CN112522273A - 特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体及其筛选方法与应用 - Google Patents

特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体及其筛选方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体及其筛选方法与应用，本发明以大口黑鲈病毒为靶标，利用GO‑SELEX技术获得了能与大口黑鲈蛙病毒高亲和力，高特异性结合的寡核苷酸适配体，能够快速、灵敏、特异的检测到大口黑鲈蛙病毒。适配体成本低，稳定性好，易于修饰，可作为抗体分子的前景性替代分子，被应用于生命科学各个领域的研究工作中。本发明还提供一种微生物分子生物学检测方法：基于核酸适配体技术快速、准确检测大口黑鲈蛙病毒的方法，为后续生物传感器的构建及实际样品中大口黑鲈蛙病毒的检测提供参考。

Description

特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体及其筛选方法与 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体及其筛选方法与应用。
背景技术
大口黑鲈(Micropterus salmoides)，俗称加州鲈、大嘴鲈，在鱼类分类学上隶属于鲈形目(Perciformes)、鲈亚目(Porcoidei)、太阳鱼科(Cehtrachidae)、黑鲈属(Micropterus)，属广温性淡水名优鱼类，主要分布于北美的加利福尼亚州密西西比河水系。因其具有适应性较强、个体较大、生长迅速、容易捕获、养殖周期短等优点，且肉多味美，刺少无硬骨，外形美观，大口黑鲈已成为我国重要的淡水养殖品种，颇受养殖者和消费者欢迎。作为一种全球养殖鱼类，其2018年产量超过43.5万吨，其中中国占99.2％。
大口黑鲈病毒(LMBV)属于虹彩病毒科蛙病毒属，由该病毒引起的溃疡综合征病发病急、死亡率较高，给养殖者造成的损伤较大，已成为大口黑鲈养殖产业的严重威胁。该病可造成大口黑鲈皮肤、肌肉和鱼鳍红肿溃烂,鳃丝和肝脏发白，脾脏和肾脏肿大出血。由于其发病症状与嗜水气单胞菌(细菌)和镰刀菌(真菌)相似，均可引起大口黑鲈皮肤溃烂，在实际生产中，还常常出现养殖户或技术服务人员“误诊”的情况，造成病害大爆发。因此，在发病初期，及早发现病原体并采取相应的措施防治，对减少病害的发生尤为重要。
随着分子生物学相关学科的迅速发展，越来越多的分子检测技术已应用于病原微生物的检测。针对大口黑鲈病毒属虹彩病毒，已有普通PCR、多重PCR及荧光定量PCR检测方法的报道。虽然这些分子诊断技术具有一定的敏感性，特异性也较强，并且可大批量检测及避免主观偏差等优点，部分解决了快速检测的需求，但由于试验过程需要专业技术人员及PCR基因扩增仪、杂交仪等昂贵的仪器设备而造成一定的局限性；免疫学方法具有灵敏度高、特异性强、易于观察等优点，但抗体制备所需时间长，成本高，不稳定。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体及其筛选方法与应用。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体，所述寡核苷酸适配体的核苷酸序列为：
LVA-3 5'-CGACGAAATGTGACGTGACTGTGGTAGTACATGCTTGCCC-3'
LVA-5 5'-ACAGTGATGCGTAGTTCCGTGCGCTGAGTGGTGTTCGTGA-3'
LVA-12：5'-CAGCGTGAGCGGACGGGGCTGCGTTCAGTGCCGCGATGCC-3'。
一种特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体的筛选方法，所述寡核苷酸适配体为以上所述的寡核苷酸适配体，包括以下步骤：
(1)随机单链DNA文库的建立和引物
随机单链DNA文库：5′-AGTATACGTATTACCTGCAGC(N 40)CGATATCTCGGAGATCTTGC-3′，两端为固定序列，中间N40为含40个碱基的随机序列；
引物F：5′-AGTATACGTATTACCTGCAGC-3′
引物R：5′-GCAAGATCTCCGAGATATCG-3′
(2)对随机单链DNA文库进行非对称PCR扩增；
