CN114807149B - 一种特异性识别大口黑鲈虹彩病毒的核酸适配体及其应用 - Google Patents

一种特异性识别大口黑鲈虹彩病毒的核酸适配体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性识别大口黑鲈虹彩病毒的核酸适配体及其应用。本发明所述核酸适配体的特异性及亲和力强，可用于检测大口黑鲈虹彩病毒或制备检测大口黑鲈虹彩病毒的产品。此外，本发明还利用带有生物素标记的核酸适配体，构建了核酸适配体‑靶标‑核酸适配体的夹心检测体系，用于大口黑鲈虹彩病毒的检测。与传统的ELISA及其他检测方法相比，利用该检测体系检测大口黑鲈虹彩病毒时具有检测速度快、灵敏度高、特异性强，且操作简便等优点，克服了传统仪器不能进行现场快速检测，以及基于抗体的检测方法需要制备抗体，耗时久、费用高、具有批次间差异的缺点。

Description

一种特异性识别大口黑鲈虹彩病毒的核酸适配体及其应用
技术领域
本发明属于大口黑鲈病毒检测技术领域。更具体地，涉及一种特异性识别大口黑鲈虹彩病毒的核酸适配体及其应用。
背景技术
大口黑鲈(Micropterussalmoides)为太阳鱼科，黑鲈属鱼类。近年来，随着大口黑鲈养殖业的迅速发展以及养殖规模的不断扩大，成为我国重要的经济养殖鱼类之一。而致死性病害的时有暴发成为影响大口黑鲈养殖业健康发展的重要因素，并且会造成巨大的经济损失。
大口黑鲈虹彩病毒(LMBV)是从患病大口黑鲈中分离到的病毒性病原，具有高传染性、高致病性、致死率高以及流行广泛等特点，目前尚无明显有效的治疗药物，只能通过做好预防措施来减少该病的发生。因此，开发能特异、高效地检测大口黑鲈虹彩病毒的产品及方法，对预防大口黑鲈虹彩病毒病的发生具有重要意义。
目前，对大口黑鲈虹彩病毒进行检测诊断的方法主要包括基于病毒学、组织病理学的传统方法，基于抗体的免疫学检测方法以及以PCR为代表的分子生物学检测技术等。虽然这些技术发展成熟且应用广泛，但由于需要提取样品核酸等复杂步骤，耗时长且操作专业性要求较高，对专业仪器设备依赖程度高，导致这些检测方法更适用于专业的实验室条件检测。酶联免疫吸附测定技术(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是一种基于抗体的检测方法。随着核酸适配体的发展，产生了一种代替抗体的酶联适配体免疫吸附测定技术(enzyme-linked apta-sorbent assay，ELASA)。
核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配体系统进化技术(systematicevolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)从体外人工合成的寡核苷酸文库中筛选得到的一种单链寡核苷酸序列(RNA或DNA)，可以形成特异性的二级结构或三级结构，并通过氢键、碱基堆积力和范德华力等次级键，以自适应的方式高特异性高亲和力地识别结合靶标分子。现有技术中虽有关于可用于检测大口黑鲈虹彩病毒的核酸适配体的报道，但其亲和力和特异性等仍有待提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种特异性识别大口黑鲈虹彩病毒的核酸适配体及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种特异性识别大口黑鲈虹彩病毒的核酸适配体。
本发明的第二个目的是提供所述核酸适配体在制备用于检测大口黑鲈虹彩病毒的产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种用于检测大口黑鲈虹彩病毒的试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种特异性识别大口黑鲈虹彩病毒的核酸适配体，包括核酸适配体序列1和/或核酸适配体序列2；核酸适配体序列1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，核酸适配体序列2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明所述核酸适配体可特异性识别大口黑鲈虹彩病毒，使用所述核酸适配体检测大口黑鲈虹彩病毒时，既可以单独使用核酸适配体序列1或序列2进行检测，也可以同时使用序列1和序列2进行检测。因此，本发明申请保护所述核酸适配体在检测大口黑鲈虹彩病毒或制备用于检测大口黑鲈虹彩病毒的产品中的应用。
