CN113528613A - 一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法 - Google Patents

一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法 Download PDF

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CN113528613A CN202110805340.1A CN202110805340A CN113528613A CN 113528613 A CN113528613 A CN 113528613A CN 202110805340 A CN202110805340 A CN 202110805340A CN 113528613 A CN113528613 A CN 113528613A
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赵俊
许成虎
周师义
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Anhui Nature Breeding Pig Co ltd
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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，且公开了一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，包括如下实验步骤：S1、细菌基因组DNA提取；S2、引物与探针设计；S3、目的片段PCR扩增；S4、PCR产物回收及纯化；S5、标准质粒的构建；S6、重组质粒鉴定；S7、MIRA体系的建立；S8、MIRA引物筛选；S9、灵敏度试验；S10、特异性试验；S11、重复性试验；S12、临床样本检测；本实验应用多酶恒温快速扩增技术分别针对沙门氏菌中invA基因，筛选合适的引物和探针，本实验建立的MIRA诊断技术方便快捷，便于规模化畜禽养殖场的快速大规模检测诊断，此种方法具有较高的特异性、高度的灵敏性、实验所需仪器简单便捷并且反应所需时间短，适合临床的紧急样本的快速检测诊断。

Description

一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验 方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法。
背景技术
随着现代科技和经济水平的快速发展，人们对畜禽肉类的需求越来越大，因而促进了规模化的畜禽养殖场的诞生，在进行规模化畜禽养殖的时候，由于禽畜缺少必要的活动空间，容易导致病菌在禽畜之间进行传播，从而容易造成禽畜发生疾病的情况，沙门氏菌畜禽养殖生产中主要的致病性病原菌，近年来关于这种病原菌导致动物发病的报道较多，大多数与畜禽废弃物产生的环境污染有关。虽然对这些废弃物进行无害化处理，但病原菌感染导致畜禽发病的情况仍常发生。且近年来抗生素的使用，细菌耐药性增高，而传统的检测方法容易出现假阴性结果，所以建立快速、简便、特异、灵敏、低耗且适用的快速检测诊断致病微生物的方法十分有必要，传统的检测方法对禽畜进行检测的时候，由于禽畜的数量较多，传统的检测防止在对禽畜进行检测的时候，较为浪费时间，且不能快速的对禽畜进行检测，并且传统的检测方式，灵敏性较低，所需要的实验仪器较为复杂，不方便临床的紧急样本的快速检测诊断。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，解决了上述背景技术中所存在的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，包括如下实验步骤：
S1、细菌基因组DNA提取；
S2、引物与探针设计；
S3、目的片段PCR扩增；
S4、PCR产物回收及纯化；
S5、标准质粒的构建；
S6、重组质粒鉴定；
S7、MIRA(荧光型)体系的建立；
S8、MIRA(荧光型)引物筛选；
S9、灵敏度试验；
S10、特异性试验；
S11、重复性试验；
S12、临床样本检测。
优选的，所述步骤S1中，具体操作步骤如下：
(1)、取备用的菌液5mL，10000rpm离心1min，留取沉淀物；
(2)、在沉淀物中加入菌液：GA溶液＝25:1的GA溶液，使用振荡器悬浊溶液；
(3)、在管中加入GA溶液：proteunase K溶液＝10:1的proteunase K溶液，吹打混匀；
(4)、继续加入proteunase K溶液：GB溶液＝1：1的GB溶液，震荡混匀，在70℃水浴；
(5)、锅中静放10min，待试管中液体澄清，瞬间离心；
(6)、再加入GB溶液：无水乙醇＝1:11的无水乙醇，震荡混匀要充分；
(7)、将混匀的溶液(包括絮状物)加入到吸附柱-收集管CB3中，12000rpm离心30seC，丢掉收集管中液体；
(8)、在吸附柱-收集管CB3中加入无水乙醇：GD溶液＝11:25的GD溶液，12000rpm离心30seC，丢掉收集管中液体。
(9)、在吸附柱-收集管CB3中加入GD溶液：PW漂洗液＝5:6的PW漂洗液，12000rpm离心30seC，丢掉收集管中液体；
(10)、重复上一步；
(11)、吸附柱-收集管CB3空管离心2min，丢掉收集管中液体后，在室内的温度静置数分钟，用来蒸发吸附柱上的漂洗液；
(12)、取一干净离心管，将吸附柱放在干净离心管中，向吸附柱中间部分加入50-200μL的TE溶液，12000rpm离心2min，收集得到试管中的液体。
