CN117925627A - 用于识别并结合人结直肠癌细胞的rna核酸适体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于识别并结合人结直肠癌细胞的RNA核酸适体及其应用。本发明提供了用于识别并结合人结直肠癌细胞的成套RNA核酸适体，由SEQ ID No.1至SEQ ID No.5所示5条适体中的全部或部分组成。这些核酸适体是通过以传统的Cell‑SELEX技术为基础，结合UMI和高通量测序技术，设计的单轮/寡轮筛选方法获得的。该方法能够同时得到多种不同靶标的核酸适体，这些核酸适体在正常细胞、不同来源的肿瘤细胞上有不同的结合模式，根据结合模式的不同，可以实现对正常细胞、不同来源肿瘤细胞的分子分型。另外，本发明对于肠癌相关的生理病理研究和治疗诊断具有重要意义。

Description

用于识别并结合人结直肠癌细胞的RNA核酸适体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于识别并结合人结直肠癌细胞的RNA核酸适体及其应用。
背景技术
核酸适体(Aptamer)是一种可以特异性地与靶标结合的单链核苷酸(DNA或RNA分子)，分子量小，易设计合成，可折叠形成特定构象特异性结合生物靶标，也因此被美誉为“化学抗体”。核酸适体具备合成简单、易修饰、化学性质稳定、免疫原性低、成本低廉等优点，可作为良好的发新型高效稳定的分子探针，在癌症的早期诊断和精准靶向治疗、药物治疗以及生物化学传感等领域极具前景。
靶标结合核酸适体的选择通常采用SELEX的方法，该方法允许我们从1013-1016个初始核酸分子中指数化富集结合的序列，并借由测序技术得到特定核酸适体的候选序列，然后通过表面等离子共振、等温量热滴定等技术手段测量候选适配体和靶标的结合。在过去的几十年里，为了得到性能更优良、更丰富的核酸适体，研究者在SELEX方法的改进上进行了大量的探索，提出了包括Cell-SELEX、Capture-SELEX、GO-SELEX、GOLD-SELEX等SELEX新方法，这些方法客观上提高了筛选的效率，但重复选择结合PCR扩增的固有属性使得我们仍然面临着不可避免的伪影带来的指数富集相关的不确定性。这些伪影产生的原因很复杂，包括非核酸适体的不彻底分离、引物序列的影响以及PCR扩增、转录和逆转录过程中的序列偏好。
除了对SELEX方法的优化外，研究者们试图通过缩短选择的时间、简化适体选择的步骤的方式来规避SELEX过程的不利影响，即通过单轮选择的方式分离适配体，这些方法大多用于DNA适体的获取。然而，这些方法并没有得到比SELEX方法更广泛的应用，原因是多种多样的，如相比于SELEX，单轮选择需要从大量的过量非适配体核酸中发现适配体，且现有的单轮选择方法难以保证得到的适配体具有较好的结合性能。此外，相对于RNA适体，DNA本身更稳定，且可以直接通过PCR扩增，每一轮筛选的过程并不复杂，即使是一位初学者也可以在一天之内完成一轮的适体选择。并且考虑到每次重复选择过程中PCR错误的积累客观上增加了序列的多样性，为核酸适配体结构的优化和更高亲和力的核酸适体的获取提供了更多的机会，DNA适体的SELEX方法相比于其单轮选择可能在多数情况下是一种更优先的选择。
然而，RNA适体的选择与DNA适体的选择有着显著的区别，这体现在RNA的不稳定性和不能直接作为PCR的模板进行扩增，这意味着在RNA适体的选择中对筛选轮数的缩减可能是更有意义的。同时，基于RNA核酸适体本身可以通过体内或体外转录大量制备的特点，基于RNA的体内调控或体外规模化生产具有独特的价值，提高RNA核酸适体的获取效率具有重要意义。现有的关于RNA适体的单轮筛选方法的报道是鲜见的，这包括了使用人类基因组RNA库作为初始文库的HT-seq研究和基于RNase消化和已知序列DNA载体的RNA适体单轮选择方法。然而，这些方法都存在着各自的局限性，目前我们仍然缺乏性能良好的RNA适体，开发RNA适体单轮筛选方法仍然是一项有意义的工作。
