JP2021129577A - 改善されたオフ速度(off−rate)を持つアプタマーを生成するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
Chemi−SELEX”は、アプタマーをそのターゲットに共有結合させるための方法を記載する。
位および/または塩基位での化学的置換が含まれる。修飾ヌクレオチドを含有する、SELEX法で同定されたアプタマーが、米国特許第5,660,985号、表題“High
Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides”に記載され、該特許は、ピリミジンの5’位および2’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載する。上記の米国特許第5,580,737号は、2’−アミノ(2’−NH2)、2’−フルオロ(2’−F)、および/または2’−O−メチル(2’−OMe)で修飾された1以上のヌクレオチドを含有する非常に特異的なアプタマーを記載する。
書に援用され、そして“Improved SELEX and PHOTOSELEX”と題される、2008年7月17日出願の米国出願第12/175,388号に開示される。位置維持ヌクレオチドはまた、光反応性でない修飾ヌクレオチドのSELEX中またはSELEX後導入に用いてもよい。
。他の態様において、キットには、関心対象のターゲットを抽出するための試薬、アプタマーを増幅するための試薬、洗浄を実行するための試薬、検出試薬等がさらに含まれてもよい。
[0041]本明細書において、用語「含む(comprises)」、「含むこと(comprising)」、「含まれる(includes)」、「含まれること(including)」、「含有する(contains)」、「含有すること(containing)」、およびそれらの任意の変形は、非包括的包含を含むと意図され、したがって、要素または要素のリストを含むか、該要素が含まれるか、または該要素を含有する、問題のプロセス、方法、プロセスによる産物、または組成物には、これらの要素のみが
含まれるのでなく、問題のこうしたプロセス、方法、プロセスによる産物、または組成物に明確に列挙されていないかまたは本質的でない、他の要素もまた、含まれてもよい。
CPG)上に保持する。これらの切断された一部切除(truncated)配列を脱イオン水(dI)で2回洗い流す。2回の洗浄後、脱保護工程の準備中に、500μLのdI水を添加する。この工程には、1.0mLのT−ブチルアミン:メタノール:水、1:1:2での、70℃で5時間の処理が伴い、その後、凍結、ろ過、および蒸発乾固が続く。PRP−3 HPLCカラム(Hamilton)上で、保護基の疎水性に基づいて、核酸産物を精製する。適切なカラム分画を収集し、そしてプールし、脱塩し、そして蒸発乾固して、揮発性溶出緩衝液を除去する。遠心分離プロセスによって、最終産物を水で洗浄し、そして次いで再懸濁する。最後に、再懸濁物質を処理して、最終産物を脱保護する。塩基組成、プライマー伸張、および配列決定ゲルによって、最終産物を性質決定する。
アミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[2−(1H−インドール−3イル)エチル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、または5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)、8位プリン修飾、環外アミンでの修飾、4−チオウリジンの置換、5−ブロモまたは5−ヨードウラシルの置換、主鎖修飾、メチル化、イソ塩基、イソシチジンおよびイソグアニジンなどの異常な塩基対形成の組み合わせ等が含まれてもよい。修飾には、キャッピングまたはPEG化などの3’および5’修飾もまた含まれてもよい。他の修飾には、類似体での1以上の天然存在ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結での修飾(例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど)、および荷電連結での修飾(例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)、挿入剤(例えばアクリジン、ソラレンなど)での修飾、キレート剤(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など)を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、および修飾連結での修飾(例えばアルファ・アノマー核酸など)が含まれてもよい。さらに、糖に通常存在する任意のヒドロキシル基を、ホスホン酸基またはリン酸基によって置換するか;標準的保護基によって保護するか;あるいはさらなるヌクレオチドまたは固体支持体へのさらなる連結に備えて活性化してもよい。5’および3’末端OH基をリン酸化するか、あるいは、アミン、約1〜約20炭素原子の有機キャッピング基部分、または約1〜約20のポリエチレングリコール(PEG)ポリマーまたは他の親水性もしくは疎水性生物学的もしくは合成ポリマーの有機キャッピング基部分で置換してもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾を、ポリマーの組み立て前または後に行ってもよい。非ヌクレオチド構成要素によって、ヌクレオチド配列を中断してもよい。標識化構成要素とのコンジュゲート化によるなどで、重合後にポリヌクレオチドをさらに修飾してもよい。
ド連結の使用が含まれる。しかし、他の適切な修飾法を用いてもよい。驚くべきことに、同定される、オフ速度が遅いアプタマーの構造が、標準的塩基対形成モデルによって予測される構造と完全には一致しないようであることが観察された。この観察は、オフ速度が遅いアプタマーの測定融解温度が、モデルによって予測される融解温度とは一致しないという事実によって裏付けられる。図13を参照されたい。示すように、オフ速度が遅いアプタマーの測定および予測融解温度間には、まったく相関はないようである。計算融解温度(Tm)は、測定Tmより平均して6℃低い。測定融解温度は、これらの修飾ヌクレオチドを含む、オフ速度が遅いアプタマーが、予測されうるよりも安定であり、そして潜在的に、新規二次構造を所持することを示す。これらの修飾アプタマーはまた、修飾されていないヌクレオチドのみを含む、対応するアプタマーとは異なる円二色性スペクトルを有する。多くのターゲットの場合、ターゲットに対するオフ速度が遅いアプタマーは、最初のライブラリーまたは候補混合物の産生中に修飾ヌクレオチドを用いた場合に、同定される可能性がより高い。
[0055]本明細書において、「修飾核酸」は、1以上の修飾ヌクレオチドを含有する核酸配列を指す。いくつかの態様において、修飾ヌクレオチドがSELEX法と適合することが望ましい可能性もある。
合剤(例えば硫酸デキストランまたは別のポリアニオン性物質)を用いて、ポリアニオンの存在に対して難分解性であるアプタマーの同定を容易にする。この文脈では、「ポリアニオン難分解性アプタマー」は、非ポリアニオン難分解性アプタマーを含むアプタマー/ターゲット複合体よりも、溶液中で解離する可能性がより低い、ポリアニオン難分解性物質もまた含有するアプタマー/ターゲット複合体を形成可能なアプタマーである。この方式で、検出法が、ポリアニオン難分解性アプタマーが難分解性であるポリアニオン性物質(例えば硫酸デキストラン)の使用を含む場合、試料中のターゲットの存在または量または濃度を検出する分析法の実行において、該アプタマーを用いることも可能である。
的な種類は、上皮組織、結合組織、神経組織および筋組織である。
に記載される。
い。
複合体および競合剤分子の混合物を、あらかじめ決定された期間、インキュベーションし;(f)候補混合物から核酸−ターゲット分子複合体を分配し;(g)核酸−ターゲット分子複合体を解離させて、未結合核酸を生成し;(h)未結合核酸を増幅して、増加したアフィニティでターゲット分子に結合可能な核酸配列が濃縮された核酸混合物を得る工程を含み、それによってターゲット分子に対するアプタマーを同定可能である、前記方法を提供する。
選択される、アプタマーおよびそのターゲットの非共有複合体を提供する。
合が、疾患プロセスまたは他の状態の存在を示す。例えば、VEGF受容体が腫瘍内およびその新規血管系内で豊富に発現されているため、VEGF受容体に対するアプタマーをin vivoで用いて、個体の体の特定の領域(例えば組織、臓器等)において、癌の存在を検出することも可能であるし、またはEGF受容体が、しばしば、腫瘍細胞上で高レベルに発現されているため、EGF受容体に対するアプタマーをin vivoで用いて、個体の体の特定の領域(例えば組織、臓器等)において、癌の存在を検出することも可能である。すなわち、分子ターゲットは、誘導される受容体の細胞外ドメイン(ECD)であり、これはこうしたターゲットが細胞の外部に位置し、そして血管系を通じてアクセス可能であるためである。さらに、特定のECDのある程度のわずかな割合は、細胞死を含む生物学的プロセスを通じて脱落しうるとしても、ECDは、病変部位に局在する傾向がある。
ディは、妥当なアフィニティおよび特異性を有することも可能であり、そしてモノクローナル抗体より速いクリアランス速度を有することも可能であるが、ターゲットからの遅い解離速度を達成するため、アフィボディはしばしば二量体およびより高次の多量体になり、解離速度が増進されると同時に、クリアランスが遅くなる。
ー間の最強の相対的アフィニティを有する核酸−ターゲット対を形成する。ターゲットに対する最高のアフィニティを持つ核酸を、ターゲットに対するより低いアフィニティを持つ核酸から分配する。最大数の高アフィニティ候補を保持する方式で、分配プロセスを実行する。ターゲットに対して比較的高いアフィニティを有するとして、分配中に選択された核酸を増幅して、ターゲットに対して比較的高いアフィニティを有する核酸が濃縮された、新規候補混合物を生成する。上記の分配および増幅工程を反復することによって、新規に形成される候補混合物は、より少ないユニークな配列を含有し、そしてターゲットに対する核酸混合物のアフィニティの平均の度合いは、一般的に増加する。極端に言えば、SELEX法は、ターゲット分子に対する最高のアフィニティを有する元来の候補混合物由来の核酸に相当するユニークな核酸を1つまたは非常に少数含有する、候補混合物を生じるであろう。しかし、この基本的SELEX法は、そのターゲットからのオフ速度が遅いアプタマーに関しては選択しない。
ット分子との結合平衡を確立することを可能にする。一般的に、ターゲット分子に高いアフィニティで結合する核酸のある程度のみが、ターゲットとともに効率的に分配される。
exponential enrichment: Chemi−SELEX”を参照されたい)。
[00123]多様な他の態様において、SELEX法を用いたオリゴヌクレオチドの限定された選択に、光SELEX法を用いた選択が続く。光反応基を含有するオリゴヌクレオチドを用いて、最初のSELEX選択ラウンドを行う。いくつかのSELEXラウンド後、光SELEXを行って、ターゲット分子に結合可能なオリゴヌクレオチドを選択する。
ョン(要素または構成要素とも記載される)を含むアプタマーの産生を記載する。これらのさらなる構成要素または要素は、アプタマー内にさらなる官能性を導入する構造的要素または構成要素であり、そしてしたがって、官能性要素または構成要素である。1以上の以下のさらなる構成要素(これらの用語の任意の組み合わせで、官能性または構造的要素または構成要素または部分とも記載される)を用いて、アプタマーをさらに産生する:標識または検出可能構成要素、スペーサー構成要素、および特異的結合タグまたは固定化要素または構成要素。