优选的，所述步骤S2中，在GenBank中检索禽沙门氏菌的invA基因(GenBank ID：1254419)通过MEGLIGN软件分析比对，确定各自的高度特异性保守片段区域，在PrimerPrimer5的辅助下，设计invA基因特异性MIRA引物和探针，MIRA(荧光型)引物名称及引物序列如下：
YinvAF1：CGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGCGTGC；
YinvAF2：ATTGTTACGCGATGGCGAGGGCCTGGACGA；
YinvAF3：ACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAGCC；
YinvAF4：CGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGCGT；
YinvAF5：CGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAGCC；
YinvAF6：TGTTACGCGATGGCGAGGGCCTGGACGA；
YinvAR1：CTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGATTA；
YinvAR2：TAATACCAAAGGACACGACTTCATCGGAATA；
YinvAR3：GACTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGAT；
YinvAR4：CTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGATT；
YinvAR5：CTGACTGCTACCTTGCTGATGGATTGT；
YinvAR6：ACTGACTGCTACCTTGCTGATGGATTGT。
优选的，所述步骤S3中，根据禽沙门氏菌invA基因片段大小为2065bp，在PrimerPrimer5的辅助下设计全长引物，进行PCR扩增，PCR全长引物名称及引物序列如下：
SinvA-AllF：ATGCGGGCGAAACTTCTGGGA；
SinvA-AllR：TTAAAATGTGTACTTAAGACCAGCA。
优选的，所述步骤S4中具体操作步骤如下：
(1)、用干净的手术刀将琼脂糖凝胶电泳的目的DNA片段切下，放入1.5mL离心管中，称重；
(2)、根据胶块的重量和浓度，按琼脂糖：Buffer B2＝1:(3-6)的比例加入BufferB2；
(3)、将离心管置于50℃水浴锅中5-10min，间或混匀，直至胶块完全溶化；
(4)、在吸附柱中心加入融化好的琼脂糖，8000Xg离心30seC。倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(5)、在吸附柱中心加入300μL Buffer B2，9000Xg离心30seC。倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(6)、在吸附柱中心加入500μL加了无水乙醇的Wash Solution,9000Xg离心30seC。倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(7)、重复步骤6一次；
(8)、在离心机中放入空吸附柱和收集管，9000Xg离心60seC。倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(9)、在吸附柱中心加入15-40μL Elution Buffer，在常温下静置1-2min，9000Xg离心60seC，收集离心下来的液体于-20℃的冰箱中保存。
优选的，所述步骤S5操作如下：
(1)、在微量离心管中配制pMD19-T Vector：Insert DNA：灭菌水溶液＝1:5:4，全量为5μL；
(2)、加入5μL(等量)的Solution I；
(3)、16℃反应30分钟。室温(25℃)也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低，5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低，长片段PCR产物(2kb以上)进行DNA克隆时，连接反应时间需延长至数小时；
(4)、使用保存在-80℃的擎科定制的大肠杆菌DH5α感受态细胞50μL，在冰盒中待DH5α融化，加入DH5α：连接液＝10；1的连接液并慢慢吹打，于冰上30min后开始下一步骤；
(5)、拿起冰上的DH5α于42℃的恒温水浴锅中热激1.5min，然后马上放回冰盒保持2min；
(6)、与900μL的的LB液体培养基混合，并放在180rpm 37℃的摇床培养箱中培养1h；
(7)、待LB液体培养基混浊后，取100μL后涂布在含有氨苄青霉素钠的LB固体培养基上，密封后再37℃的环境中过夜培养；
(8)、取单菌落在1.5mL的含有氨苄青霉素钠的LB液体培养基中180rpm37℃的摇床培养箱中培养3-4h。
优选的，所述步骤S6中，质粒DNA小量抽提如下具体步骤：
(1)、把含有重组质粒的目标菌株放在合适抗生素的培养基中接种培养，于37℃摇床培养12-16h；
(2)、对于高拷贝质粒，在室温下取1.5-5mL菌液，8000Xg离心2min，留取沉淀物；
(3)、菌体沉淀用250μL Buffer P1吹打混匀，悬浮沉淀物；
(4)、在离心管中加入250ul Buffer P2，缓慢颠倒混匀5-10次，在常温下等待2-4min；
(5)、再在离心管中加入350μL BufferP3,缓慢颠倒混匀5-10次；