根据国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer,IARC)GLOBOCAN项目的统计数据，2020年，结直肠癌是全球第三大常见的恶性肿瘤，也是恶性肿瘤相关死亡的第二大原因。大多数结直肠癌是由息肉引起，起始于异常的腺窝，后逐渐演变成息肉，最终发展为结肠直肠癌，整个过程可长达5-15年。结直肠癌发展到晚期之前，基本无明显症状表现，很多患者平时没症状，一查就已是中晚期。癌症的早筛早诊有利于提高结直肠癌患者的总体生存率，目前常见的筛查手段包括直肠指诊、粪便隐血试验、基因检测，以及结肠镜检查等。然而，目前，我国结直肠癌筛查的参与率并不理想，这可能与居民对筛查的重要性缺乏认识有关；也可能是因为现行的筛查手段，特别是具有侵入性的肠镜筛查很难被接受，尤其对于无症状的人群。此外，早发性结直肠癌似乎比晚发性结直肠癌具有更强的侵袭性表型，其在组织学上多为低分化型，更常见的是有黏液和印戒特征，这些特征也使得这类结直肠癌更难被“筛”查出来。因此，为了解决肠癌早期诊断困难的问题，筛选具有特异性识别肠癌细胞的核酸适体，发现肠癌标志物，对肿瘤的早期诊断及预后治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于识别并结合人结直肠癌细胞的RNA核酸适体及其应用。
第一方面，本发明要求保护一种成套核酸适体。
本发明所要求保护的成套核酸适体能够识别并结合人结直肠癌细胞，具体由如下五个核酸适体中的全部或部分组成：
(A1)核酸适体1：SEQ ID No.1所示单链RNA分子；
(A2)核酸适体2：SEQ ID No.2所示单链RNA分子；
(A3)核酸适体3：SEQ ID No.3所示单链RNA分子；
(A4)核酸适体4：SEQ ID No.4所示单链RNA分子；
(A5)核酸适体5：SEQ ID No.5所示单链RNA分子；
所述部分为2个或2个以上核酸适体。
在本发明的具体实施方式中，所述核酸适体1、所述核酸适体2、所述核酸适体3、所述核酸适体4和所述核酸适体5中C和U均经2′-氟代修饰。
第二方面，本发明要求保护一种成套核酸适体衍生物。
本发明所要求保护的成套核酸适体衍生物为对组成前文第一方面所述成套核酸适体中的各个单一核酸适体均进行如下操作后所得：对所述单一核酸适体的一端或中间(一个位置或者多个位置连接)接上荧光素和/或抗肿瘤药物和/或放射性元素和/或生物酶和/或生物素和/或纳米材料，得到与所述单一核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物。在本发明的具体实施方式中，是在所述单一核酸适体的5’末端接上了异硫氰酸荧光素(FITC)。
第三方面，本发明要求保护一种核酸适体。
本发明所要求保护的核酸适体用于识别并结合人结直肠癌细胞，具体可为如下五个核酸适体中的任意一个：
(A1)核酸适体1：SEQ ID No.1所示单链RNA分子；
(A2)核酸适体2：SEQ ID No.2所示单链RNA分子；
(A3)核酸适体3：SEQ ID No.3所示单链RNA分子；
(A4)核酸适体4：SEQ ID No.4所示单链RNA分子；
(A5)核酸适体5：SEQ ID No.5所示单链RNA分子。
在本发明的具体实施方式中，所述核酸适体1、所述核酸适体2、所述核酸适体3、所述核酸适体4和所述核酸适体5中C和U均经2′-氟代修饰。
第四方面，本发明要求保护核酸适体衍生物。
本发明要求保护的核酸适体衍生物为对前文第三方面所述核酸适体的一端或中间接上化学基团和/或荧光素和/或抗肿瘤药物和/或放射性元素和/或生物酶和/或生物素和/或纳米材料，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物。在本发明的具体实施方式中，是在所述核酸适体的5’末端接上了异硫氰酸荧光素(FITC)。
第五方面，本发明要求保护一种用于识别并结合肠癌细胞的检测试剂。
本发明所要求保护的用于识别并结合肠癌细胞的检测试剂，其有效成分为或包含前文第一方面所述的成套核酸适体或前文第二方面所述的成套核酸适体衍生物或前文第三方面所述的核酸适体或前文第四方面所述的核酸适体衍生物。
第六方面，本发明要求保护前文第一方面所述的成套核酸适体或前文第二方面所述的成套核酸适体衍生物或前文第三方面所述的核酸适体或前文第四方面所述的核酸适体衍生物在制备用于识别并结合肠癌细胞的产品中的应用或在识别并结合肠癌细胞中的应用。
第七方面，本发明要求保护前文第一方面所述的成套核酸适体或前文第二方面所述的成套核酸适体衍生物或前文第三方面所述的核酸适体或前文第四方面所述的核酸适体衍生物在如下任一中的应用：
(B1)制备用于识别并结合肠癌细胞的产品，或识别并结合肠癌细胞；
(B2)制备肠癌病理研究产品；
(B3)制备肠癌诊断产品；
(B4)制备肠癌治疗产品；
(B5)制备用于对肠癌细胞进行成像的产品，或对肠癌细胞进行成像。
在上述各相关方面中，所述肠癌细胞为结直肠细胞(如人结直肠细胞)；所述肠癌为结直肠癌(如人结直肠)。
在本发明的具体实施方式中，所述结直肠癌细胞为人结直肠癌细胞HCT-8。
第八方面，本发明要求保护前文第一方面所述的成套核酸适体或前文第二方面所述的成套核酸适体衍生物在如下任一中的应用：
