CN113817740B

CN113817740B - 一种核酸适配体识别并结合ptprf及其相关功能的应用研究

Info

Publication number: CN113817740B
Application number: CN202010565222.3A
Authority: CN
Inventors: 上官棣华; 邴涛; 甄笑笑; 吕静
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2024-07-09
Anticipated expiration: 2040-06-19

Abstract

本发明公开了一种核酸适配体识别并结合PTPRF及其相关功能的应用研究。本发明提供了核酸适配体及其衍生物，该核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子；本发明通过筛选得到的核酸适配体具有高亲和力；无免疫原性；能够体外化学合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且序列稳定，易于保存；便于标记(不需要标记的二抗)等。采用本发明的核酸适配体检测受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F时，操作更为简单、迅速，并且本发明核酸适配体的合成成本较抗体制备成本低，周期短，重现性好。

Description

一种核酸适配体识别并结合PTPRF及其相关功能的应用研究

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种核酸适配体识别并结合PTPRF及其相关功能的应用研究。

背景技术

受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F(PTPRF，LAR)是一种重要的磷酸酶，可以催化酪氨酸残基去磷酸化，在调节细胞生长、分化和致瘤转化中发挥重要作用。PTPRF也被称为白细胞共同抗原相关蛋白，因为它最初被认为在白血病中起作用，它在非小细胞肺癌中过表达，但其在其他恶性肿瘤中的临床意义尚不清楚。与许多其他磷酸酶一样，PTPRF被报道通过靶向其下游底物参与细胞增殖和分化调控，被认为可以抑制肝癌的致癌作用，并通过下调PTPRF的表达来促进肿瘤的发展。

核酸和蛋白质一样，都是重要的生物大分子，它们不仅编码、储存和传递遗传信息，而且它具有与目标分子特异性结合的能力或催化能力等，因此这类核酸统称为功能核酸。1990年L.Gold和J.W.Szostak分别报道了在体外人工构建的短链核苷酸文库中筛选出能与噬菌体T4 DNA聚合酶和有机染料特异性结合的RNA配体，就是所说核酸适配体(aptamer)。核酸适配体是利用指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution ofligands by exponential enrichment，SELEX)从特定的寡核苷酸库中筛选出的对靶标有特异性相互作用的单链DNA(ssDNA)或RNA，长度一般为25-60个核苷酸。

“aptamer”这个词来源于拉丁语“aptus”，意思是“适合”，和希腊语词根“meros”，意思是“区域、范围”，中文翻译为酸适配体、核酸适配体、核酸适配子等。核酸适配体能与其相应的目标分子(靶标)结合，其结合模式与抗体抗原结合方式十分相似，由于核酸适配体在亲和力和特异性上都与单克隆抗体相当且可由体外化学合成制备，因此人们称之为可人工合成的“化学抗体(chemical antibody)”。核酸适配体具有高特异性和亲和力，它的分子基础是单链的核酸序列通过氢键、疏水键、范德华力、离子键等作用形成茎环、发夹、G－四聚体等热力学上较稳定的三维结构，进而能够特异性识别靶标分子并与之紧密地结合在一起。

核酸适配体作为一种新型的分子识别探针，其与抗体相比，具有与抗体相似的特性和独特的优势：

首先，核酸适配体能够形成一定的三维结构，通过空间构象的密切适应而与靶分子高特异性，高亲和力地结合。它的亲和力通常和所熟知的抗原与抗体之间的亲和力相当，亲和力都比较高。

其二，适配体的分子量与抗体相比很小，约为6-30KDa；而抗体的分子量比抗体大很多约为150KDa。另外，与抗体比起来，还可以快速方便的利用聚合酶链式反应即PCR，对适体进行酶学放大，便于进行一些分析检测实验。

第三，核酸适配体水溶性好、无毒性，在体内没有或者具有低的免疫原性，具有快速的组织穿透能力，而且其也容易被细胞内化。而抗体往往有很高的免疫原性，在组织穿透能力和细胞内化效率上也较低。

第四，与抗体相比，核酸适配体具有高的热稳定性和化学稳定性，对湿度、酸碱度、离子强度等有很好的耐受程度，可以很方便的进行常温运输，也可以反复的变性复性不易受环境的影响，常用的核酸适配体冻干粉储存在零下二十度的冰箱中可以达到几年不受影响。在这方面来说，抗体容易发生不可逆的变性，一般需要储存在零下八十度的冰箱中。

第五，核酸适配体易于设计优化、化学修饰等。例如它非常容易地偶联FAM、cy3、cy5等各种荧光基团、生物素以及放射性同位素等，用于流式细胞术或者共聚焦荧光显微镜等的分析。对抗体而言，修饰起来比较困难，修饰成本很高，对实验的设计会有很大的限制。

第六，核酸适配体的筛选在体外进行，生产采用的是固相合成技术，这种生产技术的优势在于，一旦测定出了适配体碱基序列，就可使用核酸设备仪器快速方便的合成，生产的批间差异小，产品的均一性高，生产的成本也很低。而抗体是利用哺乳动物细胞系统产生，生产起来要数天至数月，不仅批间差异大，而且生产成本很高，耗时耗力。