(3)SELEX筛选大口黑鲈蛙病毒的寡核苷酸适配体,包括第一轮筛选，正筛选，负筛选，重复筛选获得大口黑鲈病毒的适配体；
(4)DNA克隆和测序：经步骤(3)筛选后的单链DNA进行非对称PCR扩增；
(5)对适配体序列同源性和二级结构分析；
(6)对适配体特异性和亲和性分析，得到特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体。
进一步地，步骤(2)中，非对称PCR反应在反应混合物中进行，其中包含每轮筛选后上清液，下游引物，上游引物和2×Taq Master Mix，扩增所用的热循环程序是95℃预变性5min，然后95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸1min，共进行35个变性循环，最后延伸在72℃下进行5min。
进一步地，步骤(3)具体为：
第一轮筛选：取初始文库置于金属浴下加热后立即置于冰上放置，取大口黑鲈病毒颗粒悬液与文库混合，置于室温下，摇床上避光孵育，加入GO继续孵育，随后离心，弃掉沉淀，回收上清液进行非对称PCR扩增；
正筛选：取上一轮适当稀释后的PCR扩增产物与大口黑鲈病毒颗粒悬液混合，置于室温，摇床上避光孵育，加入GO继续孵育，随后离心，取上清液进行非对称PCR扩增；
负筛选：在每2次正筛之后进行一轮负筛选；
上一轮所制备的单链次级文库适当稀释后，经热变性处理后加入适量反筛物，摇床上孵育后，加入GO继续避光孵育，随后离心，弃上清后加入ddH2O轻微混匀后离心，然后取沉淀加入ddH2O重新悬浮，将混合液置于金属浴下加热后立即置于冰上放置，随后离心，取上清液进行非对称PCR扩增；
重复筛选，最终获得大口黑鲈病毒的适配体库。
进一步地，步骤(5)中，根据同源性将适配体序列分为五大家族，选择序列较多的家族中结构最稳定和同源性高的序列作为大口黑鲈病毒的候选适配体，利用在线程序Mfold对候选适配体序列的二级结构进行预测和模拟，选择每个适配体的所有预测二级结构的自由能，能级较低的序列进行下一步分析。
特异识别大口黑鲈蛙病毒的寡核苷酸适配体在检测大口黑鲈蛙病毒中的应用，所述寡核苷酸适配体为以上所述的寡核苷酸适配体。
本发明的有益效果是：
(1)本发明以大口黑鲈病毒为靶标，利用GO-SELEX技术获得了能与大口黑鲈蛙病毒高亲和力，高特异性结合的寡核苷酸适配体，能够快速、灵敏、特异的检测到大口黑鲈蛙病毒。适配体成本低，稳定性好，易于修饰，可作为抗体分子的前景性替代分子，被应用于生命科学各个领域的研究工作中。
(2)本发明采用GO-SELEX筛选方法，不需要固定文库或靶标，操作简便，筛选周期短且成本低廉，氧化石墨烯(graphene oxide，GO)能够与单链DNA的碱基发生π-π堆积作用而将ssDNA吸附在表面。
(3)本发明还提供一种微生物分子生物学检测方法：基于核酸适配体技术快速、准确检测大口黑鲈蛙病毒的方法，为后续生物传感器的构建及实际样品中大口黑鲈蛙病毒的检测提供参考。
附图说明
图1是LVA-3、LVA-5、LVA-12二级结构示意图。
图2是LVA-3、LVA-5、LVA-12荧光定量标准曲线。
图3是LVA-3、LVA-5、LVA-12特异性分析结果图。
图4是LVA-3、LVA-5适配体的饱和曲线图。
图5是水产养殖场病鱼样本中检测大口黑鲈虹彩病毒的结果图。
图6是从市场上随机购买的6条大口黑鲈作为样本检测大口黑鲈虹彩病毒的结果图。
图7从福建省和广东省的不同水产养殖场采集7份大口黑鲈病鱼作为样本检测大口黑鲈虹彩病毒的结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当指出的是，具体实施方式只是对本发明的详细说明，不应视为对本发明的限定。
以下实施例中，所述的PBS缓冲液均为0.0067M PBS缓冲液(pH 7.4)，1M＝mol/L，所使用的仪器或者化学试剂等均能够通过商业途径获得。
实施例1
特异识别大口黑鲈病毒的核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：
1)随机单链DNA(ssDNA)文库和引物的合成
建立长度为81nt的单链DNA随机ssDNA文库：5′-AGTATACGTATTACCTGCAGC(N 40)CGATATCTCGGAGATCTTGC-3′，两端为固定序列，中间N40为含40个碱基的随机序列。
上游引物F：5′-AGTATACGTATTACCTGCAGC-3′；
