CN105385691A

CN105385691A - 用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体及检测试剂盒

Info

Publication number: CN105385691A
Application number: CN201511000281.1A
Authority: CN
Inventors: 王柯敏; 袁宝银; 郭秋平; 羊小海; 何晓晓; 蒋晓春
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2015-12-28
Filing date: 2015-12-28
Publication date: 2016-03-09
Anticipated expiration: 2035-12-28
Also published as: CN105385691B

Abstract

本发明公开了一种用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体及检测试剂盒，核酸适配体为核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7中的一种；核酸适配体J1的核苷酸序列为SEQ？ID？NO.1所示的DNA片段；核酸适配体J3的核苷酸序列为SEQ？ID？NO.2所示的DNA片段；核酸适配体J4的核苷酸序列为SEQ？ID？NO.3所示的DNA片段；核酸适配体J7的核苷酸序列为SEQ？ID？NO.4所示的DNA片段。该核酸适配体免疫原性小、分子量小、易于保存和标记；可作为检测试剂盒检测人高转移结肠癌细胞株LoVo。

Description

用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体及其筛选方法和应用。

背景技术

肿瘤转移是癌症致死最重要的原因，而在结肠癌病例中有大于50%的患者发生了肿瘤转移，这些发生了肿瘤转移的患者预后极差，五年生存率只有6%左右。因此，发展特异性的方法检测和治疗结肠癌转移肿瘤对提高这些患者的生存率至关重要。然而，由于缺乏相应的技术获得针对结肠癌肿瘤转移的高特异性和高灵敏度的分子探针，目前对高转移结肠癌的诊断和治疗仍面临巨大挑战。近年来，随着影像学和手术技术的进步，虽然使高转移结肠癌的诊断和治疗取得一定进展，但与高转移结肠癌发生有关的分子机制尚不清楚，因此筛选出它的核酸适配体对于临床检测、肿瘤标志物的鉴定、肿瘤发病机理的发现都有很重要的意义。

核酸适配体（aptamer）是通过指数富集配体的系统进化技术（SELEX）筛选得到的,能特异结合靶标的单链寡聚核苷酸（ssDNA或ssRNA）。核酸适配体与抗体功能类似，但是与抗体相比具有更多的优势，例如具有更好的亲和力与特异性；免疫原性小；易化学合成且成本低；可进行基团标记；稳定性好，易于保存等优点。此外，核酸适配体的靶标具有普适性，不仅包括离子、氨基酸、核酸、蛋白质等，而且也可以是完整的病毒颗粒及细胞等复合物靶标。因此，核酸适配体具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有比蛋白抗体更好的亲和力与特异性、免疫原性小、能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记的可用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体及其衍生物，还相应提供前述核酸适配体的筛选方法和在制备用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的检测试剂盒中的应用，提高核酸适配体的筛选效率。本发明还提供了一种包括前述核酸适配体的检测试剂盒，检测方便、迅速。

为解决上述技术问题，提供了一种用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体，所述核酸适配体为核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7中的一种；所述核酸适配体J1的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示的DNA片段；所述核酸适配体J3的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示的DNA片段；所述核酸适配体J4的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示的DNA片段；所述核酸适配体J7的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示的DNA片段。

上述的核酸适配体，优选的，所述核酸适配体还包括在核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化的核酸适配体。

上述的核酸适配体，优选的，所述氨基化具体为在所述核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7核苷酸序列的5’端标记氨基基团-NH₂。

上述的核酸适配体，优选的，所述巯基化具体为在所述核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7核苷酸序列的5’端标记巯基基团-SH。

上述的核酸适配体，优选的，所述核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4和核酸适配体J7的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。

上述的核酸适配体，优选的，所述荧光物质为FAM荧光基团或Cy5荧光基团；所述纳米发光材料为量子点或上转换纳米颗粒；所述酶标记为辣根过氧化物酶或蔗糖酶。

上述的核酸适配体，优选的，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种：

（1）与所述核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60%以上；

（2）与所述核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列；

（3）所述核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。

上述的核酸适配体，优选的，还包括所述核酸适配体的衍生物，所述核酸适配体衍生物为由所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架。

上述的核酸适配体，优选的，还包括所述核酸适配体的衍生物，所述核酸适配体衍生物为由所述核酸适配体改造而成的相应肽核酸。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了上述核酸适配体在制备用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的检测试剂盒中的应用。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的检测试剂盒，包括上述的核酸适配体。

