KR102254697B1 - 이뮤노 중합효소연쇄반응 기법을 이용한 구제역 바이러스 진단법 및 진단키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이뮤노 중합효소연쇄반응 기법(immono-polymerase chain reaction; Immono PCR)을 이용한 구제역 바이러스(Foot and mouth disease virus) 진단법 및 진단키트에 관한 것으로, 본 발명의 구제역(Foot-and-Mouth Disease, FMD) 바이러스 검출용 키트는 구제역 조기 진단을 위해, 진단 방법의 간이성과 정확한 판독을 동시에 만족할 수 있어, 사전적인 구제역 진단관리 및 구제역 바이러스의 감염 확산 방지를 통한 구제역 예방 및 확산의 방지에 중요한 방법으로서 사용될 수 있다. 또한, 맞춤형 조기진단 및 진단키트에 대한 요구가 증가함에 따라 본 발명의 구제역 바이러스 검출용 키트는 잠재적 가치가 매우 높고, 관련 시장의 확대에 긍정적 영향을 미칠 수 있다.

Description

이뮤노 중합효소연쇄반응 기법을 이용한 구제역 바이러스 진단법 및 진단키트 {Kit of detection for Foot and mouth disease virus with immono-polymerase chain reaction and method thereof}

본 발명은 이뮤노 중합효소연쇄반응 기법(immono-polymerase chain reaction; Immono PCR)을 이용한 구제역 바이러스(Foot and mouth disease virus) 진단법 및 진단키트에 관한 것이다.

구제역(Foot-and-Mouth Disease, FMD)이란 소, 돼지, 양, 염소 및 사슴 등 우제류에 감염되는 질병으로, 가축 전염병 예방법 제1종 가축전염병에 속하는 세계 동물 보건 기구(OIE, Office International des Epizooties)에서 지정한 중요 가축 전염병이다. 전염성이 매우 강하며 잠복 기간은 2일 내지 14일 정도로 매우 짧은 편이다.

구제역의 원인이 되는 구제역 바이러스(Foot-and- Mouth Disease Virus, FMDV)는 약8.4kb의 포지티브 센스 단일 가닥 RNA(single-stranded positive sense RNA; +ssRNA)로 구성된 RNA 바이러스이다. 이 바이러스는 피코르나바이러스(Picornaviridae) 계통의 일원으로 아프토바이러스속(Aphthovirus)으로 분류된다. 이들은 외피가 없고, VP1, VP2, VP3, VP4 구조단백질과 여러 종류의 비구조 단백질로 구성된 바이러스다. FMDV는 7가지 혈청형 A, O, C, Asia 1, SAT1, SAT2, SAT3으로 분류되며, 이 주요 혈청형은 80여 가지 혈청 아형으로 더 나누어진다.

구제역은 전 세계적으로 다양한 혈청형이 발현한다. 우리나라에서 주로 발생하는 혈청형은 O형과 A형이 있으며, 전 세계적으로 O형이 가장 많이 분리되었고, 그 다음으로 A형이 분리되었다. 한국의 구제역은 1911년 소규모로 발생하기 시작하여 1934년까지는 전국적으로 발생하였으나, 그 이후 발생이 없다가 2000년 다시 발병했다. 이후 20O2년 1회, 2O10년 2회, 2O10년에서 2O11년에 걸쳐 1회, 2O14년 1회, 2O14에서 2O15년에 걸쳐 1회, 2O16년 1회, 2O17년에 1회 발병해 많은 피해를 발생시켰다. 한국에서 발생한 구제역 바이러스의 혈청형은 대부분 O형이나 A형으로 한 혈청씩만 발병하였으나, 2O17년에 O형과 함께 A형이 동시에 다른 지역에서 발병했다.

구제역에 대한 최종적인 확정 진단은 OIE에서 지정한 구제역 국제표준실험실로 수포액, 수포상피세포 및 혈청 등의 가검물 또는 감염동물로부터 분리한 바이러스를 송부하여 확진하게 된다. 한국에서는 이하와 같은 과정을 거치고 있다. 구제역 의심가축이 신고되면 농림축산검역본부에서 농장으로 연구원이 파견되어 샘플을 채취한다. 파견된 연구원은 현장에서 임시 진단키트를 이용하여 채취한 샘플을 통해 빠르게 결과를 진단한다. 이 검사에서 FMDV가 검출되면 샘플을 실험실로 가져와 항체진단과 항원진단을 거쳐 정확히 양성인지, 양성이라면 어떤 혈청형인지를 확인한다. 이러한 과정은 샘플의 이동 및 검사 시간이 필요하나 그동안 가축의 이동이 통제되지 않을 경우 더 큰 확산이 발생할 가능성이 존재한다.

한편, 구제역 발생 및 확산의 원인에는 발생 초기의 대응 미숙, 진단방법의 한계, 진단과 판정의 시간이 과다하게 소요되는 점, 진단시료의 적절성, 방역조직체제 허술함 등을 포함하여 다양한 문제가 존재한다. 실제 2O11년 구제역 확산 당시에도, 구제역 발생 이후, 당시의 문제점들과 더불어 구제역 조기진단을 위한 진단방법 및 구제역 판독과정에서 미흡한 대응으로 문제가 있었다.

현재 우리나라에서 사용하고 있는 진단방법 및 진단키트의 경우 Merial사에 보관이 된 항원을 기초로 생산되거나, 비슷한 혈청형의 바이러스를 항원으로 사용하고 있다. 그러나 구제역 바이러스는 유전적인 변형이 매우 쉽게 일어나기 때문에 수많은 혈청형(아형)이 생성이 될 수 있고, 혈청형이 다른 백신은 그 효능이 낮아 혈청형이 맞는 진단키트의 사용이 중요하다. 다만, 혈청형이 맞는 진단키트의 제조 및 생산은 많은 시간이 소요되므로 발생 당시 바이러스의 혈청형에 대한 조기 진단은 거의 불가능한 실정이다. 구제역과 같이 전염성이 강한 질병을 현장에서 조기에 정확하게 진단하지 못하면 바이러스가 확산되고 피해가 커지게 된다. 의심 신고 후 확진까지 2~3일 소요되는 현재의 상황에서는 전염성 질환의 확산을 방지하는데 어려움이 많다. 따라서, 전염성 질환이 확산 되기 전 질병을 조기에 진단할 수 있는 진단법의 필요성이 요구되는 실정이다.

종래 구제역 진단방법에 대해서는 다수의 발표 사례가 있으며, 검체로부터 얻어진 체액의 항원제시 물질, 항체, 합텐 및 이들의 조합이 검출시약과의 복합체를 형성함으로써 키트의 외관 변화를 통해 구제역 바이러스 감염여부를 판단하는 진단키트가 보고되었다(대한민국등록특허: 10-053176). 감염 의심축의 항체를 분석함으로써 진단하는 방법에는 혈청형별로 SAT I형 구제역의 진단방법(대한민국등록특허: 10-1462988)과 SAT II형의 진단방법(대한민국등록특허: 10-1236203) Asia I형 진단방법(대한민국등록특허: 10-1105833)이 각각 보고되었다. 현재까지 보고된 구제역 유전자검사법에는 7가지 혈청혈을 분석하기 위해 디자인된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후에 전기영동상의 DNA 사이즈의 차이로 감별해 내는 방법(대한민국등록특허: 10-1247981)과 O형, A형, Asia I형을 대상으로 1개의 튜브에서 3가지 항혈청형을 구분할 수 있게끔 고안된 멀티플렉스 실시간 중합효소연쇄반응(Multiplex RT-PCR)이 보고되었다(대한민국등록특허: 10-129367). 실시간 PCR을 이용하여 구제역 바이러스의 감염 여부를 진단할 수 있는 방법으로 구제역 원인 바이러스의 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 이를 포함 하는 PCR칩, PCR장치 및 검출 방법에 관한 보고가 이루어졌으며(대한민국공개특허: 10-2O13-0085227) 이에 대하여 구제역의 혈청 타입별 유전자 검출용 프라이머 세트가 공개되었다(대한민국공개특허: 10-2O13-O134040). 구제역에 관한 국외 특허기술동향은 국내 특허 내용과 유사하다. 구제역 바이러스 항원을 혈청형 별로 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 진단키트(미국등록특허: 07732145) 또는 본 과제에서 항원 대신 사용하고자 하는 펩타이드를 이용하여 항체를 생성하는 방법 (미국등록특허: 07604961) 구제역 실험에서 사용되는 바이러스의 전염성에 관한 확산위험을 방지하기 위해 핵산을 불활성화하거나 제거한 세포주의 개발(미국등록특허: 05866416) 등이 특허의 대부분을 차지하고 있으나, 본 발명에서와 같이 이뮤노(Immuno) PCR 방법을 이용하거나, 핵산을 적용한 현장 신속진단과 같은 특허내용은 없었다.