能基中の特定の結合が破壊されて、2つの別個の構成要素を産生可能である官能基を指す。多様な態様において、適切な波長を官能基(光切断可能)に照射することによって、あるいは適切な化学的または酵素的試薬で処理することによって、官能基を切断してもよい。別の態様において、遊離可能要素は、還元剤で処理して結合を破壊可能なジスルフィド結合であってもよい。遊離可能要素は、固体支持体に付着したアプタマー/ターゲット・アフィニティ複合体が、複合体の溶出によるなどで、固体支持体から分離されるのを可能にする。遊離可能要素は、残りのアッセイ条件に対して安定であってもよいし、そしてアプタマー/ターゲット複合体を破壊しない条件下で遊離可能であってもよい。
−5913−02);およびArm26−Achスペーサーアミダイト(Fidelity Systems PN SP26Ach−05)が含まれる。
[00136]実施例6は、ペプチドターゲットに対する遅いオフ速度のアプタマーの生成を記載する。
項中に定義するような本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例1. 核酸ライブラリー中に修飾ヌクレオチドが取り込まれると、アフィニティSELEXにおいて、より高いアフィニティが濃縮されたライブラリーが導かれる
[00138]A. 候補混合物の調製
[00139]dATP、dGTP、5−メチル−dCTP(MedCTP)、およびdTTPまたは3つのdUTP類似体:5−ベンジル−dUTP(BzdUTP)、5−イソブチル−dUTP(iBdUTP)、または5−トリプトアミノ−dUTP(TrpdUTP)の1つを用いて、候補混合物を調製した。ビオチン化テンプレートにアニーリングしたプライマーのポリメラーゼ伸長によって、候補混合物を調製した(図2)。各候補混合物組成に関して、4.8nmolの順方向PCRプライマーおよび4nmolのテンプレートを、100μLの1XKOD DNAポリメラーゼ緩衝液(Novagen)中で混ぜ合わせ、95℃に8分間加熱して、そして氷上で冷却した。1XKOD DNAポリメラーゼ緩衝液、0.125U/μLのKOD DNAポリメラーゼ、ならびに各0.5mMのdATP、MedCTP、dGTP、およびdTTPまたはdUTP類似体を含有する400μLの伸長反応に、各100μLのプライマー:テンプレート混合物を添加し、そして70℃で30分間インキュベーションした。1mLのストレプトアビジン・コーティング磁気ビーズ(MagnaBindストレプトアビジン、Pierce、1M
NaCl+0.05%TWEEN−20中、5mg/5mL)を添加し、そして混合しながら25℃で10分間インキュベーションすることによって、テンプレート鎖ビオチンを介して、二本鎖産物を捕捉した。0.75mL SB1T緩衝液(40mM HEPES、pH7.5、125mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM
CaCl2、0.05%TWEEN−20)で3回、ビーズを洗浄した。1.2mL 20mM NaOHを用いてビーズからアプタマー鎖を溶出させ、0.3mL 80mM
HClで中和し、そして15μL 1M HEPES、pH7.5で緩衝した。Centricon−30で候補混合物をおよそ0.2mLに濃縮し、そしてUV吸収分光法によって定量化した。
[00141](His)6タグ(R&D Systems)などのポリHisタグを含むターゲットタンパク質を購入し、そしてCo+2−NTA常磁性ビーズ(TALON、Invitrogen)上に固定した。0.5mL B/W緩衝液(50mM Na−リン酸、pH8.0、300mM NaCl、0.01%TWEEN−20)中で、0.2mg/mLにターゲットタンパク質を希釈し、そして0.5mL TALONビーズ(B/W緩衝液で3回あらかじめ洗浄し、そしてB/W緩衝液中で10mg/mLに再懸濁)に添加した。混合物を25℃で30分間回転させ、そして使用するまで4℃で保存した。(His)6ペプチドでコーティングしたTALONビーズもまた調製し、そして上述のように保存した。使用前、B/W緩衝液でビーズを3回洗浄し、SB1Tで1回洗浄し、そしてSB1T中に再懸濁した。
[00143]各候補混合物を用いて、アフィニティ選択を別個に行い、ターゲットタンパク質ビーズ(シグナル、S)および(His)6ビーズ(バックグラウンド、B)間で結合を比較した。各試料に関して、40μL SB1T中、0.5μM候補DNA混合物を調製した。1μLの(His)6相補的オリゴ(1mM)(図2)を、10μLのタンパク質競合剤混合物(SB1T中の0.1%HSA、10μMカゼイン、および10μMプロトロンビン)とともにDNAに添加した。
DNA溶液を除去し、そして0.1mg/mLニシン精子DNA(Sigma−Aldrich)を含有するSB1Tを用いて37℃で5回、ビーズを洗浄した。示さない限り、100μLの洗浄溶液中にビーズを再懸濁し、30秒間混合し、磁石でビーズを分離し、そして洗浄溶液を除去することによって、すべての洗浄を行った。100μL SB1T+2Mグアニジン−HClを添加し、そして混合しながら37℃で5分間インキュベーションすることによって、結合したアプタマーをビーズから溶出させた。磁気分離後、アプタマー溶出物を新規試験管に移した。最初の2回の選択ラウンド後、ターゲットビーズ洗浄の最後の2回を、30秒間ではなく5分間行った。
[00148]選択されたアプタマーDNAをQPCRによって増幅し、そして定量化した。48μL DNAを12μL QPCR混合物(5X KOD DNAポリメラーゼ緩衝液、25mM MgCl2、10μM順方向PCRプライマー、10μMビオチン化逆方向PCRプライマー、5X SYBRグリーンI、0.125U/μL KOD DNAポリメラーゼ、ならびに各1mMのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP)に添加し、そして以下のプロトコルで、ABI5700 QPCR装置中で熱サイクリングした:1サイクルの99.9℃15秒間、55℃10秒間、70℃30分間;30サイクルの99.9℃15秒間、72℃1分間。装置ソフトウェアを用いて定量化を行い、そしてターゲットビーズおよび(His)6ビーズで選択されたDNAのコピー数を比較して、シグナル/バックグラウンド比を決定した。
1X KOD DNAポリメラーゼ緩衝液、1.5mM MgCl2、5μM順方向PCRプライマー、0.125U/μL KOD DNAポリメラーゼ、各0.5mMのdATP、MedCTP、dGTP、およびdTTPまたはdUTP類似体のいずれか)中にビーズを再懸濁し、そして混合しながら68℃で30分間インキュベーションした。SB1Tで3回ビーズを洗浄し、そして85μL 20mM NaOHを添加し、そして混合しながら37℃で1分間インキュベーションすることによって、ビーズからアプタマー鎖を溶出させた。磁気分離後、80μLのアプタマー溶出物を新規試験管に移し、20μL
80mM HClで中和し、そして5μL 0.1M HEPES、pH7.5で中和した。
[00152]選択工程の相対的ターゲットタンパク質濃度は、以下のようにS/B比に応じて、各ラウンドで低下し、ここでシグナルSおよびバックグラウンドBは上記セクションC中で定義される:
S/B<10であれば、[P](i+l)=[P]i
10≦S/B<100であれば、[P](i+l)=[P]i/3.2
S/B≧100であれば、[P](i+l)=[P]i/10
式中、[P]=タンパク質濃度であり、そしてi=現在のラウンド数である。
[00156]TALONビーズ分配を用いて、濃縮されたライブラリーの平衡結合定数を測定した。95℃に加熱し、そしてゆっくりと37℃に冷却することによって、DNAを再生させた。SB1緩衝液(先に記載するもの)中、低濃度の放射標識DNA(〜1x10−11M)をある範囲の濃度のターゲットタンパク質(1x10−7M〜1x10−12M最終)と混合して、そして37℃でインキュベーションすることによって、複合体を形成した。各反応の一部をナイロン膜に移し、そして乾燥させて、各反応中の総カウントを決定した。少量の5mg/mL MyOne TALONビーズ(Invitrogen)を各反応の残りに添加し、そして37℃で1分間混合した。一部を真空下でMultiScreen HVプレート(Millipore)に通過させて、未結合DNAからタンパク質が結合した複合体を分離して、そして100μL SB1緩衝液で洗浄した。ナイロン膜およびMultiScreen HVプレートをホスホイメージ化(phosphorimaged)し、そしてFUJI FLA−3000を用いて、各試料中の放射能量を定量化した。タンパク質濃度の関数として、捕捉されたDNAの分率をプロットし、そして非線形曲線適合アルゴリズムを用いて、データから平衡結合定数(Kd値)を抽出した。表1は、ターゲットセットに対して濃縮された候補混合物各々に関して決定されたKd値を示す。NTは、特定の塩基組成に関して濃縮されたライブラリーが、C0t分析(先に記載するもの)によって決定した際、元来の候補混合物から変化していな
いようであり、そしてしたがって、試験されなかった(NT)ことを示す。
[00159]A.候補混合物の調製
[00160]ビオチン化テンプレートにアニーリングしたプライマーのポリメラーゼ伸長によって、dATP、dCTP、dGTP、およびBzdUTPを含有する候補混合物を調製した(図4A〜B)。各テンプレートに関して、各々、5’末端にユニークな発色団を所持する、4つの異なる順方向プライマーを用いた(図5)。各候補混合物に関して、11nmolの順方向プライマー(5’発色団を含む)および10nmolのテンプレートを、250μLのプライマー伸張緩衝液(120mM Tris−HCl、pH7.8、10mM KCl、6mM (NH4)2SO4、7mM MgSO4、0.1mg/mL BSA、0.1%TritonX−100)中で混ぜ合わせ、95℃に5分間加熱して、そして氷上で冷却した。プライマー伸張緩衝液、0.125U/μLのKOD
DNAポリメラーゼ、ならびに各0.5mMのdATP、dCTP、dGTP、およびBzdUTPを含有する1mLの伸長反応に、各125μLのプライマー:テンプレート混合物を添加し、そして70℃で30分間インキュベーションした。各1mLの反応を4つの250μLのアリコットに分けて、そして氷上で冷却した。1mLのストレプトアビジン・コーティング磁気ビーズ(MagnaBindストレプトアビジン、Pierce
、1M NaCl+0.05%TWEEN−20中、5mg/5mL)を各250μLのアリコットに添加し、そして混合しながら25℃で60分間インキュベーションすることによって、テンプレート鎖ビオチンを介して、二本鎖産物を捕捉した。0.5mL SB17T緩衝液(40mM HEPES、pH7.5、125mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2、1mM EDTA、0.05%TWEEN−20)で3回、ビーズを洗浄した。1mL 20mM NaOHを用いてビーズからアプタマー鎖を溶出させ、0.25mL 80mM HClで中和し、そして10μL 1M HEPES、pH7.5で緩衝した。Centricon−30で候補混合物をおよそ0.2mLに濃縮し、そしてUV吸収分光法によって定量化した。
[00162]NHS−PEO4−ビオチン(Pierce)をリジン残基に共有結合させることによって、タグ化されていないターゲットタンパク質をビオチン化した。Sephadex G−25マイクロスピンカラムを用いて、タンパク質(50μL中、300pmol)をSB17T内に交換した。NHS−PEO4−ビオチンを1.5mMまで添加し、そして反応を4℃で16時間インキュベーションした。Sephadex G−25マイクロスピンカラムを用いて、未反応NHS−PEO4−ビオチンを除去した。
[00164]各候補混合物を用いて、選択を別個に行い、ターゲットタンパク質を伴う試料(シグナルS)およびターゲットタンパク質を伴わない試料(バックグラウンドB)間の結合を比較した。最初の3回のラウンドをアフィニティに関する選択を伴って行い(光架橋なし);第二および第三のラウンドには、遅いオフ速度の濃縮プロセスが含まれた。ラウンド4〜8には、遅いオフ速度の濃縮プロセスおよび光架橋両方が含まれた。
に移し、20μL 80mM HClで中和し、そして1μL 0.5M Tris−HCl、pH7.5で緩衝した。
[00171]選択されたアプタマーDNAをQPCRによって増幅し、そして定量化した。48μL DNAを12μL QPCR混合物(5X KOD DNAポリメラーゼ緩衝液、25mM MgCl2、10μM順方向PCRプライマー、10μMビオチン化逆方向PCRプライマー、5X SYBRグリーンI、0.125U/μL KOD DNAポリメラーゼ、ならびに各1mMのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP)に添加し、そして以下のプロトコルで、Bio−Rad MyIQ QPCR装置中で熱サイクリングした:1サイクルの99.9℃15秒間、55℃10秒間、68℃30分間;30サイクルの99.9℃15秒間、72℃1分間。光SELEXラウンドに関しては、最初の30分間のインキュベーションを行い、装置ソフトウェアを用いて定量化を行い、そしてターゲットタンパク質を伴いそして伴わずに選択されたDNAのコピー数を比較して、シグナル/バックグラウンド比を決定した。
で3回洗浄し、そして16mM NaClで1回洗浄した。
[00176]各ラウンドで、実施例1に記載するように、ターゲットタンパク質を調整した。各選択ラウンド後、実施例1に記載するように、濃縮されたプールの収束状態を決定した。
[00178]上記の実施例1に記載するように、しかしMyOne−SA捕捉ビーズを用いて、結合アフィニティを決定した。以下の表、表2は、遅いオフ速度の濃縮プロセスを伴う光SELEXプロトコルを用いて得られた平衡結合定数(Kd)を要約する。
[00180]飽和タンパク質および光の条件下で、タンパク質に架橋されたDNAのパーセントを測定することによって、濃縮されたライブラリーの架橋収率を決定した。放射標識DNA(50pM)を、SB17T中、逆方向プライマー(16nM)と混合し、95℃に3分間加熱し、そして0.1℃/秒で37℃に冷却した。ターゲットタンパク質を最終濃度10nMまでDNA混合物に添加し、そして37℃で30分間インキュベーションした。タンパク質を含まない対照試料を同時に調製した。上記のとおりであるが、飽和用量で(BrdUに関しては6分間、ANAに関しては10分間、そしてAQおよびPsorに関しては30分間)、上記の発色団特異的条件で、試料を架橋した。変性PAGEによって、試料を分析し、図6、そして定量化し、そして結果を表3に一覧にする。
[00181]A.候補混合物の調製
[00182]94のタンパク質ターゲットに対して、ビオチン化テンプレートにアニーリングしたプライマーのポリメラーゼ伸長によって、dATP、dCTP、dGTP、およびBzdUTPを含有する候補混合物を調製した。55nmolの順方向プライマー(5’ANA発色団を含む)および55nmolのテンプレートを、0.5mLのプライマー伸張緩衝液(120mM Tris−HCl、pH7.8、10mM KCl、6mM (NH4)2SO4、7mM MgSO4、0.1mg/mL BSA、0.1%TritonX−100)中で混ぜ合わせ、95℃に5分間、70℃に5分間、48℃に5分間加熱して、そして氷上で冷却した。プライマー伸張緩衝液、0.125U/μLのKOD DNAポリメラーゼ、ならびに各0.5mMのdATP、dCTP、dGTP、およびBzdUTPを含有する5.5mLの伸長反応に、プライマー:テンプレート混合物を添加し、そして70℃で60分間インキュベーションした。伸長反応の完了後、溶液を氷上で冷却した。25mLのストレプトアビジン・コーティング磁気ビーズ(MagnaBindストレプトアビジン、Pierce、1M NaCl+0.05%TWEEN−20中、5mg/5mL)をプライマー伸張産物に添加し、そして回転させながら25℃で15分間インキュベーションすることによって、テンプレート鎖ビオチンを介して、二本鎖産物を捕捉した。40mL SB17T緩衝液(40mM HEPES、pH7.5、125mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2、1mM EDTA、0.05%TWEEN−20)で3回、ビーズを洗浄した。振盪しながら、5分間、35.2mL 20mM NaOHを用いてビーズからアプタマー鎖を溶出させた。溶出された鎖を8.8mL 80mM HClで中和し、そして400μL 1M HEPES、pH7.3で緩衝した。Centricon−30で候補混合物をおよそ0.7mLに濃縮し、そしてUV吸収分光法によって定量化した。
[00184]実施例2に記載するように、タグ化されていないターゲットタンパク質をビオチン化した。
[00186]ラウンド6〜9の遅いオフ速度の濃縮プロセス中、アプタマー再結合に関する競合剤として10mMの硫酸デキストランを添加して、実施例2に記載するように
選択を別個に行った。
[00189]実施例2におけるように、増幅および精製を行った。
[00190]E.選択ストリンジェンシーおよびフィードバック
[00191]ラウンド6および8を除いて、実施例1に記載するように各ラウンドでターゲットタンパク質を調整した。これらの大規模希釈後のシグナルを最大にするため、ラウンド6および8に関してターゲットタンパク質を100nMに増加させた。各選択ラウンド後、実施例1に記載するように、濃縮されたプールの収束状態を決定した。
[00193]時間の関数として、希釈後に結合したままである、あらかじめ形成されたアプタマー:タンパク質複合体の割合を測定することによって、各アプタマーに関して、アプタマー:タンパク質複合体解離に関する速度定数(koff)を決定した。測定されたKd値より10X高い濃度のタンパク質とともに、放射標識アプタマー(50pM)をSB17T−0.002(TWEEN−20を0.002%まで減少させたSB17T)中、37℃で平衡化させた。37℃のSB17T−0.002で試料を100X希釈し、そして多様な時点でアリコットを除去し、そして分配して、未結合アプタマーをタンパク質:アプタマー複合体から分離した。試料にZORBAX樹脂(Agilent)を添加し、該樹脂上に複合体を捕捉し、真空下でDuraPore膜に試料を通過させ、そしてSB17T−0.002で樹脂を洗浄することによって、分配を完了した。タンパク質はZORBAX樹脂では効率的に捕捉されないため、SB17T中でビオチン化タンパク質を用いてアッセイを行い、そしてDyanal MyOne−SAビーズで複合体を捕捉することによって、分配を完了した。FUJI FLA−3000ホスホイメージャーで樹脂上の放射標識アプタマーを定量化することによって、各時点で残っている複合体の量を決定した。複合体の割合を時間の関数としてプロットし、そして非線形回帰を用いた生体分子解離動力学に関する分析的表現にデータを適合させることによって、解離速度定数(koff)および解離半減期値(t1/2)を決定した。
[00195]以下の表、表4は、このプロトコルを用いて、10のターゲットに対して選択されたアプタマーに関して得られる解離半減期値(t1/2)を要約する。
[00196]実施例4:遅いオフ速度の濃縮プロセスは、選択されたアプタマーの解離半減期を増加させる。
[00199]A.候補混合物の調製
[00200]実施例3に記載するように、しかし5’−ANA光反応基を用いずに、dATP、dCTP、dGTP、およびNpdUTPを含有する候補混合物を調製した。
実施例1に記載するように、ターゲットタンパク質は(His)6タグを含有し、そしてCo+2−NTAビーズを用いて、該タンパク質を捕捉した。
[00203]実施例3に記載するように、しかし光架橋を伴わずに、アプタマー選択を行った。
[00205]実施例3に記載するように、増幅および精製を行った。
[00206]E.選択ストリンジェンシーおよびフィードバック
[00207]実施例3に記載するように選択ストリンジェンシーおよびフィードバックを行った。
[00209]この選択に由来する4つのアプタマーの平衡結合定数(Kd)を表5に列挙する。
NpdUTPアプタマーの平衡結合定数(Kd)
[00211]A.候補混合物の調製
[00212]実施例3に記載するように、5’ANA発色団を含むプライマーのポリメラーゼ伸長によって、dATP、dCTP、dGTP、およびBzdUTPを含有する候補混合物を調製し、そして精製した。
[00214]29アミノ酸のビオチン化ターゲットペプチドSMAP29(ヒツジ骨髄抗細菌ペプチドMAP−29、Anaspec)を用いて、実施例3に記載するように、アプタマー選択を行った。
[00216]実施例3に記載するように、増幅および精製を行った。
[00217]D.選択ストリンジェンシーおよびフィードバック
[00218]実施例3に記載するように選択ストリンジェンシーおよびフィードバックを行った。
[00220]この選択に由来するアプタマーの平衡結合定数(Kd)は、1.2e−8M(実施例1に記載するプロトコルにしたがって測定)であった。このアプタマーの解離半減期(t1/2)は、69分であった(実施例3に記載するプロトコルにしたがって測定)、結果を図12Aおよび図12Bに示す。
[00222]工程1:実施例7:試験試料中のタンパク質測定は、オフ速度が遅いアプタマーによって可能になる。
ビオチンCy3検出標識(各4nM)を含むアプタマーを、1XSB17T中、3X過剰の捕捉プローブ(ビオチンタグおよび光切断可能要素を含有するアプタマーの3’固定領域に相補的なオリゴヌクレオチド)と混合し、そして95℃で4分間、次いで37℃で13分間加熱し、そして1xSB17T中、1:4に希釈する。55μLのアプタマー/プライマー混合物をマイクロタイタープレート(Hybaid#AB−0407)に添加し、そしてホイルで密封する。SB17T中、既知の濃度のタンパク質分析物と混合し、そしてSB17Tで連続希釈することによって、マイクロタイタープレート中で試験試料を調製する。
[00225]55μLのアプタマー/プライマー混合物を55μLの試験試料に添加し、そしてホイルで密封したマイクロタイタープレート中、37℃で15分間インキュベーションする。平衡混合物中の各アプタマーの最終濃度は0.5nMである。別に記載しない限り、平衡化後、この方法のすべての続く工程を室温で行う。
[00227]DuraPoreろ過プレート(Millipore HVカタログ#MAHVN4550)を真空ろ過によって100μL 1XSB17Tで1回洗浄し、133μL 7.5%ストレプトアビジン−アガロース樹脂(Pierce)を各ウェルに添加し、そして200μL 1XSB17Tで2回洗浄する。ストレプトアビジン−アガロース樹脂を含有するDuraporeプレートに、100μLの平衡化試料を移し、そして熱ミキサー(Eppendorf)上で、800rpmで5分間インキュベーションする。200μL 1XSB17T+100μMビオチンで1回、そして200μL 1XSB17Tで1回、樹脂を洗浄する。
[00229]使用直前に調製される、SB17T中の1.2mM NHS−PEO4−ビオチン100μLを、捕捉アプタマーおよびアプタマー:タンパク質複合体とともに樹脂に添加し、そして熱ミキサー上で800rpmで20分間インキュベーションする。真空ろ過によって、200μL 1XSB17Tで5回、樹脂を洗浄する。
[00231]Duraporeプレートの底面から水滴誘導装置(drip director)を除去し、そしてプレートを1mLマイクロタイター収集プレート上に乗せる。1000xgで30秒間遠心分離することによって、200μL 1XSB17Tで1回、樹脂を洗浄する。80μLの1XSB17T+10mM DxSO4を樹脂に添加し、そして熱ミキサー上、800rpmで10分間、BlackRay水銀ランプを照射する。DuraPoreプレートを新しい1mL深底プレートに移し、そして1000xgで30秒間遠心分離して、光切断されたアプタマーおよびタンパク質:アプタマー複合体を収集する。
[00233]50μLのMyOneストレプトアビジンC1常磁性ビーズ(Invitrogen)(1XSB17T中、10mg/mL)をマイクロタイタープレートに添加する。磁石で60秒間ビーズを分離し、そして上清を除去する。225μLの光切断混合物をビーズに添加し、そして5分間混合する。磁気ビーズを分離し、そして洗浄緩衝液を交換することによって、200μL 1XSB17Tで4回、ビーズを洗浄する。最終洗浄緩衝液を除去する。
[00235]100μLのリン酸ナトリウム溶出緩衝液(10mM Na2HPO4、pH11)をビーズに添加し、そして5分間混合する。90μLの溶出物をマイクロタイタープレートに移し、そして10μLのリン酸ナトリウム中和緩衝液(10mM NaH2PO4、pH5)で中和する。
[00237]カスタム顕微鏡スライド支持体上に固定された各アプタマーの可変領域の相補配列で構成されるオリゴヌクレオチド捕捉プローブを含む、DNAアレイを調製する。多数のアレイ(サブアレイ)が各スライド上に存在し、そしてサブアレイは、試料適用のため、ガスケット(Grace)を取り付けることによって、物理的に分離される。アレイを100μLブロッキング緩衝液で前処理し、そして熱ミキサー上、65℃で15分間インキュベーションする。30μLの高塩ハイブリダイゼーション緩衝液を、マイクロタイタープレート中、90μLの中和アプタマー溶出物に添加し、熱サイクラー中で95℃で5分間インキュベーションし、そして0.1℃/秒で65℃に冷却する。ブロッキング緩衝液をアレイから除去し、そして110μLのアプタマー試料をアレイに添加し、そして加湿チャンバー中、65℃で20時間インキュベーションする。
[00239]アプタマー試料をアレイから除去し、そしてアレイを200μLのリン酸ナトリウムTween−20洗浄緩衝液で、ガスケットを適所にして65℃で1回洗浄し、そしてガスケットを除去してパップ瓶中、25mLリン酸ナトリウム、Tween−20洗浄緩衝液を用いて、65℃で3回洗浄する。アレイを窒素銃で乾燥させる。
[00241]アレイスライドをTECAN LS300 Reloaded上、適切なチャネル中で、Cy3検出のためにスキャンし、そして各アレイ特徴上のCy3シグナルを定量化する。
[00243]伝統的なSELEX法および材料を用いて、3つの異なるターゲット(bFGF、VEGF、およびミエロペルオキシダーゼ)に特異的なアプタマーを産生した。5位修飾ヌクレオチドを用いて、ターゲットの同じセットに特異的なアプタマーの第二のセットを作製し、そしてそれぞれのターゲットに対する非常に遅いオフ速度に関して選択した。伝統的なプロセスで作製されたアプタマーは、5分未満のオフ速度と測定された。修飾ヌクレオチドを含んで、そして選択中に、遅いオフ速度の濃縮プロセスを用いて作製されたアプタマーは、20分より長いオフ速度を有した。2つの異なる方法によって、各ターゲットに関して2セットのアプタマーを作製して、各ターゲットに関して総数4の異なるアプタマー集団を得た。ターゲット濃度のある範囲に渡って、上述のように、これらのアプタマー集団が試験試料中で分析物濃度を測定する能力を評価した。DNAチップ検出からの相対的シグナルを、投入ターゲット濃度に対してプロットした。図11A〜11Cを参照されたい。伝統的なアプタマーの反応曲線は非常に平坦であり、そして検出感度はかなり低い。オフ速度が遅いアプタマーを用いたそれぞれのターゲットの検出感度は、非常に優れている。このデータは、分析性能を最大にするため、オフ速度が遅いアプタマーを用いる必要性があることを裏付ける。
[00245]A.候補混合物の調製
[00246]実施例3に記載するように、5’ANA発色団を含むプライマーのポリ
メラーゼ伸長によって、dATP、dCTP、dGTP、およびBzdUTPを含有する候補混合物を調製し、そして精製した。
[00248]実施例2に記載するように、ヒト・トロンビンをビオチンでタグ化した。
[00250]実施例3に記載するように、ターゲットとしてビオチン化ヒト・トロンビンを用いて、アプタマー選択を行った。
[00252]実施例3に記載するように、増幅および精製を行った。
[00253]E.選択ストリンジェンシーおよびフィードバック
[00254]実施例3に記載するように選択ストリンジェンシーおよびフィードバックを行った。
[00256]図15に示すように、この選択に由来するアプタマー2336−17の平衡結合定数(Kd)は、4.4e−11M(実施例1に記載するプロトコルにしたがって測定)であった。
[請求項1]
アプタマーを同定するための方法であって:
(a)核酸の候補混合物を調製し;
(b)ターゲット分子と候補混合物を接触させ、ここで、候補混合物中、他の核酸に比
較してターゲット分子に対して増加したアフィニティを有する核酸がターゲット分子に結合し、核酸−ターゲット分子複合体を形成し;
(c)核酸−ターゲット分子複合体を、遅いオフ速度の濃縮プロセスに曝露し;
(d)候補混合物から核酸−ターゲット分子複合体を分配し;
(e)核酸−ターゲット分子複合体を解離させて、未結合(free)核酸を生成し;
(f)未結合核酸を増幅して、増加したアフィニティでターゲット分子に結合可能な配列が濃縮された核酸混合物を得て、それによってターゲット分子に対するアプタマーを同定可能であり;
(g)必要に応じて(b)〜(f)を反復し;そして
(h)ターゲット分子に対する少なくとも1つのアプタマーを同定する
工程を含む、前記方法。
[請求項2]
前記候補混合物が一本鎖核酸または二本鎖核酸である、請求項1の方法。
[請求項3]
前記候補混合物がDNAまたはRNAを含む、請求項1の方法。
[請求項4]
前記候補混合物が少なくとも1つの化学的修飾を含む、請求項1の方法。
[請求項5]
前記の化学的に修飾された核酸が、リボース位、デオキシリボース位、リン酸位、および塩基位からなる群より独立に選択される1以上の位で化学的置換を含む、請求項4の方法。
[請求項6]
前記の化学的に修飾された核酸が、2’位糖修飾、2’−アミノ(2’−NH2)、2’−フルオロ(2’−F)、2’−O−メチル(2’−OMe)、5位ピリミジン修飾、シトシン環外アミンでの修飾、5−ブロモウラシルの置換、5−ブロモデオキシウリジンの置換、5−ブロモデオキシシチジンの置換、主鎖修飾、メチル化、3’キャップ、および5’キャップからなる群より独立に選択される、請求項4の方法。
[請求項7]
前記の化学的に修飾された核酸が、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[2−(1H−インドール−3イル)エチル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、および5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンからなる群より独立に選択される、請求項4の方法。
[請求項8]
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を希釈する工程を含む、請求項1の方法。
[請求項9]
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物に、少なくとも1つの競合剤を添加する工程を含む、請求項1の方法。
[請求項10]
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を希釈し、そして核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物に、少なくとも1つの競合剤を添加する工程を含む、請求項1の方法。
[請求項11]
前記ターゲット分子が、タンパク質、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、ペプチド、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬剤、色素、栄養物、増殖因子、組織、および規制物質からなる群より選択される、請
求項1の方法。
[請求項12]
少なくとも1つのアプタマーが、そのターゲット分子からの遅い解離速度(t1/2)を有する、請求項1の方法。
[請求項13]
前記解離速度(t1/2)が約30分間以上である、請求項12の方法。
[請求項14]
前記解離速度(t1/2)が約30分間〜約240分間の間である、請求項12の方法。
[請求項15]
前記解離速度(t1/2)が、約30分間以上、約60分間以上、約90分間以上、約120分間以上、約150分間以上、約180分間以上、約210分間以上、および約240分間以上の時間からなる群より選択される、請求項12の方法。
[請求項16]
前記の少なくとも1つの競合剤分子が、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン、脱塩基ホスホジエステルポリマー、dNTP、およびピロホスフェートからなる群より独立に選択される、請求項9の方法。
[請求項17]
前記ポリアニオンが、ヘパリン、ニシン精子DNA、サケ精子DNA、硫酸デキストラン、およびポリデキストランからなる群より選択される、請求項16の方法。
[請求項18]
請求項1の方法にしたがって同定されるアプタマー。
[請求項19]
そのターゲット分子からの遅い解離速度(t1/2)を有する、請求項18のアプタマー。
[請求項20]
そのターゲット分子からの約30分間以上の解離速度(t1/2)を有する、請求項18のアプタマー。
[請求項21]
そのターゲット分子からの約30分間〜約240分間の間の解離速度(t1/2)を有する、請求項18のアプタマー。
[請求項22]
そのターゲット分子からの約30分間以上、約60分間以上、約90分間以上、約120分間以上、約150分間以上、約180分間以上、約210分間以上、および約240分間以上の時間からなる群より選択される解離速度(t1/2)を有する、請求項18のアプタマー。
[請求項23]
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが:
(i)核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物が平衡結合を達成することを可能にし;
(ii)(i)の後、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を希釈し;そして
(iii)(ii)の後、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物をインキュベーションする
工程を含む、請求項1の方法。
[請求項24]
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが:
(i)核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物が平衡結合を達成することを可能にし;
(ii)(i)の後、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を、少なくと
も1つの競合剤分子と混合し;
(ii)(ii)の後、競合剤および核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物をインキュベーションする
工程を含む、請求項1の方法。
[請求項25]
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが:
(i)核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物が平衡結合を達成することを可能にし;
(ii)(i)の後、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を、少なくとも1つの競合剤分子と混合し;
(iii)(i)の後、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を希釈し;
そして
(iv)競合剤および核酸−ターゲット分子複合体を含有する希釈された候補混合物をインキュベーションする
工程を含む、請求項1の方法。
[請求項26]
核酸の候補混合物が光反応性ヌクレオチドを含む、請求項1の方法。
[請求項27]
ターゲットからの解離速度が遅いアプタマーであって、前記解離速度(t1/2)が約30分間以上である、前記アプタマー。
[請求項28]
前記解離速度(t1/2)が約30分間〜約240分間の間である、請求項27のアプタマー。
[請求項29]
約30分間以上、約60分間以上、約90分間以上、約120分間以上、約150分間以上、約180分間以上、約210分間以上、および約240分間以上の時間からなる群より選択される解離速度(t1/2)を有する、請求項27のアプタマー。
[請求項30]
ターゲットが、図7に列挙されるターゲットからなる群より選択される、請求項26のアプタマー。
[請求項31]
前記タ−ゲットがタンパク質である、請求項26のアプタマー。
[請求項32]
前記タ−ゲットがペプチドである、請求項26のアプタマー。
[請求項33]
i)切断可能要素、
ii)検出可能要素、
iii)スペーサー要素、および
iv)タグ
からなる群より独立に選択される少なくとも1つの要素を含む、請求項26のアプタマー。
[請求項34]
ターゲットに特異的に結合するアプタマーであって、図14に示される塩基修飾されたピリミジンからなる群より独立に選択される少なくとも1つの塩基修飾されたピリミジンを含む、前記アプタマー。
[請求項35]
5−ブロモウラシル(BrU)、5−ヨードウラシル(IU)、5−ブロモビニルウラシル、5−ヨードビニルウラシル、5−アジドウラシル、4−チオウラシル、5−ブロモシトシン、5−ヨードシトシン、5−ブロモビニルシトシン、5−ヨードビニルシトシン、5−アジドシトシン、8−アジドアデニン、8−ブロモアデニン、8−ヨードアデニン
、8−アジドグアニン、8−ブロモグアニン、8−ヨードグアニン、8−アジドヒポキサンチン、8−ブロモヒポキサンチン、8−ヨードヒポキサンチン、8−アジドキサンチン、8−ブロモキサンチン、8−ヨードキサンチン、5−ブロモデオキシウリジン、8−ブロモ−2’−デオキシアデニン、5−ヨード−2’−デオキシウラシル、5−ヨード−2’−デオキシシトシン、5−[(4−アジドフェナシル)チオ]シトシン、5−[(4−アジドフェナシル)チオ]ウラシル、7−デアザ−7−ヨードアデニン、7−デアザ−7−ヨードグアニン、7−デアザ−7−ブロモアデニン、および7−デアザ−7−ブロモグアニンからなる群より独立に選択される少なくとも1つの光反応性ヌクレオチドをさらに含む、請求項34のアプタマー。
[請求項36]
アントラキノン(AQ)、ソラレン(Psor)、4−アジド−2−ニトロ−アニリン(ANA)、および5−ブロモ−dUTPからなる群より独立に選択される少なくとも1つの光反応基をさらに含む、請求項33のアプタマー。
[請求項37]
そのターゲット分子からの解離速度が遅いアプタマーを同定するための方法であって:
(a)核酸の候補混合物を調製し;
(b)ターゲット分子と候補混合物を接触させ、ここで、候補混合物中、他の核酸に比較してターゲット分子に対して増加したアフィニティを有する核酸がターゲット分子に結合し、核酸−ターゲット分子複合体を形成し;
(c)核酸−ターゲット分子複合体をオフ速度濃縮プロセスに曝露し;
(d)候補混合物から核酸−ターゲット分子複合体を分配し;
(e)核酸−ターゲット分子複合体を解離させて、未結合核酸を生成し;
(f)未結合核酸を増幅して、増加したアフィニティでターゲット分子に結合可能な配列が濃縮された核酸混合物を得て、それによってターゲット分子に対するアプタマーを同定可能であり;
(g)必要に応じて(b)〜(f)を反復し;そして
(h)ターゲット分子に対する少なくとも1つのアプタマーを同定する、ここで、アプタマーがそのターゲット分子からの遅いオフ速度を有する
工程を含む、前記方法。
[請求項38]
前記候補混合物が一本鎖核酸または二本鎖核酸である、請求項37の方法。
[請求項39]
前記候補混合物がDNAまたはRNAを含む、請求項37の方法。
[請求項40]
前記候補混合物が化学的に修飾された核酸を含む、請求項37の方法。
[請求項41]
前記の化学的に修飾された核酸が、リボース位、デオキシリボース位、リン酸位、および塩基位からなる群より独立に選択される1以上の位で化学的置換を含む、請求項40の方法。
[請求項42]
前記の化学的に修飾された核酸が、2’位糖修飾、2’−アミノ(2’−NH2)、2’−フルオロ(2’−F)、2’−O−メチル(2’−OMe)、5位ピリミジン修飾、シトシン環外アミンでの修飾、5−ブロモウラシルの置換、5−ブロモデオキシウリジンの置換、5−ブロモデオキシシチジンの置換、主鎖修飾、メチル化、3’キャップ、および5’キャップからなる群より独立に選択される、請求項40の方法。
[請求項43]
前記の少なくとも1つの化学的修飾が、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[2−(1H−インドール−3イル)エチル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カル
ボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、および5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンからなる群より独立に選択される、請求項40の方法。
[請求項44]
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を希釈する工程を含む、請求項37の方法。
[請求項45]
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物に、少なくとも1つの競合剤を添加する工程を含む、請求項37の方法。
[請求項46]
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を希釈し、そして核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物に、少なくとも1つの競合剤を添加する工程を含む、請求項37の方法。
[請求項47]
前記ターゲット分子が、タンパク質、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、ペプチド、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬剤、色素、栄養物、増殖因子、組織、および規制物質からなる群より選択される、請求項37の方法。
[請求項48]
前記解離速度(t1/2)が約30分間以上である、請求項37の方法。
[請求項49]
前記解離速度(t1/2)が約30分間〜約240分間の間である、請求項37の方法。
[請求項50]
前記解離速度(t1/2)が、約30分間以上、約60分間以上、約90分間以上、約120分間以上、約150分間以上、約180分間以上、約210分間以上、および約240分間以上の時間からなる群より選択される、請求項37の方法。
[請求項51]
前記の少なくとも1つの競合剤分子が、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン、脱塩基ホスホジエステルポリマー、dNTP、およびピロホスフェートからなる群より独立に選択される、請求項45の方法。
[請求項52]
前記ポリアニオンが、ヘパリン、ニシン精子DNA、サケ精子DNA、硫酸デキストラン、およびポリデキストランからなる群より選択される、請求項51の方法。
[請求項53]
請求項37の方法にしたがって同定されるアプタマー。
[請求項54]
そのターゲット分子からの約30分間以上の解離速度(t1/2)を有する、請求項53のアプタマー。
[請求項55]
そのターゲット分子からの約30分間〜約240分間の間の解離速度(t1/2)を有する、請求項53のアプタマー。
[請求項56]
そのターゲット分子からの約30分間以上、約60分間以上、約90分間以上、約120分間以上、約150分間以上、約180分間以上、約210分間以上、および約240分間以上の時間からなる群より選択される解離速度(t1/2)を有する、請求項53のアプタマー。
[請求項57]
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが:
(i)核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物が平衡結合を達成することを可能にし;
(ii)(i)の後、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を希釈し;そして
(iii)(ii)の後、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物をインキュベーションする
工程を含む、請求項37の方法。
[請求項58]
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが:
(i)核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物が平衡結合を達成することを可能にし;
(ii)(i)の後、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を、少なくとも1つの競合剤分子と混合し;
(ii)(ii)の後、競合剤および核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物をインキュベーションする
工程を含む、請求項37の方法。
[請求項59]
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが:
(i)核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物が平衡結合を達成することを可能にし;
(ii)(i)の後、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を、少なくとも1つの競合剤分子と混合し;
(iii)(i)の後、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を希釈し;
そして
(iv)競合剤および核酸−ターゲット分子複合体を含有する希釈された候補混合物をインキュベーションする
工程を含む、請求項37の方法。
[請求項60]
核酸の候補混合物が光反応性ヌクレオチドを含む、請求項37の方法。
[請求項61]
ターゲットからの解離速度が遅いアプタマーであって、前記解離速度(t1/2)が約30分間以上である、前記アプタマー。
[請求項62]
前記解離速度(t1/2)が約30分間〜約240分間の間である、請求項61のアプタマー。
[請求項63]
前記解離速度(t1/2)が、約30分間以上、約60分間以上、約90分間以上、約120分間以上、約150分間以上、約180分間以上、約210分間以上、および約240分間以上の時間からなる群より選択される、請求項61のアプタマー。
[請求項64]
ターゲットが、図7に列挙されるターゲットからなる群より選択される、請求項61のアプタマー。
[請求項65]
前記タ−ゲットがタンパク質である、請求項61のアプタマー。
[請求項66]
前記タ−ゲットがペプチドである、請求項61のアプタマー。
[請求項67]
i)切断可能要素、
ii)検出可能要素、
iii)スペーサー要素、および
iv)タグ
からなる群より独立に選択される少なくとも1つの要素を含む、請求項61のアプタマー。
[請求項68]
ターゲットに特異的に結合する光アプタマーであって、図14に示される塩基修飾されたピリミジンからなる群より独立に選択される少なくとも1つの塩基修飾されたピリミジンを含む、前記光アプタマー。
[請求項69]
少なくとも1つの塩基修飾されたピリミジンが、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[2−(1H−インドール−3イル)エチル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、および5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンからなる群より独立に選択される、請求項68の光アプタマー。
[請求項70]
5−ブロモウラシル(BrU)、5−ヨードウラシル(IU)、5−ブロモビニルウラシル、5−ヨードビニルウラシル、5−アジドウラシル、4−チオウラシル、5−ブロモシトシン、5−ヨードシトシン、5−ブロモビニルシトシン、5−ヨードビニルシトシン、5−アジドシトシン、8−アジドアデニン、8−ブロモアデニン、8−ヨードアデニン、8−アジドグアニン、8−ブロモグアニン、8−ヨードグアニン、8−アジドヒポキサンチン、8−ブロモヒポキサンチン、8−ヨードヒポキサンチン、8−アジドキサンチン、8−ブロモキサンチン、8−ヨードキサンチン、5−ブロモデオキシウリジン、8−ブロモ−2’−デオキシアデニン、5−ヨード−2’−デオキシウラシル、5−ヨード−2’−デオキシシトシン、5−[(4−アジドフェナシル)チオ]シトシン、5−[(4−アジドフェナシル)チオ]ウラシル、7−デアザ−7−ヨードアデニン、7−デアザ−7−ヨードグアニン、7−デアザ−7−ブロモアデニン、および7−デアザ−7−ブロモグアニンからなる群より独立に選択される少なくとも1つの光反応性ヌクレオチドをさらに含む、請求項68の光アプタマー。
[請求項71]
アントラキノン(AQ)、ソラレン(Psor)、4−アジド−2−ニトロ−アニリン(ANA)、および5−ブロモ−dUTPからなる群より独立に選択される少なくとも1つの光反応基をさらに含む、請求項68の光アプタマー。
[請求項72]
ターゲットに特異的に結合するアプタマーを含有する診断キットであって、アプタマーが、図14に示される塩基修飾されたピリミジンからなる群より独立に選択される少なくとも1つの塩基修飾されたピリミジンを含む、前記診断キット。
[請求項73]
前記アプタマーが、5−ブロモウラシル(BrU)、5−ヨードウラシル(IU)、5−ブロモビニルウラシル、5−ヨードビニルウラシル、5−アジドウラシル、4−チオウラシル、5−ブロモシトシン、5−ヨードシトシン、5−ブロモビニルシトシン、5−ヨードビニルシトシン、5−アジドシトシン、8−アジドアデニン、8−ブロモアデニン、8−ヨードアデニン、8−アジドグアニン、8−ブロモグアニン、8−ヨードグアニン、8−アジドヒポキサンチン、8−ブロモヒポキサンチン、8−ヨードヒポキサンチン、8−アジドキサンチン、8−ブロモキサンチン、8−ヨードキサンチン、5−ブロモデオキシウリジン、8−ブロモ−2’−デオキシアデニン、5−ヨード−2’−デオキシウラシル、5−ヨード−2’−デオキシシトシン、5−[(4−アジドフェナシル)チオ]シトシン、5−[(4−アジドフェナシル)チオ]ウラシル、7−デアザ−7−ヨードアデニン、7−デアザ−7−ヨードグアニン、7−デアザ−7−ブロモアデニン、および7−デ
アザ−7−ブロモグアニンからなる群より独立に選択される、少なくとも1つの光反応性ヌクレオチドをさらに含む、請求項72の診断キット。
[請求項74]
前記アプタマーが、アントラキノン(AQ)、ソラレン(Psor)、4−アジド−2−ニトロ−アニリン(ANA)、および5−ブロモ−dUTPからなる群より独立に選択される少なくとも1つの光反応基をさらに含む、請求項72の診断キット。
[請求項75]
そのターゲット分子からの遅い解離速度を有する光アプタマーを同定するための方法であって:
(a)核酸の候補混合物を調製し;ここで、前記候補混合物の各核酸は、少なくとも1つの光反応部分を含有し;
(b)ターゲット分子と候補混合物を接触させ、ここで、候補混合物中、他の核酸に比較してターゲット分子に対して増加したアフィニティを有する核酸がターゲット分子に結合し、核酸−ターゲット分子複合体を形成し;
(c)(b)で形成された核酸−ターゲット分子複合体を、遅いオフ速度の濃縮プロセスに曝露し;
(d)前記核酸−ターゲット分子複合体に照射し、ここで、前記核酸−ターゲット分子が光架橋され;
(e)候補混合物から光架橋された核酸−ターゲット分子複合体を分配し;
(f)光架橋された核酸を増幅して、増加したアフィニティでターゲット分子に結合可能な配列が濃縮された核酸混合物を得て、それによってターゲット分子に対する光アプタマーを同定可能であり;
(g)必要に応じて(b)〜(f)を反復し;そして
(h)ターゲット分子に対する少なくとも1つの光アプタマーを同定する、ここで、該光アプタマーは、そのターゲット分子からの遅い解離速度を有する
工程を含む、前記方法。
[請求項76]
前記光アプタマーが一本鎖核酸または二本鎖核酸である、請求項75の方法。
[請求項77]
前記光アプタマーがDNAまたはRNAを含む、請求項76の方法。
[請求項78]
前記光アプタマーが、5−ブロモウラシル(BrU)、5−ヨードウラシル(IU)、5−ブロモビニルウラシル、5−ヨードビニルウラシル、5−アジドウラシル、4−チオウラシル、5−ブロモシトシン、5−ヨードシトシン、5−ブロモビニルシトシン、5−ヨードビニルシトシン、5−アジドシトシン、8−アジドアデニン、8−ブロモアデニン、8−ヨードアデニン、8−アジドグアニン、8−ブロモグアニン、8−ヨードグアニン、8−アジドヒポキサンチン、8−ブロモヒポキサンチン、8−ヨードヒポキサンチン、8−アジドキサンチン、8−ブロモキサンチン、8−ヨードキサンチン、5−ブロモデオキシウリジン、8−ブロモ−2’−デオキシアデニン、5−ヨード−2’−デオキシウラシル、5−ヨード−2’−デオキシシトシン、5−[(4−アジドフェナシル)チオ]シトシン、5−[(4−アジドフェナシル)チオ]ウラシル、7−デアザ−7−ヨードアデニン、7−デアザ−7−ヨードグアニン、7−デアザ−7−ブロモアデニン、および7−デアザ−7−ブロモグアニンからなる群より独立に選択される少なくとも1つの光反応性ヌクレオチドをさらに含む、請求項76の方法。
[請求項79]
前記光アプタマーが、アントラキノン(AQ)、ソラレン(Psor)、4−アジド−2−ニトロ−アニリン(ANA)、および5−ブロモ−dUTPからなる群より独立に選択される少なくとも1つの光反応基を含む、請求項75の方法。
[請求項80]
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混
合物を希釈する工程を含む、請求項75の方法。
[請求項81]
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物に、少なくとも1つの競合剤を添加する工程を含む、請求項75の方法。
[請求項82]
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を希釈し、そして核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物に、少なくとも1つの競合剤を添加する工程を含む、請求項75の方法。
[請求項83]
前記の少なくとも1つの競合剤が、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン、脱塩基ホスホジエステルポリマー、dNTP、およびピロホスフェートからなる群より独立に選択される、請求項81の方法。
[請求項84]
前記ポリアニオンが、ヘパリン、ニシン精子DNA、サケ精子DNA、および硫酸デキストランからなる群より選択される、請求項83の方法。
[請求項85]
前記解離速度(t1/2)が約30分間以上である、請求項75の方法。
[請求項86]
前記解離速度(t1/2)が約30分間〜約240分間の間である、請求項75の方法。
[請求項87]
前記解離速度(t1/2)が、約30分間以上、約60分間以上、約90分間以上、約120分間以上、約150分間以上、約180分間以上、約210分間以上、および約240分間以上の時間からなる群より選択される、請求項75の方法。
[請求項88]
請求項75の方法にしたがって生成される、光アプタマー。
[請求項89]
そのターゲットからの約30分間以上の解離速度(t1/2)を有する、請求項88の光アプタマー。
[請求項90]
そのターゲットからの約30分間〜約240分間の間の解離速度(t1/2)を有する、請求項88の光アプタマー。
[請求項91]
そのターゲットからの約30分間以上、約60分間以上、約90分間以上、約120分間以上、約150分間以上、約180分間以上、約210分間以上、および約240分間以上の時間からなる群より選択される解離速度を有する、請求項88の光アプタマー。
[請求項92]
ポリアニオン難分解性アプタマーを同定する方法であって:
a)核酸の候補混合物をターゲットと接触させ;
b)混合物が平衡に達することを可能にし、ここで核酸−ターゲット複合体が形成され;
c)ポリアニオン性物質を混合物に添加し、そして混合物をインキュベーションし;
d)候補混合物から核酸−ターゲット分子複合体を分配し;
(e)核酸−ターゲット分子複合体を解離させて、未結合核酸を生成し;
(f)未結合核酸を増幅して、増加したアフィニティでターゲット分子に結合可能な配列が濃縮された核酸混合物を得て、それによってターゲット分子に対するポリアニオン難分解性アプタマーを同定可能であり;
(g)必要に応じて(b)〜(f)を反復し;そして
(h)ターゲット分子に対する少なくとも1つのポリアニオン難分解性アプタマーを同定する
工程を含む、前記方法。
[請求項93]
アプタマーがポリアニオン性物質の存在に対して難分解性である、アプタマー−ターゲット複合体。
[請求項94]
請求項53のアプタマーを含む、バイオチップ。
[請求項95]
請求項53のアプタマーを含む、診断デバイス。
[請求項96]
請求項53のアプタマーを含む、療法物質。
[請求項97]
請求項53のアプタマーを含む、画像化試薬。
[請求項98]
請求項53のアプタマーを含む、組織学的試薬。
[請求項99]
請求項53のアプタマーを含む、病理学試薬。
[請求項100]
請求項53のアプタマーを含む、細胞学試薬。
[請求項101]
請求項53のアプタマーを含む、アフィニティ分離試薬。
[請求項102]
請求項53のアプタマーを含む、バイオセンサー。
[請求項103]
請求項54のアプタマーを含む、ALONAデバイス。
[請求項104]
約30分間以上の解離速度(t1/2)を有する、アプタマー−ターゲット複合体。
[請求項105]
約30分間〜約240分間の間の解離速度(t1/2)を有する、請求項104のアプタマー−ターゲット複合体。
[請求項106]
約30分間以上、約60分間以上、約90分間以上、約120分間以上、約150分間以上、約180分間以上、約210分間以上、および約240分間以上の時間からなる群より選択される解離速度を有する、請求項105のアプタマー−ターゲット複合体。
[請求項107]
前記アプタマーが光アプタマーである、請求項105のアプタマー−ターゲット複合体。
[請求項108]
少なくとも1つの塩基修飾されたピリミジンを含むアプタマーを同定するための方法であって:
(a)核酸の候補混合物を調製し、ここで、核酸は各々、図14に示される塩基修飾されたピリミジンからなる群より独立に選択される、少なくとも1つの塩基修飾されたピリミジンを含み;
(b)ターゲット分子と候補混合物を接触させ、ここで、候補混合物中、他の核酸に比較してターゲット分子に対して増加したアフィニティを有する核酸がターゲット分子に結合し、核酸−ターゲット分子複合体を形成し;
(c)候補混合物から核酸−ターゲット分子複合体を分配し;
(d)核酸−ターゲット分子複合体を解離させて、未結合核酸を生成し;
(e)未結合核酸を増幅して、増加したアフィニティでターゲット分子に結合可能な配列が濃縮された核酸混合物を得て、それによってターゲット分子に対するアプタマーを同定可能であり;
(f)必要に応じて(b)〜(e)を反復し;そして
(g)ターゲット分子に対する少なくとも1つのアプタマーを同定する、ここで、アプタマーは、少なくとも1つの塩基修飾されたピリミジンを含む
工程を含む、前記方法。
[請求項109]
前記アプタマーが少なくとも1つのさらなる化学的修飾をさらに含む、請求項108の方法。
[請求項110]
前記の少なくとも1つのさらなる化学的修飾が、リボース位、デオキシリボース位、リン酸位、および塩基位からなる群より独立に選択される1以上の位での化学的置換である、請求項108の方法。
[請求項111]
前記の少なくとも1つのさらなる化学的修飾が、2’位糖修飾、2’−アミノ(2’−NH2)、2’−フルオロ(2’−F)、2’−O−メチル(2’−OMe)、5位ピリミジン修飾、シトシン環外アミンでの修飾、5−ブロモウラシルの置換、5−ブロモデオキシウリジンの置換、5−ブロモデオキシシチジンの置換、主鎖修飾、メチル化、3’キャップ、および5’キャップからなる群より独立に選択される、請求項108の方法。
[請求項112]
前記の少なくとも1つの塩基修飾されたピリミジンが、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[2−(1H−インドール−3イル)エチル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、および5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンからなる群より独立に選択される、請求項108の方法。
[請求項113]
前記ターゲット分子が、タンパク質、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、ペプチド、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬剤、色素、栄養物、増殖因子、組織、および規制物質からなる群より選択される、請求項108の方法。
[請求項114]
アプタマーが、そのターゲット分子からの遅い解離速度(t1/2)を有する、請求項108の方法。
[請求項115]
前記解離速度(t1/2)が約30分間以上である、請求項114の方法。
[請求項116]
前記解離速度(t1/2)が約30分間〜約240分間の間である、請求項115の方法。
[請求項117]
前記解離速度(t1/2)が、約30分間以上、約60分間以上、約90分間以上、約120分間以上、約150分間以上、約180分間以上、約210分間以上、および約240分間以上の時間からなる群より選択される、請求項116の方法。
[請求項118]
請求項117の方法にしたがって同定されるアプタマー。
[請求項119]
そのターゲット分子からの遅い解離速度(t1/2)を有する、請求項118のアプタマー。
[請求項120]
そのターゲット分子からの約30分間以上の解離速度(t1/2)を有する、請求項1
18のアプタマー。
[請求項121]
そのターゲット分子からの約30分間〜約240分間の間の解離速度(t1/2)を有する、請求項118のアプタマー。
[請求項122]
そのターゲット分子からの約30分間以上、約60分間以上、約90分間以上、約120分間以上、約150分間以上、約180分間以上、約210分間以上、および約240分間以上の時間からなる群より選択される解離速度(t1/2)を有する、請求項118のアプタマー。
[請求項123]
核酸の候補混合物が光反応性ヌクレオチドを含む、請求項118の方法。
[請求項124]
そのターゲット分子からの解離速度が遅いアプタマーを同定するかまたは産生するための方法であって:
(a)核酸の候補混合物を調製し;
(b)ターゲット分子と候補混合物を接触させ、ここで、候補混合物中、他の核酸に比較してターゲット分子に対して増加したアフィニティを有する核酸がターゲット分子に結合し、核酸−ターゲット分子複合体を形成し;
(c)候補混合物およびターゲット分子を、平衡結合を達成するのに十分な期間、一緒にインキュベーションし;
(d)少なくとも1つの競合剤分子を(c)の混合物に過剰に添加し;
(e)(d)由来の候補混合物、ターゲット分子/アプタマー複合体および競合剤分子の混合物を、あらかじめ決定された期間、インキュベーションし;
(f)候補混合物から核酸−ターゲット分子複合体を分配し;
(g)核酸−ターゲット分子複合体を解離させて、未結合核酸を生成し;
(h)未結合核酸を増幅して、増加したアフィニティでターゲット分子に結合可能な核酸配列が濃縮された核酸混合物を得る
工程を含み、それによってターゲット分子に対するアプタマーを同定可能である、前記方法。
[請求項125]
(i)必要に応じて工程(b)〜(h)を反復し;そして
(h)ターゲット分子に対する少なくとも1つのアプタマーを同定する、ここで、アプタマーはそのターゲット分子からの比較的遅い解離速度を有する
工程をさらに含む、請求項124の方法。
[請求項126]
(e)における、あらかじめ決定された期間が:
(i)少なくとも10分間、
(ii)少なくとも20分間、
(iii)少なくとも30分間、
(iv)少なくとも45分間、
(v)少なくとも1時間、
(vi)少なくとも2時間、
(vii)少なくとも3時間、
(viii)少なくとも4時間、
(ix)少なくとも5時間、
(x)少なくとも6時間
より選択される、請求項124または125の方法。
[請求項127]
(g)の未結合核酸または(h)の混合物由来の核酸を配列決定し、それによって前記ターゲットのアプタマーを同定する工程をさらに含む、請求項124〜126のいずれか
の方法。
[請求項128]
こうして同定されたアプタマーに基づいて、アプタマーを調製する工程をさらに含む、請求項124〜126のいずれか一項の方法。
[請求項129]
そのターゲット分子からの解離速度が遅いアプタマーを産生するための方法であって、請求項128記載の方法によって同定されるアプタマーに基づいて、アプタマーを調製する工程を含む、前記方法。
[請求項130]
そのターゲット分子からの解離速度が遅いアプタマーを産生する方法であって:
(a)核酸の候補混合物を調製し;
(b)ターゲット分子と候補混合物を接触させ、ここで、候補混合物中、他の核酸に比較してターゲット分子に対して増加したアフィニティを有する核酸がターゲット分子に結合し、核酸−ターゲット分子複合体を形成し;
(c)候補混合物およびターゲット分子を、平衡結合を達成するのに十分な期間、一緒にインキュベーションし;
(d)少なくとも1つの競合剤分子を(c)の混合物に過剰に添加し;
(e)(d)由来の候補混合物、ターゲット分子/アプタマー複合体および競合剤分子の混合物を、あらかじめ決定された期間、インキュベーションし;
(f)候補混合物から核酸−ターゲット分子複合体を分配し;
(g)核酸−ターゲット分子複合体を解離させて、未結合核酸を生成し;
(h)未結合核酸を増幅して、増加したアフィニティでターゲット分子に結合可能な核酸配列が濃縮された核酸混合物を得る
工程を含み、それによってターゲット分子に対するアプタマーを同定するプロセスによって同定される核酸配列に基づいて、アプタマーを調製するかまたは合成する工程を含む、前記方法。
[請求項131]
(i)必要に応じて工程(b)〜(h)を反復し;そして
(h)ターゲット分子に対する少なくとも1つのアプタマーを同定する、ここで、アプタマーはそのターゲット分子からの比較的遅い解離速度を有する
工程をさらに含む、請求項130の方法。
[請求項132]
少なくとも1つまたは各々の核酸において、1つ、いくつかまたはすべてのピリミジンが、5位で化学的に修飾されている、修飾された核酸を候補混合物が含む、先行する請求項のいずれか一項の方法。
[請求項133]
候補混合物の核酸中のすべてのC残基が、5位で化学的に修飾されている、請求項132の方法。
[請求項134]
候補混合物の核酸中のすべてのT残基が、5位で化学的に修飾されている、請求項132または133の方法。
[請求項135]
候補混合物の核酸中のすべてのU残基が、5位で化学的に修飾されている、請求項132または134の方法。
[請求項136]
5位化学的修飾が:
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[2−(1H−インドール−3イル)エチル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン
クロリド、5−(N−ナフチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、および5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンより選択される、請求項132〜135のいずれか一項の方法。
[請求項137]
5位化学的修飾が、図14に示される化学的修飾の群より独立に選択される、請求項132〜135のいずれか一項の方法。
[請求項138]
そのターゲット分子からの解離速度が遅いアプタマーを同定するかまたは産生する方法であって:
(a)核酸の候補混合物を調製し、ここで、候補混合物の少なくとも1つまたは各々の核酸において、1つ、いくつかまたはすべてのピリミジンが、5位で化学的に修飾されている、修飾された核酸を候補混合物が含み;
(b)ターゲット分子と候補混合物を接触させ、ここで、候補混合物中、他の核酸に比較してターゲット分子に対して増加したアフィニティを有する核酸がターゲット分子に結合し、核酸−ターゲット分子複合体を形成し;
(c)候補混合物の残りからアフィニティが増加した核酸を分配し;そして
(d)アフィニティが増加した核酸を増幅して、増加したアフィニティでターゲット分子に結合可能な核酸配列が濃縮された核酸混合物を得る
工程を含み、それによってターゲット分子に対するアプタマーを同定可能である、前記方法。
[請求項139]
5位化学的修飾が:
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[2−(1H−インドール−3イル)エチル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、および5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンより選択される、請求項138記載の方法。
[請求項140]
5位化学的修飾が、図14に示される化学的修飾の群より独立に選択される、請求項138記載の方法。
[請求項141]
候補混合物の核酸中のすべてのC残基が、5位で化学的に修飾されている、請求項138〜140のいずれか一項の方法。
[請求項142]
候補混合物の核酸中のすべてのT残基が、5位で化学的に修飾されている、請求項138〜141のいずれか一項の方法。
[請求項143]
候補混合物の核酸中のすべてのU残基が、5位で化学的に修飾されている、請求項138〜141の方法。
[請求項144]
(d)の混合物由来の核酸を配列決定し、それによって前記ターゲットのアプタマーを同定する工程をさらに含む、請求項138〜142のいずれか一項の方法。
[請求項145]
こうして同定されたアプタマーに基づいて、アプタマーを調製する工程をさらに含む、請求項138〜143のいずれか一項記載の方法。
[請求項146]
そのターゲット分子からの解離速度が遅いアプタマーを産生するための方法であって、請求項138または143記載の方法によって同定されるアプタマーに基づいて、アプタ
マーを調製する工程を含む、前記方法。
[請求項147]
そのターゲット分子からの解離速度が遅いアプタマーを産生する方法であって:
(a)核酸の候補混合物を調製し、ここで、候補混合物の少なくとも1つまたは各々の核酸において、1つ、いくつかまたはすべてのピリミジンが、5位で化学的に修飾されている、修飾された核酸を候補混合物が含み;
(b)ターゲット分子と候補混合物を接触させ、ここで、候補混合物中、他の核酸に比較してターゲット分子に対して増加したアフィニティを有する核酸がターゲット分子に結合し、核酸−ターゲット分子複合体を形成し;
(c)候補混合物の残りからアフィニティが増加した核酸を分配し;そして
(d)アフィニティが増加した核酸を増幅して、増加したアフィニティでターゲット分子に結合可能な核酸配列が濃縮された核酸混合物を得る
工程を含み、それによってターゲット分子に対するアプタマーを同定するプロセスによって同定される核酸配列に基づいて、アプタマーを調製するかまたは合成する工程を含む、前記方法。
[請求項148]
5位化学的修飾が:
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[2−(1H−インドール−3イル)エチル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、および5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンより選択される、請求項147記載の方法。
[請求項149]
5位化学的修飾が、図14に示される化学的修飾の群より独立に選択される、請求項147記載の方法。
[請求項150]
候補混合物の核酸中のすべてのC残基が、5位で化学的に修飾されている、請求項147〜148のいずれか一項の方法。
[請求項151]
候補混合物の核酸中のすべてのT残基が、5位で化学的に修飾されている、請求項147〜150のいずれか一項の方法。
[請求項152]
候補混合物の核酸中のすべてのU残基が、5位で化学的に修飾されている、請求項147〜150のいずれか一項の方法。
[請求項153]
同定されるかまたは産生されるアプタマー(単数または複数)の解離速度(t1/2)が:
(i)30分間以上;
(ii)約30分間〜約240分間;
(iii)30分間〜60分間
(iv)60分間〜90分間
(v)90分間〜120分間
(vi)120分間〜150分間
(vii)150分間〜180分間
(viii)180分間〜210分間
(ix)210分間〜240分間の間
より選択される、先行する請求項のいずれか一項の方法。
[請求項154]
(i)30分間以上;
(ii)約30分間〜約240分間;
(iii)30分間〜60分間
(iv)60分間〜90分間
(v)90分間〜120分間
(vi)120分間〜150分間
(vii)150分間〜180分間
(viii)180分間〜210分間
(ix)210分間〜240分間の間
の1つより選択される、ターゲットおよびアプタマーの非共有複合体からの解離速度(t1/2)を有する、アプタマー。
[請求項155]
アプタマーおよびそのターゲットの非共有複合体であって、ターゲットからのアプタマーの解離速度(t1/2)が:
(i)30分間以上;
(ii)約30分間〜約240分間;
(iii)30分間〜60分間
(iv)60分間〜90分間
(v)90分間〜120分間
(vi)120分間〜150分間
(vii)150分間〜180分間
(viii)180分間〜210分間
(ix)210分間〜240分間の間
の1つより選択される、前記複合体。
[請求項156]
アプタマーの核酸配列において、1つ、いくつかまたはすべてのピリミジンが、5位で修飾されている、請求項155のアプタマー。
[請求項157]
5位化学的修飾が:
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[2−(1H−インドール−3イル)エチル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、および5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンより選択される、請求項156のアプタマー。
[請求項158]
5位化学的修飾が、図14に示される化学的修飾の群より独立に選択される、請求項157のアプタマー。
[請求項159]
アプタマーの核酸配列中のすべてのC残基が、5位で化学的に修飾されている、請求項156〜158のいずれか一項のアプタマー。
[請求項160]
アプタマーの核酸配列中のすべてのT残基が、5位で化学的に修飾されている、請求項156〜159のいずれか一項のアプタマー。
[請求項161]
アプタマーの核酸配列中のすべてのU残基が、5位で化学的に修飾されている、請求項156〜160のいずれか一項のアプタマー。
[請求項162]
アプタマーおよびターゲットの非共有複合体であって、アプタマーがターゲットに対し
て100nM以下のKdを有し、ターゲットからのアプタマーの解離速度(t1/2)が30分間以上であり、そしてアプタマーの核酸配列中の1つ、いくつかまたはすべてのピリミジンが、5位で修飾されており、修飾が:5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[2−(1H−インドール−3イル)エチル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、および5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンより選択されるか、または図14に示される化学修飾の群より独立に選択される、前記複合体。
Claims (19)
- アプタマーおよびターゲットの非共有複合体であって、アプタマーの核酸配列中の1つ、いくつかまたはすべてのピリミジンが5位で修飾されており、修飾がベンジル、イソブチル、インドール、またはナフチルでの置換を含み、そしてターゲットからのアプタマーの解離速度(t1/2)が30分間以上であり、アプタマーがターゲットに対して約1μM以下の解離定数(Kd)を有する、前記複合体。
- アプタマーの核酸配列中の全てのC、全てのTまたは全てのU残基が5位で化学的に修飾されている、請求項1記載のアプタマーおよびターゲットの非共有複合体。
- ヌクレオチドのC−5修飾が直接的または間接的に結合されている、請求項1記載のアプタマーおよびターゲットの非共有複合体。
- ヌクレオチドのC−5修飾がアミド結合を用いる、請求項3記載のアプタマーおよびターゲットの非共有複合体。
- アプタマーが修飾ヌクレオチド5−ベンジル−dUTP、5−イソブチル−dUTP、または5−トリプトアミノ−dUTPを含む、請求項1記載のアプタマーおよびターゲットの非共有複合体。
- アプタマーの可変領域が修飾ヌクレオチド塩基を含む、請求項1−5のいずれかに記載のアプタマーおよびターゲットの非共有複合体。
- アプタマーの固定領域が修飾ヌクレオチド塩基を含む、請求項1−5のいずれかに記載のアプタマーおよびターゲットの非共有複合体。
- ターゲットからのアプタマーの解離速度(t1/2)が、
(i)約30分間と約240分間の間、
(ii)30分間〜60分間、
(iii)60分間〜90分間、
(iv)90分間〜120分間、
(v)120分間〜150分間、
(vi)150分間〜180分間、
(vii)180分間〜210分間、
(viii)210分間〜240分間、
から選ばれる、請求項1−7のいずれかに記載のアプタマーおよびターゲットの非共有複合体。 - アプタマーが:約100nM未満、約10nM未満、約1nM未満、約100pM未満、約10pM未満、約1pM未満の1つより選択される、そのターゲットに対する解離定数(Kd)を有する、請求項1−8のいずれかに記載のアプタマーおよびターゲットの非共有複合体。
- アプタマーが、図14に示される塩基修飾されたピリミジンからなる群より独立に選択される少なくとも1つの塩基修飾されたピリミジンを含む、請求項1−9のいずれかに記載のアプタマーおよびターゲットの非共有複合体。
- 特定の5位ピリミジン修飾が図14に示されるリンカー(X)を含む、請求項10記載のアプタマーおよびターゲットの非共有複合体。
- 5位の化学修飾が以下のもの:
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、
5−(N−[2−(1H−インドール−3イル)エチル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、および
5−(N−ナフチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、
から選択されるか、または図14に示す化学修飾からなる群より独立に選択される、請求項7記載のアプタマーおよびターゲットの非共有複合体: - アプタマーが、2’−O−メチル(2’−OMe)−、2’−O−アリル、2’−フルオロ(2’−F)−または2’−アミノ(2’−NH2)−および2’−アジドからなる群から選択される糖修飾を含む、請求項1−12のいずれかに記載のアプタマーおよびターゲットの非共有複合体。
- アプタマーが、アラビノース、キシロースおよびリキソースからなる群から選択されるエピマー糖部分を含む、請求項1−13のいずれかに記載のアプタマーおよびターゲットの非共有複合体。
- アプタマーが、P(O)S(「チオエート」)、P(S)S(「ジチオエート」)、P(O)NR2(「アミデート」)、P(O)R、P(O)OR’、COおよびCH2から選択されるホスフェート部分の主鎖修飾(式中、RおよびR’は、独立に、H、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキルおよびC1−20アルキルであり、エーテル(−O−)連結を有していてもよい)を含む少なくとも1つの追加の修飾を含む、請求項1−14のいずれかに記載のアプタマーおよびターゲットの非共有複合体。
- アプタマーが、5−ブロモ−1−ウラシル、5−ヨード−1−ウラシル、5−ブロモビニル−1−ウラシル、5−ヨードビニル−1−ウラシル、5−アジド−1−ウラシル、4−チオ−1−ウラシル、4−チオ−1−シトシル、5−ブロモ−1−シトシル、5−ヨード−1−シトシル、5−ブロモビニル−1−シトシル、5−ヨードビニル−1−シトシル、5−アジド−1−シトシル、8−アジド−9−アデニニル、8−ブロモ−9−アデニニル、8−ヨード−9−アデニニル、8−アジド−9−グアニニル、8−ブロモ−9−グアニニル、8−ヨード−9−グアニニル、8−アジドヒポキサンチニル、8−ブロモヒポキサンチニル、8−ヨードヒポキサンチニル、8−アジド−9−キサンチニル、8−ブロモ−9−キサンチニル、8−ヨード−9−キサンチニル、5−[(4−アジドフェナシル)チオ]−1−シトシル、5−[(4−アジドフェナシル)チオ]−2−ウラシル、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−1−ウラシル、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)1−ウラシル、5−(N−トリプトアミノカルボキシアミド)−1−ウラシル、5−(N−[2−(1H−インドール−3イル)エチル]カルボキシアミド)−1−ウラシル、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−1−ウラシルクロリド、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−1−ウラシル、5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−1−ウラシル、7−デアザ−7−ヨード−9−アデニニル、7−デアザ−7−ヨード−9−グアニニル、7−デアザ−7−ブロモ−9−アデニニル、7−デアザ−7−ブロモ−9−グアニニル、1−イソシチジニルおよび9−イソグアニニルからなる群より選択される、少なくとも1つの追加の修飾塩基を有する、請求項1−15のいずれかに記載のアプタマーおよびターゲットの非共有複合体。
- ターゲットがタンパク質またはペプチドである、請求項1−16のいずれかに記載のア
プタマーおよびターゲットの非共有複合体。 - ターゲットが図7に記載のターゲットからなる群から選択される、請求項1−17のいずれかに記載のアプタマーおよびターゲットの非共有複合体。
- アプタマーの核酸配列中の1つ、いくつかまたはすべてのピリミジンが5位で修飾されており、修飾がベンジル、イソブチル、インドール、またはナフチルでの置換を含み、そしてターゲットからのアプタマーの解離速度(t1/2)が30分間以上であり、アプタマーがターゲットに対して約1μM以下の解離定数(Kd)を有する、アプタマー。
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