Mg2+。
5.如权利要求1所述的一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法，其特征在于：步骤二所述混合液Ⅰ中非标记单链DNA分子A和B的摩尔数相等。
6.如权利要求1-5任意一种所述的一种测定Hg2+浓度的荧光分析方法，其特征在于：所述步骤二的具体操作步骤为：将10μL摩尔浓度为100μmol/L的溶液A、10μL摩尔浓度为100μmol/L的溶液B 和 10μL 摩尔浓度为200μmol/L的硫代黄素溶液进行混合，得混合液Ⅰ；再将混合液Ⅰ溶于 970μL 摩尔浓度为10mmol/L的Tris-HNO3缓冲液混合均匀，得混合液Ⅱ。
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