下游引物R：5′-GCAAGATCTCCGAGATATCG-3′；随机ssDNA文库和引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，将随机ssDNA文库和引物用ddH2O配制成浓度10μM贮液，-20℃保存备用。
2)大口黑鲈病毒粒子制备
将50mg大口黑鲈病毒阳性的大口黑鲈肝脏用0.0067M PBS缓冲液(pH7.4)漂洗3次后，加入15mL pH 7.4Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTA缓冲液包含10mM Tris/Tris-HCl，1mMEDTA，pH 7.4)在搅拌器中进行匀浆。然后匀浆液以1500rpm离心15min。上清液加NaCl至溶液中的氯化钠浓度0.5M后，与10％(m/v)聚乙二醇6000水溶液等体积混合，并于4℃下过夜保存。将上述混合物以8000rpm离心30min，并将所得的沉淀于4℃下重悬于PBS缓冲液中过夜。将混合物再次以10000rpm在4℃下离心1h，将获得的沉淀加入0.5mL PBS缓冲液重悬，用作纯化的病毒颗粒。
3)单链DNA(ssDNA)文库的非对称PCR扩增
每轮筛选前先将ssDNA文库进行扩增，作为下一轮筛选的ssDNA文库。非对称PCR反应在40μL反应混合物中进行，其中包含14μL每轮筛选后上清液，2μL 1μM的下游引物，4μL10μM的上游引物和20μL 2×Taq Master Mix(Vazyme)。扩增所用的热循环程序是95℃预变性5min，然后95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸1min，共进行35个变性循环，最后延伸在72℃下进行5min。对非对称PCR扩增产物进行电泳，并在质量分数为1.5％琼脂糖凝胶上进行分析。
若呈现单一、清晰的条带，非对称PCR扩增产物用于下一轮筛选。
若有杂带存在，则将非对称PCR扩增产物利用凝胶割胶回收试剂盒(MiniBESTAgarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0，TaKaRa)进行目的片段回收处理后用于下一轮筛选。具体目的片段回收步骤如下：
(1)用刀片割取终轮筛选非对称PCR产物目的片段，放入1.5mL离心管中。
(2)反应管中加入约3倍凝胶体积(计算胶块溶解液体积时，按照1mg＝1μL进行计算)的胶块溶解液Buffer GM，均匀混合后37℃溶解胶块。当凝胶完全溶解后，在此溶液中再加入异丙醇，异丙醇终浓度(v/v)为20％。
(3)将试剂盒中的吸附柱安置于收集管上，混合液转移到吸附柱中，12,000rpm离心1min弃滤液。
(4)将700μL的Buffer WB加入吸附柱中，室温12,000rpm离心30s，弃滤液。
(5)重复操作步骤4。
(6)将吸附柱安置于收集管上，室温12,000rpm离心2min。
(7)将吸附柱安置于新的1.5mL的离心管上，在吸附柱膜的中央处加入20μL灭菌水，室温静置1min。
(8)室温12,000rpm离心2min，收集溶液，即为回收的DNA。
4)SELEX筛选获得大口黑鲈病毒特异的核酸适配体
第一轮筛选：取20μL 10μM初始文库(所述初始文库指的是：上述步骤1)中的随机单链DNA文库)置于金属浴(95℃)下加热5min后立即置于冰上放置10min。取30μL大口黑鲈病毒颗粒悬液与文库混合，置于25℃下，100rpm摇床上避光孵育2h，加入20μL 15mg/mL GO继续孵育40min，随后8000rpm离心2min，弃掉沉淀，回收上清液进行非对称PCR扩增，非对称PCR扩增的步骤如上述步骤3)所述。
正筛选：取10μL上一轮的PCR扩增产物与30μL大口黑鲈病毒颗粒悬液混合，置于25℃，100rpm摇床上避光孵育2h，加入20μL 15mg/mL GO继续孵育40min，随后8000rpm离心2min，取上清液进行非对称PCR扩增，非对称PCR扩增的步骤如上述步骤3)所述。
负筛选：在每2次正筛之后进行一轮负筛选。
取10μL上一轮所制备的单链次级文库经95℃热变性处理后加入40μL反筛物(反筛物包括20mg/mL健康大口黑鲈肝组织混合液、5％(m/v)聚乙二醇6000、1×108CFU/mL嗜水气单胞菌、1×108CFU/mL大肠杆菌)，25℃，100rpm摇床上孵育2h后，加入50μL 15mg/mL GO继续避光孵育40min。随后8000rpm离心2min，弃上清后加入50μL ddH2O轻微混匀后8000rpm离心2min，然后取沉淀加入50μL ddH2O重新悬浮。将混合液置于金属浴95℃下加热5min后立即置于冰上放置10min，随后8000rpm离心2min，取上清液进行非对称PCR扩增，非对称PCR扩增的步骤如上述步骤3)所述。
