CN106032534A - 一种与人非小细胞肺癌细胞特异结合的核糖核酸适配体及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与人非小细胞肺癌细胞特异结合的核糖核酸适配体(RNA aptamer)及其筛选方法。本发明人基于活体内in vivo-SELEX筛选技术，获得了一条可以与人非小细胞肺癌细胞特异性结合的核糖核酸适配体(RNA aptamer)。该核糖核酸适配体可应用于与肺癌化疗药物、siRNA等结合，构成靶向性药物，以实现肺癌的靶向治疗。该核糖核酸适配体与荧光染料等结合，可以制备人非小细胞肺癌的诊断试剂。

Description

一种与人非小细胞肺癌细胞特异结合的核糖核酸适配体及其筛选方法

技术领域

本发明属于生物医学领域；更具体地，本发明涉及一种与人非小细胞肺癌细胞特异结合的核糖核酸适配体及其筛选方法。

背景技术

癌症已成为世界人口的主要死亡原因之一，而居全国恶性肿瘤发病率和死亡率第一位的均是肺癌。目前针对癌症的诊疗关键在于开发有效的早期诊断方法以及高度特异性地针对癌细胞的靶向药物。然而，临床上能可靠用于癌症早期诊断或治疗的靶点少之又少。因此开发能特异性识别肿瘤组织而非正常组织的靶向诊断或治疗药物成为抗癌药物研发中的重中之重。

适配体(aptamer)是可以折叠成三维结构，通过空间构型与靶分子特异性结合的一段单链寡核苷酸序列(ssDNA，RNA或修饰后的RNA)。由于适配体具有与靶标结合的特异性，具有被开发为特异性的与靶组织结合的核酸药物的价值。

但是，虽然核酸的亲和识别特性已经发现20年，但是由于分析手段的限制，人们对这种特性的来源与化学基础的理解仍然极为有限。目前本领域对于核酸适配体的研究较为滞后，真正可实际应用的核酸适配体屈指可数；且目前基于核酸适配体的分析对象都集中于凝血酶等少数几个特定靶分子，实际应用远不及抗体普及，这是由于核酸适配体获得难度大导致的。核酸适配体的筛选和结构表征是一个烦琐耗时的工作，需要长期的经验和耐心，很多筛选由于得不到有用的适配体而半途而废，筛选和表征成为制约核酸适配体广泛应用的瓶颈，直接导致目前可用的核酸适配体少之又少。

目前，本领域中适配体的筛选主要是基于一种以扩增为基础的称之为指数富集的配体系统(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)的筛选技术。SELEX筛选技术中，首先将ssDNA或RNA文库与靶蛋 白或细胞进行孵育，洗去未结合的序列，再将结合的序列洗脱作为下一轮筛选的文库，如此循环往复，多轮筛选，通过克隆测序，以期筛选与靶标特异结合的适配体序列。但SELEX技术目前尚无标准筛选方法，需要根据靶标的特点和预期应用来确定。尽管目前发展出了复杂体系筛选、多靶标多文库筛选和自动化筛选等，但如何发展为可获得更多适于生物医学应用的核糖核酸适配体的筛选技术，仍然是研究的重点。

综上，尽管已经有SELEX技术应用于筛选核酸适配体，但是本领域中对于临床真正有用的适配体的开发和筛选是非常困难的。尽管本领域技术人员进行了大量的研究和筛选，但是对于特定的癌症真正具有结合能力的适配体仍然少之又少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与人非小细胞肺癌细胞特异结合的核糖核酸适配体及其筛选方法。

在本发明的第一方面，提供一种特异性靶向人非小细胞肺癌的核糖核酸适配体，选自：

(1)具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的核糖核酸适配体；或

(2)在严格条件下能够与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列杂交且具有特异性结合人非小细胞肺癌细胞功能的核糖核酸适配体；或

(3)与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；进一步更佳地95％以上)相同性且具有特异性结合人非小细胞肺癌细胞功能的核糖核酸适配体；或

(4)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的截短体，且具有特异性结合人非小细胞肺癌细胞功能的核糖核酸适配体；或