上述的核酸适配体，优选的，还包括结合缓冲液和洗涤缓冲液。优选的，所述结合缓冲液为bindingbuffer。所述洗涤缓冲液为PBS。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了上述检测试剂盒在检测人高转移结肠癌细胞株LoVo中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

（1）本发明提供了一种用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体，通过Cell-SELEX筛选得到的核酸适配体与蛋白抗体相比具有更好的亲和力与特异性；免疫原性小；能够体外化学合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且化学性质稳定，易于保存；便于标记等特点。

（2）本发明提供了一种用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体的检测试剂盒，由于核酸适配体的合成成本较抗体制备成本低，且周期短，重现性好，采用本发明的核酸适配体进行人高转移结肠癌LoVo细胞的检测时，操作更为简单、迅速。本发明的可识别人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体均可高亲和力的识别人高转移结肠癌细胞株LoVo，且结合能力强，解离常数均在纳摩尔范围以内。利用本发明的核酸适配体对其结合的靶分子进行钓取，可能得到其肿瘤标志物，这对于结肠癌的临床研究具有重要意义。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为本发明实施例1中利用Mfold软件模拟的核酸适配体FAM-J1的二级结构示意图。

图2为本发明实施例1中利用Mfold软件模拟的核酸适配体FAM-J3的二级结构示意图。

图3为本发明实施例1中利用Mfold软件模拟的核酸适配体FAM-J4的二级结构示意图。

图4为本发明实施例1中利用Mfold软件模拟的核酸适配体FAM-J7的二级结构示意图。

图5为本发明实施例1中流式细胞仪检测四条核酸适配体对人高转移结肠癌细胞株LoVo的结合能力的检测结果。

图6为本发明实施例1中流式细胞仪检测四条核酸适配体对人非转移结肠癌细胞株SW480的结合能力的检测结果。

图7为本发明实施例1中激光共聚焦扫描显微镜检测四条核酸适配体对人高转移结肠癌细胞株LoVo的结合能力及特异性的检测结果。

图8为本发明实施例1中流式细胞仪测定核酸适配体FAM-J1结合LoVo细胞的解离常数绘制曲线。

图9为本发明实施例1中流式细胞仪测定核酸适配体FAM-J3结合LoVo细胞的解离常数绘制曲线。

图10为本发明实施例1中流式细胞仪测定核酸适配体FAM-J4结合LoVo细胞的解离常数绘制曲线。

图11为本发明实施例1中流式细胞仪测定核酸适配体FAM-J7结合LoVo细胞的解离常数绘制曲线。

图12为激光共聚焦扫描显微镜检测核酸适配体FAM-J3对靶细胞株LoVo、人高入侵性结肠癌细胞株SW620、人高入侵性卵巢癌细胞株HeLa、人高入侵性前列腺癌细胞株PC-3M-1E8、人非高入侵性肝癌细胞株HepG2和人非高入侵性正常肝细胞株L02的结合能力及特异性的检测结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

实施例1

一种可用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体，采用以下方法筛选得到：

1、合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：

随机文库RL40：5’-CCTGAACCTGATGCCAACCT（N40）AGTAGCGAGCGTGTAGTGTG-3’；

5’引物：5’-FAM-CCTGAACCTGATGCCAACCT-3’；

3’引物：5’-Biotin-CACACTACACGCTCGCTACT-3’。

2、Cell-SELEX筛选获得LoVo特异性的核酸适配体文库（阳性筛选）：

2.1、细胞预处理：在1640培养基中加10%小牛血清培养人高转移结肠癌细胞株LoVo细胞至铺满瓶底90%，去除培养基后用PBS缓冲液洗涤，用无酶消化液（购自北京普利莱基因技术有限公司）将细胞处理成悬浮细胞转移至离心管中，离心洗涤得到LoVo细胞。

后与bindingbuffer（含浓度为50nM的随机序列）在冰上孵育10min，弃上清。

2.2、孵育：用100μLbindingbuffer溶解5nmol上述的随机文库RL40，95℃恒温振荡5min，迅速放入冰中；在随机文库RL40中补充bindingbuffer至终体积为lmL得到混合液。将上述混合液与步骤2.1中已经处理好的LoVo细胞在冰上孵育30min。

2.3、解离：孵育完成后离心洗涤去上清，然后用lmL无菌水重悬细胞，置沸水浴（100℃）加热10min，在10000rpm转速下离心5min，取离心后的上清液，即为筛选所得LoVo特异性核酸适配体文库。

3、预扩增：取所有所得的LoVo特异性核酸适配体文库，以步骤1中的5’引物、3’引物为引物，进行常规PCR扩增，扩增条件为95℃预变性2min，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，经10循环轮数，72℃反应3min得到预扩增产物。