第七，在识别靶点上，抗体仅能识别具有免疫原性的靶标，识别靶点较单一。而核酸适配体具有广泛的识别靶点，比如可以筛选识别离子、多肽、小分子化合物、蛋白质、核酸、病毒、细菌、细胞和组织等的核酸适配体，与抗体相比，占有绝对的优势，具有很好的应用前景。

核酸适配体基于自身的性质及优势，在很多方面都得到了应用，包括在亲和分离方面、生物传感方面、分子器件方面、成像方面、诊断方面、靶向运输治疗肿瘤、药物领域及生物标志物的发现等。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种核酸适配体。

本发明提供的核酸适配体，为如下A1)-A7)中任一种：

A1)序列3所示的单链DNA分子；

A2)将A1)所示的核酸适配体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

A3)将A1)或A2)所示的核酸适配体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

A4)将A1)或A2)所示的核酸适配体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

A5)由A1)或A2)所示的核酸适配体编码的RNA分子，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物；

A6)由A1)或A2)所示的核酸适配体编码的肽核酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

A7)将A1)-A6)任一所示的核酸适配体的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/或功能基团和/放射性核素，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物。

上述A3)中的所述修饰为磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。

上述A7)中的所述功能基团为荧光基团、生物素基团、放射性物质、治疗性物质、地高辛、纳米发光材料或酶标记。

上述A2)所示的核酸适配体为如下1)-4)中任一种：

1)序列1所示的单链DNA分子；

2)序列2所示的单链DNA分子；

3)序列4所示的单链DNA分子；

4)序列3所示的单链DNA分子，且5'末端起第1-4位和3'末端起第1-4位核苷酸进行硫代修饰。

上述核酸适配体在如下B1-B21至少一种中的应用也是本发明保护的范围：

(B1)识别并结合或辅助识别并结合受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F；

(B2)识别并结合或辅助识别并结合表达受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F的细胞；

(B3)制备识别并结合或辅助识别并结合受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F产品；

(B4)制备识别并结合或辅助识别并结合表达受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F的细胞产品；

(B5)识别或辅助识别受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白；

(B6)结合或辅助结合受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白；

(B7)捕获或提取待测样品中的受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白；

(B8)制备捕获或提取待测样品中的受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白产品；

(B9)制备识别或辅助识别受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白产品；

(B10)制备结合或辅助结合受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白产品；

(B11)检测或辅助检测待测样品中是否含有受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白；

(B12)制备检测或辅助检测待测样品中是否含有受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白的产品；

(B13)检测或辅助检测待测品中受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白含量；

(B14)制备检测或辅助检测待测样品中受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白含量的产品；

(B15)检测或辅助检测表达受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白的肿瘤或肿瘤细胞；

(B16)制备检测或辅助检测表达受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白的肿瘤或肿瘤细胞的产品；

(B17)识别或辅助识别肿瘤或肿瘤细胞；

(B18)结合或辅助结合肿瘤或肿瘤细胞；

(B19)制备识别或辅助识别肿瘤或肿瘤细胞的产品；

(B20)制备结合或辅助结合肿瘤或肿瘤细胞的产品；

(B21)用于制备靶向受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白的药物。

上述应用中，所述待测样品为细胞或其他组织；

或所述肿瘤为人唾液腺腺样囊性癌、人肺腺癌、乳头状复苏形式人甲状腺癌、人前列腺癌、人乳腺癌、人黑色素瘤、人膀胱癌、耐紫杉醇人乳腺癌、急性T细胞白血病、人子宫颈癌或人结直肠癌。

上述应用中，所述细胞为人唾液腺腺样囊性癌细胞(如SACC-LM、SACC-83细胞)、人肺腺癌细胞(A549细胞)、乳头状复苏形式人甲状腺癌细胞(BCPAP细胞)、人前列腺癌细胞(如DU145、PC3细胞)、人乳腺癌细胞(MCF-7细胞、MCF-7R)、人黑色素瘤细胞(A375细胞)、人膀胱癌细胞(T24细胞)、急性T细胞白血病细胞(Jurkat)、人子宫颈癌细胞(HeLa细胞)或人结直肠癌细胞(Colo205、LoVo)。

上述应用中，所述表达受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白的肿瘤或肿瘤细胞为受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白表达高的肿瘤或肿瘤细胞(如人唾液腺腺样囊性癌细胞或人前列腺癌细胞)。

上述应用中，所述产品为试剂盒或探针或靶向物质。

本发明另一个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，其包括上述的核酸适配体。

上述产品中，该产品具有如下C1)-C11)中至少一种：

(C1)识别并结合或辅助识别并结合受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F；

(C2)识别并结合或辅助识别并结合表达受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F的细胞；

(C3)识别或辅助识别受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白；

(C4)结合或辅助结合受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白；

(C5)捕获或提取待测样品中的受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白；

(C6)检测或辅助检测待测样品中是否含有受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白；

(C7)检测或辅助检测待测品中受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白含量；

(C8)检测或辅助检测表达受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白的肿瘤或肿瘤细胞；

(C9)识别或辅助识别肿瘤或肿瘤细胞；

(C10)结合或辅助结合肿瘤或肿瘤细胞；

(C11)用于制备靶向受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白的药物。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过筛选得到的核酸适配体具有高亲和力；无免疫原性；能够体外化学合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且序列稳定，易于保存；便于标记(不需要标记的二抗)等。采用本发明的核酸适配体检测受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F时，操作更为简单、迅速，并且本发明核酸适配体的合成成本较抗体制备成本低，周期短，重现性好。