(C1)制备用于对正常细胞和不同来源肿瘤细胞进行分子分型的产品；
(C2)对正常细胞和不同来源肿瘤细胞进行分子分型。
在本发明的具体实施方式中，所述正常细胞可选自如下：HEK-293T、SV-HUC-1、C2C12、DC2.4。所述不同来源肿瘤细胞可选自：HCT-8、MDA-MB-231、TOV21G、A549。
本发明以传统的Cell-SELEX技术为基础，结合UMI和高通量测序技术，设计了通过单轮/寡轮筛选快速获取RNA适体的方法。本发明以人结直肠癌细胞株HCT-8为靶标细胞，经过两轮的筛选后，构建UMI测序文库并进行高通量测序，挑选出多条识别结直肠癌细胞的核酸适体。本发明筛选得到的核酸适体具备免疫原性低、易于修饰标记、性质稳定且重现性好的特点；相较于抗体，稳定性良好，合成成本低。后续可通过对核酸适体的性质进行进一步的表征和靶标的鉴定，有助于探索和发现肿瘤标志物。同时核酸适体可作为高效且穿透力强的分子探针工具用于肿瘤的早期诊断，也可结合药物进行肿瘤(结直肠癌)靶向治疗。
附图说明
图1为单轮/寡轮筛选基本流程图。
图2为HCT-8细胞RNA适体筛选第二轮产物RT-qPCR表征结果。
图3为HCT-8细胞RNA筛选测序结果与序列表征。A：第2轮产物建库测序结果前十条序列的同源性情况；B：挑选并初步截短的候选核酸适体与靶细胞HCT-8的流式表征结果；C：mFOLD拟合的4条HCT-8RNA适体的二级结构；D：4条HCT-8RNA适体的亲和力的流式测定结果；E：4条HCT-8RNA适体与靶细胞HCT-8的共聚焦表征结果(Control为对照序列)。
图4为不同HCT-8RNA核酸适体与不同的细胞的流式结合情况。A：TOV21G细胞；B：HEK-293T细胞；C：A549细胞；D：SV-HUC-1细胞；E：MDA-MB-231细胞；F：C2C12细胞；G：DC2.4细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明利用Cell-SELEX技术，结合UMI和高通量测序技术，以随机合成的ssDNA序列为起始进行RNA筛选，分别以人结直肠癌细胞株HCT-82为靶细胞，旨在筛选出能特异性识别HCT-8细胞株的核酸适体，建立一种RNA单轮/寡轮筛选的方法。图1为单轮/寡轮筛选基本流程图。
实验所需细胞均来源于American type culture collection(ATCC)，具体培养条件如表1所示，所用培养基均加入10％ FBS和100U/mL的青霉素和链霉素，且均培养于二氧化碳37℃恒温培养箱，CO2浓度为5％。细胞传代所用消化液为0.25％Trypsin-EDTA，冻存细胞所用冻存液为商品化无血清细胞冻存液。
表1、各细胞及其培养条件
细胞系 中文名称 培养条件
MDA-MB-231 人乳腺癌细胞 DMEM+10％FBS+1％P/S
HCT-8 人结直肠癌细胞 RPMI1640+10％FBS+1％P/S
TOV21G 人卵巢癌细胞 1640+10％FBS+1％P/S
HEK-293T 人胚肾细胞 DMEM+10％FBS+1％P/S
SV-HUC-1 人输尿管上皮永生化细胞 Ham's F-12K+10％ FBS+1％P/S
C2C12 小鼠成肌细胞 DMEM+10％FBS+1％P/S
DC2.4 小鼠骨髓来源树突状细胞 DMEM+10％FBS+1％P/S
A549 人非小细胞肺癌细胞 1640+10％FBS+1％P/S
实施例1、HCT-8RNA核酸适体筛选与制备
一、文库及引物设计
本发明进行RNA核酸适体筛选时，所用核酸文库和引物的设计如下：
随机核酸文库(LibDD DNA)：5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCG G-N40-CAGACGACTCGCCCGA-3′(SEQ ID No.6)；其中，N40表示40个连续的N。
LibDD上游引物：5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GGA CGA TGC GG-3′(SEQ IDNo.7)。
LibDD下游引物/逆转录引物：5′-TCG GGC GAG TCG TCT G-3′(SEQ ID No.8)。
UMI文库：5′-TGGTGCGAATTCTGAGAGGT-N30-AGGT-TCGGGCGAGTCGTCTG-3′(SEQIDNo.9)；其中，N30表示30个连续的N，用于区分同一个UMI文库的不同序列,N30后紧邻的四个碱基为barcode序列，用于区分不同的UMI文库。