(5)核苷酸序列与(1)-(4)任一限定的核糖核酸适配体的核苷酸序列互补的核糖核酸适配体。

在本发明的了另一方面，提供所述的核糖核酸适配体的用途，用于制备特异性靶向人非小细胞肺癌的靶向性药物。

在本发明的了另一方面，提供一种特异性靶向人非小细胞肺癌的靶向性药物，所述的靶向性药物包括：所述的核糖核酸适配体，以及与之相连的人非小细胞肺癌治疗药物；较佳地，所述的人非小细胞肺癌治疗药物包裹于纳米微球。

在一个优选例中，所述的人非小细胞肺癌治疗药物包括：具有抑制人非小细胞肺癌的小分子化合物(如化疗药物)，核酸药物(如siRNA或shRNA)或蛋白药物。一般地，所述治疗药物本身不具有靶向人非小细胞肺癌的靶向性。

在本发明的了另一方面，提供所述的靶向性药物在制备抑制人非小细胞肺癌的药物中的应用。

在本发明的了另一方面，提供所述的核糖核酸适配体的用途，用于制备特异性诊断人非小细胞肺癌的诊断试剂。

在本发明的了另一方面，提供一种特异性诊断人非小细胞肺癌的诊断试剂，所述的诊断试剂包括：所述的核糖核酸适配体，以及与之相连的可检测标记物。

在一个优选例中，所述的诊断试剂中，所述的可检测标记物是荧光标记。

在另一优选例中，所述的荧光标记包括(但不限于)：Cy3，Cy5，荧光素，FITC，荧光纳米微球。

在本发明的了另一方面，提供一种特异性诊断人非小细胞肺癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒中包括：前面任一所述的诊断试剂。

在本发明的了另一方面，提供一种特异性治疗人非小细胞肺癌的药盒，所述的药盒中包括：所述的特异性靶向人非小细胞肺癌的靶向性药物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、用Mfold软件对本发明的序列进行二级结构模拟的结构示意图。

图2、RNA序列分别与人非小细胞肺癌NCI-H460细胞结合后的荧光显微镜照片。

A)Cy3标记的RNA起始文库；

B)Cy3标记的第五轮筛选后的RNA库；

C)Cy3标记的5条随机RNA；

D)Cy3标记的本发明的核糖核酸适配体(RNA aptamer)。

图3、本发明的核糖核酸适配体分别与NCI-H460细胞，293T细胞，Hela细胞的结合效果。

A、经活体筛选后所得2’-F-RNA适配体与293T细胞结合后的荧光显微镜照片。A)明场；B)Cy3(红光)；C)Hoechst33342(蓝光)；D)B&C merge。

B、经活体筛选后所得2’-F-RNA适配体与Hela细胞结合后的荧光显微镜照片。A)明场；B)Cy3(红光)；C)Hoechst33342(蓝光)；D)B&C merge。

C、经活体筛选后所得2’-F-RNA适配体与NCI-H460细胞结合后的荧光显微镜照片。A)明场；B)Cy3(红光)；C)Hoechst33342(蓝光)；D)B&C merge。

图4、本发明的核糖核酸适配体的筛选过程的流程示意图。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，将传统SELEX筛选技术改进为活体内in vivo-SELEX筛选技术，获得了一条可以与人非小细胞肺癌细胞特异性结合的核糖核酸适配体。该核糖核酸适配体可被应用于与肺癌化疗药物、siRNA等结合，构成靶向性药物，以实现肺癌的靶向治疗。

本发明人致力于针对人非小细胞肺癌的靶向性分子的研究，在长期的研究和筛选工作中发现，采用传统SELEX筛选技术，并不能获得能够有效地靶 向人非小细胞肺癌的核糖核酸适配体，这可能是由于人非小细胞肺癌细胞表面缺少足够被有效结合的靶点或其它不明原因。为此，本发明人进行了SELEX筛选技术的改造，经过反复的试验和调整，开发了一种活体内in vivo-SELEX筛选技术，该技术直接采用活体动物作为筛选靶标，在动物内进行SELEX筛选。利用in vivo-SELEX筛选技术，本发明人成功筛选获得了可以与人非小细胞肺癌细胞特异性结合的核糖核酸适配体。

在本发明的具体实施方式中，在裸鼠体内构建人非小细胞肺癌细胞皮下瘤模型，直接对人非小细胞肺癌NCI-H460荷瘤模型进行体内筛选，采用RNA文库进行活体SELEX，将RNA文库中嘧啶核苷2’位以氟基团修饰后经尾静脉注射到裸鼠体内，然后将与肿瘤结合的文库进行扩增，通过体外转录和修饰制备下一轮的筛选产物，如此循环，经多轮筛选后获得了一条特异性RNA适配体序列，筛选流程如图4。