通过以下的详细说明和所附权利要求书将更明确本发明的其它特征和实施方式。

附图说明

图1为筛选获得的核酸适配体1与SACC-LM细胞、DU145的细胞和U87细胞的结合情况。

图2为核酸适配体3的衍生物与其竞争情况。

图3为核酸适配体3与不同细胞孵育结合的细胞流式结果图；包含如下18种细胞株：SACC-LM细胞、SACC-83细胞、A549(人肺腺癌细胞)、A2780T(人卵巢癌细胞紫杉醇耐药株)、DU145(人前列腺癌脑转移细胞)、PC3(人前列腺癌骨转移细胞)、Jurkat(急性T细胞白血病细胞，JK)、T24(膀胱癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、MCF-7R(耐紫杉醇人乳腺癌细胞)、LoVo(人结直肠癌细胞)、Colo205(人结直肠癌细胞)、BCPAP(乳头状复苏形式人甲状腺癌细胞)、A375(人黑色素瘤细胞、U87(人胶质瘤细胞)、HCT116(结肠癌细胞)、HeLa(人子宫颈癌细胞)、SMMC7721(人肝癌细胞)和RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)。

图4为siRNA干扰人前列腺癌脑转移细胞DU145细胞表达受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F分子蛋白后，核酸适配体ZAJ-4b对DU145细胞染色的流式细胞实验结果和Westernblot分析结果。

图5为激光共聚焦显微镜分析DU145细胞与核酸适配体ZAJ-4b结合情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的核酸序列均由上海生工生物工程股份公司合成。

下述实施例中的受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F抗体(anti-PTPRF/LAR)是SantaCruz.公司的产品，产品目录号为sc-135969。

下述实施例中的抗体同型对照(normal mouse IgG₁)是ANTA CRUZ公司的产品，产品目录号为sc-3877。

下述实施例中的siRNA是苏州吉玛基因股份有限公司的产品。

下述实施例中的结合缓冲液(pH＝7.4)：137mM NaCl、5mM MgCl₂、2.7mM KCl、2mMKH₂PO₄、10mM Na₂HPO₄，25mM葡萄糖，1μg/mL BSA，0.1μg/mL鲱鱼精DNA和0.01％(v/v)吐温-80，余量为水。

下述实施例中的洗涤缓冲液(pH＝7.4)：137mM NaCl、5mM MgCl₂、2.7mM KCl、2mMKH₂PO₄、10mM Na₂HPO₄和25mM葡萄糖，余量为水。

下述实施例中的PBS缓冲液(pH＝7.4)：137mM NaCl、5mM MgCl₂、2.7mM KCl、2mMKH₂PO₄、10mM Na₂HPO₄，余量为水。

A549(人肺腺癌细胞，资源编号：3111C0001CCC000002)、DU145(人前列腺癌脑转移细胞，资源编号：3111C0001CCC000006)、PC3(人前列腺癌骨转移细胞，资源编号：3111C0001CCC000115)、Jurkat(急性T细胞白血病细胞，，资源编号：3111C0001CCC000075)、T24(膀胱癌细胞，资源编号：3111C0001CCC000295)、LoVo(人结直肠癌细胞，资源编号：3111C0001CCC000164)、A375(人黑色素瘤细胞，资源编号：3111C0001CCC000126)、U87(人胶质瘤细胞，资源编号：3111C0001CCC000208)、HeLa(人子宫颈癌细胞，资源编号：3111C0001CCC000011)、SMMC7721(人肝癌细胞，资源编号：3111C0001CCC000087)、Colo205(人结直肠癌细胞，资源编号：3111C0001CCC000132)和RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，资源编号：3111C0001CCC000146)购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。MCF-7(人乳腺癌细胞，资源编号：3142C0001000001079)购自中国典型培养物保藏中心细胞库，MCF-7R(耐紫杉醇人乳腺癌细胞)购自购自上海艾研生物科技有限公司。BCPAP(乳头状复苏形式人甲状腺癌细胞，资源编号：BNCC100390)购自北纳创联生物技术有限公司。A549T(人肺腺癌耐药细胞，货号：KG354)购自江苏凯基生物技术股份有限公司；A2780T(人卵巢癌细胞紫杉醇耐药株，货号：MZ-1999)购自宁波明舟生物科技有限公司。

下述实施例中的siRNA溶解液：DEPC水。

实施例1、核酸适配体的筛选和制备

一、唾液腺腺样囊性癌细胞的培养

具有肺转移潜能的唾液腺腺样囊性癌细胞(SACC-LM)和唾液腺腺样囊性癌细胞(SACC-83)(均由北京大学口腔医院王衣祥老师惠赠，记载在如下文献中：Dong,L.；Wang,Y.X.；Li,S.L.；Yu,G.Y.；Gan,Y.H.；Li,D.；Wang,Y.,TGF-beta 1Promotes Migration andInvasion of Salivary Adenoid Cystic Carcinoma.J Dent Res 2011,90(6),804-809.)用RPMI 1640(含10％胎牛血清、1％青/链霉素)培养基，在培养箱中进行常规培养(37℃，5％CO₂)，每两天传代一次。

二、随机核酸文库的设计

设计如下两端包括20个固定核苷酸、中间包括45个核苷酸的随机文库：5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-N₄₅-TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’；其中，N₄₅代表45个A、T、C或G的随机核苷酸序列。