UMI文库上游引物：5′-TGGTGCGAATTCTGAGAGGT-3′(SEQ ID No.10)。
在上述序列中，N均表示A、T、C、G随机任一碱基。
二、溶液配制
1、洗涤缓冲溶液：PBS缓冲液(pH＝7.4)，1mM MgCl2，1mM CaCl2，4.5g/L D-葡萄糖。
2、结合缓冲液：由洗涤缓冲液加入1mg/mL的胎牛血清白蛋白(BSA)和0.1mg/mL的tRNA(T8630，索莱宝)组成，每次使用前现配现用。
3、扩增5×Mix：含有适宜量比例的引物、dNTPs、Taq酶、10×Buffer和H2O的预混液，其中引物为LibDD的上下游引物。
4、建库5×Mix：含有适宜量比例的引物、dNTPs、Taq酶、10×Buffer和H2O的预混液，其中引物为LibDD的上游引物和UMI文库的上游引物。
本发明中，所有使用到的H2O均为DEPC H2O，所有使用到的耗材均经过高温蒸汽灭菌处理。
三、RNA核酸适体筛选及其鉴定
1、文库浓缩与RNA文库制备
(1)文库制备：用200μL的DPBS溶解2.4nmol LibDD文库(SEQ ID No.6)，混匀95℃变性5min，冰上冷却5min，室温复性10min。
(2)PCR延伸：加入LibDD下游引物(SEQ ID No.8)将合成的ssDNA文库(SEQ IDNo.6)单轮延伸成为双链，延伸条件为：a)95℃、5min；b)59℃、5min；c)72℃，5min；d)4℃短期保存，-40℃长期保存。
(3)转录
配制转录体系(20μL)：其中dsDNA的量依据DNA序列的长度和PCR延伸投入模板量进行计算并使用DEPC H2O稀释获取，体系根据实际情况可翻倍调整。如表2所示。然后将配制好的转录体系混匀并在37℃下转录8-12h。
表2、转录体系
(4)DNA模板降解：在20μL转录产物中加入2.5μL DNaseⅠ、2.5μL 10×ReactionBuffer(EN401-01，Vazyme)，37℃孵育20min。
(5)RNA提取与回收
a)向25μL上一步骤产物中加入125μL DEPC H2O，混匀并转移至一新的1.5mL EP管。
b)向EP管中加入1×体积的苯酚-氯仿-异戊醇溶液(体积比＝25:24:1，pH<5.0)(EX0125，G-CLONE)，涡旋混匀。
c)4℃，15,000×g离心10min，吸取尽可能多的上层水相转移至一新的1.5mL EP管。
d)向上层水相中加入1μL糖原，1/10×体积的乙酸铵(10mol/L)和2×体积的冰冷乙醇(100％)，-80℃沉降2h。
e)取出上步产物，4℃，15,000×g离心15min。
f)弃上清，加入300μL冰冷乙醇(75％)，涡旋使沉淀尽量洗涤充分，随后4℃，15,000×g离心10min。
g)真空旋干。h)加入50μL DPBS充分溶解RNA产物，混匀并使用NanoDrop标定RNA的含量。
i)变复性：95℃变性5min，冰上冷却5min，室温复性10min，随后-80℃暂存备用。该步骤所得RNA即为初始RNA筛选文库。
2、第一轮RNA核酸适体筛选
(1)准备靶细胞(新复苏的HCT-8细胞培养三代以后使用，10cm×2cm培养皿)，培养细胞至汇合度90％，贴壁状态良好时使用。
(2)吸掉培养基，用2mL 4℃保存的洗涤缓冲液洗涤两次。
(3)将准备好的初始RNA筛选文库加入1300μL结合缓冲液中重悬，混合均匀。
(4)将上步的重悬液加入HCT-8细胞培养皿中，在冰上孵育1h，每五分钟摇动混匀一次。
(5)孵育结束后，去掉上清，用2mL洗涤缓冲液轻缓洗涤2次。确保细胞不被洗脱，以免丢失序列。
(6)4℃下，向培养皿中加入2mL Reagent(15596026，Invitrogen)消化1min，收集裂解液于1.5mL EP管中，涡旋混匀2-4min使细胞裂解更充分。注：TRIzol用量视具体情况调整。
(7)向EP管中加入1/5×体积的氯仿，涡旋混匀，随后4℃，15,000×g离心10min。
(8)转移上层水相至新的1.5mL EP管中，加入适量的DNaseⅠ，37℃孵育30-60min。
(9)按前文相关操作提取RNA，随后加入7.5μL DEPC H2O复溶备用。
(10)使用第一链cDNA合成试剂盒(E6560S，NEB)，根据试剂说明书将上步所得RNA逆转录成cDNA。
(11)PCR扩增
PCR1体系：20μL上一步骤所得cDNA+40μL扩增5×Mix+140μL DEPC H2O。扩增程序：a)95℃，3min；b)95℃，30s+58℃，30s+72℃，30s，扩增10循环；c)72℃，5min；d)4℃，短期保存。