본 발명은 전염성이 강한 구제역이 의심 신고 후 확진까지 2~3일 소요되어 구제역의 확산 방지에 어려움이 있는 현재 문제점을 해결할 방안으로, 기존의 ELISA 기술에서 항원을 검출하는데 사용하는 항체-효소 접합체를 사용하지 않고, 그의 대체로서 항체-DNA 접합체를 사용하며, 이후 DNA를 검출하기 위해 PCR을 수행하는 신규의 하이브리드 면역 기반 분석법인 이뮤노(Immuno) PCR 방법 및 이에 적용하기 위한 신규의 구제역(Foot-and-Mouth Disease, FMD) 바이러스 검출용 키트를 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체에 서열번호 12 또는 서열번호 15의 핵산서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)가 결합된 올리고머 결합 항체를 포함하는 구제역 바이러스 검출을 위한 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno PCR)용 키트를 제공한다.

본 발명의 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno PCR)용 키트에 있어, 상기 키트는, 바람직하게 상기 서열번호 12 또는 서열번호 15의 핵산서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)가 결합된 항체와 서로 다른 항원 인식 부위를 갖는, 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체에 마그네틱 파티클(Magnetic particles)이 결합된 마그네틱 결합 항체를 더 포함하는 것이 좋다.

본 발명의 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno PCR)용 키트에 있어, 상기 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체는, 바람직하게 서열번호 2의 핵산서열, 서열번호 4의 핵산서열, 서열번호 6의 핵산서열 및 서열번호 8의 핵산서열로 이루어진 재조합 항원 중 선택되는 어느 하나를 항원으로 인식하여 제조된 항체인 것이 좋다.

본 발명의 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno PCR)용 키트에 있어, 상기 서열번호 12의 핵산 서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)는, 바람직하게 서열번호 13의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 14의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트에 의해 증폭되는 것이 좋다.

본 발명의 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno PCR)용 키트에 있어, 상기 서열번호 15의 핵산 서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)는, 바람직하게 서열번호 16의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 17의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트에 의해 증폭되는 것이 좋다.

한편, 본 발명은 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체에 서열번호 12 또는 서열번호 15의 핵산서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)가 결합된 올리고머 결합 항체를 항원인 구제역 바이러스와 항원-항체반응을 통해 결합시키는 단계 (a); 및 상기 단계 (a) 후, 서열번호 12 또는 서열번호 15의 핵산서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여, 상기 단계 (a)에서 구제역 바이러스와 결합된 화합물을 증폭하는 단계 (b);를 포함하는 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스의 검출방법을 제공한다.

본 발명의 구제역 바이러스의 검출방법은, 바람직하게 상기 단계 (a) 후, 단계 (b) 전에, 상기 서열번호 12 또는 서열번호 15의 핵산서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)가 결합된 올리고머 결합 항체와 서로 다른 항원 인식 부위를 갖는, 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체에 마그네틱 파티클(Magnetic particles)이 결합된 마그네틱 결합 항체를 항원-항체반응을 통해 항원인 구제역 바이러스에 결합시키는 것이 좋다.

본 발명의 구제역 바이러스의 검출방법에 있어, 상기 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체는, 바람직하게 서열번호 2의 핵산서열, 서열번호 4의 핵산서열, 서열번호 6의 핵산서열 및 서열번호 8의 핵산서열로 이루어진 재조합 항원 중 선택되는 어느 하나를 항원으로 인식하여 제조된 항체인 것이 좋다.

본 발명의 구제역 바이러스의 검출방법에 있어, 상기 단계 (b)의 프라이머는, 바람직하게 서열번호 13의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 14의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 (A) 또는 서열번호 16의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 17의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 (B)를 이용하는 것이 좋다.

본 발명의 구제역 바이러스의 검출방법에 있어, 상기 단계 (b)의 증폭은, 바람직하게 워킹볼륨 (working volume) 20㎕에 대해, 서열번호 13의 핵산서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 14의 핵산서열로 이루어진 프라이머가 혼합된 프라이머 혼합물(priner mix)이 1㎕만큼 첨가되며, 단계 (a)의 단계 (a)의 항원-항체반응을 통해 수득된 항원-항체 결합물이 5㎕만큼 첨가되어 사용되는 것이 좋다.

본 발명의 구제역 바이러스의 검출방법에 있어, 상기 단계 (b)의 증폭은, 바람직하게 워킹볼륨 (working volume) 20㎕에 대해, 서열번호 16의 핵산서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 17의 핵산서열로 이루어진 프라이머가 혼합된 프라이머 혼합물(priner mix)이 1㎕만큼 첨가되며, 단계 (a)의 항원-항체반응을 통해 수득된 항원-항체 결합물이 5㎕만큼 첨가되어 사용되는 것이 좋다.

본 발명의 구제역 바이러스의 검출방법에 있어, 상기 단계 (b)의 증폭은, 바람직하게 95℃, 30초를 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하고, 순차적으로 95℃에서 5초, 58℃에서 15초를 한 세트로 25 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하는 것이 좋다.

본 발명의 구제역(Foot-and-Mouth Disease, FMD) 바이러스 검출용 키트는 구제역 조기 진단을 위해, 진단 방법의 간이성과 정확한 판독을 동시에 만족할 수 있어, 사전적인 구제역 진단관리 및 구제역 바이러스의 감염 확산 방지를 통한 구제역 예방 및 확산의 방지에 중요한 방법으로서 사용될 수 있다. 또한, 맞춤형 조기진단 및 진단키트에 대한 요구가 증가함에 따라 본 발명의 구제역 바이러스 검출용 키트는 잠재적 가치가 매우 높고, 관련 시장의 확대에 긍정적 영향을 미칠 수 있다.

도 1은 본 발명 진단키트의 반응모식도이다.
도 2는 본 발명에서 선정한 한국형 구제역바이러스 VP1 항원의 핵산서열을 나타낸다.
도 3은 본 발명에서 선정한 한국형 구제역바이러스 VP1 A형 항원의 코돈 최적화된 서열을 나타낸다.
도 4는 본 발명에서 선정한 한국형 구제역바이러스 VP1 Asia1형 항원의 코돈 최적화된 서열을 나타낸다.
도 5는 본 발명에서 선정한 한국형 구제역바이러스 VP1 O1형 항원의 코돈 최적화된 서열을 나타낸다.
도 6은 본 발명에서 선정한 한국형 구제역바이러스 VP1 O2형 항원의 코돈 최적화된 서열을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 재조합 항원 단백질 His-VP1(A형, Asia1형, O1형, O2형)을 이용하여 제작한 다클론 항체(Polyclonal antibody)와 재조합 항원의 반응성을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 재조합 항원 단백질 His-VP1(A형, Asia1형, O1형, O2형)을 이용하여 제작한 단일클론 항체(Monoclonal antibody)와 재조합 항원의 반응성을 확인한 결과이다.
도 9는 초기 조건으로 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno-PCR)을 수행한 결과이다.
도 10은 개선 후 조건으로 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno-PCR)을 수행한 결과이다.