为便于检测，所述核酸适配体上结合有标记物，所述标记物可以为酶、发光基团或生物素。
具体地，所述标记物为生物素。
本发明还提供了一种用于检测大口黑鲈虹彩病毒的试剂盒，其含有本发明所述核酸适配体。
具体地，所述试剂盒中的核酸适配体上带有生物素标记。
具体地，所述试剂盒中还含有酶联免疫反应所需试剂。
具体地，所述试剂盒中的核酸适配体的使用浓度为160～240nM。
优选地，核酸适配体的使用浓度为200nM。
本发明利用带有生物素标记的特异性识别大口黑鲈病毒的核酸适配体，构建了一种核酸适配体-靶标(LMBV)-核酸适配体的夹心检测体系(即SandwichELASA)，同时提供了一种用于检测大口黑鲈虹彩病毒的试剂盒。使用时，通过将带有生物素标记的核酸适配体固定在被生物素结合蛋白(链霉亲和素)包被的酶联免疫板，以捕获待测样品中的大口黑鲈虹彩病毒，再用生物素标记的核酸适配体结合大口黑鲈虹彩病毒，加入辣根过氧化物酶-链霉亲和素孵育结合，通过辣根过氧化物酶显色试剂盒显色，根据测定的吸光值分析是否有大口黑鲈虹彩病毒感染。
本发明所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
S1.孵育：将所述核酸适配体加入预包被生物素结合蛋白的酶联免疫板中进行孵育结合，清洗掉未结合的核酸适配体；
S2.封闭：加入封闭液进行封闭，封闭后清洗；
S3.捕获靶标：将待测样品加入酶联免疫板充分孵育后再次清洗；
S4.二次孵育：再次向酶联免疫板中加入所述核酸适配体，孵育结合后清洗；
S5.显色：向酶联免疫板中加入辣根过氧化物酶与生物素结合蛋白的混合液孵育，清洗后加入底物显色液避光反应，反应结束后加入终止液，通过测定450nm吸光值来判断结果；当所测样品的吸光值大于对照时，则该样品的检测结果为阳性，表明所测样品中含有大口黑鲈虹彩病毒；当所测样品的吸光值小于对照时，该样品的检测结果为阴性。
具体地，步骤S1中所述核酸适配体在进行孵育结合前，需要先在95℃变性10min，后迅速放在冰上复性10min。
具体地，步骤S2中所述封闭液为500nM的生物素溶液，使用体积为500μL。
具体地，步骤S1和S4中所加入核酸适配体的浓度为200nM，体积为100μL。
具体地，步骤S1中加入的核酸适配体为SEQ ID NO.3所示核酸适配体；步骤S4中加入的核酸适配体为SEQ ID NO.4所示核酸适配体。除此外，也可在步骤S1中先加入SEQ IDNO.4所示核酸适配体，在步骤S4中加入SEQ ID NO.3所示核酸适配体；或步骤S1和S4中均使用SEQ ID NO.3所示核酸适配体；或步骤S1和S4中均使用SEQ ID NO.4所示核酸适配体。
具体地，步骤S5中辣根过氧化物酶与生物素结合蛋白(链霉亲和素)的体积比为1：10000，所加入混合液的体积为100μL。
具体地，步骤S5中所述终止液为2M H2SO4，使用体积为100μL。
具体地，上述步骤中清洗所用试剂均为PBS缓冲液。
利用本发明所述试剂盒，参照上述方法，可检测样品中是否含有大口黑鲈虹彩病毒。
所述样品可以为大口黑鲈脾组织样品或细胞样品。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了特异性及亲和力增强的核酸适配体，较短的序列长度同时也降低了成本，且更易被标记物修饰，更利于使用。本发明在所述特异性识别大口黑鲈虹彩病毒的核酸适配体的基础上，利用带有生物素标记的核酸适配体，构建了一种核酸适配体-靶标(LMBV)-核酸适配体的夹心检测体系和方法和相应的检测试剂盒，可用于大口黑鲈养殖过程中对大口黑鲈虹彩病毒的检测和监测。
与传统的ELISA及其他检测方法相比，本发明所述检测方法具有检测速度快、灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，克服了传统检测仪器不能用于现场快速检测，基于抗体的ELISA需要制备制备抗体，耗时久、费用高、具有批次间差异等缺点。
附图说明