(6)、离心机12000Xg离心5-10min，将上清小心加入吸附柱，9000×g离心30seC。倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(7)、向吸附柱中加入500ul Wash Solution，9000×g离心30seC。倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(8)、重复步骤7一次；
(9)、将空吸附柱和收集管放入离心机，9000×g离心60seC；
(10)、在吸附柱中心加入50-100μL Elution Buffer，在常温下静置1-2min，9000×g离心60seC，收集离心下来的液体于-20℃的冰箱中保存。
优选的，所述步骤7操作步骤:提前30分钟将试剂盒所需组分职出，室温融化，震荡混匀；
(1)、每个干粉反应管加入29.4μL A buffer(注意:A buffer需完全融化混匀，否则会对实验效果产生影响)；
(2)、每个反应管分别加入2μL上游引物、2μL下游引物和0.6μL探针(引物和探针浓度为10μM，对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中)；
(3)、向反应管中依次加入11.5μL ddH2O和2μL核酸模板(可根据核酸浓度调整加入的核酸模板体积，并相应调整加入的ddH2O体积，至模板与ddH2O总体积为13.5μL)；
(4)、最后向反应管中加入2.5μLB buffer并充分混合(请务必上下颠倒甩动反应管8-10次进行混匀；对于多个反应，建议将B buffer加至反应管的盖子内侧上下颠倒后混匀):
(5)、混匀后，将反应液甩(或快速离心)至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中。荧光检测程序设置为:恒温39℃；每30s采集一次FAM通道(信号采集通道的选择与荧光探针设计一致)荧光值；反应时间20mins。
优选的，所述步骤S8中，使用前期建立的MIRA(荧光型)体系，对MIRA(荧光型)体系的引物进行筛选试验，对比结果，MIRA(荧光型)反应组分及体系含量如下：
A buffer：29.4μL；
上游引物(10μM)：2μL；
下游引物(10μM)：2μL；
探针(10μM)：0.6μL；
ddH2O和模板：13.5μL；
B buffer：2.5μL。
优选的，所述步骤S9具体如下操作步骤：
测量出质粒浓度，根据拷贝数浓度copies/μL＝[6.02×1023×浓度(ng/μL)×10-9]/[DNA长度×660]公式，计算拷贝数浓度，以10倍稀释浓度分别稀释invA基因重组质粒pMD-19T-invA，稀释浓度为100copies/μL、101copies/μL、102copies/μL、103copies/μL、104copies/μL，并使用灭菌水ddH2O作为实验的阴性对照，反应体系使用本实验建立的体系进行灵敏度验证并与PCR检测技术进行比较；
所述步骤S10具体如下操作步骤：
使用所述步骤S2中提取的禽大肠杆菌和禽沙门氏菌提取的目的基因DNA保守片段构建的质粒作为阳性样本，志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、单增李斯特菌、霍乱弧菌的基因组DNA作为模板，ddH2O作为阴性对照，进行禽沙门氏菌和禽大肠杆菌的特异性实验；
所述步骤S11具体如下操作步骤：
以重组质粒pMD-19T-invA和pMD-19T-phoA的102copies/μL、103copies/μL和104copies/μL为模板，每个浓度设置3个重复，进行组内重复性试验，每个浓度的质粒分别进行3次独立的试验，进行组间的重复性试验，统计组内和组间重复性试验的变异系数，组内变异系数在0.502％～2.305％，组间变异系数在1.409％～1.922％，两者变异系数在3％以内，以评价该检测方法的重复性和稳定性；
所述步骤S12具体操作步骤如下：
对粪便样本用生理盐水稀释后离心沉淀，吸取上清液，根据DNA提取方法进行粪样中核酸的提取，用建立的MIRA技术检测体系，针对某大型禽养殖场的23份粪样进行检测，同时，使用普通PCR技术和qPCR技术检测方法平行检测，做对照实验，比较两者的检出率情况，评价MIRA技术的临床应用的实用价值。
(三)有益效果
本发明提供了一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，具备以下有益效果：
(1)、本发明中，本实验应用多酶恒温快速扩增技术(MIRA)分别针对沙门氏菌中invA基因，筛选合适的引物和探针，建立MIRA(荧光型)检测技术结果显示：禽沙门氏菌invA基因重组质粒的MIRA荧光扩增曲线，在39℃的的等温条件下，20min的反应时间即可检出禽沙门氏菌和禽大肠杆菌，并且特异性高，与没有交叉反应，可以检测出目的基因重组质粒的最低浓度是102copies/μL。
(2)、本实验建立的MIRA诊断技术方便快捷，便于规模化畜禽养殖场的快速大规模检测诊断，此种方法具有较高的特异性、高度的灵敏性、实验所需仪器简单便捷并且反应所需时间短，适合临床的紧急样本的快速检测诊断。
附图说明
图1为本发明invA保守基因的上游引物筛选；1-6:YinvAF1～YinvAF6实验结果示意图；
图2为本发明invA保守基因下游引物筛选；1-6:YinvAR1～YinvAR6实验结果示意图；
图3为本发明禽沙门氏菌MIRA(荧光型)灵敏度实验结果图；
图4为本发明禽沙门氏菌MIRA(荧光型)特异性实验结果图；
图5为本发明禽沙门氏菌的组内和组间重复性试验结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1-5所示，本发明提供一种技术方案：一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，包括如下实验步骤：