一般重复筛选10次以上，本实施例中重复筛选12次获得大口黑鲈病毒的适配体库。
5)克隆和测序
终轮筛选后的ssDNA进行非对称PCR扩增。所述非对称PCR扩增步骤与上述步骤3)中的非对称PCR扩增步骤一样。
利用pMD19-T Vector克隆试剂盒对得到的扩增产物进行克隆。
(1)在0.2mL离心管中配置下列DNA溶液：
pMD19-T Vector 1μL
回收DNA 2μL
ddH<sub>2</sub>O 2μL
SolutionⅠ 5μL
16℃反应60min。
(2)连接产物(10μL)加入至100μL JM109感受态细胞中，冰浴30min。
(3)42℃热激1min后，迅速置于冰中放置1min。
(4)加入890μL 37℃预热的SOC培养基，混匀后37℃震荡培养1h。
(5)取200μL步骤(4)中的混合液涂布于含X-Gal、IPTG、Amp的LB平板固体培养基上，正面放置30min，37℃倒置培养14h。
(6)取LB平板上的白色菌落，于1mL含Amp的LB液体培养基中37℃培养18h。
(7)利用PCR对菌液初步进行验证是否含有目的片段，将挑选阳性克隆进行送样测序。测序由上海生工生物工程股份有限公司完成，获得61条适配体序列。
6)适配体序列结构分析
根据同源性将61条适配体序列分为五大家族。选择序列较多的家族中结构最稳定和同源性高的序列作为大口黑鲈病毒的候选适配体。本实施例中，筛选出的大口黑鲈病毒的候选适配体为：
LVA-3：5'-CGACGAAATGTGACGTGACTGTGGTAGTACATGCTTGCCC-3'
LVA-5：5'-ACAGTGATGCGTAGTTCCGTGCGCTGAGTGGTGTTCGTGA-3'
LVA-12：5'-CAGCGTGAGCGGACGGGGCTGCGTTCAGTGCCGCGATGCC-3'
利用在线程序Mfold对这3条候选适配体序列的二级结构进行预测和模拟。3条候选适配体序列二级结构如图1所示，比较每个适配体的所有预测二级结构的自由能，能级较低的序列为代表进行下一步分析。每条适配体中的茎环结构和发卡结构可能是适配体与靶病毒结合的基础。
7)候选适配体荧光定量PCR标准曲线制定
后续实验中对适配体进行定量，以适配体LVA-3，LVA-5和LVA-12的10倍系列稀释度(5pM-50nM)为模板进行荧光定量PCR标准曲线制定。荧光定量PCR反应体系20μL：模板1.5μL，上下游引物F/R各0.3μL，10μL
Figure BDA0002832306350000071
Premix Ex TaqTM(TaKaRa)，ddH2O补至20μL，反应条件：95℃预变性5min，40个循环(95℃预变性5s,62℃退火30s，72℃延伸30s)。图2显示，实时PCR具有较高的线性关系，
LVA-3的相关系数R2＝0.9988，回归方程为:
y＝-3.298x+28.95
LVA-5的相关系数R2＝0.9925，回归方程为:
y＝-3.342x+30.3
LVA-12的相关系数R2＝0.9962，回归方程为:
y＝-3.312x+29.52
8)适配体与大口黑鲈病毒特异性分析
分别取3条大口黑鲈病毒阳性(样品1，2，3)和3条大口黑鲈病毒阴性(样品4，5，6)的大口黑鲈的20mg肝脏，反复冻融研磨，重悬于500μL PBS缓冲液中，8000rpm离心5min后取上清。
将50μL 40nM核酸适配体水溶液分别与50μL上述6个上清液样品混合，置于25℃、100rpm摇床上孵育120min；再向混合液中加入50μL 15mg/mL氧化石墨烯(GO)继续避光孵育，离心后取上清液进行荧光定量PCR，测得Ct值，从而获得与靶标结合的适配体浓度。此处荧光定量PCR的步骤与上述步骤7)中的一样。
该试验共重复3次，通过计算与靶标结合的适配体浓度来分析核酸适配体对LMBV结合的特异性，结果如图3所示。由图3可知LVA-3、LVA-5对LMBV阳性肝组织匀浆上清液的结合效果明显高于对LMBV阴性肝组织匀浆上清液，适配体LVA-12对LMBV阴性肝组织匀浆上清液的结合效果高于LVA-3、LVA-5对LMBV阴性肝组织匀浆上清液的结合效果，该结果表明LVA-3与LVA-5对LMBV的特异性较好。