图1为本发明所述核酸适配体的特异性分析结果；其中，图A为核酸适配体序列1的特异性分析结果；图B为核酸适配体序列2的特异性分析结果。
图2为本发明所述核酸适配体的亲和力分析结果；其中，图A为全长序列1的亲和力分析结果；图B为核酸适配体序列1的亲和力分析结果；图C为序列3的亲和力分析结果；图D为序列4的亲和力分析结果；图E为全长序列2的亲和力分析结果；图F为核酸适配体序列2的亲和力分析结果；图G为序列5的亲和力分析结果；图H为序列6的亲和力分析结果。
图3为利用本发明所述Sandwich ELASA检测LMBV及其感染的细胞裂解物的特异性分析结果；其中，LMBV为序列1-LMBV-序列2的夹心模型；LMBV-EPC裂解物为序列1-LMBV感染的EPC细胞的裂解物-序列2的夹心模型；对照1为序列1-SGIV-序列2的夹心模型；对照2为序列1-FV3-序列2的夹心模型；对照3为序列1-EPC细胞-序列2的的夹心模型；对照4为文库-LMBV-文库的夹心模型；对照5为文库-LMBV感染的EPC细胞裂解物-文库的夹心模型；对照6为文库-SGIV-文库的夹心模型；对照7为文库-FV3-文库的夹心模型；对照8为文库-EPC细胞-文库的夹心模型；序列1为生物素标记的SEQ ID NO.3所示核酸适配体，序列2为生物素标记的SEQ ID NO.4所示核酸适配体。
图4为利用本发明所述试剂盒检测LMBV感染的EPC细胞的灵敏度分析结果；其中，对照1为SGIV感染的GS细胞，对照2为EPC细胞。
图5为利用本发明所述试剂盒检测LMBV感染所需孵育结合时间的分析结果；其中，对照1为SGIV感染的GS细胞，对照2为EPC细胞。
图6为利用本发明所述试剂盒检测LMBV感染的大口黑鲈脾组织的检测结果，对照为正常大口黑鲈脾组织。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
1、核酸适配体
本发明在前期筛选所得的核酸适配体(CN 112522274A)的全长序列的基础上，通过截短全长序列获得了一系列截短体，并从中获得了特异性及亲和力较全长序列增强的核酸适配体，所述核酸适配体全长序列以及所得截短体的序列如下所示。
其中，序列1、3和4为全长序列1的截短体；序列2、5和6为全长序列2的截短体。本发明所述特异性识别大口黑鲈虹彩病毒的核酸适配体为核酸适配体序列1(SEQ ID NO.3)和核酸适配体序列2(SEQ ID NO.4)。
全长序列1(SEQ ID NO.1)：
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAGCCGGCCCGGGGGATAGAGTGCTCCCGATCCCTTGGCGAAGGGACTGGACACGGTGGCTTAGT-3’
全长序列2(SEQ ID NO.2)：
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCATTTTGACGCTTTATCCTTTTCTTATGGCGGGATAGTTTCGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’
核酸适配体序列1(SEQ ID NO.3)：
5’-GCCGGCCCGGGGGATAGAGTGCTCCCGATCCCTTGGCGAAGGGAC-3’
核酸适配体序列2(SEQ ID NO.4)：
5’-TTTTGACGCTTTATCCTTTTCTTATGGCGGGATAGTTTCG-3’
序列3(SEQ ID NO.5)：
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAGCCGGGGACTGGACACGGTGGCTTAGT-3’
序列4(SEQ ID NO.6)：
5’-CCCGGGGGATAGAGTGCTCCCGATCCCTTGGCGAA-3’
序列5(SEQ ID NO.7)：
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCATTCGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’
序列6(SEQ ID NO.8)：
5’-ACGCTTTATCCTTTTCTTATGGCGGGATAG-3’