本发明的核糖核酸适配体具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其构成的结构如图1所示。

本发明的核糖核酸适配体是RNA形式。本发明的核糖核酸适配体的全长核苷酸序列或其片段通常可以用体外转录、重组或人工合成的方法获得。

本发明也涉及在所述的核糖核酸适配体基础上经过修饰的核糖核酸适配体，例如，为了提高核糖核酸适配体的稳定性或体内有效作用时间，在序列的两端或中间位置的部分碱基上进行一些化学修饰。为了提高核酸的稳定性而进行修饰的手段是本领域技术人员了解的。

多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还包括与本发明的核糖核酸适配体的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少70％，更佳地至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、或98％)相同性的多核苷酸，所述核酸也具有特异性结合人非小细胞肺癌细胞的功能。

序列“相同性”是指按照位置，相应碱基相同的百分比，其能指示两条或多条核酸之间的相似水平(也称为序列同源性、相似性或同一性)。

本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如 0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有特异性结合人非小细胞肺癌细胞的功能。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及也涉及含有所述多核苷酸的宿主细胞。

本发明也涉及一种特异性靶向人非小细胞肺癌的靶向性药物，所述的靶向性药物包括：所述的核糖核酸适配体，以及与之相连的人非小细胞肺癌治疗药物。

所述的人非小细胞肺癌治疗药物可以是任何本领域中认为对于人非小细胞肺癌有抑制作用的药物，且该治疗药物能够与核酸发生较为稳定的连接(含偶联)。所述的治疗药物例如包括：具有抑制人非小细胞肺癌的小分子化合物(如化疗药物)，核酸药物(如siRNA或shRNA)或蛋白药物。一般地，所述治疗药物本身不具有靶向人非小细胞肺癌的靶向性。

本发明的核糖核酸适配体是直接以人类肿瘤组织为筛选靶标模型，利用活体-SELEX筛选出的可与肿瘤组织特异性结合的适配体，潜在的肿瘤靶向生物标记物均以天然构象存在于肿瘤组织表面或内部，有利于肿瘤诊断及靶向药物的开发，能够大大缩短基于适配体的靶向核酸药物进入临床前试验期，提高临床应用的成功率。

本发明的核糖核酸适配体与抗体功能类似，但比抗体具有更多的优势，具有更高的亲和力与特异性；无免疫原性；能够大规模化学合成，成本低；稳定性好，易于保存等优点。因此，本发明的核糖核酸适配体具有广泛的应用前景。

传统的体外核糖核酸适配体的筛选方法利用体外表达的蛋白及细胞进行筛选，无法模拟蛋白在体内的天然空间构象、抗原表位的暴露、与其他生物分子作用和影响，以及蛋白在体内的表达水平、分布形式等，导致靠体外筛选到的适配体可能根本无法靶向到靶标，因此发展高效有力的体内筛选方法显得尤为重要。本发明利用构建的NCI-H460皮下瘤模型，将荷瘤鼠内肿瘤直接作为筛选的靶标，直接模拟体内肿瘤环境，筛选到的适配体更有利于癌症 诊断及治疗药物的开发。

在以往进行适配体研究过程中，均是在筛选出潜在的适配体分子后，再进行后续的序列修剪、末端加帽、PEG修饰等优化处理，本发明在活体SELEX筛选过程中，利用T7RNA聚合酶突变型(Y639F)插入2’-氟修饰的嘧啶碱基，制备能够抗核糖核酸酶的RNA；且每一轮筛选过程中均对RNA文库进行PEG修饰，提高其稳定性和体内半衰期，得到的本发明的适配体具有抗核酸酶活性，且不会因为后期的修饰改变其三维结构。

将本发明的核糖核酸适配体用荧光染料Cy3进行标记，将标记的核糖核酸适配体与人非小肺癌NCI-H460细胞及其他细胞作用，其能够特异性且高亲和力的与人非小肺癌NCI-H460细胞结合。利用本发明的核糖核酸适配体对其结合的靶分子进行研究，可以得到该肿瘤标志物，这对于肺癌的早期检测具有重要意义，在肺癌的诊断方面有良好的应用前景。将本发明的核糖核酸适配体与化疗药物、siRNA等结合，能够实现肺瘤的靶向治疗，对于肺癌的治疗方面也有良好的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、筛选核糖核酸适配体