三、核酸适配体的筛选

1、文库预处理

将9nmol随机核酸文库(步骤二中合成)溶于结合缓冲液，95℃变性5min，冰上冷却10min，室温复性放置15min，得到预处理后的ssDNA库。

2、反筛

在第2-10轮与靶标细胞(具有肺转移潜能的唾液腺腺样囊性癌细胞，SACC-LM)孵育前，取一皿唾液腺腺样囊性癌细胞(SACC-83)，将预处理后的ssDNA库(随着筛选压力增加而降低DNA量)加入细胞中，4℃振荡孵育1h(随筛选轮数增加而逐渐增加孵育时间)。

3、正筛

将反筛过程得到上清液与具有肺转移潜能的唾液腺腺样囊性癌细胞(SACC-LM)在4℃振荡孵育1h(随筛选轮数增加而逐渐减少孵育时间)。再用洗涤缓冲液清洗细胞几次之后，加双蒸水用细胞刮将细胞刮下来，将刮下的细胞悬液于95℃加热5min，洗脱结合在具有肺转移潜能的唾液腺腺样囊性癌细胞(SACC-LM)上的ssDNA。然后将洗脱下来的ssDNA进行PCR扩增。PCR扩增的引物为：

5’-FAM-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3’；

5’-Biotin-ACCACGACGACACACCCTAA-3’。

PCR扩增程序：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，10个循环；72℃，5min。

用链霉亲和素琼脂糖球从PCR产物中分离得到FAM标记的单链DNA(ssDNA)序列。将得到的ssDNA用NAP-5柱子(通用电气医疗集团，瑞典)脱盐，真空干燥，用于下一轮的筛选。

为了提高核酸适配体的亲和力和特异性，在筛选过程中逐步增加洗涤次数、减少正筛细胞SACC-LM和增加反筛细胞SACC-83的细胞数量，以增加筛选的压力。10轮筛选后，以筛选产物为模板通过引物(5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3’和5’-ACCACGACGACACACCCTAA-3’)进行PCR扩增，将第10轮PCR产物进行测序。最终选择的核酸适配体1，如下：

5‘-AAGGAGCAGCGTGGAGGATATAGGTTGGCTTAGGTGGCTTTGCGTTGGGTGTGGTGCATATCCTT AGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’(序列1)。

4、核酸适配体1特异性结合检测

序列1所示的核酸适配体1的5'末端标记FAM基团，再用结合缓冲液溶解。

对照核酸序列L45(核苷酸序列：NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN)5'末端标记FAM基团，用结合缓冲液溶解。

它们分别依据紫外吸收标定浓度(2μM)后，95℃加热5min，冰上放置10min，室温放置15min，分别得到核酸适配体1-FAM溶液和对照核酸序列L45-FAM溶液。

将上述5’荧光染料修饰的核酸适配体1，考察它与SACC-LM细胞、DU145细胞和U87细胞的结合能力，具体如下：取对数生长期SACC-LM细胞、DU145细胞和U87细胞，用含0.2％EDTA的PBS消化成单分散细胞悬液后平均分成若干份，分别与核酸适配体1-FAM溶液(200nM)和对照核酸序列L45-FAM溶液(200nM)孵育30min后，用洗涤缓冲液洗涤两遍，用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪测定细胞表面的荧光强度。

结果如图1所示，核酸适体1可以特异性结合SACC-LM细胞和DU145细胞，而不结合U87细胞，说明核酸适配体1是一个特异性的核酸适配体。

四、核酸适配体与DU145细胞的亲和力测定

1、核酸适配体截短体

步骤三得到的核酸适配体1较长，经结构分析后，设计并合成一系列经截短的核酸序列，通过荧光染料修饰，然后考察它们与DU145细胞的结合能力，挑选结合能力最强的序列用于进一步的应用，优化后的序列长度只有48-85个核苷酸。

最终得到的截短核酸适配体序列和修饰的序列如下：

核酸适配体2(又称为核酸适配体ZAJ-4a)：

5’-GTGGAGGATATAGGTTGGCTTAGGTGGCTTTGCGTTGGGTGTGGTGCATATCC-3’(序列2)；核酸适配体2是将核酸适配体1序列去掉由5’端到3’端的第1-10个和由3’端到5’端第1-20个碱基，且其他碱基保持不变得到的核苷酸序列。

核酸适配体3(又称为核酸适配体ZAJ-4b)：

5’-GGATATAGGTTGGCTTAGGTGGCTTTGCGTTGGGTGTGGTGCATATCC-3’(序列3)；核酸适配体3是将核酸适配体1序列去掉由5’端到3’端的第1-15个碱基和由3’端到5’端第1-20个碱基，且其他碱基保持不变得到的核苷酸序列。

核酸适配体4：

5’-TGGAGGATATAGGTTGGCTTAGGTGGCTTTGCGTTGGGTGTGGTGCATATCCTCCA-3’(序列4)；核酸适配体4是在核酸适配体3序列的5’端加上TGGA，3’端加上TCCA，且其他碱基保持不变得到的核苷酸序列。