2、Sandwich ELASA
本发明同时利用带有生物素标记的核酸适配体，构建了一种核酸适配体-靶标(LMBV)-核酸适配体的夹心检测体系(即Sandwich ELASA)。
利用Sandwich ELASA进行检测的具体过程为：
(1)合成带有生物素标记的核酸适配体
所述核酸适配体的序列如上所示，由生工生物合成，核酸适配体序列的5’或3’端带有生物素标记；
(2)核酸适配体的固定
将浓度为200nmol的生物素标记的核酸适配体加入预包被链酶亲和素的酶联免疫板，在冰上孵育1h，孵育结束后每个孔用1×PBS(1×PBS：称取0.24g磷酸二氢钾，1.42g磷酸氢二钠，8g氯化钠和0.2g氯化钾溶于800mL双蒸水中，用浓盐酸调pH至7.4，定容到1L，高温高压灭菌后于室温保存)清洗3次；同时用生物素标记的随机起始文库作为对照；
(3)封闭
加入浓度为500nM的生物素溶液孵育30min以封闭，孵育结束后每个孔用PBS洗涤；
(4)捕获LMBV
将100μL待测样品(可能感染大口黑鲈病毒的细胞样品或切碎后用裂解液裂解的大口黑鲈脾组织)加入至对应孔中，冰上孵育1h，孵育结束后每个孔用PBS洗涤；
(5)检测
将浓度为200nmol的生物素标记的核酸适配体加入对应孔中，并在冰上孵育1h，孵育结束后每个孔用PBS洗涤；然后加入100μL辣根过氧化物酶-链霉亲和素(辣根过氧化物酶与链酶亲和素的体积比为1：10000)，冰上孵育30分钟后用PBS洗涤5次。
(6)显色
使用Pierce TMB底物试剂盒显色，每孔加入100μL反应液，避光反应20分钟，加入100μL 2M H2SO4终止液终止反应，并用酶标仪测定每孔对应的OD450，根据吸光值来判断是否有大口黑鲈病毒感染。
当所测样品的OD450大于对照时，则该样品的检测结果为阳性，表明所测样品中含有大口黑鲈虹彩病毒；当所测样品的OD450小于对照时，该样品的检测结果为阴性。
3、特异性及亲和力分析
利用2所述Sandwich ELASA检测方法，对上述核酸适配体的特异性及亲和力进行分析。
特异性分析结果如图1所示，其中，图1A为SEQ ID NO.3所示核酸适配体序列1的特异性分析结果；图1B为SEQ ID NO.4所示核酸适配体序列2的特异性分析结果。由图1可知，核酸适配体序列1和序列2均可以与靶标LMBV特异性结合，而与对照组SGIV、FV3和EPC细胞没有明显结合。序列3和序列4均为全长序列1上的部分截短序列。与全长序列1、序列3和序列4相比，序列1对靶标LMBV的特异性更强；序列5和序列6均为全长序列2上的部分截短序列。序列2与全长序列2对靶标LMBV的特异性无显著差异，但与序列5和序列6相比，序列2对靶标LMBV的特异性更强。
核酸适配体的亲和力分析结果如图2所示，其中，图2A为全长序列1的亲和力分析结果，其Kd值为5.09nM；图2B为核酸适配体序列1的亲和力分析结果，其Kd值为3.42nM；图2C为序列3的亲和力分析结果，其Kd值为15.58nM；图2D为序列4的亲和力分析结果，其Kd值为11.29nM；图2E为全长序列2的亲和力分析结果，其Kd值为5.43nM；图2F为核酸适配体序列2的亲和力分析结果，其Kd值为2.34nM；图2G为序列5的亲和力分析结果，其Kd值为27.16nM；图2H为序列6的亲和力分析结果，其Kd值为7.35nM。Kd值越低表明亲和力越强，对比Kd值可知，本发明所述核酸适配体序列1和2具有更强的亲和力。
基于上述实验结果，本发明还提供了一种用于检测大口黑鲈虹彩病毒的试剂盒，所述试剂盒中含有核酸适配体序列1(SEQ ID NO.3)和核酸适配体序列2(SEQ ID NO.4)。
所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
S1.孵育：将所述核酸适配体加入预包被生物素结合蛋白的酶联免疫板中进行孵育结合，清洗掉未结合的核酸适配体；
S2.封闭：加入封闭液进行封闭，封闭后清洗；
S3.捕获靶标：将待测样品加入酶联免疫板充分孵育后再次清洗；
S4.二次孵育：再次向酶联免疫板中加入所述核酸适配体，孵育结合后清洗；
S5.显色：向酶联免疫板中加入辣根过氧化物酶与生物素结合蛋白的混合液孵育，清洗后加入底物显色液避光反应，反应结束后加入终止液，通过测定450nm吸光值来判断结果；若所测样品的吸光值高于对照，则检测结果为阳性，反之为阴性。