本实施例的上述可用于检测人非小细胞肺癌NCI-H460细胞的核糖核酸适配体主要采用以下筛选方法筛选得到，具体包括以下步骤：

1、合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物

随机文库：

5’-CACTAATACGACTCACTATAGGGAGAGAACAATGACCTNGAGTGCATTGCATCACGTCAGTAG-3’(SEQ ID NO:2)；

5’引物：5’-CACTAATACGACTCACTATAGGGAGAGAACAATG-3’(SEQ ID NO:3)；

3’引物：5’-CTACTGACGTGATGCAATGCACTC-3’(SEQ ID NO:4)。

2、NCI-H460(简称H460)皮下瘤模型构建

1640培养基加10％胎牛血清培养人非小细胞肺癌细胞株NCI-H460细胞(购自中国科学院上海生科院细胞资源中心)至铺满瓶底95％，去除培养基后用10mL PBS洗涤，用0.25％胰酶消化后以2×10⁷/mL的浓度悬于PBS溶液中，于5周龄裸鼠腋下接种细胞，每只鼠接种100μL。接种后每天观察裸鼠的肿瘤生长情况，肿瘤直径长至5mm以上，认为模型构建成功，即可用于筛选。

3、PEG修饰的RNA文库构建

3.1 RNA文库体外转录

以上述随机单链DNA文库为模板，以2’F-dCTP、2’F-dUTP，CTP，ATP，amino-GMP为底物，进行体外转录反应。反应条件为：37℃，8h。反应完成后用DNaseⅠ去除DNA模板，以苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀法得到纯化的RNA文库。

3.2 PEG修饰

将乙醇沉淀后的RNA悬于100μL DEPC-H₂O中，加入等体积0.2MNaHCO₃溶液，再加入适量NHS-PEG(30kD)干粉，室温反应2h，加入终浓度为20mM的Tris-HCl缓冲液中和未反应的NHS，即得PEG修饰的RNA文库。

4、In vivo-SELEX筛选获得NCI-H460(简称H460)特异核糖核酸适配体文库。

4.1 尾静脉注射

用400μL结合缓冲液溶解1nmol上述PEG修饰的RNA文库，95℃变性3min，置于37℃缓慢折叠成二级结构；然后将折叠后的RNA文库尾静脉注射3只荷瘤裸鼠。

4.2 肿瘤提取

将RNA通过尾静脉注射入裸鼠体内后，待其在体内循环5～6h；将裸鼠脱颈椎处死，取出肿瘤组织，用PBS淋洗3遍后，称重。

4.3 RNA抽提

将提取的肿瘤组织用干烤过的眼科剪刀剪成小碎块，加入适量Trizol，用一次性研磨杵研磨成悬液，室温放置5min；加入1/5体积的氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min。12,000rpm 4℃离心10min；吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20min。12,000rpm 4℃离心10min，弃上清；加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀。12,000rpm 4℃离心5min，弃上清。室温干燥10min；悬于一定量的DEPC-H₂O。

4.4 DNase I及RNase A处理

将上一步提取的RNA取出1/2进行DNase Ⅰ及RNase A处理，反应条件为37℃，1h。将酶灭活后即为筛选所得H460的特异核糖核酸适配体文库。

5、进行反转录-PCR扩增文库

取100μL筛选所得的H460特异核糖核酸适配体文库进行常规反转录，条件为：

1)RNA与引物孵育：70℃10min，冰上急冷2min；

2)反转录：42℃1h，70℃15min，冰上急冷2min；然后以反转录后产物为模板进行常规PCR扩增，扩增条件为：94℃3min；94℃30sec，62℃30sec，72℃30sec，经合适循环轮数；72℃3min；每一轮筛选后需先进行预扩增确定合适的循环轮数，再进行本步骤的扩增，得到扩增产物。

6、重复筛选

将步骤5得到的DNA扩增产物代替步骤3.1中的DNA随机文库，重复上述步骤3～5所示的RNA文库构建、体内筛选及反转录-PCR扩增过程。随着筛选轮数的增加，逐渐减少尾静脉注射的RNA文库用量，至5轮筛选后，将所得产物进行克隆测序，对测序结果进行分析后，最终获得富集度高的一 条序列，即为本发明的可与人非小细胞肺癌NCI-H460细胞特异结合的核糖核酸适配体。