4、PCR扩增文库：选择10v/v%步骤3中得到的预扩增产物，按照步骤3的条件继续PCR扩增12轮得到扩增产物。

5、制备DNA单链文库：

5.1、将100μL链霉亲和素修饰的琼脂糖微球在5000rpm转速下离心去上清，沉淀用1000μLPBS洗涤，离心去上清；重复洗涤一次。

5.2、将步骤4中PCR扩增所得的扩增产物与步骤5.1中洗涤后的琼脂糖微球在常温下孵育30min，通过扩增产物双链DNA上的生物素与琼脂糖微球上的链霉亲和素的亲和作用将双链DNA充分捕获到琼脂糖微球表面，得到携带有双链DNA的琼脂糖微球。

5.3、将步骤5.2中制备得到的携带有双链DNA的琼脂糖微球在5000rpm转速下离心去上清，沉淀用PBS离心洗涤两次；然后加入500μL浓度为200mM的NaOH溶液至携带有双链DNA的琼脂糖微球中，常温下进行碱变性反应10min，使琼脂糖微球中的双链DNA变性。将碱变性反应得到的反应液在5000rpm离心2min，收集上清。

5.4、将除盐柱用15mL无菌水洗涤后，加入步骤5.3中经过碱变性后得到的上清液，自然滴完。然后加入1mL无菌水，收集滴下的溶液，此即为DNA单链文库。

6、重复筛选：将步骤5得到的DNA单链文库替代步骤2.2中的随机文库，重复上述步骤2～4所示的阳性筛选、PCR扩增及制取单链DNA文库过程。

7、阴性筛选：经过步骤6的重复筛选3轮后，以人非转移结肠癌细胞株SW480为对照，将经过步骤6的三轮筛选得到的DNA单链文库进行阴性筛选，阴性筛选的具体操作为：

培养人非转移结肠癌细胞株SW480至铺满瓶底90%，去除培基后用PBS缓冲液洗涤，用无酶消化液（购自北京普利莱基因技术有限公司）将细胞处理成悬浮细胞转移至离心管中，离心洗涤后得到SW480细胞，后与bindingbuffer(含50nM随机序列)在冰上孵育后，离心弃上清；再将步骤6筛选得到的DNA单链文库溶解，恒温振荡后与经前述处理后的人非转移结肠癌细胞SW480在冰上孵育，孵育完成后收集上清液。

8、多轮筛选：将步骤7中所收集的上清液替代步骤6中的DNA单链文库，继续重复进行上述步骤6～7的操作过程，在第一轮筛选以后，用于细胞孵育筛选的文库量约为200pmol，从第三轮筛选开始，阳性筛选细胞预处理的孵育溶液中需加入胎牛血清，随着筛选轮数的增加，添加量从5%增加至20%；重复筛选过程中用流式细胞术监测所得DNA单链文库对LoVo细胞识别能力的增强情况，直至14轮筛选后DNA单链文库对LoVo细胞的识别能力满足要求，将所得产物经克隆测序分析，对测序结果整理分析后，最终可得到富集度较高的四条序列，这四条序列分别为：

核酸适配体FAM-J1（即在核酸适配体J1的5’端标记FAM）为SEQIDNO.1所示的DNA片段，具体为：

FAM-J1：5’-CCTGAACCTGATGCCAACCTTGCCGATGGGTGGGTGCTCGTGGGAA

ACCGAGGGGGACTGAGTAGCGAGCGTGTAGTGTG-3’。

核酸适配体FAM-J3（即在核酸适配体J3的5’端标记FAM）为SEQIDNO.2所示的DNA片段，具体为：

FAM-J3：5’-CCTGAACCTGATGCCAACCTGCCAGCGGGCAGTGCGCGAGTGGGAA

ACCGAGGGGGACTGAGTAGCGAGCGTGTAGTGTG-3’。

核酸适配体FAM-J4（即在核酸适配体J4的5’端标记FAM）为SEQIDNO.3所示的DNA片段，具体为：

FAM-J4：5’-CCTGAACCTGATGCCAACCTAACATGCGGCTGCTGTCGTTGGAGTGTCG

TTGACCGTGTAGTAGCGAGCGTGTAGTGTG-3’。

核酸适配体FAM-J7（即在核酸适配体J7的5’端标记FAM）为SEQIDNO.4所示的DNA片段，具体为：

FAM-J7：5’-CCTGAACCTGATGCCAACCTTGACGCCTCAACCCGTCTGTTGGACCAC

GCGCGGCGTGTCAGTAGCGAGCGTGTAGTGTG-3’。

本发明中，核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记，均能达到与实施例1相同或相似的技术效果。