具体地，步骤S1中所述核酸适配体在进行孵育结合前，需要先在95℃变性10min，后迅速放在冰上复性10min。
具体地，步骤S2中所述封闭液为500nM的生物素溶液，使用体积为500μL。
具体地，步骤S1和S4中所加入核酸适配体的浓度为200nM，体积为100μL；步骤S1中加入的核酸适配体为SEQ ID NO.3所示核酸适配体；步骤S4中加入的核酸适配体为SEQ IDNO.4所示核酸适配体。
此外，也可在步骤S1中先加入SEQ ID NO.4所示核酸适配体，在步骤S4中加入SEQID NO.3所示核酸适配体；或步骤S1和S4中均使用SEQ ID NO.3所示核酸适配体；或步骤S1和S4中均使用SEQ ID NO.4所示核酸适配体。
具体地，步骤S5中辣根过氧化物酶与生物素结合蛋白(链霉亲和素)的体积比为1：10000，所加入混合液的体积为100μL。
具体地，步骤S5中所述终止液为2M H2SO4，使用体积为100μL。
具体地，上述步骤中清洗所用试剂均为PBS缓冲液。
实施例2
本发明利用Sandwich ELASA对LMBV及其感染后的细胞裂解物进行了检测，以此对本发明所述核酸适配体的检测特异性进行分析。
本发明将带有生物素标记的核酸适配体和随机起始文库分别与LMBV及其感染后的细胞裂解物结合，制备了10个夹心模型来进行特异性分析。所述夹心模型分别为：LMBV：序列1-LMBV-序列2；LMBV-EPC裂解物：序列1-LMBV感染的EPC细胞的裂解物-序列2；对照1：序列1-SGIV-序列2；对照2：序列1-FV3-序列2；对照3：序列1-EPC细胞-序列2；对照4：文库-LMBV-文库；对照5：文库-LMBV感染的EPC细胞裂解物-文库；对照6；文库-SGIV-文库；对照7：文库-FV3-文库；对照8：文库-EPC细胞-文库。其中，序列1为SEQ ID NO.3所示核酸适配体，序列2为SEQ ID NO.4所示核酸适配体；“SGIV”为新加坡石斑鱼虹彩病毒；“FV3”为蛙病毒；EPC为鲤鱼上皮瘤细胞；文库为随机起始文库。
结果如图3所示，由图3可知，利用本发明所述试剂盒可以检测到LMBV病毒粒子和LMBV感染的EPC细胞的裂解物，但无法检测到对照SGIV、FV3病毒粒子和EPC细胞。此外，基于文库的Sandwich ELASA无法检测到LMBV及LMBV感染的细胞裂解物，同时也无法检测到SGIV、FV3和EPC细胞。上述结果表明，本发明所述核酸适配体对LMBV具有高度特异性，可用于LMBV的检测。
实施例3
本发明通过将LMBV感染的EPC细胞的裂解物进行稀释，得到梯度检测样品，对实施例1所述试剂盒的检测灵敏度进行了测试。所述梯度检测样品的稀释浓度依次为：9×107、1×107、1×106、1×105、5×104、2.5×103、1.25×102个/mL。
灵敏度分析结果如图4所示，其中，对照1为SGIV感染的石斑鱼脾脏细胞(GS)，对照2为EPC细胞；由图4所示结果可知，本发明所述核酸适配体可检测浓度低至1.25×102个/mLLMBV感染细胞裂解物。
实施例4
本发明还对实施例1所述试剂盒检测LMBV感染所需孵育结合时间进行了分析。将LMBV感染的EPC细胞与生物素标记的核酸适配体在冰上分别孵育结合60、50、40、30、20、15、10和5分钟后进行检测，对检测LMBV感染所需孵育结合时间的分析。结果如图5所示，其中，对照1为SGIV感染的GS细胞，对照2为EPC细胞；由图5所示结果可知，当孵育时间大于10分钟时，本发明所述核酸适配体可以检测到LMBV感染。
实施例5实际样品的检测
本发明还利用实施例1所述试剂盒对实际样品进行了检测。首先将疑似患病的大口黑鲈解剖，取其脾脏组织，用PBS洗涤3次后，加入200μL Pierce IP LysisBuffer，放入匀浆仪中处理，得匀浆液；以正常大口黑鲈脾脏组织裂解后的匀浆液为对照。
将生物素标记的核酸适配体加入酶联免疫板中，孵育后清洗，封闭后再次清洗，将脾组织裂解后的匀浆液加入100μL至对应孔中，后续操作参照实施例1所述Sandwich ELASA的操作方法。结果如图6所示，由图6可知，本发明所述试剂盒可以检测到患病大口黑鲈脾组织中的LMBV，可用于实际样本中LMBV的检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