核酸适配体5是将核酸适配体3序列中部分碱基硫代修饰，其中sA，sT,sG，sC分别为硫代修饰，

5’-sGsGsAsTATAGGTTGGCTTAGGTGGCTTTGCGTTGGGTGTGGTGCATsAsTsCsC-3’。

2、核酸适配体截短体亲和力检测

取对数生长期的DU145细胞，用含0.2％EDTA的PBS消化成单分散细胞悬液后平均分成若干份，分别与标记荧光分子的核酸适配体探针溶液孵育30min后，用洗涤缓冲液洗涤两遍，用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪测定细胞表面的荧光强度。以细胞表面平均荧光强度和核酸适配体浓度作图，利用公式Y＝B_maxX/(K_d+X)计算核酸适配体的平衡解离常数K_d，用来表示亲和力的大小。

各个标记荧光分子的核酸适配体探针为将上述各个核酸适配体的5'末端标记FAM基团，得到各个标记荧光分子的核酸适配体探针。

上述标记荧光分子的核酸适配体探针溶液按照如下方法制备：用结合缓冲液溶解各个标记荧光分子的核酸适配体探针，依据紫外吸收标定浓度后，95℃加热5min，冰上放置10min，室温放置15min，得到变性-再复性后的DNA；再用结合缓冲液稀释成终浓度0nmol/L，5nmol/L，10nmol/L，20nmol/L，50nmol/L，100nmol/L和200nmol/L浓度梯度的DNA溶液，得到各个标记荧光分子的核酸适配体探针溶液。

结果如下：

核酸适配体2(又称为核酸适配体ZAJ-4a)用DU145细胞测得其平衡解离常数为3.3±1.2nM。

核酸适配体3(又称为核酸适配体ZAJ-4b)用DU145细胞测得其平衡解离常数为1.3±0.7nM。

核酸适配体4用DU145细胞测得其平衡解离常数为4.6±1.3nM。

核酸适配体5用DU145细胞测得其平衡解离常数为3.7±1.6nM，经测定硫代修饰的核酸适配体仍然保持很好的亲和力。

上述结果表明，核酸适配体2-5均可结合DU145细胞；其中核酸适配体3(ZAJ-4b)的平衡解离常数最小，表明其亲和力最高。

五、核酸适配体3(ZAJ-4b)衍生物与核酸适体ZAJ-4b的竞争

将荧光素标记的核酸适配体ZAJ-4b(ZAJ-4b，100nM)分别与如下物质混合：未标记荧光分子的ZAJ-4b核酸适配体、核酸适配体1、核酸适配体2、核酸适配体4、核酸适配体5和对照核酸序列L45(4μM)混合，分别加入约5×10⁴个DU145细胞数，分别得到混合液，将混合液在冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤两遍，过400目筛网后，上流式细胞仪进行检测。

对照核酸序列L45的核苷酸序列：NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN。

结果如图2所示，未标记荧光核酸适配体3(ZAJ-4b)和其他其未标记荧光素的核酸适配体1、2、4、5都能够与荧光素标记的核酸适配体3竞争性与目标细胞结合，而对照序列L45无任何竞争，说明核酸适配体1、2、4、5作为核酸适配体3的衍生物，均具有与核酸适配体3相同的功能。

实施例2、核酸适配体3(又称为核酸适配体ZAJ-4b)特异性识别并结合受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F

一、同位素标记的SACC-LM细胞及核酸适配体3衍生物的制备

1、同位素标记的细胞的制备

重型同位素标记的SACC-LM细胞按照如下方法制备：在含重型同位素标记的赖氨酸([¹³C₆,¹⁵N₂]-L-赖氨酸)和重型同位素标记的精氨酸([¹³C₆]-L-精氨酸)的RPMI 1640的培养基(Thermo公司，培养基货号：89982)中培养SACC-LM细胞6-7天后获得备用；

轻型同位素标记的SACC-LM细胞按照如下方法制备：在含轻型同位素标记的赖氨酸([¹²C₆,¹⁴N₂]-L-赖氨酸)和轻型同位素标记的精氨酸([¹²C₆]-L-精氨酸)的RPMI 1640的培养基(Thermo公司，培养基货号：89982)中培养SACC-LM细胞6-7天后获得备用。

2、核酸适配体3衍生物的制备

(1)生物素标记的核酸适配体3

生物素标记的核酸适配体3溶液为在核酸适配体3的5’端偶联生物素基团得到，再用结合缓冲液溶解，依据紫外吸收标定浓度(200nM)后，95℃加热5min，冰上放置10min，室温放置15min，得到生物素标记的核酸适配体3溶液。

(2)生物素标记的对照核酸序列L45(L45-Bio)

生物素标记的对照核酸序列L45(L45-Bio)溶液为在对照核酸序列L45的5’端偶联生物素基团Bio，再用结合缓冲液溶解，依据紫外吸收标定浓度(200nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min，得到L45-Bio溶液。

对照核酸序列L45的核苷酸序列：TTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN。

二、核酸适配体3特异性识别并结合受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F的质谱鉴定

1、核酸适配体3靶标蛋白的提取

(1)分别取2×10⁸个指数生长期的重型同位素标记的SACC-LM细胞和轻型同位素标记的SACC-LM细胞，PBS洗涤后，分别与生物素标记的核酸适配体3(200nM)溶液和生物素标记的对照核酸序列L45(200nM)溶液孵育30分钟，然后加入甲醛固定10分钟。