현재 우리나라에서 사용하고 있는 백신은 Merial사(France)의 항원을 분주한 형태이거나 Biogenesis Bago사(Argentina) 및 ARRIAH사(Russia)에서 제조된 O형과 A형 항원이 조합된 백신을 상시 백신으로 사용하고 있다. 구제역 바이러스는 유전적 변형이 매우 쉽게 일어나기 때문에 수많은 혈청형 및 혈청아형이 생성될 수 있고, 혈청형이 다른 백신은 변형된 바이러스에 대해서는 효능이 낮아 혈청형이 부합하는 예방제의 적용이 중요하다. 그러나 자주 변형되는 혈청형에 따른 백신의 제조 및 생산 보급 등에는 많은 시간이 소요되므로, 발생 당시 혈청형 맞춤형의 백신 접종은 거의 불가능한 실정이다. 그렇게 때문에 할 수 있는 최선은 발생 직후 최대한 빠르게 혈청형을 파악하여 백신을 투여하는 것, 발생 후 최대한 빠른 살처분과 가축 이동 통제로 피해를 최소한으로 줄이는 것에 있다.

이에, 본 발명은 구제역 예방 및 조기진단을 통하여 확산을 방지하기 위한 최적의 방법으로, 항원-항체 반응의 ELISA와 목적(target) DNA를 증폭하는 PCR 기술을 응용한 고감도 진단 방법을 제공하고자 하는 것이다. 이를 위하여, 본 발명은 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체에 서열번호 12 또는 서열번호 15의 핵산서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)가 결합된 올리고머 결합 항체를 포함하는 구제역 바이러스 검출을 위한 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno PCR)용 키트를 제공한다.

본 발명의 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno PCR)용 키트에 있어, 상기 키트는, 바람직하게 상기 서열번호 12 또는 서열번호 15의 핵산서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)가 결합된 항체와 서로 다른 항원 인식 부위를 갖는, 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체에 마그네틱 파티클(Magnetic particles)이 결합된 마그네틱 결합 항체를 더 포함하는 것이 좋다. 본 발명에서는 마그네틱 결합 항체를 사용함으로써, 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno PCR)에서 효소를 처리하여 올리고머를 떼어내는 단계를 별도로 거치지 않고도, 즉시 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 항원의 존재 여부를 확인할 수 있는 이점이 있다.

현재 시행되는 구제역 판정은 구제역의 원인체인 구제역 바이러스를 확진하기 위하여 일반적으로 바이러스의 게놈(RNA)을 추출하여 RT-PCR을 통해 특정부위를 증폭시킨 후, 핵산 염기서열분석(capillary sequencing)을 실시하게 된다. 이러한 염기서열분석은 Sanger법을 기초로 하고 있으며, ddNTP를 사용하여 반응한 후, 다시 정제과정을 거치고 별도의 장비에서 전기영동(electrophoresis)을 통해서 데이터를 얻는 과정이 필요하기 때문에 RT-PCR이 종료된 이후에도 통상 6 ~ 8시간 이상 소요되는 방법이라 과정이 복잡하고 구제역 판정시간이 과다하다. 또한, 획득한 염기서열을 GenBank와 같은 염기서열 데이터베이스에서 찾는 과정을 통해 병원체의 혈청형(유전형)을 파악하게 되는데, 검체에 복수의 병원체가 섞여 있을 경우 정확한 분석결과를 얻기 어려운 문제가 있다.

항원 또는 항체를 검사하기 위해 간단하게 사용할 수 있는 간이 신속 진단 방법은 시료가 측방유동(lateral-flow) 방식으로 전개되면서 항원-항체 반응에 따라 결합하여 발색되도록 고안된 제품으로, 현장에서 신속하게 감염 여부를 일차 확인하기 위한 용도로 주로 사용된다. 그러나 비특이적인 반응으로 인해 위음성, 위양성이 발생할 확률이 높고, 간편한 방법이지만 발생 초기 진단 과정에서 오류가 다량 발생한다.

ELISA 방법은 효소면역 측정법이라 하며, 마이크로플레이트 웰(microplate well) 내에서 항원-항체 반응 후, 항체에 부착한 효소의 반응(발광 또는 발색)을 측정하여 정성 및 정량 분석하는 방법이다. 여러 가지 발색시약을 사용하여 적용성을 확장시킬 수 있으나, 확진을 위한 검사 시간이 많이 소요되고, 혈청형 분석을 위해 동일한 검사를 반복하여 시행해야 하는 단점이 있다.

RT-PCR 및 염기서열 분석은 분자진단에서 주로 사용되는 방법이며, 대부분의 감염질환의 최종 확진에 사용되는 방법으로 바이러스의 핵산을 추출하고 특정한 올리고머를 사용하여 증폭한 후 전기영동을 통해 바이러스 감염 여부를 정성분석하거나, 추가적인 실험으로 염기서열을 분석하면 정확한 혈청형을 알 수 있다. 그러나 ELISA 반응과 같이 분석 시간이 많이 소요되고, 검사비용도 높은 편이다. 또한, 유사한 혈청형 간에 PCR 반응이 비특이적으로 발생하거나 염기서열 분석이 불가능할 수 있다.

현재 검사에서 사용되는 면역검사방법은 항원-항체 반응을 기반으로 하기 때문에 구제역 항체가 검출 가능한 농도로 생성되기 전에 진단하기 어렵고, 항원 진단의 경우도 검출 한계 이상 존재하지 않은 시료에서는 위음성으로 진단되기 쉽다.

그에 반해, 이뮤노(Immuno) PCR은 기존의 ELISA 기술에서 항원을 검출하는데 사용하는 항체-효소 접합체를 사용하지 않고, 대체로서 항체-DNA 접합체를 사용하며, 이후 DNA를 검출하기 위해 PCR을 사용하는 하이브리드 면역 기반 분석법이다. 이뮤노(Immuno) PCR을 사용한 구제역 바이러스 진단방법은 일반적으로 잠복기에 상관없이 조기 진단이 가능하고, 특히, 구제역 바이러스와 같은 RNA 바이러스의 경우, 일반적인 DNA보다 까다로운 RNA 추출과정과 cDNA 합성과정이 불필요하여, 편리한 이점이 있다. 또한, 항원-항체의 반응 특이성의 장점과 PCR 방법의 타겟(target) 증폭이라는 장점을 융합한 것으로 기존의 면역반응으로 검출할 수 없는 농도의 항원이 존재하는 시료에서 항원-항체 반응결합물을 얻은 후, PCR을 통해 핵산을 증폭하여 극미량(10 copies 이하)의 항원도 검출할 수 있다.

다만, 기존 이뮤노(Immuno) PCR은 플레이트(plate)에 항원(또는 항체)가 결합되어 있고, 플레이트에 붙은 항원(또는 항체)에 특이적으로 결합하는 항체(또는 항원)을 결합시키고, 플레이트에 결합되어있는 항원-항체 반응물을 절단해서 중합효소연쇄반응을 시행하여야 하는 불편함이 존재했다.

그러나 본 발명은 구체적으로 항체에 마그네틱 파티클이 결합한 마그네틱 결합 항체(구성 1)와 항체에 올리고머가 결합한 올리고머 결합 항체(구성 2)로 구분되는 두 가지 구성으로 이루어져 있어, 플레이트에 부착하지 않아도 검출이 가능하며, 별도로 반응물을 절단하는 단계를 수행하지 않아도 되기 때문에 시간적, 비용적 효율이 높은 특징이 있다 (도 1). 도 1은 본 발명 진단키트의 반응모식도이다.