9)适配体与大口黑鲈病毒亲和性分析
将50μL梯度浓度(0-100nM)的候选适配体水溶液(LVA-3和LVA-5)分别与等浓度的LMBV(1.75×107copies/μL)混合并置于25℃、100rpm摇床上孵育120min。加入50μL 15mg/mL GO，继续孵育40min吸附游离适配体，8000rpm离心2min，对上清液中与LMBV结合的适配体进行荧光定量PCR，测得Ct值，从而获得与上清液中与LMBV结合的适配体浓度。此处荧光定量PCR的步骤与上述步骤7)中的一样。
最后以体系初始加入的适配体浓度为横坐标，上清液中与LMBV结合的适配体浓度为纵坐标，进行非线性拟合，得到候选适配体的饱和曲线(图4)，并计算得到LVA-3解离常数Kd值为48.43±7.25nM，而LVA-5解离常数Kd值为69.24±7.60nM。根据亲和常数越小，适配体与靶标的亲和力越大的原则可知，适配体LVA-3对LMBV的亲和力更大。因此，利用GO-SELEX技术筛选的大口黑鲈病毒高亲和性特异核酸适配体检测大口黑鲈病毒，具有广泛应用前景。
实施例2
从浙江省的不同水产养殖场采集了8份大口黑鲈病鱼样本。该样本显示出溃疡、鳞片脱落、体表出血和腹壁出血等临床症状。分别取8份大口黑鲈病鱼样本的肝脏20mg，反复冻融研磨，重悬于500μL PBS中，8000rpm离心5min后取上清。将50μL 40nM LVA-3核酸适配体水溶液分别与50μL上述8个上清液样品混合，置于25℃、100rpm摇床上孵育120min；再向混合液中加入50μL 15mg/mL GO继续避光孵育30min，离心后取上清液进行荧光定量PCR(此处荧光定量PCR的步骤与上述实施例1步骤7)一样)，测得Ct值，从而获得与靶标结合的适配体浓度。该试验共重复3次，依据实验结果可以判断是否被大口黑鲈病毒感染。结果如图5所示，样品1，3，5，7，8为大口黑鲈病毒阳性。
实施例3
从市场上随机购买的大口黑鲈6条，按照实施例2所述方法进行检测。检测结果如图6所示：样品2为LMBV阳性，其他样品均为LMBV阴性。
实施例4
从福建省和广东省的不同水产养殖场采集了7份大口黑鲈病鱼样本(该样本显示出溃疡、鳞片脱落、体表出血和腹壁出血等临床症状)，按照实施例2所述方法进行检测。如图7所示：样品1，2，5为LMBV阳性，其他样品均为LMBV阴性。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
序列表
<110> 浙江工商大学
<120> 特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体及其筛选方法与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgacgaaatg tgacgtgact gtggtagtac atgcttgccc 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acagtgatgc gtagttccgt gcgctgagtg gtgttcgtga 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagcgtgagc ggacggggct gcgttcagtg ccgcgatgcc 40

Claims (6)

1.特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体，其特征是，所述寡核苷酸适配体的核苷酸序列为：
LVA-3 5'-CGACGAAATGTGACGTGACTGTGGTAGTACATGCTTGCCC-3'
LVA-5 5'-ACAGTGATGCGTAGTTCCGTGCGCTGAGTGGTGTTCGTGA-3'
LVA-12：5'-CAGCGTGAGCGGACGGGGCTGCGTTCAGTGCCGCGATGCC-3'。
2.一种特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体的筛选方法，其特征是，所述寡核苷酸适配体为权利要求1所述的寡核苷酸适配体，包括以下步骤：
(1)随机单链DNA文库的建立和引物的合成
随机单链DNA文库：
5′-AGTATACGTATTACCTGCAGC(N 40)CGATATCTCGGAGATCTTGC-3′，两端为固定序列，中间N40为含40个碱基的随机序列；
