CN113234728B - 一种温度性敏感位点核酸适配体及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种核酸适配体，尤其涉及一种温度性敏感位点核酸适配体及其筛选方法。适配体序列如SEQ.NO.1‑5所示，本发明以变形假单胞菌为研究对象，采用反筛等SELEX技术，筛选能特异性识别变形假单胞菌温度敏感位点的核酸适配体，通过测定亲和力的变化来表征核酸适配体对温度敏感位点进行识别。本发明可对高频序列进行客观有效的分类，为后续核酸适配体的精准选择和验证提供了一种客观有效的依据，该方法简单，操作方便，大大减少了验证的盲目性，提高了筛选效率。从筛选结果中挑选相对重要指数最高的五个适配体M19、M56、M17、M48、M81，这些适配体对18℃变形假单胞菌的亲和力均高于对其他菌的亲和力，从而得知这些适配体均对18℃变形假单胞菌有较好的亲和特异性。

Description

一种温度性敏感位点核酸适配体及其筛选方法

技术领域

本发明涉及一种核酸适配体，尤其涉及一种温度性敏感位点核酸适配体及其筛选方法。

背景技术

核酸适配体(Aptamer)是通过指数富集配体的系统进化技术(SystematicEvolutionofligandsbyExponentialEnrichment，SELEX)筛选出的对靶目标具有较高亲和特异性的寡核苷酸分子。Ellington等人于1990年首次报道，利用体外筛选技术从随机文库中分离出罕见的RNA分子，这些RNA分子可以任意地与所选的靶分子结合，Ellington将这些产生得到的基序命名为“适配体(aptamer)”。由于核酸适配体具有多项优势：(1)核酸适配体的体积小，质量在6-30KDa之间，大小约为5nm；(2)核酸适配体结构简单，易化学修饰；(3)核酸适配体化学稳定性高；(4)核酸适配体免疫原性低；(5)核酸适配体组织渗透率高；(6)核酸适配体的靶目标范围广：可为离子、小分子、多肽、蛋白质、病毒、细菌、寄生虫和整个活细胞等；(7)核酸适配体可识别细胞表面功能分子：需借助配体或翻译后修饰；被广泛应用于生物医学、蛋白质科学、纳米材料及疾病诊断等各研究领域。核酸适配体在水产病害方面也有应用，目前已成功筛选到特异性核酸适配体的水产病原有病毒性出血性败血症病毒(Viralhemorrhagicsepticemiavirus，VHSV)，新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singaporegrouperiridovirus，SGIV)，赤点石斑鱼神经坏死症病毒(RedspottedgroupernervOusnecrosisvirus，RGNNV)，牙鲆弹状病毒(Hiramerhabdovirusvirus，HIRRV)，鲤春病毒血症病毒(Springviremiaofcarpvirus，SVCV)，中华鳖虹彩病毒(Soft-shelledturtleiridovirus，STIV)，副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)，溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)，哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等。

变形假单胞菌隶属于假单胞菌科，假单胞菌属，恶臭假单胞菌组，杀香鱼假单胞菌种，是一种直或微弯、不呈螺旋状的革兰氏阴性杆菌，以单极毛或数根极毛运动，需氧，不生芽孢，感染的鱼类品种主要集中在香鱼、石斑鱼和大黄鱼，被感染的大黄鱼主要表现为部分病鱼有腹水，肝、脾、肾等内脏组织与器官都表现出不同程度的充血、出血、坏死，其中肝脏严重充血，脾脏和肾脏布满白色小结节。根据病鱼脾、肝脏、肾等内脏长满白色结节而命名该病为大黄鱼内脏白点病，发病温度在特定温度15℃到20℃之间，是近年来在大黄鱼养殖中暴发流行的一种细菌性疾病，给养殖产业造成了重大的经济损失。目前，尽管大黄鱼内脏白点病的研究报道已有多篇，但是主要集中在病理形态学分析等，其致病机制虽然与胞外产物有一定相关性，但是还不能完全解释其致病性，因此迫切需要对变形假单胞菌的致病机理的研究思路和研究方法，识别变形假单胞菌对温度敏感的位点，揭示变形假单胞菌的温度敏感机制。