한편, 본 발명의 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno PCR)용 키트에 있어, 상기 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체는, 바람직하게 서열번호 2의 핵산서열, 서열번호 4의 핵산서열, 서열번호 6의 핵산서열 및 서열번호 8의 핵산서열로 이루어진 재조합 항원 중 선택되는 어느 하나를 항원으로 인식하여 제조된 항체인 것이 좋다. 이때, 서열번호 2의 핵산서열은 재조합형 A형 항원 서열을 나타내고, 서열번호 4의 핵산서열은 재조합형 Asia1형 항원 서열을 나타내며, 서열번호 6의 핵산서열은 재조합형 O1형 항원의 서열을 나타내고, 서열번호 8의 핵산서열은 재조합형 O2형 항원 서열을 나타낸다. 이처럼, 본 발명에서는 구제역 바이러스의 다양한 혈청형의 과발현을 유도하기 위하여 대장균 코돈 최적화된 서열을 개발한 것이다. 본 발명에서 개발한 코돈 최적화된 서열은 대장균에서 대량생산이 가능하면서도, 항원결정기(epitope)의 변화를 일으키지 않아, 본 발명의 코돈 최적화된 항원에 대응하는 항체를 개발하였을 시, 야생형의 구제역 바이러스를 매우 높은 감도로 검출할 수 있었다.

이때, 본 발명의 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno PCR)용 키트에 있어, 상기 서열번호 12의 핵산 서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)는, 바람직하게 서열번호 13의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 14의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트에 의해 증폭되는 것이 좋고, 상기 서열번호 15의 핵산 서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)는, 바람직하게 서열번호 16의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 17의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트에 의해 증폭되는 것이 좋다. 올리고머는 해당 서열에 따라 추후 진행되는 real-time PCR 조건 최적화에 부합되지 않을 수 있어, 본 발명의 서열로 이루어진 올리고머의 사용이 중요하다.

본 발명에서 제조한 항체는 기존에 판매되는 진단 키트에 대한 반응성을 확인했을 때 유효하였으므로, 본 출원인은 항체 제작 시 사용된 재조합 항원 단백질인 His-VP1도 항원으로써 사용이 적합하다고 판단하였다. 본 발명의 키트는 마그네틱 결합 항체(구성 1)와 올리고머 결합 항체(구성 2)를 이용함으로써, PCR을 수행하기 위한 전처리 단계 (제한효소 처리)를 필요로 하지 않아 시간을 절약하고, PCR 증폭을 통해 미량의 항원 검출이 가능하다.

이러한 특성에 의해, 본 발명의 키트는 조기에 바이러스를 검출하고, 바이러스 감염을 예방하며, 바이러스의 확산 방지에 유용하기 이용될 수 있다. 바이러스의 혈청형을 정확하고 신속하게 구분할 수 있는 진단법은 적합한 백신을 만드는데 도움이 되며, 감염축을 빠르게 살처분하고 아직 비감염 지역은 적합한 백신을 투여하여 효과적인 질병 통제에 기여할 수 있기 때문이다.

한편, 본 발명은 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체에 서열번호 12 또는 서열번호 15의 핵산서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)가 결합된 올리고머 결합 항체를 항원인 구제역 바이러스와 항원-항체반응을 통해 결합시키는 단계 (a); 및 상기 단계 (a) 후, 서열번호 12 또는 서열번호 15의 핵산서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여, 상기 단계 (a)에서 구제역 바이러스와 결합된 화합물을 증폭하는 단계 (b);를 포함하는 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스의 검출방법을 제공한다. 이때, 올리고머는 해당 서열에 따라 real-time PCR 조건 최적화(단계 (b))에 부합되지 않을 수 있어, 본 발명의 서열로 이루어진 올리고머의 사용이 중요하다.

또한, 본 발명의 구제역 바이러스의 검출방법은, 바람직하게 상기 단계 (a) 후, 단계 (b) 전에, 상기 서열번호 12 또는 서열번호 15의 핵산서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)가 결합된 올리고머 결합 항체와 서로 다른 항원 인식 부위를 갖는, 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체에 마그네틱 파티클(Magnetic particles)이 결합된 마그네틱 결합 항체를 항원-항체반응을 통해 항원인 구제역 바이러스에 결합시키는 것이 좋다.

더욱 구체적으로 본 발명은 올리고머 결합 항체(구성 1)와 마그네틱 결합 항체(구성 2)로 구분되는 두 가지 구성으로 이루어져 있어, 플레이트에 부착하지 않아도 검출이 가능하며, 별도로 반응물을 절단하는 단계를 수행하지 않아도 되기 때문에 시간적, 비용적 효율이 높은 특징이 있다.

본 발명의 구제역 바이러스의 검출방법에 있어, 상기 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체는, 바람직하게 서열번호 2의 핵산서열, 서열번호 4의 핵산서열, 서열번호 6의 핵산서열 및 서열번호 8의 핵산서열로 이루어진 재조합 항원 중 선택되는 어느 하나를 항원으로 인식하여 제조된 항체인 것이 좋다. 이때, 서열번호 2의 핵산서열은 재조합형 A형 항원 서열을 나타내고, 서열번호 4의 핵산서열은 재조합형 Asia1형 항원 서열을 나타내며, 서열번호 6의 핵산서열은 재조합형 O1형 항원의 서열을 나타내고, 서열번호 8의 핵산서열은 재조합형 O2형 항원 서열을 나타낸다.

본 발명의 구제역 바이러스의 검출방법에 있어, 상기 단계 (b)의 프라이머는, 바람직하게 서열번호 13의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 14의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 (A) 또는 서열번호 16의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 17의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 (B)를 이용하는 것이 좋다.

본 발명의 구제역 바이러스의 검출방법에 있어, 상기 단계 (b)의 증폭은, 바람직하게 워킹볼륨 (working volume) 20㎕에 대해, 서열번호 13의 핵산서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 14의 핵산서열로 이루어진 프라이머가 혼합된 프라이머 혼합물(priner mix)이 1㎕만큼 첨가되며, 단계 (a)의 단계 (a)의 항원-항체반응을 통해 수득된 항원-항체 결합물이 5㎕만큼 첨가되어 사용되는 것이 좋다.

본 발명의 구제역 바이러스의 검출방법에 있어, 상기 단계 (b)의 증폭은, 바람직하게 워킹볼륨 (working volume) 20㎕에 대해, 서열번호 16의 핵산서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 17의 핵산서열로 이루어진 프라이머가 혼합된 프라이머 혼합물(priner mix)이 1㎕만큼 첨가되며, 단계 (a)의 항원-항체반응을 통해 수득된 항원-항체 결합물이 5㎕만큼 첨가되어 사용되는 것이 좋다. 본 발명의 구제역 바이러스 검출방법은 상기와 같이 프라이머 믹스의 농도 및 첨가량을 조절함으로써, 비특이적 반응을 해소할 수 있었다.

본 발명의 구제역 바이러스의 검출방법에 있어, 상기 단계 (b)의 증폭은, 바람직하게 95℃, 30초를 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하고, 순차적으로 95℃에서 5초, 58℃에서 15초를 한 세트로 25 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하는 것이 좋다. 본 발명의 구제역 바이러스 검출방법은 상기와 같은 방법에 의해 음성대조군 위양성 결과가 나타나는 문제를 해소할 수 있었으며, 항원이 존재하는 경우에는 증폭이 일어나고, 존재하지 않은 경우에는 증폭이 일어나지 않도록 조절할 수 있어, 구제역 바이러스 검출의 용이성과 정확한 판독을 동시에 만족할 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1: 본 발명의 구제역 바이러스 검출용 키트 제작]

(1) 재조합 FMDV (Foot-and-Mouth Disease Virus) VP1 서열 합성 및 항원 제작

일차적으로 한국형 구제역바이러스의 VP1 항원(A형, Asia1형, O1형, O2형)의 대표서열을 우선 선정하고자 하였다. 국내에서 등록한 genbank 서열 총 66개의 서열을 단백질 수준에서 염기서열 비교를 하여 혈청형 및 빈도에 따라 각각 A형 (GU441855.1), Asia1형 (JQ070321.1), O1형 (AHO12984.2), O2형 (JQ070321.1)으로 구분하여 선정하였다 (도 2). 도 2는 본 발명에서 선정한 한국형 구제역바이러스 VP1 항원의 핵산서열을 나타낸다.