循环数优化PCR2：1μL PCR1产物+10μL扩增5×Mix+39μL DEPC H2O，分装为5个管，每管10μL。PCR各程序的温度和时间条件同PCR1，循环数为7-15，间隔2个循环。PCR2完成后，进行核酸变性PAGE凝胶(8％)电泳：在各样本中加入1倍体积的2×尿素上样缓冲液，95℃变性10min后，冷却至4℃，上样并在300V恒压电泳10-15min，通过凝胶成像仪(ImageQuant800，Cytiva(GE))观察PAGE胶的条带，根据目标条带产量和是否存在杂带确认最佳循环数。
PCR3：在优化后的条件(最佳循环数)下进行PCR3(PCR3体系：10μL PCR1产物+100μL扩增5×Mix+390μL DEPC H2O)，完成后将产物合并到一个新的1.5mL EP管中，以备进行胶回收。
(12)琼脂糖凝胶回收
a)配制3％琼脂糖凝胶(预加入Gelred染料)。
b)向PCR3产物中加入100μL 6×上样缓冲液，混匀上样。
c)在300V恒定电压下，跑胶约40min至条带分开较明显。
d)在紫外灯下观察并切下约88bp长度位置的目标条带，称重。
e)使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(DC301-01，Vazyme)，按照试剂说明书进行胶回收。注：回收过程中最后一步洗脱时，使用DEPC H2O洗脱。
f)使用NanoDrop(NANODROP ONE，Thermo Scientific)标定dsDNA的含量。
g)真空旋干，加入DEPC H2O复溶至0.1mg/mL。
(13)按照前文相关步骤进行转录和RNA回收，所得RNA即为第一轮筛选产物文库。
3、第二轮RNA核酸适体筛选
为了进一步提升核酸适体的亲和力和特异性，保证筛选能够成功获取RNA适体，本发明进行了第二轮筛选。在第二轮筛选过程中适当增加筛选压力：包括减少靶细胞数量，减少细胞孵育时间，增加洗涤次数。其余操作同第一轮筛选。完成第二轮筛选并通过RT-qPCR表征后，将第二轮的PCR产物用于高通量测序。
4、RT-qPCR表征、UMI建库以及高通量测定
(1)RT-qPCR表征
为了表征所得的筛选产物文库与靶细胞的结合情况，在完成两轮的筛选后，使用RT-qPCR的方法进行了表征：
a)准备RNA链：该实验中，使用到的RNA筛选序列包括一条随机序列(Random RNA)和上述步骤获得的第二轮RNA筛选产物文库(记为R2 Lib)，所用序列均已进行了变复性。其中，Random RNA为一条已知序列的RNA，其与HCT-8细胞有一定程度的结合，通过测序，我们发现该序列也出现在测序结果中，即表3中的HCTRNA-1。
b)准备靶细胞：使用无酶消化液消化靶细胞(HCT-8细胞，培养至汇合度90％，贴壁状态良好)，经洗涤缓冲液洗涤两次、结合缓冲液重悬、活细胞计数仪计数后，得到细胞悬液
c)孵育：4℃下，将300pmol Random RNA或R2-lib分别与50万靶细胞孵育30min，完成后洗涤两次。
d)RNA提取：使用TRIzol裂解细胞并用酚氯仿抽提、乙醇沉降的方法提取RNA，具体操作与筛选中孵育结束后提取RNA一致。提取完成后，将旋干的RNA使用50μLDEPC H2O复溶，并使用NanoDrop标定RNA的含量。
e)取相同量的RNA，以LibDD下游引物(SEQ ID No.8)作为逆转录引物，使用第一链cDNA合成试剂盒(E6560S，NEB)，根据试剂说明书逆转录得到cDNA。
f)使用得到的cDNA进行qPCR，计算Ct值。该步骤中，共包含R2-lib、Random RNA和水空白对照3个样本，每个样本设置6个重复；所用仪器为96(Roche)，所用引物对与前述PCR所用引物对相同(即LibDD上、下游引物)，所用荧光染料为EvaGreen(M9021，杭州麦伯生物技术有限公司)；实验结束后，使用仪器配套软件进行数据处理。
如图2(数据处理时，每个重复去除最大值和最小值，故图示数据仅显示实际使用的4个重复)所示，R2-lib的平均Ct值为16.06，远小于Random RNA的平均Ct值24.78，,表明第二轮RNA筛选文库中有比随机序列(Random RNA)更强的能特异性结合靶细胞(HCT-8细胞)的序列。
(2)UMI建库