S1、细菌基因组DNA提取；
S2、引物与探针设计；
S3、目的片段PCR扩增；
S4、PCR产物回收及纯化；
S5、标准质粒的构建；
S6、重组质粒鉴定；
S7、MIRA(荧光型)体系的建立；
S8、MIRA(荧光型)引物筛选；
S9、灵敏度试验；
S10、特异性试验；
S11、重复性试验；
S12、临床样本检测。
进一步的，步骤S1中，具体操作步骤如下：
(1)、取备用的菌液5mL，10000rpm离心1min，留取沉淀物；
(2)、在沉淀物中加入菌液：GA溶液＝25:1的GA溶液，使用振荡器悬浊溶液；
(3)、在管中加入GA溶液：proteunase K溶液＝10:1的proteunase K溶液，吹打混匀；
(4)、继续加入proteunase K溶液：GB溶液＝1：1的GB溶液，震荡混匀，在70℃水浴；
(5)、锅中静放10min，待试管中液体澄清，瞬间离心；
(6)、再加入GB溶液：无水乙醇＝1:11的无水乙醇，震荡混匀要充分；
(7)、将混匀的溶液(包括絮状物)加入到吸附柱-收集管CB3中，12000rpm离心30seC，丢掉收集管中液体；
(8)、在吸附柱-收集管CB3中加入无水乙醇：GD溶液＝11:25的GD溶液，12000rpm离心30seC，丢掉收集管中液体。
(9)、在吸附柱-收集管CB3中加入GD溶液：PW漂洗液＝5:6的PW漂洗液，12000rpm离心30seC，丢掉收集管中液体；
(10)、重复上一步；
(11)、吸附柱-收集管CB3空管离心2min，丢掉收集管中液体后，在室内的温度静置数分钟，用来蒸发吸附柱上的漂洗液；
(12)、取一干净离心管，将吸附柱放在干净离心管中，向吸附柱中间部分加入50-200μL的TE溶液，12000rpm离心2min，收集得到试管中的液体。
进一步的，步骤S2中，在GenBank中检索禽沙门氏菌的invA基因(GenBank ID：1254419)通过MEGLIGN软件分析比对，确定各自的高度特异性保守片段区域，在PrimerPrimer5的辅助下，设计invA基因特异性MIRA引物和探针，MIRA(荧光型)引物名称及引物序列如下：
YinvAF1：CGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGCGTGC；
YinvAF2：ATTGTTACGCGATGGCGAGGGCCTGGACGA；
YinvAF3：ACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAGCC；
YinvAF4：CGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGCGT；
YinvAF5：CGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAGCC；
YinvAF6：TGTTACGCGATGGCGAGGGCCTGGACGA；
YinvAR1：CTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGATTA；
YinvAR2：TAATACCAAAGGACACGACTTCATCGGAATA；
YinvAR3：GACTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGAT；
YinvAR4：CTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGATT；
YinvAR5：CTGACTGCTACCTTGCTGATGGATTGT；
YinvAR6：ACTGACTGCTACCTTGCTGATGGATTGT。
进一步的，步骤S3中，根据禽沙门氏菌invA基因片段大小为2065bp，在PrimerPrimer5的辅助下设计全长引物，进行PCR扩增，PCR全长引物名称及引物序列如下：
SinvA-AllF：ATGCGGGCGAAACTTCTGGGA；
SinvA-AllR：TTAAAATGTGTACTTAAGACCAGCA。
进一步的，步骤S4中具体操作步骤如下：
(1)、用干净的手术刀将琼脂糖凝胶电泳的目的DNA片段切下，放入1.5mL离心管中，称重；
(2)、根据胶块的重量和浓度，按琼脂糖：Buffer B2＝1:(3-6)的比例加入BufferB2；
(3)、将离心管置于50℃水浴锅中5-10min，间或混匀，直至胶块完全溶化；
(4)、在吸附柱中心加入融化好的琼脂糖，8000×g离心30seC。倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(5)、在吸附柱中心加入300μL Buffer B2，9000×g离心30seC。倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(6)、在吸附柱中心加入500μL加了无水乙醇的Wash Solution,9000×g离心30seC。倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(7)、重复步骤6一次；
(8)、在离心机中放入空吸附柱和收集管，9000×g离心60seC。倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(9)、在吸附柱中心加入15-40μL Elution Buffer，在常温下静置1-2min，9000×g离心60seC，收集离心下来的液体于-20℃的冰箱中保存。