(2)PBS洗涤2遍，加入1mL的细胞裂解液(R0278，Sigma公司)，孵育1小时。

(3)2000rpm离心去除沉淀，收集上清，加入链霉亲和素修饰的琼脂糖微球(GE公司，货号：17-5113-01)，孵育1小时，收集微球，得到各种带有靶标蛋白的链霉亲和素修饰的琼脂糖微球。

(4)用PBS洗涤上述步骤(3)孵育后各种带有靶标蛋白的链霉亲和素修饰的琼脂糖微球，洗涤5次，分别得到生物素标记的核酸适配体3提取的结合重型同位素标记的蛋白微球、生物素标记的对照核酸序列L45提取的结合轻型同位素标记的蛋白微球、生物素标记的核酸适配体3提取的结合轻型同位素标记的蛋白微球和生物素标记的对照核酸序列L45提取的结合重型同位素标记的蛋白微球。

2、正向和反向实验

(1)正向实验：将生物素标记的核酸适配体3提取的结合重型同位素标记的蛋白微球与生物素标记的对照核酸序列L45提取的结合轻型同位素标记的蛋白微球混合，得到生物素标记的核酸适配体3提取的结合重型同位素标记的蛋白微球和生物素标记的对照核酸序列L45提取的结合轻型同位素标记的蛋白微球的混合体系。

(2)反向实验：将生物素标记的核酸适配体3提取的结合轻型同位素标记的蛋白与生物素标记的对照核酸序列L45提取的结合重型同位素标记的蛋白混合，得到生物素标记的核酸适配体3提取的结合轻型同位素标记的蛋白微球和生物素标记的对照核酸序列L45提取的结合重型同位素标记的蛋白微球混合体系。

3、蛋白的PAGE电泳

将上述正向实验的混合体系和反向实验的混合体系分别加入10μL SDS上样缓冲溶液(碧云天，货号：P0015)，在95℃加热10min。然后上样，用10％SDS-PAGE胶在150V电压下，15min，蛋白电泳距离大概1cm左右。

4、蛋白的胶酶解和LC-MS鉴定

(1)DTT还原：将电泳后的各PAGE胶样品切成1mm左右的小块，用50％的乙腈/水溶液脱色，然后入500μL 20mM二硫苏糖醇(DTT，溶于50mM NH₄HCO₃水溶液)，56℃反应45min。

(2)IAA烷基化：将步骤(1)的产物离心(200g，1min)，弃上清(去除DTT)，向沉淀中分别加入500μL 55mM碘乙酰胺(IAA，溶于50mM NH₄HCO₃水溶液)，在25℃避光反应30min。

(3)将步骤(2)的产物离心，弃上清(去除IAA)，向沉淀中加入5μg质谱用胰蛋白酶(Promega公司，产品目录号：V5111)，37℃酶切过夜，得到酶切后的多肽。

(4)酶切后的多肽经过真空浓缩后，加入100uL水，利用Ziptip C₁₈微柱(ThermoFisher公司，货号：87782)脱盐。质谱分析前，放置-20℃冰箱保存。

(5)利用LTQ-OrbitrapVelos质谱仪(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)对步骤(4)的产物进行分析鉴定，得到原始的质谱数据。

(6)数据搜索分析

利用MaxQuant搜索引擎(版本号：1.6.1.0)将步骤(5)获得的原始的质谱数据在Uniprot蛋白数据库中进行检索。数据库搜索的一些参数如下：固定化修饰为半胱氨酸上的烷基化修饰，可变修饰为甲硫氨酸上的氧化修饰和蛋白质N端的乙酰化修饰。允许2个漏切位点，母离子容错量为20ppm，MS/MS碎片离子质量误差为0.5Da。候选蛋白需在正向实验和反向实验中同时被鉴定出。

结果如表1所示：SILAC(稳定同位素标记技术)实验鉴定出93个有效蛋白，只有受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F(Receptor-type tyrosine-protein phosphatase F)在正向实验和反向实验中核酸适配体3/对照序列L45的比值大于10。

上述结果说明，核酸适配体3可以特异性的结合受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F，并用于受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F的分离提取。

表1、利用SILAC鉴定出的核酸适配体3的受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F

实施例3、核酸适配体3检测siRNA干扰DU145细胞受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F分子蛋白的表达水平

一、核酸适配体3衍生物及siRNA干扰后的DU145细胞的制备

1、荧光素分子标记的核酸适配体3的制备

荧光素标记的核酸适配体3溶液为在核酸适配体3的5’端偶联荧光素基团FAM得到的，用结合缓冲液溶解荧光素(FAM)标记的核酸适配体3，依据紫外吸收标定浓度(20μM)后，95℃加热变性5min，冰上放置10min，室温放置15min。

2、siRNA干扰后的DU145细胞的制备

(1)转染试剂的制备

受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F分子蛋白的siRNA L1CAM，正义链：

5’-CCAAGAACCGGGCUGGCUUTT；反义链：5’-AAGCCAGCCCGGUUCUUGGTT-3’；

siRNA阴性对照序列NC,正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；反义链：

5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’；

上述均合成于苏州吉玛基因股份有限公司。

将上述siRNA L1CAM和siRNA阴性对照序列NC均用DEPC水溶解配制成20μM的母液，再加入转染试剂，分别得到含有siRNA序列(PTPRF)的转染试剂和含有对照RNA序列(NC)的转染试剂。

