CN103966224B - 一种适配子及其筛选方法和应用 - Google Patents
一种适配子及其筛选方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103966224B CN103966224B CN201410198044.XA CN201410198044A CN103966224B CN 103966224 B CN103966224 B CN 103966224B CN 201410198044 A CN201410198044 A CN 201410198044A CN 103966224 B CN103966224 B CN 103966224B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- albumen
- kiaa0157
- aptamer
- ssdna
- oligonucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 title description 26
- 238000012216 screening Methods 0.000 title description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 8
- 102100024635 BRISC complex subunit Abraxas 2 Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 101000760684 Homo sapiens BRISC complex subunit Abraxas 2 Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 7
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 2
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 2
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010565 Apoptosis Regulatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010063104 Apoptosis Regulatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229940005654 nitrite ion Drugs 0.000 description 1
- -1 nitrite ions Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一组能识别KIAA0157蛋白的寡核苷酸序列及其制备方法。寡核苷酸序列包括SEQ ID No.2～11，其分别具有较高的亲和特异性，可以用于KIAA0157蛋白的检测。
Description
背景技术
近些年来，寡核苷酸适配子作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人注目。寡核苷酸适配子是由SELEX技术(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)生物文库技术筛选获得的，该技术的原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20-100个碱基左右。利用单链寡核苷酸分子构像灵活多变的特性，将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留以空间构像与靶分子结合的寡核苷酸，经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶子特异结合的寡核苷酸序列得到富集，最终获得多种靶分子的特异寡核苷酸适配子，即aptamer。利用SELEX技术筛选获得的aptamer识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类抗体相比，核酸类配基具有更多的优越性，如不受免疫条件和免疫原性限制，可体外人工合成，变性与复性可逆，可修饰并有利于长期保存和室温运输等。更重要的是，aptamer比抗体具有更高的特异性，甚至能识别单抗不能区分的蛋白质分子。而且aptamer的靶分子非常广泛，小至染料分子，大至完整的病毒颗粒和细菌病原体，甚至完整的细胞也可以通过消减SELEX技术筛选出高亲和力的寡核苷酸适配子。
KIAA0157定位于10q26.13(NM_032182.)，mRNA全长3008bp，cDNA1248bp，编码416个氨基酸(序列2)，分子量为47KD的蛋白质。小鼠、大鼠与人的KIAA0157同源性高达90％以上，说明它在进化过程中高度保守，可能发挥着重要的生物学功能。利用生物信息学分析显示，KIAA0157蛋白内部215-266位氨基酸处存在着一个coiledcoil结构域，此结构域通常存在于单体蛋白质中，且高度保守，通常介导蛋白与蛋白之间的相互作用。在对抗凋亡蛋白BPE(BRCA复合体亚基4)的相互作用蛋白筛选过程中，KIAA0157被筛选到。该基因及蛋白为全细胞分布，并在多种肿瘤组织中明显下调表达；肝癌病人中KIAA0157在肝癌组织中表达水平高于癌旁组织。高表达KIAA0157可抑制包括肝癌细胞＼肺癌细胞＼神经母细胞瘤细胞的生长，并导致细胞发生G0/G1期阻滞。