进一步的，步骤S5操作如下：
(1)、在微量离心管中配制pMD19-T Vector：Insert DNA：灭菌水溶液＝1:5:4，全量为5μL；
(2)、加入5μL(等量)的Solution I；
(3)、16℃反应30分钟。室温(25℃)也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低，5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低，长片段PCR产物(2kb以上)进行DNA克隆时，连接反应时间需延长至数小时；
(4)、使用保存在-80℃的擎科定制的大肠杆菌DH5α感受态细胞50μL，在冰盒中待DH5α融化，加入DH5α：连接液＝10；1的连接液并慢慢吹打，于冰上30min后开始下一步骤；
(5)、拿起冰上的DH5α于42℃的恒温水浴锅中热激1.5min，然后马上放回冰盒保持2min；
(6)、与900μL的的LB液体培养基混合，并放在180rpm 37℃的摇床培养箱中培养1h；
(7)、待LB液体培养基混浊后，取100μL后涂布在含有氨苄青霉素钠的LB固体培养基上，密封后再37℃的环境中过夜培养；
(8)、取单菌落在1.5mL的含有氨苄青霉素钠的LB液体培养基中180rpm37℃的摇床培养箱中培养3-4h。
进一步的，步骤S6中，质粒DNA小量抽提如下具体步骤：
(1)、把含有重组质粒的目标菌株放在合适抗生素的培养基中接种培养，于37℃摇床培养12-16h；
(2)、对于高拷贝质粒，在室温下取1.5-5mL菌液，8000×g离心2min，留取沉淀物；
(3)、菌体沉淀用250μL Buffer P1吹打混匀，悬浮沉淀物；
(4)、在离心管中加入250ul Buffer P2，缓慢颠倒混匀5-10次，在常温下等待2-4min；
(5)、再在离心管中加入350μL BufferP3,缓慢颠倒混匀5-10次；
(6)、离心机12000×g离心5-10min，将上清小心加入吸附柱，9000×g离心30seC。倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(7)、向吸附柱中加入500ul Wash Solution，9000×g离心30seC。倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(8)、重复步骤7一次；
(9)、将空吸附柱和收集管放入离心机，9000×g离心60seC；
(10)、在吸附柱中心加入50-100μL Elution Buffer，在常温下静置1-2min，9000×g离心60seC，收集离心下来的液体于-20℃的冰箱中保存。
进一步的，步骤7操作步骤:提前30分钟将试剂盒所需组分职出，室温融化，震荡混匀；
(1)、每个干粉反应管加入29.4μL A buffer(注意:A buffer需完全融化混匀，否则会对实验效果产生影响)；
(2)、每个反应管分别加入2μL上游引物、2μL下游引物和0.6μL探针(引物和探针浓度为10μM，对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中)；
(3)、向反应管中依次加入11.5μL ddH2O和2μL核酸模板(可根据核酸浓度调整加入的核酸模板体积，并相应调整加入的ddH2O体积，至模板与ddH2O总体积为13.5μL)；
(4)、最后向反应管中加入2.5μLB buffer并充分混合(请务必上下颠倒甩动反应管8-10次进行混匀；对于多个反应，建议将B buffer加至反应管的盖子内侧上下颠倒后混匀):
(5)、混匀后，将反应液甩(或快速离心)至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中。荧光检测程序设置为:恒温39℃；每30s采集一次FAM通道(信号采集通道的选择与荧光探针设计一致)荧光值；反应时间20mins。
进一步的，步骤S8中，使用前期建立的MIRA(荧光型)体系，对MIRA(荧光型)体系的引物进行筛选试验，对比结果，MIRA(荧光型)反应组分及体系含量如下：
A buffer：29.4μL；
上游引物(10μM)：2μL；
下游引物(10μM)：2μL；
探针(10μM)：0.6μL；
ddH2O和模板：13.5μL；
B buffer：2.5μL。
进一步的，步骤S9具体如下操作步骤：
测量出质粒浓度，根据拷贝数浓度(copies/μL)＝[6.02×1023×浓度(ng/μL)×10-9]/[DNA长度×660]公式，计算拷贝数浓度，以10倍稀释浓度分别稀释invA基因重组质粒(pMD-19T-invA)，稀释浓度为100copies/μL、101copies/μL、102copies/μL、103copies/μL、104copies/μL，并使用灭菌水(ddH2O)最为实验的阴性对照，反应体系使用本实验建立的体系进行灵敏度验证并与PCR检测技术进行比较；
步骤S10具体如下操作步骤：
使用步骤S2中提取的禽大肠杆菌和禽沙门氏菌提取的目的基因DNA保守片段构建的质粒作为阳性样本，志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、单增李斯特菌、霍乱弧菌的基因组DNA作为模板，ddH2O作为阴性对照，进行禽沙门氏菌和禽大肠杆菌的特异性实验；
步骤S11具体如下操作步骤：
以重组质粒pMD-19T-invA和pMD-19T-phoA的102copies/μL、103copies/μL和104copies/μL为模板，每个浓度设置3个重复，进行组内重复性试验，每个浓度的质粒分别进行3次独立的试验，进行组间的重复性试验。统计组内和组间重复性试验的变异系数(CV值)，以评价该检测方法的重复性和稳定性；