引物F：5′-AGTATACGTATTACCTGCAGC-3′
引物R：5′-GCAAGATCTCCGAGATATCG-3′
(2)对随机单链DNA文库进行非对称PCR扩增；
(3)SELEX筛选大口黑鲈蛙病毒的寡核苷酸适配体，包括第一轮筛选，正筛选，负筛选，重复筛选获得大口黑鲈病毒的适配体；
(4)DNA克隆和测序：经步骤(3)筛选后的单链DNA进行非对称PCR扩增；
(5)对适配体序列同源性和二级结构分析；
(6)对适配体特异性和亲和性分析，得到特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体。
3.根据权利要求2所述的一种特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体的筛选方法，其特征是，步骤(2)中，非对称PCR反应在反应混合物中进行，其中反应混合物包含每轮筛选后上清液，下游引物，上游引物和2×Taq Master Mix，扩增所用的热循环程序是95℃预变性5min，然后95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸1min，共进行35个变性循环，最后延伸在72℃下进行5min。
4.根据权利要求2所述的一种特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体的筛选方法，其特征是，步骤(3)具体为：
第一轮筛选：取初始文库置于金属浴下加热后立即置于冰上放置，取大口黑鲈病毒颗粒悬液与文库混合，置于室温下，摇床上避光孵育，加入GO继续孵育，随后离心，弃掉沉淀，回收上清液进行非对称PCR扩增；
正筛选：取上一轮的PCR扩增产物与大口黑鲈病毒颗粒悬液混合，置于室温，摇床上避光孵育，加入GO继续孵育，随后离心，取上清液进行非对称PCR扩增；
负筛选：在每2次正筛之后进行一轮负筛选；
取上一轮所制备的单链次级文库，经热变性处理后加入适量反筛物，摇床上孵育后，加入GO继续避光孵育，随后离心，弃上清后加入ddH2O轻微混匀后离心，然后取沉淀加入ddH2O重新悬浮，将混合液置于金属浴下加热后立即置于冰上放置，随后离心，取上清液进行非对称PCR扩增；
重复筛选，最终获得大口黑鲈病毒的适配体库。
5.根据权利要求2所述的一种特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体的筛选方法，其特征是，步骤(5)中，根据同源性将适配体序列分为五大家族，选择序列较多的家族中结构最稳定和同源性高的序列作为大口黑鲈病毒的候选适配体，利用在线程序Mfold对候选适配体序列的二级结构进行预测和模拟，选择每个适配体的所有预测二级结构的自由能，能级较低的序列进行下一步分析。
6.特异识别大口黑鲈蛙病毒的寡核苷酸适配体在检测大口黑鲈蛙病毒中的应用，其特征是，所述寡核苷酸适配体为权利要求1所述的寡核苷酸适配体。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113215167A (zh) * 2021-05-24 2021-08-06 广西科学院 核酸适配体及其在检测大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞中的应用
CN113462694A (zh) * 2021-05-24 2021-10-01 广西科学院 一种针对大口黑鲈虹彩病毒感染细胞的核酸适配体及其应用
CN113462693A (zh) * 2021-05-24 2021-10-01 广西科学院 ssDNA核酸适配体在识别大口黑鲈虹彩病毒感染细胞中的应用
CN113684312A (zh) * 2021-08-24 2021-11-23 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种用于检测桑提库珀蛙病毒的数字pcr检测试剂盒
CN114230660A (zh) * 2022-02-25 2022-03-25 华南农业大学 抗大口黑鲈虹彩病毒lmbv的单克隆抗体及其应用
CN114807149A (zh) * 2022-03-21 2022-07-29 华南农业大学 一种特异性识别大口黑鲈虹彩病毒的核酸适配体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111073891A (zh) * 2019-10-30 2020-04-28 广西科学院 一种检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用