对比例1：

阴性探针，其核苷酸序列为：

FAM-Random：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’（5’端标记有FAM）。

N代表A、T、G、C中任一碱基。

考察1：用Mfold软件对该本实施例四条序列进行二级结构模拟。用Mfold软件对本实施例的四条序列进行二级结构模拟后的结构示意图如图1～图4所示。

图1所示的为核酸适配体FAM-J1的二级结构图，从图中可知核酸适配体FAM-J1由四个环状结构和两个明显的茎状结构组成，且其中两个小环位于一个大环之上。

图2所示的为核酸适配体FAM-J3的二级结构图，从图中可知核酸适配体FAM-J3二级结构大体上与序列1类似，不过其环状结构更为丰富为六个。

图3所示的为核酸适配体FAM-J4的二级结构图，从图中可知，核酸适配体FAM-J4的茎状结构丰富，而环状结构碱基含量少。

图4所示的为核酸适配体FAM-J7的二级结构图，从图中可知，核酸适配体FAM-J7含有三个明显的环状结构和三个明显的茎状结构。

综合该本实施例四条核酸适配体的结构特点，发现它们富含环状结构和茎状结构，这些二级结构在与靶标结合的过程中发挥重要作用。

考察2：流式细胞仪检测本实施例1四条核酸适配体与LoVo细胞的结合效果及其特异性。

将处于对数期生长的LoVo细胞用无酶消化液消化后打散，2000rpm离心去上清，用5mLPBS离心洗涤两次。LoVo细胞分别与含250nM核酸适配体FAM-J1的bindingbuffer、含250nM核酸适配体FAM-J3的bindingbuffer、含250nM核酸适配体FAM-J4的bindingbuffer、含250nM核酸适配体FAM-J7的bindingbuffer和含250nM阴性探针FAM-Random的bindingbuffer在冰上孵育30min，2000rpm去上清，沉淀用200μLbindingbuffer洗涤两次，最后加入200μLbindingbuffer，用于流式细胞仪检测，以人非转移结肠癌细胞株SW480作为对照，检测结果如图5、图6所示。

由图5、图6流式细胞术的检测结果证明，本实施例的FAM-J1、FAM-J3、FAM-J4和FAM-J7四条核酸适体均对靶细胞人高转移结肠癌细胞株LoVo具有较强的识别能力，而对对照细胞人非转移结肠癌细胞株SW480无识别，阴性探针（即上述的阴性探针：FAM-Random）与靶细胞和对照细胞也均无识别。

考察3：激光共聚焦扫描显微镜检测实施例1四条核酸适配体与LoVo细胞的结合效果及其特异性。

在细胞培养皿中分别培养人高转移结肠癌细胞株LoVo和人非转移结肠癌细胞株SW480，过夜去除培养基，用PBS将细胞洗涤三次。将LoVo细胞分别与含250nM核酸适配体FAM-J1的bindingbuffer、含250nM核酸适配体FAM-J3的bindingbuffer、含250nM核酸适配体FAM-J4的bindingbuffer、含250nM核酸适配体FAM-J7的bindingbuffer在冰上孵育30min，去除反应液，用bindingbuffer洗涤三次，最后加入400μLbindingbuffer用于成像检测，检测结果如图7所示（图中的两组图片，一组是荧光通道的成像，一组是荧光通道与明场通道的叠加成像，是同一个照片不同通道的信息）。

按照同样的方法，将SW480分别与含250nM核酸适配体FAM-J1的bindingbuffer、含250nM核酸适配体FAM-J3的bindingbuffer、含250nM核酸适配体FAM-J4的bindingbuffer、含250nM核酸适配体FAM-J7的bindingbuffer在冰上孵育，30min，去除反应液，用bindingbuffer洗涤三次，最后加入400μLbindingbuffer用于成像检测，检测结果如图7所示。

从图7的检测结果可知：实施例1的四条核酸适体均能识别原位生长状态下的靶细胞LoVo，而不能识别对照细胞SW480。

考察4：流式细胞仪测定本实施例四条核酸适配体对LoVo细胞的解离常数。

将处于对数期生长的LoVo细胞用无酶消化液消化后打散，2000rpm离心去上清，用5mLPBS离心洗涤两次。本实施例四条核酸适配体对LoVo细胞的解离常数测定操作与考察2的操作基本一致，平行配制不同浓度（浓度分别为：0.5nM、1nM、4nM、15.625nM、62.5nM、125nM、250nM、500nM）的含本实施例核酸适配体的反应液与LoVo细胞孵育，以流式细胞仪的荧光几何平均值为纵坐标，以核酸适配体的浓度为横坐标，由Y=Bmax×X/（K_d+X）方程模拟曲线，得到实施例1四条核酸适配体的解离常数绘制曲线如图8～图11所示，由此可得到解离常数K_d如下表1所示。