상기에서 선정한 한국형 구제역 바이러스 VP1 단백질 유전자는 대장균에서 과발현을 유도하기 위하여 대장균(E. coli) 코돈(codon) 최적화 서열로 변환하여 합성하였다 (표 1, 도 3 내지 6). 도 3은 본 발명에서 선정한 한국형 구제역바이러스 VP1 A형 항원의 코돈 최적화된 서열을 나타내고, 도 4는 본 발명에서 선정한 한국형 구제역바이러스 VP1 Asia1형 항원의 코돈 최적화된 서열을 나타내며, 도 5는 본 발명에서 선정한 한국형 구제역바이러스 VP1 O1형 항원의 코돈 최적화된 서열을 나타내고, 도 6은 본 발명에서 선정한 한국형 구제역바이러스 VP1 O2형 항원의 코돈 최적화된 서열을 나타낸다.

코돈 최적화된 서열

항원	서열
A형 (GU441855.1)	단백질 서열 (서열번호 1)	MTTATGESAD PVTTTVENYG GETQVQRRHH TDVSFIMDRF VQIKPVSPTH VIDLMQTHQH GLVGAMLRAA TYYFSDLEIV VNHTGRLTWV PNGAPEAALD NTSNPTAYHK APFTRLALPY TAPHRVLATV YNGTSRYSAP ATRRGDLGSL AARLAAQLPA SFNYGAVRAT EIQELLVRMK RAELYCPRPL LAVEVTSQDR HKQKIIAPAK QLL
	핵산 서열 (서열번호 2)	atgaccaccg cgaccggtga atctgctgat ccggttacta ccactgttga aaactatggt ggtgaaaccc aggttcagcg tcgtcatcac actgatgttt ctttcatcat ggatcgtttc gttcagatta aaccagtttc accaactcac gtaattgatc tgatgcagac tcatcagcat ggtttagttg gcgcgatgtt acgtgctgct acttattatt tctctgattt agaaattgtt gttaatcata ccggtcgttt aacctgggtt ccgaacggcg caccggaagc ggcgctggat aacacttcta acccgaccgc gtaccacaaa gctccgttta ctcgtttagc tctgccatat actgcgccgc accgtgttct ggcaaccgtg tataacggta cctctcgtta ttctgcgccg gctactcgcc gcggcgatct gggtagcctg gcagcacgtc tggctgctca gctgccagct tcttttaact acggcgctgt tcgtgcaacc gaaatccagg aattattagt gcgtatgaaa cgtgcagaac tgtattgccc gcgtccgctg ctggctgttg aagtgacctc tcaggatcgt cacaaacaaa aaattatcgc accggctaaa cagctgctgt aa
Asia1형 (JQ070321.1)	단백질 서열 (서열번호 3)	MTTTTGESAD PVTTTVENYG GETQTARRLH TDVAFVLDRF VKLTQPKSTQ TLDLMQIPSH TLVGALLRSA TYYFSDLEVA LVHTGPVTWV PNGAPKTALD NHTNPTAYQK QPITRLALPY TAPHRVLSTV YNGKTTYGGE PPRRGDLAAL ARRVSNRLPT SFNYGAVKAD TITELLIRMK RAETYCPRPL LALDTTQDRR KQEIIAPEKQ TL
	핵산 서열 (서열번호 4)	atgaccacca ccaccggtga gtccgcggac ccggtcacca ccaccgttga aaactacggc ggtgaaaccc agaccgcccg tcgtctgcac accgacgttg cattcgttct ggaccgcttc gttaaactga cccagccaaa aagcacccag accctggacc tgatgcagat cccgagccac accctggttg gtgctctgct gcgttctgca acttattact tttctgattt agaagttgcg ctggttcaca ctggtccggt tacttgggtt cctaatggtg ctccgaaaac tgcactggat aatcacacca acccgaccgc ttaccaaaaa cagccgatta cccgtctggc actgccgtat actgcaccgc atcgtgttct gagcactgtt tataacggta aaaccactta tggtggtgaa ccgccgcgtc gtggtgatct ggcagcgtta gcacgtcgtg ttagcaaccg tctgccgacc tctttcaact atggtgcggt taaagctgat actattaccg aattactgat tcgtatgaaa cgtgctgaaa cctattgtcc gcgtccgctg ctggcactgg ataccaccca ggatcgtcgt aaacaggaaa tcatcgcgcc ggaaaaacag accctgtaa
O1형 (AHO12984.2)	단백질 서열 (서열번호 5)	MTTSTGESAD PVTATVENYG GETQVQRRQH TDVSFILDRF VKVTPKDQIN VLDLMQIPAH TLVGALLRTA TYYFADLEVA VKHEGNLTWV PNGAPEAALD NTTNPTAYHK APLTRLALPY TAPHRVLATV YNGNCKYGES PVTNLRGDLQ VLTQKAARTL PTSFNYGAIK ATRVTELLYR MKRAETYCPR PLLAIHPSEA RHKQKIVAPV KQLL
	핵산 서열 (서열번호 6)	atgaccacct ctaccggtga aagcgctgat ccggttaccg ctaccgttga aaactatggt ggtgaaaccc aggttcagcg tcgtcagcac accgatgttt ctttcattct ggatcgtttt gttaaagtta ccccgaaaga tcagattaac gttctggatt taatgcagat cccggctcat accctggttg gtgctctgct gcgtaccgcg acctactact tcgctgatct ggaagttgct gttaaacacg aaggtaactt aacctgggtt ccgaacggtg caccggaagc agcactggat aacaccacta acccgaccgc ttatcataaa gcgccgctga ctcgtctggc tctgccgtat accgcgccgc atcgtgtttt agctactgtt tataacggta attgtaaata cggtgaatct ccggttacca acctgcgtgg tgatctgcag gttctgactc agaaagcggc tcgtaccctg ccaacctctt ttaattatgg cgcgattaaa gcaacccgtg ttactgaact gctgtatcgt atgaaacgtg ctgaaaccta ttgcccgcgt ccgctgctgg ctatccaccc gtctgaagcg cgtcataaac agaaaatcgt tgctccggtt aaacagctgc tgtaa
O2형 (JQ070321.1)	단백질 서열 (서열번호 7)	MTTSTGESAD PVTATVENYG GETQVQRRHH TDVSFILDRF VKVTPKDSIN VLDLMQTPSH TLVGALLRTA TYYFADLEVA VKHEGDLTWV PNGAPEAALD NTTNPTAYHK APLTRLALPY TAPHRVLATV YNGNCKYAGG SLPNVRGDLQ VLAQKAARPL PTSFNYGAIK ATRVTELLYR MKRAETYCPR PLLAVHPSAA RHKQKIVAPV KQSL
	핵산 서열 (서열번호 8)	atgaccacca gcaccggtga atctgcggat ccggttaccg cgaccgttga aaactacggt ggtgaaaccc aggttcagcg tcgtcaccat accgatgtta gctttatcct ggatcgtttc gttaaagtta ctccaaaaga ttctattaac gttctggatc tgatgcagac tccgtctcat accttagttg gtgctctgct gcgtaccgca acttactatt tcgctgattt agaagttgca gttaaacatg aaggtgatct gacctgggtt ccgaacggtg ctccggaagc agctttagat aacaccacta acccgaccgc atatcacaaa gcaccgctga cccgtttagc tctgccgtat accgctccgc atcgtgttct ggctaccgtt tataacggca actgtaaata cgcaggtggt agcctgccga acgttcgtgg tgatctgcag gtgctggctc agaaagctgc tcgtccgctg ccgacctctt ttaactatgg cgctattaaa gctacccgtg ttaccgaact gctgtatcgt atgaaacgtg ctgaaaccta ttgcccgcgt ccgctgttag ctgttcatcc gtctgctgca cgtcataaac agaaaatcgt tgcgccggtt aaacagtctc tgtaa

VP1 단백질의 항체 제작을 위한 항원 단백질을 준비하기 위해, 상기에서 합성한 VP1 유전자(A형, Asia1형, O1형, O2형)를 대장균 발현 벡터에 클로닝하였다.