CN111135295A (zh) * 2020-01-17 2020-05-12 浙江省淡水水产研究所 一种大口黑鲈虹彩病毒病灭活疫苗及其制备方法
CN112080584A (zh) * 2020-08-05 2020-12-15 珠海科艺普检测科技有限公司 一种检测大口黑鲈病毒的引物及探针、试剂盒和方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111073891A (zh) * 2019-10-30 2020-04-28 广西科学院 一种检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用
CN111135295A (zh) * 2020-01-17 2020-05-12 浙江省淡水水产研究所 一种大口黑鲈虹彩病毒病灭活疫苗及其制备方法
CN112080584A (zh) * 2020-08-05 2020-12-15 珠海科艺普检测科技有限公司 一种检测大口黑鲈病毒的引物及探针、试剂盒和方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YU QING等: "Selection and Characterization of ssDNA Aptamers Targeting Largemouth Bass Virus Infected Cells With Antiviral Activities", 《FRONT MICROBIOL》 *
夏焱春等: "大口黑鲈主要病害研究进展", 《中国动物检疫》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113215167A (zh) * 2021-05-24 2021-08-06 广西科学院 核酸适配体及其在检测大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞中的应用
CN113462694A (zh) * 2021-05-24 2021-10-01 广西科学院 一种针对大口黑鲈虹彩病毒感染细胞的核酸适配体及其应用
CN113462693A (zh) * 2021-05-24 2021-10-01 广西科学院 ssDNA核酸适配体在识别大口黑鲈虹彩病毒感染细胞中的应用
CN113215167B (zh) * 2021-05-24 2023-11-17 广西科学院 核酸适配体及其在检测大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞中的应用
CN113462694B (zh) * 2021-05-24 2024-04-05 广西科学院 一种针对大口黑鲈虹彩病毒感染细胞的核酸适配体及其应用
CN113462693B (zh) * 2021-05-24 2024-04-05 广西科学院 ssDNA核酸适配体在识别大口黑鲈虹彩病毒感染细胞中的应用
CN113684312A (zh) * 2021-08-24 2021-11-23 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种用于检测桑提库珀蛙病毒的数字pcr检测试剂盒
CN113684312B (zh) * 2021-08-24 2022-05-10 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种用于检测桑提库珀蛙病毒的数字pcr检测试剂盒
CN114230660A (zh) * 2022-02-25 2022-03-25 华南农业大学 抗大口黑鲈虹彩病毒lmbv的单克隆抗体及其应用
CN114807149A (zh) * 2022-03-21 2022-07-29 华南农业大学 一种特异性识别大口黑鲈虹彩病毒的核酸适配体及其应用
CN114807149B (zh) * 2022-03-21 2023-11-17 华南农业大学 一种特异性识别大口黑鲈虹彩病毒的核酸适配体及其应用

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