基于RNA的特点，在进行DNA测序前，我们增添了额外的文库构建步骤。该步骤中，我们将第二轮RNA筛选产物文库(R2 Lib)与靶细胞(HCT-8细胞)进行孵育后，分选活细胞，并使用UMI文库作为引物进行逆转录，得到的cDNA经PCR后交由公司进行测序。其中，UMI文库的序列为：5′-TGGTGCGAATTCTGAGAGGT-N30-AGGT-TCGGGCG AGTCGTCTG-3′(SEQ IDNo.9)；其中，N30表示30个连续的N(N表示A、T、C、G随机任一碱基)，文库中每种序列仅含有一个拷贝。通过逆转录添加UMI序列的方式，我们力求减少PCR偏好扩增等对测序的影响，尽可能真实的反映RNA与靶细胞的结合差异。该部分的操作包括：
a)使用第二轮RNA筛选文库，按步骤(1)中相关步骤孵育结束后，使用200μL洗涤缓冲液重悬细胞。
b)使用流式细胞分选仪(MoFlo Astrios EQS，Beckman Coulter)进行活细胞分选。
c)按前文相关步骤提取RNA。
d)使用第一链cDNA合成试剂盒(E6560S，NEB)，以特异性的UMI文库作为引物，根据试剂说明书逆转录得到cDNA。
e)PCR扩增并用8％核酸变性PAGE胶检验目的条带。
本过程中，PCR扩增使用的引物为LibDD上游引物和UMI文库上游引物，即使用建库5×Mix进行实验。
(3)高通量测定
PCR扩增反应后，选择无非特异性条带、目的条带清晰、泳道明亮的PCR条带进行扩增。扩增后由杭州瑞普基因科技有限公司测序。
高通量测序完成后，使用Python对数据进行初步处理。一条有效的序列应该同时包含完整的LibDD ssDNA文库序列结构(上下游固定区段、中间的随机序列区段)、用于区分不同UMI文库的四个碱基组成的barcode序列(本发明中即为AGGT)、用于区分同一个UMI文库中不同序列的UMI文库随机区(N30)及上游固定序列互补序列。在分析过程中，首先去除掉序列两端的固定序列，即LibDD ssDNA文库序列上游固定区段和UMI文库上游固定序列互补序列。随后根据LibDD ssDNA文库序列下游固定区段前十个碱基序列进行切割，并根据后半段序列中是否包含barcode进行数据拆分，统计包含有barcode的数据中对应前半段各序列出现的次数并输出结果。值得注意的是，为了尽可能反映与细胞结合的RNA的真实情况，无论测序中单条有效序列的count数值为多大，在拆分后进行统计时，都视为出现一次。统计完成后的核酸序列中前十条序列的分布如表3所示，随机序列的长度大部分都集中在40个碱基左右，与设计的文库序列相符。
表3、HCT-8细胞RNA适体筛选第二轮测序结果
名称 序列(此处省略了两端固定序列区域) 长度 拷贝数 排序
HCTRNA-1 5′-GAUGAACCGAACGCCGGGUUAAGGCGCCCGAUGCCGACGCUCAU-3′ 44 1739 1
HCTRNA-2 5′-CGUAUGCCCUUAUGGUGGUUUUGGGUGUGCGCCGUGUUGCC-3′ 41 1365 2
HCTRNA-3 5′-GCACCAGAGGGGUAUGAUCAGUAAGUUGCUGGUUGUGCCC-3′ 40 1332 3
HCTRNA-4 5′-GUCACCAGAGGUCUCGCGUGAGUAAUAGUUACCGCGUGGC-3′ 40 1269 4
HCTRNA-5 5′-CACACCCCGUUGAGUAUAUUUGGGGUGGGUCCGUUGUGGG-3′ 40 1239 5
HCTRNA-6 5′-UCAGACGGCUGUUAUAGGCUGUCUGGCCGUUAUCGGGGUG-3′ 40 1048 6
HCTRNA-7 5′-CAUGUUUAAGGACAGGUUAGUGCCGCACUUGUUCCGUGUG-3′ 40 991 7
HCTRNA-8 5′-CACCACACUCUUAAGUGUAGGGUUGGAGGUGCUGUGGGUG-3′ 40 964 8
HCTRNA-9 5′-CCCAUGGUGAUAAAAGUGGGUCGUGUUGAUCCGUGGUGUG-3′ 40 960 9
HCTRNA-10 5′-GUAGUCCACCGUGGGGUACUCUAUUGUUCGUAGGGUGCCC-3′ 40 951 10
实施例2、HCT-8核酸适体候选者的表征
1、核酸适体候选者与靶细胞的结合
如表3和图3中A，根据高通量测序的测序情况，根据序列富集度及同源性分析，我们挑选了5条潜在的核酸适体序列。根据其可能的二级结构，我们对其进行了初步的截短，截短后的序列见表4，其拟合的结构如图3中C所示。将适体于5′末端标记上异硫氰酸荧光素(FITC)，通过流式细胞术，我们测定了它们与靶标细胞(HCT-8细胞)的结合情况。其中，流式细胞术的具体操作步骤如下：