추후 단백질 정제를 위해 N-말단에 6×히스티딘(histidine)이 태깅(tagging)된 VP1(A형, Asia1형, O1형, O2형) 단백질로 발현시키고, 제한효소 처리와 전기영동, 시퀀싱(sequencing)을 통해 본 발명의 VP1 유전자와 주항원 부위를 포함하는 유전자가 포함된 벡터를 선별하였다. 선별된 벡터는 대장균 균주 BL21(DE3)에 형질전환하여 발현 및 정제를 거쳐 항원 단백질을 수득하였다.

(2) 항체 제작 및 확인

제작한 재조합 항원 단백질 His-VP1(A형, Asia1형, O1형, O2형)을 이용하여 다클론 항체(Polyclonal antibody)와 단일클론 항체(Monoclonal antibody)를 제작하였다.

완성된 항체는 ELISA를 통해 반응성 및 항체의 역가를 확인하였다 (도 7 내지 8). 도 7은 본 발명의 재조합 항원 단백질 His-VP1(A형, Asia1형, O1형, O2형)을 이용하여 제작한 다클론 항체(Polyclonal antibody)와 재조합 항원의 반응성을 확인한 결과이고, 도 8은 본 발명의 재조합 항원 단백질 His-VP1(A형, Asia1형, O1형, O2형)을 이용하여 제작한 단일클론 항체(Monoclonal antibody)와 재조합 항원의 반응성을 확인한 결과이다.

실험 결과, 모든 항체가 1:50000 이상의 높은 ELISA 역가를 보였기 때문에, 제조한 항체들을 사용하여 다음 단계인 다클론항체-마그네틱 파티클(Magnetic particles) 결합물, 단클론 항체-올리고머(oligomer) 결합물의 컨쥬게이트(conjugation) 실험을 진행하였다.

(3) 항체 컨쥬게이션 (Antibody conjugation)

아민 그룹(Amine group)으로 코팅된 마그네틱 파티클(Magnetic particles)을 준비한 후, 다클론 항체와 아민 반응성 동종이작용성 가교제(Amine reactive homobifunctional cross-linker)를 첨가하여 다클론 항체-마그네틱 파티클(Magnetic particles) 결합물을 제작하였다. 생성된 결합물의 반응성은 ELISA 방법을 이용하여 확인하였다.

구제역 바이러스와 관련 없는 올리고머 서열을 합성하였으며 (표 2), 올리고 컨쥬게이션 키트(oligo conjugation kit; Thunder-Link®PLUS Oligo Conjugation System (Expedeon))를 사용하여 단클론항체-올리고머(oligomer) 결합물을 제작하였다.

올리고머 서열

	서열
Oligo-1	서열번호 9		5'-AAAAA AAAAA AAAAA TTCAT CGCCC TTGGA CTACG ACTCT GACTG ATCGC TAAAT CGTG-3'(59mer)
	Primer	Forward 서열번호 10	5'-CATCGCCCTTGGACTACGA-3'
		Reverse 서열번호 11	5'-CACGATTTAGCGATCAGTCAGAG-3'
Oligo-2	서열번호 12		5'-AATGA TACGG CGACC ACCGA GATCT ACACT CTTTC CCTAC ACGAC GCTCT TCCGA TCTNN NNNNN CGACG AATCA GTCAA CAGAT AAGCG AGCAA GATCG GAAGA GCACA CGTCT GAACT CCAGT CAC-3'(128mer)
	Primer	Forward 서열번호 13	5'-TCCCTACACGACGCTCTTCC-3'
		Reverse 서열번호 14	5'-GCTCTTCCGATCTTGCTCGC-3'
Oligo-5	서열번호 15		5'-CTACC ATGGA CTGAC ACCGT TCATA GCCCA TCTTA CACTG TGGAA AAGCT TTTGG AGTCG TTTCC TAGTC GGATG TCAGT-3'(80mer)
	Primer	Forward 서열번호 16	5'-CATGGACTGACACCGTTCATA-3'
		Reverse 서열번호 17	5'-CATCCGACTAGGAAACGACTC-3'

* oligo-1 : Longyan Chen, Hongping Wei, Yongchao Guo, Zongqiang Cui, Zhiping Zhang and Xian-En Zhang. Gold nanoparticle enhanced immuno-PCR for ultrasensitive detection of Hantaan virus nucleocapsid protein. Journal of immunological methods. (2009). 346:64-70.

* oligo-2 : Jessie A. G. L. van Buggenum, Jan P. Gerlach, Selma Eising, Lise Schoonen, Roderick A. P. M. van Eijl, Sabine E. J. Tanis, Mark Hogeweg, Nina C. Hubner, Jan C. van Hest, Kimberly M. Bonger and Klaas W. Mulder. A covalent and cleavable antibody-DNA conjugation strategy for sensitive protein detection via immuo-PCR. Sci Rep. (2O16). Mar 7;6:22675.

* oligo-5 : Sreeja Gopal, Shobha Purushothama, Alvydas Mikulskis and Lauren Stevenson. Development of a plug and play ImmunoPCR technique for the analysis of biomolecules. Bioanalysis. (2O17). Sep;9(17):1293-1303.

[ 실시예 2: 이뮤노 중합효소연쇄반응 ( Immuno - PCR ) 조건의 최적화]

1. 실험 방법

1) 이뮤노 반응(Immune Reaction)

① 플레이트(plate)의 각 웰(well)에 희석한 다클론 항체-마그네틱 파티클(Magnetic particles) 결합물을 50㎕씩 분주한 후, 검사하고자 하는 시료(항원)을 50㎕씩 분주하였다.

② 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.

③ 96-웰 플레이트를 마크네틱 96-웰 세파레이터(magnetic 96-well separator) 위에 고정 시키고 1분간 방치하였다.

④ 마크네틱 96-웰 세파레이터(Magentic 96-well separator)에 96-웰 플레이트를 고정시킨 채 반응액을 털어버리고 1X 세척액 (1X Washing Buffer) 250㎕씩을 모든 웰에 분주한 후, 바로 털어버리는 과정을 5회 반복하였다.

⑤ 마지막 세척액을 제거하고 웰 내에 물기가 남지 않도록 플레이트를 거꾸로 들고 종이타월(paper towel) 위에 여러 번 쳐서 물기를 제거하였다. 이때, 물기를 털어버린 후 웰이 마르지 않도록 특히 주의하여야 한다.

※ 세척하는 모든 과정은 96-웰 플레이트를 마크네틱 96-웰 세파레이터(Magentic 96-well separator)에 고정시킨 채로 수행하였다.

⑥ 96-웰 플레이트와 마크네틱 96-웰 세파레이터(Magentic 96-well separator)를 분리한 후, 희석한 올리고 컨쥬게이트(Oligo Conjugate)를 100㎕씩 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.

⑦ 위의 ③~⑤과 동일한 방법으로 세척하였다.

⑧ 96-웰 플레이트와 마크네틱 96-웰 세파레이터(Magentic 96-well separator)를 분리한 후 각 웰에 디엔에이즈&알엔에이즈 프리 워터(DNase&RNase Free Water)를 100㎕씩 분주하였다.

2) 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-time PCR )

상기 1)-⑧과정에서 수득한 시료를 주형(Template)으로 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하였다.

1) 초기 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno-PCR) 결과

상기 이뮤노 반응의 세척 단계에서 tween20 0.05% in 1X PBS로 조성된 워싱버퍼(washing buffer)를 사용하여 수행하고, 하기 표 3의 조건으로 이뮤노 중합효소연쇄반응 혼합물을 제조하고, 하기 표 4의 조건으로 이뮤노 중합효소연쇄반응을 수행하였다.