上述转染试剂为脂质体转染试剂盒(RNAiMAX转染试剂)是ThermoFisher Scientific公司的产品。

(2)siRNA干扰后的DU145细胞的获得

人前列腺癌细胞DU145细胞(产品编号：3111C0001CCC000006)购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，均匀地铺种于6孔板中，每孔2mL培养基(RPMI1640培养基，Gibco)中含约1×10⁵个细胞，生长过夜后，转移到如下进行处理：

处理一、2mL新鲜RPMI1640培养基中加入250uL含有对照RNA序列(NC)的转染试剂；

处理二、2mL新鲜RPMI1640培养基中加入250uL含有siRNA序列(siPTPRF)的转染试剂。

每种处理方式重复三个孔。

六孔板中的细胞在孵箱内继续培养48h，分别得到siRNA干扰后的DU145细胞和对照RNA干扰后的DU145细胞。

然后将六孔板中细胞用5mM EDTAPBS溶液消化成单分散细胞悬液后，用洗涤缓冲液洗涤2遍，细胞分散于结合缓冲液中，每孔的细胞分为2份。

二、Westernblot检测敲降效果

对上述一制备的siRNA干扰后的DU145细胞和对照RNA干扰后的DU145细胞提取细胞的全蛋白。

配制全细胞裂解液：RIPA Buffer(Sigma公司，货号R0278)加100×PMSF溶液(Sigma公司，货号：93482)，再加入100×蛋白酶抑制剂(Sigma公司，货号：P8340)。

具体方法如下：将细胞用PBS洗涤3次，置于冰上每孔加100μL裂解液，放置2-3min，用提前洗涤干净的细胞刮将细胞刮下收集。使用4℃低温离心机，13400g离心15分钟分离细胞碎片，收集上清。取1μL样品加19μL PBS稀释，加200μL bradford显色剂显色5-20min，用酶标仪测定595nm处吸收度。用蛋白质浓度-吸收度标准曲线计算蛋白浓度，加loading混匀，95℃煮10min。

然后用10％SDS-PAGE电泳分离。转膜至PVDF膜((Millipore,公司)，然后用含5％的脱脂牛奶(上海生工)和0.1％Tween-20的PBS室温封闭1h.分别加入1:5000的anti-PTPRF抗体(sc-135969，Santa公司)在4℃孵育过夜。用PBST洗涤膜5次，加入HRP标记的二抗(1:5000稀释,Santa公司)，室温孵育1小时。用PBST洗涤膜5次，加入SuperSignal West FemtoMaximum Sensitivity Substrate试剂(Thermo Fisher Scientific公司)，用全自动化学发光图像分析系统(天能公司)成像。

结果如图4B所示，可以看出，siRNA的siPTPRF处理细胞DU45后，DU145细胞的LAR表达降低，siPRPRF可以明显的敲降PTPRF的表达。

三、siRNA干扰后的DU145细胞的受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F分子蛋白的表达水平检测

上述步骤一处理后六孔板每孔的细胞悬液分别入荧光素标记的核酸适配体3溶液(终浓度为200nmol/L)；混匀后在冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤两遍；细胞用洗涤缓冲液重悬，BD公司的FACSCalibur流式细胞仪收集第一通道荧光强度数据，作为细胞表面的荧光强度。

结果如图4A所示，核酸适配体3与细胞DU145的结合较对照细胞结合量变小，说明核酸适配体3可以用于检测细胞表面PTPRF的表达。

上述结果表明，核酸适配体3可以特异结合细胞中的PTPRF，并且用于检测细胞表面PTPRF的表达量高低。

实施例4、核酸适配体3在用于流式细胞仪测定细胞中受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F的表达中的应用

一、核酸适配体溶液的制备及细胞株的处理

1、核酸适配体溶液的制备

1)荧光素标记的核酸适配体3

荧光素标记的核酸适配体3溶液为在核酸适配体3(序列3)的5’端偶联荧光素基团FAM，用结合缓冲液溶解，依据紫外吸收标定浓度(200nM)后，95℃加热5min，冰上放置10min，室温放置15min，得到核酸适配体3-FAM溶液。

2)荧光素标记的对照核酸序列溶液(L45-FAM)(100nM)的制备

荧光素标记的对照核酸序列L45(L45-FAM)溶液为在对照核酸序列L45的5’端偶联荧光素基团FAM得到的，用结合缓冲液溶解L45-FAM，依据紫外吸收标定浓度(100nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min，得到荧光素标记的对照核酸序列L45溶液。

对照核酸序列L45的核苷酸序列：TTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

2、细胞株的预处理

分别培养如下20种细胞株，SACC-LM细胞、SACC-83细胞、A549(人肺腺癌细胞)、A549T(人肺腺癌耐药细胞)、A2780T(人卵巢癌细胞紫杉醇耐药株)、DU145(人前列腺癌脑转移细胞)、PC3(人前列腺癌骨转移细胞)、Jurkat(急性T细胞白血病细胞)、T24(膀胱癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、MCF-7R(耐紫杉醇人乳腺癌细胞)、LoVo(人结直肠癌细胞)、Colo205(人结直肠癌细胞)、BCPAP(乳头状复苏形式人甲状腺癌细胞)、A375(人黑色素瘤细胞)使用RPMI1640培养基(GIBCO)加10％胎牛血清(FBS)(Invitrogen)和100IU/mL青霉素链霉素双抗(Invitrogen)；U87(人胶质瘤细胞)、HCT116(结肠癌细胞)、HeLa(人子宫颈癌细胞)、SMMC7721(人肝癌细胞)使用DMEM培养基(GIBCO)加10％胎牛血清(FBS)(Invitrogen)和100IU/mL青霉素链霉素双抗(Invitrogen)；RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)。