一般的核酸适配体对温度具有弱敏感性，而变形假单胞菌发病温度在15℃到20℃之间，因此筛选温度敏感位点适配体，并利用这些核酸适配体来识别相应的温度敏感位点，对研究变形假单胞菌的温度敏感机制，从而为变形假单胞菌的病害防治提供参考具有重大意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题，在于提供一种能特异性识别变形假单胞菌温度敏感位点的核酸适配体及其筛选方法。

本发明是这样实现的：

一种温度性敏感位点核酸适配体，其核苷酸序列按5’-3’的顺序如下：

M19：

TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCCCGTGGTGGCGCAGTAATCCTTTTATCCCGGAGGAGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG

M56：

TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCCGATCACTGTTGACCTAGTGGGGATGCGTCAGGGATAAGGGTGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG

M17：

TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCCAGAGATCGGGCAACGCGTGCGGGTAAACGTATGGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG

M48：

TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCCATCTAACATCGGCGTATGCCGCTCGCACCATCATGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG

M81：

TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCTGGGCTCGATGTCCTGGGATCTCAGCATTTTGGCGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG。

本发明还提供了一种温度性敏感位点核酸适配体的筛选方法，具体包括如下步骤：

2)培养变形假单胞菌：取变形假单胞菌于LB液体培养基中，在18℃、100rpm摇床中过夜培养；

2)准备变形假单胞菌：取上述培养好的变形假单胞菌菌液于无菌离心管内，6000rpm离心5min，将菌沉淀用1×结合缓冲溶液洗涤2次，再用2×缓冲溶液悬浮沉淀，然后根据变形假单胞菌的标准曲线，配制成浓度为10⁸个/mL变形假单胞菌菌液；

3)准备随机ssDNA文库：取20μL10μM的随机ssDNA文库于离心管中，加入80μL 2×缓冲溶液，配制成2μM、100μL的ssDNA文库，然后加热95℃，5min，冰浴10min；

4)孵育结合：上述2μM、100μL随机ssDNA文库与步骤(2)的100μL、10⁸个/mL变形假单胞菌菌液混匀，于100rpm、18℃孵育结合2h；

5)洗涤：孵育结合好后，6000rpm离心5min，弃上清，再用1×结合缓冲溶液洗涤1次，轻轻吹打，洗去不与目标菌-变形假单胞菌结合的ssDNA，再6000rpm离心5min，弃上清，用1×缓冲溶液悬浮沉淀，得到与目标菌结合的ssDNA菌悬液；

6)加热变性：将上述菌悬液置于金属浴，95℃加热5min，待其冷却至室温后，12000rpm离心10min，保留上清，即为筛选获得能与目标菌结合的ssDNA；

7)非目标菌反筛：取嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌和迟钝爱德华氏菌于TSB液体培养基中，取变形假单胞菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌于LB培养基中，均放置于28℃，100rpm摇床过夜；按照步骤(2)配制成10⁸个/mL非目标菌，各100μL混合均匀，与步骤(6)的上清ssDNA结合，100rpm、28℃孵育结合2h；

8)分离：孵育结合完成后，12000rpm，离心10min，此时的沉淀为非目标菌-ssDNA复合物，上清为能与目标菌结合且不与非目标菌结合的ssDNA，取上清，备用；

9)取步骤8)得到的上清液(即筛选出的ssDNA)作为模板，进行不对称PCR反应；热力学循环参数：98℃预变性3min，98℃变形10s，60℃退火30s，75℃延伸15s，共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温；

10)反应体系结束后，PCR产物和剩余模板于4℃保存备用，此为第一轮筛选；

12)第二轮筛选：取第一轮PCR产物，重复步骤(1)至步骤(9)，不同的是非目标菌只有在28℃培养的变形假单胞菌，孵育结合时间缩短为1小时，其他步骤均不变；

13)第三轮筛选：取第二轮PCR产物，重复步骤(1)至步骤(6)，不同的是结合时间缩短为0.5h，其他步骤不变，之后进行步骤(9)不对称PCR反应，扩增能够与目标菌变形假单胞菌结合的ssDNA；