步骤S12具体操作步骤如下：
对粪便样本用生理盐水稀释后离心沉淀，吸取上清液，根据DNA提取方法进行粪样中核酸的提取，用建立的MIRA技术检测体系，针对某大型禽养殖场的23份粪样进行检测，同时，使用普通PCR技术和qPCR技术检测方法平行检测，做对照实验，比较两者的检出率情况，评价MIRA技术的临床应用的实用价值，对23份临床样本用本研究建立的MIRA技术检测禽沙门氏菌，MIRA技术荧光检测出11份阳性样本。MIRA技术荧光检测得阳性率为47.83％。
引物筛选实验结果：
按照MIRA(荧光型)试剂盒使用说明书，在39℃的水浴锅中进行进行MIRA(荧光型)实验体系，禽沙门氏菌和禽致病性大肠杆菌均使用Primer 5.0引物设计软件各设计禽沙门氏菌inv的上下游引物各6条，禽沙门氏菌的引物筛选是先筛选上游引物，再使下游引物与扩增效率比较高的上游引物相结合，以选择最佳引物。禽沙门氏菌的众多引物中，选出起峰早，峰值高的引物，这说明这组引物扩增效率更高。
MIRA(荧光型)特异性实验：
使用DNA质粒小量提取试剂盒提取禽沙门氏菌和禽致病性大肠杆菌基因组质粒，用MIRA(荧光型)检测技术和qPCR检测技术进行特异性实验，对实验结果进行比较，评估两种方法的特异性。
禽沙门氏菌的invA基因扩增成功，曲线起峰时间早，起峰高度高。其他的病原菌均为出现明显峰值。
禽沙门氏菌的重复性试验：
本研究建立的禽沙门氏菌的invA基因，基于MIRA(荧光型)的检测方法以102copies/μL、103copies/μL和104copies/μL为模板进行组内和组间的重复性试验。结果如图5所示，组内变异系数在0.502％～2.305％，组间变异系数在1.409％～1.922％。两者变异系数在3％以内，表明建立的MIRA检测方法有较高的稳定性和重复性。
本实施例中，MIRA依靠多种功能蛋白在常温下同时作用，实现核酸的快速扩增，是能够真正实现便携式的现场快速核酸检测技术。MIRA作用过程如图1-5，重组酶和引物结合成复合体，寻找目标序列区域上互补序列，在单链结合蛋白的帮助下进行同源重组，这时DNA聚合酶发生作用，重组酶和引物分离解体，DNA聚合酶和引物3′端结合，催化子链延伸，以上过程不断重复发生，实现核酸的快复制扩增。在结果呈现上不仅可以以琼脂糖凝胶的形式展现，还可以使用荧光分析和胶体金试纸条的形式展现。荧光法分析依赖核酸外切酶的作用，加入根据模板设计的特异的分子探针，使用荧光监测设备实现对目标片段扩增过程的实时监控。胶体金试纸条法根据核酸试纸条三明治夹心检验法设计探针、引物，即可使用胶体金试纸条进行检测，快速、简便，最适用于规模化畜禽场的现场检测。因为MIRA的反应温度为39℃，所以建议使用长度在30～35bp的引物，引物过长或过短会影响扩增速度和检测灵敏度(特殊情况下设计较长引物比较困难的序列，引物长度可缩短至25bp，但最好不少于25bp)；引物序列要求：碱基排布随机性高，GC含量在30％～70％之间；扩增片段避免形成二级结构而影响扩增；扩增片段长度建议在150～300bp，通常不超过500bp。MIRA的探针设计也有要求，在上下游引物中间，设计一段长度为46-52nt与目的片段互补的序列作为荧光探针；探针序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46～52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。探针共有四个修饰位点：距离5′端的30～35nt的中部位置标记一个dSpacer(四氢呋喃，THF)，作为核酸外切酶的识别位点(任何碱基，无特殊要求)；THF位点的上游的T碱基上标记一个荧光基团(如FAM)，下游在T碱基上标记一个淬灭基团(如BHQ1)，两个基团的间距为2～4nt；THF距离3′末端约15nt，并且3′末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或C3-spacer。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，其特征在于：包括如下实验步骤：
S1、细菌基因组DNA提取；
S2、引物与探针设计；
S3、目的片段PCR扩增；
S4、PCR产物回收及纯化；
S5、标准质粒的构建；
S6、重组质粒鉴定；
S7、MIRA体系的建立；
S8、MIRA引物筛选；
S9、灵敏度试验；
S10、特异性试验；
S11、重复性试验；
S12、临床样本检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，其特征在于：所述步骤S1中，具体操作步骤如下：
(1)、取备用的菌液5mL，10000rpm离心1min，留取沉淀物；
(2)、在沉淀物中加入菌液：GA溶液＝25:1的GA溶液，使用振荡器悬浊溶液；
(3)、在管中加入GA溶液：proteunase K溶液＝10:1的proteunase K溶液，吹打混匀；
(4)、继续加入proteunase K溶液：GB溶液＝1：1的GB溶液，震荡混匀，在70℃水浴；
(5)、锅中静放10min，待试管中液体澄清，瞬间离心；
(6)、再加入GB溶液：无水乙醇＝1:11的无水乙醇，震荡混匀要充分；
(7)、将混匀的溶液包括絮状物加入到吸附柱-收集管CB3中，12000rpm离心30seC，丢掉收集管中液体；
(8)、在吸附柱-收集管CB3中加入无水乙醇：GD溶液＝11:25的GD溶液，12000rpm离心30seC，丢掉收集管中液体。
(9)、在吸附柱-收集管CB3中加入GD溶液：PW漂洗液＝5:6的PW漂洗液，12000rpm离心30seC，丢掉收集管中液体；