基于以上考虑，本发明以KIAA0157蛋白为目的靶蛋白，采用SELEX技术获得了10条KIAA0157蛋白特异的aptamer，组合应用能够迅速、敏感、特异的检测到KIAA0157蛋白。由于单链DNA寡核苷酸适配子性能稳定、合成方便且廉价、经修饰后可直接用于荧光或化学发光、发色方法检测靶绑带，因此操作简单、直接。
发明内容
本发明的目的在于提供不仅具有检测快速、操作简单、稳定性高于抗体等特点，而且制备方法容易、制备周期较短的一组能识别KIAA0157蛋白的寡核苷酸序列及其制备方法。
所述能识别KIAA0157蛋白的寡核苷酸序列，包括SEQIDNo.1-10，且采用其中的一条寡核苷酸序列就能完成对KIAA0157蛋白的识别检测；
所述一组能识别KIAA0157蛋白的寡核苷酸序列的制备方法包括以下步骤：
1、合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC----
N35----GCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3′)，其中N35为35个随机寡核苷酸；
2、将寡核苷酸文库分别与KIAA0157蛋白混合后进行SELEX筛选，获得适配子富集文库；
3、SELEX筛选完成后，对获得的适配子富集文库进行克隆测序；
4、选择测序结果中出现的高拷贝ssDNA，进行亲和特异性的验证，筛选获得能识别KIAA0157蛋白的寡核苷酸序列。
具体实施方式
实施例1
1、KIAA0157蛋白的制备
采用本领域技术人员熟知的酵母重组表达的方式获得具有与人KIAA0157蛋白相同生物活性的KIAA0157蛋白，该蛋白序列如SEQIDNO：1所示；蛋白溶液的浓度为10mg/ml。
2、文库和引物的合成
2.1、合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC----
N35----GCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3′)，其中N35为35个随机寡核苷酸；
引物P1：TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC；
引物P2：CCCTCTGGGGTCTCCCTCTTGTGC。
2.2、适配子的SELEX筛选，具体方法如下：
2.2.1ssDNA与KIAA0157蛋白的结合、分离，具体方法如下：
取100μM的ssDNA寡核苷酸文库4μL，用2×结合缓冲液稀释至100μl，95℃变性5min，冰浴10min后加入100μlKIAA0157蛋白，摇床结合30min，再6000rpm离心5min，弃上清，然后用1×结合缓冲液洗沉淀，弃上清；在沉淀中再加入1×结合缓冲液100μL，96℃加热5min，然后15000rpm离心10min，取上清液，对沉淀再次加热并离心，合并上清液，则可分离得到与KIAA0157蛋白有亲和力的ssDNA次级文库；所述2×结合缓冲液为20×结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述1×结合缓冲液为20×结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20×结合缓冲液配方为1MNaCl、50mMKCl、500mMTris-HCl、10mMMgCl2、pH7.4。
2.2.2ssDNA与KIAA0157蛋白的结合、分离，具体方法如下：
将步骤2.2.1分离得到的能与KIAA0157蛋白结合的ssDNA，再与100μ1KIAA0157蛋白摇床结合30min，后续步骤同步骤2.2.1，则可分离到与KIAA0157蛋白都有亲和力的ssDNA次级文库。
2.2.3不对称PCR扩增ssDNA，具体方法如下：
对步骤2.2.2分离获得的ssDNA次级文库进行不对称PCR扩增，总体积为25μ1的不对称PCR扩增体系为：10×PCR缓冲液：2μl；P1(10μM)：1μl；P2(0.2μM)：1μ1；dNTP(各2.5mM)：0.4μl；MgCl2(25mM)：1.2μl；ssDNA模板(0.2μg/μ1)：2μl；TaqDNA聚合酶(5u/μ1)：0.2μl；ddH2O：17.2μl；PCR反应参数：94℃预变性4min，然后进行40个循环94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，最后72℃延伸7min；
2.2.4亲和力的测定，具体方法如下：
2.2.4.1扩增：用带有地高辛标记的引物P1不对称PCR扩增筛选出来的ssDNA次级文库，扩增条件和参数与步骤2.2.3的不对称PCR扩增体系和参数相同；
2.2.4.2与蛋白结合：取步骤2.2.4.1扩增所得的PCR产物100μL，95℃变性5min，冰浴10min后加入100μL蛋白中，充分混合，在室温下结合30min，然后6000rpm离心，分离蛋白与上清液，蛋白中包含有与蛋白中结合的带地高辛标记的ssDNA，上清液中是未结合的ssDNA，同时做一不加ssDNA的空白，即用2×结合缓冲液代替PCR产物，同样进行上述操作；
2.2.4.3洗涤：将蛋白用1×结合缓冲液500μL洗涤1次，6000rpm离心，弃上清，取蛋白；
2.2.4.4与酶标兔抗地高辛抗体结合：在蛋白中加入100μL1∶900TBS稀释的过量的酶标兔抗地高辛抗体，充分混合后，反应10min，使之与蛋白中的地高辛标记的ssDNA结合；
所述TBS为0.5MTris-NaCl溶液，配制方法为：先水溶8.5～9gNaCl，再加Tris-HCl(0.5M、pH7.6)溶液100ml，最后加水定容至1L；0.5MTris-HCl(pH7.6，100m1)溶液配制方法：称取Tris6.06g，加入双蒸水40ml溶解，滴加浓HCI调pH至7.6，定容至100ml。
2.2.4.5洗涤：6000rpm离心，去上清，再用1×结合缓冲液500μL洗涤3次，得蛋白；