14)将以上三轮PCR产物进行高通量测序，从测序结果中选择高频序列进行后续分析；每轮筛选产物测序后都可获得数万条的序列，这些序列中有的种类出现一次，有的出现数千次，高频序列是指测序结果中出现的频率大于等于2次的序列；

15)IRI筛选：根据公式：相对重要性指数IRI＝N％×F％，其中N％为所有筛选轮或测序轮中某种序列的出现次数占所有序列总数量的百分比，F％为该种序列出现的测序轮数占总测序轮数的百分比；根据IRI计算结果进行分类，相应的分类依据为：IRI≥1000时，该高频序列为优势高频适配体；10≤IRI＜100时，该高频序列为常见高频适配体；1≤IRI＜10时，该高频序列为一般高频核酸适配体；IRI＜1时，该高频序列为少见高频适配体；从相对重要性指数IRI来看，M19、M56、M17、M48属于重要高频序列，M81属于常见高频序列。

本发明具有如下优点：

本发明以变形假单胞菌为研究对象，采用反筛等SELEX技术，筛选能特异性识别变形假单胞菌温度敏感位点的核酸适配体，通过测定亲和力的变化来表征核酸适配体对温度敏感位点进行识别，为变形假单胞菌的病害防治提供参考。

本发明可对高频序列进行客观有效的分类，为后续核酸适配体的精准选择和验证提供了一种客观有效的依据，该方法简单，操作方便，大大减少了验证的盲目性，提高了筛选效率。从筛选结果中挑选相对重要指数最高的五个适配体M19、M56、M17、M48、M81，这些适配体对18℃变形假单胞菌的亲和力均高于对其他菌的亲和力，从而得知这些适配体均对18℃变形假单胞菌有较好的亲和特异性，从而验证了通过相对重要性指数筛选核酸适配体的可行性。

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1为适配体M17的亲和特异性。

图2为适配体M19的亲和特异性。

图3为适配体M48的亲和特异性。

图4为适配体M56的亲和特异性。

图5为适配体M81的亲和特异性。

具体实施方式

1、温度性敏感位点核酸适配体的SELEX筛选

1)培养变形假单胞菌：取变形假单胞菌于LB液体培养基中，在18℃、100rpm摇床中过夜培养。

2)准备变形假单胞菌：取上述培养好的变形假单胞菌菌液于无菌离心管内，6000rpm，离心5min，将菌沉淀用1×结合缓冲溶液洗涤2次，再用100μL 2×缓冲溶液悬浮沉淀后备用。然后根据变形假单胞菌的标准曲线，配制成浓度为108个/mL变形假单胞菌，备用。

3)准备随机ssDNA文库：取20μL10μM的随机ssDNA文库于离心管中，加入80μL 2×缓冲溶液，配制成2μM、100μL的ssDNA文库，然后加热95℃，5min，冰浴10min。

4)孵育结合：上述随机ssDNA文库100μL与步骤(2)的100μL、108个/mL菌液混匀，100rpm、18℃孵育结合2h。

5)洗涤：孵育结合好后，6000rpm离心5min，再用200μL1×结合缓冲溶液洗涤1次，轻轻吹打，洗去不与目标菌-变形假单胞菌结合的ssDNA，再6000rpm离心5min，弃上清，用100μL1×缓冲溶液悬浮沉淀，此时的溶液是就是目标菌变形假单胞菌和与之结合的ssDNA菌悬液。

6)加热变性：将上述菌悬液置于金属浴，95℃加热5min，待其冷却至室温后，12000rpm离心10min，保留上清，4℃备用。上清就是筛选获得能与目标菌结合的ssDNA。

7)非目标菌反筛：取嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌和迟钝爱德华氏菌于适量的TSB液体培养基中，取变形假单胞菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌于适量的LB培养基中，均放置于28℃，100rpm摇床过夜。按照步骤(2)配制108个/mL非目标菌，各100μL混合均匀，与步骤(6)的上清ssDNA结合，100rpm、28℃孵育结合2h。