岭南现代农业科学与技术广东省实验室
<120> 一种特异性识别大口黑鲈虹彩病毒的核酸适配体及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atccagagtg acgcagcagc cggcccgggg gatagagtgc tcccgatccc ttggcgaagg 60
gactggacac ggtggcttag t 81
<210> 2
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atccagagtg acgcagcatt ttgacgcttt atccttttct tatggcggga tagtttcgtg 60
gacacggtgg cttagt 76
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccggcccgg gggatagagt gctcccgatc ccttggcgaa gggac 45
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttttgacgct ttatcctttt cttatggcgg gatagtttcg 40
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atccagagtg acgcagcagc cggggactgg acacggtggc ttagt 45
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccgggggat agagtgctcc cgatcccttg gcgaa 35
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atccagagtg acgcagcatt cgtggacacg gtggcttagt 40
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgctttatc cttttcttat ggcgggatag 30

Claims (6)

1.一种特异性识别大口黑鲈虹彩病毒的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体上结合有标记物。
3.根据权利要求2所述核酸适配体，其特征在于，所述标记物为生物素。
4.权利要求1～3任一所述核酸适配体在制备用于检测大口黑鲈虹彩病毒的产品中的应用。
5.一种用于检测大口黑鲈虹彩病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1～3任一所述核酸适配体；所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
S1.孵育：将核酸适配体加入预包被生物素结合蛋白的酶联免疫板中进行孵育结合，清洗掉未结合的核酸适配体；所述核酸适配体在进行孵育结合前，需要先在95℃变性10min，后迅速放在冰上复性10min；所加入的核酸适配体的浓度为160～240nM，体积为100μL；
S2.封闭：加入封闭液进行封闭，封闭后清洗；
S3.捕获靶标：将待测样品加入酶联免疫板充分孵育后再次清洗；
S4.二次孵育：再次向酶联免疫板中加入核酸适配体，孵育结合后清洗；
S5.显色：向酶联免疫板中加入辣根过氧化物酶与生物素结合蛋白的混合液孵育，清洗后加入底物显色液避光反应，反应结束后加入终止液，通过测定450nm吸光值来判断结果；若所测样品的吸光值高于对照，则检测结果为阳性，反之为阴性；所述辣根过氧化物酶与生物素结合蛋白的体积比为1：10000，所加入混合液的体积为100μL。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，步骤S1和S4中所加入核酸适配体的浓度为200nM，体积为100μL。
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