取上述20种生长到对数期的细胞株，用5mM EDTA的PBS消化成单分散细胞悬液后，用洗涤缓冲液洗涤2遍；

将悬浮生长的人白血病细胞(Jurkat)直接吹散后用洗涤缓冲液洗涤2遍。

3、核酸适配体3用于测定细胞受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F的表达

将上述1制备的核酸适配体3-FAM溶液、荧光素标记的对照核酸序列L45溶液分别与20种不同来源的细胞系混合，分别得到混合液，将混合液在冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤两遍，过400目筛网后，上流式细胞仪进行检测。

结果如图3所示，用核酸适配体3可以检测受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F(P10586)在细胞系中的表达情况，可以看到MCF-7细胞、MCF-7R细胞、T24细胞、A375细胞、A549细胞、PC3细胞、SACC-83细胞、SACC-LM细胞、BCPAP细胞、Jurkat细胞、DU145细胞、HeLa细胞、Colo205细胞、LoVo细胞、RAW246.7细胞等细胞表达受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F；而A2780T细胞、U87细胞和SMMC细胞不表达受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F。

上述结果表明，核酸适配体3可以检测细胞中是否表达受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F(又称白细胞共同抗原相关蛋白，LAR)。

实施例5、核酸适配体3在用于细胞共聚焦成像测定细胞中受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F的表达中

荧光素分子标记的核酸适配体3溶液为在核酸适配体3的5’端偶联荧光素FAM基团得到的，用结合缓冲液溶解荧光素(FAM)标记的核酸适配体3，依据紫外吸收标定浓度(20μM)后，95℃加热变性5min，冰上放置10min，室温放置15min，得到荧光素FAM标记的核酸适体3溶液。

将上述荧光素分子标记的核酸适配体3溶液用结合缓冲液稀释成200nmol/L的DNA溶液，加入已在共聚焦培养皿中培养好的DU145细胞中，冰上孵育30min，PBS洗涤一次后于FV3000激光共聚焦扫描显微镜(OLYMPUS/奥林巴斯)100倍镜下观察。

结果如图5所示，可明显看出核酸适配体3与DU145细胞的细胞膜有很好的结合。

因此，该核酸适配体可用于细胞成像测定受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F在细胞膜表面的表达。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院化学研究所

<120> 一种核酸适配体识别并结合PTPRF及其相关功能的应用研究

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 83

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

aaggagcagc gtggaggata taggttggct taggtggctt tgcgttgggt gtggtgcata 60

tccttagggt gtgtcgtcgt ggt 83

<210> 2

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gtggaggata taggttggct taggtggctt tgcgttgggt gtggtgcata tcc 53

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

ggatataggt tggcttaggt ggctttgcgt tgggtgtggt gcatatcc 48

<210> 4

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

tggaggatat aggttggctt aggtggcttt gcgttgggtg tggtgcatat cctcca 56

Claims

1.一种核酸适配体，为如下A1）-A6）中任一种：

A1）序列3所示的单链DNA分子；

A2）序列1所示的单链DNA分子；

A3）序列2所示的单链DNA分子；

A4）序列4所示的单链DNA分子；

A5）序列3所示的单链DNA分子，且5'末端起第1-4位和3'末端起第1-4位核苷酸进行硫代修饰；

A6）将A1）-A5）任一所示的核酸适配体的5’端偶联生物素基团或FAM基团，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物。

2.权利要求1所述的核酸适配体在如下B1-B11至少一种中的应用：

（B1）制备识别并结合或辅助识别并结合受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F产品；

（B2）制备识别并结合或辅助识别并结合表达受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F的细胞产品；

（B3）捕获或提取待测样品中的受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白；

（B4）制备捕获或提取待测样品中的受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白产品；

（B5）制备识别或辅助识别受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白产品；

（B6）制备结合或辅助结合受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白产品；

（B7）制备检测或辅助检测待测样品中是否含有受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白的产品；

（B8）制备检测或辅助检测表达受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F蛋白的肿瘤或肿瘤细胞的产品；

（B9）制备识别或辅助识别肿瘤或肿瘤细胞的产品；

（B10）制备结合或辅助结合肿瘤或肿瘤细胞的产品；

所述肿瘤为人唾液腺腺样囊性癌、人肺腺癌、乳头状复苏形式人甲状腺癌、人前列腺癌、人乳腺癌、人黑色素瘤、人膀胱癌、耐紫杉醇人乳腺癌、急性T细胞白血病、人子宫颈癌或人结直肠癌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述待测样品为细胞或其他组织。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述细胞为人唾液腺腺样囊性癌细胞、人肺腺癌细胞、乳头状复苏形式人甲状腺癌细胞、人前列腺癌细胞、人乳腺癌细胞、人黑色素瘤细胞、人膀胱癌细胞、急性T细胞白血病细胞、人子宫颈癌细胞或人结直肠癌细胞。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述产品为试剂盒或探针或靶向物质。

6.一种产品，其包括权利要求1所述的核酸适配体。