(10)、重复上一步；
(11)、吸附柱-收集管CB3空管离心2min，丢掉收集管中液体后，在室内的温度静置数分钟，用来蒸发吸附柱上的漂洗液；
(12)、取一干净离心管，将吸附柱放在干净离心管中，向吸附柱中间部分加入50-200μL的TE溶液，12000rpm离心2min，收集得到试管中的液体。
3.根据权利要求1所述的一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，其特征在于：所述步骤S2中，在GenBank中检索禽沙门氏菌的invA基因通过MEGLIGN软件分析比对，确定各自的高度特异性保守片段区域，在Primer Primer5的辅助下，设计invA基因特异性MIRA引物和探针，MIRA引物名称及引物序列如下：
YinvAF1：CGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGCGTGC；
YinvAF2：ATTGTTACGCGATGGCGAGGGCCTGGACGA；
YinvAF3：ACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAGCC；
YinvAF4：CGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGCGT；
YinvAF5：CGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAGCC；
YinvAF6：TGTTACGCGATGGCGAGGGCCTGGACGA；
YinvAR1：CTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGATTA；
YinvAR2：TAATACCAAAGGACACGACTTCATCGGAATA；
YinvAR3：GACTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGAT；
YinvAR4：CTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGATT；
YinvAR5：CTGACTGCTACCTTGCTGATGGATTGT；
YinvAR6：ACTGACTGCTACCTTGCTGATGGATTGT。
4.根据权利要求1所述的一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，其特征在于：所述步骤S3中，根据禽沙门氏菌invA基因片段大小为2065bp，在PrimerPrimer5的辅助下设计全长引物，进行PCR扩增，PCR全长引物名称及引物序列如下：
SinvA-AllF：ATGCGGGCGAAACTTCTGGGA；
SinvA-AllR：TTAAAATGTGTACTTAAGACCAGCA。
5.根据权利要求1所述的一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，其特征在于：所述步骤S4中具体操作步骤如下：
(1)、用干净的手术刀将琼脂糖凝胶电泳的目的DNA片段切下，放入1.5mL离心管中，称重；
(2)、根据胶块的重量和浓度，按琼脂糖：Buffer B2＝1:3-6的比例加入Buffer B2；
(3)、将离心管置于50℃水浴锅中5-10min，间或混匀，直至胶块完全溶化；
(4)、在吸附柱中心加入融化好的琼脂糖，8000×g离心30seC，倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(5)、在吸附柱中心加入300μL Buffer B2，9000×g离心30seC，倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(6)、在吸附柱中心加入500μL加了无水乙醇的Wash Solution，9000×g离心30seC，倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(7)、重复步骤6一次；
(8)、在离心机中放入空吸附柱和收集管，9000×g离心60seC，倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(9)、在吸附柱中心加入15-40μL Elution Buffer，在常温下静置1-2min，9000×g离心60seC，收集离心下来的液体于-20℃的冰箱中保存。
6.根据权利要求1所述的一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，其特征在于：所述步骤S5操作如下：
(1)、在微量离心管中配制pMD19-T Vector：Insert DNA：灭菌水溶液＝1:5:4，全量为5μL；
(2)、加入5μL的Solution I；
(3)、16℃反应30分钟，室温也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低，5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低，长片段PCR产物2kb以上进行DNA克隆时，连接反应时间需延长至数小时；
(4)、使用保存在-80℃的擎科定制的大肠杆菌DH5α感受态细胞50μL，在冰盒中待DH5α融化，加入DH5α：连接液＝10：1的连接液并慢慢吹打，于冰上30min后开始下一步骤；
(5)、拿起冰上的DH5α于42℃的恒温水浴锅中热激1.5min，然后马上放回冰盒保持2min；
(6)、与900μL的的LB液体培养基混合，并放在180rpm 37℃的摇床培养箱中培养1h；