초기 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno-PCR) 혼합물 제조 조건

	1rxn	no template control
TB Green Premix EX Taq	10.00㎕	10.00㎕
Primer Mix (10μM)	2.00㎕	2.00㎕
Template(Immunoassay) or oligomer	2.00㎕	-
DW	6.00㎕	8㎕
Total	20.00㎕	20.00㎕

초기 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno-PCR) 조건

Real-time PCR	95℃	30 sec	1 cycle
	95℃	5 sec	40 cycles
	65℃	20 sec

실험 결과, 음성대조군(negative control)의 위양성 문제가 발생하였다. 이는, 올리고 컨쥬게이트(oligo conjugate)가 제대로 세척되지 않았거나 비특이적인 결합으로 웰에 남아있게 되면서, 민감한 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)에서 증폭이 되어 양성 반응이 일어나는 것으로 판단되었다 (도 9). 도 9는 초기 조건으로 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno-PCR)을 수행한 결과이다.

2) 개선 후 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno-PCR) 결과

상기 결과에 따라, 비특이적인 결합을 줄이고자, 워싱 버퍼(washing buffer) 내 디털젼트(Detergent; Tween20)의 함량을 0.05%에서 0.5%로 늘렸다. 증폭을 위한 중합효소연쇄반응 혼합물(PCR Mixture) 조성은 주형 5㎕, SYBR green Premix Taq (2X) 10㎕, 프라이머 혼합물(Primer Mix) 1㎕, 총 용량은 20㎕로 최종 설정하였다. 실험 결과, 올리고머-1은 실시간 중합효소연쇄반응 조건의 최적화에 적당하지 않아 제외하였고, 조건 최적화에 가장 부합되는 올리고머-2(Oligo-2)를 실험에 이용하였다. 따라서, 상기 프라이머 혼합물(Primer Mix)은 서열번호 13의 프라이머와 서열번호 14의 프라이머가 혼합된 것을 이용하였다.

개선 후 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno-PCR) 혼합물 제조 조건

	1rxn	no template control
TB Green Premix EX Taq	10.00㎕	10.00㎕
Primer Mix (5μM)	1.00㎕	1.00㎕
Template(Immunoassay) or oligomer	5.00㎕	-
DW	4.00㎕	9㎕
Total	20.00㎕	20.00㎕

또한, 적절한 증폭단계의 온도를 실험을 통하여 65℃에서 58℃로 변경하였다. PCR에서 증폭단계의 시간이 길수록, 사이클(cycle) 수가 증가할수록 비특이적인 증폭이 일어나게 되므로, 하기 표 6과 같이, 증폭단계의 시간을 15초, 사이클 수를 25사이클로 줄여 실험을 진행하였다. 즉, 95℃, 30초를 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하고, 순차적으로 95℃에서 5초, 58℃에서 15초를 한 세트로 25 사이클(cycle)의 최종 조건으로 수행하였다.

개선 후 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno-PCR) 조건

Real-time PCR	95℃	30 sec	1 cycle
	95℃	5 sec	25 cycles
	58℃	15 sec

실험 결과, 워싱 버퍼(washing buffer) 내 디털젼트(Detergent; Tween20)의 함량을 늘려서 비특이적인 결합을 줄임으로써, 음성 대조군과 양성 반응이 Ct 값의 차이를 증가시켜, 음성 대조군의 위양성 결과가 확인되지 않았다. 또한, 프라이머 믹스의 농도 및 첨가량을 줄임으로써, 비특이적 반응을 해소할 수 있었다. 또한, 사이클 수를 25 사이클로 줄임으로써, 항원이 존재하는 경우에는 증폭이 일어나고, 존재하지 않은 경우에는 증폭이 일어나지 않도록 조절할 수 있었다 (도 10). 도 10은 개선 후 조건으로 이뮤노 중합효소연쇄반응(Immuno-PCR)을 수행한 결과이다.