(1)核酸序列准备：将核酸适体RNA(冻干粉，由苏州贝信生物技术有限公司合成)或对照序列(DNA，冻干粉，由上海生工生物科技有限公司合成)以8,000×g转速于室温下离心1min，使用DPBS溶解并用NanoDrop定量至5μmol·L-1。将定量好的候选核酸适体按以下步骤进行变复性：a)95℃，5min；b)冰上，5min；c)室温，10min。根据核酸序列数取用1.5ml洁净EP管并做好相应标记(每种序列一个)，分别取4μl核酸序列于对应的EP管，4℃避光暂存，余下的核酸序列分装成50μl/管后置于-80℃保存，在后续的流式细胞术及其他实验中可以直接使用。
注：在该步骤中涉及到的对照序列(Random Sequence)为：cg gcg act tcc actgag tgg ctg ggt agg ggt agg cgg gtt agg gtg tgt cgt cg。若无特别说明，本实施例中所有涉及到的对照序列均为该序列。
(2)细胞准备：使用无酶消化液消化靶细胞(HCT-8细胞，培养至汇合度90％，贴壁状态良好)，经洗涤缓冲液(参见实施例1，下同)洗涤两次、结合缓冲液(参见实施例1，下同)重悬、活细胞计数仪计数后，得到细胞悬液。根据计数结果，补充结合缓冲液至细胞浓度为3×105个/96μl。
(3)孵育：分别取96μl细胞悬液于步骤(1)所述的各EP管中，轻微振荡混匀并于冰上孵育30min，每5min取出振荡混匀一次。
(4)洗涤：孵育完成后，离心，去上清，随后加入200μl洗涤缓冲液洗涤2次，完成后加入200μl洗涤缓冲液重悬细胞。
(5)上机检测：使用Attune NXT流式细胞仪(Thermo Scientific)进行检测。实验结束后，数据用FlowJo_V10软件处理。
如图3中B所示，五条序列在靶细胞HCT-8上都有不同程度的结合，表明筛选所得的五条序列都是HCT-8细胞的核酸适体。
表4、HCTRNA适体序列及亲和力
注：序列名称中的数字为测序的核酸适体丰度排名；核酸适体序列中C碱基和U碱基为2′-Fluoro修饰碱基。
2、核酸适体亲和力测定。
根据上述结果挑选出与靶细胞结合较好的四条序列：HCTrna-1a、HCTrna-2a、HCTrna-3a和HCTrna-4a，对其亲和力进行了表征。将不同浓度的核酸适体分别与3×105个HCT-8细胞在冰上孵育30min，细胞经离心、洗涤、重悬后，用流式细胞仪进行检测。流式细胞实验数据用FlowJo_V10软件处理，并用GraphPad Prism 9软件作图，横坐标X为RNA浓度(nM)，纵坐标Y为扣去细胞自发荧光值后的平均荧光强度。利用公式Y＝BmaxX/(KD+X)计算核酸适体的平衡解离常数KD，该计算中，Bmax为最大特异性结合时的平均荧光强度，与KD值同时被拟合输出。
如图3中D和表4所示，它们的平衡解离常数(KD值)分别为106.59±34.09nM、137.92±12.09nM、125.38±17.4nM和74.55±14.55nM，说明它们与靶细胞(HCT-8细胞)具有较强的亲和力。
3、共聚焦表征核酸适体候选者的结合情况
在使用胰酶消化并制备成细胞悬液后，使用计数仪计数，取10-20万HCT-8细胞于共聚焦皿中，加入2ml适宜的培养基后于37℃，5％ CO2环境培养24-48小时，至细胞完全贴壁且生长达70％-80％。取出共聚焦皿，加入DPBS洗涤三次，随后加入DPBS稀释的1×hochest于37℃染色15-20分钟。加入DPBS洗净染料，随后加入经结合缓冲液稀释的200nM的5′末端标记有FITC的RNA适体或对照序列，4℃孵育30min。使用洗涤缓冲液洗涤三次，并于常温下使用4％多聚甲醛固定。
使用尼康单光子共聚焦显微镜进行显微成像，获取FITC和hochest通道的荧光图像，使用NIS-Element Viewer和IMAGE J进行后期图像处理。结果如图3中E所示，相比于对照序列，其余四条序列的共聚焦图像上都观察到了荧光结合信号，表明四条序列都是HCT-8细胞的核酸适体。
4、核酸适体用于细胞的分子分型
进一步地，我们利用五条核酸适体在更多的细胞系上进行了流式细胞术表征，其中流式细胞术实验具体操作同前述相关内容。如图4所示，五条序列在SV-HUC-1和DC2.4细胞上的结合均不明显。HCTRNA-2a、HCTRNA-3a和HCTRNA-13a在多种癌细胞(MDA-MB-231、TOV21G、A549)上有较强的结合，在四种正常细胞系(HEK-293T、SV-HUC-1、C2C12、DC2.4)中结合相对弱或不明显，提示其结合靶标可能在癌细胞表面高表达。HCTRNA-1a和HCTRNA-4a在各个细胞系表面的表达存在差异性，提示其靶标可能在不同细胞中的差异表达。总之，我们的结果表明，通过寡轮/单轮RNA适体细胞筛选方法，我们可以同时得到多种不同靶标的核酸适体，这些核酸适体在正常细胞、不同来源的肿瘤细胞上有不同的结合模式，根据结合模式的不同，可以实现对正常细胞、不同来源肿瘤细胞的分子分型。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.成套核酸适体，由如下五个核酸适体中的全部或部分组成：