2.2.4.6TMB(四甲基联苯胺)显色：加入400μL双蒸水重悬蛋白，再加入200μLTMB显色液，避光显色10min后，以2mol/LH2SO4200μL终止反应，测定450nm处的吸光值OD450，该值即反映与菌结合的ssDNA的亲和力，即OD结合，空白同样进行上述步骤2.2.4.3，2.2.4.4，2.2.4.5和2.2.4.6，得到空白相应的吸光度OD空白；
所述TMB显色液使用常规的配制方法配制。
2.2.4.7测定PCR产物中DNA的摩尔浓度：取步骤2.2.4.1扩增所得的PCR产物，以已知浓度梯度的初始ssDNA文库为标准品，用Bandscan软件作为图像分析软件，采用溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳法定量测定PCR产物中的DNA含量，获得相应DNA的摩尔浓度，进而可以计算出100μLPCR产物中的DNA摩尔数。
2.2.4.8计算相应文库的亲和力：
2.3重复筛选，具体方法为：以每一轮不对称PCR的产物作为下一轮的筛选文库，重复上述SELEX筛选步骤2.2，直到亲和力不再上升为止，最后经过16轮的筛选得到ssDNA的适配子富集文库。经不对称PCR扩增后，条件同前面的步骤，克隆并测序，得到拷贝数最高的25个有效的ssDNA，将25个适配子分别进行亲和特异性验证，得到10个对KIAA0157蛋白有较好亲和特异性的寡核苷酸序列(适配子)，具体序列如下：
亲和力具体数据如下：
| 适配子名称 | 亲和力 | 适配子名称 | 亲和力 |
| K1 | 0.54 | K10 | 0.464 --> |
| K4 | 0.50 | K13 | 0.57 |
| K5 | 0.57 | K17 | 0.55 |
| K8 | 0.55 | K20 | 0.53 |
| K9 | 0.60 | K22 | 0.52 |
2.4、分析25条适配子的特异性和亲和性
荧光标记的适配子序列与KIAA0157蛋白孵育，进行流式细胞分析检测，其中10条序列显示了高荧光强度，使用GraphPadPrism5.0软件针对饱和曲线做非线性回归曲线，分别对10条高亲和性适配子序列采用相同的实验操作，得到了每条是配置的Kd值：
| 适配子名称 | Kd值(nM) | 适配子名称 | Kd值(nM) |
| K1 | 54.0 | K10 | 0.46 |
| K4 | 52.7 | K13 | 38.59 |
| K5 | 42.8 | K17 | 40.26 |
| K8 | 50.5 | K20 | 41.57 |
| K9 | 37.26 | K22 | 45.41 |
其中K9的Kd值最小，说明与靶蛋白可以快速结合并且结构稳定不易分离。
采用DNAMAN软件构建了10条适配子的二级结构并计算了他们的最小自由能，其结构最小自由能也都较小，结构也相对稳定。
2.5适配子特异性分析
分别采用BSA、人血红蛋白、KIAA0157蛋白与10条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这10条序列都不与BSA或人血红蛋白相结合，而只与KIAA0157蛋白结合保持较高的特异性。
Claims (1)
1.一种识别KIAA0157蛋白的寡核苷酸序列，其特征在于为SEQIDNo.2-11任一条序列所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410198044.XA CN103966224B (zh) | 2014-05-12 | 2014-05-12 | 一种适配子及其筛选方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410198044.XA CN103966224B (zh) | 2014-05-12 | 2014-05-12 | 一种适配子及其筛选方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103966224A CN103966224A (zh) | 2014-08-06 |
| CN103966224B true CN103966224B (zh) | 2016-07-13 |
Family
ID=51236230
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410198044.XA Expired - Fee Related CN103966224B (zh) | 2014-05-12 | 2014-05-12 | 一种适配子及其筛选方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103966224B (zh) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105693849A (zh) * | 2014-07-13 | 2016-06-22 | 马海龙 | 一种特异性针对Neutrokine-α蛋白的核酸适配体NKXA5及其应用 |
| CN105693848A (zh) * | 2014-07-13 | 2016-06-22 | 马海龙 | 一种特异性针对Neutrokine-α蛋白的核酸适配体NKXA7及其应用 |
| CN105693847A (zh) * | 2014-07-13 | 2016-06-22 | 马海龙 | 一种特异性针对Neutrokine-α蛋白的核酸适配体NKXA9及其应用 |
| CN104962560B (zh) * | 2015-06-16 | 2017-07-21 | 湖南大学 | 一种检测日本血吸虫卵的核酸适配体及其在制备检测制剂中的应用 |