本发明的核糖核酸适配体的序列如下(SEQ ID NO:1)：

5’-GGGAGAGAACAAUGACCUGCGGUGCCAAGCCGUCGGGUUAUGUUGAUCUCCACAAGGACGAGUGCAUUGCAUCACGUCAGUAG-3’

用Mfold软件对本发明的核糖核酸适配体进行二级结构模拟。用Mfold软件对本发明的序列进行二级结构模拟后的结构示意图如图1所示。

实施例2、本发明的核糖核酸适配体的结合性能的观测

本实施例中，应用荧光显微镜检测前述筛选获得的核糖核酸适配体与人非小细胞肺癌NCI-H460细胞的结合效果。

在12孔板中培养人非小细胞肺癌NCI-H460细胞，倒出培养基，用PBS将H460细胞洗涤三次，然后分别与含200nM的本发明的核糖核酸适配体(标记有Cy3)、RNA文库(标记有Cy3)以及其他5条混合序列(5random RNA mixture，标记有Cy3)的结合缓冲液37℃孵育1小时，倒出反应液，用结合缓冲液洗涤三次，最后加入200μL结合缓冲液用于检测，检测结果如图2所示。

由图2可见，本发明获得的核糖核酸适配体对于人非小细胞肺癌细胞具有极其优异的结合能力。

实施例3、本发明的核糖核酸适配体的结合特异性

本实施例中，应用荧光显微镜检测本发明的核糖核酸适配体与人非小细胞肺癌NCI-H460细胞结合的特异性。

在12孔板中分别培养人非小细胞肺癌NCI-H460细胞和人293T细胞，Hela细胞，倒出培养基，用PBS将H460细胞，293T细胞，Hela细胞洗涤三次，然后分别与含200nM的本发明的核糖核酸适配体(标记有Cy3)的结合缓冲液37℃孵育1小时，倒出反应液，用结合缓冲液洗涤三次，最后加入Hoechst33342进行细胞核染色，用PBS洗涤细胞2次，再加入200μL结合缓冲液用于检测，检测结果如图3A-C所示。

由图3可见，本发明获得的核糖核酸适配体能够特异性地结合人非小细胞肺癌细胞，且发生结合的比例非常高(根据细胞计数统计，与90％以上的肺癌细胞结合)，而与其它细胞不发生交叉结合。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种特异性靶向人非小细胞肺癌的核糖核酸适配体，其特征在于，选自：

(1)具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的核糖核酸适配体；或

(2)在严格条件下能够与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列杂交且具有特异性结合人非小细胞肺癌细胞功能的核糖核酸适配体；或

(3)与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列有80％以上相同性且具有特异性结合人非小细胞肺癌细胞功能的核糖核酸适配体；或

(4)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的截短体，且具有特异性结合人非小细胞肺癌细胞功能的核糖核酸适配体；或

(5)核苷酸序列与(1)-(4)任一限定的核糖核酸适配体的核苷酸序列互补的核糖核酸适配体。

2.权利要求1所述的核糖核酸适配体的用途，用于制备特异性靶向人非小细胞肺癌的靶向性药物。

3.一种特异性靶向人非小细胞肺癌的靶向性药物，其特征在于，所述的靶向性药物包括：权利要求1所述的核糖核酸适配体，以及与之相连的人非小细胞肺癌治疗药物；较佳地，所述的人非小细胞肺癌治疗药物包裹于纳米微球。

4.权利要求3所述的靶向性药物在制备抑制人非小细胞肺癌的药物中的应用。

5.权利要求1所述的核糖核酸适配体的用途，用于制备特异性诊断人非小细胞肺癌的诊断试剂。

6.一种特异性诊断人非小细胞肺癌的诊断试剂，其特征在于，所述的诊断试剂包括：权利要求1所述的核糖核酸适配体，以及与之相连的可检测标记物。

7.如权利要求6所述的诊断试剂，其特征在于，所述的可检测标记物是荧光标记。

8.如权利要求7所述的诊断试剂，其特征在于，所述的荧光标记包括：Cy3，Cy5，荧光素，FITC，荧光纳米微球。

9.一种特异性诊断人非小细胞肺癌的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：权利要求6-8任一所述的诊断试剂。

10.一种特异性治疗人非小细胞肺癌的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括：权利要求3所述的特异性靶向人非小细胞肺癌的靶向性药物。