8)分离弃去与非目标菌结合的ssDNA：孵育结合完成后，12000rpm，离心10min，此时的沉淀为非目标菌-ssDNA复合物，上清为筛选获得能与目标菌结合且不与非目标菌结合的ssDNA，取上清，备用。

9)取上述上清液(即筛选出的ssDNA)作为模板，进行不对称PCR反应。放入PCR仪，热力学循环参数：98℃预变性3min，98℃变形10s，60℃退火30s，75℃延伸15s，共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温。

10)反应体系结束后，PCR产物和剩余模板于4℃保存备用。此为第一轮筛选。

12)第二轮筛选：取第一轮PCR产物100μL，重复步骤(1)至步骤(9)，不同的是非目标菌只有在28℃培养的变形假单胞菌，孵育结合时间缩短为1小时，其他步骤均不变。

13)第三轮筛选：取第二轮PCR产物100μL，重复步骤(1)至步骤(6)，不同的是结合时间缩短为0.5h，其他步骤不变，之后进行步骤(9)不对称PCR反应，扩增能够与目标菌变形假单胞菌结合的ssDNA。

14)将以上三轮PCR产物由上海生工生物工程有限公司进行高通量测序，从测序结果中选择高频序列进行后续研究。

3.1测序序列的筛选

表2适配体相对重要性指数

根据公式IRI＝N％×F％，当IRI≥1000时，该高频序列为优势高频序列；10≤IRI＜100时，该种类为常见高频适配体；1≤IRI＜10时，该高频序列为一般高频核酸适配体；IRI＜1时，该种类为少见高频适配体。从相对重要性指数IRI来看，M19、M56、M17、M48属于重要高频序列，M81属于常见高频序列。

2亲和力和亲和常数

2.1材料

2.1.1核酸适配体

选择的核酸适配体其序列如表1(两端带下划线的是和引物结合的固定序列)。

上述适配体由生工生物工程股份有限公司合成。合成的冻干粉产物，用1×TE缓冲液配制成浓度为10μmol/L的贮存液，于-20℃冰箱保存备用。

表1变形假单菌适配体的序列

2.1.2实验用菌

变形假单菌(Vibrioanguillarum)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)、哈维氏弧菌(Vibrioharveryi)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)，由集美大学病害实验室鉴定并提供。

2.1.3培养基和试剂

LB固体培养基：取胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，NaC15g，琼脂粉7.5g。加超纯水溶解，用HCl或NaOH调pH至7.0，总体积至500mL，经121℃灭菌45min后备用。

20×结合缓冲液：取NaC15.844g、KC13.725g、Tris-HC16.06g、MgC12·6H2O2.033g。加超纯水溶解，用HCl或NaOH调pH至7.0定容至100mL。稀释为2×和1×结合缓冲液，经121℃灭菌后备用。

2.2实验方法

(1)变形处理：取培养好的鳗弧菌于离心管中，6000r/min离心5min，弃上清，用1×结合缓冲液洗涤菌沉淀1次，再用2×结合缓冲液悬浮菌沉淀。然后测菌液的OD值，并根据其OD值将其配制成5×10⁸个/mL的菌液。

(2)核酸适配体处理：取10μmol/L的核酸适配体，用2×结合缓冲液将其稀释成不同的浓度梯度：为10、20、40、60、80、100、120、140、200、250、300、350nmol/L，然后在恒温金属浴中95℃变性5min，再冰浴10min。

(3)结合和洗涤：取100μL浓度为5×108个/mL鳗弧菌分别与100μL的上述浓度梯度的核酸适配体混合均匀，在30℃、100r/min的摇床中结合30min后，6000r/min离心5min，弃上清，再用1×结合缓冲液洗涤菌沉淀3次。