| CN106349358A (zh) * | 2016-11-07 | 2017-01-25 | 李露青 | 一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用 |
| CN106397566A (zh) * | 2016-11-07 | 2017-02-15 | 李露青 | 一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用 |
| CN106349359A (zh) * | 2016-11-07 | 2017-01-25 | 李露青 | 一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用 |
| CN106397567A (zh) * | 2016-11-08 | 2017-02-15 | 李露青 | 一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用 |
| CN106432464A (zh) * | 2016-11-08 | 2017-02-22 | 李露青 | 一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用 |
| CN106432465A (zh) * | 2016-11-08 | 2017-02-22 | 李露青 | 一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用 |
| CN106349361A (zh) * | 2016-11-09 | 2017-01-25 | 李露青 | 一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用 |
| CN106349360A (zh) * | 2016-11-09 | 2017-01-25 | 李露青 | 一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用 |
| CN106349362A (zh) * | 2016-11-09 | 2017-01-25 | 李露青 | 一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用 |
| CN106432466A (zh) * | 2016-11-10 | 2017-02-22 | 李露青 | 一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用 |
| CN106349364A (zh) * | 2016-11-10 | 2017-01-25 | 李露青 | 一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用 |
| CN106349363A (zh) * | 2016-11-10 | 2017-01-25 | 李露青 | 一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用 |
| CN106478799A (zh) * | 2016-11-14 | 2017-03-08 | 李露青 | 一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用 |
| CN106349365A (zh) * | 2016-11-14 | 2017-01-25 | 李露青 | 一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用 |
| CN106349366A (zh) * | 2016-11-14 | 2017-01-25 | 李露青 | 一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用 |
| JP2022511203A (ja) * | 2018-11-08 | 2022-01-31 | 世奇 廖 | 標的－腫瘍血清アプタマー複合物の検出方法及びキット |
| CN113234728B (zh) * | 2021-06-09 | 2023-09-19 | 集美大学 | 一种温度性敏感位点核酸适配体及其筛选方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101148667B (zh) * | 2006-09-22 | 2012-05-30 | 国家纳米技术与工程研究院 | 一种亲和人白蛋白核酸适配子的制备与用途 |
| CN101712958A (zh) * | 2008-10-08 | 2010-05-26 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种新的人肿瘤抑制基因kiaa0157及其应用 |
| CN102766632B (zh) * | 2012-07-09 | 2013-09-18 | 徐霞 | 一种高尔基体膜蛋白gp73核酸适配子、其制备方法及其用途 |
-
2014
- 2014-05-12 CN CN201410198044.XA patent/CN103966224B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103966224A (zh) | 2014-08-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103966224B (zh) | 一种适配子及其筛选方法和应用 | |
| CN104109194B (zh) | Sfrp1蛋白的适配子及其筛选方法和应用 | |