(A1)核酸适体1：SEQ ID No.1所示单链RNA分子；
(A2)核酸适体2：SEQ ID No.2所示单链RNA分子；
(A3)核酸适体3：SEQ ID No.3所示单链RNA分子；
(A4)核酸适体4：SEQ ID No.4所示单链RNA分子；
(A5)核酸适体5：SEQ ID No.5所示单链RNA分子；
所述部分为2个或2个以上核酸适体。
2.核酸适体，为如下五个核酸适体中的任意一个：
(A1)核酸适体1：SEQ ID No.1所示单链RNA分子；
(A2)核酸适体2：SEQ ID No.2所示单链RNA分子；
(A3)核酸适体3：SEQ ID No.3所示单链RNA分子；
(A4)核酸适体4：SEQ ID No.4所示单链RNA分子；
(A5)核酸适体5：SEQ ID No.5所示单链RNA分子。
3.根据权利要求1所述的成套核酸适体或权利要求2所述的核酸适体，其特征在于：所述核酸适体1中的C和U均经2′-氟代修饰；和/或
所述核酸适体2中的C和U均经2′-氟代修饰；和/或
所述核酸适体3中的C和U均经2′-氟代修饰；和/或
所述核酸适体4中的C和U均经2′-氟代修饰；和/或
所述核酸适体5中的C和U均经2′-氟代修饰。
4.成套核酸适体衍生物，其特征在于：所述成套核酸适体衍生物为对组成权利要求1或3所述成套核酸适体中的各个单一核酸适体均进行如下操作后所得：对所述单一核酸适体的一端或中间接上荧光素和/或抗肿瘤药物和/或放射性元素和/或生物酶和/或生物素和/或纳米材料，得到与所述单一核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物。
5.核酸适体衍生物，其特征在于：所述核酸适体衍生物为对权利要求2或3所述核酸适体的一端或中间接上荧光素和/或抗肿瘤药物和/或放射性元素和/或生物酶和/或生物素和/或纳米材料，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物。
6.一种用于识别并结合肠癌细胞的检测试剂，其有效成分为或包含权利要求1或3所述的成套核酸适体或权利要求4所述的成套核酸适体衍生物或权利要求2或3所述的核酸适体或权利要求5所述的核酸适体衍生物。
7.如下任一应用：
(B1)权利要求1或3所述的成套核酸适体或权利要求4所述的成套核酸适体衍生物或权利要求2或3所述的核酸适体或权利要求5所述的核酸适体衍生物在制备用于识别并结合肠癌细胞的产品中的应用或在识别并结合肠癌细胞中的应用；
(B2)权利要求1或3所述的成套核酸适体或权利要求4所述的成套核酸适体衍生物或权利要求2或3所述的核酸适体或权利要求5所述的核酸适体衍生物在制备肠癌病理研究产品中的应用；
(B3)权利要求1或3所述的成套核酸适体或权利要求4所述的成套核酸适体衍生物或权利要求2或3所述的核酸适体或权利要求5所述的核酸适体衍生物在制备肠癌诊断产品中的应用；
(B4)权利要求1或3所述的成套核酸适体或权利要求4所述的成套核酸适体衍生物或权利要求2或3所述的核酸适体或权利要求5所述的核酸适体衍生物在制备肠癌治疗产品中的应用；
(B5)权利要求1或3所述的成套核酸适体或权利要求4所述的成套核酸适体衍生物或权利要求2或3所述的核酸适体或权利要求5所述的核酸适体衍生物在制备用于对肠癌细胞进行成像的产品中的应用或在对肠癌细胞进行成像中的应用。
8.根据权利要求6所述的检测试剂或权利要求7所述的应用，其特征在于：所述肠癌细胞为结直肠细胞；所述肠癌为结直肠癌；
进一步地，所述结直肠癌细胞为人结直肠癌细胞HCT-8。
9.权利要求1或3所述的成套核酸适体或权利要求4所述的成套核酸适体衍生物在如下任一中的应用：
(C1)制备用于对正常细胞和不同来源肿瘤细胞进行分子分型的产品；
(C2)对正常细胞和不同来源肿瘤细胞进行分子分型。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述正常细胞选自如下：HEK-293T、SV-HUC-1、C2C12、DC2.4；和/或
所述不同来源肿瘤细胞选自：HCT-8、MDA-MB-231、TOV21G、A549。
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