表1：解离常数结果

序列名	解离常数（nM）
		FAM-J1	31.7 ± 6.4
FAM-J3	138.2 ± 100.1
		FAM-J4	5.9 ± 1.6
FAM-J7	129.5 ± 65.7

图8～图11及表1的检测结果表明：FAM-J1、FAM-J3、FAM-J4和FAM-J7与靶细胞LoVo细胞的结合能力很强，解离常数均在纳摩尔级别。

考察5：激光共聚焦扫描显微镜检测实施例1核酸适配体FAM-J3与靶细胞株LoVo、人高入侵性结肠癌细胞株SW620、人高入侵性卵巢癌细胞株HeLa、人高入侵性前列腺癌细胞株PC-3M-1E8、人非高入侵性肝癌细胞株HepG2和人非高入侵性正常肝细胞株L02的结合效果及其特异性。

在细胞培养皿中分别培养上述六种细胞株，过夜去除培养基，用PBS将细胞洗涤三次，细胞与含250nM实施例1核酸适体FAM-J3的bindingbuffer在冰上孵育30min，去除反应液，细胞用bindingbuffer洗涤三次，最后加入400μLbindingbuffer用于成像检测，检测结果如图12所示（图中的两组图片，一组是荧光通道的成像，一组是荧光通道与明场通道的叠加成像，是同一个照片不同通道的信息）。

检测结果表明：本实施例的核酸适体FAM-J3能识别原位生长状态下的靶细胞株LoVo和人高入侵性结肠癌细胞株SW620、人高入侵性卵巢癌细胞株HeLa、人高入侵性前列腺癌细胞株PC-3M-1E8，而不能识别人非高入侵性肝癌细胞株HepG2和人非高入侵性正常肝细胞株L02。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

<110>湖南大学

<120>用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体及检测试剂盒

<130>无

<160>4

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(80)

<223>根据实验要求而设计，作为本发明的核酸适配体FAM-J1。

<400>1

cctgaacctgatgccaaccttgccgatgggtgggtgctcgtgggaaaccgagggggactg60

agtagcgagcgtgtagtgtg80

<210>2

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(80)

<223>根据实验要求而设计，作为本发明的核酸适配体FAM-J3。

<400>2

cctgaacctgatgccaacctgccagcgggcagtgcgcgagtgggaaaccgagggggactg60

agtagcgagcgtgtagtgtg80

<210>3

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(79)

<223>根据实验要求而设计，作为本发明的核酸适配体FAM-J4。

<400>3

cctgaacctgatgccaacctaacatgcggctgctgtcgttggagtgtcgttgaccgtgta60

gtagcgagcgtgtagtgtg79

<210>4

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(80)

<223>根据实验要求而设计，作为本发明的核酸适配体FAM-J7。

<400>4

cctgaacctgatgccaaccttgacgcctcaacccgtctgttggaccacgcgcggcgtgtc60

agtagcgagcgtgtagtgtg80

Claims

1.一种用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体为核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7中的一种；所述核酸适配体J1的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示的DNA片段；所述核酸适配体J3的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示的DNA片段；所述核酸适配体J4的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示的DNA片段；所述核酸适配体J7的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体还包括在核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化的核酸适配体。

3.根据权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于，所述氨基化具体为在所述核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7核苷酸序列的5’端标记氨基基团-NH₂。

4.根据权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于，所述巯基化具体为在所述核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7核苷酸序列的5’端标记巯基基团-SH。

5.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4和核酸适配体J7的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。

6.根据权利要求5所述的核酸适配体，其特征在于，所述荧光物质为FAM荧光基团或Cy5荧光基团；所述纳米发光材料为量子点或上转换纳米颗粒；所述酶标记为辣根过氧化物酶或蔗糖酶。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种：

（1）与所述核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60%以上；

（2）与所述核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列；

（3）所述核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸适配体，其特征在于，还包括所述核酸适配体的衍生物，所述核酸适配体衍生物为由所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸适配体，其特征在于，还包括所述核酸适配体的衍生物，所述核酸适配体衍生物为由所述核酸适配体改造而成的相应肽核酸。

10.一种用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至9中任一项所述的核酸适配体。