<110> Dowgene <120> Kit of detection for Foot and mouth disease virus with immono-polymerase chain reaction and method thereof <130> YP-19-127 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> This comes from Foot and Mouth Disease Virus type A. <400> 1 Met Thr Thr Ala Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp 20 25 30 Val Ser Phe Ile Met Asp Arg Phe Val Gln Ile Lys Pro Val Ser Pro 35 40 45 Thr His Val Ile Asp Leu Met Gln Thr His Gln His Gly Leu Val Gly 50 55 60 Ala Met Leu Arg Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val 65 70 75 80 Val Asn His Thr Gly Arg Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu 85 90 95 Ala Ala Leu Asp Asn Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro 100 105 110 Phe Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala 115 120 125 Thr Val Tyr Asn Gly Thr Ser Arg Tyr Ser Ala Pro Ala Thr Arg Arg 130 135 140 Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala 145 150 155 160 Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Val Arg Ala Thr Glu Ile Gln Glu Leu Leu 165 170 175 Val Arg Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala 180 185 190 Val Glu Val Thr Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro 195 200 205 Ala Lys Gln Leu Leu 210 <210> 2 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This comes from Foot and Mouth Disease Virus type A. <400> 2 atgaccaccg cgaccggtga atctgctgat ccggttacta ccactgttga aaactatggt 60 ggtgaaaccc aggttcagcg tcgtcatcac actgatgttt ctttcatcat ggatcgtttc 120 gttcagatta aaccagtttc accaactcac gtaattgatc tgatgcagac tcatcagcat 180 ggtttagttg gcgcgatgtt acgtgctgct acttattatt tctctgattt agaaattgtt 240 gttaatcata ccggtcgttt aacctgggtt ccgaacggcg caccggaagc ggcgctggat 300 aacacttcta acccgaccgc gtaccacaaa gctccgttta ctcgtttagc tctgccatat 360 actgcgccgc accgtgttct ggcaaccgtg tataacggta cctctcgtta ttctgcgccg 420 gctactcgcc gcggcgatct gggtagcctg gcagcacgtc tggctgctca gctgccagct 480 tcttttaact acggcgctgt tcgtgcaacc gaaatccagg aattattagt gcgtatgaaa 540 cgtgcagaac tgtattgccc gcgtccgctg ctggctgttg aagtgacctc tcaggatcgt 600 cacaaacaaa aaattatcgc accggctaaa cagctgctgt aa 642 <210> 3 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> This comes from Foot and Mouth Disease Virus type Asial. <400> 3 Met Thr Thr Thr Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Thr Ala Arg Arg Leu His Thr Asp 20 25 30 Val Ala Phe Val Leu Asp Arg Phe Val Lys Leu Thr Gln Pro Lys Ser 35 40 45 Thr Gln Thr Leu Asp Leu Met Gln Ile Pro Ser His Thr Leu Val Gly 50 55 60 Ala Leu Leu Arg Ser Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Val Ala 65 70 75 80 Leu Val His Thr Gly Pro Val Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Lys 85 90 95 Thr Ala Leu Asp Asn His Thr Asn Pro Thr Ala Tyr Gln Lys Gln Pro 100 105 110 Ile Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ser 115 120 125 Thr Val Tyr Asn Gly Lys Thr Thr Tyr Gly Gly Glu Pro Pro Arg Arg 130 135 140 Gly Asp Leu Ala Ala Leu Ala Arg Arg Val Ser Asn Arg Leu Pro Thr 145 150 155 160 Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Val Lys Ala Asp Thr Ile Thr Glu Leu Leu 165 170 175 Ile Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala 180 185 190 Leu Asp Thr Thr Gln Asp Arg Arg Lys Gln Glu Ile Ile Ala Pro Glu 195 200 205 Lys Gln Thr Leu 210 <210> 4 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This comes from Foot and Mouth Disease Virus type Asial. <400> 4 atgaccacca ccaccggtga gtccgcggac ccggtcacca ccaccgttga aaactacggc 60 ggtgaaaccc agaccgcccg tcgtctgcac accgacgttg cattcgttct ggaccgcttc 120 gttaaactga cccagccaaa aagcacccag accctggacc tgatgcagat cccgagccac 180 accctggttg gtgctctgct gcgttctgca acttattact tttctgattt agaagttgcg 240 ctggttcaca ctggtccggt tacttgggtt cctaatggtg ctccgaaaac tgcactggat 300 aatcacacca acccgaccgc ttaccaaaaa cagccgatta cccgtctggc actgccgtat 360 actgcaccgc atcgtgttct gagcactgtt tataacggta aaaccactta tggtggtgaa 420 ccgccgcgtc gtggtgatct ggcagcgtta gcacgtcgtg ttagcaaccg tctgccgacc 480 tctttcaact atggtgcggt taaagctgat actattaccg aattactgat tcgtatgaaa 540 cgtgctgaaa cctattgtcc gcgtccgctg ctggcactgg ataccaccca ggatcgtcgt 600 aaacaggaaa tcatcgcgcc ggaaaaacag accctgtaa 639 <210> 5 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> This comes from Foot and Mouth Disease Virus type O1. <400> 5 Met Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp 20 25 30 Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln 35 40 45 Ile Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Ile Pro Ala His Thr Leu Val Gly 50 55 60 Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala 65 70 75 80 Val Lys His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu 85 90 95 Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro 100 105 110 Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala 115 120 125 Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn 130 135 140 Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Thr Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu 145 150 155 160 Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu 165 170 175 Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu 180 185 190 Leu Ala Ile His Pro Ser Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala 195 200 205 Pro Val Lys Gln Leu Leu 210 <210> 6 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This comes from Foot and Mouth Disease Virus type O1. <400> 6 atgaccacct ctaccggtga aagcgctgat ccggttaccg ctaccgttga aaactatggt 60 ggtgaaaccc aggttcagcg tcgtcagcac accgatgttt ctttcattct ggatcgtttt 120 gttaaagtta ccccgaaaga tcagattaac gttctggatt taatgcagat cccggctcat 180 accctggttg gtgctctgct gcgtaccgcg acctactact tcgctgatct ggaagttgct 240 gttaaacacg aaggtaactt aacctgggtt ccgaacggtg caccggaagc agcactggat 300 aacaccacta acccgaccgc ttatcataaa gcgccgctga ctcgtctggc tctgccgtat 360 accgcgccgc atcgtgtttt agctactgtt tataacggta attgtaaata cggtgaatct 420 ccggttacca acctgcgtgg tgatctgcag gttctgactc agaaagcggc tcgtaccctg 480 ccaacctctt ttaattatgg cgcgattaaa gcaacccgtg ttactgaact gctgtatcgt 540 atgaaacgtg ctgaaaccta ttgcccgcgt ccgctgctgg ctatccaccc gtctgaagcg 600 cgtcataaac agaaaatcgt tgctccggtt aaacagctgc tgtaa 645 <210> 7 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> This comes from Foot and Mouth Disease Virus type O2. <400> 7 Met Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp 20 25 30 Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Ser 35 40 45 Ile Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ser His Thr Leu Val Gly 50 55 60 Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala 65 70 75 80 Val Lys His Glu Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu 85 90 95 Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro 100 105 110 Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala 115 120 125 Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn 130 135 140 Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu 145 150 155 160 Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu 165 170 175 Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu 180 185 190 Leu Ala Val His Pro Ser Ala Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala 195 200 205 Pro Val Lys Gln Ser Leu 210 <210> 8 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This comes from Foot and Mouth Disease Virus type O2. <400> 8 atgaccacca gcaccggtga atctgcggat ccggttaccg cgaccgttga aaactacggt 60 ggtgaaaccc aggttcagcg tcgtcaccat accgatgtta gctttatcct ggatcgtttc 120 gttaaagtta ctccaaaaga ttctattaac gttctggatc tgatgcagac tccgtctcat 180 accttagttg gtgctctgct gcgtaccgca acttactatt tcgctgattt agaagttgca 240 gttaaacatg aaggtgatct gacctgggtt ccgaacggtg ctccggaagc agctttagat 300 aacaccacta acccgaccgc atatcacaaa gcaccgctga cccgtttagc tctgccgtat 360 accgctccgc atcgtgttct ggctaccgtt tataacggca actgtaaata cgcaggtggt 420 agcctgccga acgttcgtgg tgatctgcag gtgctggctc agaaagctgc tcgtccgctg 480 ccgacctctt ttaactatgg cgctattaaa gctacccgtg ttaccgaact gctgtatcgt 540 atgaaacgtg ctgaaaccta ttgcccgcgt ccgctgttag ctgttcatcc gtctgctgca 600 cgtcataaac agaaaatcgt tgcgccggtt aaacagtctc tgtaa 645 <210> 9 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This nucleic acid sequece is named "Oligo-1" refer to Journal of immunological methods. (2009). 346:64-70. <400> 9 aaaaaaaaaa aaaaattcat cgcccttgga ctacgactct gactgatcgc taaatcgtg 59 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This nucleic acid sequece is forward primer refer to Journal of immunological methods. (2009). 346:64-70. <400> 10 catcgccctt ggactacga 19 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This nucleic acid sequece is reverse primer refer to Journal of immunological methods. (2009). 346:64-70. <400> 11 cacgatttag cgatcagtca gag 23 <210> 12 <211> 128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This nucleic acid sequence is named "Oligo-2" refer to Sci Rep. (2O16). Mar 7;6:22675. <400> 12 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60 nnnnncgacg aatcagtcaa cagataagcg agcaagatcg gaagagcaca cgtctgaact 120 ccagtcac 128 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplification of Oligo-2. <400> 13 tccctacacg acgctcttcc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplification of Oligo-2. <400> 14 gctcttccga tcttgctcgc 20 <210> 15 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This nucleic acid sequence is named "Oligo-5" and refer to Bioanalysis. (2O17). Sep;9(17):1293-1303. <400> 15 ctaccatgga ctgacaccgt tcatagccca tcttacactg tggaaaagct tttggagtcg 60 tttcctagtc ggatgtcagt 80 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplification of Oligo-5. <400> 16 catggactga caccgttcat a 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplification of Oligo-5. <400> 17 catccgacta ggaaacgact c 21

Claims (12)

1. 삭제
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3. 삭제
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6. 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체에 서열번호 12의 핵산서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)가 결합된 올리고머 결합 항체를 항원인 구제역 바이러스와 항원-항체반응을 통해 결합시키고,
   상기 서열번호 12의 핵산서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)가 결합된 올리고머 결합 항체와 서로 다른 항원 인식 부위를 갖는, 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체에 마그네틱 파티클(Magnetic particles)이 결합된 마그네틱 결합 항체를 항원-항체반응을 통해 항원인 상기 구제역 바이러스에 결합시켜 구제역 바이러스와 결합된 항원-항체 결합물을 제조하는 단계 (a); 및
   상기 단계 (a) 후, 서열번호 12의 핵산서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여, 상기 단계 (a)에서 구제역 바이러스와 결합된 항원-항체 결합물을 증폭하는 단계 (b);를 포함하되,
   상기 단계 (a) 후, 상기 단계 (b) 전에, Tween20을 0.5%(v/v) 포함하는 워싱버퍼로 상기 구제역 바이러스와 결합된 항원-항체 결합물을 세척하는 과정을 추가로 포함하고,
   상기 단계 (b)의 증폭은,
   워킹볼륨 (working volume) 20㎕에 대해, 서열번호 13의 핵산서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 14의 핵산서열로 이루어진 프라이머가 혼합된 프라이머 혼합물(primer mix)이 1㎕만큼 첨가되며, 단계 (a)의 단계 (a)의 항원-항체반응을 통해 수득된 구제역 바이러스와 결합된 항원-항체 결합물이 5㎕만큼 첨가되어 사용되고,
   95℃, 30초를 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 증폭 반응을 진행하고, 순차적으로 95℃에서 5초, 58℃에서 15초를 한 세트로 25 사이클(cycle)의 조건으로 증폭 반응을 진행하는 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스의 검출방법.
   
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