(7)、待LB液体培养基混浊后，取100μL后涂布在含有氨苄青霉素钠的LB固体培养基上，密封后再37℃的环境中过夜培养；
(8)、取单菌落在1.5mL的含有氨苄青霉素钠的LB液体培养基中180rpm37℃的摇床培养箱中培养3-4h。
7.根据权利要求1所述的一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，其特征在于：所述步骤S6中，质粒DNA小量抽提如下具体步骤：
(1)、把含有重组质粒的目标菌株放在合适抗生素的培养基中接种培养，于37℃摇床培养12-16h；
(2)、对于高拷贝质粒，在室温下取1.5-5mL菌液，8000×g离心2min，留取沉淀物；
(3)、菌体沉淀用250μL Buffer P1吹打混匀，悬浮沉淀物；
(4)、在离心管中加入250ul Buffer P2，缓慢颠倒混匀5-10次，在常温下等待2-4min；
(5)、再在离心管中加入350μL Buffer P3，缓慢颠倒混匀5-10次；
(6)、离心机12000×g离心5-10min，将上清小心加入吸附柱，9000×g离心30seC，倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(7)、向吸附柱中加入500ulWash Solution，9000×g离心30seC，倒掉废液，将吸附柱放回收集管；
(8)、重复步骤7一次；
(9)、将空吸附柱和收集管放入离心机，9000×g离心60seC；
(10)、在吸附柱中心加入50-100μL Elution Buffer，在常温下静置1-2min，9000×g离心60seC，收集离心下来的液体于-20℃的冰箱中保存。
8.根据权利要求1所述的一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，其特征在于：所述步骤7操作步骤:提前30分钟将试剂盒所需组分职出，室温融化，震荡混匀；
(1)、每个干粉反应管加入29.4μL A buffer；
(2)、每个反应管分别加入2μL上游引物、2μL下游引物和0.6μL探针，引物和探针浓度为10μM，对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中；
(3)、向反应管中依次加入11.5μLddH2O和2μL核酸模板，可根据核酸浓度调整加入的核酸模板体积，并相应调整加入的ddH2O体积，至模板与ddH2O总体积为13.5μL；
(4)、最后向反应管中加入2.5μLB buffer并充分混合，上下颠倒甩动反应管8-10次进行混匀；对于多个反应，建议将B buffer加至反应管的盖子内侧上下颠倒后混匀；
(5)、混匀后，将反应液甩或快速离心至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中，荧光检测程序设置为：恒温39℃；每30seC采集一次FAM通道荧光值；反应时间20min。
9.根据权利要求1所述的一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，其特征在于：所述步骤S8中，使用前期建立的MIRA体系，对MIRA体系的引物进行筛选试验，对比结果，MIRA反应组分及体系含量如下：
A buffer：29.4μL；
上游引物10μM：2μL；
下游引物10μM：2μL；
探针10μM：0.6μL；
ddH2O和模板：13.5μL；
B buffer：2.5μL。
10.根据权利要求1所述的一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法，其特征在于：所述步骤S9具体如下操作步骤：
测量出质粒浓度，根据拷贝数浓度copies/μL＝[6.02×1023×浓度(ng/μL)×10-9]/[DNA长度×660]公式，计算拷贝数浓度，以10倍稀释浓度分别稀释invA基因重组质粒pMD-19T-invA，稀释浓度为100copies/μL、101copies/μL、102copies/μL、103copies/μL、104copies/μL，并使用灭菌水ddH2O作为实验的阴性对照，反应体系使用本实验建立的体系进行灵敏度验证并与PCR检测技术进行比较；
所述步骤S10具体如下操作步骤：
使用所述步骤S2中提取的禽大肠杆菌和禽沙门氏菌提取的目的基因DNA保守片段构建的质粒作为阳性样本，志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、单增李斯特菌、霍乱弧菌的基因组DNA作为模板，ddH2O作为阴性对照，进行禽沙门氏菌和禽大肠杆菌的特异性实验；
所述步骤S11具体如下操作步骤：
以重组质粒pMD-19T-invA和pMD-19T-phoA的102copies/μL、103copies/μL和104copies/μL为模板，每个浓度设置3个重复，进行组内重复性试验，每个浓度的质粒分别进行3次独立的试验，进行组间的重复性试验，统计组内和组间重复性试验的变异系数，组内变异系数在0.502％～2.305％，组间变异系数在1.409％～1.922％，两者变异系数在3％以内，以评价该检测方法的重复性和稳定性；
所述步骤S12具体操作步骤如下：
对粪便样本用生理盐水稀释后离心沉淀，吸取上清液，根据DNA提取方法进行粪样中核酸的提取，用建立的MIRA技术检测体系，针对某大型禽养殖场的23份粪样进行检测，同时，使用普通PCR技术和qPCR技术检测方法平行检测，做对照实验，比较两者的检出率情况，评价MIRA技术的临床应用的实用价值。
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