(4)亲和力测定：用100μL1×结合缓冲液悬浮菌沉淀，菌悬液在恒温金属浴中95℃加热变性5min，使结合的核酸适配体与菌分开，然后15000r/min离心10min，取上清，并用超微量分光光度计测定上清中的ssDNA浓度，从而得到相应浓度梯度所对应的ssDNA浓度，即亲和力值。

(5)数据拟合：以核酸适配体的浓度为横坐标，亲和力为纵坐标，采用Origin8.0软件，选择反比例函数(Hyperbola函数)进行非线性拟合，从而获得相应核酸适配体的饱和结合曲线及其拟合方程，从拟合方程中可以得到相应适配体的亲和常数Kd值和最大亲和力Am值。

3.结果与分析：

3.3适配体的亲和特异性

本研究利用单链ssDNA浓度法测定核酸适配体M19、M56、M17、M48、M81对18℃变形假单胞菌(PP18℃)的亲和力，以及对28℃变形假单胞菌(PP28℃)嗜水气单胞菌(Ah)、溶藻弧菌(Va)、哈维氏弧菌(Vh)、大肠杆菌(Ec)、迟钝爱德华氏菌(Et)、铜绿假单胞菌(Pa)亲和力(由于其他菌种没有特定温度致病的特征，因此其他菌种是在28度下进行亲和力比较)，各适配体对细菌的亲和力如图1-5所示，由图中可以看出，这些适配体对18℃变形假单胞菌的亲和力均高于对其他菌的亲和力，从而得知这些适配体均对18℃变形假单胞菌有较好的亲和特异性。

3.4适配体的亲和常数

核酸适配体亲和常数Kd和饱和亲和常数Am结果如下：

适配体M17亲和常数Kd是23.35±6.40nM，是最低的，说明适配体M17与18℃变形假单胞菌的结合能力最强，M48、M19、M81、M56适配体的亲和常数依次是105.91±21.41nM、66.37±14.73nM、52.63±13.82nM、31.16±5.03nM，表明M48、M19、M81、M56适配体对18℃变形假单胞菌的结合能力逐渐增强。

适配体M19的饱和亲和常数Am最高，是2291.76±171.96nM，说明适配体M19对18℃变形假单胞菌的饱和结合量最多，适配体M56、M48、M17、M81的饱和亲和常数Am依次是1307.70±54.01nM、1258.51±21.41nM、1041.26±57.08nM、543.27±44.16nM，表明适配体M56、M48、M17、M81对18℃变形假单胞菌的饱和结合量依次降低。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

序列表

<110> 集美大学

<120> 一种温度性敏感位点核酸适配体及其筛选方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 82

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

tcagtcgctt cgccgtctcc ttcccgtggt ggcgcagtaa tccttttatc ccggaggagc 60

acaagaggga gaccccagag gg 82

<210> 2

<211> 89

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

tcagtcgctt cgccgtctcc ttccgatcac tgttgaccta gtggggatgc gtcagggata 60

agggtgcaca agagggagac cccagaggg 89

<210> 3

<211> 82

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

tcagtcgctt cgccgtctcc ttccagagat cgggcaacgc gtgcgggtaa acgtatgggc 60

acaagaggga gaccccagag gg 82

<210> 4

<211> 82

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

tcagtcgctt cgccgtctcc ttccatctaa catcggcgta tgccgctcgc accatcatgc 60

acaagaggga gaccccagag gg 82

<210> 5

<211> 82

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

tcagtcgctt cgccgtctcc ttctgggctc gatgtcctgg gatctcagca ttttggcggc 60

acaagaggga gaccccagag gg 82

Claims (1)

1.一种温度性敏感位点核酸适配体，其特征在于：为如下任一条核苷酸序列所示的适配体：

M19：

TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCCCGTGGTGGCGCAGTAATCCTTTTATCCCGGAGGAGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG；

M17：

TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCCAGAGATCGGGCAACGCGTGCGGGTAAACGTATGGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG；

M48：

TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCCATCTAACATCGGCGTATGCCGCTCGCACCATCATGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG；

M81：

TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCTGGGCTCGATGTCCTGGGATCTCAGCATTTTGGCGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG。