KR101747665B1 - 시료의 다중분석 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시료에 존재할 수 있는 하나 또는 그 이상의 표적 분자의 검출을 위한 방법, 기구, 시약 및 키트에 관한 것이다. 상기 기재된 방법, 기구, 키트 및 시약들은 핵산(즉, 압타머)을 검출하고 정량함으로써 시료 내의 비-핵산 표적(예를 들어, 단백질 표적)의 검출 및 정량을 용이하게 한다. 상기 방법은 비-핵산 표적을 대신하여 핵산을 생성하므로 넓은 범위의 원하는 표적, 특히 단백질 표적에 적용되는 증폭을 포함하는 다양한 핵산 기술을 사용할 수 있게 한다는 것을 설명한다. 명세서는 다양한 분석 검출 적용에서 압타머의 사용을 용이하게 하는 압타머 구조체를 더 설명한다.
Description
이 출원은 2007년 7월 17일에 출원된 미국 가출원 특허번호 제60/950,281호, 2007년 7월 17일에 출원된 미국 가출원 특허번호 제60/950,293호, 2007년 7월 17일에 출원된 미국 가출원 특허번호 제60/950,283호, 2008년 2월 26일에 출원된 미국 가출원 특허번호 제61/031,420호 및 2008년 5월 8일에 출원된 미국 가출원 특허번호 제61/051,594호의 이익을 청구하고 있다. 이 출원은 또한 각각 2007년 1월 16일에 출원된 미국 특허출원번호 제11/623,580호 및 미국 특허출원번호 제11/623,535호의 계속 출원이다. 이 참조들 각각은 전체로서 참조에 의해 본원에 통합된다.
본 발명은 일반적으로 샘플에서 표적 분자(target molecule)를 검출하기 위한 방법, 기구, 시약 및 키트에 관한 것이며, 보다 상세하게는 시료(test sample)에 함유될 수 있는 하나 또는 그 이상의 표적 분자의 검출 및/또는 정량에 관한 것이다. 이와 같은 방법은 진단적 적용 뿐만 아니라 바이오마커의 발견 및 치료법의 설계 및 개발에 널리 유용하다.
하기의 명세서는 본 발명에 관련된 정보의 개요를 제공하며, 본원에 제공된 임의의 정보 또는 언급된 간행물들은 현재 청구된 발명에 대한 종래기술일 뿐 특허에 관한 것은 아니다.
생물학적 샘플들 및 다른 샘플들에서 생리학적으로 중요한 분자들의 검출 및 정량을 유도하는 검정법(assay)은 과학적 연구 및 건강관리 분야에서의 중요한 수단이다. 이러한 검정법의 종류 중 하나는 고체 지지체 상에 고정된 하나 또는 그 이상의 압타머(aptamers)를 포함하는 마이크로어레이(microarray)의 이용을 포함한다. 상기 압타머들은 각각 매우 특이적인 방식과 매우 높은 친화력으로 표적 분자에 결합할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허등록번호 제5,475,096호("Nucleic Acid Ligands")를 참조하라. 또한, 미국 특허등록번호 제6,242,246호, 미국 특허등록번호 제6,458,543호 및 미국 특허등록번호 제6,503,715호(각각 "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip")를 참조하라. 일단 마이크로어레이가 샘플과 접촉하면, 압타머들은 샘플 내에 존재하는 각각의 표적 분자들에 결합하고, 그것에 의하여 샘플 내 표적 분자들의 부재, 존재, 양 및/또는 농도를 측정할 수 있다.
이 검정법의 변형은 압타머들이 그것의 표적 분자들에 공유적으로 결합하거나 "광교차결합(photocrosslink)"을 할 수 있게 하는 광반응성 작용기를 포함하는 압타머들을 사용한다. 예를 들어, 미국 특허등록번호 제6,544,776호("Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip")를 참조하라. 이러한 광반응성 압타머들은 또한 광압타머(photoaptamers)라고도 칭해진다. 예를 들어, 미국 특허등록번호 제5,763,177호, 미국 특허등록번호 제6,001,577호 및 미국 특허등록번호 제6,291,184호(각각 "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX")를 참조하라. 또한, 미국 특허등록번호 제6,458,539호("Photoselection of Nucleic Acid Ligands")를 참조하라. 마이크로어레이를 샘플과 접촉시킨 후 광압타머들은 표적 분자들에 결합할 기회를 가지게 되고, 상기 광압타머들은 광활성화되며, 고체 지지체는 임의의 비특이적으로 결합한 분자들을 제거하기 위하여 세척된다. 광압타머 상의 광활성화된 작용기들에 의해 만들어진 공유결합 때문에 광압타머들에 결합된 표적 분자들은 일반적으로 잘 제거되지 않으므로, 엄격한 세척 조건이 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 검정법은 시료 내 표적 분자들의 부재, 존재, 양 및/또는 농도를 측정할 수 있다.
이러한 검정법의 형식들 모두에서, 상기 압타머들은 샘플과 접촉되기 전에 고체 지지체 상에 고정된다. 그러나 어떤 환경 하에서는, 샘플과 접촉하기 전의 압타머의 고정화는 최적의 검정을 제공하지 않을 수 있다. 예를 들어, 압타머의 전고정화(pre-immobilization)는 고체 지지체의 표면상에서 표적 분자들과 압타머들의 비효율적 혼합을 야기할 수 있으며, 아마도 반응시간이 길어지게 되므로 표적 분자들에 압타머들이 효율적으로 결합할 수 있도록 하기 위한 배양 기간이 늘어나게 된다. 게다가, 광압타머들이 검정법에 사용되고 고체 지지체로서 사용된 물질에 좌우되는 경우, 상기 고체 지지체는 광압타머와 그것의 표적 분자들간의 공유결합 형성에 영향을 주기 위하여 사용된 빛을 산란시키거나 흡수하는 경향이 있을 수 있다. 더욱이, 사용된 방법에 의존하는 압타머에 결합된 표적 분자들의 검출은 고체 지지체의 표면이 또한 사용된 임의의 표지 시약에 노출될 수 있고 영향을 받을 수 있기 때문에 부정확해질 수 있다. 결론적으로, 고체 지지체 상의 압타머의 고정화는 일반적으로 샘플에 압타머를 노출시키기 전 압타머-준비 단계(aptamer-preparation step; 즉, 고정화)를 포함하며, 이 준비 단계는 압타머의 활성 또는 기능성에 영향을 줄 수 있다.
따라서, 하나 또는 그 이상의 (1) 압타머의 활성, (2) 압타머-표적 분자 복합체에 대한 결합 평형상태 달성의 효율, (3) 압타머와 그것의 표적 분자간의 공유결합 형성, (4) 관련없는 시료 성분 및 초과된 압타머의 제거, (5) 느린 오프-레이트(slow off-rate)를 가지는 압타머의 사용을 통하여 형성된 친화 복합체의 분리(dissociation), 및 (6) 압타머-표적 분자 복합체의 검출에 영향을 주는 조건을 최적화시킴으로써, 시료 내 표적 분자들의 검출 및/또는 정량을 위한 높은 민감도의 검정법을 제공하는 방법, 기구, 시약 및 키트가 필요하다.
본 명세서는 시료에 존재할 수 있는 하나 또는 그 이상의 표적 분자들의 검출 및/또는 정량을 위한 방법, 기구, 시약 및 키트를 포함한다. 더욱 상세하게는, 본 명세서는 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)로부터 자유 표적(free target) 및 자유 압타머들을 모두 제거하여 검정법에서 노이즈(noise)의 잠재적 원인을 제거하는 것에 의한 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)의 정제 방법을 제공한다. 본 발명의 명세서는 또한 표적 분자의 정량을 위한 압타머- 및 광압타머에 기초한 검정법을 제공하며, 여기에서 상기 압타머(또는 광압타머)는 임의의 적절한 핵산 검출 방법을 사용하는 최종 검출을 위하여 압타머 친화 복합체(또는 광압타머 공유결합 복합체)로부터 분리될 수 있다. 본 명세서는 또한 압타머 친화 복합체(또는 광압타머 공유결합 복합체)로부터 검정 성분의 분리를 용이하게 하고, 검출 및/또는 정량을 위하여 압타머를 분리할 수 있게 하는 압타머 구조체(constructs)를 기재한다. 본 명세서는 또한 표적으로부터의 느린 오프-레이트와 개선된 결합 효율을 가지는 압타머를 사용함으로써 개선된 민감성 및 특이성을 제공하는 방법, 기구, 키트 및 시약을 기재한다. 본 명세서는 또한 시료의 다중화 분석을 위한 방법, 기구, 키트 및 시약을 제공하며, 여기에서 시료 내의 다중 표적은 동시에 검출되고/되거나 정량화될 수 있다. 궁극적으로, 이 방법 및 시약들은 표적 농도(예를 들어, 시료 내의 단백질 표적 농도)를 임의의 다양한 핵산 검출 및 정량 방법에 의해 검출되고 정량될 수 있는 핵산 농도로 전환시킬 수 있다. 게다가, 일단 상기 표적 농도가 대응하는 핵산 농도로 효과적으로 전환되면, 그 후 시그널을 증가시키기 위한 표준 핵산 증폭 및 검출 단계를 사용할 수 있다. 본 명세서에 따른 방법은 시험관 내(in vitro)에서 수행될 수 있다.
단일 포획 친화 검정법(Single Catch Affinity Assay)
한 실시예에서, 시료는 표적 분자에 대하여 특이적인 친화력을 가지는 압타머와 접촉된다. 만일 시료가 표적 분자를 함유하고 있다면, 시료와의 혼합물 내에서 압타머 친화 복합체가 형성될 것이다. 한 실시예에서, 태그는 압타머 친화 복합체의 표적 분자에 부착된다. (상기 태그는 압타머 친화 복합체를 파괴하지 않는 방법으로 표적에 부착될 수 있게 설계된다는 것에 유의한다.) 다른 실시예에서, 상기 태그는 압타머 친화 복합체의 형성 전에 표적에 부착된다. 다른 실시예에서, 상기 태그는 고체 지지체 상의 포획 성분에 혼합물을 노출시키기 전의 임의의 시점에 표적에 첨가된다. 상기 태그된 압타머 친화 복합체는 다음에 고체 지지체에 혼합물을 노출시킴으로써 고체 지지체 상에서 포획된다. 상기 부착은 압타머 친화 복합체와 고체 지지체를 접촉시키고, 고체 지지체에 부착된 적절한 포획제(capture agents)를 사용하여 직접 또는 간접적으로 결합시키기 위하여 태그와 접촉하게 함으로써 달성된다. 고체 지지체 상의 포획제와 결합된 상기 압타머 친화 복합체는 시료 혼합물의 잔여물로부터 분리된다. 압타머 친화 복합체 내에서 표적과 착물화된 압타머는 압타머 친화 복합체의 분리에 의해 고체 지지체로부터 방출될 수 있다. 마지막으로, 상기 방출된 압타머는 질량 분석법(mass spectrometry), 침입성 검정법(Invader assay method), 핵산 칩(nucleic acid chip), 정량 중합효소 연쇄반응법(quantitative polymerase chain reaction; Q-PCR) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 다양한 적절한 핵산 검출 방법을 사용하여 검출되고/되거나 정량화될 수 있다. 어떤 실시예에서, 사용된 특정 핵산 검출 방법에 따라 상기 압타머는 검출될 수 있지만, 여전히 압타머 친화 복합체의 일부분만이 검출된다.
이중 포획 친화 검정법(Dual Catch Affinity Assay)
다른 실시예에서, 방출가능한 태그를 포함하고 표적 분자에 대하여 특정 친화력을 가지는 압타머와 시료를 접촉시킨다. 만일 시료가 표적 분자를 함유한다면, 시료를 포함하는 혼합물 내에 압타머 친화 복합체가 형성될 것이다. 상기 압타머 친화 복합체는 제1 고체 지지체에 혼합물을 노출시킴으로써 제1 고체 지지체 상에서 포획된다. 상기 부착은 압타머 친화 복합체와 제1 고체 지지체를 접촉시키고, 제1 고체 지지체에 부착된 적절한 제1 포획제와 압타머를 직접적 또는 간접적으로 결합시키기 위하여 압타머 상에 포함된 방출가능한(releasable) 제1 태그를 접촉시킴으로써 달성된다. 압타머 친화 복합체에 더하여 비착물화된(uncomplexed) 압타머 또한 제1 고체 지지체에 부착될 것이라는 것에 유의한다. 그 후, 고체 지지체 상의 프로브와 결합된 상기 압타머 친화 복합체 및 비착물화된 압타머는 혼합물의 잔여물로부터 분리되고, 그것에 의하여 시료 내(샘플 매트릭스)에서의 자유 표적과 모든 다른 비착물화된 물질; 즉 제1 고체 지지체와 결합되지 않은 혼합물의 성분들이 제거된다. 이어서 임의의 비착물화된 압타머와 함께 분리된 압타머 친화 복합체는 사용된 특정의 방출가능한 제1 태그에 적절한 방법을 사용하여 제1 지지체로부터 방출된다. (방출가능한 제1 태그와 동일하거나 다를 수 있는) 제2 태그는 압타머 친화 복합체의 표적 분자에 부착된다. 상기 제2 태그는 상기 압타머 친화 복합체를 파괴하지 않는 방식으로 표적에 부착될 수 있도록 설계된다. 상기 압타머 친화 복합체는 제2 고체 지지체에 방출된 압타머 친화 복합체를 노출시킴으로써 제2 고체 지지체에 부착된 적절한 제2 포획제와 직접적 또는 간접적으로 결합시키기 위하여 제2 태그와 접촉시킴으로써 제2 고체 지지체 상에 포획된다. 고체 지지체 상의 프로브에 결합된 상기 압타머 친화 복합체는 혼합물의 잔여물로부터 분리되고, 그것에 의해 임의의 자유, 비착물화된 압타머는 제거된다. 상기 압타머 친화 복합체 내에서 표적과 착물화된 압타머들은 압타머 친화 복합체의 분리에 의해 고체 지지체로부터 방출될 수 있다. 마지막으로 상기 압타머 친화 복합체로부터 방출된 압타머들은 질량 분석법, 침입성 검정법, DNA 칩, 정량 중합효소 연쇄반응법(quantitative polymerase chain reaction; Q-PCR) 등을 포함하지만 이제 제한되지는 않는 임의의 다양한 적절한 핵산 검출 방법을 사용하여 검출되고/되거나 정량화될 수 있다. 어떤 실시예에서, 상기 표적은 제2 태그와 반응할 수 있지만, 압타머 친화 복합체는 여전히 제1 지지체에 고정되어 있다. 분리 단계 후 제2 태그를 첨가하는 것은 압타머 친화 복합체의 일부분이 아닌 표적 분자들의 표지를 제거한다. 어떤 실시예에서, 핵산 검출 방법이 사용되는 경우, 압타머는 검출될 수 있지만, 여전히 압타머 친화 복합체의 일부분만이 검출된다.
단일 포획 광가교결합 검정법(Single Catch Photocrosslink Assay)
다른 실시예에서, 시료는 표적 분자에 대한 특정 친화력을 가지는 광압타머와 접촉된다. 만일 시료가 표적 분자를 포함한다면, 시료를 포함하는 혼합물 내에 광압타머 친화 복합체가 형성될 것이다. 상기 압타머 복합체는 광가교결합 기(photocrosslinking group)의 적절한 여기(excitation)에 의해 압타머 공유결합 복합체로 전환된다. 상기 태그는 압타머 공유결합 복합체를 파괴하지 않는 방법으로 표적에 부착될 수 있도록 설계된다. 상기 압타머 공유결합 복합체는 고체 지지체에 혼합물을 노출시킴으로써 고체 지지체 상에 포획된다. 상기 부착은 압타머 공유결합 복합체와 고체 지지체를 접촉시키고, 고체 지지체에 부착된 적절한 포획제와 직접적 또는 간접적으로 결합시키기 위하여 태그와 접촉시킴으로써 달성된다. 고체 지지체 상의 포획제와 결합된 압타머 공유결합 복합체는 시료 혼합물의 잔여물로부터 분리되고, 그것에 의해 임의의 자유 광압타머가 제거된다. 압타머 공유결합 복합체의 일부분인 광압타머는 침입성 검정법, 정량 중합효소 연쇄반응법 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 다양한 방법을 사용하여 (여전히 고체 지지체에 부착되어 있는 동안) 검출되고/되거나 정량화될 수 있다.
다른 실시예에서, 광압타머의 검출, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응법과 같은 핵산 증폭 단계 전에 변형된 상기에 기재된 단일 포획 광가교결합 검정법은 고체 지지체에 결합된 압타머 공유결합 복합체의 일부분인 하나 또는 그 이상의 광압타머 복제를 만들기 위하여 사용될 수 있다. 그 후, 이 압타머들의 복제들은 방출될 수 있고, 이어서 질량 분석법, 침입성 검정법, 질량분석기, DNA 칩, 정량 중합효소 연쇄반응법 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 다양한 적절한 방법을 사용하여 검출되고/되거나 정량화될 수 있다.
단일 포획 광가교결합 검정법의 다른 실시예에서, 광압타머의 광가교결합 기는 절단가능한 링커(cleavable linker)를 통해 압타머에 부착된다. 한 실시예에서, 이 절단가능한 링커는 광절단가능한 링커(photocleavable linker)지만, 화학 절단가능한 링커(chemically cleavable linker) 또는 검정법에서 임의의 원하는 부위에서 태그로부터 표적 분자를 방출하도록 절단할 수 있는 임의의 다른 절단가능한 링커일 수 있다. 이 실시예에서, 상기에 기재된 염기성 단일 포획 광가교결합 검정법은 광압타머의 검출 전에 변형되고, 상기 절단가능한 링커는 고체 지지체에 결합된 광압타머 공유결합 복합체로부터 광압타머를 방출하기 위해 사용된다. 이 방출된 압타머들은 침입성 검정법, DNA 칩, 정량 중합효소 연쇄반응법 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 다양한 적절한 방법을 사용하여 검출되고/되거나 정량화될 수 있다.
단일 포획 광가교결합 검정법의 또 다른 실시예에서, 표적 분자에 부착된 태그는 절단가능한 링커를 통하여 부착된다. 한 실시예에서, 이 절단가능한 링커는 광절단가능한 링커이다. 이 검정법의 다른 실시예에서, 상기 태그는 화학 절단가능한 링커 또는 검정법에서 임의의 원하는 부위에서 태그로부터 표적 분자를 방출하도록 절단할 수 있는 임의의 다른 절단가능한 링커를 통해 부착된다. 이 실시예에서, 상기에 기재된 단일 포획 광가교결합 검정법은 광압타머의 검출 전에 변형되고, 상기 절단가능한 링커는 고체 지지체로부터 광압타머 공유결합 복합체를 방출하기 위해 사용된다. 상기 방출된 압타머 공유결합 복합체들은 질량 분석법, 침입성 검정법, DNA 칩, 정량 중합효소 연쇄반응법 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 다양한 적절한 방법을 사용하여 검출되고/되거나 정량화될 수 있다.
이중 포획 광가교결합 검정법(Dual Catch Photocrosslink Assay)
다른 실시예에서, 시료는 표적 분자에 대한 특정 친화력을 가지는 제1 방출가능한 태그를 함유하는 광압타머와 접촉된다. 만일 시료가 표적 분자를 함유한다면, 시료를 포함하는 혼합물 내에 광압타머 친화 복합체가 형성될 것이다. 상기 광압타머 친화 복합체는 광가교결합 기의 적절한 여기에 의해 압타머 공유결합 복합체로 전환된다. 상기 압타머 공유결합 복합체는 제1 고체 지지체에 혼합물을 노출시킴으로써 제1 고체 지지체 상에 포획된다. 상기 부착은 상기 압타머 공유결합 복합체와 제1 고체 지지체를 접촉시키고, 제1 고체 지지체에 부착된 적절한 제1 포획제와 직접적 또는 간접적으로 결합시키기 위하여 광압타머 상에 포함된 방출가능한 제1 태그와 접촉시킴으로써 달성된다. 광압타머 공유결합 복합체에 더하여 비착물화된 광압타머들 또한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 고체 지지체 상의 프로브에 결합된 압타머 공유결합 복합체와 비착물화된 압타머는 혼합물의 잔여물로부터 분리되고, 그것에 의해 시료 내(샘플 매트릭스)에서 자유 표적 및 모든 다른 비착물화된 물질들이 제거된다. 다음으로 임의의 비착물화된 광압타머와 함께 분리된 광압타머 공유결합 복합체는 사용된 특정의 방출가능한 제1 태그에 적절한 방법을 사용하여 고체 지지체로부터 방출된다. 제2 태그는 압타머 공유결합 복합체의 표적 분자에 부착된다. 상기 제2 태그는 상기 압타머 공유결합 복합체가 파괴되지 않는 방법으로 표적에 부착될 수 있도록 설계된다. 상기 압타머 공유결합 복합체는 제2 고체 지지체에 방출된 압타머 공유결합 복합체를 노출시킴으로써 제2 고체 지지체 상에 포획된다. 상기 부착은 압타머 공유결합 복합체와 제2 고체 지지체를 접촉시키고, 상기 제2 고체 지지체에 부착된 적절한 제2 포획제와 직접적 또는 간접적으로 결합시키기 위하여 제2 태그와 접촉시키는 것에 의해 달성된다. 고체 지지체 상의 제2 포획제와 결합된 압타머 공유결합 복합체는 혼합물의 잔여물로부터 분리되고, 그것에 의해 임의의 자유 광압타머가 제거된다. 압타머 공유결합 복합체의 일부분인 광압타머는 침입성 검정법, 질량분석법, DNA 칩, 정량 중합효소 연쇄반응법(quantitative polymerase chain reaction; Q-PCR) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 다양한 적절한 방법을 사용하여 (고체 지지체 상에 여전히 부착되어 있는 동안) 검출되고/되거나 정량화될 수 있다.
다른 실시예에서, 검출, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응법과 같은 핵산 증폭 단계 전에 변형된 상기에 기재된 이중 포획 광가교결합 검정법은 고체 지지체에 결합된 압타머 공유결합 복합체의 일부분인 하나 또는 그 이상의 광압타머 복제를 만들기 위하여 사용된다. 이 압타머들의 복제들은 방출될 수 있고, 이어서 질량 분석법, 침입성 검정법, DNA 칩, 정량 중합효소 연쇄반응법(quantitative polymerase chain reaction; Q-PCR) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 다양한 적절한 방법을 사용하여 검출되고/되거나 정량화될 수 있다.
다른 실시예에서, 상기에 기재된 이중 포획 광가교결합 검정법은 광압타머의 광가교결합 기가 절단가능한 링커를 통해 압타머에 부착되도록 변형된다. 이 검정법의 다른 실시예에서, 광압타머의 광가교결합 기는 화학절단가능한 링커(chemically cleavable linker) 또는 검정법에서 임의의 원하는 부위에서 태그로부터 표적 분자를 방출하도록 절단할 수 있는 임의의 다른 적절한 절단가능한 링커를 통해 압타머에 부착된다. 이 실시예에서, 상기에 기재된 이중 포획 광가교결합 검정법은 광압타머의 검출 전에 절단가능한 링커가 고체 지지체에 결합된 광압타머 공유결합 복합체로부터 광압타머를 방출시키는 데 사용되도록 변형된다. 상기 방출된 압타머들은 질량 분석법, 침입성 검정법, DNA 칩, 정량 중합효소 연쇄반응법(quantitative polymerase chain reaction; Q-PCR) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 다양한 적절한 방법을 사용하여 검출되고/되거나 정량화될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 이중 포획 광가교결합 검정에서의 표적 분자에 부착된 태그는 절단가능한 링커를 통해 부착된다. 한 실시예에서, 이 절단가능한 링커는 광절단가능한 링커이다. 이 검정법의 다른 실시예에서, 상기 태그는 화학절단가능한 링커 또는 검정법에서 임의의 원하는 부위에서 태그로부터 표적 분자를 방출하도록 절단할 수 있는 임의의 다른 적절한 절단가능한 링커를 통해 부착된다. 이 실시예에서, 상기에 기재된 이중 포획 광가교결합 검정법은 광압타머의 검출 전에 절단가능한 링커가 고체 지지체로부터 광압타머 공유결합 복합체를 방출시키는 데 사용되도록 변형된다. 상기 방출된 광압타머 공유결합 복합체들은 질량 분석법, 침입성 검정법, DNA 칩, 정량 중합효소 연쇄반응법(quantitative polymerase chain reaction; Q-PCR) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 다양한 적절한 방법을 사용하여 검출되고/되거나 정량화될 수 있다.
동적 유발(Kinetic Challenge)
다른 실시예에서, 동적 유발은 본원에 기재된 검정법의 특이성(specificity) 및 민감성(sensitivity)을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 동적 유발은 각각 2007년 1월 16일에 출원된, 특정 검정법의 특이성을 증가시키기 위하여 비특이적 복합체에 관한 특정 압타머 표적 복합체의 상대적으로 긴 오프-레이트를 사용하는 것에 대한 내용을 제공하는 미국 특허출원번호 제11/623,580 및 미국 특허출원번호 제11/623,535에 처음으로 기재되었고, 각각의 내용들 모두는 전체로서 참조에 의해 본원에 통합된다. 게다가, 전체로서 참조에 의해 본원에 통합되어 있는 2008년 7월 17일에 출원된 미국 특허출원번호 제12/175,434("Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates")는 느린 오프-레이트의 압타머가 SELEX 공정 동안 느린 오프-레이트 강화 공정을 적용하고/적용하거나 어떤 변형된 뉴클레오티드를 사용함으로써 확인될 수 있다는 것을 개시하고 있다(전체로서 참초제 의해 본원에 통합되어 있는 2008년 7월 17일에 출원된 미국 특허출원번호 제12/175,388호 "Improved SELEX and PhotoSELEX"를 참조하라).
상기에 기재된 검정법들(단일 포획 친화 검정법, 이중 포획 친화 검정법, 단일 포획 광가교결합 검정법 및 이중 포획 광가교결합 검정법)은 각각 동적 유발의 사용을 통하여 개선될 수 있다. 단지 실례를 목적으로, 하기에 동적 유발이 이중 포획 친화 검정법 및 이중 포획 광가교결합 검정법의 선택된 실시예에 어떻게 첨가될 수 있는지를 기재하였다. 동적 유발은 유사한 방법으로 임의의 다른 검정법 및 본원에 기재된 방법에 첨가될 수 있음을 알아야 한다. 상기 동적 유발은 본원에 기재된 다양한 실시예에 기재된 단계들에 더하여 임의의 원하는 검정법 및 방법의 임의의 적절한 부분에 첨가될 수 있음을 알아야 한다.
한 실시예에서, 동적 유발은 제1 고체 지지체 상의 프로브와 결합된 압타머 친화 복합체 및 비착물화된 압타머가 혼합물의 잔여물로부터 분리되는 단계 후, 압타머 친화 복합체 내의 압타머가 방출되거나 직접적으로 검출 또는 정량되는 단계 전에 이중 포획 친화 검정법 내로 삽입된다. 한 실시예에서, 상기 동적 유발은 압타머 친화 복합체가 제1 고체 지지체로부터 방출된 후에 수행된다. 이 실시예에서, 상기 동적 유발은 고농도의 경쟁분자(competitor)를 함유하는 버퍼에 압타머 친화 복합체를 방출한 후, 압타머 친화 복합체의 분리 반감기(dissociation half life) 이하의 시간 동안 경쟁분자 용액에서 압타머 친화 복합체를 배양함으로써 수행된다.
다른 실시예에서, 동적 유발은 압타머 친화 복합체의 형성 후 광가교결합 단계 전에 이중 포획 광가교결합 검정법 내로 삽입된다. 한 실시예에서, 상기 동적 유발은 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물에 경쟁분자를 첨가한 후, 압타머 친화 복합체의 분리 반감기(dissociation half life) 이하의 시간 동안 경쟁분자 용액에서 압타머 친화 복합체를 배양함으로써 수행된다.
검출 및 정량 방법
상기에 언급한 바와 같이, 질량 분석법, 침입성 검정법, DNA 칩, 정량적 PCR 방법 등을 포함하는 다수의 서로 다른 핵산 검출 기술을 사용함으로써 압타머 친화 복합체(또는 광가교결합 검정법의 경우에 압타머 공유결합 복합체)를 검출할 수 있다.
한 실시예에서, 상기 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)는 DNA 칩을 사용하여 검출되고/되거나 정량화된다. 이 실시예에서, 고체 지지체에 결합된 상기 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)는 용리되고, DNA 칩 상에 인쇄된 상보적 프로브 서열(complementary probe sequence)과 혼성화된다. 한 실시예에서, 상기 상보적 프로브 서열은 압타머 전체에 대하여 상보적이다. 다른 실시예에서, 상기 상보적 프로브 서열은 단지 압타머의 일부분에 대해서만 상보적이다. 다른 실시예에서, 상기 프로브는 혼성화를 목적으로 압타머에 첨가된 서열에 대하여 상보적이다. DNA 칩 상에 혼성화된 압타머(또는 광압타머)를 검출하기 위하여, 표지(label)가 도입될 수 있다. 한 실시예에서, 상기 표지는 압타머가 합성될 때 압타머 내로 혼입된다. 예를 들어, 형광 염료(fluorescent dye)가 화학적으로(또는 효소적으로) 합성된 압타머 내로 혼입될 수 있다. 한 실시예에서, 표지는 압타머를 합성하는 동안에 압타머에 첨가된다. 다른 실시예에서, 표지는 검정 전, 동안 또는 후의 어느 때에 압타머에 첨가된다. 다른 실시예에서, PCR과 같은 핵산 증폭 기술은 압타머(또는 광압타머)의 개체수를 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 이 경우에, 표지는 또한 증폭 단계의 일부분으로서 혼입될 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 압타머 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)는 질량 분석법을 사용하여 검출되고/되거나 정량화된다. 이 실시예에서, 고체 지지체에 결합된 상기 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)는 용리되고, 확인을 위해 사용될 수 있는 피크의 스펙트럼을 보이는 질량 분석법을 사용하여 분석되며, 그것에 의해 표적 분자를 검출한다. 일단 표적 분자가 검출되면, 그것은 또한 선택적으로 임의의 수의 적절한 기술에 의해 정량화될 수 있다. 한 실시예에서, 상기 표적 분자가 단백질이거나 폴리펩티드인 경우, 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)를 분석하기 위하여 질량 분석법을 사용하기 전에, 상기 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)는 표적 분자를 확인하는 데 사용할 수 있는 결합 표적 분자의 단편을 생산하기 위하여, 예를 들어 프로테이나아제 K 또는 트립신과 같은 프로테아제 효소로 절단하여 표적 분자의 검출 및 선택적 정량을 할 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)는 Q-PCR을 사용하여 검출되고/되거나 정량화된다. 상기에 언급한 바와 같이, 이것은 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)가 고체 지지체에 부착되어 있는 동안 또는 고체 지지체로부터 분리된 후에 완료될 수 있다. 상기 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)는 PCR을 수행하고 시료 내에서 그것의 표적 분자에 결합된 압타머의 양 또는 농도를 직접적 또는 간접적으로 검출함으로써 정량화된다. 시료 내에서 상기 표적 분자의 양 또는 농도는 일반적으로 Q-PCR을 사용하여 정량화된 압타머의 양 또는 농도에 직접적으로 비례한다. 이 방법에서 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)를 정량하는 데 사용될 수 있는 대표적인 방법은 TaqMan® 검정법(TaqMan® assay; PE Biosystems, Foster City, Calif.; US. Pat. No.5,210,015 또한 참조하라)이다.
다른 실시예에서, 상기 압타머는 선택적으로 검출 및/또는 정량 전에 그것의 대응하는 표적 분자로부터 분리된다. 자유 압타머는 핵산의 검출 및/또는 정량에 대한 임의의 공지의 적절한 방법을 사용하여 검출되고 측정될 수 있다.
다중 검정법(Multiplexed Assays)
다른 실시예에서, 상기에 기재된 검정법 및 방법은 두개 또는 그 이상의 표적을 검출 및/또는 정량하는 데 사용된다. 한 실시예에서, 다중 압타머들은 다중 표적을 정량하고/하거나 검출하기 위하여 이중 포획 친화 검정법에서 사용된다. 압타머 친화 복합체들로부터 압타머들이 마지막으로 분리된 후, 각각의 압타머들은 그 후 핵산의 다중 검출에 적합한 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 한 방법에서, 다중 DNA 칩이 상기 압타머의 검출 및/또는 정량에 사용된다. 본원에 기재된 임의의 검정법은 다중 표적을 검출하기 위하여 다중화된 방식으로 수행될 수 있다. 다중화 규모에 대한 어떠한 제한도 없기 때문에, 이 다중 검정법들은 예를 들어, 2 또는 그 이상의 표적, 10개 또는 그 이상의 표적, 25개 또는 그 이상의 표적, 50개 또는 그 이상의 표적, 100개 또는 그 이상의 표적, 250개 또는 그 이상의 표적, 500개 또는 그 이상의 표적, 또는 1000개 또는 그 이상의 표적을 검출하는 데 사용될 수 있다.
시약 및 키트
한 실시예에서, 진단 키트, 바이오마커 발견 키트, 환경 테스트 키트, 생물학적위험(biohazard) 또는 생물무기(bioweapons) 검출 키트를 제한 없이 포함하는 다양한 검출 적용을 위한 키트, 및 생명과학(life science) 및 분석화학 적용에서 표적을 검출하기 위한 키트가 본원에 기재된 방법에 기초하여 제조될 수 있다.
상세한 설명
본 발명의 실시는 다른 언급이 없는 한 당업자 수준 내의 화학, 미생물학, 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술의 기존 방법을 사용한다. 이러한 기술들은 문헌에 충분히 설명되어 있다(Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Current Edition); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. Ⅰ&Ⅱ (D.Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition).
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 공개된 특허 문헌 및 특허 출원서는 발명에 관련된 당업자들의 수준을 나타내는 것이다. 본원에 인용된 모든 간행물, 공개된 특허 문헌 및 특허 출원서는 여기서 각 간행물, 공개된 특허 문헌 또는 특허 출원서가 특이적이고 개별적으로 참고로서 통합됨을 나타내는 것과 동일한 정도로 참고로서 통합된다.
본 명세서는 시료 내 존재할 수 있는 하나 또는 그 이상의 표적 분자의 검출 및/또는 정량을 위한 개선된 방법, 기구, 시약 및 키트를 포함한다. 기재된 방법, 기구, 시약 및 키트는 하나 또는 그 이상의 (1) 압타머의 활성, (2) 압타머-표적 분자 복합체에 대한 결합 평형상태 달성의 효율, (3) 압타머와 그것의 표적 분자간의 공유결합 형성, (4) 초과된 시약 및 샘플 성분의 제거, (5) 느린 오프 레이트 압타머의 사용, (6) 바람직한 압타머 구조체, 및 (7) 압타머-표적 분자 복합체의 검출에 영향을 주는 조건을 최적화시킴으로써, 시료 내 표적 분자의 검출 및/또는 정량에 대한 높은 민감도의 검정법을 제공한다.
특정 실시예로 기재하지 않는 한, 본원에 기재된 표적 분자의 검출 및/또는 정량을 위한 방법은 기재된 단계에서의 특정 지시에 독립적이다. 설명을 목적으로, 상기 방법은 특정 순서의 단계로서 기재되어 있으나, 기재된 특정 검정법의 목적이 이뤄진다면 임의의 수의 특정 순서의 단계의 변형이 가능하다는 것으로 이해되어야 한다. 정해진 다른 방법에서, 임의의 기재된 방법에 열거된 단계들은 임의의 실현가능한 순서로 수행될 수 있고, 본 발명의 방법들은 임의의 기재된 실시예, 예시 또는 첨부된 청구항에 존재하는 임의의 특정 순서에 제한되지 않는다. 게다가, 설명의 편리함과 용이성을 위하여, 다양한 방법들은 단일 표적 분자 및 단일 압타머와 관련하여 기재되었다. 그러나, 임의의 기재된 방법들은 예를 들어, 시료 내 다중 표적 분자들은 다중 압타머와 시료를 접촉시킴으로써 검출되고/되거나 정량화될 수 있는 것과 같은, 다중 압타머를 사용한 다중 표적을 동시에 검출 및/또는 정량하기 위하여 제공될 수 있는 다중 형식로 수행될 수 있는 것으로 이해되어야 하며, 여기에서 각각의 압타머는 특정 표적 분자(즉, 다중 형식에서)에 대하여 특이적 친화력을 가진다.
도 1A 및 1B를 참고하면, 시료 내 표적 분자의 존재는 표적 분자에 대하여 특이적 친화력을 가지는 압타머와 시료를 처음 접촉시킴으로써 검출되고/되거나 정량화된다. 상기 방법은 대응하는 수의 특정 압타머, 즉 다중 형식의 사용에 의하여 다수의 특정 표적의 검출 및/또는 정량에 적용될 수 있다. 단일 표적에 대한 논의는 설명의 용이성만을 위하여 존재한다. 압타머 친화 복합체는 만일 시료가 표적 분자를 함유하고 있다면, 그것의 표적 분자에 압타머가 결합함으로써 형성된다. 압타머가 그것의 표적 분자와 공유적으로 결합하는 경우, 압타머 친화 복합체는 사용될 압타머에 적합한 방법을 이용하여 압타머 공유결합 복합체로 선택적으로 전환된다. 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)는 검출되고/되거나 정량화된다. 다수의 서로 다른 검출 방법들, 예를 들어 침입성 검정법, 혼성화 검정법 또는 DNA 칩, 질량 분석법 또는 QPCR이 압타머 친화 복합체를 검출하기 위하여 사용될 수 있다.
상기에 언급한 바와 같이, 본원에 기재된 검정법들은 설명을 위하여 4개의 검정 포맷으로 분류하였다: 단일 포획 친화 검정법; 이중 포획 친화 검정법; 단일 포획 광가교결합 검정법; 및 이중 포획 광가교결합 검정법. 그러나, 단계들의 다른 분류, 조합 및 순서들도 고려되며, 모두 본 명세서의 범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 할 것이다. 네 개의 검정 포맷 모두 압타머-표적 복합체가 예를 들어, 단백질과 같은 표적을 포획하는 분리 단계에 의해 자유 압타머(또는 자유 광압타머)로부터 분리되는 공통 단계를 공유한다. 이 분리 단계는 "포획 2(Catch 2) 부분"으로서 본원에 칭한다. 두 개의 "이중 포획(dual-catch)" 검정법은 압타머-표적 복합체들이 압타머를 포획하는 분리 단계에 의해 자유 표적으로부터 분리된다는 부가적인 공통점을 공유한다. 이 후자의 분리 단계를 "포획 1(Catch 1) 부분"으로서 본원에 칭한다. 각각의 이 단계들의 수행을 위한 방법들을 하기에 상세하게 기재하였다.
각각의 이 검정법 포맷에서의 동적 유발의 사용을 더 기재하였다. 전통적으로, 원하는 표적의 검출에서의 특이성은 두개의 포획제를 사용하는 샌드위치 검정법(sandwich assay)의 사용을 통하여 개선되었다. 놀랍게도, 압타머를 사용하는 검출 방법에 대한 동적 유발의 적용은 제2 포획제를 도입함으로써 특이성을 강화시킬 필요성을 없애준다는 것을 발견하였다. 만일 동적 유발이 도입되면, 압타머와 임의의 비-표적 분자들 간의 비-특이적 복합체는 그것들의 분리에 따른 재형성(re-form)과 같지 않다. 비-특이적 분자들은 일반적으로 압타머 친화 복합체보다 더 빠르게 분리되기 때문에, 동적 유발은 압타머가 비-표적과 함께 비-특이적 복합체에 포함될 가능성을 감소시킨다. 효과적인 동적 유발은 초기의 압타머 결합 및 임의의 후속의 공유적 상호작용(covalent interaction)을 넘는 부가적인 특이성을 가지는 검정법을 제공할 수 있다. 따라서, 상기 동적 유발은 이 검출 방법들에서 특이성의 제2의 결정요인을 제공한다. 동적 유발을 실행하기 위한 방법들은 하기에 상세하게 기재하였다.
도 2A(이중 단계 친화 검정법) 및 2B(이중 단계 가교결합 검정법)를 참고하면, 시료 내 존재할 수 있는 표적 분자의 검출 및/또는 정량을 위한 예시적인 방법에서, 시료는 제1 태그를 포함하고 표적 분자에 대하여 특이적 친화력을 가지는 압타머(또는 광압타머)와 접촉된다. 시료가 표적 분자를 함유하는 경우, 그것의 표적 분자와 결합된 압타머(또는 광압타머)를 포함하는 압타머 친화 복합체가 형성된다. 광가교결합 예시(2B)에서, 광압타머가 그것의 표적 분자에 공유적으로 결합하는 경우, 압타머 친화 복합체는 사용될 압타머에 적합한 방법을 사용하여 압타머 공유결합 복합체로 전환된다. 상기 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)는 제1 포획 성분(capture element)을 통하여 제1 고체 지지체에 부착된다. 상기 부착은 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)와 제1 고체 지지체를 접촉시키고, 압타머 상에 포함된 태그가 제1 고체 지지체에 부착된 제1 포획 성분과 직접 또는 간접적으로 결합하게 함으로써 달성된다. 제1 고체 지지체 상의 제1 포획 성분과 결합된 상기 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)는 혼합물의 잔여물로부터 분리된다. 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)를 분리하는 것은 사용될 특정 태그에 적합한 방법을 사용하여 제1 고체 지지체로부터 분리된다. 대안적으로, 상기 태그는 절단가능한 부분(cleavable moiety)을 통하여 압타머에 부착될 수 있고, 이러한 절단가능한 부분은 제1 고체 지지체로부터 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)를 분리하도록 절단된다. (제1 태그와 동일하거나 다를 수 있는) 제2 태그는 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)의 표적 분자에 부착된다. 선택적으로, 검정법의 특이성을 증가시키고 백그라운드 시그널(background signal)을 감소시키기 위해 동적 유발이 수행될 수 있다. 상기 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)는 제2 고체 지지체에 부착된다. 상기 부착은 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)와 제2 고체 지지체를 접촉시키고, 표적 분자 상에 포함된 제2 태그와 제2 고체 지지체에 부착된 제2 포획 성분을 직접 또는 간접적으로 결합시키기 위하여 접촉시킴으로써 달성된다. 제2 고체 지지체 상의 제2 포획 성분과 결합된 상기 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)는 혼합물의 잔여물로부터 분리된다. 상기 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)가 검출되고 선택적으로 정량화된다.
다른 실시예에서, 상기 압타머(또는 광압타머)는 그것의 각각의 표적 분자로부터 처음으로 분리되고, 자유 압타머(또는 광압타머)가 검출되고 선택적으로 정량화된다.
압타머 친화 복합체는 예를 들어, 혼성화 또는 DNA 칩, QPCR, 질량분석법, 침입성 검정법 등과 같은 임의의 적합한 핵산 검출 기술을 사용함으로써 검출될 수 있다. 사용되는 기술에 따라, 압타머는 표지를 포함하는 것으로 설계되거나 변형될 수 있다. 이것은 (효소적으로 또는 화학적으로) 합성하는 동안 또는 검정하는 동안(즉, 검출하기 전 어떤 시간에) 이뤄질 수 있다.
본원에 기재된 방법들은 검정법으로부터 용리된 자유 압타머를 검출함으로써 표적 분자의 존재 및 양을 검출할 수 있다. 이것은 핵산의 검출, 정량 및 증폭의 상대적 간단함 때문에 표적 분자의 검출 및 정량을 용이하게 하고, 매우 좋은 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio)를 가지는 표적 검출 검정법을 제공한다.
단일 포획(포획 2만) 친화 검정법
한 실시예에서, 단일 포획 친화 검정법은 포획 2 분할을 사용하여 수행된다(도 1A 또는 1B를 참조). 이 방법은 시료 내의 다른 성분들이 태그와 경쟁하지 않도록 샘플 매트릭스가 매우 복잡하지 않은 경우에 효과가 좋다. 상기 방법은 또한 표적이 높은 카피수 또는 농도로 존재하는 샘플에 대하여 효과가 좋다.
표적 분자에 대하여 높은 친화력과 특이성을 가지는 압타머를 제공한다. 한 실시예에서, 도 6A에 나타낸 압타머 구조체가 사용된다. 이 실시예에서, 상기 압타머는 압타머, 표적 분자 및 비-표적 분자, 또는 샘플 매트릭스를 포함하는 혼합물을 형성하기 위하여 샘플과 접촉된다. 상기 표적 분자가 샘플 내에 존재하는 경우, 압타머 친화 복합체가 형성된다. 상기 혼합물은 선택적으로 표적 분자에 대한 압타머의 평형 결합을 달성하기에 충분한 시간 동안 배양될 수 있다(예를 들어, 적어도 약 10분, 적어도 약 20분, 적어도 약 30분).
한 실시예에서, 상기 혼합물은 선택적으로 동적 유발의 영향을 받을 수 있다. 상기 동적 유발은 시료 내에 존재하는 압타머와 임의의 비-표적 분자들 간의 임의의 비-특이적 결합을 감소시킨다. 한 실시예에서, 10mM의 덱스트란 설페이트(dextran sulfate)를 첨가하고, 상기 혼합물을 약 16분간 배양하였다.
한 실시예에서, 상기 포획-2 분할은 자유 압타머를 제거하기 위하여 수행된다. 한 실시예에서, 압타머 친화 복합체를 포함하는 상기 혼합물은 압타머 친화 복합체의 표적 분자 성분에 포획 태그를 도입하는 시약으로 처리된다. 다른 실시예에서, 상기 태그는 압타머가 평형 결합 또는 동적 유발 전, 테스트 혼합물과 접촉하기 전에 도입된다. 한 실시예에서, 상기 표적은 단백질 또는 펩티드이고, 비오틴 태그는 NHS-PEO4-비오틴으로 처리함으로써 표적 분자에 부착된다. 그 후, 상기 혼합물을 표적 포획 태그와 결합할 수 있는, 표면에 부착된 포획 성분을 가지는 고체 지지체와 접촉시킨다. 이 실시예에서, 상기 고체 지지체 상의 상기 포획 성분은 전형적으로 그것이 높은 친화력과 특이성을 가지는 표적 포획 태그에 결합하도록 하기 위하여 선택된다. 한 실시예에서, 상기 고체 지지체는 미량역가 플레이트의 웰 내에 포함된 (DynaBeads MyOne Streptavidin C1과 같은) 마그네틱 비드(magnetic beads)이고, 상기 포획 성분은 스트렙타비딘(streptavidin)이다. 상기 마그네틱 비드는 혼합물의 분리된 성분의 분리에 용이한 방법을 제공한다. 그것에 의하여, 혼합물에 포함된 압타머 포획 복합체는 고체 지지체 상의 표적 포획 태그와 포획 성분의 결합 상호작용을 통하여 고체 지지체에 결합된다. 그 후, 상기 압타머 친화 복합체는 예를 들어, 비착물화된 압타머를 제거하기 위하여 지지체를 세척함으로써, 혼합물의 잔여물로부터 분리된다. 한 실시예에서, 압타머 친화 복합체로부터의 압타머는 그 후 하나 또는 그 이상의 하기의 처리에 의해 더 처리되어 분리될 수 있다: 고농도 염, 높은 pH, 낮은 pH 또는 상승 온도.
다른 실시예에서, 포획-2 분할로부터 분리된 압타머는 예를 들어, DNA 칩 혼성화, Q-PCR, 질량 분석법, 침입성 검정법 등과 같은 임의의 적절한 핵산 검출 방법에 의해 검출되고, 선택적으로 정량화된다. 다른 실시예에서, 상기 압타머 친화 복합체에서의 압타머들은 여전히 고체 지지체와 접촉하고 있는 동안에 검출되고 선택적으로 정량화된다. 한 실시예에서, 압타머는 이 검출 단계를 용이하게 하기 위한 검출가능한 부분(detectable moiety)을 포함한다. 상기 검출가능한 부분은 사용될 검출 방법에 기초하여 선택된다. 한 실시예에서, 상기 검출가능한 부분 또는 표지는 합성하는 동안 또는 검정하기 전에 압타머에 첨가된다. 다른 실시예에서, 상기 검출가능한 부분은 검정하는 동안 또는 검출하는 동안에 압타머에 첨가된다. 그 후, 상기 검출된 압타머를 원래 시료에서의 표적의 양 또는 농도와 상호연관시킬 수 있다.
이중 포획(포획 1 & 2) 친화 검정법
일 실시예에서, 이중 포획 친화 검정법은 단일 포획 친화 검정법과 유사하지만, 부가적인 민감성 및 특이성을 제공하기 위한 부가적인 분리 단계를 포함한다.
한 실시예에서, 표적 분자에 대하여 높은 친화력과 특이성을 가지고 제1 방출가능한 태그를 가지는 압타머가 제공된다. 다른 실시예에서, 상기 제1 방출가능한 태그는 포획 1 분할 이전 검정법에서의 임의의 시점에 첨가된다(도 2A 및 2B를 참조). 한 실시예에서, 이 방출가능한 태그는 광절단가능한 비오틴이다. 한 실시예에서, 도 6B에 나타낸 압타머 구조체가 사용된다. 이것과 다른 태그들 및 절단가능한 부분들 및 이러한 태그와 절단가능한 부분들을 포함하는 압타머를 기재하였다. 압타머, 표적 분자 및 비-표적 분자, 또는 샘플 매트릭스를 포함하는 혼합물을 형성하기 위하여, 상기 압타머를 표적 분자를 포함할 수 있는 시료와 접촉시켰다. 표적 분자가 시료 내에 존재할 경우, 압타머-표적 분자 복합체(압타머 친화 복합체)가 형성된다. 상기 혼합물은 선택적으로 표적 분자에 대한 압타머의 평형 결합을 달성하는 데 충분한 시간 동안 배양될 수 있다(예를 들어, 적어도 약 10분, 적어도 약 20분, 적어도 약 30분).
한 실시예에서, 상기 포획 1 분할은 임의의 자유 표적 및 샘플 매트릭스를 제거하기 위하여 수행된다. 상기 혼합물은 압타머 포획 태그에 결합할 수 있는, 바람직하게는 높은 친화력과 특이성을 가지는, 표면에 부착된 제1 포획 성분을 가지는 제1 고체 지지체와 접촉된다. 한 실시예에서, 제1 방출가능한 태그는 광절단가능한 비오틴이고, 상기 제1 고체 지지체는 컬럼 내의 아가로오스 비드(agarose beads)이고, 상기 포획 성분은 스트렙타비딘이다. 예를 들면, 피어스의 고정화된 스트렙타비딘 비드(Pierce Immobilized Streptavidin beads)가 사용될 수 있다. 그것에 의하여 혼합물 내에 포함된 압타머 친화 복합체들은 제1 방출가능한 태그 및 제1 포획 성분의 결합 상호작용을 통해 제1 고체 지지체에 결합된다. 상기 압타머 친화 복합체들은 예를 들어, 비결합된 분자들을 제거하기 위하여 제1 고체 지지체를 세척함으로써, 혼합물의 잔여물로부터 분리된다.
한 실시예에서, 고체 지지체에 결합된 압타머 친화 복합체들은 그 후 압타머 친화 복합체의 표적 분자 성분에 제2 태그를 도입하는 시약으로 처리된다. 한 실시예에서, 상기 표적은 단백질 또는 펩티드이고, 상기 표적은 NHS-PE04-비오틴으로 처리함으로써 비오틴화된다. 표적 분자에 도입된 상기 제2 태그는 압타머 포획 태그와 동일하거나 서로 다를 수 있다. 만일 상기 제2 태그가 제1 태그 또는 압타머 포획 태그와 동일하다면, 제1 고체 지지체 상의 자유 포획 부위는 이 태깅 단계의 개시 전에 차단(blocked)될 수 있다. 이 대표적 실시예에서, 상기 제1 고체 지지체는 표적 태깅의 개시 전에 자유 비오틴으로 세척된다. 태깅 방법과, 특히 펩티드 및 단백질과 같은 표적의 태깅을 기재하였다. 다른 실시예에서, 표적의 태깅은 포획 2 분할의 개시 전 검정법에서의 임의의 다른 시점에서 수행된다(도 2A 및 2B를 참조). 제1 및 제2 태그가 동일한 경우, 상기 표적은 수행된 포획 1 분할의 포획 단계 후에 태깅된다.
포획 1 분할은 제1 고체 지지체로부터 압타머 친화 복합체를 방출함으로써 완료된다. 한 실시예에서, 제1 방출가능한 태그는 약 90% 이상의 제1 방출가능한 태그를 절단하는 조건 하에서 UV 램프로 방사선 조사를 함으로써 절단된 광절단가능한 부분이다. 다른 실시예에서, 상기 방출은 제1 방출가능한 태그에서 선택된 방출가능한 부분에 대한 적절한 방법에 의해 달성된다. 압타머 친화 복합체는 검정법에서 더 사용하기 위하여 용출되고 수집될 수 있거나, 검정법의 남아있는 단계를 수행하기 위하여 다른 고체 지지체와 함께 접촉될 수 있다(도 2A 및 2B를 참조).
한 실시예에서, 상기 혼합물은 선택적으로 동적 유발의 영향을 받을 수 있다. 상기 동적 유발은 압타머와 비-표적 분자간의 임의의 비-특이적 결합을 감소시킨다. 한 실시예에서, 10mM의 덱스트란 설페이트가 압타머 친화 복합체에 첨가되고, 상기 혼합물은 약 15분간 배양된다. 다른 실시예에서, 상기 동적 유발은 10mM의 덱스트란 설페이트의 존재하에서 포획 1 용리를 수행함으로써 개시된다. 다른 실시예에서, 상기 동적 유발은 평형 결합 단계 후, 포획 2 분할 전에 수행된다.
한 실시예에서, 상기 포획-2 분할은 자유 압타머를 제거하기 위하여 수행된다. 상기에 기재한 바와 같이, 한 실시예에서, 포획-2 분할에서 사용된 제2 태그는 압타머 친화 복합체가 여전히 포획-1 분할에서 사용된 고체 지지체에 접촉하고 있는 동안 표적에 첨가될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 제2 태그는 포획-2 분할의 개시 전에 검정법에서의 다른 시점에서 표적에 첨가될 수 있다. 상기 혼합물은 고체 지지체와 접촉되고, (제2의) 포획 성분을 가지는 상기 고체 지지체는 (제2의) 표적 포획 태그와 결합할 수 있는, 바람직하게는 높은 친화력과 특이성을 가지는 그것의 표면에 부착된다. 한 실시예에서, 상기 고체 지지체는 미량역가 플레이트의 웰 안에 포함된 (DynaBeads MyOne Streptavidin C1과 같은) 마그네틱 비드이고, 상기 포획 성분(제2 포획 성분)은 스트렙타비딘이다. 상기 마그네틱 비드는 혼합물의 분리된 성분의 분리에 용이한 방법을 제공한다. 그것에 의하여, 혼합물에 포함된 압타머 친화 복합체들은 제2 고체 지지체 상의 (제2의) 표적 포획 태그와 제2 포획 성분의 결합 상호작용을 통하여 고체 지지체에 결합된다. 그 후, 상기 압타머 친화 복합체는 예를 들어, 비착물화된 압타머를 제거하기 위하여 지지체를 세척함으로써, 혼합물의 잔여물로부터 분리된다. 한 실시예에서, 압타머 친화 복합체로부터의 압타머는 그 후 하나 또는 그 이상의 하기 처리에 의해 더 처리하여 방출될 수 있다: 고농도 염, 높은 pH, 낮은 pH 또는 상승된 온도.
다른 실시예에서, 포획-2 분할로부터 방출된 압타머는 예를 들어, DNA 칩 혼성화, Q-PCR, 질량 분석법, 침입성 검정법 등과 같은 임의의 적절한 핵산 검출 방법에 의해 검출되고 선택적으로 정량화된다. 이 검출 방법들은 하기에 더 상세히 기재하였다. 다른 실시예에서, 압타머 친화 복합체에서의 압타머는 고체 지지체에 여전히 접촉하고 있는 동안에 검출되고 선택적으로 정량화된다. 다른 실시예에서, 상기 압타머는 이 검출 단계를 용이하게 하기 위하여 검출가능한 부분을 포함한다. 상기 검출가능한 부분은 사용될 검출 방법에 기초하여 선택된다. 다른 실시예에서, 상기 검출가능한 부분(표지)은 합성하는 동안 또는 검정 전의 임의의 시점에 압타머에 첨가된다. 다른 실시예에서, 상기 검출가능한 부분은 검정하는 동안 또는 검출하는 동안에 압타머에 첨가된다. 상기 검출된 압타머는 시료 내의 표적의 양 또는 농도와 서로 상호관련이 있다.
단일 포획(포획 2만) 가교결합 검정법
한 실시예에서, 단일 포획 가교결합 검정법은 포획 2 분할을 사용하여 수행된다. 이 방법은 샘플 내 다른 성분이 태그와 경쟁하지 않게 하기 위하여 샘플 매트릭스가 너무 복잡하지 않은 경우에 효과가 좋다. 상기 방법은 또한 표적이 높은 카피수 또는 농도로 존재하는 샘플에 대하여 효과가 좋다. 어떤 경우에 있어서, 가교결합이 수행된 후의 단계에서 더욱 엄격하게 세척되기 때문에 광압타머와 표적간의 공유결합을 형성하는 것에 의하여 부가적인 이점이 제공된다(도 1B).
표적 분자에 대한 높은 친화력과 특이성을 가지는 광압타머가 제공된다. 한 실시예에서, 상기 광압타머의 가교결합 부분은 절단가능한 링커를 통하여 압타머에 결합된다. 한 실시예에서, 상기 가교결합 기는 ANA(4-아지도-2-니트로-아닐린)(ANA(4-azido-2-nitro-aniline)이고, 상기 광절단가능한 기는 PC 링커이다. 한 실시예에서, 도 6C에 나타낸 압타머 구조체가 사용된다. 상기 광압타머는 압타머, 표적 분자, 비-표적 분자, 또는 샘플 매트릭스를 포함하는 혼합물을 형성하기 위하여 표적 분자를 포함할 수 있는 샘플과 접촉된다. 상기 표적 분자가 시료 내에 존재할 경우, (광)압타머 친화 복합체가 형성된다. 상기 혼합물은 선택적으로 압타머와 표적 분자의 평형 결합을 달성하기에 충분한 시간 동안 배양될 수 있다(예를 들어, 적어도 약 10분, 적어도 약 20분 또는 적어도 약 30분).
한 실시예에서, 상기 혼합물은 선택적으로 동적 유발의 영향을 받을 수 있다. 상기 동적 유발은 광압타머와 비-표적 분자간의 임의의 비-특이적 결합을 감소시킨다. 한 실시예에서, 10mM의 덱스트란 설페이트가 첨가되고, 상기 혼합물은 약 15분간 배양된다.
한 실시예에서, 광압타머 친화 복합체는 적절한 파장에서 빛을 조사(irradiation)함으로써 압타머 공유결합 복합체로 전환된다. 예를 들면, 약 470nM에서의 조사는 단백질 또는 펩티드 표적에 광압타머를 포함하는 ANA를 가교결합시키기 위하여 사용될 수 있다.
한 실시예에서, 포획-2 분할은 자유 광 압타머를 제거하기 위하여 수행된다. 한 실시예에서, 상기 압타머 공유결합 복합체를 포함하는 혼합물은 압타머 공유결합 복합체의 표적 분자 성분에 포획 태그를 도입하는 시약으로 처리된다. 다른 실시예에서, 상기 태그는 압타머가 시료와 접촉되기 전, 평형 결합 전 또는 동적 유발 전에 도입된다. 한 실시예에서, 상기 표적은 단백질 또는 펩티드이고, 비오틴 태그는 NHS-PEO4-비오틴으로 처리함으로써 표적 분자에 부착된다. 상기 혼합물은 고체 지지체와 접촉되고, 포획 성분을 가지는 상기 고체 지지체는 표적 포획 태그에 결합할 수 있는, 바람직하게는 높은 친화력과 특이성을 가지는 그것의 표면에 부착된다. 한 실시예에서, 상기 고체 지지체는 미량역가 플레이트의 웰 내에 포함된 (DynaBeads MyOne Streptavidin C1과 같은) 마그네틱 비드이고, 상기 포획 성분은 스트렙타비딘이다. 상기 마그네틱 비드는 상기 혼합물의 분할된 성분의 분리에 용이한 방법을 제공한다. 압타머 공유결합 복합체는 예를 들어, 비착물화된 압타머를 제거하기 위하여 지지체를 세척함으로써, 혼합물의 잔여물로부터 분할된다. 한 실시예에서, 압타머 공유결합 복합체로부터의 광압타머는 절단가능한 부분에 적절한 방법에 의해 더 처리하기 위하여 방출될 수 있다. 예를 들면, PC 링커를 절단하기 위하여 상기 혼합물은 약 20분간 UV 램프로 조사된다.
다른 실시예에서, 포획-2 분할로부터 방출된 광압타머는 예를 들어, DNA 칩 혼성화, Q-PCR, 질량 분석법, 침입성 검정법 등과 같은 임의의 적절한 핵산 검출 방법에 의해 검출되고 선택적으로 정량화된다. 이 검출 방법들은 하기에 더 상세히 기재된다. 다른 실시예에서, 압타머 공유결합 복합체에서 광압타머는 고체 지지체와 여전히 접촉하고 있는 동안 검출되고 선택적으로 정량화된다. 상기 검출된 광압타머는 원래 시료에서의 표적의 양 또는 농도와 서로 관련이 있을 수 있다.
이중 포획(포획 1 & 2)
광가교결합
검정법
한 실시예에서, 단일 포획 광가교결합 검정법과 유사한 이중 포획 광가교결합 검정법은 부가적인 민감성 및 특이성을 제공하기 위한 부가적인 분할 단계를 사용한다(도 2B).
표적 분자에 대한 높은 친화력과 특이성을 가지는 광압타머가 제공된다. 한 실시예에서, 상기 광압타머의 가교결합 부분은 절단가능한 링커를 통하여 압타머에 연결된다. 한 실시예에서, 상기 가교결합 기는 ANA(4-아지도-2-니트로-아닐린)이고, 상기 광절단가능한 기는 PC 링커이다. 한 실시예에서, 상기 광압타머는 또한 제1의 방출가능한 태그를 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 제1 방출가능한 태그는 포획 1 분할 전 검정법에서의 임의의 시점에 첨가된다. 한 실시예에서, 상기 제1 방출가능한 태그 부분은 비오틴이고, 상기 방출가능한 성분은 혼성화 링커이다. 한 실시예에서, 도 6D에 나타낸 광압타머 구조체가 사용된다. 상기 광압타머는 압타머, 표적 분자 및 비-표적 분자, 또는 샘플 매트릭스를 포함하는 혼합물을 형성하기 위하여 표적 분자를 포함할 수 있는 샘플과 접촉된다. 상기 표적 분자가 시료 내에 존재할 경우, (광)압타머 친화 복합체가 형성된다. 상기 혼합물은 선택적으로 압타머와 표적 분자의 평형 결합을 달성하는 데 충분한 시간 동안 배양될 수 있다(예를 들어, 적어도 약 10분, 적어도 약 20분, 또는 적어도 약 30분.)
한 실시예에서, 상기 혼합물은 선택적으로 동적 유발의 영향을 받을 수 있다. 상기 동적 유발은 광압타머와 비-표적 분자간의 임의의 비-특이적 결합을 감소시킨다. 일 특정 실시예에서, 10mM의 덱스트란 설페이트가 첨가되고, 상기 혼합물은 약 15분간 배양된다.
(광)압타머 친화 복합체는 적절한 파장에서 빛으로 조사함으로써 압타머 공유결합 복합체로 전환된다. 예를 들면, 약 470nm에서의 조사는 단백질 표적에 광압타머를 포함하는 ANA를 가교결합시키는 데 사용될 수 있다.
한 실시예에서, 포획 1 분할은 자유 표적 및 샘플 매트릭스를 제거하기 위해 수행된다. 혼합물은 압타머 포획 태그에 결합할 수 있는, 바람직하게는 높은 친화력과 특이성을 가지는 그것의 지지체에 부착된 제1 포획 성분을 가지는 제1의 고체 지지체와 접촉된다. 한 실시예에서, 제1 방출가능한 태그는 비오틴인 태그 부분을 포함하고, 상기 제1 고체 지지체는 컬럼 내의 아가로오스 비드이고, 상기 제1 포획 성분은 스트렙타비딘이다. 예를 들면, 피어스의 고정화된 스트렙타비딘 비드가 사용될 수 있다. 그것에 의하여, 혼합물에 포함된 압타머 공유결합 복합체는 제1 방출가능한 태그와 제1 포획 성분의 결합 상호작용을 통하여 제1 고체 지지체에 결합된다. 상기 압타머 공유결합 복합체는 예를 들어, 비-결합된 분자를 제거하기 위해 제1 고체 지지체를 세척함으로써, 상기 혼합물의 잔여물로부터 분할된다.
한 실시예에서, 제1 고체 지지체에 결합되어 남아있는 압타머 공유결합 복합체는 그 후 예를 들어, NHS-PEO4-비오틴으로 처리함으로써 단백질 또는 펩티드 표적 분자의 비오틴화에 의해 압타머 친화 복합체의 표적 분자 성분에 제2 태그를 도입하는 시약으로 처리된다. 표적 분자로 도입된 상기 제2 태그는 제1 태그와 동일하거나 서로 다를 수 있다. 만일 상기 제2 태그가 제1 태그와 동일하다면, 제2 고체 지지체 상의 자유 포획 부위는 이 태깅 단계의 개시 전에 차단될 수 있다. 이 실시예에서, 상기 제1 고체 지지체는 표적 태깅의 개시 전에 자유 비오틴으로 세척된다. 태깅 방법 및 특히 펩티드 및 단백질과 같은 표적의 태깅은 하기에 상세히 기재된다. 다른 실시예에서, 표적의 태깅은 포획 2 분할의 개시 전 검정법에서의 임의의 다른 시점에서 수행된다. 만일 제1 및 제2 태그가 동일하다면, 상기 표적은 포획 1 분할이 수행되는 포획 단계 후에 태깅된다.
다른 실시예에서, 포획 1 분할은 제1 고체 지지체로부터 압타머 공유결합 복합체를 방출함으로써 완료된다. 한 실시예에서, 상기 제1 방출가능한 태그는 압타머의 전체 또는 일부분에 대해 상보적인 혼성화 태그이다. 이 제1 방출가능한 태그는 높은 pH와 같은 혼성화 링커를 파괴할 수 있는 조건을 사용하여 혼합물을 처리함으로써 절단된다. 한 실시예에서, 20mM의 NaOH가 혼합물에 첨가된다. 다른 실시예에서, 압타머 공유결합 복합체의 방출은 제1 방출가능한 태그에서 방출가능한 부분에 적절한 임의의 방법에 의해 달성된다. 압타머 공유결합 복합체는 검정법에서 더 사용하기 위해 용출되고 수집될 수 있거나, 검정의 남아있는 단계를 수행하기 위하여 추가의 고체 지지체에 접촉될 수 있다.
한 실시예에서, 포획-2 분할은 자유 광압타머를 제거하기 위해 수행된다. 상기 혼합물은 제2 포획 태그에 결합할 수 있는, 바람직하게는 높은 친화력과 특이성을 가지는 그것의 표면에 부착된 포획 성분을 가지는 고체 지지체와 접촉된다. 한 실시예에서, 상기 고체 지지체는 미량역가 플레이트의 웰에 포함된 (DynaBeads MyOne Streptavidin C1과 같은) 마그네틱 비드이고, 상기 포획 성분은 스트렙타비딘이다. 상기 마그네틱 비드는 혼합물의 분할된 성분의 분리에 용이한 방법을 제공한다. 그것에 의하여, 혼합물에 포함된 압타머 공유결합 복합체는 표적 제2 포획 태그와 제2 포획 성분의 결합 상호작용을 통하여 고체 지지체에 결합된다. 그 후, 상기 압타머 공유결합 복합체는 비착물화된 압타머를 제거하기 위해 지지체를 세척함으로써, 혼합물의 잔여물로부터 분할된다. 한 실시예에서, 압타머 공유결합 복합체로부터의 광압타머는 그 후 절단가능한 부분에 적절한 방법에 의해 더 처리하기 위하여 방출될 수 있다. 예를 들면, PC 링커를 절단하기 위하여 상기 혼합물은 약 20분간 UV 램프로 조사된다.
다른 실시예에서, 포획-2 분할로부터 방출된 광압타머는 예를 들어, DNA 칩 혼성화, Q-PCR, 질량 분석법, 침입성 검정법 등과 같은 임의의 적절한 핵산 검출 방법에 의해 검출되고 선택적으로 정량화된다. 다른 실시예에서, 압타머 공유결합 복합체에서 광압타머는 고체 지지체와 여전히 접촉하고 있는 동안에 검출되고 선택적으로 정량화된다. 상기 검출된 광압타머는 원래의 시료 내에서 표적의 양 또는 농도와 서로 관련이 있을 수 있다.
본원에 기재된 임의의 실시예들 중에서, 시료는 본원에 기재된 방법에 의해 동적 범위(dynamic range)의 표적 검출을 증가시킬 수 있는, 두배 또는 그 이상의 희석 시료로서 제조될 수 있다. 개개의 희석 시료들은 압타머 공유결합 복합체 형성을 포함하여 개별적으로 검정되고, 압타머 공유결합 복합체 형성 이후에 희석 시료는 검정 잔여물로서 모여질 수 있으며, 동시에 단일 고체 지지체 상에서 검출될 수 있다. 한 실시예에서, 각각의 희석 시료는 고유(unique)한 압타머를 포함하므로, 표적에 대응하는 단일 측정이 가능하다. 다른 실시예에서, 압타머는 두배 또는 그 이상의 희석물에 첨가될 수 있으며, 각 희석물은 특정 표적에 대해 뚜렷하게 태그된 압타머와 접촉하고, 단일 지지체 상의 서로 다른 각각의 단일 희석 샘플에 대한 특정 압타머 시그널을 검출한다. 이 방법에서 희석 샘플과 함께 연쇄화(chaining)하는 것은 수백, 수천배 이상으로 단일 표적 분자의 동적 범위를 확장시킬 수 있고, 정량화의 겹치는 부분이 단일 표적의 농도를 다중 측정하게 하는 경우에 정확성을 더해준다.
본원에 기재된 임의의 실시예들 중에서, 상기 비즈 또는 고체 지지체는 비착물화된 표적 및 시료 또는 샘플 매트릭스를 포함하는 상등액(supernatant)을 버린 후 비즈를 현탁될 수 있다. 한 실시예에서, 비즈로부터 자유 압타머 및 압타머(또는 공유결합) 복합체를 용리하기 전 비즈를 현탁시키기 위한 임의의 시점에서, 상기 압타머(또는 공유결합) 복합체는 표지 시약과 접촉될 수 있고, 뒤이어 표적 분자의 검출 및/또는 정량을 위하여 압타머(또는 공유결합) 복합체와 고체 지지체를 접촉시키기 전 비반응성(unreactive) 표지 시약을 제거하기 위하여 펠렛팅(pelleting)을 반복하고 세척한다.
한 실시예에서, 시료의 한 세트는 표적 분자에 대해 특이적인 친화력을 가지는 태그된 압타머(또는 태그된 광압타머)가 도입된 연속 희석물로서 제조된다. 서로 다른 태그를 가지는 동일한 압타머가 각각의 시료 희석물에 첨가될 수 있다. 본원에 더 기재된 바와 같이, 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체로의 광학적 전환)의 형성에 이어, 개개의 시료들이 모여질 수 있고, 압타머 공유결합 복합체가 고체 지지체에 부착되기 전 또는 후에 표지 시약과 접촉될 수 있다. 만일 시료 내에 존재한다면, 표적 분자는 압타머(또는 공유결합) 복합체 상의 표지 시약을 검출함으로써 검출되고/되거나 정량화된다. 서로 다른 태그를 가지는 각각의 압타머에 대하여 측정된 결과 시그널들은 원래 시료 내의 표적 분자의 양 또는 농도를 정확히 정량하기 위해 조합될 수 있다. 예를 들면, 1차 희석은 단지 반정량적 정보(semi-quantitative information)를 산출하는 표적에 대한 최대 시그널을 산출하는 반면, 2차 희석은 원 시료 내 표적의 정확한 정량화를 허용하는 포화상태(saturating)에도 못미치는 시그널을 산출할 수 있다.
다른 실시예에서, 시료의 한 세트는 표적 분자에 대하여 특이적인 친화력을 가지는 태그된 압타머(또는 태그된 광압타머)가 도입된 연속 희석물로서 제조된다. 고유의 태그를 가지는 서로 다른 압타머들이 각각의 샘플 희석물에 첨가될 수 있다. 본원에 더 기재된 바와 같이, 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체로의 광학적 전환)의 형성에 이어, 개개의 시료들이 모여질 수 있고 고체 지지체에 압타머(또는 공유결합) 복합체가 부착되기 전 또는 후에 표지 시약과 접촉될 수 있다. 시료 내에 존재하는 표적 분자들은 압타머(또는 공유결합) 복합체 상에서 표지 시약을 검출함으로써 검출되고/되거나 정량화된다. 결과 시그널들은 원래 샘플의 서로 다른 연속 희석물에 의존하는 수백, 수천배 이상의 표적 범위에 대하여 정량화될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 실시예에서, 시료는 대조 샘플(reference sample)과 비교될 수 있다. "대조 샘플"은 본원에서 다수의 분자를 함유하며 적어도 하나의 표적 분자를 포함한다고 알려져 있는 임의의 물질, 용액 또는 혼합물을 말한다. 대조 샘플 내에 존재하는 임의의 표적 분자의 정확한 양 또는 농도 또한 잘 알려져 있을 수 있다. 상기 용어 대조 샘플은 본원에 정의된 바와 같이 생물학적 샘플 및 예를 들어, 오염되거나 오염되었을 가능성이 있는 물 및 공업폐수와 같은 환경 또는 독소 테스트를 위해 사용될 수 있는 샘플을 포함한다. 대조 샘플은 또한 최종 산물(end product), 중간 산물(intermediate product) 또는 제조 공정, 예를 들어 준비 과정의 부산물(by-product)일 수 있다. 대조 샘플은 생물 또는 다른 어떤 원(예를 들어, 환경원 또는 공업원)으로부터 얻어진 물질, 용액 또는 혼합물에 첨가될 수 있는 임의의 적절한 검정 배지, 버퍼 또는 희석제를 포함할 수 있다.
한 실시예에서, 두개의 서로 다른 프로브를 가지는 압타머를 제조하였다. 예를 들어, 하나의 압타머는 Cy3 염료를 가질 수 있고, 다른 하나는 Cy5 염료이다. 예로서 이중 포획 가교결합 검정법을 사용하여, 대조 샘플은 하나의 압타머에 노출되고, 시료는 다른 압타머에 노출된다. 각각의 샘플은 가교결합 단계를 포함하여 동일한 방법으로 개별적으로 처리된다. 가교결합 후, 상기 샘플들은 균일하게 혼합될 수 있고, 검정의 나머지 단계들이 수행될 수 있다. 대조 샘플 및 시료간의 임의의 다른 발현(즉, 샘플 내 표적의 서로 다른 양 또는 농도)의 직접적 비교는 개별적으로 각각의 표지 시약으로부터의 시그널을 측정함으로써 가능하다. 이 방법은 본원에 기재된 임의의 다른 검정법 내로 통합될 수 있다. 게다가, 형광 염료의 사용을 포함하는 서로 다른 염료를 사용하는 것에 더하여, 서로 다른 각각의 압타머로부터 시그널을 구별하기 위하여 다른 표지가 사용될 수 있다. 예를 들면, 다른 실시예에서, 각각의 샘플에서 사용된 압타머들은 서로 다른 서열 표지를 가질 수 있다. 이 방법은 예를 들어, 판독(readout)이 QPCR 또는 DNA 혼성화 어레이인 경우에 유용하다.
한 실시예에서, 상기 대조 샘플은 대조군을 나타내는 혼주 생물학적 샘플일 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 대조 샘플은 개인으로부터 얻어지고, 처음에 수집된 생물학적 샘플일 수 있고, 상기 시료는 동일한 개인으로부터 얻어지지만 두번째에 수집된 것일 수 있으며, 그것에 의해 시간에 따라 개인에 의해 제공된 다중 생물학 샘플에서의 하나 또는 그 이상의 표적 분자의 양 또는 농도에서 임의의 변화를 측정하고 평가함으로써 개인의 장기적인 연구를 용이하게 한다.
본원에 기재된 임의의 방법은 시료의 다중 분석을 수행하기 위하여 사용될 수 있다. 임의의 이와 같은 다중 분석은 예를 들어, 생물학적 샘플과 같은 시료 내 동일한 수의 표적 분자를 동시에 검정하기 위한 적어도 두개, 적어도 10개, 적어도 100개 또는 적어도 10,00개의 압타머의 사용을 포함할 수 있다. 이 실시예들에서, 각각 서로 다른 분석물(analyte)을 인식하고 선택적으로 가교결합하는 다수의 압타머(또는 표지된 광압타머)들이 시료에 도입되고, 임의의 상기에 기재된 검정법들이 수행될 수 있다. 압타머들의 방출 후, 방출된 서로 다른 압타머들을 측정하기 위하여 임의의 적절한 다중 핵산 검출 방법이 적용될 수 있다. 한 실시예에서, 이것은 고체 표면 상에 개별적으로 배열된 상보적 프로브에 대한 혼성화에 의해 달성될 수 있다. 다른 실시예에서, 각각의 서로 다른 압타머들이 질량 분석법을 사용하여 분자량에 기초하여 검출될 수 있다. 여전히 다른 실시예에서, 각각의 서로 다른 압타머들은 예를 들어, 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)에서, 겔에서 또는 액체 크로마토그래피에서와 같은 전기 영동도(electrophoretic mobility)에 기초하여 검출될 수 있다. 다른 실시예에서, 고유의 PCR 프로브는 QPCR을 사용한 각각의 서로 다른 압타머를 정량화하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 각각의 검정법에서, 검정법의 특이성을 증가시키고 비-특이적 결합을 감소시키기 위하여 동적 유발이 사용된다. 한 실시예에서, 본원에 기재된 각각의 검정법에서 선택적으로 적용될 수 있는, 비-특이적 결합에서의 추가적인 감소는 시료와 함께 경쟁자를 전배양하거나 평형 결합하는 동안 혼합물에 경쟁자를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 한 실시예에서, 4μM의 Z-블록(Z-block) 경쟁자 올리고뉴클레오티드(5'-(ACZZ)28AC-3', 여기에서 Z = 5-벤질-dUTP)는 시료와 함께 약 5분간 전배양된다.
본 발명의 다른 양상은 시료를 분석하기 위하여 본원에 기재된 임의의 방법을 알맞게 수행하는데 유용한 키트에 관한 것이다. 기재된 발명의 다목적성(versatility)을 강화시키기 위하여, 시약은 방법 및 검정의 실질적인 최적화를 제공하기 위한 시약의 비율을 제공하기 위하여 동일 또는 개별 용기에 패키지된 조합으로 제공될 수 있다. 이 시약들은 각각의 개별 용기에 담겨질 수 있거나, 여러 시약들이 시약의 교차 반응성(cross-reactivity) 및 안정성에 따라 하나 또는 그 이상의 용기에서 화합될 수 있다.
키트는 적어도 하나의 태그된 압타머 및 각각 적어도 하나의 포획제를 포함하는 하나 또는 그 이상의 고체 지지체를 패키지된 조합 내에 포함한다. 상기 키트는 또한 어레이 세척, 샘플 제조 시약 등 뿐만 아니라 샘플 희석을 위한 완충된 수성 매질(aqueous midium)과 같은 세척 용액도 포함할 수 있다. 상기 키트는 일반적으로 표적의 변형(modification) 또는 유도체화(derivatization)를 통하여 제2 태그를 도입하는 데 유용한 시약을 더 포함할 수 있다. 게다가, 상기 키트는 분석 방법 동안 바람직한 동적 유발을 수행하는 데 적합한 시약을 포함할 수 있다. 키트 내 다양한 시약의 상대적인 양은 검정 중에 발생할 필요가 있는 반응을 실절적으로 최적화시키고, 또한 검정의 민감도를 실질적으로 최적화시키는 시약의 농도를 제공하기 위해 매우 달라질 수 있다. 적절한 환경 하에서, 키트 내의 하나 또는 그 이상의 시약들은 첨가제를 포함하는 일반적으로는 감압하에 동결건조된 건조 분말로서 제공될 수 있고, 이것의 용해는 본 발명에 따른 방법 또는 검정을 수행하기에 적절한 농도를 가지는 시약 용액을 제공할 것이다. 상기 키트는 본원에 기재된 것과 같은 임의의 방법에 따른 설명서(written description)를 더 포함할 수 있다.
한 실시예에서, 시료에 존재할 수 있는 하나 또는 그 이상의 표적 분자의 검출 및/또는 정량을 위한 키트는 표적 분자에 대하여 특이적인 친화력을 가지는 적어도 하나의 압타머를 포함하고, 태그; 및 고체 지지체를 포함하며, 여기에서 상기 고체 지지체는 고체 지지체 상에 배열된 적어도 하나의 포획제를 포함하고, 여기에서 상기 포획 성분은 압타머 상의 태그와 결합할 수 있다.
다른 실시예에서, 시료에 존재할 수 있는 하나 또는 그 이상의 표적 분자의 검출 및/또는 정량을 위한 키트는 표적 분자에 대하여 특이적인 친화력을 가지는 적어도 하나의 압타머를 포함하고, 태그 및 표지; 및 고체 지지체를 포함하며, 여기에서 상기 고체 지지체는 고체 지지체 상에 배열된 적어도 하나의 포획제를 포함하고, 여기에서 상기 포획 성분은 압타머 상의 태그와 결합할 수 있다.
다른 실시예에서, 시료에 존재할 수 있는 하나 또는 그 이상의 표적 분자의 검출 및/또는 정량을 위한 키트는 표적 분자에 대하여 특이적인 친화력을 가지는 적어도 하나의 압타머를 포함하고, 방출가능한 태그 및 표지; 및 고체 지지체를 포함하며, 여기에서 상기 고체 지지체는 고체 지지체 상에 배열된 적어도 하나의 포획제를 포함하고, 여기에서 상기 포획 성분은 압타머 상의 태그와 결합할 수 있다.
게다가, 상기에 기재된 임의의 키트는 키트의 검출 방법 동안에 동적 유발의 수행을 위한 시약 및 물질을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 것으로서, "핵산(nucleic acid)", "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)" 및 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머를 칭하기 위하여 상호교환적으로 사용되며, 이러한 뉴클레오티드들은 데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides), 리보뉴클레오티드(ribonucleotides) 및/또는 유사체 또는 화학적으로 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
만약 존재한다면, 뉴클레오티드의 화학적 변형은 단독으로 또는 임의의 조합으로 2'-위치의 당 변형, 5-위치의 피리미딘 변형(예를 들어, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘(5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘(5-(N-isobutylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine), 5-(N-트립타미노카르복시아미드)-2'-데옥시우리딘(5-(N-tryptaminocarboxyamide)-2'-deoxyuridine), 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄)프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드5-(N-[1-(3-trimethylammonium)propyl]carboxyamide)-2'-deoxyuridine chloride), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘(5-(N-napthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine), 및 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘)(5-(N-[1-(2,3-dihydroxypropyl)]carboxyamide)-2'-deoxyuridine), 8-위치의 퓨린 변형, 엑소시클릭 아민(exocyclic amines)에서의 변형, 4-티오우리딘의 치환, 5-브로모- 또는 5-이오도-우라실(5-iodo-uracil)의 치환, 기본골격(backbone) 변형, 메틸화, 이소베이스 이소시티딘(isobases isocytidine) 및 이소구아니딘(isoguanidine) 등과 같은 비정상적 염기쌍 조합(unusual base-paring combinations)을 포함할 수 있다.
한 실시예에서, 상기 용어 "C-5 변형된 피리미딘(C-5 modified pyrimidine)"은 도 16에 나타낸 그것들의 부분들(moieties) 이외에도 C-5 위치에 변경을 가지는 피리미딘을 말한다. C-5 변형된 피리미딘의 예는 U.S. Pat. Nos. 5,719,273 및 5,945,527에 기재된 것들을 포함한다. C-5 변형의 예는 바로 아래에 나타낸 것과 같은 벤질카르복시아미드(benzylcarboxyamide)(대안적으로, 벤질아미노카르보닐(benzylaminocarbonyl))(Bn), 나프틸메틸카르복시아미드(naphthylmethylcarboxyamide)(대안적으로, 나프틸메틸아미노카르보닐(naphthylmethylaminocarbonyl))(Nap), 트립타미노카르복시아미드(tryptaminocarboxyamide)(대안적으로, 트립타미노카르보닐(tryptaminocarbonyl))(Trp) 및 이소부틸카르복시아미드(isobutylcarboxyamide)(대안적으로, 이소부틸아미노카르보닐(isobutylaminocarbonyl))(iBu)로부터 선택된 치환기와 함께 C-5 위치에 데옥시우리딘의 치환을 포함한다.
상기 기술한 바와 같이, 각각의 C-5 변형된 피리미딘은 5-(N-벤질카르복시아미드)-2'-데옥시우리딘(BndU), 5-(N-이소부틸카르복시아미드)-2'-데옥시우리딘(iBndU), 5-(N-트립타미노카르복시아미드)-2'-데옥시우리딘(TrpdU) 및 5-(N-나프틸메틸카르복시아미드)-2'-데옥시우리딘(NapdU)를 포함한다.
변형은 또한 캡핑(capping)과 같은 3' 및 5' 변형을 포함할 수 있다. 다른 변형은 유사체와 함께 하나 또는 그 이상의 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드의 치환, 비전하 결합(uncharged linkage)을 가지는 것(예를 들어, 메틸 포스포네이트(methyl phosphonates), 포스포트리에스테르(phosphotriesters), 포스포아미데이트(phosphoamidates), 및 카바메이트(carbamate) 등), 전하 결합(charged linkage)을 가지는 것(예를 들어, 포스포로티오에이트(phosphorothioates), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioates) 등), 인터컬레이터(intercalators)를 가지는 것(예를 들어, 아크리딘(acridine), 솔라렌(psoralen) 등), 킬레이터를 포함하는 것(예를 들어, 금속, 방사선 금속, 붕소, 산화금속 등) 및 변형된 결합을 가지는 것(예를 들어, 알파 아노머성(alpha anomeric) 핵산 등)과 같은 뉴클레오티드간 변형(internucleotide modifications)을 포함한다. 게다가, 당에 보통 존재하는 임의의 하이드록실기는 포스포네이트기(phosphonate group) 또는 포스페이트기(phosphate group)에 의해 치환될 수 있고; 임의의 적절한 보호기(protecting groups)에 의해 보호될 수 있거나; 추가적인 뉴클레오티드 또는 고체 지지체에 부가적인 결합을 만들기 위해 활성화될 수 있다. 5' 및 3' 말단의 OH기는 인산화(phosphorylated)될 수 있거나, 아민, 약 1 내지 약 20개의 탄소 원자로부터의 유기 캡핑기 부분(organic capping group moieties), 또는 약 1 내지 약 20 개의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 폴리머들 또는 다른 친수성 또는 소수성 생물학적 또는 합성 폴리머들로부터의 유기 캡핑기 부분으로 치환될 수 있다. 만일 존재한다면, 뉴클레오티드 구조는 폴리머 조합 전 또는 후에 변형될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지 성분(labeling component)과 함께 결합(conjugation)되는 것과 같은 폴리머화 후에 더 변형될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 또한 2'-O-메틸-(2'-O-methyl-), 2'-O-알릴(2'-O-allyl), 2'-플루오로-(2'-fluoro-) 또는 2'-아지도-리보오스(2'-azido-ribose), 카보시클릭 당 유사체(carbocyclic sugar analogs), α-아노머성 당(α-anomeric sugars), 아라비노스, 자일로스 또는 릭소오스(lyxoses)와 같은 에피메릭 당(epimeric sugars), 피라노오스 당(pyranose sugars), 퓨라노오스 당(furanose sugars), 세도헵툴로오스(sedoheptuloses), 아시클릭 유사체(acyclic analogs) 및 메틸 리보사이드와 같은 어베이직 뉴클레오티드 유사체(abasic nucleotide analogs)를 포함하는, 당업자에게 일반적으로 잘 알려져 있는 리보오스 또는 데옥시리보오스와 유사한 형태를 포함할 수 있다. 상기에 언급한 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 포스포디에스테르 결합들은 대안적 연결기(alternative linking group)로 대체될 수 있다. 이러한 대안적 연결기들은 포스페이트가 P(O)S("티오에이트(thioate)"), P(S)S("디티오에이트(dithioate)"), (O)NR2("아미데이트(amidate)"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("포름아세탈(formacetal)")로 대체되고, 각 R 또는 R'는 독립적으로 H 이거나 에테르(-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄딜(araldyl)을 선택적으로 포함하는 치환되거나 비치환된 알킬(1-20C)이다. 폴리뉴클레오티드에서 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 당, 퓨린 및 피리미딘의 유사한 형태의 치환은 예를 들어, 폴리아미드 기본골격과 같은 대안적인 기본골격 구조일 수 있는 최종 제품을 설계하는데 유리할 수 있다.
한 실시예에서, 압타머 구조체는 그것의 표적으로부터 압타머의 분리 속도를 효과적으로 늦추는 압타머의 가변 영역(variable region)에 하나 또는 그 이상의 C5-변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 압타머의 가변 영역의 생성에 사용된 뉴클레오티드의 염기 변형은 그것들 각각의 표적으로부터 매우 느린 오프 레이트를 가지는 압타머를 생성하는 것으로 나타났다. 예를 들면, 임의의 도 16에 나타낸 것과 같은 5 위치 변형된 피리미딘을 포함하는 압타머는 그것의 표적으로부터 느린 분리 속도를 가지는 것으로 나타났다. 어떤 실시예에서, 동적 유발을 포함하는 검정 방법에서 이 방법으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 압타머의 사용은 표적의 검출에서 강화된 민감성 및 특이성을 제공한다. 도 4에 나타낸 것과 같이, 지금까지 500개 이상의 표적에 대한 압타머가 생산되었다. 이 압타머들 중 대부분은 느린-오프 레이트 특성을 가진다.
한 실시예에서, 압타머의 가변 영역은 변형된 염기를 가지는 뉴클레오티드를 포함한다. 이 압타머들은 본원에 기재된 임의의 방법, 기구 및 키트에 사용될 수 있다. 이 변형된 뉴클레오티드들은 표적에 대하여 높은 친화력을 유지함과 동시에 그것들 각각의 표적으로부터 매우 느린 오프 레이트를 가지는 압타머들을 확인할 수 있게 하는 것으로 나타났다. 한 실시예에서, 피리미딘 염기의 C-5 위치가 변형될 수 있다. 다른 실시예에서, 압타머에서 피리미딘의 일부 또는 전부는 염기 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 여전히 다른 실시예에서, 변형된 피리미딘의 조합이 사용될 수 있다. 변형된 염기를 가지는 뉴클레오티드를 포함하는 압타머들은 비변형된 뉴클레오티드(즉, 자연적으로 생성된 뉴클레오티드) 만을 포함하는 압타머들과는 매우 다른 성질을 가진다. 한 실시예에서, 뉴클레오티드의 변형을 위한 방법은 카복시아미드 결합을 통해서 이루어진다. 그러나, 변형을 위한 다른 방법이 적절할 수 있다. 놀랍게도, 확인된 느린-오프 레이트 압타머의 구조는 염기쌍 모델에 의해 예상된 구조와 일치하지 않는 것으로 관찰되었다. 이것은 측정된 압타머의 용융 온도가 예상할 수 있는 모델과 일치하지 않는다는 사실에 의하여 뒷받침된다. 본원에 나타낸 바와 같이, 측정되고 예측된 용융 온도간의 연관성은 거의 없거나 없는 것으로 나타났다. 게다가, 대체로 예측된 Tm은 측정된 Tm보다 6℃ 더 낮았다. 상기 측정된 용융 온도는 이 변형된 뉴클레오티드들을 포함하는 압타머가 예측될 수 있는 것보다 더 안정하며, 신규한 2차 구조를 가질 가능성이 있다는 것을 나타낸다. 느린 오프-레이트 압타머들의 확인은 또한 변형된 뉴클레오티드가 초기 라이브러리(initial library) 또는 후보 혼합물(candidate mixture)의 생산에 사용될 때 더 적당하다.
본원에 사용된 것과 같은 "변형된 핵산"은 SELEX 공정과 양립하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 말한다.
본 발명의 다른 실시예에서, 압타머와 표적의 비공유결합 복합체가 제공되며, 여기에서 상기 압타머는 약 10nM 이하의 표적에 대한 Kd를 가지고, 여기에서 표적으로부터의 압타머의 분리 속도(t1/2)는 약 30분보다 길거나 같고; 약 30분 및 약 240분 사이이고; ≥ 약 30분, ≥ 약 60분, ≥ 약 90분, ≥ 약 120분, ≥ 약 150분, ≥ 약 180분, ≥ 약 210분, ≥ 약 240분이고/이거나, 여기에서 압타머의 핵산 서열에서 하나, 여러 개 또는 모든 피리미딘은 염기의 5-위치에서 변형된다. 상기 변형은 도 16에 나타낸 화합물의 기(group)로부터 선택될 수 있다. 압타머들은 바람직한 염기 변형 뉴클레오티드의 임의의 조합으로 설계될 수 있다.
본원에서 사용된 것으로서, "압타머(aptamer)" 및 "핵산 리간드(nucleic acid ligand)"는 표적 분자에 대하여 특이적인 결합 친화력을 가지는 핵산을 말하는 데 상호교환적으로 사용된다. 친화적 상호작용은 정도의 문제(matter of degree)라고 인식되고 있으나, 이 문맥에서 그것의 표적에 대한 압타머의 "특이적 결합 친화력"은 압타머가 시료 내의 다른 성분과 결합하는 것보다 일반적으로 더욱 높은 친화력을 가지고 표적과 결합하는 것을 의미한다. "압타머"는 특정 뉴클레오티드 서열을 가지는 한 형태 또는 종류의 핵산 분자의 복제 세트이다. 압타머는 임의의 적절한 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. "압타머"는 많은 이러한 분자세트를 말한다. 서로 다른 압타머들은 동일하거나 서로 다른 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법들은 하나 또는 그 이상의 압타머의 사용을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법들은 또한 특히 동일한 표적 분자에 결합하는 두개 또는 그 이상의 압타머의 사용을 포함할 수 있다. 하기에 더 기재된 바와 같이, 압타머는 태그를 포함할 수 있다. 만일 압타머가 태그를 포함한다면, 모든 압타머의 복제들은 동일한 태그를 가질 필요가 없다. 게다가, 만일 서로 다른 압타머들이 각각 태그를 포함한다면, 이러한 서로 다른 압타머들은 동일한 태그 또는 서로 다른 태그를 모두 가질 것이다. 압타머는 ssDNA, dsDNA, RNA 또는 DNA와 RNA의 조합일 수 있다.
압타머는 SELEX 공정을 포함한 임의의 공지의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허등록번호 제 5,475,096("Nucleic Acid Ligands")을 참조하라. 일단 확인되면, 압타머는 화학적 합성 방법 및 효소적 합성 방법을 포함하는 임의의 공지의 방법에 따라 제조되거나 합성될 수 있다.
용어 "SELEX" 및 "SELEX 공정(SELEX process)"은 일반적으로 (1) 예를 들어, 단백질에 대해 높은 친화력으로 결합하는 바람직한 방법으로 표적 분자와 결합하는 핵산의 선택과 (2) 그렇게 선택된 핵산의 증폭의 조합을 말하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, 미국 특허등록번호 제 5,475,096("Nucleic Acid Ligands")을 참조하라. SELEX 공정은 그것의 표적과 비공유적으로 결합하는 압타머 뿐만 아니라 표적과 공유적으로 결합하는 압타머를 만드는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허등록번호 제 5,705,337("Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX")을 참조하라. 상기 SELEX 공정은 또한 본 발명과 동시에 출원되고 전체로서 참조에 의해 본원에 통합되어 있는 미국 특허출원번호 제12/175,434("Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates")에 기재된 것과 같은 향상된 오프-레이트를 가지는 압타머를 만드는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "압타머 친화 복합체(aptamer affinity complex)" 또는 "압타머 복합체(aptamer complex)"는 그것의 표적 분자와 압타머의 상호작용에 의해 형성된 비공유적 복합체를 말한다. "압타머 친화 복합체" 또는 "압타머 복합체"는 대응하는 표적 분자에 결합하는 압타머에 의해 형성된 한 형태 또는 종류의 복합체의 복제 세트이다. "압타머 친화 복합체" 또는 "압타머 복합체"는 많은 이러한 복합체 세트를 말한다. 압타머 친화 복합체 또는 압타머 복합체는 일반적으로 예를 들어, 온도를 높이고, 염 농도를 높이거나 변성제(denaturant)의 첨가와 같은 환경 조건에서의 변화에 의해 전환되거나 분리될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, "비특이적 복합체(non-specific complex)"는 압타머와 그것의 표적 분자를 제외한 두 개 또는 그 이상의 분자간 비-공유적 결합을 말한다. 비특이적 복합체는 그것의 구성 분자들 간의 친화 상호작용에 기초하여 선택되지는 않지만 분자 종류들 간의 상호작용을 나타내기 때문에, 비특이적 복합체에 결합된 분자들은 대체로 서로 매우 낮은 친화력을 나타낼 것이고, 압타머와 그것의 표적 분자들보다 그에 상응하는 더 높은 분리 속도를 가질 것이다. 비특이적 복합체는 압타머와 비표적 분자, 경쟁자와 비표적 분자, 경쟁자와 표적 분자, 및 표적 분자와 비표적 분자간에 형성된 복합체를 포함한다.
SELEX 공정은 일반적으로 서로 다른 서열의 핵산 후보 혼합물의 제조로부터 시작한다. 상기 후보 혼합물은 일반적으로 두개의 고정 영역(즉, 후보 혼합물의 각각의 구성요소들은 동일한 위치에 동일한 서열을 포함한다) 및 가변 영역을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 전형적으로, 상기 고정된 서열 영역은 하기에 기재된 증폭 단계에 도움을 주거나, 후보 혼합물에서 핵산의 주어진 구조적 배열의 가능성을 강화시키기 위해 선택된다. 상기 가변 영역은 전형적으로 후보 혼합물에서 각각의 핵산의 표적 결합 부위를 제공하고, 이 가변 영역은 완전하게 랜덤화되거나(즉, 임의의 위치에서 염기를 찾을 가능성은 4개 중 1개이다) 부분적으로 랜덤화(즉, 임의의 위치에서 염기를 찾을 가능성은 1 및 100 퍼센트 사이의 임의의 레벨에서 선택될 수 있다)될 수 있다. 제조된 후보 혼합물은 표적 및 후보 혼합물의 구성 성분간에 발생하는 결합을 용이하게 하는 조건 하에서 선택된 표적 분자와 접촉된다. 이 조건 하에서, 표적과 후보 혼합물의 핵산 간의 상호작용은 일반적으로 한쌍의 구성 성분간에 가장 강한 상대적 친화력을 가지는 핵산-표적 쌍(nucleic acid-target pairs)을 형성한다. 표적에 대한 가장 높은 친화력을 가지는 핵산은 표적에 대하여 더 낮은 친화력을 가지는 핵산으로부터 분리된다. 분리 공정은 최대 수의 높은 친화력의 후보물질을 유지하는 방법으로 수행된다. 표적에 대해 상대적으로 높은 친화력을 가지도록 분리하는 동안 선택된 핵산들은 표적에 대하여 상대적으로 높은 친화력을 가지는 핵산에서 강화된 새로운 후보 혼합물을 만들기 위하여 증폭된다. 상기의 분리 및 증폭 단계를 반복함으로써, 새롭게 형성된 후보 혼합물은 점점 더 적은 고유 서열을 포함하고, 표적에 대한 핵산 혼합물의 평균 친화도(average degree of affinity)는 일반적으로 증가할 것이다. 극단적인 측면에서 보면, 상기 SELEX 공정은 표적 분자에 대하여 가장 높은 친화력을 가지는 원래의 후보 혼합물로부터의 핵산을 나타내는 하나 또는 매우 적은 수의 고유 핵산을 포함하는 후보 혼합물을 제공할 것이다.
본원에 사용된 것으로서, "광압타머(photoaptamer)", "광반응성 핵산 리간드(photoreactive nucleic acid ligand)" 및 "광반응성 압타머(photoreactive aptamaer)"는 표적 분자와 공유적으로 결합 또는 "가교결합(crosslink)"할 수 있는 하나 또는 그 이상의 광반응성 작용기를 포함하는 압타머를 말하는 데 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, 자연적으로 생성되는 핵산 잔기는 적절한 파장의 조사원(radiation source)에 노출시키면 핵산 잔기에 광반응성을 제공하는 화학적 작용기를 포함하도록 변경될 수 있다. 광압타머는 임의의 공지의 방법을 사용하여 확인되고/되거나 제조될 수 있다. 어떤 실시예에서, 광반응성 압타머는 광SELEX 공정을 사용하여 확인된다. 예를 들어, 미국 특허등록번호 제5,763,177호, 미국 특허등록번호 제6,001,577호 및 미국 특허등록번호 제6,291,184호를 참조하라("Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligand by Exponential Enrichment:Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"). 또한 예를 들어, 본원 발명과 동시에 출원되고 전체로서 참조에 의해 본원에 통합되어 있는 미국 특허등록번호 제6,468,539호("Photoselection of Nucleic Acid Ligand") 및 미국 특허출원번호 제12/175,388("Improved SELEX and PHOTOSELEX")을 참조하라.
광압타머 내로 포함될 수 있는 대표적인 광반응성 작용기는 5-브로모우라실(5-bromouracil), 5-이오도우라실(5-iodouracil), 5-브로모비닐우라실(5-bromovinyluracil), 5-이오도비닐우라실(5-iodovinyluracil), 5-아지도우라실(5-azidouracil), 4-티오우라실(thiouracil), 5-티오우라실(5-thiouracil), 4-티오시토신(4-thiocytosine), 5-브로모시토신(5-bromocytosine), 5-이오도시토신(5-iodocytosine), 5-브로모비닐시토신(5-bromovinylsytosine), 5-이오도비닐시토신(5-iodovinylcytosine), 5-아지도시토신(5-azidocytosine), 8-아지도아데닌(8-azidoadenine), 8-브로모아데닌(8-bromoadenine), 8-이오도아데닌(8-iodoadenine), 8-아지도구아닌(8-azidoguanine), 8-브로모구아닌(8-azidoguanine), 8-이오도구아닌(8-iodoguanine), 8-아지도하이포크산틴(azidohypoxanthine), 8-브로모하이포크산틴(8-bromohypoxanthine), 8-이오도하이포크산틴(8-iodohypoxanthine), 8-아지도크산틴(azidoxanthine), 8-브로모크산틴(8-bromoxanthine), 8-이오도크산틴(8-iodoxanthine), 5-[(4-아지도페나실)티오]시토신(5-[(4-azidophenacyl)thio]cytosine), 5-[(4-아지도페나실)티오]우라실(5-[(4-azidophenacyl)thio]uracil), 7-데아자-7-이오도아데닌(7-deaza-7-iodoadenine), 7-데아자-7-이오도구아닌(7-deaza-7-iodoguanine), 7-데아자-7-브로모아데닌(7-deaza-7-bromoadenine) 및 7-데아자-7-브로모구아닌(7-deaza-7-bromoguanine)을 포함한다.
이러한 대표적인 뉴클레오시드에 기초한 광반응성 작용기 이외에도, 적절한 연결 분자를 통하여 압타머의 말단(terminal end)에 첨가될 수 있는 다른 광반응성 작용기 또한 사용될 수 있다. 이러한 광반응성 작용기는 벤조페논(benzophenone), 안트라퀴논(anthraquinone), 4-아지도-2-니트로-아닐린(4-azido-2-nitro-aniline), 소랄렌(psoralen), 이런한 것들의 임의의 유도체 등을 포함한다.
광압타머 내에 포함된 광반응성 작용기는 임의의 적절한 방법에 의해 활성화될 수 있다. 한 실시예에서, 광반응성 작용기를 포함하는 광압타머는 광압타머 친화 복합체를 전자기 방사선원(source of electromagnetic radiation)에 노출시킴으로써 표적에 가교결합된다. 적절한 형태의 전자기 방사선은 자외선, 가시광선, X-레이 및 감마선을 포함한다. 적절한 방사선원은 단색광(monochromatic light) 또는 여과된 다색광(filtered polychromatic light) 중 어느 하나를 사용하는 광원을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "압타머 공유결합 복합체(aptamer covalent complex)"는 압타머가 그것의 표적 분자와 공유결합을 형성하도록 유도되거나 그렇지 않으면 공유결합을 형성하는 압타머 친화 복합체를 말한다. "압타머 공유결합 복합체"는 그것에 상응하는 표적 분자에 공유적으로 결합한 압타머에 의해 형성된 하나의 형태 또는 종류의 복합체의 복제 세트이다. "압타머 공유결합 복합체"는 많은 이러한 복합체 세트를 말한다. 압타머와 그것의 표적 분자간의 공유결합 또는 결합은 광압타머에 관하여 상기에 기재된 부분을 포함하는 압타머 상의 화학적 부분의 광활성화에 의해 유도될 수 있다. 압타머와 그것의 표적 분자간의 공유결합 또는 결합은 또한 화학적으로 유도될 수 있다. 압타머에 포함될 수 있고 표적 분자와의 공유 결합을 유도하는 데 사용될 수 있는 화학기(chemical groups)는 알데히드(aldehydes), 말레이미드(maleimides), 아크릴일 유도체(acrylyl derivatives), 디아조늄 유도체(diazonium derivatives), 티올(thiols) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 어떤 실시예에서, 예를 들어 말레이미드 또는 디아조늄 염과 같은 화학적 가교결합기는 적절한 환경 및 특이적이고 충분히 강화된 화학 반응을 일으키도록 요구되는 반응성 기의 병렬(juxtaposition)을 제공함으로써 간단하게 압타머 친화 복합체를 압타머 공유결합 복합체로 전환시킬 수 있다. 다른 실시예에서, 알데히드기와 같은 화학적 가교제는 압타머 친화 복합체를 안정하고 불가역적인(irreversible) 압타머 공유결합 복합체로 전환시키기 위하여, 다른 성분, 예를 들어 소디움 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride)의 첨가를 필요로 할 수 있다. 여전히 다른 실시예에서, 어떤 화학적 가교제도 압타머에 포함되지 않으며, 오히려 제3의 시약이 압타머와 그것의 표적 간의 공유적 부착을 용이하게 함으로써 압타머 친화 복합체를 압타머 공유결합 복합체로 전환시키는 데 사용된다. 예를 들어, 아민 반응성 부분(예를 들어, N-하이드록시 숙신이미딜 에스테르(N-hydroxy succinimidyl ester), 알데히드(aldehyde) 또는 이미데이트(imidate)) 및 뉴클레오시드-반응성기(예를 들어, 이오도아세트아미드(iodoacetamide) 또는 활성화된 알데히드)를 모두 포함하는 동종이작용성(homobifunctional) 또는 이종이작용성(heterobifunctional) 시약은 압타머와 표적 단백질에 의해 형성된 친화 복합체와 같은 압타머 친화 복합체의 공유적 착물화(complexation)를 유도할 수 있다.
광압타머는 친화 압타머를 처음으로 확인하고, 하나 또는 그 이상의 광반응성 뉴클레오티드 잔기로 치환함으로써 확인될 수 있다. 대안적으로, 광압타머는 (a) 핵산 후보 혼합물을 제조하고, 여기에서 각각의 핵산은 (i) 적어도 하나의 비광반응성 위치지정(placeholding) 피리미딘 및 (ii) 적어도 하나의 변형된 피리미딘을 포함하고; (b) 표적과 후보 혼합물을 접촉시키고, 여기에서 후보 혼합물에 대한 표적에 대하여 증가된 친화력을 가지는 핵산은 후보 혼합물의 잔여물로부터 분리될 수 있고; (c) 후보 혼합물의 잔여물로부터 증가된 친화력을 가지는 핵산을 분리하고; (d) 핵산 리간드가 풍부한 핵산 혼합물을 산출하기 위하여 증가된 친화력을 가지는 핵산을 증폭시키고, 그것에 의하여 표적 화합물에 대한 압타머를 확인할 수 있으며; (e) 원하는 만큼 (b)-(d)를 반복하고; (f) 광반응성 피리미딘과 함께 하나 또는 그 이상의 비광반응성 위치지정 피리미딘인 (d)의 핵산 리간드가 풍부한 혼합물의 각각의 핵산으로 대체함으로써 후보 광압타머를 생산하고; (g) 상기 표적과 후보 광압타머를 접촉시키고, 여기에서 후보 광압타머-표적 복합체가 형성되며; (h) 상기 광압타머-표적 복합체를 방사선 조사하고; (i) 상기 후보 광압타머-표적 복합체의 광가교결합 여부를 측정하고; (j) 원하는 만큼 (f)-(i)를 반복하고; (k) 표적에 대한 적어도 하나의 광압타머를 확인하는 것을 포함하는 SELEX 공정에 의해 확인될 수 있다.
상기 용어 "시료(test sample)"는 본원에서 다수의 분자들을 포함하는 임의의 물질, 용액 또는 혼합물을 말하며, 적어도 하나의 표적 분자를 포함할 수 있다. 상기 용어 시료는 하기에 기재된 것과 같이 생물학적 샘플 및 예를 들어, 오염되거나 오염되었을 가능성이 있는 물 및 공업 폐수와 같은 환경 또는 독물 검사를 하기 위하여 사용될 수 있는 샘플을 포함한다. 시료는 또한 최종 생성물(end product), 중간 생성물(intermediate product) 또는 예를 들어, 제조 공정과 같은 준비하는 과정에서의 부산물일 수 있다. 시료는 생물 또는 어떤 다른 원(source)(예를 들어, 환경 또는 공업원)으로부터 얻어진 물질, 용액 또는 혼합물이 첨가된 임의의 적절한 검정 배지, 버퍼 또는 희석제를 포함할 수 있다.
용어 "생물학적 샘플(biological sample)"은 생물로부터 얻어진 임의의 물질, 용액 또는 혼합물을 말한다. 이것은 혈액(전혈(whole blood), 백혈구, 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells), 혈장 및 혈청), 가래(sputum), 입김(breath), 소변, 정액, 침(saliva), 뇌막액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 림프액(lymph fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 세포, 세포 추출물 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함한다. 이것은 또한 대표적으로 앞서 말한 모든 것들의 분리된 단편들을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 또한 예를 들어, 대변(stool) 샘플, 조직 샘플 또는 조직 생검과 같은 물질, 용액 또는 균질화된 고형 물질을 포함하는 혼합물을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 또한 조직 배양, 세포 배양, 세균 배양 또는 바이러스 배양으로부터 유래된 물질, 용액 또는 혼합물을 포함한다.
본원에서 사용된 것으로서, "표적 분자(target molecule)" 및 "표적(target)"은 압타머가 높은 친화력과 특이성으로 결합할 수 있고 시료에 존재할 수 있는 관심있는 임의의 분자를 말하는 데 상호교환적으로 사용된다. "관심있는 분자(molecule of interest)"는 단백질의 경우에 예를 들어, 아미노산에서의 경미한 변이(minor variation), 이황화 결합(disulfide bond formation), 당화(glycosylation), 지질화(lipidation), 아세틸화(acetylation), 인산화(phosphorylation) 또는 분자의 본질을 실질적으로 변경하지 않는 표지 성분과의 결합과 같은 임의의 다른 조작(manipulation) 또는 변형(modification)과 같은 특정 분자의 임의의 경미한 변이를 포함한다. "표적 분자" 또는 "표적"은 압타머와 결합할 수 있는 분자 또는 다분자(multimolecular) 구조의 한 형태 또는 종류의 복제 세트이다. "표적 분자" 또는 "표적"은 하나 이상의 이러한 분자 세트를 말한다. 대표적인 표적 분자는 단백질, 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 다당, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 애피바디(affibody), 항체 모조체(antibody mimics), 바이러스, 병원체, 독성 물질, 기질, 대사 산물, 전이 유사물(transition state analogs), 보조인자(cofactors), 저해제, 약물, 염료, 영양소, 성장 인자, 세포, 조직 및 앞서 말한 임의의 것들에 대한 임의의 단편 또는 부분을 포함한다. 압타머는 사실상 임의의 크기를 가지는 임의의 화학적 또는 생물학적 분자로 확인될 수 있으므로, 사실상 임의의 크기를 가지는 임의의 화학적 또는 생물학적 분자는 적절한 표적이 될 수 있다. 표적은 또한 표적과 압타머 간의 상호작용의 가능성 또는 세기를 강화시키기 위해 변형될 수 있다. 표적은 또한 상기에 기재된 것과 같이 태그를 포함하도록 변형될 수 있다. 대표적 실시예에서, 표적 분자는 단백질이다. SELEX 표적이 펩티드인 방법에 대한 미국 특허등록번호 제6,376,190호("Modified SELEX Processes Without Purified Protein")를 참조하라.
"폴리펩티드(polypeptide)", "펩티드(peptide)" 및 "단백질(protein)"은 임의의 길이를 가지는 아미노산의 폴리머를 말하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 폴리머는 직선이거나 분지될 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어들은 또한 자연적으로 변형되거나, 예를 들어, 이황화 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 표지된 성분과의 결합과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형과 같은 조정(intervention)에 의한 아미노산 폴리머를 포함한다. 또한 정의 내에는 예를 들어, 당업계에 공지된 다른 변형 뿐만 아니라 아미노산(예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함)의 하나 또는 그 이상의 유사물을 포함하는 폴리펩티드도 포함된다. 폴리펩티드는 단일 사슬 또는 연결된 사슬(associated chains)일 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, "비-표적 분자(non-target molecule)" 및 "비-표적(non-target)"은 압타머와 비특이적인 복합체를 형성할 수 있는 시료 내에 포함된 분자를 말하는 것으로 상호교환적으로 사용된다. "비-표적 분자" 또는 "비-표적"은 압타머와 결합할 수 있는 하나의 형태 또는 종류의 분자 또는 복합 분자 구조의 복제 세트이다. "비-표적 분자" 또는 "비-표적"은 하나 이상의 이러한 분자 세트를 말한다. 제1 압타머에 대한 비-표적 분자는 제2 압타머에 대한 표적이 될 수 있음을 확인할 수 있을 것이다. 마찬가지로, 제1 압타머에 대한 표적 분자는 제2 압타머에 대한 비-표적이 될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 상기 용어 "분할(partition)"은 시료로부터의 하나 또는 그 이상의 분자종(molecular species)의 분리 또는 제거를 말한다. 분할은 민감도를 증가시키고/증가시키거나 백그라운드(background)를 감소시키는 데 사용될 수 있다. 분할은 다음의 압타머 복합체 형성 또는 가교결합하는 동안 도입된 공유결합 때문에 압타머 친화 복합체가 불가역적이 될 때 매우 효과적이다. 분할 단계는 압타머 친화 복합체가 고정화된 경우, 임의의 단계 후에 또는 매 단계 후에 도입될 수 있다. 분할은 또한 압타머 친화 복합체와 시료의 다른 성분간에 별도로 존재하는 크기의 차이 또는 다른 특이적 특성에 의존한다. 분할은 또한 압타머 또는 표적과의 특이적 상호작용을 통하여 달성될 수 있다. 분할은 또한 압타머, 표적, 압타머 친화 복합체 또는 압타머 공유결합 복합체의 물리적 또는 생화학적 특성에 기초하여 달성될 수 있을 것이다.
본원에서 사용된 것으로서, "포획 1(Catch 1)"은 압타머의 포획에 기초한 압타머 친화 복합체 또는 압타머 공유결합 복합체의 분할을 말한다. 포획 1의 목적은 압타머와 결합되지 않은 시료 내의 모든 성분을 실질적으로 제거하기 위한 것이다. 다수의 이러한 성분들의 제거는 일반적으로 포획 2(Catch 2) 포획에 사용된 표적 태깅 단계로부터 비-표적 분자를 제거함으로써 표적 태깅 효율을 향상시킬 것이고, 더욱 낮은 검정 백그라운드를 제공할 것이다. 한 실시예에서, 태그는 태그를 압타머에 추가함으로써 검정하기 전, 검정을 준비하는 동안 또는 검정하는 동안에 압타머에 부착된다. 한 실시예에서, 상기 태그는 방출가능한 태그(releasable tag)이다. 한 실시예에서, 상기 방출가능한 태그는 절단가능한 링커(cleavable linker) 및 태그를 포함한다. 상기에 기재된 바와 같이, 태그된 압타머는 고체 지지체가 태그에 적절한 포획 성분을 포함하는 경우, 고체 지지체 상에 포획될 수 있다. 상기 고체 지지체는 그 후 압타머와 결합되지 않은 시료 혼합물 내의 임의의 물질을 제거하기 위해 세척될 수 있다.
여러가지 실시예에서, 압타머 친화(또는 공유결합) 복합체들은 압타머 내로 포함된 포획 태그(압타머 태그)를 사용하여 고체 지지체 상에 포획되거나 고정화된다. 예를 들어, 만일 압타머 상의 포획 태그가 상기에 기재된 바와 같은 비오틴이라면, 표면 상에 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘(neutravidin), 엑스트라비딘(Extravidin) 등을 가지는 비드가 압타머 친화(또는 공유결합) 복합체를 포획하는 데 사용될 수 있다. 상기 비드는 임의의 자유(비착물화된) 표적 및 다른 샘플 매트릭스 성분들을 제거하기 위하여 세척된다.
다른 실시예에서, 상기 태그는 제1 고체 지지체 상에 고정화된 프로브에 대하여 상보적인 혼성화 태그(hybridization tag)이다. 이 경우에 상기 고체 지지체는 마이크로비드(예를 들어, 상자성 비드(paramagnetic beads)), 본원에 기재된 임의의 다른 적절한 고체 지지체 등을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 태그는 압타머에 첨가된 고유의 서열 태그 또는 압타머 서열의 일부분 또는 전 압타머 서열일 수 있다. 압타머가 혼성화를 통하여 상기 고체 지지체와 결합된 후, 시료는 압타머와 결합되지 않은 임의의 물질을 제거하기 위하여 세척될 수 있다. 한 실시예에서, 상기 압타머 공유결합 복합체 및 자유 압타머는 고농도 염, 낮거나 높은 pH, 높은 온도 또는 임의의 이것들의 조합과 같은 역 혼성화(reverse hybridization)를 위한 임의의 적절한 방법을 사용하여 고체 지지체로부터 방출될 수 있다. 태그-프로브 혼성화를 파괴시키는 조건은 일반적으로 압타머 구조를 변성시킬 것이며, 그 결과 압타머 친화 복합체가 분리되기 때문에, 포획 1에서 혼성화 태그의 방출은 일반적으로 압타머 친화 복합체를 보호할 수 없다.
다른 실시예에서, 압타머와 결합되지 않은 성분의 제거는 외재적(explicit) 압타머 태그 및 제1 고체 지지체 보다는 물리적 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 한 실시예에서, 이것은 시료로부터의 자유 및 착물화된 압타머 모두를 침전시킴으로서 달성되며, 상층액에서 표적 태깅 시약과 반응할 수 있는 남아있는 다른 분자들은 버린다. 이 방법은 광가교결합 검정법과 함께 사용하기 위하여 설계된다는 것에 유의한다. 이러한 핵산 침전법은 예를 들어, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide; CTAB), 도데실트리메틸암모늄 브로마이드(dodecyltrimethylammonium bromide; DTAB) 및 에탄올과 같은 유기 용매를 포함하는 시약을 사용하여 달성될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, "포획 2(Catch 2)"는 표적 분자의 포획에 기초한 압타머 친화 복합체 또는 압타머 공유결합 복합체의 분할을 말한다. 포획 2의 목적은 검출 및 광학적 정량 전에 시료로부터 자유 또는 비착물화된 압타머를 제거하기 위한 것이다. 시료로부터 자유 압타머를 제거하는 것은 임의의 적절한 핵산 검출 기술에 의하여 압타머 친화 또는 압타머 공유결합 복합체를 검출할 수 있도록 한다. 검출 및 광학적 정량을 위하여 Q-PCR을 사용하는 경우, 자유 압타머의 제거는 표적 분자의 정확한 검출 및 정량을 위하여 필요하다.
한 실시예에서, 상기 표적 분자는 단백질 또는 펩티드이고, 자유 압타머는 단백질(및 펩티드) 및 예를 들어, 압타머 친화(또는 공유결합) 복합체와 같은 단백질(또는 펩티드)을 포함하는 복합체 내로 포함될 수 있는 시약을 사용하여, 압타머 친화(또는 공유결합) 복합체(및 시료의 나머지)로부터 분할된다. 태그된 단백질(또는 펩티드) 및 압타머 친화(또는 공유결합) 복합체는 고체 지지체 상에 고정화될 수 있고, 자유 압타머로부터 단백질(또는 펩티드) 및 압타머 친화(또는 공유결합) 복합체를 분할할 수 있게 한다. 이러한 태깅은 예를 들어, 단백질 또는 펩티드 내로 포함될 수 있는 비오틴 부분(biotin moiety)을 포함할 수 있다.
한 실시예에서, 포획 2 태그는 표적에 태그를 화학적으로 부착시킴으로써 검정하기 전, 검정을 준비하기 전 또는 검정하는 동안에 단백질(또는 펩티드)에 부착된다. 한 실시예에서, 포획 2 태그는 방출가능한 태그이다. 한 실시예에서, 상기 방출가능한 태그는 절단가능한 링커 및 태그를 포함한다. 그러나, 포획 2 고체 지지체로부터 상기 단백질(또는 펩티드)을 방출시키는 것이 일반적으로 필요하지는 않다. 상기에 기재한 바와 같이, 태그된 표적은 고체 지지체가 표적 태그에 적절한 포획 성분을 포함하는 경우, 제2 고체 지지체 상에 포획될 수 있다. 상기 고체 지지체는 그 후 용액으로부터 자유 압타머를 제거하기 위해 세척될 수 있다.
한 실시예에서, 포획 2에 도입된 표적 태그는 포획 1에 사용된 압타머 상의 것과 동일한 태그이다. 이 실시예에서, 상기 표적 태깅은 포획 1 단계 후 포획 2 고체 지지체의 도입 전에 수행된다. 한 실시예에서, 만약 표적 태깅이 포획 1 지지체 상에서 완료된다면, 포획 1 지지체 상의 압타머가 부착되어 있지 않은 부위는 표적을 태깅하기 전에 차단될 수 있다.
다른 실시예에서, 압타머 친화 복합체 또는 압타머 공유결합 복합체는 제2 고체 지지체 상의 포획제와의 결합을 통하여 직접적으로 제2 고체 지지체 상에 포획될 수 있다. 이 실시예에서 외재적 표적 태깅은 필요하지 않다. 한 실시예에서, 상기 제2 고체 지지체는 표적 분자와 결합하는 항체를 포함한다. 다른 실시예에서, 표적 분자가 IgG, IgM, IgA 또는 IgE인 경우, 상기 지지체는 표적 단백질과 결합하기 위한 단백질 A(protein A)를 포함할 수 있다. 압타머 친화 또는 압타머 공유결합 복합체에서 표적 분자와 결합하는 임의의 포획 시약은 포획 2 단계를 위해 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 자유 압타머의 제거는 외재적 표적 태그 및 제2 고체 지지체보다는 물리적 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 한 실시예에서, 표적 분자가 단백질 또는 펩티드인 경우, 이것은 압타머 공유결합 복합체를 침전시킴으로써 달성되며, 상층액에 남아있는 자유 압타머는 버린다[이 작업은 단지 공유결합 복합체만을 위한 것임을 유의한다]. 이러한 단백질 또는 펩티드 침전은 예를 들어, SDS 및 고농도 염, 주로 K+를 사용하여 달성될 수 있고, 상기 압타머 공유결합 복합체는 정량화를 위해 재생될 수 있다.
제2 고체 지지체를 세척함으로써 자유 압타머를 제거한 후, 상기 압타머 친화 복합체는 그 후 표적 분자가 일반적으로 프로브와 표적 포획 태그의 결합 상호작용을 통하여 고체 지지체에 여전히 결합하고 있는 동안 자유 압타머를 생성하기 위하여 복합체들을 파괴시키는 분리 단계에 들어간다. 압타머 친화 복합체로부터 압타머는 압타머 또는 표적의 구조를 파괴하는 임의의 방법에 의해 방출될 수 있다. 이것은 비공유결합적으로 결합된 압타머-표적 복합체를 분리시키는 고농도 염의 버퍼에서 압타머 친화 복합체와 결합된 고체 지지체의 세척을 통하여 달성될 수 있다. 용출된 자유 압타머들을 수집하고 검출하였다. 다른 실시예에서, 높거나 낮은 pH는 압타머 친화 복합체를 파괴시키는 데 사용된다. 다른 실시예에서, 높은 온도는 압타머 친화 복합체를 분리시키는 데 사용된다. 다른 실시예에서, 임의의 상기 방법들의 조합이 사용될 수 있다.
압타머 공유결합 복합체의 경우에서, 다음의 정량을 위한 압타머의 방출은 압타머 구조체에서의 절단가능한 링커를 사용하여 달성된다. 다른 실시예에서, 표적 태그에서의 절단가능한 링커는 압타머 공유결합 복합체의 방출을 야기할 것이다.
본원에 사용된 것으로서, "경쟁 분자(competitor molecule)" 및 "경쟁자(competitor)"는 예를 들어, 비표적 분자가 압타머에 비특이적으로 재결합을 형성하는 것을 방지하기 위하여 비표적 분자와 비특이적 복합체를 형성할 수 있는 임의의 분자를 말하는 것으로 상호교환적으로 사용된다. "경쟁 분자" 또는 "경쟁자"는 하나의 형태 또는 종류의 분자의 복제 세트이다. "경쟁 분자" 또는 "경쟁자"는 하나 이상의 이러한 분자 세트를 말한다. 경쟁 분자는 올리고뉴클레오티드, 다중 음이온(예를 들어, 헤파린, 단일가닥 청어 정자 DNA, 단일가닥 연어 정자 DNA 및 폴리덱스트란(예를 들어, 덱스트란 설페이트)), 비염기성 포스포디에스테르 폴리머(abasic phosphodiester polymers), dNTPs 및 피로포스페이트(pyrophosphate)를 포함한다. 경쟁자를 사용하는 동적 유발의 경우에 있어서, 상기 경쟁자는 또한 예를 들어, 압타머가 비표적 분자에 비특이적으로 재결합을 형성하는 것을 방지하기 위하여 자유 압타머와 비특이적 복합체를 형성할 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 이러한 경쟁 분자는 다중 양이온(예를 들어, 스페르민(spermine), 스페르미딘(spermidine), 폴리라이신(polylysine) 및 폴리아르기닌(polyarginine)) 및 아미노산(예를 들어, 아르기닌 및 라이신))일 수 있다. 경쟁자가 동적 유발로서 사용될 때, 샘플에 존재하는 총 단백질 또는 총 압타머의 예상되는 농도에 비례하여 꽤 높은 농도가 사용된다. 한 실시예에서, 약 10mM의 덱스트란 설페이트가 동적 유발에서 경쟁자로서 사용된다. 한 실시예에서, 상기 동적 유발은 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물에 경쟁자를 첨가하고, 약 30초, 약 1분, 약 2분, 약 3분, 약 4분, 약 5분, 약 10분, 약 30분 및 약 60분보다 길거나 같은 시간 동안 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 배양하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 동적 유발은 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물에 경쟁자를 첨가하고, 비특이적 복합체의 측정 레벨에 대한 압타머 친화 복합체의 측정 레빌의 비율이 증가되도록 하는 시간 동안 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 배양하는 것을 포함한다.
어떤 실시예에서, 상기 동적 유발은 중립적인 압타머 친화 복합체의 분리 속도를 현저하게 증가시키기 않는 결합 버퍼 또는 다른 임의의 용액을 이용하여 시료를 희석시킴으로써 수행된다. 상기 희석은 약 2X, 약 3X, 약 4X, 5X 또는 임의의 적절한 크기의 희석일 수 있다. 더 큰 희석은 희석 후 총 단백질 및 압타머의 농도를 감소시킴으로써 더욱 효과적인 동적 유발을 제공하므로 그것들의 재결합율을 제공한다. 만일 동적 유발을 도입하기 위하여 희석이 사용된다면, 그 다음으로 압타머 친화 복합체를 포함하는 시료 혼합물은 더 처리되기 전에 농축될 수 있다. 만일 적용하게 된다면, 이 농도는 시료로부터의 임의의 압타머의 광학적 분리 및/또는 태깅 시약과 반응할 수 있는 시료의 다른 성분의 광학적 제거에 대하여 본원에 기재된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 동적 유발로서 희석이 사용될 경우, 초기 시료 용량 및 복합체의 현저한 손실을 초래하지 않을 만큼의 최종(희석된) 용량으로부터 압타머 친화 복합체 제거의 바람직함의 관점에서, 희석의 양은 실행할 만큼 높은 것이 선택된다. 한 실시예에서, 상기 압타머 친화 복합체는 희석되고, 상기 혼합물은 ≥ 약 30초, ≥ 약 1분, ≥ 약 2분, ≥ 약 3분, ≥ 약 4분, ≥ 약 5분, ≥ 약 10분, ≥ 약 30분 및 ≥ 약 60분의 시간 동안 배양된다. 다른 실시예에서, 상기 압타머 친화 복합체는 희석되고, 상기 혼합물은 비특이적 복합체의 측정 레벨에 대한 압타머 친화 복합체의 측정 레벨의 비율이 증가되도록 하는 시간 동안 배양된다.
어떤 실시예에서, 상기 동적 유발은 샘플 희석의 효과와 경쟁자 도입의 효과가 동시에 달성되는 그러한 방법으로 수행된다. 예를 들면, 시료는 대량의 경쟁자로 희석될 수 있다. 이 두 동적 유발 단계를 조합하는 것은 한 단계를 사용하여 달성될 수 있는 것보다 더욱 효과적인 동적 유발을 제공할 수 있다. 한 실시예에서, 상기 희석은 약 2X, 약 3X, 약 4X, 약 5X 또는 임의의 적절한 크기의 희석일 수 있고, 상기 경쟁자는 약 10mM의 덱스트란 설페이트이다. 한 실시예에서, 상기 동적 유발은 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 희석하고, 상기 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물에 경쟁자를 첨가하고, 약 30초, 약 1분, 약 2분, 약 3분, 약 4분, 약 5분, 약 10분, 약 30분 및 약 60분보다 길거나 같은 시간 동안 상기 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 배양하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 동적 유발은 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 희석하고, 상기 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물에 경쟁자를 첨가하고, 비특이적 복합체의 측정 레벨에 대한 압타머 친화 복합체의 측정 레벨의 비율이 증가되도록 하는 시간 동안 상기 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 배양하는 것을 포함한다.
여러가지 실시예에서, 압타머(또는 공유결합) 복합체는 압타머(압타머 태그) 내로 포함되거나 표적에 부착된 태그를 사용하여 고체 지지체 상에 포획되거나 고정화된다. 예를 들면, 만일 압타머 상의 태그가 비오틴이라면, 표면 상에 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 엑스트라비딘 등과 같은 포획 성분을 가지는 비드가 압타머 친화(또는 공유결합) 복합체를 포획하는 데 사용될 수 있다. 상기 비드는 임의의 자유(비찰물화된) 표적을 제거하기 위하여 세척된다.
본원에 기재된 바와 같이, 압타머는 고체 지지체에 압타머(및 그것에 결합된 임의의 표적 분자)를 부착하거나 고정화시키기 위한 수단을 제공하는 성분을 말하는 "태그(tag)"를 더 포함할 수 있다. "태그"는 "포획 성분(capture element)"과 결합할 수 있는 하나의 형태 또는 종류의 성분의 복제 세트이다. "태그" 또는 "포획 성분"은 하나 이상의 이러한 성분의 세트를 말한다. 상기 태그는 임의의 적절한 방법에 의해 압타머에 부착되거나 포함될 수 있다. 일반적으로, 상기 태그는 압타머가 고체 지지체에 부착된 포획 성분 또는 수용체와 직접적 또는 간접적으로 결합할 수 있도록 한다. 상기 포획 성분은 전형적으로 태그와 그것의 상호작용에 매우 특이적이거나 그 다음의 처리 단계 또는 방법 동안 결합을 유지하도록 선택(또는 설계)된다. 태그는 고체 지지체 상의 공간적으로 정의된 위치에 압타머 친화 복합체(또는 공유결합 압타머 친화 복합체)를 위치시킬 수 있다. 따라서, 서로 다른 태그들은 서로 다른 압타머 공유결합 복합체를 고체 지지체 상의 서로 다른 공간적으로 정의된 곳에 위치시킬 수 있다. 태그는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 펩티드 핵산, 잠금 핵산(locked nucleic acid), 올리고당, 다당, 항체, 애피바디(affibody), 항체 모조체, 세포 수용체, 리간드, 지질, 이러한 구조들의 임의의 단편 또는 유도체, 앞서 기재한 것들의 임의의 조합 또는 특이성을 가지도록 설계되거나 특이성을 가지고 결합하도록 만들거나 특이성을 가지고 결합될 수 있는 포획 성분(또는 하기에 기재된 것과 같은 연결 분자)일 수 있다. 일반적으로, 태그는 그것이 그것 자체 또는 태그에 부착되거나 그것이 태그의 일부분인 압타머와 분자 내적으로 상호작용하지 않도록 구성된다. 만일 압타머를 확인하기 위하여 SELEX를 사용한다면, 상기 태그는 SELEX 전 또는 후에 압타머에 추가될 수 있다. 한 실시예에서, 상기 태그는 SELEX 후 압타머의 5' 말단 상에 포함된다. 다른 실시예에서, 상기 태그는 SELEX 후 압타머의 3' 말단 상에 포함된다. 여전히 다른 실시예에서, 태그는 SELEX 후 변형 공정에서 압타머의 3' 및 5' 말단 모두에 포함될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 태그는 압타머의 내부 부분(internal segment)일 수 있다.
한 실시예에서, 상기 태그는 비오틴기이고, 상기 포획 성분은 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 엑스트라비딘과 같은 비오틴 결합 단백질이다. 이 조합은 다양한 실시예에서 전형적으로 사용될 수 있고, 비오틴은 합성하는 동안에 압타머 내로 쉽게 통합되며, 스트렙타비딘 비드는 쉽게 입수할 수 있다.
한 실시예에서, 상기 태그는 폴리히스티딘(polyhistidine)이고, 상기 포획 성분은 니켈(nickel), 코발트(cobalt), 철(iron)과 같은 금속 이온 또는 니트릴로트리아세트산(nitrilotriacetic acid; NTA)과 킬레이트될 때 폴리-히스티딘과 배위 화합물을 형성할 수 있는 임의의 다른 금속 이온과 킬레이트화된 니트릴로트리아세트산이다.
한 실시예에서, 상기 태그는 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 포획 성분과 직접적으로 혼성화되도록 설계된 폴리뉴클레오티드이다. 이 경우에서, 태그는 때때로 "서열 태그(sequence tag)"로서 말해지고, 상기 포획 성분은 일반적으로 "프로브(probe)"로서 말해진다. 이 실시예에서, 상기 태그는 일반적으로 구성되며, 상기 혼성화 반응은 태그가 상기 프로브의 완벽한 상보체(complement) 이외의 프로브와 혼성화되지 않도록 하기 위한 조건 하에서 수행된다. 이것은 각각의 태그/프로브 조합이 고유의 서열을 가질 수 있도록 검정 형식의 설계를 가능하게 한다.
어떤 실시예에서, 상기 태그는 압타머 자체의 일부분인 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 만약 압타머를 확인하기 위하여 SELEX를 사용한다면, 상기 압타머는 일반적으로 압타머에 의존하는, 즉 가변 영역(variable region)을 변형하는 뉴클레오티드 서열에 의해 3'-고정 말단으로부터 분리된 5'-고정 말단을 포함한다. 한 실시예에서, 상기 태그는 예를 들어, 고정 말단에 내재하는 뉴클레오티드를 포함하는 전체 고정 말단 또는 고정 말단의 임의의 부분과 같은, 압타머의 고정 말단에 포함된 임의의 적절한 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 태그는 예를 들어, 전체 가변 영역 또는 가변 영역의 임의의 부분과 같은, 압타머의 가변 영역 내에 포함된 임의의 적절한 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 태그는 고정 말단 중의 하나 및 가변 영역 모두와 일치하는 임의의 적절한 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 즉 태그는 가변 영역의 임의의 부분(모두를 포함) 및 고정 말단의 임의의 부분(모두를 포함)을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 태그는 프로브와 직접적으로 결합할 수 있고 프로브에 공유적으로 결합되므로, 압타머는 고체 지지체의 표면에 공유적으로 결합된다. 이 실시예에서, 태그와 프로브는 공유 결합을 만드는 화학 반응을 위하여 서로 충분히 근접하는 프로브와 태그의 결합 상에 적절한 반응기를 포함할 수 있다. 상기 반응은 자발적으로 일어날 수 있거나, 예를 들어 광-활성화 또는 화학적 활성화와 같은 활성화를 필요로 한다. 한 실시예에서, 상기 태그는 디엔(diene) 부분을 포함하며, 상기 프로브는 친디엔체(dienophile)를 포함하고, 디엔과 친디엔체의 자발적 딜스-알더(Diels-Alder) 결합 반응에 의해 공유 결합이 형성된다. 임의의 적절한 상보적 화학반응, 예를 들어, N-만니치 반응(N-Mannich reaction), 이황화물 형성(disulfide formation), 쿠르티우스 반응(Curtius reaction), 알돌 축합(Aldol condensation), 시프 염기 형성(Schiff base formation) 및 마이클 부가반응(Michael addition)과 같은 것들이 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 태그는 예를 들어, 하기에 더 기재된 것과 같은 링커 분자를 통하여 프로브와 간접적으로 연결된다. 이 실시예에서, 태그는 링커 분자의 특정 영역 또는 성분에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 태그는 일반적으로 구성되고, 상기 혼성화 반응은 링커 분자에 포함된 폴리뉴클레오티드 서열 이외의 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화되지 않도록 수행된다.
만일 태그가 폴리뉴클레오티드를 포함한다면, 상기 폴리뉴클레오티드는 임의의 적절한 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 한 실시예에서, 태그는 적어도 약 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시예에서, 태그는 약 10개 내지 약 45개의 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 태그는 적어도 약 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 서로 다른 태그들은 동일한 수의 뉴클레오티드 또는 서로 다른 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
어떤 실시예에서, 상기 태그 성분은 고체 지지체 상의 포획 성분 또는 하기에 기재된 것과 같은(프로브 결합 성분) "프로브"와의 특이적 상호작용에 대한 기능성 및 태그의 프로브 결합 성분에 부착된 분자를 분리하는 것에 대한 기능성을 포함하므로 두가지 기능을 가진다. 태그의 프로브 결합 성분을 분리하기 위한 수단은 화학적 수단, 광화학적 수단 또는 사용될 특정 태그에 따라 다른 수단을 포함한다.
어떤 실시예에서, 상기 태그는 압타머에 부착된다. 다른 실시예에서, 상기 태그는 표적 분자에 부착된다. 상기 태그는 압타머 결합 단계 전에 표적 분자에 부착될 수 있거나, 결합 평형(또는 가교결합)이 달성된 후에 표적 분자 또는 압타머 친화(또는 광) 복합체에 부착될 수 있다.
본원에서 사용된 것으로서, "포획 성분(capture element)", "프로브(probe)" 또는 "수용체(receptor)"는 태그와 직접적 또는 간접적으로 결합하도록 형성된 분자를 말한다. "포획 성분", "프로브" 또는 "수용체"는 태그와 직접적 또는 간접적으로 결합시킴으로써 고체 지지체에 부착된 태그에 상기 부분을 고정시킬 수 있는 한 형태의 분자 또는 한 형태의 복합-분자(multi-molecular) 구조의 복제 세트이다. "포획 성분", "프로브" 또는 "수용체"는 하나 이상의 이러한 분자 세트를 말한다. 포획 성분, 프로브 또는 수용체는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 올리고당, 다당, 항체, 애피바디, 항체 모조체, 세포 수용체, 리간드, 지질, 비오틴, 폴리히스티딘 또는 이러한 구조의 임의의 단편 또는 유도체, 앞서 기재한 것들의 임의의 조합 또는 특이성을 가지도록 설계되거나 특이성을 가지고 결합하도록 형성되거나 그렇지 않으면 특이성을 가지고 결합될 수 있는 태그(또는 연결 분자)를 가진 임의의 다른 구조일 수 있다. 포획 성분, 프로브 또는 수용체는 임의의 적절한 방법에 의해 공유적 또는 비공유적으로 고체 지지체에 부착될 수 있다.
한편으로는, 상기 용어 "포획 성분", "프로브" 또는 "수용체"는 상호교환적으로 사용되며, 프로브는 일반적으로 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 한 실시예에서, 상기 프로브는 폴리뉴클레오티드 태그 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이 실시예에서, 상기 프로브 서열은 일반적으로 형성되며, 혼성화 반응은 프로브가 상보적 서열을 포함하는 프로브에 대한 태그 이외의 뉴클레오티드 서열과 혼성화되지 않도록 하기 위한 조건 하에서 수행된다(즉, 프로브는 일반적으로 형성되며, 혼성화 반응은 프로브가 서로 다른 태그 또는 압타머와 혼성화되지 않도록 하기 위한 조건 하에서 수행된다).
다른 실시예에서, 프로브는 예를 들어, 링커 분자를 통하여 태그와 간접적으로 결합한다. 이 실시예에서, 프로브는 링커 분자의 특정 영역 또는 성분에 대하여 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 프로브는 일반적으로 형성되며, 혼성화 반응은 프로브가 링커 분자 내에 포함된 폴리뉴클레오티드 서열 이외의 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화되지 않도록 하기 위한 조건 하에서 수행된다.
만일 프로브가 폴리뉴클레오티드를 포함한다면, 상기 폴리뉴클레오티드는 임의의 적절한 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 한 실시예에서, 프로브는 적어도 약 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시예에서, 프로브는 약 10개 내지 약 45개의 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 프로브는 적어도 약 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 서로 다른 프로브는 동일한 수의 뉴클레오티드 또는 서로 다른 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
어떤 실시예에서, 상기 포획 프로브는 폴리뉴클레오티드 태그와의 특이적 상호작용에 대한 기능성 및 프로브와 압타머가 동시에 방출되도록 하기 위하여 고체 지지체로부터 프로브를 분리하기 위한 기능성을 포함하므로 두가지 기능을 가진다. 고체 지지체로부터 프로브를 분리하기 위한 수단은 화학적 수단, 광화학적 수단 또는 사용될 특정 태그에 따라 다른 수단을 포함한다.
특정 태그와 포획 성분 한 쌍 간의 상호작용의 상호간 특성 때문에, 한 실시예에서의 태그는 다른 실시예에서 포획 성분으로서 사용될 수 있고, 한 실시예에서의 포획 성분은 다른 실시예에서 태그로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 비오틴 태그를 이용한 압타머는 한 실시예에서 고체 지지체에 부착된 스트렙타비딘으로 포획될 수 있는 반면에, 스트렙타비딘 태그를 이용한 압타머는 다른 실시예에서 고체 지지체에 부착된 비오틴으로 포획될 수 있다.
어떤 실시예에서, 압타머 친화(또는 공유결합) 복합체의 분리를 가능하게 하고 자유 압타머를 제거하기 위하여, 압타머 친화(또는 공유결합) 복합체를 고체 지지체에 고정시키는 것이 바람직하다. 한 실시예에서, 상기 태그는 표적 분자에 강하게 반응하고 압타머에는 약하게 반응하는(또는 이상적으로는 반응하지 않는) 시약을 사용하여 친화(또는 공유결합) 복합체의 표적 분자에 첨가된다. 이 실시예에서, 상기 태그는 압타머 친화 복합체의 표적 태깅이 예를 들어, 친화적 상호작용에 적합하며 표적 또는 압타머의 구조를 변화시키지 않는 pH와 이온 강도 및 압타머와의 상호작용이 영향을 받도록 하기 위하여 각각의 표적 분자 상의 다수의 태그를 도입하지 않을 정도의 태깅에서 친화 복합체의 분리를 약간 사용하거나 거의 사용하지 않고 달성된다. 압타머 공유결합 복합체의 표적 태깅은 이러한 제한을 공유하지 않으며, 효과적인 태깅에 적합한 임의의 환경 하에서 달성될 수 있다.
어떤 실시예에서, 태깅 시약은 시료 내에 존재하는 대부분(비록 모두는 아닐지라도)의 단백질을 태깅하지만, 태깅하지 않는 경향이 있거나, 단지 최소한으로만 핵산 또는 고체 지지체와 같은 검정의 다른 성분을 태깅한다는 것이 중요할 수 있다. 단백질 상에서는 발견되었지만 핵산 또는 기질 표면상에서는 발견되지 않은 임의의 반응성 화학기가 공유성 부착(covalent attachment) 부위로서 제공될 수 있다. 대표적인 반응성 화학기는 일차 아민(primary amine; 예를 들어, 라이신 잔기), 티올(예를 들어, 이황화 결합의 환원에 의해 생성될 수 있는 시스테인), 알콜(예를 들어, 세린, 쓰레오닌, 티로신 및 당단백질(이러한 당 상에서의 시스-디올(cis-diols)의 산화 생성물을 포함) 및 카르복시산염(예를 들어, 글루탐산 및 아스파르트산)을 포함한다. 한 실시예에서, 상기 태깅 시약은 단백질 및 펩티드 상에서 라이신 잔기와 우선적으로 반응하는 N-하이드록시숙신이미드-활성화된 태그(N-hydroxysuccinimide-activated tag)를 포함한다.
서로 다른 압타머 친화(또는 공유결합) 복합체를 표지하기 위한 광학적 조건은 서로 다를 수 있고, 일반적으로 방법의 민감성을 최적화하기 위하여 경험적으로 결정될 수 있다. 한 실시예에서, 표지 시약의 농도는 일반적으로 적어도 약 1%의 표적 분자를 검출하는데 충분하다. 다른 실시예에서, 표지 시약의 농도는 일반적으로 적어도 약 10%의 표적 분자를 검출하는데 충분하다. 또 다른 실시예에서, 표지 시약의 농도는 적어도 약 90%의 표적 분자를 검출하는데 충분하다.
한 실시예에서, 상기 표적은 단백질 또는 펩티드이고, 상기 태그는 예를 들어, NHS-PEO4-비오틴과 같은 단백질 비오틴화를 위한 표준 시약을 사용하여 표적에 부착된 비오틴이다. 다른 적절한 시약들은 설포-NHS-LC-비오틴, PEP-비오틴(PEP-biotin), TFP-PEO3-비오틴 또는 단백질에 태그를 부착하는 데 사용될 수 있는 임의의 다른 적절한 시약을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 링커(linker)는 두개의 작용기 또는 분자 구조를 연결하는 데 사용하는 분자 구조이다. 본원에 사용된 것으로서, "스페이싱 링커(spacing linker)" 또는 더욱 간단하게는 "스페이서(spacer)"는 압타머 내의 두개의 서로 다른 작용기 사이에 간격 또는 거리를 제공하는 양성 원자(benign atom) 기를 말한다. 본원에 사용된 것으로서, "방출가능한(releasable)" 또는 "절단가능한(cleavable)" 성분, 부분 또는 링커는 두개의 분리된 성분을 만들기 위하여 깨질 수 있는 분자 구조를 말한다. 방출가능한(또는 절단가능한) 성분은 화학결합이 깨질 수 있는 단일 분자(본원에서 "직렬 절단가능한 링커(inline cleavable linker)라고 칭함)를 포함할 수 있고, 또는 그것은 비공유적 상호작용이 깨지거나 파괴될 수 있는 두 개 또는 그 이상의 분자(본원에서 "혼성화 링커(hybridization linker)"로 칭함)를 포함할 수 있다.
어떤 실시예에서, 개개의 기능성의 방해를 방지하기 위하여 다른것들로부터 어떤 작용기를 공간적으로 분리할 필요가 있다. 예를 들면, 광절단가능한기(photocleavable group)에 가장 가까운 빛의 특정 파장을 흡수하는 표지의 존재는 광절단 능력을 방해할 수 있다. 따라서, 예를 들어 광절단의 전 활성(full activity)을 회복시키기에 충분한 공간적 분리를 제공하는 비간섭 부위(non-interfering moiety)를 가지는 이러한 기를 분리하는 것이 바람직하다. 어떤 실시예에서, "스페이싱 링커"는 표지와 광절단 기능성을 모두 가지는 압타머 내로 도입된다.
한 실시예에서, 스페이싱 링커는 합성하는 동안에 압타머 내로 도입되며, 3, 6, 9. 12 및 18개의 탄소 원자 길이의 지방족 탄소 사슬(aliphatic carbon chain), 1, 3 및 9개의 에틸렌 글리콜 유닛 길이의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 테트라하이드로퓨란 부분(d스페이서(dSpacer)라고 칭함(Glenn Research)) 또는 앞서 말한 것의 임의의 조합 또는 임의의 다른 구조 또는 포스포디에스테르 골격에 따라 길이를 첨가하기 위하여 설계되거나 형성될 수 있는 화학적 성분을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다수의 포스포아미다이트 스페이서(phosphoamidite spacers)로 구성될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 스페이싱 링커는 폴리 dT, dA, dG, 또는 dC 또는 폴리 U, A, G 또는 C와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 앞서 말한 것의 임의의 조합을 포함한다. 다른 실시예에서, 스페이서는 하나 또는 그 이상의 어베이식 리보오스 또는 데옥시리보오스 부분을 포함한다. 이러한 서열들은 그것들이 압타머의 구조 또는 기능을 방해하지 않도록 하기 위하여 설계된다.
본원에서 사용된 것으로서, "직렬 절단가능한 링커(Inline cleavable linker)"는 방출가능한 또는 절단가능한 성분을 포함하는 원소의 기를 말한다. 어떤 실시예에서, 직렬 절단가능한 링커는 압타머를 태그에 연결시키는 데 사용되며, 그것에 의하여 방출가능한 태그를 형성한다. 예를 들어, 직렬 절단가능한 링커는 (예를 들어, 친화 검정법 및 가교결합 검정법에서) 압타머와 비오틴간의 방출가능한 연결 또는 (광가교결합 검정법에서) 압타머와 광가교결합 기 간의 방출가능한 연결을 만들기 위하여 임의의 기재된 검정법에서 사용될 수 있다.
한 실시예에서, 상기 직렬 절단가능한 링커는 그것이 빛의 적절한 파장에서 방출가능한 성분이 방사선 조사에 의해 절단될 수 있는 결합을 포함한다는 점에서 광-절단가능할(photo-cleavable) 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 직렬 절단가능한 링커는 그것이 적절한 화학 또는 효소 시약을 사용하여 그것을 처리함으로써 절단될 수 있는 결합을 포함한다는 점에서 화학적으로 절단될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 방출가능한 성분은 결합을 파괴하기 위한 환원제(reducing agent)로 그것을 처리함으로써 절단될 수 있는 이황화 결합을 포함한다.
본원에서 사용된 것으로서, "혼성화 링커(Hybridization linker)"는 화학적 또는 물리적 방법을 통하여 비공유적 상호작용이 깨지거나 파괴될 수 있는 두 개 또는 그 이상의 분자를 포함하는 링커를 말한다. 어떤 실시예에서, 혼성화 링커는 압타머를 태그에 연결하기 위해 사용되며, 그것에 의해 방출가능한 태그를 형성한다. 예를 들어, 혼성화 링커는 (예를 들어, 친화 검정법 및 광가교결합 검정법에서) 압타머와 비오틴 간의 방출가능한 연결 또는 (예를 들어, 광가교결합 검정법에서) 압타머와 광가교결합 기 간의 방출가능한 연결을 만들기 위하여 임의의 기재된 검정법에서 사용될 수 있다.
한 실시예에서, 혼성화 링커는 비공유 결합을 형성하기 위하여 혼성화되는 두개의 핵산을 포함한다. 한 실시예에서, 혼성화 링크를 형성하는 핵산 중의 하나는 압타머 그 자체의 부위일 수 있고, 다른 핵산은 그것의 부위에 상보적인 핵산일 수 있다. 방출은 (여전히 검정과의 친화성을 유지하고 있는) 핵산 듀플렉스(duplex)를 파괴시키기 위한 임의의 적절한 메커니즘에 의해 달성될 수 있다. 한 실시예에서, 20mM의 NaOH는 이중 포획 광가교결합 검정법에서 혼성화 링커를 파괴시키기 위하여 사용된다. 혼성화 링커 분자는 임의의 적절한 구조를 가질 수 있고, 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 펩티드 핵산, 잠금 핵산(locked nucleic acid), 올리고당, 다당류, 항체, 애피바디, 항체 모조체 또는 단편, 세포 수용체, 리간드, 지질, 이러한 구조들의 임의의 단편 또는 유도체, 앞서 기재한 것들의 임의의 조합 또는 방출가능한 구조를 형성하도록 설계되거나 형성될 수 있는 임의의 다른 구조 또는 화학 성분을 포함하는, 임의의 적절한 성분을 포함할 수 있다.
한 실시예에서, 상기 방출가능한 태그는 적절한 수의 뉴클레오티드로 이루어지는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드로 이루어진다. 한 실시예에서, 링커 분자의 폴리뉴클레오티드 성분은 적어도 약 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시예에서, 링커 분자의 폴리뉴클레오티드 성분은 약 10개 내지 약 45개의 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 링커 분자의 폴리뉴클레오티드 성분은 적어도 약 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법에서 사용된 링커 분자들은 동일한 수의 뉴클레오티드 또는 서로 다른 수의 뉴클레오티드를 가지는 폴리뉴클레오티드 성분을 포함할 수 있다.
"고체 지지체(solid support)"는 분자가 공유결합 또는 비공유결합을 통하여직접 또는 간접적으로 부착될 수 있는 표면을 가지는 임의의 기질을 말한다. 상기 고체 지지체는 표면에 부착되는 포획 성분 또는 프로브에 대하여 물리학적 지지체를 제공할 수 있는 임의의 기질 물질(substrate material)을 포함할 수 있다. 상기 물질은 일반적으로 표면에 대한 포획 성분 또는 프로브의 부착에 관련된 조건 및 검정법의 수행 동안에 겪게되는 임의의 후속 처리, 조작 또는 공정을 견딜 수 있다. 상기 물질은 자연적으로 생성된 것, 합성물 또는 자연적으로 생성된 물질의 변형된 것일 수 있다. 적절한 고체 지지체 물질은 실리콘(silicon), 실리콘 웨이퍼 칩(silicon wafer chip), 그래파이트(graphite), 거울 표면(mirrored sruface), 라미네이트(laminates), 멤브레인(membranes), 세라믹(ceramics), 플라스틱(plastics)(예를 들어, 폴리(비닐클로라이드), 시클로-올레핀 공중합체, 아가로스 겔 또는 비즈, 폴리아크릴아마이드, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌테레프탈레이트), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE 또는 테플론®), 나일론, 폴리(비닐 부티레이트)과 같은 폴리머를 포함), 게르마늄(germanium), 갈륨 비소(gallium arsenide), 금, 은, 랑뮤어 블로젯 필름(langmuir blodgett films), 투수성 칩(flow through chip) 등을 포함할 수 있으며, 그것들 자체 또는 다른 물질과 함께 사용된다. 실리카를 포함하고, 예를 들어, 생체 유리(bioglass)로서 이용할 수 있는 유리를 더 포함하는 유리와 같은 부가적인 단단한 재료가 고려될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 물질은 예를 들어, 조절 공극 유리 비드(controlled pore glass beads), 가교결합된 비디드 세파로즈®(crosslinked beaded Sepharose®) 또는 아가로스 수지(agarose resins) 또는 가교결합된 비스-아크릴아미드(bis-acrylamide)와 아자락톤(azalactone)의 공중합체와 같은 다공성 물질(porous materials)을 포함한다. 다른 비즈는 폴리머 비즈(polymer beads), 고체 핵 비즈(solid core beads), 상자성 비즈(paramagnetic beads) 또는 마이크로비즈(microbeads)를 포함한다. 예를 들어, 표면상에 결합된 임의의 아미노, 카복실, 티올 또는 하이드록실 작용기와 같은 하나 또는 그 이상의 작용기를 가질 수 있는 당업계에 잘 알려져 있는 임의의 다른 물질 또한 고려된다.
고체 지지체용으로 사용된 물질은 단순한 것에서부터 복잡한 것에 이르기까지 임의의 다양한 구성을 취할 수 있다. 상기 고체 지지체는 긴 조각(strip), 판(plate), 원반(disk), 봉(rod), 입자(particle), 비드(bead), 튜브(tube), (미세역가(microtiter)) 웰(well) 등을 포함하는 다수의 형태 중 하나일 수 있다. 상기 고체 지지체는 다공성(porous) 또는 비다공성(non-porous), 자성(magnetic), 상자성(paramagnetic) 또는 비자성(non-magnetic), 다분산성(polydisperse), 친수성(hydrophilic) 또는 소수성(hydrophobic)일 수 있다. 상기 고체 지지체는 또한 겔 또는 꽉 차있거나(컬럼 매트릭스에서와 같은) 꽉 차있지 않은 입자의 슬러리의 형태일 수 있다.
한 실시예에서, 부착된 포획 성분과 고체 지지체는 시료 혼합물로부터 태그된 압타머 친화 복합체 또는 압타머 공유결합 복합체를 포획하는 데 사용된다. 한 특정 실시예에서, 태그가 비오틴 부분일 때, 고체 지지체는 스트렙타비딘으로 코팅된 비드 또는 다이나비즈 M-280 스트렙타비딘(Dynabeads M-280 streptavidin), 다이나비즈 마이원 스트렙타비딘(Dynabeads MyOne streptavidin), 다이나비즈 M-270 스트렙타비딘(Dynabeads M-270 streptavidin; Invitrogen), 스트렙타비딘 아가로오스 레진(Streptavidin Agarose Resin; Pierce), 스트렙타비딘 울트라링크 레진(Streptavidin Ultralink Resin), 마그나빈드 스트렙타비딘 비드(MagnaBind Streptavidin Beads; Thermo Fisher Scientific), 바이오매그 스트렙타비딘(BioMag Streptavidin), 프로매그 스트렙타비딘(ProMag Streptavidin), 실리카 스트렙타비딘(Silica Streptavidin; Bangs Laboratories), 스트렙타비딘 세파로오스 하이퍼포먼스(Streptavidin Sepharose High Performance; GE Healthcare), 스트렙타비딘 폴리스티렌 마이크로스피어(Streptavidin Polystyrene Microspheres; Microspheres-Nanospheres), 스트렙타비딘 코팅된 폴리스티렌 입자(Streptavidin Coated Polystyrene Particles; Spherotech) 또는 포획 비오틴-태그된 분자에 대하여 당업자에 의해 일반적으로 사용되는 임의의 다른 스트렙타비딘 코팅된 비드 또는 레진일 수 있다.
상기에 기재된 것과 같이, 본 발명의 하나의 목적은 단백질 시그널을 압타머 시그널로 전환하는 것이다. 그 결과, 수집되고/검출된 압타머의 양은 시료에서의 표적 분자의 양에 대하여 결합된 표적 분자의 양을 나타내며, 그 양에 직접적으로 비례할 수 있다. 다수의 검출 도식이 포획 2 분할 후에 제2 고체 지지체로부터 압타머 친화 복합체 또는 압타머 공유결합 복합체를 용출하지 않고 사용될 수 있다. 검출 방법의 하기의 실시예 외에, 다른 검출 방법들도 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다.
많은 검출 방법들이 검출 전 압타머 내로 통합될 외재적 표지를 필요로 한다. 이 실시예에서, 예를 들어 형광(fluorescent) 또는 화학발광(chemiluminescent) 염료와 같은 표지들은 핵산 합성을 위한 표준 기술을 사용하여 합성하는 동안 또는 합성한 후에 압타머 내로 통합될 수 있다. 방사성 표지(radioactive labels)는 적절한 시약을 사용하는 표준 효소 반응을 이용하여 합성하는 동안 또는 합성한 후에 통합될 수 있다. 표지는 또한 포획 2 분할 및 적절한 효소적 기술을 사용하는 것에 의한 용리 후에 일어난다. 예를 들어, 상기에 언급된 표지와 함께 프라이머를 사용하는 PCR은 표지를 용리된 압타머의 증폭 산물 내로 통합시킬 것이다. 정량을 위한 겔 기술을 사용할 때, 서로 다른 크기의 질량 표지(mass labels)도 PCR을 사용하여 통합될 수 있다. 이 질량 표지들은 또한 부가적인 다중화 능력을 위하여 서로 다른 형광 또는 화학발광 염료를 포함한다. 표지들은 합성하는 동안 또는 합성한 후에 압타머 내로 통합된 특정 태그를 사용함으로써 압타머에 간접적으로 첨가될 수 있고, 그 후 태그와 결합하고 표지를 운반하는 프로브를 첨가한다. 상기 표지들은 예를 들어, 비색형 판독(colorimetric readouts)을 위한 표준 검정법에서 사용되는 효소 뿐만 아니라 상기에 기재된 것들을 포함한다. 이 효소들은 효소 기질과 함께 작용하며, 예를 들어 호스래디쉬 퍼록시다아제(horseradish peroxidase, HRP) 및 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP)와 같은 효소를 포함한다. 표지는 또한 전기화학적 검출을 위한 전기화학적 작용기인 물질 또는 화합물을 포함할 수 있다.
예를 들어, 압타머는 시료와 접촉하기 전 32P와 같은 방사성 동위원소로 상기에 기재된 것과 같이 표지될 수 있다. 4개의 기본 검정법 중 임의의 하나와 상기에 기재된 것과 같은 그것들의 변형을 사용하는 압타머 검출은 검정법의 마지막에서 제2 고체 지지체 상의 방사성을 정량함으로써 간단히 달성될 수 있다. 방사성의 수는 원 시료에서의 표적의 양에 직접적으로 비례할 것이다. 유사하게는, 시료에 접촉하기 전 상기에 기재된 것과 같은 형광 염료로 압타머를 표지하는 것은 제2 고체 지지체 상에서 직접적으로 간단히 형광 판독을 할 수 있게 한다. 화학발광 표지 또는 양자점(quantum dot)이 압타머 용리를 필요로 하지 않는 제2 고체 지지체로부터의 직접적인 판독을 위해 유사하게 사용될 수 있다.
제2 고체 지지체로부터 압타머를 용리시키거나 광압타머 공유결합 복합체를 방출시킴으로써, 부가적인 검출 도식이 상기에 기재된 것들에 더하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 방출된 압타머, 광압타머 또는 광압타머 공유결합 복합체들은 PAGE 겔 상에 흘릴 수 있고, SYBR 골드와 같은 핵산 염색으로 검출하고 광학적으로 정량할 수 있다. 대안적으로, 방출된 압타머, 광압타머 또는 광압타머 공유결합 복합체는 상기에 기재된 것과 같이 압타머 내에 통합된 형광 표지를 사용하는 모세관 겔 전기영동(capillary gel electrophoresis; CGE)을 사용하여 검출되고 정량될 수 있다. 다른 검출 도식은 예를 들어, SYBR 그린을 사용하여 용리된 압타머를 검출하고 정량하기 위하여 정량적 PCR을 사용한다. 대안적으로, 인베이더® DNA 검정법(Invader® DNA assay)이 용리된 압타머를 검출하고 정량하기 위하여 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)의 양 또는 농도는 복제 공정(replicative process) 동안에 "분자 비콘(molecular beacon)"을 사용하여 검출된다(예를 들어, Tyagi et al., Nat. Biotech. 16:49 53, 1998: U.S. Pat. No. 5,925,517을 참조하라). 분자 비콘은 헤어핀 루프 안으로 접힌 특정 핵산 프로브이며, 헤어핀이 형성될 때 형광단(fluorophore)에 의해 시그널이 거의 생성되지 않거나 생성되지 않도록, 헤어핀 구조의 하나의 말단에는 형광단을 함유하고 다른 하나의 말단에는 퀀쳐(quencher)를 함유한다. 상기 루프 서열은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적이며, 압타머 서열과 혼성화하자마자 헤어핀이 펼쳐지기 때문에 형광 시그널을 발생시킨다.
2개 또는 3개, 또는 5개 또는 10개 이상의 각각의 압타머를 검출하고 정량하기 위하여, 여전히 제2 고체 지지체에 결합되어 있는 적은 수의 압타머의 다중 검출을 위한 서로 다른 여기/방출 스펙트럼을 가지는 형광 염료가 사용될 수 있다. 유사하게는, 서로 다른 크기의 양자점이 다중 판독을 위해 사용될 수 있다. 상기 양자점은 제2 고체 지지체로부터 자유 압타머를 분할시킨 후 도입될 수 있다. 고유의 양자점에 부착된 압타머 특이적 혼성화 서열을 사용함으로써, 2, 3, 5 및 10개 이상의 압타머들에 대한 다중화된 판독을 수행할 수 있다. 32P, 125I, 3H, 13C 및 35S와 같은 개별적으로 검출될 수 있는 서로 다른 방사성 동위원소로 서로 다른 압타머를 표지하는 것 또한 제한된 다중 판독을 위해 사용될 수 있다.
포획 2로부터 방출된 압타머의 다중 검출을 위하여, 상기에 기재된 것과 같이 각각 압타머 내로 통합된 제2 고체 지지체, 단일 형광 염료가 압타머 레벨의 정량에 따라 압타머의 서열을 확인할 수 있게 하는 정량 방법으로 사용될 수 있다. 방법은 DNA 칩 혼성화, 마이크로-비드 혼성화 및 CGE 분석을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
한 실시예에서, 표준 DNA 혼성화 어레이 또는 칩은 애질런트 어레이(Agilent arrays), 일루미나 비드칩 어레이(Illumina BeadChip Arrays) 또는 님블젠 어레이(NimbleGen arrays)와 같은 슬라이드 또는 칩 상에 고정화된 단일 또는 시리즈의 고유한 프로브에 각각의 압타머 또는 광압타머를 혼성화시키는 데 사용된다. 각각의 고유한 프로브는 압타머 상의 서열에 대하여 상보적이다. 상기 상보적 서열은 압타머에 통합된 고유의 혼성화 태그일 수 있거나, 압타머 서열의 일부일 수 있거나, 전체 압타머 서열일 수 있다. 포획 2 고체 지지체로부터 방출된 압타머들은 적절한 혼성화 버퍼에 첨가되며, 표준 혼성화 방법을 사용하여 처리된다. 예를 들면, 상기 압타머 용액은 엄격한 혼성화를 확실하게 하기 위하여 60℃에서 DNA 혼성화 어레이를 사용하여 12시간 동안 배양된다. 상기 어레이를 세척한 후, 어레이의 각각의 부분 상의 압타머 혼성화 세기의 이미지를 생성하는 형광 슬라이드 스캐너로 스캔하였다. 이미지 분할 및 정량은 어레이 비젼(Array Vision)과 같은 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 달성된다. 한 실시예에서, 다중 압타머 검정은 25개 이상의 압타머, 50개 이상의 압타머, 100개 이상의 압타머, 200개 이상의 압타머, 500개 이상의 압타머, 1000개 이상의 압타머 및 10,000개 이상의 압타머를 사용하여 검출될 수 있다.
한 실시예에서, 상기에 기재된 것과 같은 압타머에 상보적인 고유의 DNA 프로브를 가지는 위치지정 가능한(addressable) 마이크로-비드가 혼성화를 위해 사용된다. 상기 마이크로-비드는 루미넥스 비드 기술과 같은 고유의 형광 염료를 사용하거나, 일루미나 베라코드(VeraCode) 기술에서와 같은 바 코드(bar code)를 사용하거나, 레이저 트랜스폰더(laser-powered transponders)를 사용하여 위치 지정할 수 있다. 한 실시예에서, 포획 2 고체 지지체로부터 방출된 압타머는 적절한 혼성화 버퍼에 첨가되며, 표준 마이크로-비드 혼성화 방법을 사용하여 처리된다. 예를 들어, 상기 압타머 용액은 엄격한 혼성화를 위하여 약 60℃에서 마이크로-비드 세트를 사용하여 2시간 동안 배양된다. 그 후, 상기 용액을 각각의 비드 타입을 세는 루미넥스 기구상에 처리하고, 압타머 형광 시그널을 정량하였다. 다른 실시예에서, 베라코드 비드를 압타머 용액과 접촉시키고, 약 60℃에서 2시간 동안 혼성화시킨 후, 눈금 표면 위에 두고 확인과 형광 정량을 위한 슬라이드 스캐너를 사용하여 스캔하였다. 다른 실시예에서, 트랜스폰더 마이크로-비드는 약 60℃에서 압타머 샘플과 배양된 후, 트랜스폰더 마이크로-비드용의 적절한 기구를 사용하여 정량된다. 한 실시예에서, 다중 압타머 검정법은 25개 이상의 압타머, 50개 이상의 압타머, 100개 이상의 압타머, 200개 이상의 압타머, 500개 이상의 압타머를 사용하여 마이크로-비드에 혼성화시킴으로써 검출될 수 있다.
용리된 압타머를 포함하는 샘플은 상기에 기재된 것과 같이 형광 표지와 함께 고유의 질량 태그를 통합시키기 위하여 처리될 수 있다. 상기 질량 표지된 압타머는 그 후 CGE 기기, 본질적으로는 DNA 시퀀서(DNA sequencer) 내로 주입되고, 상기 압타머는 그것의 고유 질량에 의해 확인되며, 표지 반응 동안에 통합된 염료로부터의 형광을 사용하여 정량된다. 이 기술의 대표적인 예 중 하나는 알테아 테크놀로지(Althea Technologies)에 의해 개발되었다.
상기에 기재된 방법의 대부분에서, 압타머 용액은 정량 전에 증폭되고 선택적으로 태그될 수 있다. 표준 PCR 증폭은 포획 2 고체 지지체로부터 용리된 압타머 용액과 함께 사용될 수 있다. 이러한 증폭은 DNA 어레이 혼성화, 마이크로-비드 혼성화 및 CGE 판독 전에 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)는 Q-PCR을 사용하여 검출되고/되거나 정량화된다. 본원에 사용된 것으로서, "Q-PCR"은 검정 결과가 양으로 계산되는(quantitative), 즉 검정법이 시료 내에 존재하는 압타머의 양 또는 농도를 정량할 수 있는 방법과 제한된 조건 하에서 수행된 PCR 반응을 말한다.
한 실시예에서, 시료 내의 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)의 양 또는 농도는 TaqMan® PCR을 사용하여 측정된다. 이 기술은 일반적으로 표적화된 서열로부터 시그널을 발생시키기 위하여 올리고뉴클레오티드 복제 효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성에 의존한다. TaqMan 프로브는 유전자 증폭 기술(polymerase chain reaction; PCR)을 이용하여 증폭된 압타머 서열과 같이 시그널을 발생시키기 위하여 정량화될 압타머의 서열에 기초하여 선택되고, 일반적으로 예를 들어 6-카복시플로오레세인(6-carboxyfluorescein)과 같은 5'-말단 형광단(fluorophore), 예를 들어 6-카복시테트라메틸플루오레세인(6-carboxytetramethylfluorescein)과 같은 3'-말단 퀀쳐(quencher)를 포함한다. 폴리머라아제가 압타머 서열을 복제함에 따라, 엑소뉴클레아제 활성이 PCR 프라이머로부터 하부(downstream)에서 어닐링된 프로브로부터 형광단을 유리시킴으로서 시그널을 발생시킨다. 복제 산물(replicative product)로서 증가된 시그널이 생산된다. PCR 산물의 양은 압타머의 시작 농도 뿐만 아니라 수행된 복제 주기의 수 모두에 좌우된다.
다른 실시예에서, 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)의 양 또는 농도는 복제 공정 동안 삽입성 형광 염료(intercalating fluorescent dye)를 사용하여 측정된다. 예를 들어, SYBR® 그린(SYBR® green)과 같은 삽입성 염료는 단일가닥 DNA의 존재 하에서 생성된 형광 시그널에 비해 이중가닥 DNA의 존재 하에서 큰 형광 시그널을 생성한다. 이중가닥 DNA 산물이 PCR 동안에 형성되는 것과 같이, 염료에 의해 생성된 시그널도 증가한다. 생성된 시그널의 크기는 PCR 주기 및 압타머의 시작 농도 모두에 의존한다.
다른 실시예에서, 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)는 질량 분석법을 사용하여 검출되고/되거나 정량된다. 고유한 질량 태그는 상기에 기재된 효소적 기술을 사용하여 도입될 수 있다. 질량 분석법의 판독을 위하여 검출 표지는 필요하지 않으며, 그보다는 질량 그 자체가 당업자들에게 일반적으로 사용되는 기술을 사용하여 확인하는 데 사용되며, 질량 분석법을 분석하는 동안에 생성된 질량 피크(mass peak) 아래의 위치와 영역에 기초하여 정량화된다. 질량 분석법을 사용하는 예는 세퀴놈(Sequenom)에 의해 개발된 MassARRAY® 시스템이다.
다른 실시예에서, 서로 다른 내장된 기능성들을 포함하는 압타머 구조체가 제공된다. 이 기능성들은 고정화를 위한 태그, 검출을 위한 표지, 광반응성기, 분리를 촉진하거나 조절하기 위한 수단 등을 포함할 수 있다. 한 실시예에서, 압타머는 압타머 서열 내에 절단가능한 또는 방출가능한 부분(section)(또한, 성분(element or component)로서 기재됨)을 포함한다. 이 부가적인 성분들(components or elements)은 압타머 내로 부가적인 기능성을 도입하는 구조적 성분들이다. 다른 실시예에서, 상기 압타머는 하나 또는 그 이상의 하기의 부가적인 성분들(또한, 기능적 또는 구조적 성분 또는 부분으로서 기재됨)을 포함한다: 표지되거나 검출가능한 성분, 스페이서 성분, 절단가능한 성분 및 특이적 결합 태그 또는 고정화 성분. 예를 들어, 광가교결합 압타머의 한 실시예에서, 상기 압타머는 도 3L에 나타낸 것과 같이 절단가능한 부분(moiety)을 통하여 압타머에 연결된 태그, 표지, 표지와 절단가능한 부분을 분리하는 스페이서 성분 및 광가교결합 부분을 포함한다.
모든 압타머 구조체들은 표준 포스포라미다이트 화학물질을 사용하여 합성될 수 있다. 대표적인 압타머 구조체는 도 3A에서부터 도3L에 나타내었다. 상기 기능성은 5' 및 3' 말단의 사이에서 쪼개질 수 있거나, 그 중 어느 하나의 말단에 결합될 수 있다. 광절단가능한 부분에 더하여, 화학적 또는 효소적 절단가능한 부분을 포함하는 다른 절단가능한 부분들도 사용될 수 있다. 다양한 스페이서 부분들이 사용될 수 있고, 하나 또는 그 이상의 비오틴 부분들이 포함될 수 있다. 비오틴 이외의 태그(또한, 고정화 또는 특이적 결합 성분이라 칭함) 또한 포함될 수 있다. 적절한 구조 시약(construction reagent)은 비오틴 포스포라미다이트(biotin phosphoramidite); PC Linker(Glen Research PN 10-4920-02); PC 비오틴 포스포라미다이트(PC biotin phosphoramidite, Glen Research PN 10-4950-02); d스페이서 CE 포스포라미다이트(dSpacer CE Phosphoramidite; Glen Research PN 10-1914-02); Cy3 포스포라미다이트(Cy3 phosphoramidite; Glen Research PN 10-5913-02) 및 암26-아크 스페이서 아미다이트(Arm26-Ach Spacer Amidite; Fidelity Systems PN SP26Ach-05)를 포함한다. 도 3K에 나타낸 것과 같이, (Cy3와 같은) 형광 염료, 스페이서, 광절단가능한 부분 및 비오틴 부분이 압타머의 말단에 첨가될 수 있다. 한 실시예에서, 광절단가능한 부분과 염료간의 잠재적 상호작용 때문에 스페이서가 이 두개의 부분 사이에 삽입된다.
한 실시예에서, 상기 태그는 도 3I-3K에 나타낸 것과 같이 압타머에 공유적으로 부착된다. 다른 실시예에서, 상기 태그는 도 3E-3H에 나타낸 것과 같이 공유적으로 부착된 태그를 가지는 압타머 서열의 일부분에 상보적인 혼성화된 폴리뉴클레오티드 서열의 형태로 압타머에 간접적으로 부착된다.
한 실시예에서, 압타머는 압타머 내의 광가교결합 기와 고유 서열 사이에 위치된 제1 절단가능한 부분을 포함하도록 더 변형될 수 있다. 이 제1 절단가능한 부분은 예를 들어, 사용된 절단가능한 부분에 따른 화학, 광화학 또는 이온을 포함하는 다양한 서로 다른 수단에 의해 절단될 수 있다. 한 실시예에서, 압타머는 도 3B에 나타낸 구조를 가진다. 예를 들면, 상기 광가교결합기는 4-아지도-2-니트로-아닐린 및 광절단가능한기 또는 포스포라미다이트(-(4,4'-디메톡시트리틸)-1-(2-니트로페닐)-프로판-1-일-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포라미다이트)로서 글렌 리서치사로부터 입수 가능한 PC 링커일 수 있는 절단가능한 부분일 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 압타머는 절단가능한 기를 통하여 압타머에 연결되는 포획 태그를 포함한다. 예를 들면, 비오틴 포획 태그는 도 3F에 나타낸 것과 같이 압타머에 혼성화되는 제2 올리고뉴클레오티드를 통하여 압타머에 부착될 수 있다. 다른 실시예에서, 다른 포획 태그 또는 절단가능한 성분은 동일한 압타머에 부착될 수 있다. 예를 들면, 폴리-His 태그는 제2 화학 또는 광절단가능한 부분을 통하여 압타머에 부착될 수 있다. 이 압타머 구조체에 대한 이점은 시료 내의 다른 성분으로부터 압타머 친화(또는 공유결합) 복합체를 분리하기 위해 두개의 서로 다른 처리 단계를 적용할 수 있다는 것이다. 이 분리 단계들은 원하는 임의의 서열에 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 검출 표지 또한 도 3C에 나타낸 것과 같이 압타머 내로 포함될 수 있다. 이 검출 표지는 상기에 상세히 기재된 것과 같은 검정법의 최종 단계에서 자유 압타머의 검출 및/또는 정량을 위해 제공된다. 예를 들면, 형광 검출을 위하여, Cy3 또는 Cy5 염료와 같은 형광 염료가 압타머 내로 포함될 수 있다. Cy3는 글렌 리서치사로부터 입수한 Cy3 포스포라미다이트(3-(4-모노메톡시트리틸옥시) 프로필]-1'-[3-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필) 포스포라미디틸]프로필]-3,3,3',3'-테트라메틸인도카보시아닌 클로라이드))를 사용하여 도입될 수 있지만, 임의의 적절한 표지도 압타머 내로 포함될 수 있다.
첨부된 청구항을 포함하는 본 명세서에서 사용된 것으로서, 단수 형태인 "하나("a", "an" 및 "the")"는 별다른 명확한 지시가 없는 한 복수를 포함하며, "적어도 하나(at least one)" 및 "하나 또는 그 이상(one or more)"과 상호교환적으로 사용된다. 따라서, "압타머"는 압타머의 혼합체를 포함하고, "프로브"는 프로브의 혼합물 등을 포함한다는 것을 참고한다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "포함하는("comprises", "comprising", "includes", "including", "contains", "containing")" 및 그것들의 임의의 변화는 예를 들어 제법(process), 방법, 제법에 의한 물건, 또는 물건의 조성과 같은 비 배타적인 것들을 포함하는 것을 의도한다. 구성(comprises), 포함(includes), 또는 요소 또는 요소들의 포함은 오직 이 요소들만 포함되는 것이 아니라 상세히 진술되지 않거나 내재되지 않은 다른 제법, 방법, 제법에 의한 물건 등 다른 요소들도 포함된다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "약(about)"은 수치에 관련된 항목의 기본 함수가 변하지 않는 범위에서의 대수롭지 않은 변경 또는 수치의 변동을 나타낸다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "결합하다(associate or associates)" 및 그것들의 임의의 변형은 태그와 프로브 간의 상호작용 또는 복합체 형성(complexation)으로 인해, 예를 들어, 주어진 복합체 형성 또는 반응 조건 하에서 태그-프로브 복합체로부터 시료의 비결합된 성분과 같은 "비결합된(unassociated or unbound)" 물질의 분리를 가능하게 하기 위하여 충분히 안정한 복합체를 형성하는 것을 말한다. 태그 및 프로브는 특이성을 가지고 서로 상호작용하고 결합함으로써 서로 직접적으로 결합될 수 있다. 태그 및 프로브는 또한 복합체 형성이 연결 분자에 의해 매개되는 경우와 같이 서로 간접적으로 결합될 수 있다.
본원에 기재된 하나 또는 그 이상의 단계의 임의의 방법을 수행하기 위하여 컴퓨터 프로그램이 사용될 수 있다. 본원 명세서의 다른 양상은 컴퓨터 내로 로딩될 때 본원에 기재된 임의의 방법의 실행을 수행하거나 돕는 컴퓨터 프로그램을 가지는 컴퓨터 판독 가능한 기억 매체(computer readable storage medium)를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품이다.
본 발명의 한 양상은 본원에 기재된 임의의 방법의 제품이고, 즉 테스트 장소에서 평가될 수 있는 검정 결과이거나, 만일 원한다면 그것은 평가 및 원격지에 있는 관계자와의 의사소통을 위하여 다른 장소로 이송될 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "보조작업 현장(remote location)"은 결과가 얻어진 곳과 물리적으로 다른 장소를 말한다. 따라서, 상기 결과는 서로 다른 방, 서로 다른 빌딩, 서로 다른 도시의 일부, 서로 다른 도시 등으로 보내질 수 있다. 데이터는 예를 들어, 팩스, 우편, 일일배달(overnight delivery), 이메일, ftp, 보이스 메일 등과 같은 임의의 적절한 수단에 의해 전달될 수 있다.
정보를 "전달(Communicating)"하는 것은 적절한 전달 경로(예를 들면, 사설 또는 공중 네트워크)를 통하여 전자 시그널로서 정보를 나타내는 데이터의 전달을 말한다. 아이템을 "운송(Forwarding)"하는 것은 아이템을 물리적으로 또는 (가능하다면) 다른 방법으로 수송하는 것이든 간에, 한 장소에서 다음 장소로 아이템을 이송하는 임의의 수단을 말하고, 최소한 데이터인 경우에는, 그 데이터를 이송하거나 의사소통하는 매체를 물리적으로 수송하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 방법은 검정법으로부터 용리된 자유 압타머를 검출함으로써 표적 분자의 존재 및 양을 검출할 수 있다. 이것은 핵산의 검출, 정량 및 증폭의 상대적 간단함 때문에 표적 분자의 검출 및 정량을 용이하게 하고, 매우 좋은 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio)를 가지는 표적 검출 검정법을 제공한다.
도 1A 및 1B는 시료 내에 존재할 수 있는 하나 또는 그 이상의 표적 분자의 검출 및/또는 정량화를 위한 대표적 방법을 나타낸 것이다.
도 2A 및 2B는 시료 내에 존재할 수 있는 하나 또는 그 이상의 표적 분자의 검출 및/또는 정량화를 위한 대표적 방법을 나타낸 것이다.
도 3A-L은 본원에 기재된 검정법과 함께 사용하기 위한 대표적 압타머 구조체을 나타낸 것이다.
도 4는 500개의 표적에 대해 생성된 압타머들의 리스트를 나타낸 것이다. 이 압타머들의 대부분은 그것의 각각의 표적에 대하여 느린 분리 속도를 가지도록 설계되었다.
도 5A는 혼성화 태그(hybridization tag)의 예를 나타낸 것이다. 도 5B 내지 도D는 절단가능한 또는 방출가능한 요소, 태그(예를 들어, 비오틴), 스페이서(spacer) 및 표지(예를 들어, Cy3)를 포함하는 압타머 구조체의 예를 나타낸 것이다.
도 6은 이 명세서에 기재된 검정 방법에서 사용된 압타머 및 프라이머 구조체을 나타낸 것이다. Cy3는 시아닌 3 염료(Cyanine 3 dye), B는 비오틴(biotin), PC는 광절단가능한 링커(photocleavable linker), ANA는 광반응성 광가교결합기(photoreactive crosslinking group), (AB)2는 dA 잔기에 의해 분리된 한쌍의 비오틴 잔기, 및 (T)8은 폴리 dT 링커(poly dT linker)이다. 프라이머 구조체는 압타머 구조체의 완전한 3' 고정 영역(fixed region)에 대하여 상보적이다. 도 6A는 단일 포획 친화 검정법 프로토콜에 사용된 압타머 구조체이다. 도 6B는 이중 포획 친화 검정법 프로토콜에 사용된 압타머 구조체이다. 도 6C는 단일 포획 광가교결합 검정법 프로토콜에 사용된 압타머 구조체이다. 도 6D는 이중 포획 광가교결합 검정법 프로토콜에 사용된 압타머 구조체이다.
도 7A, 7B 및 7C는 마이크로어레이 검출과 함께 친화 검정법 프로토콜을 사용한, 버퍼에서의 표적 단백질의 검출에 대한 용량 반응 곡선(RFU 대 로그 인풋 표적 단백질 농도)을 나타낸 것이다. 반복된 단백질을 포함하지 않는 대조군 값을 y축 상에 그래프로 나타내었다. 실선(solid line)은 데이터 포인트를 통하여 S자 형태를 나타낸다. 점선(dashed line)은 반복된 단백질을 포함하지 않는 값의 두개의 표준편차를 나타낸다. 도 7A는 bFGF 표적 단백질이다. 도 7B는 FGF7 표적 단백질이다. 도 7C는 림포택틴 표적 단백질이다.
도 8은 마이크로어레이 검출과 함께 친화 검정법 프로토콜을 사용한, 버퍼에서의 표적 단백질 림포택틴의 세번의 반복측정에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸 것이다. 반복된 단백질을 포함하지 않는 대조군 값을 y축 상에 그래프로 나타내었다. 실선은 각각의 세번의 반복에 대한 데이터 포인트를 통하여 S자 형태를 나타낸다.
도 9는 마이크로어레이 검출과 함께 친화 검정법 프로토콜을 사용한, 10% 인간 혈장에서의 표적 단백질 림포택틴의 검출에 대한 용량 반응 곡선(RFU 대 로그 인풋 표적 단백질 농도)을 나타낸 것이다. 반복된 단백질을 포함하지 않는 대조군 값을 y축 상에 그래프로 나타내고, 서클로 나타내었다. 실선은 데이터 포인트를 통하여 S자 형태를 나타낸다.
도 10은 마이크로어레이 검출과 함께 친화 검정법 프로토콜을 사용한, 10% 전 인간 혈액(whole human blood)에서의 표적 단백질 림포택틴의 검출에 대한 용량 반응 곡선(RFU 대 로그 인풋 표적 단백질 농도)을 나타낸 것이다. 반복된 단백질을 포함하지 않는 대조군 값을 y축 상에 그래프로 나타내고, 서클로 나타내었다. 실선은 데이터 포인트를 통하여 S자 형태를 나타낸다.
도 11은 마이크로어레이 검출과 함께 친화 검정법 프로토콜을 사용한, 버퍼에서의 표적 단백질 안지오제닌(Angiogenin)의 검출에 대한 용량 반응 곡선(RFU 대 로그 인풋 표적 단백질 농도)을 나타낸 것이다. 실선은 데이터 포인트를 통하여 S자 형태를 나타낸다. 4번의 반복된 단백질이 포함되지 않은 데이터 포인트를 서클로 나타내었다.
도 12는 QPCR 검출과 함께 친화 검정법 프로토콜을 사용한, 버퍼에서의 표적 단백질 안지오제닌(Angiogenin)의 검출에 대한 용량 반응 곡선(RFU 대 로그 인풋 표적 단백질 농도)을 나타낸 것이다. 실선은 데이터 포인트를 통하여 S자 형태를 나타낸다. 4번의 반복된 단백질이 포함되지 않은 측정값을 오픈 서클로 y축 상에 나타내었다.
도 13A 내지 13C는 세개의 서로 다른 표적에 대한 느린 오프 레이트 압타머 대 기존의 압타머에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸 것이다.
도 14는 검정법 재현성 연구(assay reproducibility study)에 대한 샘플 설계(sample layout)를 나타낸 것이다.
도 15는 혼주 샘플(pooled sample) 및 비혼주 샘플(unpooled sample) 연구의 CV 값을 나타낸 것이다.
도 16은 이 명세서에 기재된 핵산의 염기 변형을 나타낸다. 뉴클레오티드 부착 부위와 R기 사이에 사용될 수 있는 링커(X)에 더하여 기재된 사용될 수 있는 R기를 보여준다. 다양한 "R"기에 대한 부착 위치 또한 각각의 R기 상에 나타내었다.
도 2A 및 2B는 시료 내에 존재할 수 있는 하나 또는 그 이상의 표적 분자의 검출 및/또는 정량화를 위한 대표적 방법을 나타낸 것이다.
도 3A-L은 본원에 기재된 검정법과 함께 사용하기 위한 대표적 압타머 구조체을 나타낸 것이다.
도 4는 500개의 표적에 대해 생성된 압타머들의 리스트를 나타낸 것이다. 이 압타머들의 대부분은 그것의 각각의 표적에 대하여 느린 분리 속도를 가지도록 설계되었다.
도 5A는 혼성화 태그(hybridization tag)의 예를 나타낸 것이다. 도 5B 내지 도D는 절단가능한 또는 방출가능한 요소, 태그(예를 들어, 비오틴), 스페이서(spacer) 및 표지(예를 들어, Cy3)를 포함하는 압타머 구조체의 예를 나타낸 것이다.
도 6은 이 명세서에 기재된 검정 방법에서 사용된 압타머 및 프라이머 구조체을 나타낸 것이다. Cy3는 시아닌 3 염료(Cyanine 3 dye), B는 비오틴(biotin), PC는 광절단가능한 링커(photocleavable linker), ANA는 광반응성 광가교결합기(photoreactive crosslinking group), (AB)2는 dA 잔기에 의해 분리된 한쌍의 비오틴 잔기, 및 (T)8은 폴리 dT 링커(poly dT linker)이다. 프라이머 구조체는 압타머 구조체의 완전한 3' 고정 영역(fixed region)에 대하여 상보적이다. 도 6A는 단일 포획 친화 검정법 프로토콜에 사용된 압타머 구조체이다. 도 6B는 이중 포획 친화 검정법 프로토콜에 사용된 압타머 구조체이다. 도 6C는 단일 포획 광가교결합 검정법 프로토콜에 사용된 압타머 구조체이다. 도 6D는 이중 포획 광가교결합 검정법 프로토콜에 사용된 압타머 구조체이다.
도 7A, 7B 및 7C는 마이크로어레이 검출과 함께 친화 검정법 프로토콜을 사용한, 버퍼에서의 표적 단백질의 검출에 대한 용량 반응 곡선(RFU 대 로그 인풋 표적 단백질 농도)을 나타낸 것이다. 반복된 단백질을 포함하지 않는 대조군 값을 y축 상에 그래프로 나타내었다. 실선(solid line)은 데이터 포인트를 통하여 S자 형태를 나타낸다. 점선(dashed line)은 반복된 단백질을 포함하지 않는 값의 두개의 표준편차를 나타낸다. 도 7A는 bFGF 표적 단백질이다. 도 7B는 FGF7 표적 단백질이다. 도 7C는 림포택틴 표적 단백질이다.
도 8은 마이크로어레이 검출과 함께 친화 검정법 프로토콜을 사용한, 버퍼에서의 표적 단백질 림포택틴의 세번의 반복측정에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸 것이다. 반복된 단백질을 포함하지 않는 대조군 값을 y축 상에 그래프로 나타내었다. 실선은 각각의 세번의 반복에 대한 데이터 포인트를 통하여 S자 형태를 나타낸다.
도 9는 마이크로어레이 검출과 함께 친화 검정법 프로토콜을 사용한, 10% 인간 혈장에서의 표적 단백질 림포택틴의 검출에 대한 용량 반응 곡선(RFU 대 로그 인풋 표적 단백질 농도)을 나타낸 것이다. 반복된 단백질을 포함하지 않는 대조군 값을 y축 상에 그래프로 나타내고, 서클로 나타내었다. 실선은 데이터 포인트를 통하여 S자 형태를 나타낸다.
도 10은 마이크로어레이 검출과 함께 친화 검정법 프로토콜을 사용한, 10% 전 인간 혈액(whole human blood)에서의 표적 단백질 림포택틴의 검출에 대한 용량 반응 곡선(RFU 대 로그 인풋 표적 단백질 농도)을 나타낸 것이다. 반복된 단백질을 포함하지 않는 대조군 값을 y축 상에 그래프로 나타내고, 서클로 나타내었다. 실선은 데이터 포인트를 통하여 S자 형태를 나타낸다.
도 11은 마이크로어레이 검출과 함께 친화 검정법 프로토콜을 사용한, 버퍼에서의 표적 단백질 안지오제닌(Angiogenin)의 검출에 대한 용량 반응 곡선(RFU 대 로그 인풋 표적 단백질 농도)을 나타낸 것이다. 실선은 데이터 포인트를 통하여 S자 형태를 나타낸다. 4번의 반복된 단백질이 포함되지 않은 데이터 포인트를 서클로 나타내었다.
도 12는 QPCR 검출과 함께 친화 검정법 프로토콜을 사용한, 버퍼에서의 표적 단백질 안지오제닌(Angiogenin)의 검출에 대한 용량 반응 곡선(RFU 대 로그 인풋 표적 단백질 농도)을 나타낸 것이다. 실선은 데이터 포인트를 통하여 S자 형태를 나타낸다. 4번의 반복된 단백질이 포함되지 않은 측정값을 오픈 서클로 y축 상에 나타내었다.
도 13A 내지 13C는 세개의 서로 다른 표적에 대한 느린 오프 레이트 압타머 대 기존의 압타머에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸 것이다.
도 14는 검정법 재현성 연구(assay reproducibility study)에 대한 샘플 설계(sample layout)를 나타낸 것이다.
도 15는 혼주 샘플(pooled sample) 및 비혼주 샘플(unpooled sample) 연구의 CV 값을 나타낸 것이다.
도 16은 이 명세서에 기재된 핵산의 염기 변형을 나타낸다. 뉴클레오티드 부착 부위와 R기 사이에 사용될 수 있는 링커(X)에 더하여 기재된 사용될 수 있는 R기를 보여준다. 다양한 "R"기에 대한 부착 위치 또한 각각의 R기 상에 나타내었다.
하기의 예는 단지 실례를 목적으로 제공되며, 첨부된 청구항에 정의된 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
앞서 말한 것은 다양한 실시예 및 예시들과 관련한 명세서를 기재한다. 어떠한 특정 실시예, 예시 또는 특정 실시예 또는 예시의 구성 요소도 임의의 청구항의 중요하고, 필요하고 또는 필수 구성 요소 또는 특징으로서 구성될 수 없다.
다양한 변형 및 치환이 하기의 청구항에 기재된 것과 같은 명세서의 범위를 벗어나지 않는 기재된 실시예로 만들어질 수 있다. 도면과 실시예를 포함하는 명세서는 제한적인 것보다는 설명하기 위한 수단으로 간주되며, 모든 이러한 변형 및 치환은 병세서의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 따라서, 본 명세서의 범위는 실시예에 의해서라기 보다는 첨부된 청구항 및 그것들의 법적 동등물에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 임의의 방법 또는 제법 청구항에 기술된 단계들은 임의의 실행가능한 순서로 실행될 수 있으며, 임의의 실시예, 예시 또는 청구항에 존재하는 순서로 제한되지 않는다.
실시예
1.
압타머
및
프라이머
구조체
압타머 및 서로 다른 5'-말단 작용기를 가지는 비오틴화된 프라이머 구조체를 제조하고, 상기 차이점을 도 6에 도시하였다. 압타머는 5'-말단에 Cy3 형광 염료(글렌사로부터 입수한 Cy3 포스포라미다이트 (-[3-(4-monomethoxytrityloxy)propyl]-1'-[3-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)phosphoramidityl]propyl]-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine chloride))를 포함하며, 프라이머는 두개의 비오틴 잔기((AB)2), (T)8 링커 및 광절단가능한 부분(phosphoramidite(-(4,4'-Dimethoxytrityl)-1-(2-nitrophenyl)-propan-1-yl-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)으로서 글렌사로부터 입수가능한 PC 링커)이 포함된다. 도 6에 기재된 방법을 위하여, 압타머는 본원에서 ANA(4-아지도-2-니트로-아닐린)로서 칭하는 광반응성 가교결합기, 광절단가능한 부분(PC Linker) 및 5'-말단에 Cy3 염료를 포함하며, 프라이머는 두개의 비오틴 잔기와 (T)8 링커를 포함한다.
실시예
2. 친화 결합 반응(2 포획 방법)
a) 버퍼
30μL의 Cy3-압타머 혼합물(각각의 압타머에 대하여 2nM)을 SB17T에서 30μL의 (AB)2-T8-PC-프라이머 혼합물(각각의 프라이머에 대하여 6nM)과 함께 결합시키고, 4분간 95℃에서, 13분간 37℃에서 배양하였다. 개별적인 반응에서, 60μL의 표적 단백질 혼합물을 제조하였다(SB17T에서 2X 농도로). 55μL의 상기 표적 단백질 혼합물을 96-웰 플레이트(Omni-Tube Plate, Abgene #AB0407)에서 55μL의 압타머/프라이머 혼합물과 결합시키고, 결합 평형을 달성하기 위하여 15분간 37℃에서 배양하였다. 모든 하기의 단계들은 별다른 지시가 없는 한 상온에서 수행하였다.
b) 혈장(plasma), 혈청(serum) 또는
전혈
(whole blood)
30μL의 Cy3-압타머 혼합물(각각의 압타머에 대하여 2nM)을 SB17T에서 30μL의 (AB)2-T8-PC-프라이머 혼합물(각각의 프라이머에 대하여 6nM)과 함께 결합시키고, 4분간 95℃에서, 13분간 37℃에서 배양하였다. 개별적인 반응에서, 30μL의 복합 생물학적 단백질 혼합물(혈장, 혈청, 전혈)의 1x 내지 2.5x 희석물을 Z-블록 경쟁자 올리고뉴클레오티드(5'-(ACZZ)7AC-3', 여기에서 Z = 5-벤질-dUTP, 4μM)를 포함하는 희석제로 제조하고, 5분간 배양하였다. 상기 복합 생물학적 단백질 혼합물을 30μL의 표적 단백질 혼합물(SB17T에 용해시킨 4X 농도)과 결합시켰다. 55μL의 표적 단백질/생물학적 매트릭스 혼합물을 55μL의 압타머/프라이머 혼합물과 화합시키고, 결합 평형을 달성하기 위하여 15분간 37℃에서 배양하였다. 모든 하기의 단계들은 별다른 지시가 없는 한 상온에서 수행하였다.
c)
비오틴화된
압타머
포획 및 자유 단백질 제거
133μL의 스트렙타비딘-아가로오스 레진(Pierce Immobilized Streptividin, #20353, 7.5% 수성 슬러리)을 듀라포어 멤브레인(Durapore membrane; MultiScreen-HV45, Millipore #MAHVN4550)을 통한 진공 여과에 의해 200μL의 SB17T로 2회 세척하였다. 10μL의 압타머:단백질 혼합물을 세척된 레진에 첨가하고, 15분간 혼합하였다. 상기 레진은 10μM 비오틴(Sigma-Aldrich, Inc. #B4501-1G)을 포함하는 200μL의 SB17T로 1회, 진공 여과에 의해 SB17T 200μL SB17T로 1회 세척하였다.
d) 단백질 태깅 및
압타머
방출
1.2mM NHS-PEO4-비오틴(Pierce #21329)을 포함하는 100μL의 SB17T을 레진을 세척하기 위하여 첨가하고, 20분간 혼합하였다. 상기 레진을 진공 여과에 의해 200μL의 SB17T로 5회, 원심분리에 의해 200μL의 SB17T로 1회 세척하고, 10mM 덱스트란 설페이트(Mr ~5000, Sigma-Aldrich #31404)를 포함하는 75μL의 SB17T에 재현탁시키고, 혼합하면서 5분간 UV 램프로 방사선조사하였다(두개의 Sylvania 350 Blacklight bulbs, 15W, 원 시료로부터 샘플 5cm). 상기 레진을 듀라포어 멤브레인을 통하여 원심분리에 의해 제거하였고, 방출된 압타머 단백질 복합체와 함께 용리액을 150μL의 SB17T + 10mM 덱트스란 설페이트가 담겨있는 1.1mL의 96-웰 플레이트(1.1mL Deep-Well plate, Marsh Biomedical #DW9611)에 수집하였다.
e) 단백질 포획 및 자유
압타머
제거
50μL의 스트렙타비딘 레진(DynaBeads MyOne Streptavidin C1, Invitrogen #650-03, 10mg/mL in SB17B)를 듀라포어 멤브레인에 첨가하였다. 225μL의 압타머:단백질 혼합물을 레진에 첨가하고 15분간 혼합하였다. 상기 레진을 10mM 덱스트란 설페이트가 포함된 200μL의 SB17T로 2회, 진공 여과에 의해 200μL의 SB17T로 1회, 원심분리에 의해 200μL의 SB17T로 1회 세척하였다.
f)
착물화된
압타머
방출
레진을 90μL의 용리 버퍼(2mM NaOH, 0.1% TWEEN-20)에 재현탁시키고 5분간 혼합하였다. 이 시간 동안에, 압타머가 단백질:압타머 복합체로부터 방출된다. 상기 레진을 원심분리에 의해 제거하고, 방출된 압타머와 함께 용출액을 수집하였다. 80μL의 용출액을 중성화시키고, 20μL의 중성화 버퍼(8mM HCl, 0.5mM Tris-HCl(pH 7.5))로 완충시켰다. 압타머를 실시예 4에 기재된 것과 같이 검출하였다.
g) 결과
각각 10nM 또는 3nM 농도의 분석물(bFGF, FGF7, tPA, Lymphotactin)로 시작하는 11개의 단백질 분석물(bFGF, Eotaxin-2, FGF7, FGF-16. GDNF, IL-7, IL-20, Lymphotactin, TARC, tPA, VEGF)을 위해 반로그 희석법(half-log dilution, 3.1623의 희석 배율)으로 33fM까지 연속적으로 희석하여, 버퍼으로 12개점 희석 시리즈를 만들었다. 주어진 총 14개의 샘플에 두개의 단백질을 첨가하지 않은 대조군을 포함하였다. Cy3-압타머 혼합물은 희석 시리즈에 표적 단백질에 대한 11개의 압타머를 포함할 뿐 아니라, 표적 단백질이 없는 28개의 대조 압타머를 포함한다. 3개의 복제 희석 시리즈를 제조하였다. 상기 결과를 도 7-10에 나타내었다.
도 7A 내지 C는 버퍼에서 11개의 표적 단백질 중 3개에 대한 농도 플롯(concentration plot)(로그-로그 용량 반응 곡선)에 대한 상대적 형광 유닛(relative fluorescence unit; RFU)을 나타낸다. 검출 한계값(Limit of Detection values; LOD)은 평균값과 두개의 단백질이 포함되지 않은 값의 표준편차를 더한 것과 동등한 시그널을 제공하는 단백질 농도로서 각각의 단백질에 대하여 계산된다. 3개의 단백질에 대한 LOD는 630fM(bFGF), 90fM(FGF7) 및 530fM(Lymphotactin)이었다. 친화 검정법은 서브-피코몰라 레벨(sub-picomolar level)에서 버퍼에서 단백질을 검출할 수 있다.
도 8은 버퍼에서의 표적 단백질 림포택틴에 대하여 세번의 반복 측정에 대한 농도 플롯에 대한 상대적 형광 유닛을 나타낸다. 세개의 선은 각각의 세개의 복제에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸다. 복제 곡선은 친화 검정 프로토콜에 대하여 매우 높은 재현성을 보여주는 상호간에 매우 일치하였다.
12개점 희석 시리즈를 또한 각각 분석물의 10nM(VEGF 및 Eotaxin-2) 또는 3nM(bFGF, tPA, Lymphotactin)의 농도로부터 시작해서 2.5배의 희석으로 420fM 또는 126fM까지 연속으로 희석하여 5개의 단백질 분석물에 대하여 10% 혈장으로 처리하였다. 그 후에 마이크로어레이 슬라이드 상에 혼성화된 총 14개의 샘플들을 제공하기 위하여 두개의 단백질을 포함하지 않은 대조군들을 포함하였다. Cy3-압타머 혼합물은 희석물에 표적 단백질에 대한 5개의 압타머 뿐만 아니라 표적 단백질이 없는 5개의 대조군 압타머들 또한 포함한다. 하기의 예외사항을 제외하고는 상기에 기재된 것과 같이 검정법을 수행하였다. 100% PPT-혈장(혼주 인간 혈장)을 0.5 x SB18, 0.05% TWEEN-20을 이용하여 5μM의 Z-블록으로 1 내지 2배 희석하였다. 40μL의 이 50% 혈장 용액을 3.33x의 최종 농도에서 60μL의 단백질 혼합물과 혼합하였다. 50μL의 혈장/단백질 혼합물을 50μL의 압타머/프라이머 혼합물(3nM 압타머, 9nM 프라이머)와 결합시켰다. 37℃에서 15분간 평형 결합 반응을 수행하였다. (100μL 대신에) 40μL의 전혈-단백질-압타머 혼합물을 스트렙타비딘-아가로오스 레진에 첨가하고 15분간 혼합하였다.
도 9는 10% 인간 혈장에서 표적 단백질 림포택틴에 대한 농도 플롯 대 상대적 형광 유닛(RFU)을 나타낸다. 이 곡선은 버퍼에서의 용량 반응 곡선에 대한 형태 및 반응과 유사하다. 이것은 친화 검정 프로토콜이 수행될 수 있지만 10% 혈장 용액에 제한되지는 않는다는 것을 나타낸다.
도 10은 10% 전 인간 혈액에서 표적 단백질 림포택틴에 대한 농도 플롯 대 상대적 형광 유닛(RFU)을 나타낸다. 이 곡선은 10% 인간 혈장(도 9)에서의 용량 반응 곡선에 대한 형태 및 반응과 유사하고, 임의의 식별할 수 있는 매트릭스 효과 없이 복합 생물학적 매트릭스에서 친화 검정 프로토콜의 수행을 보여준다.
실시예
3. 광-
가교결합
검정 프로토콜
이 프로토콜의 모든 단계들은 광압타머의 광활성화를 예방하기 위하여 빛에 대한 노출을 최소한으로 하여 수행되었다.
a) 단백질 결합
30μL의 ANA-PC-Cy3-압타머 혼합물(각각의 압타머에 대하여 2nM)을 SB17T 버퍼(40mM HEPES, pH 7.5, 120mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM EDTA, 0.05% TWEEM-20)에서 30μL의 (AB)2-T8-프라이머 혼합물(각각의 압타머에 대하여 6nM)과 결합시키고, 5분간 95℃에서, 13분간 37℃에서 배양하였다. 분리 반응에서, 60μL의 단백질 혼합물을 2X 농도로 제조하였다. 55μL의 표적 단백질 혼합물을 96-웰 플레이트(Omni-Tube Plate, Abgene #AB0407)에서 55μL의 압타머/프라이머 혼합물과 결합시키고, 결합 평형을 달성하기 위하여 15분간 37℃에서 배양하였다. 모든 하기의 단계들은 별다른 지시가 없는 한 상온에서 수행하였다.
b) 동적 유발 및 광-
가교결합
100μL의 평형된 샘플을 10mM 덱스트란 설페이트(Mr~5000, Sigma-Aldrich #31404)를 포함하는 1400μL의 SB17T에 첨가하고, 15분간 37℃에서 배양하였다. 단백질이 광압타머에 공유적으로 가교결합하도록 1.5mL의 샘플을 10분간 37℃에서 470nm의 빛(Custom LED array)으로 조사하였다.
c)
비오틴화된
압타머
포획 및 자유 단백질 제거
40μL의 스트렙타비딘 레진(DynaBeads MyOne Streptavidin C1, Invitrogen #650-03, 10mg/mL in SB17T)을 1.5mL의 샘플에 첨가하고, 혼합하면서 30분간 25℃에서 배양하였다. 상기 레진을 원심분리에 의해 펠릿화시키고, 1.4mL의 상층액을 제거하였다. 상기 레진과 남아있는 상층액을 듀라포어 멤브레인(MultiScreen-HV45, Millipore #MAHVN4550)으로 옮기고, 상기 상층액을 진공 여과에 의해 제거하였다. 상기 레진을 10μM 비오틴(Sigma-Aldrich, Inc. #B4501-1G)을 포함하는 200μL의 SB17T로 2회 세척하고, 진공 여과에 의해 200μL의 SB17T로 1회 세척하였다.
d) 단백질 태깅 및
압타머
(자유 및 복합체) 방출
1.2mM NHS-PEO4-비오틴(Pierce #21329)를 포함하는 100μL의 SB17T를 세척된 레진에 첨가하고 20분간 혼합하였다. 상기 레진을 200μL의 구아니딘 세척 버퍼(3M guanidine, 50mM NaCl, 40mM HEPES pH 7.5, 2mM EDTA, 0.05% TWEEN-20, 1mM TROLOX)로 3회 세척하고, 진공 여과에 의해 200μL의 HEPES 세척 버퍼(50mM NaCl, 40mM HEPES pH 7.5, 0.05% TWEEN-20, 1mM TROLOX)로 2회 세척하였다. 상기 레진을 110μL의 20mM NaOH에 재현탁시키고 5분간 혼합하였다. 상기 레진을 원심분리에 의해 제거하고, 방출된 압타머:단백질 복합체와 함께 NaOH 용출액을 수집하였다. 100μL의 용출액을 25μL의 80mM HCl로 중성화시키고, 2M NaCl 및 1% TWEEN-20을 포함하는 10μL의 55mM HEPES(pH 7.5)로 완충시켰다.
e) 단백질 포획 및 자유
압타머
제거
133μL의 스트렙타비딘 레진(Pierce Immobilized Streptavidin, #20347, 10% aqueous slurry)을 듀라포어 PVDF 멤브레인을 통하여 진공 여과에 의해 200μL의 SB17T로 2회 세척하였다. 135μL의 압타머:단백질 혼합물을 세척된 레진에 첨가하고 20분간 혼합하였다. 상기 레진을 혼합하면서 10분간 50℃에서 200μL의 구아니딘 세척 버퍼로 1회 세척하고, 혼합하면서 2분간 200μL의 20mM NaOH로 1회 세척하고, 진공 여과에 의해 200μL의 SB17T로 2회 세척하고, 원심분리에 의해 200μL의 SB17T로 1회 세척하였다.
f) 광-
가교결합된
압타머
방출
상기 레진을 100μL의 SB17T에 재현탁시키고, 혼합하면서 20분간 UV 램프(two Sylvania 350 Blacklight bulbs, 15W, sample 5cm from source)로 방사선조사하였다. 이 시간 동안에, 단백질에 광-가교결합된 압타머는 광절단에 의해 방출된다. 상기 레진을 듀라포어 멤브레인을 통하여 원심분리에 의해 제거하고, 방출된 압타머와 함께 용출액을 수집하였다.
실시예
4.
마이크로어레이
검출 프로토콜
a) 샘플 제조
30μL의 4X 혼성화 버퍼(3.638M NaCl, 200mM Na-phosphate, pH 7.5, 1nM corner marker oligo, 4mM TROLOX, 0.1% TWEEN-20)를 90μL의 검정 샘플(실시예 2의 단계 e 또는 실시예 3의 단계 f의 생성물)에 첨가하였다.
b)
마이크로어레이
슬라이드
프로플레이트 슬라이드 모듈(ProPlate Slide Module)(CSW Gasket, FLC adhesive; Grace Bio-Labs, #204841)을 9mm씩 떨어져 있는 14(7x2) 어레이를 포함하는 마이크로어레이 슬라이드로 만들었다. 각각의 어레이는 압타머의 랜덤 영역에 대하여 상보적인 96 아민이 변형된 올리고뉴클레오티드의 3개의 복제(replica)로 이루어져 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 독점적인 3' x 1' 폴리머 슬라이드 상에 내부의 컨택트 프린터(contact printer)로 점 찍힌다.
e)
마이크로어레이
차단(blocking)
100μL의 차단 버퍼(Blocker Casein in PBS, Pierce #37528, 1mM TROLOX)를 프로플레이트 슬라이드 모듈의 웰에 첨가하고, 15 내지 30분간 65℃에서 배양하였다. 상기 차단 버퍼를 제거하였다.
d)
혼성화
및 세척
110μL의 검정 샘플을 마이크로어레이에 첨가하고, 3 x 1 x 0.125인치의 알루미늄 블록을 프로플레이트 슬라이드 모듈의 윗부분에 놓았다. 조립품을 알루미늄 호일로 감싸고 항습기(humidity chamber)에서 혼합하지 않고 16시간 동안 65℃에서 배양하였다. Al-호일 및 Al-블록을 샘플과 함께 제거하고, 마이크로어레이를 200μL의 세척 버퍼 1(50mM Na-Phosphate, pH 7.5, 0.1% TWEEN-20)로 1회 세척하고, 65℃로 미리 가열하였다. 세척 버퍼 1을 제거하고, 프로플레이트 슬라이드 모듈을 분리하였다. 상기 마이크로어레이 슬라이드를 25mL의 (65℃로 미리 가열된) 세척 버퍼 1을 포함하는 팹모양 병(pap jar)에 놓고, 혼합하면서 15분간 65℃에서 배양하였다. 상기 마이크로어레이 슬라이드를 25mL의 세척 버퍼 2(50mM Na-Phosphate, pH 7.5, 65℃로 미리 가열)를 포함한 제2의 팹모양 병으로 옮기고, 혼합하면서 5분간 65℃에서 배양하였다. 상기 마이크로어레이 슬라이드를 25mL의 세척 버퍼 2를 포함한 제3의 팹모양 병으로 옮기고, 혼합하면서 5분간 65℃에서 배양하였다. 상기 마이크로어레이 슬라이드를 세척 버퍼 2로부터 제거하고, 건조 질소의 흐름하에서 즉시 건조시켰다.
e) 검출
상기 마이크로어레이 슬라이드를 TECAN LS300 재충전 형광 레이저 스캐너(TECAN LS300 reloaded fluorescent Laser Scanner)로 스캔하였고, 형광 시그널을 어레이 비젼(8.0 Rev 3.0 Imaging Research, Inc.) 소프트웨어 패키지를 사용하여 각각의 특징에 따라 정량하였다. 상기 형광 시그널을 분할(segmentation)과 변동 점 형상(variable spot shape)과 함께 원칙적인 척도로서 밀도를 사용하여 정량화하였다. xml 익스포트 파일(export file)을 추가 데이터 분석을 위하여 데이터베이스로 보냈다.
f) 정량적
PCR
검출 프로토콜
프라이머
설계
각각의 압타머에 대한 증폭 프라이머들을 프라이머 Tm 분(min) = 60℃, 최적(optimum) = 65℃, 및 최대(max) = 70℃, 및 생성물 크기 범위 = 50-100bp를 제외한 기본 매개변수(default parameter)의 셋팅과 함께 프라이머퀘스트(PrimerQuest; Integrated DNA Technologies)를 사용하여 선택하였다. 그 후, 올리고 농도 = 0.2μM을 제외한 기본 매개변수의 셋팅과 함께 올리고 아날라이저 3.0(Oligo Analyzer 3.0; Intetrated DNA Technologies)을 사용하여 후보 프라이머들의 내부 헤어핀구조(internal hairpin), 이량체(homo-dimer) 및 이질 이량체(hetero-dimer) 3' 말단 상보성(complementarity)에 대하여 분석하였다.
정량적
PCR
반응
5μL의 중성화된 검정 샘플(친화 검정 프로토콜(실시예 2)의 단계 5 또는 광-가교결합 검정 프로토콜(실시예 3)의 단계 6을 참조)을 95μL의 dH2O를 사용하여 20X로 희석하였다. 5μL의 희석된 검정 샘플과 1X의 KOD 버퍼(Novagen #), 각각0.2mM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 1X SYBR 그린 I(Invitrogen #), 각각 0.2μM의 5' 프라이머와 3' 프라이머, 및 0.025U/μL의 KOD XL DNA 폴리머라아제(Novagen #)를 사용하여 20μL의 증폭 반응물을 제조하였다. 샘플들을 오염물질을 함유하지 않은 시약을 사용하여 바이오 후드(bio hood) 안에서 제조하였다. 한쌍의 프라이머를 한 압타머의 정량을 위한 각각의 반응에 사용하였다. 표준 곡선을 만들기 위하여 알려진 양의 압타머를 가지는 샘플 또한 제조하였다. 샘플들을 Bio-Rad iCyler에서 2분간 95℃에서 배양하고, 15초 동안 95℃에서 40번 사이클링한 후 60초간 72℃에서 사이클링하여 증폭하였다.
데이터 분석
각각의 압타머에 대하여, 증폭 그래프로부터 각 샘플에 대한 역치 주기(threshold cycle; Ct) 값을 측정하고, Bio-Rad iCycler와 함께 제공되는 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 각각의 압타머에 대한 표준 곡선을 만들기 위하여 사용하였다. 표준 곡선을 사용하여 각각의 검정 샘플에서의 각각의 압타머 복제의 수를 측정하고, 희석배율과 샘플 부피를 조정한 후 압타머 농도로 전환하였다. 각각 검정 샘플에서 압타머의 농도를 입력 단백질 농도의 함수로 나타내었다.
실시예 5. 광- 가교결합 검정 프로토콜 및 어레이 검출을 사용한 버퍼에서의 단백질 검출
10개점 희석 시리즈를 각각 분석물의 10nM의 농도로부터 시작해서 반로그 희석(3.1623의 희석 배율)으로 330fM까지 연속으로 희석하여 13개의 단백질 분석물(안지오제닌(angiogenin), BLC, C3a, 응고 인자 V, 응고 인자 XI, CTACK, 엔도스타틴(Endostatin), FGF7, IGFBP-3, 프리칼리크레인(Prekallikrein), PSA-ACT, TIMP-1 및 tPA)을 만들었다. 총 14개의 샘플들을 제공하기 위하여 4개의 단백질을 포함하지 않은 대조군들을 포함하였다. Cy3-압타머 혼합물은 희석 시리즈에 표적 단백질에 대한 13개의 압타머 뿐만 아니라 표적 단백질이 없는 14개의 대조군 압타머들 또한 포함한다. 샘플들을 광-가교결합 검정 프로토콜(실시예 3)을 사용하여 처리하고, 실시예 4에 기재된 것과 같은 마이크로어레이 검출을 이용하여 정량하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었으며, 이는 버퍼에서 표적 단백질 안지오제닌에 대한 농도 플롯 대 상대적 형광 유닛(RFU)을 나타낸다.
실시예
6. 친화 검정 프로토콜 및
QPCR을
이용한 버퍼에서의 단백질 검출
10개점 희석 시리즈를 각각 분석물의 10nM의 농도로부터 시작해서 반로그 희석(3.1623의 희석 배율)으로 330fM까지 연속으로 희석하여 12개의 단백질 분석물(안지오제닌(angiogenin), C1q, C5b, 6 복합체, CNP-SAS, EG-VEGF, IP-10, PAI-1, PDGF-BB, 프로트롬빈, E-셀렉틴, tPA 및 vWF)을 만들었다. 총 14개의 샘플들을 제공하기 위하여 4개의 단백질을 포함하지 않은 대조군들을 포함하였다. Cy3-압타머 혼합물은 희석 시리즈에 표적 단백질에 대한 12개의 압타머를 포함한다. 샘플들을 친화 검정 프로토콜(실시예 2)을 사용하여 처리하고, QPCR(실시예 4)을 이용하여 정량하였다. 검정 샘플에서 안지오제닌 압타머 2175-47의 정량을 위해 프라이머 2175-47-F3 (5'-GAGTGTGTGACGAGTGTGGAG-3')(SEQ ID NO:1) 및 2175-47-R3(5'-TCGGTTGTGGTGACGCCCG-3')(SEQ ID NO: 2)을 사용하였다. 상기 결과를 도 12에 나타내었으며, 이는 안지오제닌에 대한 입력 단백질 농도 대 검출된 압타머의 농도의 로그 플롯을 나타낸다.
실시예
7. 시료에서의 단백질 측정은 느린
오프
-
레이트를
가진
압타머에
의해 가능함
압타머
/
프라이머
혼합물 및 시료의 제조
비오틴 Cy3 검출 표지(각각 4nM)를 가지는 압타머를 1X SB17T에서 3X 과량의 포획 프로브(비오틴 태그 및 광절단가능한 성분을 포함하는 압타머의 3' 고정 영역에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드)와 함께 혼합하고, 4분간 95℃에서 가열한 후 13분 동안 37℃에서 가열하고, 1x SB17T에 1:4로 희석하였다. 55μL의 압타머/프라이머 혼합물을 미량역가 플레이트(Hybaid #AB-0407)에 첨가하고 호일로 밀봉하였다. 미량역가 플레이트에서 SB17T에 알려진 농도의 단백질 분석물을 혼합하고 SB17T로 연속적으로 희석함으로써 시료를 제조하였다.
샘플 평형
55μL의 압타머/프라이머 혼합물을 55μL의 시료에 첨가하고, 호일로 밀봉된 미량역가 플레이트에서 15분간 37℃에서 배양하였다. 평형 혼합물에서 각각의 압타머의 최종 농도는 0.5nM였다. 평형 후, 이 방법의 모든 후속 단계는 별다른 지시가 없는 한 상온에서 수행되었다.
압타머
포획 및 자유 단백질 제거
듀라포어 여과 플레이트(Millipore HV cat# MAHVN4550)을 진공 여과에 의해 100μL 1X SB17T로 1회 세척하고, 각각의 웰에 133.3μL의 7.5% 스트렙타비딘-아가로오스 레진(Pierce)를 첨가하고, 200μL 1X SB17T로 2회 세척하였다. 100μL의 평형화된 샘플을 스트렙타비딘-아가로오스 레진을 포함하는 듀라포어 플레이트로 옮기고, 5분간 800rpm으로 써모믹서(thermomixer) 상에서 배양하였다. 상기 레진을 200μL의 1X SB17T + 100μM의 비오틴으로 1회 세척하고, 200μL의 1X SB17T로 1회 세척하였다.
비오틴을 이용한 단백질 태깅
사용 전 즉시 제조된 SB17T에 용해시킨 100μL의 1.2mM NHS-PEO4-비오틴을 포획된 압타머 및 압타머:단백질 복합체와 함께 레진에 첨가하고, 20분간 800rpm으로 써모믹서 상에서 배양하였다. 상기 레진을 진공 여과에 의하여 200μL 1X SB17T로 5회 세척하였다.
느린
오프
레이트
강화 프로토콜 &
광절단
듀라포어 플레이트의 밑면에서 드립 디렉터(drip director)를 제거하고, 상기 플레이트를 1 mL 미량역가 수집 플레이트 상에 배치하였다. 레진을 원심분리에 의해 1000 x g에서 30 초간 200μL의 1X SB17T로 1회 세척하였다. 80μL의 1X SB17T + 10 mM DxSO4를 상기 레진에 첨가하고, 써모믹서 상에서 블랙레이(BlackRay) 수은 램프로 800rpm으로 10 분간 조사하였다. 상기 듀라포어 플레이트를 새로운 I mL 딥(deep) 웰 플레이트에 이동시키고, 1000 x g에서 30 초간 원심분리하여 광분열된 압타머 및 단백질:압타머 복합체를 수집하였다.
단백질 포획 및 자유
압타머
제거
50μL의 마이원-스트렙타비딘 Cl 상자성 비드(Invitrogen) (1X SB17T에 10 mg/mL) 미량역가 플레이트에 첨가하였다. 상기 비드를 자석으로 60 초간 분리하고 상등액을 제거하였다. 광분열 혼합물 225μL를 상기 비드에 첨가하고 5분간 혼합하였다. 자성 비드를 분리하고 세척 버퍼를 교체하면서 200μL의 1X SB17T로 상기 비드를 4회 세척하였다. 최종 세척 버퍼는 제거하였다.
압타머
용리
소디움 포스페이트 용리 버퍼(10 mM Na2HPO4, pH 11) 100μL 를 상기 비드에 첨가하고 5 분간 혼합하였다. 용리액 90μL를 미량역가 플레이트로 이동시키고, 소디움 포스페이트 중화 버퍼 (10 mM NaH2PO4, pH 5) 10μL로 중화시켰다.
마이크로어레이로
압타머
혼성화
DNA 어레이를 실체 현미경(custom microscope) 슬라이드 지지체 상에 고정된 각 압타머의 가변 영역의 상보적 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 포획 프로브로 준비하였다. 다중 어레이(서브어레이)가 각 슬라이드 상에 존재하고, 서브어레이는 샘플 적용처에 가스켓(Grace)을 부착하여 물리적으로 분리되었다. 어레이는 블록킹 버퍼 100μL로 전처리하고, 써모믹서 상에서 15 분간 65 ℃에서 배양하였다. 고농도 염(high salt) 혼성화 버퍼 30μ를 미량역가 플레이트 내에서 중화된 압타머 용리액 90μL에 첨가하고, 써멀 사이클러(Thermal Cycler) 내에서 95 ℃에서 5분간 배양하고, 0.1℃/초의 속도로 65℃까지 냉각시켰다. 블록킹 버퍼를 어레이로부터 제거하고, 압타머 샘플 110μL를 어레이에 첨가하고 항습기 내에서 65℃에서 20 시간 동안 배양하였다.
어레이 세척
압타머 샘플을 어레이로부터 제거하고, 어레이를 소디움 포스페이트 Tween-20 세척 버퍼 200μL로 65 ℃에서 가스켓으로 1회 세척하고, 소디움 포스페이트 Tween-20 세척 버퍼 25 mL로 65℃에서 가스켓이 제거된 팹모양 병(pap jar) 내에서 3회 세척하였다. 어레이는 질소 총(gun)으로 건조시켰다.
어레이 상에서 시그널을 정량화
어레이 슬라이드를 Cy3 검출에 적절한 채널에서 재충진된 TECAN LS300상에서 스캔하고, 각 어레이 피쳐(array feature)상에서 Cy3 시그널을 정량화하였다.
결과 :
3가지 다른 표적 (bFGF, VEGF, 및 마이엘로퍼옥시다제(Myeloperoxidase))에 특이적인 압타머들을 전통적인 SELEX 방법과 물질을 사용하여 생산하였다. 동일한 셋트의 표적에 대하여 특이적인 제2 압타머 셋트를 5-위치 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 제작하고, 각각의 표적에 대하여 매우 느린 오프-레이트로 선별하였다. 전통적인 공정으로 제작된 압타머는 5분 이하의 수준으로 오프 레이트가 측정되었다. 변형된 뉴클레오티드로 제작되고 선별 도중 느린 오프-레이트 강화 공정을 사용한 압타머는 오프 레이트가 20 분 이상이었다. 각 표적에 대하여 4가지 다른 압타머 개체군 전체에 대하여 상기 2가지 다른 방식으로 각 표적에 대하여 2가지 셋트의 압타머를 제작하였다. 시료 내 분석물 농도를 측정함에 있어 이들 압타머 개체군의 성능은 상술한 바와 같이 표적 농도 범위를 초과하여 평가되었다. DNA 칩 검출로부터 상대적인 신호가 입력 표적 농도에 대해 감지되었다. 도 13A 내지 13C를 참조하라. 전통적인 압타머의 반응 곡선은 매우 편평하고 검출 민감도가 매우 낮다. 느린 오프-레이트 압타머를 갖는 표적의 검출 민감도는 탁월하였다. 데이터는 최대 분석물 성능을 위하여 느린 오프-레이트 압타머를 사용할 필요가 있음을 뒷받침한다.
실시예
8. 느린
오프
레이트
압타머를
사용한 재현성
실시예 7의 방법을 사용하여 하나의 혈장 샘플을 68개의 다른 엘리컷 내로 분배하였다. 실시예 7의 검정법을 각각의 68개의 샘플에서 수행하였다. 34개의 샘플들을 결합시키고 다시 분배하였다. 남아있는 34개의 샘플들을 간단히 재검사하였다. 이 방법에서 검정법의 재현성은 검정 일관성(assay consistency)간에 검사될 수 있다. 샘플의 레이아웃과 검출식을 도 14에 나타내었다. 도 15는 도 14에 나타낸 모든 샘플들의 측정값에서 %CV를 나타낸다. 혼주 및 비혼주 샘플들은 동일한 CV를 갖는다.
실시예
9. 하나의 포획 친화 결합 방법
a) 혈장, 혈청 또는
전혈을
이용한
압타머의
평형화
30μL의 Cy3-압타머 혼합물(각 압타머에 대하여 20nM)을 SB17T에서 30μL의 (AB)2-T8-PC-프라이머 혼합물(각 프라이머에 대하여 60nM)과 결합시키고, 4분간 95℃, 13분간 37℃에서 배양하였다. SB17T로 1:1000으로 희석된 55μL의 상기 복합 생물학적 단백질 혼합물(혈장, 혈청 또는 전혈)을 55μL의 압타머/프라이머 혼합물과 결합시키고, 15분간 37℃에서 배양하여 결합 평형을 달성하였다. 모든 하기의 단계들은 별다른 지시가 없는 한 상온에서 수행하였다.
b) 단백질 태깅
100μL의 압타머:단백질 혼합물을 500μM NHS-PEO4-비오틴(Pierce #21329)을 포함하는 10μL의 SB17T과 결합시키고, 37℃에서 20분간 배양하였다. 반응 혼합물에 10μL의 200mM TRIS 버퍼(pH 7.5)를 첨가하여 과량의 NHS 시약을 퀀칭하고, 37℃에서 10분간 배양하였다.
c) 단백질 포획 및 자유
압타머
제거
압타머/단백질 복합체를 포획하기 위하여, 100μL의 스트렙타비딘 레진(DynaBeads MyOne Stresptavidin C1, Invitrogen #650-03, SB17T에 10mg/mL)을 듀라포어 멤브레인에 첨가하였다. 100μL의 압타머:단백질 혼합물을 레진에 첨가하여 15분간 혼합하고, 자유 압타머를 제거하기 위하여 진공 여과하였다. 상기 레진을 진공 여과에 의하여 200μL의 SB17T로 3회 세척하고, 원심 분리에 의해 200μL의 SB17T로 1회 세척하였다.
d) 착물화된 압타머 방출
상기 레진을 90μL의 용리 버퍼(2mM NaOH, 0.1% TWEEN-20)로 재현탁시키고, 5분간 혼합하여 압타머:단백질 혼합물로부터 압타머가 방출되었다. 상기 레진을 원심분리에 의해 제거하고, 상기 방출된 압타머를 포함하는 용출액을 수집하였다. 80μL의 용출액을 중성화시키고, 20μL의 중성화 버퍼(8mM HCl, 0.5mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.1% TEWEEN-20)을 사용하여 완충시켰다. 압타머를 실시예 4에 기재된 것과 같이 검출하였다.
다수의 특허, 특허출원 및 과학적 간행물들이 상세한 설명을 통해 인용되고 및/또는 말미에 목록화되었다. 이것들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 마찬가지로, 통합된 간행물 내에 언급된 모든 간행물들도 전적으로 참고문헌으로서 통합된다. 인용된 간행물 내 실시예 및 이와 관련된 한정은 예시적인 것으로 이에 한정하는 것은 아니다. 인용문헌 내 다른 제한은 상세한 설명 및 도면에 기초하여 당업계에서 숙련된 자에게 명백할 것이다.
용어 "포함하는("comprise", "comprises" 및 "comprising")은 한정이라기보다는 내포하는 쪽으로 해석된다.
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<130> I16010C0051p_US
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<151> 2007-07-17
<150> US 60/950,281
<151> 2007-07-17
<150> US 61/031,420
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<150> US 61/051,594
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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gagtgtgtga cgagtgtgga g 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 2
tcggttgtgg tgacgcccg 19
Claims (35)
- (a) 제1 태그를 포함하며 표적 분자에 대하여 특이적인 친화력을 가지는 압타머 및 시료를 접촉시킴으로써 혼합물을 제조하고, 여기에서 만일 상기 표적 분자가 상기 시료 내에 존재한다면 압타머 친화 복합체가 형성되고;
(b) 제1 포획 성분을 포함하는 제1 고체 지지체에 상기 혼합물을 노출시켜 제1 태그가 제1 고체 지지체의 제1 포획 성분과 결합하도록 하고;
(c) 상기 제1 고체 지지체와 결합되지 않은, 상기 혼합물 내 성분을 제거하고;
(d) 상기 제1 고체 지지체로부터 압타머 친화 복합체 및 비착물화된 압타머를 방출시키고;
(e) 상기 방출된 압타머 친화 복합체의 표적 분자에 제2 태그를 부착하고;
(f) 제2 포획 성분을 포함하는 제2 고체 지지체에 제2 태그가 부착된 압타머 친화 복합체를 노출시켜 제2 태그에 의해 상기 압타머 친화 복합체가 제2 고체 지지체의 제2 포획 성분과 결합하도록 하고;
(g) 제2 고체 지지체와 결합되지 않은 비착물화된 압타머를 압타머 친화 복합체로부터 분리하고; 및
(h) 상기 압타머 친화 복합체의 압타머를 검출함으로써 상기 표적 분자를 검출하는 것;
을 포함하는, 시료에 존재할 수 있는 표적 분자를 검출하기 위한 방법. - 제1항에 있어서,
상기 (h) 단계는 압타머를 검출하기 전에 상기 압타머 친화 복합체로부터 압타머를 분리하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 태그는 제2 태그와 같고, 제2 태그는 (b) 단계 후 및 (f) 단계 전에 표적 분자에 첨가되며, 제2 태그의 첨가 전에 제1 포획 성분을 블록킹(blocking)하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 태그는 제2 태그와 서로 다르고, 제2 태그는 (f) 단계 전에 표적 분자에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
(a) 단계 이후와 (d) 단계 전에 동적 유발(kinetic challenge)을 유도하는 것을 더 포함하며,
여기에서 상기 동적 유발은 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 희석하는 것, 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물에 경쟁자를 첨가하는 것; 그리고 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 희석하고 경쟁자를 첨가하는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 동적 유발은 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 희석하고, 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 30분 및 60분보다 길거나 같은 시간으로 이루어지는 군으로부터 선택된 시간 동안 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 동적 유발은 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 희석하고, 비특이적 복합체의 측정 농도에 대한 압타머 친화 복합체의 측정 농도의 비율이 증가되는 시간 동안 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 동적 유발은 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물에 경쟁자를 첨가하고, ≥ 30초, ≥ 1분, ≥ 2분, ≥ 3분, ≥ 4분, ≥ 5분, ≥ 10분, ≥ 30분 및 ≥ 60분으로 이루어지는 군으로부터 선택된 시간 동안 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 동적 유발은 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물에 경쟁자를 첨가하고, 비특이적 복합체의 측정 농도에 대한 압타머 친화 복합체의 측정 농도의 비율이 증가되는 시간 동안 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 동적 유발은 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 희석하고, 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물에 경쟁자를 첨가하고, 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 30분 및 60분보다 길거나 같은 시간으로 이루어지는 군으로부터 선택된 시간 동안 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 동적 유발은 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 희석하고, 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물에 경쟁자를 첨가하고, 비특이적 복합체의 측정 농도에 대한 압타머 친화 복합체의 측정 농도의 비율이 증가되는 시간 동안 압타머 친화 복합체를 포함하는 혼합물을 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 동적 유발은 경쟁자의 도입을 포함하며, 상기 경쟁자는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), 헤파린(heparin), 청어 정자 DNA(herring sperm DNA), 연어 정자 DNA(salmon sperm DNA), 덱스트란 설페이트(destran sulfate), 다중 음이온(polyanion), 어베이식 포스포디에스테르 폴리머(abasic phosphodiester polymer), dNTP 및 피로포스페이트(pyrophophate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 압타머 친화 복합체의 분리 속도는 30분보다 길거나 같은 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 압타머 친화 복합체의 분리 속도는 30분 내지 240분 사이인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 압타머 친화 복합체의 분리 속도는 ≥ 30분, ≥ 60분, ≥ 90분, ≥ 120분, ≥ 150분, ≥ 180분, ≥ 210분, 및 ≥ 240분으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 압타머는 Q-PCR, MS 및 혼성화로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 검출되고 정량화되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 Q-PCR은 TaqMan® PCR, PCR 공정 동안의 삽입성 형광 염료(intercalating fluorescent dye), 또는 PCR 공정 동안의 분자 비콘(molecular beacon)을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
압타머에 검출가능한 부분(detectable moiety)을 더 첨가하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제18항에 있어서,
상기 검출가능한 부분은 염료(dye), 양자점(quantum dot), 방사능표지(radiolabel), 전기화학적 작용기(electrochemical functional group), 효소(enzyme) 및 효소 기질(enzyme substrate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제19항에 있어서,
상기 염료는 형광 염료인 것을 특징으로 하는 방법. - 제19항에 있어서,
상기 효소는 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase) 또는 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 압타머는 단일 가닥 핵산 또는 이중 가닥 핵산인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 압타머는 DNA, RNA 또는 DNA와 RNA 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 압타머는 적어도 하나의 화학적 변형을 추가적으로 포함하며, 여기에서 상기 적어도 하나의 화학적 변형은 리보오스 위치, 데옥시리보오스 위치, 포스페이트 위치 및 염기 위치로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상의 위치에서의 화학적 치환인 것을 특징으로 하며, 여기에서 상기 화학적 변형은 2'-위치의 당 변형(2'-position sugar modification), 2'-플루오로(2'-F), 2'-O-메틸(2'-OMe), 8-위치의 퓨린 변형, 시토신 엑소시클릭 아민(exocyclic amines)에서의 변형, 5-브로모우라실(5-bromouracil)의 치환, 5-브로모데옥시우리딘(5-bromodeoxyuridine)의 치환, 5-브로모데옥시시티딘(5-bromodeoxycytidine)의 치환, 기본골격(backbone) 변형, 메틸화, 3' 캡(3' cap) 및 5' 캡(5' cap)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 표적 분자는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 보조인자(cofactors), 약물, 염료, 및 성장 인자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 표적 분자는 단백질 또는 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 시료는 생물학적 샘플, 환경 샘플, 화학 샘플, 약제학적 샘플, 식품 샘플, 농업 샘플 및 가축 샘플로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 시료는 전혈(whole blood), 백혈구, 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells), 혈장, 혈청, 가래(sputum), 입김(breath), 소변, 정액, 침(saliva), 뇌막액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 림프액(lymph fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 세포, 세포 추출물, 대변(stool), 조직 추출물, 조직 생검, 및 뇌척수액으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 시료는 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 태그 및 상기 제2 태그는 각각 폴리뉴클레오티드(polynucleotide), 폴리펩티드(polypeptide), 펩티드 핵산(peptide nucleic acid), 잠금 핵산(locked nucleic acid), 올리고당(oligosaccharide), 과당(polysaccharide), 항체(antibody), 애피바디(affibody), 항체 모조체(antibody mimic), 세포 수용체(cell receptor), 리간드(ligand), 지질(lipid), 비오틴(biotin), 아비딘(avidin), 스트렙아비딘(strepavidin), 엑스트라비딘(Extravidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 금속(metal), 및 히스티딘(histidine)으로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 포획 성분 및 제2 포획 성분은 각각 폴리뉴클레오티드(polynucleotide), 폴리펩티드(polypeptide), 펩티드 핵산(peptide nucleic acid), 잠금 핵산(locked nucleic acid), 올리고당(oligosaccharide), 과당(polysaccharide), 항체(antibody), 애피바디(affibody), 항체 모조체(antibody mimic), 세포 수용체(cell receptor), 리간드(ligand), 지질(lipid), 비오틴(biotin), 아비딘(avidin), 스트렙아비딘(strepavidin), 엑스트라비딘(Extravidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 금속(metal), 히스티딘(histidine)으로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 태그는 방출가능한 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 고체 지지체 및 제2 고체 지지체는 각각 폴리머 비드(polymer bead), 아가로오스 비드(agarose bead), 폴리스티렌 비드(polystyrene bead), 아크릴아마이드 비드(acrylamide bead), 솔리드 코어 비드(solid core bead), 다공성 비드(porous bead), 상자성 비드(paramagnetic bead), 유리 비드(glass bead), 조절된 공극을 가지는 비드(controlled pore bead), 미량역가 웰(microtitre well), 시클로-올레핀 공중합체 기질(cyclo-olefin copolymer substrate), 막(membrane), 플라스틱 기질(plastic substrate), 나일론(nylon), 랭뮤어-블러짓 필름(Langmuir-Blodgett films), 유리, 게르마늄 기질(germanium substrate), 실리콘 기질(silicon substrate), 실리콘 웨이퍼 칩(silicon wafer chips), 유통 칩(flow through chips) 및 마이크로 비드(microbead), 폴리테트라플로오로에틸렌 기질(polytetrafluoroethylene substrate), 폴리스티렌 기질(polystyrene substrate), 갈륨 비소 기질(galliu m arsenide substrate), 금 기질 및 은 기질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 압타머를 정량함으로써 상기 표적을 정량하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
압타머의 검출은 제3 고체 지지체에 압타머를 혼성화시키는 것을 포함하고, 여기에서 상기 제3 고체 지지체는 다수의 위치를 지정할 수 있는 부분(addressable feature)을 포함하며, 상기 부분 중 적어도 하나는 압타머 내에 포함된 서열에 상보적인 지지체 상에 배열된 적어도 하나의 포획 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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