| US10620210B2 (en) | Aptamers and diagnostic methods for detecting the EGF receptor | |
| CN104293793B (zh) | 一种特异识别t-2毒素的寡核苷酸适配体 | |
| JP2017525695A5 (zh) | ||
| US20120156678A1 (en) | Binding-induced hairpin detection system | |
| CN102703454A (zh) | 可用于检测肌红蛋白的核酸适体、筛选用微流控芯片及其筛选方法和应用 | |
| CN104031137B (zh) | 鳐血管生成抑制因子1的适配子及其筛选方法和应用 | |
| CN102766693A (zh) | 可用于检测人肝癌细胞株smmc-7721的核酸适体及其筛选方法和应用 | |
| Wen et al. | A microfluidic dual-aptamer sandwich assay for rapid and cost-effective detection of recombinant proteins | |
| JP6831776B2 (ja) | ２個のリガンドと１個のレセプタとからなる高親和性錯体の特定方法と該方法を実行する装置及び該方法に用いられる自己集合型ケミカルライブラリ | |
| CN102766633A (zh) | 可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体及其筛选方法和应用 | |
| KR101670135B1 (ko) | 리포칼린 2 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 | |
| CN105669851A (zh) | 鳐血管生成抑制因子1的适配子k6及其筛选方法和应用 | |
| CN105646695A (zh) | 鳐血管生成抑制因子1的适配子k16及其筛选方法和应用 | |
| CN105713081A (zh) | 鳐血管生成抑制因子1的适配子k17及其筛选方法和应用 | |
| CN105669852B (zh) | 鳐血管生成抑制因子1的适配子k10及其筛选方法和应用 | |
| Daldrop et al. | The functional exchangeability of pk-and k-turns in RNA structure | |
| JP7176739B2 (ja) | 標的物質検出用核酸プローブ | |
| JP2022106581A (ja) | Ｃｒｐ結合核酸分子、ｃｒｐ検出用センサ、ｃｒｐ検出試薬、ｃｒｐの検出方法、およびｃｒｐ結合領域 | |
| CN104818277A (zh) | 一组特异识别金黄色葡萄球菌黄金亚种的寡核苷酸适配子 | |
| CN105277698B (zh) | 一种用于胃病检测的试剂盒 | |
| JP2019149979A (ja) | 分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）結合核酸分子、ｓＩｇＡ検出用センサ、ｓＩｇＡ検出試薬、およびｓＩｇＡの分析方法 | |
| CN107881242A (zh) | Egfr基因检测试剂盒及检测方法 | |
| Ander et al. | A Single-Strand Annealing Protein Clamps DNA to Detect Homology |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20160506 Address after: 315137 Zhejiang city of Ningbo province Yinzhou District Yunlong Town Li Yun Road No. 10 Applicant after: Zhu Yupan Address before: Yinzhou District Heng Jie Heng Jie Zhen Road 315181 No. 50 Zhejiang city of Ningbo Province Applicant before: Hua Guoguang |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Dong Ruihua Inventor before: Hua Guoguang |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20170228 Address after: Chunhui road 400084 Dadukou District of Chongqing cypress Road No. 101 Building 1 Street 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9 Patentee after: Chongqing Diweina Biological Technology Co. Ltd. Address before: 315137 Zhejiang city of Ningbo province Yinzhou District Yunlong Town Li Yun Road No. 10 Patentee before: Zhu Yupan |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160713 Termination date: 20200512 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |