PT2489743E - Aptâmeros com uridinas substituídas por 5-(n-naftilo) - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO APTÂMEROS COM URIDINAS SUBSTITUÍDAS POR 5—(N—NAFTILO)
CAMPO DA INVENÇÃO A presente divulgação refere-se, em geral, a métodos para a geração de aptâmeros e fotoaptâmeros possuindo propriedades melhoradas e aos aptâmeros e fotoaptâmeros melhorados assim gerados. Em particular, a presente divulgação descreve aptâmeros com taxa de dissociação lenta que são altamente específicos para um alvo de interesse. A divulgação descreve a composição desses aptâmeros com taxa de dissociação lenta, bem como métodos para a sua seleção. Além disso, a divulgação descreve constructos de aptâmeros com funcionalidades melhoradas para métodos de deteção. Além disso, a divulgação descreve aplicações habilitadas por estes aptâmeros melhorados.
ANTECEDENTES A seguinte descrição proporciona um sumário de informações relevantes para a presente divulgação e não constitui uma concessão que qualquer informação fornecida ou publicações aqui referenciadas sejam técnica anterior à invenção reivindicada. 0 processo SELEX é um método para a seleção in vitro de moléculas de ácido nucleico que são capazes de se ligar com elevada especificidade a moléculas alvo e é descrito na Patente U.S. N.° 5.475.096, intitulada "Nucleic Acid
Ligands" e Patente U.S. N.° 5.270.163 (veja-se também o documento WO 91/19813) intitulado "Nucleic Acid Ligands". Estas patentes, em conjunto, referem-se aqui como as Patentes SELEX, que descrevem métodos para criar um aptâmero para qualquer molécula alvo desejável. O processo SELEX básico tem sido modificado de forma a alcançar uma série de objetivos específicos. Por exemplo, a Patente U.S. N.° 5.707.796, intitulada "Method for
Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure", descreve a utilização do processo SELEX em conjunção com eletroforese em gel para selecionar moléculas de ácidos nucleicos com características estruturais específicas, tais como ADN dobrado. A Patente U.S. N.° 5.580.737, intitulada "High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine" descreve um método para a identificação de aptâmeros altamente específicos capazes de discriminar entre moléculas estreitamente relacionadas, denominado Counter-SELEX. A Patente U.S. N.° 5.567.588, intitulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX", descreve um método baseado em SELEX que consegue uma partição altamente eficiente entre os oligonucleótidos que têm alta e baixa afinidade para uma molécula alvo. A Patente U.S. N.° 5.496.938, intitulada "Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev", descreve métodos para a obtenção de aptâmeros melhorados de ser ter realizado o SELEX. A Patente U.S. N.° 5 705 337, intitulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX", descreve métodos para a ligação covalente de um aptâmero ao seu alvo. O processo SELEX engloba a identificação de aptâmeros de alta afinidade contendo nucleótidos modificados que conferem características melhoradas no ligando, tais como estabilidade in vivo melhorada ou características de distribuição melhoradas. Exemplos de tais modificações incluem substituições químicas na ribose e/ou fosfato e/ou posições das bases. Os aptâmeros identificados pelo processo SELEX contendo nucleótidos modificados são descritos na Patente U.S. N.° 5.660.985, intitulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", que descreve oligonucleótidos contendo derivados de nucleótidos quimicamente modificados nas posições 5'- e 2'- de pirimidinas. A Patente U.S. N.° 5.580.737, veja-se acima, descreve aptâmeros altamente específicas contendo um ou mais nucleótidos modificados com 2'-amino (2'-NH2), 2'-fluoro (2 ' —F), e/ou 2'-0-metilo (2 ' — OMe) .
Mais modificações do processo SELEX são descritas na Patente U.S. N.° 5.763.177, Patente U.S. N.° 6.001.577, e Patente U.S. N.° 6.291.184, cada uma das quais intituladas "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX; " veja-se também, por exemplo, Patente U.S. N.° 6.458.539, intitulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands". Estas patentes, em conjunto, referem-se aqui como "as Patentes FotoSELEX," que descrevem vários métodos SELEX para a seleção de aptâmeros contendo grupos funcionais fotorreativos capazes de ligação e/ou fotoligação cruzada a e/ou fotoinativação de uma molécula alvo. Os aptâmeros fotorreativos resultantes são referidos como aptâmeros de fotoligação cruzada ou fotoaptâmeros.
Embora estes processos SELEX e fotoSELEX sejam úteis, existe sempre a necessidade de processos que levem à melhoria das propriedades de aptâmeros gerados a partir de técnicas de seleção in vitro. Por exemplo, existe a necessidade de aptâmeros para moléculas alvo com melhores afinidades de ligação do que aqueles alcançados com nucleótidos de ADN e ARN de ocorrência natural, bem como de métodos para produzir tais aptâmeros. Para muitas aplicações, tais como, por exemplo, ensaios in vitro, diagnósticos, terapêuticas ou aplicações imagiológicas, é de interesse produzir aptâmeros com taxas de dissociação lentas do complexo de afinidade aptâmero/alvo. Diversas técnicas têm sido propostas para a produção de tais reagentes (veja-se, por exemplo, os documentos WO 99/27133 e US 2005/0003362). No entanto, estes processos de seleção não discriminam entre a seleção de reagentes que têm cinéticas de associação com o alvo rápidas (ou seja, taxas de associação rápidas) e a seleção de reagentes que têm cinéticas de dissociação do alvo lentas (ou seja, taxas de dissociação lentas) . Assim, existe a necessidade de novos processos e técnicas que favoreçam a seleção de aptâmeros com taxas de dissociação lentas, enquanto se inibe a seleção de aptâmeros que simplesmente têm uma taxa de associação com o alvo rápida.
Latham et al. (Nucleic Acids Research Special Publication (1994), 22(14):2817-2822) divulgam, aptâmeros obteníveis através de procedimentos SELEX que incorporam pirimidinas modificadas na sua posição 5, nomeadamente 5-(1-pentinil)-2'-desoxiuridina.
Finalmente, existe a necessidade de constructos de aptâmeros que incluam diferentes funcionalidades incorporadas. Estas funcionalidades podem incluir marcadores para imobilização, etiquetas para deteção, meios para promover ou controlar a separação, etc.
SUMÁRIO A presente divulgação descreve novos aptâmeros e métodos para produzir e utilizar tais aptâmeros. Em particular, a divulgação descreve aptâmeros com taxas de dissociação lentas (taxa de dissociação lenta), aptâmeros com taxas de dissociação lentas contendo pirimidinas modificadas em C-5, e processos para a seleção de aptâmeros com taxas de dissociação lentas por diluição, por adição de um competidor, ou por combinação de ambas as abordagens. Adicionalmente, aptâmeros com taxas de dissociação lentas para vários alvos, tais como proteínas e péptidos, são descritos. Aptâmeros com taxas de dissociação lentas com características estruturais e temperaturas de fusão únicas, são também descritos. A divulgação também descreve aptâmeros com taxas de dissociação lentas com grupos funcionais fotorreativos, aptâmeros que são refratários à presença de materiais polianiónicos e um processo de seleção destes aptâmeros, bem como aptâmeros construídos com uma variedade de outras funcionalidades para melhorar a sua utilidade em várias aplicações. A presente divulgação descreve métodos SELEX melhorados para gerar aptâmeros que são capazes de se ligarem a moléculas alvo. Mais especificamente, a presente divulgação descreve métodos para a produção de aptâmeros e/ou fotoaptâmeros com taxas de dissociação das suas respetivas moléculas alvo mais lentas do que aptâmeros e fotoaptâmeros obtidos com métodos SELEX anteriores. Geralmente, depois de contactar a mistura candidata com a molécula alvo e permitir-se que ocorra a formação de complexos ácido nucleico-alvo, um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas é introduzido, em que os complexos ácido nucleico-alvo com taxas de dissociação rápidas dissociar-se-ão e não se reformarão, enquanto os complexos com taxas de dissociação lentas permanecerão intactos. Métodos para a introdução de um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas incluem, mas não estão limitados a, adição de moléculas competidoras à mistura de ácidos nucleicos e moléculas alvo, diluição da mistura de ácidos nucleicos e moléculas alvo, ou uma combinação de ambos. A divulgação descreve ainda aptâmeros e fotoaptâmeros obtidos utilizando estes métodos.
Numa disposição, o método compreende a preparação de uma mistura candidata de ácidos nucleicos; o contacto da mistura candidata com uma molécula alvo, em que os ácidos nucleicos com as afinidades mais elevadas para a molécula alvo unem-se, preferencialmente, à molécula alvo, formando complexos ácido nucleico-molécula alvo; introdução de um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas para induzir a dissociação de complexos ácido nucleico-molécula alvo com taxas de dissociação relativamente rápidas; partição dos restantes complexos ácido nucleico-moléculas alvo unidos de ácidos nucleicos livres na mistura candidata; e identificação dos ácidos nucleicos que se uniram à molécula alvo. 0 processo pode ainda incluir a etapa iterativa de amplificação dos ácidos nucleicos que se unem à molécula alvo para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida com ácidos nucleicos que se unem à molécula alvo, e ainda produzir complexos ácido nucleico-molécula alvo com taxas de dissociação lentas.
Numa outra disposição, a mistura de ácidos nucleicos candidata inclui ácidos nucleicos contendo bases de nucleótidos modificadas que podem auxiliar a formação de complexos ácido nucleico-alvo modificados possuindo taxas de dissociação lentas. Métodos melhorados para a realização de SELEX com nucleótidos modificados, incluindo nucleótidos que contêm grupos funcionais fotoativos ou outros, ou nucleótidos que contêm espaços reservados para os grupos fotoativos são divulgados no Pedido U.S. N.° de Série 12/175.388, depositado em 17 de julho de 2008 e intitulado "Improved SELEX and PHOTOSELEX", que está a ser depositado concorrentemente com o presente pedido. Nucleótidos com espaços reservados também podem ser utilizados para a introdução de nucleótidos modificados que não são fotorreativos a meio do SELEX ou depois do SELEX.
Os vários métodos e etapas aqui descritos podem ser utilizados para gerar um aptâmero capaz de ou (1) ligar-se a uma molécula alvo ou (2) ligar-se a uma molécula alvo e, subsequentemente, formar uma ligação covalente com a molécula alvo após irradiação com luz no espectro UV ou visível.
Os vários métodos e etapas aqui descritos podem ser utilizados para gerar um aptâmero capaz de modificar a atividade biológica de uma molécula alvo, através de ligação e/ou ligação cruzada com a molécula alvo. Numa forma de realização, um aptâmero para uma molécula alvo única associado a ou relevante para um processo de doença é identificado. Este aptâmero pode ser utilizado como um reagente de diagnóstico quer in vitro quer in vivo. Numa outra forma de realização, um aptâmero para uma molécula alvo associado a um estado de doença pode ser administrado a um indivíduo e usado para tratar a doença in vivo. Os aptâmeros e fotoaptâmeros aqui identificados podem ser utilizados em quaisquer técnicas ou procedimentos ou ensaios de diagnóstico, imagiológicos, rastreio de alta capacidade ou validação de alvo para os quais aptâmeros, oligonucleótidos, anticorpos e ligandos, sem limitação, podem ser utilizados.
Aptâmeros anteriores que não têm as propriedades de taxas de dissociação lentas dos aptâmeros da presente invenção têm sido utilizados para uma variedade de propósitos. Em quase todas essas utilizações, aptâmeros com taxas de dissociação lentas terão desempenhos melhorados em relação a aptâmeros não selecionadas para ter propriedades de taxas de dissociação lentas. 0 aptâmero Macugen®, (veja-se, por exemplo, a Patente U.S. N. 0 6.168.778; Patente U.S. N.° 6.051.698; Patente U.S. N.° 6.426.335; e Patente U.S. N.° 6.962.784) foi aprovado para o tratamento de degeneração macular, e funções devido à sua afinidade específica para VEGF. Outros aptâmeros têm sido estudados e/ou estão em desenvolvimento para utilização como agentes terapêuticos. Aptâmeros não selecionados para terem propriedades de taxas de dissociação lentas têm também sido utilizados em muitas aplicações de diagnóstico e imagiologia (veja-se, por exemplo, a Patente U.S. N.° 5.843.653; Patente U.S. N.° 5.789.163; Patente U.S. N.°. 5.853.984; Patente U.S. N.° 5.874.218; Patente U.S. N.° 6.261.783; Patente U.S. N.° 5.989.823; Patente U.S. N.° 6.177.555; Patente U.S. N.° 6.531.286), rastreio de alta capacidade (veja-se, por exemplo, Patente U.S. N.° 6.329.145; Patente U.S. N.° 6.670.132; Patente U.S. N.° 7.258.980) e em kits de PCR (veja-se, por exemplo, a Patente U.S. N.° 6.183.967; Patente U.S. N.° 6.020.130; Patente U.S. N.° 5.763.173;
Patente U.S. N.° 5.874.557; Patente U.S. N.° 5.693.502.) Os aptâmeros com taxas de dissociação lentas desta divulgação podem ser usados em qualquer utilização de diagnóstico, terapêutica, ou imagiológica ou qualquer outra, para a qual anticorpos, aptâmeros e pares de ligação ao ligando têm sido utilizados. A divulgação proporciona aptâmeros e fotoaptâmeros identificados pelos métodos melhorados aqui divulgados, kits de diagnóstico que incluem tais aptâmeros e fotoaptâmeros, e utilizações terapêuticas e de diagnóstico de tais aptâmeros e fotoaptâmeros. Os novos aptâmeros e fotoaptâmeros com taxas de dissociação lentas identificados utilizando os métodos descritos podem ser usados numa variedade de ensaios, incluindo ensaios que utilizam matrizes planas, esferas e outros tipos de suportes sólidos. Os ensaios podem ser utilizados numa variedade de contextos, incluindo aplicações de investigação de ciências da vida, aplicações de diagnóstico clinico, (por exemplo, um teste de diagnóstico para uma doença, ou um teste de "bem estar" em saúde preventiva); ensaios de ALONA e UPS, e aplicações imagiológicas in vivo. Para algumas aplicações, ensaios multiplexados empregando os aptâmeros e fotoaptâmeros descritos podem ser utilizados.
Em algumas formas de realização, os aptâmeros com taxas de dissociação lentas (ou fotoaptâmeros) aqui descritos podem ser utilizados como agentes de contraste intravenosos ou orais para explorações por TAC ou outras aplicações imagiológicas. Explorações por TAC são usadas no diagnóstico de distúrbios musculares e ósseos, localização de coágulos sanguíneos, deteção de hemorragias internas, monitorização de doenças, tais como cancro, etc. Os aptâmeros com taxas de dissociação lentas podem ser marcados com um componente detetável por exploração por TAC, tal como, por exemplo, iodo, bário, ou gastrografin. Além de transportar o componente detetável, o aptâmero podem ser concebidos para dirigir esse componente a um tecido especifico ou alvo desejado. 0 aptâmero pode servir para concentrar ou localizar o componente detetável e, assim, melhorar a relação sinal-ruído, por aumento do sinal disponível. Porque a taxa de dissociação do aptâmero pode ser suficientemente lenta, a duração da exploração pode ser aumentada, e a relação sinal-ruído da exploração pode ser melhorada. A especificidade do aptâmero para o alvo pode também melhorar a relação sinal-ruído nestas aplicações imagiológicas.
Numa forma de realização, o aptâmero com taxa de dissociação lenta é marcado com um material diamagnético ou paramagnético. Nesta forma de realização, o aptâmero marcado pode ser utilizado para melhorar o desempenho de uma imagem por ressonância magnética (IRM) . A IRM está particularmente bem adaptada para a imagiologia de áreas e tecidos seletivos, pequenos, com elevado teor de água ou para monitorizar o fluxo de sangue. A especificidade dos aptâmeros com taxas de dissociação lentas pode melhorar a localização do reagente de IRM para uma secção de tecido desejada. À semelhança, aptâmeros com taxas de dissociação lentas podem ser modificados com materiais, tal como flúor, carbono-11, oxigénio-15, ou nitrogénio-13, para a utilização explorações por PET. Numa outra forma de realização, os aptâmeros podem ser marcados com materiais ativos IR que podem ser utilizadas para imagiologia de infravermelhos. É também contemplado que aptâmeros com taxas de dissociação lentas possam ser marcados para utilização noutras modalidades imagiológicas.
Numa forma de realização, os aptâmeros com taxas de dissociação lentas podem ser utilizados como um reagente muito sensível e específico para incorporação numa variedade de métodos ou kits de diagnóstico in vitro. Em algumas formas de realização, os aptâmeros com taxas de dissociação lentas são utilizados como substitutos de anticorpos numa série de doenças infecciosas, ou de outro tipo, em métodos de deteção de doenças onde o aptâmero para o alvo de interesse inclui um material detetável ou um componente de imobilização ou de captura ou ambos. Nestas formas de realização, depois de o aptâmero do kit ser misturado com um espécime clinico, uma variedade de formatos de ensaio podem ser utilizados. Numa forma de realização, o aptâmero inclui também um marcador detetável, tal como um fluoróforo. Noutras formas de realização, o formato de ensaio pode incluir extinção de fluorescência, métodos de hibridização, citometria de fluxo, espectroscopia de massa, métodos de inibição ou competição, ensaios de oligonucleótidos ligados a enzimas, SPR, métodos de ondas evanescentes, etc. Em algumas formas de realização, o aptâmero é proporcionado no kit em solução. Noutras formas de realização, o aptâmero no kit é imobilizada sobre um suporte sólido utilizado em conjugação com o ensaio para testar o espécime. Em várias formas de realização, o suporte sólido é concebido para a deteção de um ou mais alvos de interesse. Noutras formas de realização, o kit pode ainda incluir reagentes para a extração do alvo de interesse, reagentes para a amplificação do aptâmero, reagentes para a realização de lavagens, reagentes de deteção, etc.
Numa outra forma de realização, os aptâmeros com taxas de dissociação lentas podem ser utilizados em estudos imagiológicos terapêuticos. Durante o desenvolvimento de novos compostos terapêuticos, é muitas vezes difícil avaliar determinadas características do composto, tais como, por exemplo, biodistribuição, taxa de eliminação, biodisponibilidade, interações fármaco/alvo in vivo, etc. Em muitos casos, se um material detetável adequado fosse utilizado para modificar o composto terapêutico, estudos imagiológicos poderiam ser utilizados para avaliar todas estas características. Apesar da modificação direta de um composto terapêutico frequentemente inibir a sua capacidade de interação com o seu alvo e, assim, reduzir a eficácia, o pequeno tamanho e especificidade personalizada de um aptâmero tornam-no potencialmente bem adaptado para reagir com um composto terapêutico (por exemplo, um anticorpo ou outro agente terapêutico baseado em proteínas), minimizando quaisquer efeitos indesejáveis sobre a eficácia terapêutica do composto. Para avaliar tais características, como a biodistribuição e a taxa de eliminação, o complexo aptâmero/agente terapêutico pode sobreviver durante um período de tempo prolongado. Estes tipos de estudos podem ser simplificados nos casos em que o composto terapêutico é um aptâmero com taxa de dissociação lenta. Em várias formas de realização, os aptâmeros utilizados em aplicações terapêuticas, imagiológicas e de diagnóstico podem incluir várias modificações, tais como, por exemplo, 2'-fluoro, e outras modificações, para aumentar a estabilidade do aptâmero após exposição a vários componentes que podem estar presentes numa amostra de teste ou in vivo, tal como, por exemplo, nucleases e outras amostras ou componentes de fluidos corporais.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. IA ilustra um método SELEX exemplificativo e a FIG. 1B ilustra um método SELEX exemplificativo que inclui a etapa ou processo de incorporação de um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas. FIG. 2 ilustra o modelo de aptâmero representativo, iniciador e sequências de oligonucleótidos complementares utilizados na divulgação. Os oligonucleótidos foram preparados através de técnicas padrão de síntese em fase sólida. B = dT-biotina. A FIG. 3 ilustra histogramas de constantes de taxa de dissociação para aptâmeros de afinidade selecionados sem (A) e com (B), um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas conforme descrito no Exemplo 2.
As FIGs. 4A e B mostram oligonucleótidos que foram utilizados para preparar as misturas candidatas ou realizar várias etapas no processo de seleção descrito nos Exemplos 3 e 4. Os oligonucleótidos foram preparados através de técnicas padrão de síntese em fase sólida. Duas sequências de misturas candidatas foram usadas neste exemplo, designadas 1 e 2. B = dT-biotina. Cromóforos BrdU (5-bromo-dUTP), Antraquinona (AQ) e psoraleno (Psor) foram comprados como fosforamidites e adicionados à terminação 5' do iniciador direto durante a síntese. 4-azido-2-nitro-anilina (ANA) foi preparada como um derivado de carbonato de paranitro-fenilo e acoplada a uma fosforamidite hexilamina 5' após a síntese. Duas sequências de misturas candidatas foram usadas neste exemplo, designadas 1 e 2. (A) Modelo 1 foi utilizado com misturas candidatas contendo BrdU, AQ e ANA em 5' , e (B) Modelo 2 foi utilizados com misturas candidatas contendo Psor em 5'. A FIG. 5 ilustra estruturas químicas dos cromóforos acoplados à terminação 5' do iniciador direto, conforme ilustrado nas FIGS. 4A e 4B. A FIG. 6 ilustra uma análise PAGE de atividade de ligação cruzada de uma biblioteca enriquecida com TIMP-3 5'ANA/BzdU utilizando FotoSELEX fixo 5' descrito no Exemplo 3. 0 gel ilustra a separação de aptâmero livre (Af), aptâmero de ligação cruzada intramolecular (Af*), e complexos proteína:aptâmero de ligação cruzada (P:A). A FIG. 7 é uma lista de mais de 500 alvos para os quais aptâmeros com taxas de dissociação lentas foram identificados.
As FIGS. 8A a 8D ilustram constructos de aptâmeros que contêm uma variedade de funcionalidades diferentes e opcionais, incluindo etiquetas de imobilização, marcadores, frações de fotoligação cruzada, separadores e frações libertáveis.
As FIGs. 9A a 9F ilustram exemplos de constructos de aptâmeros incluindo um elemento libertável ou clivável, uma etiqueta (por exemplo, biotina), um separador, e um marcador (por exemplo, Cy3) . A FIG. 10 ilustra os constructos de aptâmeros e iniciadores descritos nesta divulgação. Cy3 representa um corante de Cianina 3, PC um linker fotoclivável, ANA um grupo de ligação cruzada fotorreativo, (AB)2 um par de resíduos de biotina separados por resíduos de dA, e (T)8 um linker de poli dT. Os constructos de iniciadores são complementários à região fixa completa 3' dos constructos de aptâmeros.
As FIGs. 11A a 11C ilustram curvas de dose-resposta para aptâmeros com taxas de dissociação lentas versus aptâmeros tradicionais para três alvos diferentes.
As FIGs. 12A e 12B ilustram curvas de desempenho para um aptâmero com taxa de dissociação lenta em que o alvo foi um péptido. A FIG. 13 ilustra um gráfico da temperatura de fusão medida de uma série de aptâmeros com taxas de dissociação lentas em relação à temperatura de fusão prevista. A FIG. 14 descreve as modificações de bases de nucleótidos incluídos nesta divulgação. Os grupos R que podem ser utilizados são descritos em adição aos linkers (X) que podem ser utilizados entre o ponto de fixação do nucleótido e o grupo R. As posições para modificação dos nucleótidos são também indicadas. A FIG. 15 ilustra um gráfico utilizado na determinação da constante de ligação para um aptâmero contendo pirimidinas modificadas em C-5.
DESCRIÇÃO DETALHADA A prática da invenção aqui revelada emprega, a menos que indicado em contrário, métodos convencionais de química, microbiologia, biologia molecular e técnicas de ADN recombinante dentro do nível de habilidade na técnica. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Veja-se, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Edição atual); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Edição atual); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Edição atual); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Edição atual).
Todas as publicações, documentos de patentes publicadas e pedidos de patente citados neste relatório descritivo são indicativos do nível de habilidade na(s) técnicas(s) à qual a invenção pertence.
Como utilizado neste relatório descritivo, incluindo as reivindicações anexas, as formas singulares "um/uma", "um/uma", e "o/a" incluem referências plurais, a menos que o conteúdo dite claramente o contrário, e são usadas alternadamente com "pelo menos um/uma" e "um/uma ou mais". Assim, referência a "um aptâmero" inclui misturas de aptâmeros, referência a "uma sonda" inclui misturas de sondas, e semelhantes.
Como aqui utilizado, o termo "cerca de" representa uma modificação ou variação insignificante dos valores numéricos de tal modo, que a função básica do item ao qual o valor numérico se refere é inalterada.
Como aqui utilizados, os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "contém", "contendo", e quaisquer variações destes, destinam-se a abranger uma inclusão não exclusiva, de tal modo que um processo, método, produto por processo, ou composição de matéria que compreende, inclui, ou contém um elemento ou lista de elementos não inclui apenas aqueles elementos, mas pode incluir outros elementos não expressamente listados ou inerentes a tal processo, método, produto por processo, ou composição de matéria.
Como aqui utilizado, "ligando de ácido nucleico", "aptâmero" e "clone" são utilizados indiferentemente para se referirem a um ácido nucleico de ocorrência não natural que tem ou pode ter uma ação desejável numa molécula alvo. Uma ação desejável inclui, mas não está limitado a, ligação do alvo, alteração catalítica do alvo, reação com o alvo de uma forma que modifica ou altera o alvo ou a atividade funcional do alvo, vinculação covalente ao alvo (como num inibidor suicida) , e facilitação da reação entre o alvo e uma outra molécula. Numa forma de realização, a ação consiste em afinidade de ligação específica para uma molécula alvo, tal molécula alvo sendo uma estrutura química tridimensional, que não um polinucleótido, que se liga ao aptâmero através de um mecanismo que é predominantemente independente do emparelhamento de bases ou ligação de hélice tripla de Watson/Crick, em que o aptâmero não é um ácido nucleico possuindo a função fisiológica conhecida de se ligar através de uma molécula alvo. Aptâmeros incluem ácidos nucleicos que são identificados a partir de uma mistura candidata de ácidos nucleicos, sendo o aptâmero um ligando de um determinado alvo, pelo método compreendendo: (a) contactar a mistura candidata com o alvo, em que ácidos nucleicos com uma afinidade aumentada para o alvo relativamente a outros ácidos nucleicos na mistura candidata podem ser separados do restante da mistura candidata; (b) partição dos ácidos nucleicos com afinidade aumentada e/ou taxa de dissociação lenta do restante da mistura candidata; e (c) amplificar os ácidos nucleicos com afinidade aumentada para se produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em ligandos, onde aptâmeros da molécula alvo são identificados. Reconhece-se que as interações de afinidade são uma questão de grau; no entanto, neste contexto, a "afinidade de ligação especifica" de um aptâmero para o seu alvo significa que o aptâmero se liga ao seu alvo, geralmente, com um grau muito mais elevado de afinidade do que se pode ligar a outros, não alvos, componentes numa mistura ou amostra. Um "aptâmero" ou "ligando de ácido nucleico" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de molécula de ácido nucleico que tem uma sequência de nucleótidos particular. Um aptâmero pode incluir qualquer número apropriado de nucleótidos. "Aptâmeros" refere-se a mais do que um tal conjunto de moléculas. Diferentes aptâmeros podem ter ou o mesmo número ou um número diferente de nucleótidos. Aptâmeros podem ser de ADN ou ARN e talvez em cadeia simples, cadeia dupla, ou conter regiões de cadeia dupla.
Como aqui utilizado, "taxa de dissociação lenta" refere-se ao tempo que demora um complexo aptâmero/alvo para começar a dissociar-se. Isto pode ser expresso como uma semivida, ti/2, ou o ponto no qual 50% do complexo aptâmero/alvo se tenha dissociado. A taxa de dissociação de um aptâmero com taxa de dissociação lenta, expressa como valores ti/2, pode ser cerca de > 30 min., > 60 min., > 90 min., > 120 min., > 150 min., > 180 min., > 210 e cerca de > 240 min.
Numa forma de realização, um método para a produção de uma biblioteca de síntese de ácidos nucleicos compreende: 1) sintetizar os ácidos nucleicos; 2) desproteger os ácidos nucleicos; 3) purificar os ácidos nucleicos; e 4) analisar os ácidos nucleicos. Na etapa de síntese, uma mistura de monómeros é preparada, onde a razão dos diferentes nucleótidos na mistura é optimizada para se produzir razões iguais de cada nucleótido no produto final. Um ou mais dos monómeros na mistura pode compreender um nucleótido modificado. Grupos de proteção de amidite são utilizados neste procedimento e numa forma de realização a concentração do monómero é 0,1 M. Durante a síntese, os cinco grupos de proteção principais são retidos no ácido nucleico do produto. A síntese é conduzida sobre um suporte sólido (vidro de porosidade controlada, CPG) e, pelo menos, cerca de 80 ciclos são concluídos para sintetizar o produto final.
Depois do processo de síntese, o produto de ácido nucleico é desprotegido. Um tampão aquoso de lisina a 1,0 M, pH 9,0, é empregue para clivar sítios apurínicos, enquanto o produto é retido no suporte (vidro de porosidade controlada, CPG) . Estas sequências truncadas clivadas são lavadas duas vezes com água desionizada (dl) . 500 uL de água dl são adicionados depois das duas lavagens como preparação para a etapa de desproteção. Esta etapa envolve o tratamento com 1,0 ml de T-butilamina:metanol:água, 1:1:2, durante 5 horas, 70 °C, seguindo-se congelamento, filtração e evaporação até à secagem. O produto de ácidos nucleicos é purificado com base na hidrofobicidade do grupo de proteção numa coluna de HPLC PRP-3 (Hamilton). Frações apropriadas da coluna foram recolhidas e reunidas, dessalinizadas e evaporadas até à secagem para remover os tampões de eluição voláteis. O produto final é lavado com água por meio de um processo de centrifugação e depois ressuspenso. Finalmente, o material ressuspenso é tratado para se desproteger o produto final. O produto final é caracterizado por composição de bases, extensão de iniciadores, e gel de sequenciação.
Uma mistura de ácidos nucleicos candidata pode também ser produzida por um método enzimático, utilizando uma fase sólida. Numa forma de realização, este método compreende as mesmas etapas básicas descritas acima. Neste caso, o objetivo é a síntese de uma biblioteca antissentido e estas bibliotecas são produzidos com uma modificação de biotina 5'. Todos os processos de síntese restantes são como descrito acima. Uma vez preparada a biblioteca de síntese, os ácidos nucleicos podem ser utilizados numa mistura de extensão de iniciadores contendo um ou mais nucleótidos modificados para produzir a mistura candidata final num método clássico de extensão de iniciadores.
Os aptâmeros podem ser sintetizados pela mesma química utilizada para a síntese de uma biblioteca. No entanto, em vez de uma mistura de nucleótidos, um nucleótido é introduzido em cada etapa da síntese para controlar a sequência final gerada por métodos de rotina. Nucleótidos modificados podem ser introduzidos no processo de síntese nas posições desejadas na sequência. Outras funcionalidades podem ser introduzidas conforme desejado, usando modificações químicas de nucleótidos conhecidas.
Como aqui utilizado, "mistura candidata" é uma mistura de ácidos nucleicos de diferente sequência a partir da qual se seleciona um ligando desejado. A fonte de uma mistura candidata pode ser ácidos nucleicos de ocorrência natural ou fragmentos destes, ácidos nucleicos sintetizados quimicamente, ácidos nucleicos sintetizados enzimaticamente ou ácidos nucleicos obtidos por combinação das técnicas anteriores. Nucleótidos modificados, tais como nucleótidos com grupos fotorreativos ou outras modificações, podem ser incorporados na mistura candidata. Adicionalmente, um processo SELEX pode ser usado para produzir uma mistura candidata, isto é, um primeiro experimento de processo SELEX pode ser usado para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em ligandos que é utilizada como a mistura candidata num segundo experimento de processo SELEX. A mistura candidata pode também compreender ácidos nucleicos com um ou mais motivos estruturais comuns. Como aqui utilizado, a mistura candidata é também, por vezes, referida como um "conjunto" ou uma "biblioteca". Por exemplo, um "conjunto de ARN" refere-se a uma mistura candidata que compreende ARN.
Cada ácido nucleico numa mistura candidata pode ter sequências fixas em ambos os lados de uma região ao acaso, para facilitar o processo de amplificação. Os ácidos nucleicos na mistura candidata de ácidos nucleicos podem, cada um, compreender ainda regiões ou sequências de "cauda" fixas nas suas terminações 5' e 3' para prevenir a formação de parasitas de elevada massa molecular durante o processo de amplificação.
Como aqui utilizado, "ácido nucleico", "oligonucleótido" e "polinucleótido" são utilizados indiferentemente para se referirem a um polímero de nucleótidos de qualquer comprimento, e tais nucleótidos podem incluir desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos e/ou análogos ou desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos quimicamente modificados. Os termos "polinucleótido", "oligonucleotídicos" e "ácido nucleico" incluem moléculas de cadeia dupla ou simples, bem como moléculas de tripla hélice.
Se presentes, modificações químicas de um nucleótido podem incluir, sozinhas ou em combinação, modificações de açúcar na posição 2', modificações de pirimidina na posição 5 (por exemplo, 5- (N-benzilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-[2-(1H- indol-3-il)etil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina, cloreto de 5-(N-[1-(3-trimetilamónio)propil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, ou 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'- desoxiuridina), modificações de purina na posição 8, modificações em aminas exocíclicas, substituição de 4-tiouridina, substituição de 5-bromo- ou 5-iodo-uracilo, modificações da estrutura principal, metilações, combinações de emparelhamento de bases incomuns, tais como as isobases isocitidina e isoguanidina, e semelhantes. As modificações podem também incluir modificações em 3' e 5', tais como adição de Cap ou peguilação. Outras modificações podem incluir substituição de um ou mais nucleótidos de ocorrência natural por um análogo, modificações internucleótidos tais como, por exemplo, aqueles com ligações não carregadas (por exemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e aqueles com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aqueles com intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc.), aqueles contendo quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), aquelas contendo agentes alquilantes, e aqueles com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.) . Além disso, qualquer dos grupos hidroxilo normalmente presentes num açúcar pode ser substituído por um grupo fosfonato ou um grupo fosfato; protegido por grupos de proteção padrão; ou ativado para preparar ligações adicionais a nucleótidos adicionais, ou a um suporte sólido. Os grupos OH dos terminais 5' e 3' podem ser fosforilados ou substituídos por aminas, frações orgânicas de grupos de adição de Cap de desde cerca de 1 a cerca de 20 átomos de carbono, ou frações orgânicas de grupos de adição de Cap de desde cerca de 1 a cerca de 20 polímeros de polietilenoglicol (PEG) ou outros polímeros hidrofílicos ou hidrofóbicos biológicos ou sintéticos. Se presente, uma modificação da estrutura nucleotídica pode ser transmitida antes ou após da montagem de um polímero. Uma sequência de nucleótidos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleótido pode ser ainda modificado após polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação.
Os polinucleótidos podem também conter formas análogas de açúcares ribose ou desoxirribose que são geralmente conhecidas na técnica, incluindo 2'-0-metil-, 2'-0-alil-, 2'-fluoro- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbociclico, açúcares α-anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedoeptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleósidos abásicos, tais como metil-ribosídeo. Como notado acima, uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem formas de realização em que fosfato é substituído por P (0)S ("tioato"), P (S) S ("ditioato"), (0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P (0) OR', CO ou CH2 ("f ormacetal") , no qual cada R ou R' é, independentemente, H ou alquilo (1-20 C) substituído ou não substituído contendo uma ligação éter (-0-) , arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo ou araldilo. Nem todas as ligações num polinucleótido necessitam ser idênticas. A substituição de formas análogas de açúcares, purinas e pirimidinas pode ser vantajosa na concepção de um produto final, tal como estruturas principais alternativas, como um esqueleto de poliamida, por exemplo.
Numa forma de realização, a região variável do aptâmero inclui nucleótidos que incluem bases modificadas. Determinados aptâmeros modificados podem ser utilizados em qualquer dos métodos, dispositivos e kits descritos. Estes nucleótidos modificados têm mostrado produzir novos aptâmeros que têm taxas de dissociação dos seus respetivos alvos muito lentas, enquanto mantêm simultaneamente elevada afinidade para o alvo. Numa forma de realização, a posição C-5 das bases pirimidina pode ser modificada. Aptâmeros contendo nucleótidos com bases modificadas têm uma série de propriedades que são diferentes das propriedades dos aptâmeros padrão que incluem apenas nucleótidos de ocorrência natural (isto é, nucleótidos não modificados). Numa forma de realização, o método para a modificação dos nucleótidos inclui a utilização de uma ligação amida. No entanto, outros métodos adequados para modificação podem ser utilizados. Tem sido surpreendentemente observado que a estrutura dos aptâmeros com taxas de dissociação lentas identificados parece não estar inteiramente de acordo com a estrutura prevista através de modelos de emparelhamento de bases padrão. Esta observação é suportada pelo facto de as temperaturas de fusão medidas dos aptâmeros com taxas de dissociação lentas não serem consistentes com as temperaturas de fusão previstas pelos modelos, veja-se Fig. 13. Conforme mostrado, parece não haver nenhuma correlação entre as temperaturas de fusão medidas e as previstas dos aptâmeros com taxas de dissociação lentas. Em média, a temperatura de fusão calculada (Tm) é 6 °C inferior à Tm medida. As temperaturas de fusão medidas indicam que aptâmeros com taxas de dissociação lentas, incluindo aqueles nucleótidos modificados, são mais estáveis do que se poderia prever e potencialmente possuem novas estruturas secundárias. Estes aptâmeros modificados também têm espectros de dicroismo circular diferentes dos dos aptâmeros correspondentes que incluem apenas nucleotideos não modificados. No caso de muitos alvos, aptâmeros com taxas de dissociação lentas para o alvo têm maior probabilidade de ser identificados quando nucleótidos modificados são utilizados na produção da biblioteca inicial ou mistura candidata.
Modificações particulares de pirimidina na posição 5 incluem aquelas descritas nas Patentes U.S. 5.719.273 e 5.945.527, bem como aquelas ilustradas na Fig. 14.
Como aqui utilizado, "ácido nucleico modificado" refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos contendo um ou mais nucleótidos modificados. Em algumas formas de realização pode ser desejável que os nucleótidos modificados sejam compatíveis com o processo SELEX. "Polipéptido", "péptido" e "proteína" são aqui utilizados indiferentemente para se referirem a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. 0 polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados, e/ou pode ser interrompido por ácidos não aminados. Os termos englobam também um polímero de aminoácidos que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligações de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de marcação. Também estão incluídos dentro da definição, por exemplo, polipéptidos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica. Os polipéptidos podem ser cadeias simples ou cadeias associadas.
Como aqui utilizado, "nucleótido fotorreativo" significa qualquer nucleótido modificado que é capaz de fotoligação cruzada com um alvo, tal como uma proteína, após irradiação com luz de determinados comprimentos de onda. Por exemplo, fotoaptâmeros produzidos pelo processo fotoSELEX podem incluir um grupo fotorreativo selecionado a partir dos seguintes: 5-bromouracilo (BrU), 5-iodouracilo (IU), 5-bromoviniluracilo, 5-iodoviniluracilo, 5-azidouracilo, 4-tiouracilo, 5-bromocitosina, 5-iodocitosina, 5-bromovinilcitosina, 5-iodovinilcitosina, 5-azidocitosina, 8-azidoadenina, 8-bromoadenina, 8-iodoadenina, 8-azidoguanina, 8-bromoguanina, 8-iodoguanina, 8-azidohipoxantina, 8-bromohipoxantina, 8-iodohipoxantina, 8-azidoxantina, 8-bromoxantina, 8-iodoxantina, 5-bromodesoxiuridina, 8-bromo-2'-desoxiadenina, 5-iodo-2'-desoxiuracilo, 5-iodo-2'-desoxicitosina, 5 —[ (4 — azidofenacil)tio]citosina, 5-[ (4-azidofenacil)tio]uracilo, 7-deaza-7-iodoadenina, 7-deaza-7-iodoguanina, 7-deaza-7-bromoadenina, e 7-deaza-7-bromoguanina. Uma "pirimidina fotorreativa" significa qualquer pirimidina modificada que é capaz de fotoligação cruzada com um alvo após irradiação com determinados comprimentos de onda. Pirimidinas fotorreativas exemplificativas incluem 5-bromo-uracilo (BrdU), 5-bromo-citosina (BrdC), 5-iodo-uracilo (IdU), e 5-iodo-citosina (IdC). Em várias formas de realização, o grupo funcional fotorreativo irá absorver comprimentos de onda de luz que não são absorvidos pelo alvo ou as porções não modificadas do oligonucleótido. "SELEX" refere-se a um processo que combina a seleção dos ácidos nucleicos que interagem com um alvo de uma maneira desejável (por exemplo, ligando-se a uma proteína) com a amplificação desses ácidos nucleicos selecionados. Um ciclo iterativo opcional das etapas de seleção/amplificação permite a seleção de um ou de um pequeno número de ácidos nucleicos que interagem mais fortemente com o alvo a partir de um conjunto que contém um grande número de ácidos nucleicos. Um ciclo dos processos seleção/amplificação é continuado até que um objetivo selecionado seja alcançado. A metodologia SELEX é descrita nas Patentes SELEX. Em algumas formas de realização do processo SELEX, aptâmeros que se ligam de forma não covalente aos seus alvos são gerados. Noutras formas de realização do processo SELEX, aptâmeros que se ligam de forma covalente aos seus alvos são gerados.
Como aqui utilizado, o termo "amplificação" ou "amplificar" significa qualquer processo ou combinação de etapas do processo que aumenta a quantidade ou número de cópias de uma molécula ou classe de moléculas. "Alvo SELEX" ou "molécula alvo" ou "alvo" refere-se aqui a qualquer composto sobre o qual um ácido nucleico pode atuar de uma forma desejável. A molécula alvo SELEX pode ser uma proteína, péptido, ácido nucleico, carboidrato, lípido, polissacárido, glicoproteína hormona, recetor, antigénio, anticorpo, vírus, agente patogénico, substância tóxica, substrato, metabolito, análogo de estado de transição, cofator, inibidor, fármaco, corante, nutriente, fator de crescimento, célula, tecido, qualquer porção ou fragmento de qualquer dos anteriores, etc., sem limitações. Numa forma de realização, um alvo SELEX não inclui moléculas que são conhecidos por se ligarem a ácidos nucleicos, tais como, por exemplo, proteínas de ligação a ácidos nucleicos conhecidas (por exemplo, fatores de transcrição). Virtualmente, qualquer efetor biológico ou químico pode ser um alvo SELEX adequado. Moléculas de qualquer tamanho podem servir como alvos SELEX. Um alvo também pode ser modificado, em certa forma, para melhorar a probabilidade ou a força de uma interação entre o alvo e o ácido nucleico. Um alvo pode também incluir qualquer variação menor de um composto ou molécula particular, tal como, no caso de uma proteína, por exemplo, variações menores na sequência de aminoácidos, formação de ligações dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de marcação, a qual não altera substancialmente a identidade da molécula. Uma "molécula alvo" ou "alvo" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de molécula ou estrutura multimolecular que é capaz de se ligar a um aptâmero. "Moléculas alvo" ou "alvo" referem-se a mais do que um tal conjunto de moléculas. As formas de realização do processo SELEX no qual o alvo é um péptido são descritas na Patente U.S. N.° 6.376.190, intitulado "Modified SELEX Processes Without Purified Protein". A Figura 7 lista mais de 500 alvos para os quais têm sido produzidos aptâmeros, incluindo uma variedade de aptâmeros com taxas de dissociação lentas.
Como aqui utilizado, "molécula competidora" e "competidor" são utilizados indiferentemente para se referirem a qualquer molécula que pode formar um complexo não específico com uma molécula não alvo. Neste contexto, moléculas não alvo incluem aptâmeros livres, em que, por exemplo, um competidor pode ser utilizado para inibir o aptâmero de se ligar (religar), não especificamente, a uma outra molécula não alvo. Uma "molécula competidora" ou "competidor" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de moléculas. "Moléculas competidoras" ou "competidores" referem-se a mais do que um tal conjunto de moléculas. Moléculas competidoras incluem, mas não estão limitadas a, oligonucleótidos, polianiões (por exemplo, heparina, ADN de esperma de arenque, ADN de esperma de salmão, ARNt, sulfato de dextrano, polidextrano, polímeros de fosfodiéster abásicos, dNTPs, e pirofosfato). Em várias formas de realização, uma combinação de um ou mais competidores pode ser utilizada.
Como aqui utilizado, "complexo não específico" refere-se a uma associação não covalente entre duas ou mais moléculas que não um aptâmero e a sua molécula alvo. Um complexo não específico representa uma interação entre classes de moléculas. Complexos não específicos incluem complexos formados entre um aptâmero e uma molécula não alvo, um competidor e uma molécula não alvo, um competidor e uma molécula alvo, e uma molécula alvo e uma molécula não alvo.
Como aqui utilizado, o termo "processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas" refere-se a um processo de alteração das concentrações relativas de determinados componentes de uma mistura candidata de tal modo que, a concentração relativa de complexos de afinidade de aptâmeros possuindo taxas de dissociação lentas é aumentada em relação à concentração de complexos de afinidade de aptâmeros possuindo taxas de dissociação mais rápidas, menos desejáveis. Numa forma de realização, o processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas é um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas baseado numa solução. Nesta forma de realização, um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas baseado numa solução ocorre em solução, de tal modo que nem o alvo nem os ácidos nucleicos que formam os complexos de afinidade de aptâmeros na mistura são imobilizados sobre um suporte sólido durante o processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas. Em várias formas de realização, o processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas pode incluir uma ou mais etapas, incluindo a adição de e incubação com uma molécula competidora, diluição da mistura, ou combinação destas (por exemplo, diluição da mistura na presença de uma molécula competidora). Porque o efeito de um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas geralmente depende das diferentes taxas de dissociação de diferentes complexos de afinidade de aptâmeros (isto é, complexos de afinidade de aptâmeros formados entre a molécula alvo e diferentes ácidos nucleicos na mistura candidata), a duração do processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas é selecionada de modo a reter uma elevada proporção de complexos de afinidade de aptâmeros possuindo taxas de dissociação lentas, enquanto se reduz substancialmente o número de complexos de afinidade de aptâmeros possuindo taxas de dissociação rápidas. 0 processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas pode ser utilizado em um ou mais ciclos durante o processo SELEX. Quando a diluição e a adição de um competidor são usadas em combinação, podem ser realizadas simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem. 0 processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas pode ser usado quando a concentração total do alvo (proteína) na mistura é baixa. Numa forma de realização, quando o processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas inclui uma diluição, a mistura pode ser diluída tanto quanto for praticável, tendo em conta que os ácidos nucleicos retidos no aptâmero são recuperados por ciclos subsequentes no processo SELEX. Numa forma de realização, o processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas inclui a utilização de um competidor, bem como uma diluição, permitindo que a mistura seja diluída menos do que pode ser necessário, sem a utilização de um competidor.
Numa disposição, o processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas inclui a adição de um competidor, e o competidor é um polianião (por exemplo, heparina ou sulfato de dextrano (dextrano) ) . A heparina ou dextrano têm sido utilizados na identificação de aptâmeros específicos em seleções SELEX anteriores. Em tais métodos, no entanto, a heparina ou dextrano está presente durante a etapa de equilíbrio, na qual o alvo e aptâmero se ligam para formar complexos. Em tais métodos, como a concentração de heparina ou dextrano aumenta, a razão de complexos alvo/aptâmero de alta afinidade para complexos alvo/aptâmero de baixa afinidade aumenta. No entanto, uma elevada concentração de heparina ou dextrano pode reduzir o número de complexos alvo/aptâmero de elevada afinidade em equilíbrio devido a competição para ligação ao alvo entre o ácido nucleico e o competidor. Pelo contrário, os métodos descritos presentemente adicionam o competidor depois de os complexos alvo/aptâmero serem autorizados a formar-se e, deste modo, o número de complexos formados não é afetado. A adição de competidor depois de ter ocorrido a ligação de equilíbrio entre alvo e aptâmero cria um estado de não equilíbrio que evolui no tempo para um novo equilíbrio com menos complexos alvo/aptâmero. 0 aprisionando de complexos alvo/aptâmero antes de ser atingido o novo equilíbrio enriquece a amostra em aptâmeros com taxas de dissociação lentas, uma vez que os complexos com taxas de dissociação rápidas dissociar-se-ão primeiro.
Numa outra disposição, um competidor polianiónico (por exemplo, sulfato de dextrano ou outro material polianiónico) é usado no processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas para facilitar a identificação de um aptâmero que é refratário à presença do polianião. Neste contexto, "aptâmero refratário polianiónico" é um aptâmero que é capaz de formar um complexo aptâmero/alvo menos provável de se dissociar na solução que também contém o material refratário polianiónico do que um complexo aptâmero/alvo que inclui um aptâmero refratário não polianiónico. Deste modo, aptâmeros refratários polianiónicos podem ser utilizados na realização de métodos analíticos para detetar a presença ou quantidade ou concentração de um alvo numa amostra, em que o método de deteção inclui a utilização do material polianiónico (por exemplo, sulfato de dextrano) para o qual o aptâmero é refratário.
Assim, numa disposição, um método para a produção de um aptâmero refratário polianiónico é proporcionado. Nesta disposição, depois de contactar uma mistura candidata de ácidos nucleicos com o alvo, o alvo e os ácidos nucleicos na mistura candidata são permitidos entrar em equilíbrio. Um competidor polianiónico é introduzido e deixado a incubar na solução durante um período de tempo suficiente para assegurar que a maioria dos aptâmeros com taxas de dissociação rápidas na mistura candidata se dissociam da molécula alvo. Além disso, os aptâmeros na mistura candidata que pode dissociar-se na presença do competidor polianiónico serão libertados da molécula alvo. A mistura é dividida para isolar os aptâmeros com taxas de dissociação lentas e elevada afinidade que permaneceram em associação com a molécula alvo e para remover quaisquer materiais não complexados da solução. 0 aptâmero pode então ser libertado da molécula alvo e isolado. 0 aptâmero isolado também pode ser amplificado e ciclos adicionais de seleção podem ser aplicados para aumentar o desempenho global dos aptâmeros selecionados. Este processo também pode ser utilizado com um tempo de incubação mínimo, se a seleção de aptâmeros com taxas de dissociação lentas não é necessária para uma aplicação específica.
Assim, um processo SELEX modificado é proporcionado para a identificação ou produção de aptâmeros com taxas de dissociação lentas (longas), em que a molécula alvo e mistura candidata são postas em contacto e incubadas em conjunto durante um período de tempo suficiente para que ocorra a ligação em equilíbrio entre a molécula alvo e os ácidos nucleicos contidos na mistura candidata. Na sequência da ligação em equilíbrio, um excesso de molécula competidora, por exemplo, competidor polianiónico, é adicionado à mistura e a mistura é incubada juntamente com o excesso de molécula competidora durante um período de tempo predeterminado. Uma proporção significativa de aptâmeros possuindo taxas de dissociação que são menores do que este período de incubação predeterminado, dissociar-se-ão do alvo durante o período de incubação predeterminado. A reassociação destes aptâmeros com taxas de dissociação "rápidas" com o alvo é minimizada devido ao excesso de molécula competidora que pode ligar-se não especificamente ao alvo e ocupar os sítios de ligação ao alvo. Uma proporção significativa de aptâmeros possuindo taxas de dissociação mais longas permanecerá complexada com o alvo durante o período de incubação predeterminado. No final do período de incubação, a partição dos complexos ácido nucleico-alvo do restante da mistura permite a separação de uma população de aptâmeros com taxas de dissociação lentas de entre aqueles possuindo taxas de dissociação rápidas. Uma etapa de dissociação pode ser utilizada para dissociar do seu alvo os aptâmeros com taxas de dissociação lentas e permite o isolamento, identificação, sequenciação, síntese e amplificação de aptâmeros com taxas de dissociação lentas (quer de aptâmeros individuais, quer de um grupo de aptâmeros com taxas de dissociação lentas) que tem elevada afinidade e especificidade para a molécula alvo. Tal como acontece com o SELEX convencional, as sequências de aptâmeros identificadas a partir de um ciclo do processo SELEX modificado podem ser utilizadas na síntese de uma nova mistura candidata de tal modo que, as etapas de contacto, ligação em equilíbrio, adição de molécula competidora, incubação com molécula competidora e partição de aptâmeros com taxas de dissociação lentas, podem ser iteradas/repetidas tantas vezes quantas as desejadas. A combinação que permiti a ligação em equilíbrio da mistura candidata ao alvo antes da adição do competidor, seguida pela adição de um excesso de competidor e incubação com o competidor durante um período de tempo predeterminado, permite a seleção de uma população de aptâmeros possuindo taxas de dissociação que são muito maiores que aquelas anteriormente alcançadas.
De forma a conseguir uma ligação em equilíbrio, a mistura candidata pode ser incubada com o alvo durante, pelo menos, cerca de 5 minutos, ou, pelo menos, cerca de 15 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 45 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas ou cerca de 6 horas. O período de incubação predeterminado da molécula competidora com a mistura da mistura candidata e molécula alvo pode ser selecionado conforme desejável, tendo em conta fatores tais como a natureza do alvo e taxas de dissociação conhecidas (se houverem) de aptâmeros conhecidos para o alvo. Os períodos de incubação predeterminados podem ser escolhidos de: pelo menos cerca de 5 minutos, pelo menos cerca de 10 minutos, pelo menos cerca de 20 minutos, pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de 1 hora, pelo menos cerca de 2 horas, pelo menos cerca de 3 horas, pelo menos cerca de 4 horas, pelo menos cerca de 5 horas, pelo menos cerca de 6 horas.
Noutras disposições, uma diluição é utilizada como um processo de enriquecimento de taxas de dissociação e a incubação da mistura candidata diluída, complexo molécula alvo/aptâmero pode ser realizada durante um período de tempo predeterminado, o qual pode ser escolhido de: pelo menos cerca de 5 minutos, pelo menos cerca de 10 minutos, pelo menos cerca de 20 minutos, pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de 1 hora, pelo menos cerca de 2 horas, pelo menos cerca de 3 horas, pelo menos cerca de 4 horas, pelo menos cerca de 5 horas, pelo menos cerca de 6 horas.
As formas de realização da presente divulgação dizem respeito à identificação, produção, síntese e utilização de aptâmeros com taxas de dissociação lentas. Estes são aptâmeros que têm uma taxa de dissociação (ti/2) de um complexo aptâmero-alvo não covalente que é maior que a de aptâmeros obtidos normalmente por SELEX convencional. Para uma mistura contendo complexos não covalentes de aptâmero e alvo, a 11/2 representa o tempo necessário para que metade dos aptâmeros se dissocie dos complexos aptâmero-alvo. A 11/2 de aptâmeros com taxas de dissociação lentas de acordo com a presente divulgação é escolhida de entre uma de: maior ou igual a cerca de 30 minutos; entre cerca de 30 minutos a cerca de 240 minutos; entre cerca de 30 minutos a cerca de 60 minutos; entre cerca de 60 minutos a cerca de 90 minutos, entre cerca de 90 minutos a cerca de 120 minutos; entre cerca de 120 minutos a cerca de 150 minutos; entre cerca de 150 minutos a cerca de 180 minutos; entre cerca de 180 minutos a cerca de 210 minutos; entre cerca de 210 minutos a cerca de 240 minutos.
Um aspeto caracterizante de um aptâmero identificado por um procedimento SELEX é a sua elevada afinidade para o seu alvo. Um aptâmero terá uma constante de dissociação (kd) para o seu alvo que é escolhida de um de: menos que cerca de 1 μΜ, menos que cerca de 100 nM, menos que cerca de 10 nM, menos que cerca de 1 nM, menos que cerca de 100 pM, menos que cerca de 10 pM, menos que cerca de 1 pM. "Alvo tecidular" ou "tecido" refere-se aqui a um determinado subconjunto dos alvos SELEX descritos acima. De acordo com esta definição, os tecidos são macromoléculas num ambiente heterogéneo. Como aqui utilizado, tecido refere-se a um tipo celular único, a uma coleção de tipos celulares, um agregado de células, ou um agregado de macromoléculas. Isto difere de alvos SELEX mais simples que são tipicamente moléculas solúveis isoladas, tais como proteínas. Em algumas formas de realização, os tecidos são macromoléculas insolúveis que têm ordens de grandeza maiores do que alvos SELEX mais simples. Os tecidos são alvos complexos constituídos de inúmeras macromoléculas, cada macromolécula tendo inúmeros epitopos potenciais. As diferentes macromoléculas que compreendem os inúmeros epitopos podem ser proteínas, lípidos, carboidratos, etc., ou combinações destas. Os tecidos são geralmente uma matriz física de macromoléculas que pode ser quer rígida que fluida, ambos em termos de estrutura e composição. A matriz extracelular é um exemplo de um tecido mais rígido, tanto estruturalmente como em termos de composição, enquanto uma membrana de camada dupla é mais fluida em estrutura e composição. Os tecidos não são geralmente solúveis e permanecem em fase sólida, e assim a partição pode ser realizada de forma relativamente fácil. Tecido inclui, mas não está limitado a, um agregado de células normalmente de um tipo particular em conjunto com a sua substância intercelular, que formam um dos materiais estruturais frequentemente utilizados para designar o tecido celular geral de um dado órgão, por exemplo, tecido renal, tecido cerebral. As quatro classes gerais de tecidos são o tecido epitelial, tecido conjuntivo, tecido nervoso e tecido muscular.
Exemplos de tecidos que caiem dentro desta definição incluem, mas não estão limitados a, agregados heterogéneos de macromoléculas, tais como coágulos de fibrina, que são celulares; agregados homogéneos ou heterogéneos de células; estruturas de ordem superior contendo células que têm uma função especifica, tal como órgãos, tumores, linfonodos, artérias, etc.; e células individuais. Tecidos ou células podem estar no seu ambiente natural, isolados, ou em culturas de tecidos. 0 tecido pode estar intacto ou modificado. A modificação pode incluir numerosas alterações tais como transformação, transfeção, ativação, e isolamento de subestruturas, por exemplo, membranas celulares, núcleos celulares, organelos celulares, etc.
As fontes do tecido, células ou estruturas subcelulares podem ser obtidas a partir de procariotas, bem como eucariotas. Isto inclui estruturas humanas, animais, vegetais, bacterianas, fúngicas e virais.
Como agui utilizado, o termo "agente de marcação", "marcador" ou "fração detetável", ou "elemento detetável" ou "componente detetável" refere-se a um ou mais reagentes gue podem ser utilizados para detetar uma molécula alvo gue está ligada a um aptâmero. Uma fração detetável ou marcador é capaz de ser detetado direta ou indiretamente. Em geral, gualguer molécula repórter gue é detetável pode ser um marcador. Os marcadores incluem, por exemplo, (i) moléculas repórteres gue podem ser detetadas diretamente em virtude da geração de um sinal, (ii) membros de pares de ligação específicos que podem ser detetados indiretamente por ligação subsequente a um cognato que contém uma molécula repórter, (iii) etiquetas de massa detetáveis por espectrometria de massa, (iv) iniciadores oligonucleotídicos que podem proporcionar um modelo para amplificação ou ligação, e (v) uma sequência polinucleotídica específica ou sequência de reconhecimento que pode atuar como um ligando, tal como, por exemplo, uma proteína repressora, em que nos dois últimos casos, o iniciador oligonucleotídico ou proteína repressora terão, ou serão capaz de ter, uma molécula repórter, e assim por diante. A molécula repórter pode ser um catalisador, tal como uma enzima, um polinucleot ido que codifica para um catalisador, promotor, corante, molécula fluorescente, pontos quânticos, molécula quimioluminescente, coenzima, substrato enzimático, grupo radioativo, uma molécula orgânica pequena, sequência polinucleotídica amplificável, uma partícula tal como partícula de látex ou carbono, metal sol, cristalito, lipossoma, célula, etc., que pode ou não ser ainda marcada com um corante, catalisador ou outro grupo detetável, uma etiqueta de massa que altera a massa da molécula à qual é conjugada para propósitos de espectrometria de massa, e semelhantes. 0 marcador pode ser selecionado a partir de materiais eletromagnéticos ou eletroquímicos. Numa forma de realização, o marcador detetável é um corante fluorescente. Outros marcadores e esquemas de marcação serão evidentes para um perito na especialidade com base na presente divulgação.
Uma fração (elemento ou componente) detetável pode incluir qualquer das moléculas repórteres acima listadas e qualquer outro químico ou componente que possa ser utilizado de qualquer forma para gerar um sinal detetável. A fração detetável pode ser detetada por meio de um sinal fluorescente, um sinal quimioluminescente, ou qualquer outro sinal detetável que dependa da identidade da fração. No caso em que a fração detetável é uma enzima (por exemplo, fosfatase alcalina), o sinal pode ser gerado na presença do substrato enzimático e de quaisquer fatores adicionais necessários para a atividade enzimática. No caso em que a fração detetável é um substrato enzimático, o sinal pode ser gerado na presença da enzima e de quaisquer fatores adicionais necessários para a atividade enzimática. Configurações de reagentes adequadas para ligar a fração detetável a uma molécula alvo incluem ligação covalente da fração detetável à molécula alvo, associação não covalente da fração detetável a um outro componente do agente de marcação que é ligado covalentemente à molécula alvo, e ligação covalente da fração detetável a um componente do agente de marcação que está associado de forma não covalente à molécula alvo. Corantes proteicos universais (UPS) são descritos em detalhe no Pedido de Patente U.S. N.° de Série 10/504.696, depositado em 12 de agosto de 2004, intitulada "Methods and Reagents for Detecting Target
Binding by Nucleic Acid Ligands." "Suporte sólido" refere-se aqui a qualquer substrato que tenha uma superfície à qual as moléculas podem ser ligadas, direta ou indiretamente, através de ligações quer covalentes quer não covalentes. Os materiais de substrato podem ser de ocorrência natural, sintética, ou uma modificação de um material de ocorrência natural. Os materiais do suporte sólido podem incluir silício, grafite, superfícies espelhadas, laminados, cerâmicas, plásticos (incluindo polímeros tais como, por exemplo, policloreto de vinilo, copolímeros de ciclo-olefinas, poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli (4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, politereftalato de etileno, politetrafluoroetileno (PTFE ou Teflon®), nylon, polibutirato de vinilo, germânio, arsenieto de gálio, ouro, prata, etc., quer utilizados por si só ou em conjunção com outros materiais. Materiais rígidos adicionais podem ser considerados, tais como vidro, que inclui sílica e inclui ainda, por exemplo, vidro que está disponível como vidro bioativo. Outros materiais que podem ser empregues incluem materiais porosos, tais como, por exemplo, esferas de vidro de porosidade controlada. Quaisquer outros materiais conhecidos na técnica que sejam capazes de ter um ou mais grupos funcionais, tais como qualquer um de um grupo funcional amino, carboxilo, tiol, ou hidroxilo, por exemplo, incorporado na sua superfície, são também contemplados. 0 suporte sólido pode tomar qualquer uma de uma variedade de configurações que variam de simples as complexas e pode ter qualquer uma de uma série de formas, incluindo uma tira, placa, disco, haste, partícula, incluindo esfera, tubo, poço, e semelhantes. A superfície pode ser relativamente plana (por exemplo, uma lâmina), esférica (por exemplo, uma esfera), cilíndrica (por exemplo, uma coluna), ou entalhada. Suportes sólidos exemplificativos que podem ser utilizados incluem poços de microtitulação, lâminas de microscópio, membranas, esferas paramagnéticas, papel carregado, películas de Langmuir-Blodgett, pastilhas de silício, pastilhas de passagem de fluxo, e microesferas .
Como aqui utilizado, "partição" significa qualquer processo pelo qual um ou mais componentes de uma mistura são separados dos outros componentes da mistura. Por exemplo, aptâmeros ligados a moléculas alvo podem ser separados de outros ácidos nucleicos que não estão ligados a moléculas alvo e de moléculas não alvo. Mais amplamente afirmado, partição permite a separação de todos os ácidos nucleicos numa mistura candidata em, pelo menos, dois conjuntos baseados nas suas afinidades relativas e/ou taxas de dissociação da molécula alvo. A partição pode ser conseguida por vários métodos conhecidos na técnica, incluindo filtração, cromatografia de afinidade, partição líquido-líquido, HPLC, etc. Por exemplo, pares ácido nucleico-proteína podem ser ligados a filtros de nitrocelulose, enquanto os ácidos nucleicos não ligados não podem. Colunas que retêm especificamente complexos ácido nucleico-alvo também pode ser usadas para partição. Por exemplo, oligonucleótidos capazes de se associarem a uma molécula alvo ligada numa coluna permitem a utilização de cromatografia em coluna para a separação e isolamento dos aptâmeros de afinidade mais elevada. Esferas sobre as quais moléculas alvo são conjugadas também podem ser usadas para a partição de aptâmeros numa mistura. Se as esferas são paramagnéticas, a partição pode ser alcançada através da aplicação de um campo magnético. A tecnologia de ressonância de plasmão de superfície pode ser usada para a partição de ácidos nucleicos numa mistura por imobilização de um alvo sobre um chip sensor e fluindo a mistura sobre o chip, em que aqueles ácidos nucleicos que possuem afinidade para o alvo podem ser ligados ao alvo, e os ácidos nucleicos restantes podem ser removidos por lavagem. Partição líquido-líquido pode ser utilizada, assim como retardamento em gel de filtração e centrifugação por gradiente de densidade. Etiquetas de afinidade sobre as moléculas alvo podem também ser usadas para separar moléculas de ácidos nucleicos ligadas ao alvo etiquetado de aptâmeros que estão livres em solução. Por exemplo, moléculas alvo biotiniladas, juntamente com aptâmeros ligados a elas, podem ser sequestradas da solução de sequências de ácidos nucleicos não ligados utilizando esferas paramagnéticas de estreptavidina. Etiquetas de afinidade podem também ser incorporadas no aptâmero durante a preparação.
Como aqui utilizado, "fotoSELEX" é um acrónimo para Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento
Exponencial Fotoquímico e refere-se a formas de realização do processo SELEX nas quais aptâmeros de fotoligação cruzada são gerados. Numa forma de realização do processo fotoSELEX, um nucleótido fotorreativo ativado pela absorção de luz é incorporado no lugar de um base nativa em bibliotecas de oligonucleótidos aleatórias quer de ARN quer de ADNss, a mistura de moléculas alvo e ácidos nucleicos é irradiada fazendo com que alguns ácidos nucleicos incorporados em complexos ácido nucleico-molécula alvo realizem ligação cruzada com a molécula alvo através dos grupos funcionais fotorreativos, e a etapa de seleção é uma seleção para atividade de fotoligação cruzada. 0 processo fotoSELEX é descrito em maior detalhe nas Patentes fotoSELEX.
Como aqui utilizado, "fotoaptâmero", "aptâmero fotorreativo" e "aptâmero fotorreativo" são utilizados indiferentemente referindo-se a um aptâmero que contém um ou mais grupos funcionais fotorreativos que podem ligar-se covalentemente a ou por "ligação cruzada" a uma molécula alvo. Por exemplo, um resíduo de ácido nucleico de ocorrência natural pode ser modificado para incluir um grupo químico funcional que confira fotorreatividade ao resíduo de ácido nucleico após exposição a uma fonte de radiação de um comprimento de onda apropriado. Em algumas formas de realização, um aptâmero fotorreativo é inicialmente identificado. Noutras formas de realização, um aptâmero é primeiro identificado e, subsequentemente, é modificado para incorporar um ou mais grupos funcionais fotorreativos, gerando-se, deste modo, um fotoaptâmero. Nestas formas de realização, um ou mais resíduos de ácidos nucleicos fotorreativos podem ser incorporados num aptâmero ou por substituição de um resíduo de ácido nucleico fotorreativo no lugar de um ou mais outros nucleótidos, tal como um ou mais dos nucleótidos de timidina e/ou citidina no aptâmero, por exemplo, ou por modificação de um ou mais resíduos de ácidos nucleicos de forma a incluir um grupo funcional fotorreativo.
Grupos funcionais fotorreativos exemplificativos que podem ser incorporados por um fotoaptâmero incluem 5-bromouracilo, 5-iodouracilo, 5-bromoviniluracilo, 5-iodoviniluracilo, 5-azidouracilo, 4-tiouracilo, 5-tiouracilo, 4-tiocitosina, 5-bromocitosina, 5-iodocitosina, 5-bromovinilcitosina, 5-iodovinilcitosina, 5-azidocitosina, 8-azidoadenina, 8-bromoadenina, 8-iodoadenina, 8-aziodoguanina, 8-bromoguanina, 8-iodoguanina, 8-azidohipoxantina, 8-bromohipoxantina, 8-iodohipoxantina, 8-azidoxantina, 8-bromoxantina, 8-iodoxantina, 5 —[ (4 — azidofenacil)tio]citosina, 5-[(4-azidofenacil)tio]uracilo, 7-deaza-7-iodoadenina, 7-deaza-7-iodoguanina, 7-deaza-7-bromoadenina, e 7-deaza-7-bromoguanina.
Em adição a estes grupos funcionais fotorreativos exemplificativos à base de nucleósidos, outros grupos funcionais fotorreativos que podem ser adicionados a uma extremidade terminal de um aptâmero utilizando uma molécula ligante adequada podem também ser utilizados. Tais grupos funcionais fotorreativos incluem benzofenona, antraquinona, 4-azido-2-nitro-anilina, psoraleno, derivados de qualquer um destes, e semelhantes.
Um grupo funcional fotorreativo incorporado num fotoaptâmero pode ser ativado por qualquer método adequado. Numa forma de realização, um fotoaptâmero contendo um grupo funcional fotorreativo pode realizar ligação cruzada com o seu alvo, expondo-se o fotoaptâmero e a sua molécula alvo ligada a uma fonte de radiação eletromagnética. Os tipos adequados de radiação eletromagnética incluem luz ultravioleta, luz visível, raios X, e raios gama. Fontes de radiação adequadas incluem fontes que utilizam ou luz monocromática ou luz policromática filtrada.
Como aqui utilizado, o termo "o processo SELEX de afinidade" refere-se a formas de realização do processo SELEX nas quais são gerados aptâmeros de não fotoligação cruzada aos alvos. Em algumas formas de realização do processo SELEX de afinidade, o alvo é imobilizado sobre um suporte sólido ou antes ou depois do alvo ser posto contacto com a mistura candidata de ácidos nucleicos. A associação do alvo ao suporte sólido permite que os ácidos nucleicos na mistura candidata que se ligaram, caso um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas seja utilizado, permaneçam ligados ao alvo para serem separados do restante da mistura candidata. 0 termo "processo SELEX de afinidade com esferas" refere-se a formas de realização particulares do processo SELEX de afinidade em que o alvo é imobilizado numa esfera, por exemplo, antes do contacto com a mistura candidata de ácidos nucleicos. Em algumas formas de realização, as esferas são esferas paramagnéticas. 0 termo "processo SELEX de afinidade com filtro" refere-se a formas de realização em que complexos ácido nucleico-alvo são separados da mistura candidata em virtude da sua associação com um filtro, tal como um filtro de nitrocelulose. Isto inclui formas de realização em que o alvo e os ácidos nucleicos são inicialmente postos em contacto em solução, e postos em contacto com o filtro, e também inclui formas de realização em que os ácidos nucleicos são postos em contacto com o alvo que é pré-imobilizado no filtro. 0 termo "processo SELEX de afinidade em placa" refere-se a formas de realização em que o alvo é imobilizado sobre a superfície de uma placa, tal como, por exemplo, uma placa de microtitulação com vários poços. Em algumas formas de realização, a placa é composta por poliestireno. Em algumas formas de realização, o alvo é ligado à placa no processo SELEX de afinidade com placa através de interações hidrofóbicas. A presente divulgação descreve métodos SELEX melhorados para gerar aptâmeros que são capazes de se ligarem a moléculas alvo. Mais especificamente, a presente divulgação descreve métodos para a identificação de aptâmeros e/ou fotoaptâmeros com taxas de dissociação das suas respetivas moléculas alvo mais lentas do que aptâmeros obtidos com métodos SELEX anteriores. A divulgação descreve ainda aptâmeros e/ou fotoaptâmeros obtidos utilizando os métodos aqui descritos e métodos de utilização dos mesmos.
Um método é proporcionado para a identificação de um aptâmero com uma taxa de dissociação da sua molécula alvo lenta, o método compreendendo (a) preparação de uma mistura candidata de sequências de ácidos nucleicos; (b) contacto da mistura candidata com uma molécula alvo em que os ácidos nucleicos com as afinidades relativas mais elevadas para a molécula alvo ligam-se preferencialmente à molécula alvo, formando complexos ácido nucleico-molécula alvo; (c) aplicação de um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas para permitir a dissociação de complexos ácido nucleico-molécula alvo com taxas de dissociação relativamente rápidas; (d) partição dos restantes complexos ácido nucleico-molécula alvo tanto dos ácidos nucleicos livres como de moléculas não alvo na mistura candidata; e (e) identificação de um aptâmero para a molécula alvo. 0 processo pode ainda incluir a etapa iterativa de amplificação dos ácidos nucleicos que se ligam à molécula alvo para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em sequências que são capazes de se ligar à molécula alvo, e ainda produzir complexos ácido nucleico-molécula alvo com taxas de dissociação lentas. Conforme definido acima, o processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas pode ser selecionado de diluição da mistura candidata contendo complexos ácido nucleico-molécula alvo, adição de pelo menos um competidor à mistura candidata contendo os complexos ácido nucleico-molécula alvo, e diluição da mistura candidata contendo os complexos ácido nucleico-molécula alvo e adição de pelo menos um competidor à mistura candidata contendo os complexos ácido nucleico-molécula alvo.
Um método é proporcionado para a identificação de um aptâmero com uma taxa de dissociação da sua molécula alvo lenta, o método compreendendo: (a) a preparação de uma mistura candidata de ácidos nucleicos; (b) o contacto da mistura candidata com uma molécula alvo, em que os ácidos nucleicos com uma afinidade para a molécula alvo aumentada relativamente a outros ácidos nucleicos na mistura candidata se ligam à molécula alvo, formando complexos ácido nucleico-molécula alvo; (c) a incubação da mistura candidata e molécula alvo em conjunto durante um período de tempo suficiente para atingir uma ligação em equilíbrio; (d) a adição de um excesso de pelo menos uma molécula competidora à mistura de (c); (e) a incubação da mistura de mistura candidata, complexos ácido nucleico-molécula alvo e molécula de competidora de (d) durante um período de tempo predeterminado; (f) a partição dos complexos ácido nucleico-molécula alvo da mistura candidata; (g) a dissociação dos complexos ácido nucleico-molécula alvo para gerar ácidos nucleicos livres; (h) a amplificação dos ácidos nucleicos livres para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em sequências de ácidos nucleicos que são capazes de se ligar à molécula alvo, com afinidade aumentada, onde um aptâmero para a molécula alvo pode ser identificado. É proporcionado um método para a produção de um aptâmero com uma taxa de dissociação da sua molécula alvo lenta, o método compreendendo a preparação ou síntese de um aptâmero que inclui uma sequência de ácidos nucleicos identificada pelo processo seguinte que compreende as etapas de: (a) preparação de uma mistura candidata de ácidos nucleicos; (b) contacto da mistura candidata com uma molécula alvo, em que os ácidos nucleicos com uma afinidade para a molécula alvo aumentada relativamente a outros ácidos nucleicos na mistura candidata se ligam à molécula alvo, formando complexos ácido nucleico-molécula alvo; (c) incubação da mistura candidata e molécula alvo em conjunto durante um período de tempo suficiente para atingir uma ligação em equilíbrio; (d) adição de um excesso de pelo menos uma molécula competidora à mistura de (c) ; (e) incubação da mistura de mistura candidata, complexos ácido nucleico-molécula alvo e molécula de competidora de (d) durante um período de tempo predeterminado; (f) partição dos complexos ácido nucleico-molécula alvo da mistura candidata; (g) dissociação dos complexos ácido nucleico-molécula alvo para gerar ácidos nucleicos livres; (h) amplificação dos ácidos nucleicos livres para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em sequências de ácidos nucleicos que são capazes de se ligar à molécula alvo com afinidade aumentada, onde um aptâmero para a molécula alvo pode ser identificado.
Um método é proporcionado de identificação de um aptâmero com uma taxa de dissociação da sua molécula alvo lenta, o método compreendendo: (a) a preparação de uma mistura candidata de ácidos nucleicos, em que a mistura candidata compreende ácidos nucleicos modificados nos quais uma, várias ou todas as pirimidinas em pelo menos um, ou cada, dos ácidos nucleicos da mistura candidata é quimicamente modificada na posição 5; (b) o contacto da mistura candidata com uma molécula alvo, em que os ácidos nucleicos com afinidade para a molécula alvo aumentada em relação a outros ácidos nucleicos na mistura candidata se ligam à molécula alvo, formando complexos ácido nucleico-molécula alvo; (c) a partição dos ácidos nucleicos de afinidade aumentada do restante da mistura candidata; e (d) a amplificação dos ácidos nucleicos de afinidade aumentada para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em sequências de ácidos nucleicos que são capazes de se ligar à molécula alvo com afinidade aumentada, onde um aptâmero para a molécula alvo pode ser identificado. É proporcionado um método para a produção de um aptâmero com uma taxa de dissociação da sua molécula alvo lenta, o dito método compreendendo a preparação ou síntese de um aptâmero que inclui uma sequência de ácidos nucleicos identificada pelo processo seguinte: (a) preparação de uma mistura candidata de ácidos nucleicos, em que a mistura candidata compreende ácidos nucleicos modificados nos quais uma, várias ou todas as pirimidinas em pelo menos um, ou cada, dos ácidos nucleicos da mistura candidata é quimicamente modificada na posição 5; (b) contacto da mistura candidata com uma molécula alvo, em que os ácidos nucleicos com afinidade para a molécula alvo aumentada em relação a outros ácidos nucleicos na mistura candidata se ligam à molécula alvo, formando complexos ácido nucleico-molécula alvo; (c) partição dos ácidos nucleicos de afinidade aumentada do restante da mistura candidata; e (d) amplificação dos ácidos nucleicos de afinidade aumentada para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em sequências de ácidos nucleicos que são capazes de se ligar à molécula alvo com afinidade aumentada, onde um aptâmero para a molécula alvo pode ser identificado.
Numa outra forma de realização, é proporcionado um complexo não covalente de um aptâmero e seu alvo, em que a taxa de dissociação (ti/2) do aptâmero do alvo é escolhida de entre uma de: maior que ou igual a cerca 30 minutos; entre cerca de 30 minutos e cerca de 240 minutos; cerca de 30 minutos a cerca de 60 minutos; cerca de 60 minutos a cerca de 90 minutos; cerca de 90 minutos a cerca de 120 minutos; cerca de 120 minutos a cerca de 150 minutos; cerca de 150 minutos a cerca de 180 minutos; cerca de 180 minutos a cerca de 210 minutos; ou cerca de 210 minutos a cerca de 240 minutos.
Numa outra forma de realização, é proporcionado um complexo não covalente de um aptâmero e um alvo, em que o aptâmero tem uma Kd para o alvo de cerca de 100 nM ou menos, em que a taxa de dissociação (ti/2) do aptâmero do alvo é maior que ou igual a cerca de 30 minutos, e em que uma, várias ou todas as pirimidinas na sequência de ácidos nucleicos do aptâmero são modificadas na posição 5 da base. As modificações podem ser selecionadas a partir do grupo de compostos mostrado na FIG. 14, essas modificações referidas como "nucleótido modificado na base". Aptâmeros podem ser concebidos com qualquer combinação desejável das pirimidinas modificadas na base. Métodos melhorados para a realização de SELEX com nucleótidos modificados, incluindo nucleótidos que contêm grupos fotoativos ou nucleótidos que contêm espaços reservados para os grupos fotoativos são divulgados no Pedido U.S. N.° de Série 12/175.388, intitulado "Improved SELEX and PHOTOSELEX", que está a ser depositado concorrentemente com o presente pedido. Numa outra disposição, a mistura candidata de moléculas de ácidos nucleicos inclui ácidos nucleicos contendo bases de nucleótidos modificadas que podem auxiliar na formação de complexos ácido nucleico-alvo modificados possuindo taxas de dissociação relativamente lentas.
Os vários métodos e etapas aqui descritos podem ser utilizados para gerar um aptâmero capaz de ou (1) ligar-se a uma molécula alvo ou (2) ligar-se a uma molécula alvo e, subsequentemente, formar uma ligação covalente com a molécula alvo após irradiação.
Os aptâmeros identificados de acordo com os métodos aqui descritos são úteis numa gama de métodos de diagnóstico e terapêuticos. Aptâmeros com tacas de dissociação lentas ligar-se-ão ao alvo por uma duração mais longa. Isto é útil em métodos de diagnóstico em que a ligação de um aptâmero ao alvo pode ser usada para detetar a presença, ausência, valor ou quantidade da molécula alvo, e uma interação prolongada do aptâmero e alvo facilita tal detecção. Uma vantagem semelhante pode ser conferida se aptâmeros com taxas de dissociação lentas são usados em métodos imagiológicos, in vitro ou in vivo. Uma interação prolongada de aptâmero e alvo também proporciona métodos de tratamento terapêuticos melhorados, em que a interação prolongada pode permitir um efeito terapêutico melhorado, por exemplo, devido à maior ativação ou inibição de uma molécula alvo ou cascata de sinalização a jusante.
Por conseguinte, em diversas formas de realização, aptâmeros com taxas de dissociação lentas obtidos, identificados ou produzidos pelos métodos descritos podem ser usados numa variedade de métodos de tratamento médico ou método de diagnóstico (in vitro ou in vivo) .
Numa outra forma de realização, aptâmeros com taxas de dissociação lentas podem ser utilizados in vitro para o diagnóstico de uma doença. Numa outra forma de realização, um aptâmero com taxa de dissociação lenta pode ser utilizado no fabrico de um agente terapêutico (por exemplo, composição farmacêutica) ou no fabrico de um agente de diagnóstico para utilização num método de tratamento ou diagnóstico de uma doença. Aplicações de diagnóstico ou terapêuticas de aptâmeros com taxas de dissociação lentas podem envolver um resultado diagnóstico ou terapêutico que dependa da ligação de afinidade especifica e/ou elevada do aptâmero com taxa de dissociação lenta ao seu alvo. Aptâmeros com taxas de dissociação lentas também pode ser utilizados na validação de alvos e em ensaios de rastreio de alta capacidade no processo de desenvolvimento de fármacos.
Aptâmeros com taxas de dissociação lentas são reagentes adequados para imagiologia molecular in vivo. Um aptâmero com taxa de dissociação lenta pode ser utilizado in vivo para detetar a presença de uma patologia, processo de doença, ou outra condição no corpo de um indivíduo (por exemplo, um ser humano ou um animal) , onde a ligação do aptâmero ao seu alvo indica a presença do processo de doença ou outra condição. Por exemplo, um aptâmero para o recetor VEGF pode ser utilizado in vivo para detetar a presença de cancro numa área particular (por exemplo, um tecido, um órgão, etc.) do corpo de um indivíduo, uma vez que o recetor VEGF é expresso abundantemente no interior dos tumores e da sua neovasculatura, ou um aptâmero para o recetor EGF pode ser utilizado in vivo para detetar a presença de cancro numa área particular (por exemplo, um tecido, um órgão, etc.) do corpo de um indivíduo, uma vez que o recetor EGF é frequentemente expresso em níveis elevados em células tumorais. Isto é, o alvo molecular será o domínio extracelular (ECD) de um recetor induzido, uma vez que tais alvos estão localizados fora das células e são acessíveis através da vasculatura. Adicionalmente, os ECDs tendem a localizar-se no local da patologia, embora uma pequena fração do ECD específico possa ser eliminada por processos biológicos, incluindo a morte celular.
Os candidatos óbvios para imagiologia molecular, os anticorpos monoclonais de alta afinidade, não se tornaram o reagente de escolha para esta aplicação. Os reagentes de imagiologia molecular têm requisitos rigorosos. Estes devem ter uma elevada atividade de ligação ao seu alvo pretendido, e baixa atividade de ligação a outros alvos num ser humano ou animal. Os aptâmeros com taxas de dissociação lentas têm vantagens únicas que os tornam desejáveis para utilização em imagiologia molecular in vivo. Por um lado, são selecionados para ter constantes da taxa de dissociação lentas, permitindo assim a residência in vivo sobre o alvo pretendido durante um período de tempo substancial (pelo menos cerca de 30 minutos) . Por outro lado, espera-se que aptâmeros com taxas de dissociação lentas tenham taxas de eliminação da vasculatura muito rápidas. Constantes da taxa de dissociação lentas e taxa de eliminação da vasculatura rápida, são duas propriedades desejáveis para imagiologia molecular in vivo. De uma prospetiva cinética, os bons reagentes para imagiologia molecular in vivo devem ficar localizados no local da patologia, enquanto a concentração de reagente livre na vasculatura circundante torna-se baixa. Isto constitui uma restrição sinal-ruído. Razões sinal-ruído adequadas podem ser obtidas por acumulação de sinal no local da patologia por excesso do sinal na vasculatura, ou podem ser obtidas por retenção de um sinal no local da patologia, enquanto a concentração na vasculatura diminuí.
Aptâmeros que não têm propriedades de taxas de dissociação lentas, com aproximadamente a mesma massa molecular e carga total que os aptâmeros com taxas de dissociação lentas, foram estudados em animais e seres humanos por mais de uma década. Em geral, verificou-se que esses aptâmeros são eliminados da vasculatura rapidamente, normalmente entrando no rim e/ou no fígado e, em seguida, sendo também metabolizados para excreção. Tais aptâmeros mostram a assim chamada eliminação de "primeira passagem", a menos que adutos de elevada massa molecular (tais como, por exemplo, PEG) estejam ligados aos aptâmeros.
Experiências foram realizadas dentro de um aptâmero cujo alvo é a tenascina C, uma proteína extracelular (não um ECD) encontrada em concentrações elevadas em alguns tumores. Nessas experiências, o aptâmero específico para tenascina C eliminou-se rapidamente e foi capaz de ser retido no local do tumor porque a concentração local extracelular de tenascina C era muito alta. Aptâmeros com taxas de dissociação lentas, pelo contrário, manterão a taxa de eliminação de aptâmeros rápida, mas oferecem uma vantagem cinética devido às suas taxas de dissociação lentas, tornando-os adequados para utilização com alvos cuja presença no local de interesse (por exemplo, o local da patologia) pode ser algo esparsa (ECDs em tumores, por exemplo).
Reagentes alternativos para imagiologia molecular não partilham as duas propriedades dos aptâmeros com taxas de dissociação lentas (isto é, taxa de dissociação lenta e eliminação rápida do corpo). Os anticorpos monoclonais têm frequentemente afinidade e especificidade elevadas, e podem ter constantes da taxa de dissociação lentas; no entanto, os anticorpos monoclonais têm taxas de eliminação da vasculatura muito lentas. Péptidos pequenos, identificados por, por exemplo, expressão em fagos, podem ter eliminação rápida, mas afinidade e especificidade fracas e taxas de dissociação dos seus alvos pretendidos rápidas. Affibodies, uma versão peptídica particular de um mimético de anticorpo, podem ter afinidade e especificidade razoáveis e podem ter eliminação mais rápida que os anticorpos monoclonais, contudo, a fim de atingir taxas de dissociação dos seus alvos lentas, os Affibodies são frequentemente feitos em dimeros e multimeros de ordem superior, retardando a sua eliminação, ao mesmo tempo que as suas taxas de dissociação são reforçadas.
Os aptâmeros com taxas de dissociação lentas podem ser usados para imagiologia molecular in vivo com um ou mais adutos de baixa massa molecular tanto para proteger o aptâmero com taxa de dissociação lenta de nucleases no organismo como detetar o alvo pretendido uma vez ligado pelo aptâmero com taxa de dissociação lenta. Por exemplo, os aptâmeros com taxas de dissociação lentas podem ser atacados por nucleases no sangue, tipicamente exonucleases (para ADN) que são facilmente bloqueadas utilizando adutos de refração a exonucleases nas posições terminais 5' e 3' do aptâmero com taxa de dissociação lenta, ou endonucleases (para ARN) que são facilmente bloqueadas incorporando pirimidinas de refração a endonucleases (tais como, por exemplo, nucleótidos 2'-fluoro) no aptâmero com taxa de dissociação lenta. A deteção dos complexos aptâmero com taxa de dissociação lenta-alvo pode ser conseguida ligando uma fração de deteção ao aptâmero com taxa de dissociação lenta. Em algumas formas de realização, a fração de deteção para estes fins pode incluir compartimentos para moléculas radioativas (por exemplo, o tecnécio 99) , aglomerados de ferro para deteção por ressonância magnética, isótopos de flúor para imagiologia por PET, e semelhantes. As modificações feitas no aptâmero com taxa de dissociação lenta para proteger a integridade do aptâmero com taxa de dissociação lenta no corpo e possibilitar a deteção do alvo pretendido deveriam ser concebidas de tal modo que não interferissem com a interação do aptâmero com taxa de dissociação lenta com o seu alvo e não fizessem com que o aptâmero com taxa de dissociação lenta fosse eliminado da vasculatura demasiado lentamente.
Dispositivos de diagnóstico ou ensaio, por exemplo, colunas, tiras de teste ou biochips, possuindo um ou mais aptâmeros com taxas de dissociação lentas aderidos a uma superfície sólida do dispositivo são também proporcionados. 0(s) aptâmero (s) podem ser posicionados de modo a serem capazes de se ligar a moléculas alvo que estão em contacto com a superfície sólida para formar complexos aptâmero-alvo que permanecem aderidos à superfície do dispositivo, capturando, deste modo, o alvo e possibilitando a deteção e, opcionalmente, quantificação do alvo. Uma matriz de aptâmeros com taxas de dissociação lentas (que podem ser iguais ou diferentes) pode ser proporcionada num tal dispositivo.
Numa outra forma de realização, complexos incluindo um aptâmero com taxa de dissociação lenta e uma molécula alvo são proporcionados. Uma classe de aptâmeros caracterizados por terem elevada afinidade para as suas moléculas alvo correspondentes e taxas de dissociação (11/2) de um complexo não covalente do aptâmero e alvo lentas é proporcionada.
Em referência à FIG. IA, o processo SELEX básico, geralmente começa com a preparação de uma mistura candidata de ácidos nucleicos de diferente sequência. A mistura candidata geralmente inclui sequências de ácidos nucleicos que incluem duas regiões fixas (isto é, cada um dos membros da mistura candidata contém as mesmas sequências na mesma localização) e uma região variável. Normalmente, as regiões fixas das sequências são selecionadas de tal modo que ajudam nas etapas de amplificação descritas abaixo, ou aumentam o potencial de um determinado arranjo estrutural dos ácidos nucleicos na mistura candidata. A região variável proporciona, tipicamente, na região de ligação ao alvo de cada ácido nucleico na mistura candidata, e esta região variável pode ser completamente aleatória (isto é, a probabilidade de encontrar uma base em qualquer posição é de um em quatro) ou apenas parcialmente aleatória (por exemplo, a probabilidade de encontrar uma base em qualquer localização pode ser selecionada em qualquer nível entre 0 e 100 por cento). A mistura candidata preparada é posta em contacto com o alvo selecionado sob condições que são favoráveis para que ocorra a ligação entre o alvo e os membros da mistura candidata. Sob estas condições, a interação entre o alvo e os ácidos nucleicos da mistura candidata geralmente forma pares ácido nucleico-alvo que possuem afinidade relativa mais forte entre os membros do par. Os ácidos nucleicos com a maior afinidade para o alvo são separados daqueles ácidos nucleicos com menor afinidade para o alvo. 0 processo de partição é conduzido de maneira a manter o número máximo de candidatos de alta afinidade. Aqueles ácidos nucleicos selecionados durante a partição como tendo afinidade relativamente elevada para o alvo são amplificados para criar uma nova mistura candidata que está enriquecida com ácidos nucleicos possuindo afinidade relativamente elevada para o alvo. Repetindo as etapas de partição e amplificação acima, a mistura candidata formada recentemente conterá cada vez menos sequências únicas e o grau médio de afinidade da mistura de ácidos nucleicos para o alvo, em geral, aumentará. Levado ao seu extremo, o processo SELEX produzirá uma mistura candidata contendo um ou um número muito pequeno de ácidos nucleicos únicos, representando aqueles ácidos nucleicos da mistura candidata original que possuem maior afinidade para a molécula alvo. No entanto, este processo SELEX básico não seleciona aptâmeros que têm taxas de dissociação dos seus alvos lentas.
As Patentes SELEX e Patentes FotoSELEX descrevem e elaboram este processo em grande detalhe. Estas patentes incluem descrições dos vários alvos que podem ser utilizados no processo; métodos para a preparação da mistura candidata inicial; métodos para a partição de ácidos nucleicos dentro de uma mistura candidata; e métodos para a amplificação dos ácidos nucleicos separados para gerar misturas candidatas enriquecidas. As Patentes SELEX descrevem também soluções de aptâmeros obtidos para uma série de diferentes tipos de moléculas alvo, incluindo alvos proteicos em que a proteína é e não é uma proteína de ligação ao ácido nucleico.
Em referência à FIG. 1B, o processo SELEX modificado aqui divulgado inclui a introdução de um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas na sequência do equilíbrio da mistura candidata de ácidos nucleicos com o alvo ou alvos e uma etapa de partição antes das etapas subsequentes no processo SELEX. A introdução de um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas no processo SELEX básico proporciona um meio para o enriquecimento de complexos de afinidade de aptâmeros com taxas de dissociação lentas a partir de um conjunto de complexos ácido nucleico-alvo que inclui uma variedade de taxas de dissociação. Assim, o processo SELEX modificado proporciona um método para a identificação de aptâmeros que se ligam a moléculas alvo e, uma vez ligados, têm taxas de dissociação (também aqui referidas como "taxas de dissociação") da molécula alvo relativamente baixas.
Como aqui utilizado, "ligação" refere-se geralmente à formação de uma associação não covalente entre o ligando e o alvo, apesar de tal ligação não ser necessariamente reversível. Os termos "complexo ácido nucleico-alvo" ou "complexo" ou "complexo de afinidade" são utilizados referindo-se ao produto de tal associação de ligação não covalente.
Em várias formas de realização, os aptâmeros com taxas de dissociação lentas podem ser oligonucleótidos de ADN ou ARN de cadeia simples ou dupla. Os aptâmeros podem conter bases não padrão ou modificadas. Além disso, os aptâmeros podem conter qualquer tipo de modificação. Como aqui utilizado, uma "base modificada" pode incluir uma modificação relativamente simples num resíduo de ácido nucleico natural, modificação a qual confere uma alteração nas propriedades físicas do resíduo de ácido nucleico. Tais modificações incluem, mas não estão limitadas a, modificações na posição 5 de pirimidinas, substituição com grupos hidrofóbicos, por exemplo, benzilo, isobutilo, indol ou naftilo, ou substituição com grupos hidrofílicos, por exemplo, amina quaternária ou guanidinio, ou mais grupos "neutros", por exemplo, imidazol e semelhantes. Modificações adicionais podem estar presentes no anel de ribose, por exemplo, posição 2', tais como 2'-amino (2 ' — NH2) e 2'-fluoro (2'—F), ou na estrutura principal de um fosfodiéster, por exemplo, fosforotioatos ou fosfonatos de metilo.
Em vários arranjos, uma mistura candidata contendo um conjunto aleatório de sequências de ácidos nucleicos que contêm bases de nucleótidos modificadas é misturada com uma quantidade da molécula alvo e deixada estabelecer um equilíbrio de ligação com a molécula alvo. Geralmente, apenas alguns daqueles ácidos nucleicos que se ligam à molécula alvo com elevada afinidade irão separar-se eficientemente do alvo.
Em vários arranjos, a mistura candidata inclui sequências de ácidos nucleicos possuindo regiões variáveis que incluem grupos modificados. Os grupos modificados podem ser bases de nucleótidos modificadas. A região variável pode conter sequências completa ou parcialmente aleatórias; também pode conter subpartes de uma sequência fixa que é incorporada dentro da região variável. Os nucleótidos dentro das regiões fixas também podem conter bases de nucleótidos modificadas, ou podem conter o conjunto padrão de bases de ocorrência natural.
Em alguns arranjos, a amplificação ocorre depois dos membros da mistura de ensaio terem sido separados, e é o ácido nucleico que é amplificado. Por exemplo, a amplificação de moléculas de ARN pode ser levada a cabo por uma sequência de três reações: fazer cópias de ADNc de ARN selecionados, utilizar a reação em cadeia da polimerase para aumentar o número de cópias de cada ADNc, e transcrever as cópias de ADNc para obter moléculas de ARN que tenham as mesmas sequências que os ARN selecionados. Qualquer reação ou combinação de reações conhecidas na técnica podem ser utilizadas de forma adequada, incluindo replicação direta de ADN, amplificação direta de ARN e semelhantes, conforme serão reconhecidas pelos peritos na especialidade. 0 método de amplificação pode resultar nas proporções da mistura amplificada sendo representativas das proporções de diferentes sequências na mistura antes da amplificação. Sabe-se que muitas modificações de ácidos nucleicos são compatíveis com a amplificação enzimática. As modificações que não são compatíveis com a amplificação podem ser efetuadas após cada ciclo de amplificação, se necessário. A mistura candidata de ácidos nucleicos pode ser modificada de várias maneiras para aumentar a probabilidade de que os ácidos nucleicos possuam propriedades facilitadoras ou outras propriedades desejáveis, particularmente aquelas que potencializam a interação entre o ácido nucleico e o alvo. As modificações contempladas incluem modificações que introduzem outros grupos químicos que têm corretas carga, polarizabilidade, ligações de hidrogénio, ou interação eletrostática para melhorar as interações desejáveis ligando-alvo. As modificações que podem melhorar as propriedades de ligação, incluindo a afinidade e/ou taxas de dissociação, do ácido nucleico, por exemplo, incluem frações hidrofílicas, frações hidrofóbicas, estruturas rígidas, grupos funcionais encontrados em proteínas, tais como imidazóis, álcoois primários, carboxilatos, grupos de guanidínio, grupos amino, tióis e semelhantes. As modificações podem também ser utilizadas para aumentar a sobrevivência de complexos aptâmero-alvo sob pressões de seleção rigorosas que podem ser aplicadas para produzir aptâmeros com taxas de dissociação lentas para uma ampla gama de alvos. Numa forma de realização, Bz-dU (benzil-dU) é utilizado na geração das misturas candidatas usadas para produzir aptâmeros com taxas de dissociação lentas, embora outros nucleótidos modificados estejam bem adaptados para a produção de tais aptâmeros. Outros nucleótidos modificados são mostrados na FIG. 14.
As misturas candidatas de nucleótidos modificados para o propósito deste pedido consistem em quaisquer misturas candidatas de ARN ou ADN que incluam tanto nucleótidos de ocorrência natural como outros além dos de ocorrência natural. Modificações adequadas incluem modificações em cada resíduo do ácido nucleico, num único resíduo do ácido nucleico, em resíduos aleatórios, em todas as pirimidinas ou todas as purinas, em todas as ocorrências de uma base específica (isto é, G, C, A, T ou U) no ácido nucleico, ou qualquer outro esquema de modificação que possa ser adequado para uma aplicação particular. Reconhece-se que a modificação não é um pré-requisito para a facilitação da atividade ou capacidade de ligação dos aptâmeros. Os aptâmeros podem incluir resíduos de dUTP e dCTP modificados.
Misturas candidatas para aptâmeros com taxas de dissociação lentas podem compreender um conjunto de pirimidinas tendo uma modificação diferente na posição da base C-5. A modificação em C-5 pode ser introduzida através de uma ligação amida, diretamente, ou indiretamente através de um outro tipo de ligação. Estas misturas candidatas são usadas num processo SELEX para identificar aptâmeros com taxas de dissociação lentas. Neste processo pode ser também incluída a utilização do processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas. As misturas candidatas podem ser produzidas sinteticamente ou enzimaticamente.
Como descrito acima, os nucleótidos podem ser modificados de um grande número de maneiras, incluindo modificações da ribose e/ou fosfato e/ou das posições das bases. Determinadas modificações são descritas na Patente U.S. N.° 5.660.985, intitulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", Patente U.S. N.° 5.428.149, intitulada "Method for Palladium Catalyzed Carbon-Carbon Coupling and Products", Patente U.S. N.° 5.580.972, intitulada "Purine Nucleoside Modifications by Palladium Catalyzed Methods". Numa forma de realização, modificações são aquelas em que um outro grupo químico é vinculado à posição 5 de uma pirimidina, à posição 8 de uma purina ou à posição 2' de um açúcar. Não há limites quanto ao tipo de outro grupo químico que pode ser incorporado nos nucleótidos individuais. Em algumas formas de realização, o nucleótido modificado resultante é amplificável ou pode ser modificado após as etapas de amplificação (veja-se, por exemplo, Patente U.S. N.° 6.300.074, intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Chemi-SELEX".
Ainda noutras formas de realização, determinados nucleótidos são modificados de tal modo que um método para a produção de aptâmeros que se ligam e formam uma ligação cruzada covalente com a sua molécula alvo após fotoativação do complexo de afinidade. Este método engloba aptâmeros que se ligam, realizam fotoligação cruzada, e/ou fotoinativam moléculas alvo. Em vários arranjos, os aptâmeros contêm grupos fotorreativos capazes de fotoligação cruzada com a molécula alvo, após irradiação com luz. Noutros arranjos, os aptâmeros são capazes de formar uma ligação com o alvo na ausência de irradiação.
Um grupo fotorreativo pode ser qualquer estrutura química que contenha um fotocromóforo e que seja capaz de fotoligação cruzada com uma molécula alvo. Embora referindo-se aqui a grupos fotorreativos, em alguns casos, como descrito abaixo, a irradiação não é necessária para que ocorra ligação covalente entre o aptâmero e o alvo. Em algumas formas de realização, o grupo fotorreativo absorverá luz de um comprimento de onda que não é absorvido pelo alvo ou pelas porções não modificadas do oligonucleótido. Os grupos fotorreativos incluem 5-halo- uridinas, 5-halo-citosinas, 7-halo-adenosinas, 2-nitro-5-azidobenzoilos, diazirinas, arilazidas, arilazidas fluoradas, benzofenonas, amino-benzofenonas, psoralenos, antraquinonas, etc.
Os grupos fotorreativos geralmente formam ligações com o alvo após irradiação do par associado ácido nucleico-alvo. Em alguns casos, irradiação não é necessária para que ocorra formação da ligação. A fotoligação cruzada que ocorre tipicamente será a formação de uma ligação covalente entre o aptâmero e o alvo associado. No entanto, uma interação iónica forte entre o aptâmero e alvo pode também ocorrer após irradiação.
Num arranjo, fotoligação cruzada ocorre devido à exposição a radiação eletromagnética. Radiação eletromagnética inclui a luz ultravioleta, luz visível, raios-X e raios gama.
Em vários outros arranjos, uma seleção limitada de oligonucleótidos utilizando um método SELEX é seguida por uma seleção utilizando um método fotoSELEX. Os ciclos de seleção SELEX iniciais são realizados com oligonucleótidos contendo grupos fotorreativos. Após uma série de ciclos SELEX, fotoSELEX é conduzido para selecionar oligonucleótidos capazes de se ligarem à molécula alvo.
Num outro arranjo, a produção de um aptâmero que inclui uma secção (também descrita como um elemento ou componente) clivável ou libertável na sequência do aptâmero é descrita. Estes componentes ou elementos adicionais são elementos ou componentes estruturais que introduzem funcionalidade adicional no aptâmero e são, portanto, elementos ou componentes funcionais. 0 aptâmero é ainda produzido com um ou mais dos seguintes componentes (também descritos como um elemento ou componente ou fracção funcional ou estrutural em qualquer combinação destes termos) adicionais: um componente marcado ou detetável, um componente separador, e uma etiqueta de ligação específica ou elemento ou componente de imobilização.
Como observado acima, a presente divulgação proporciona métodos para a identificação de aptâmeros que se ligam as moléculas alvo e, uma vez ligados, têm taxas de dissociação lentas. As taxas de dissociação lentas obtidas com este método podem exceder uma semivida de cerca de uma hora e como muito de cerca de 240 minutos, ou seja, uma vez gerado um conjunto de complexos ácido nucleico-alvo, metade dos complexos do conjunto permanecem ligados após uma hora. Porque o efeito de um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas depende das diferentes taxas de dissociação de complexos de afinidade de aptâmeros, a duração do processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas é escolhida de modo a reter uma alta proporção de complexos de afinidade de aptâmeros com taxas de dissociação lentas, enquanto se reduz substancialmente o número de complexos de afinidade de aptâmeros com taxas de dissociação rápidas. Por exemplo, a incubação da mistura durante períodos de tempo relativamente mais longos depois da imposição do processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas selecionará aptâmeros com taxas de dissociação mais longas que os aptâmeros selecionados usando o processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas com períodos de incubação mais curtos.
Em vários arranjos, uma mistura candidata é misturada com uma quantidade da molécula alvo e deixada estabelecer um equilíbrio de ligação com a molécula alvo. Antes da partição dos ácidos nucleicos ligados ao alvo daqueles livres em solução, um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas é imposto para enriquecer a população ligada em taxas de dissociação lentas. Como observado acima, um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas pode ser aplicado por meio da adição de uma molécula competidora, por diluição da amostra, por combinação de diluição da amostra na presença de uma molécula competidora. Assim, num arranjo, o processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas é aplicado introduzindo moléculas competidoras na mistura contendo os complexos ácido nucleico-alvo e incubando a mistura durante um certo período de tempo antes da partição dos ácidos nucleicos ligados dos livres. A quantidade de moléculas competidoras é geralmente, pelo menos, uma ordem de grandeza maior do que a das moléculas de ácidos nucleicos e pode ser duas ou mais ordens de grandeza maior. Numa outra forma de realização, o processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas é aplicado diluindo várias vezes a mistura de amostragem de complexos ácido nucleico-alvo (por exemplo, pelo menos, cerca de um de 2x, 3x, 4x, 5x) em volume e incubando a mistura durante um certo período de tempo antes da partição dos ácidos nucleicos ligadas dos livres. 0 volume de diluição é geralmente, pelo menos, uma ordem de grandeza maior, e pode ser cerca de duas ou mais ordens de grandeza maior, do que o volume original. Ainda numa outra forma de realização, uma combinação tanto de moléculas competidoras como de diluição é usada para aplicar o processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas. Numa outra forma de realização, as misturas candidatas que mostraram resultar numa frequência aumentada de aptâmeros com taxas de dissociação lentas são usadas para selecionar uma série de aptâmeros candidatos. Estes aptâmeros são pesquisados para se identificar os aptâmeros com taxas de dissociação lentas.
Num outro arranjo, um aptâmero com taxa de dissociação lenta, que inclui uma secção clivável ou libertável na região fixa do aptâmero, é produzido. 0 aptâmero também pode ser produzido com um ou mais dos seguintes componentes adicionais: um componente marcado, um componente separador, e uma etiqueta de ligação específica. Qualquer um ou todos estes elementos podem ser introduzidos num aptâmero de cadeia simples. Num arranjo, o elemento é introduzido na extremidade 5' do aptâmero. Num outro arranjo, um ou mais destes elementos é incluído criando um aptâmero de cadeia parcialmente dupla, em que uma cadeia contém os vários elementos desejáveis, bem como uma sequência complementar a uma das secções fixas da sequência da segunda cadeia contendo a região variável de ligação ao alvo.
Um elemento ou fração ou componente "libertável" ou "clivável" refere-se a um grupo funcional em que determinadas ligações no grupo funcional podem ser quebradas para produzir 2 componentes separados. Em vários arranjos, o grupo funcional pode ser clivado por irradiação do grupo funcional (fotoclivável) no comprimento de onda apropriado ou por tratamento com os reagentes químicos ou enzimáticos apropriados. Numa outra forma de realização, o elemento libertável pode ser uma ligação dissulfeto, que pode ser tratada com um agente redutor para romper a ligação. 0 elemento libertável permite que um complexo de afinidade aptâmero/alvo que está ligado a um suporte sólido seja separado do suporte sólido, tal como, por eluição do complexo. 0 elemento libertável pode ser estável às condições do resto do ensaio e pode ser libertável sob condições que não romperão o complexo aptâmero/alvo.
Como aqui divulgado, um aptâmero pode ainda compreender uma "etiqueta" ou "componente ou elemento de imobilização" ou "componente ou elemento de ligação especifica" que se refere a um componente que proporciona um meio para fixar ou imobilizar um aptâmero (e qualquer molécula alvo que se ligue a ele) num suporte sólido. Uma "etiqueta" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de componente que é capaz de se associar a uma sonda. "Etiquetas" refere-se a mais do que um tal conjunto de componentes. A etiqueta pode ser fixa a ou incluída no aptâmero por qualquer método adequado. Geralmente, a etiqueta permite que o aptâmero se associe, quer direta quer indiretamente, a uma sonda ou recetor que está fixo ao suporte sólido. A sonda pode ser altamente específica na sua interação com a etiqueta e manter essa associação durante todas as etapas ou procedimentos de processamento subsequentes. Uma etiqueta pode possibilitar a localização de um complexo de afinidade de aptâmeros (ou complexo de afinidade covalente de aptâmeros opcional) num endereço espacialmente definido num suporte sólido. Diferentes etiquetas, por conseguinte, podem possibilitar a localização de diferentes complexos covalentes de aptâmeros em diferentes endereços espacialmente definidos num suporte sólido. Uma etiqueta pode ser um polinucleótido, um polipéptido, um ácido nucleico peptídico, um ácido nucleico bloqueado, um oligossacárido, um polissacárido, um anticorpo, um affybody, um mimetizador de anticorpos, um recetor celular, um ligando, um lípido, biotina, qualquer fragmento ou derivado destas estruturas, qualquer combinação dos anteriores, ou qualquer outra estrutura com a qual uma sonda (ou molécula de ligação, como descrita abaixo) possa ser concebida ou configurada para se ligar ou, de outra forma, associar com especificidade. Geralmente, uma etiqueta é configurada de tal modo que não interage intramolecularmente ou com ela própria ou com o aptâmero ao qual está ligada ou do qual é parte. Se SELEX é usado para identificar um aptâmero, a etiqueta pode ser adicionada ao aptâmero quer pré- quer pós-SELEX. A etiqueta é incluída na extremidade 5' do aptâmero pós-SELEX, ou a etiqueta é incluída na extremidade 3' do aptâmero pós-SELEX, ou as etiquetas podem ser incluídas tanto nas extremidade 3' como na 5' dos aptâmeros num processo pós-SELEX.
Como ilustrado na FIG. 8D, um corante fluorescente (tal como Cy3), as frações fotocliváveis e de biotina são todos adicionados à extremidade do aptâmero. Devido à potenciais interações entre a fração fotoclivável e o corante, um separador é inserido entre estas duas frações.
Todos os constructos podem ser sintetizados utilizando a química de fosforamidite padrão. Construtos de aptâmeros representativos são mostrados da FIG. 9A à FIG. 9F. A funcionalidade pode ser dividida entre a extremidade 5' e 3' ou combinada em qualquer extremidades. Além de frações fotocliváveis, outras frações cliváveis podem ser utilizadas, incluindo frações quimicamente ou enzimaticamente cliváveis. Uma variedade de frações separadoras podem ser utilizadas e uma ou mais frações de biotina podem ser incluídas. Etiquetas (também referidas como elementos ou componentes de imobilização ou de ligação específicos) que não a biotina, podem também ser incorporadas. Os reagentes de construção adequados incluem biotin phosphoramidite, PC Linker (Glen Research PN 10-4920-02); PC biotin phosphoramidite (Glen Research PN 10-4950-02); dSpacer CE phosphoramidite (Glen Research PN 10-1914-02); Cy3 phosphoramidite (Glen Research PN 10-5913-02); e Arm26-Ach Spacer Amidite (Fidelity Systems PN SP26Ach-05).
Numa forma de realização, modificações de bases dos nucleótidos são utilizadas na produção da região variável do aptâmero. Estes nucleótidos modificados têm mostrado produzir aptâmeros que têm taxas de dissociação dos seus alvos muito lentas.
Nos métodos da presente divulgação, a mistura candidata pode compreender ácidos nucleicos modificados nos quais uma, várias (por exemplo, uma de, ou, pelo menos, uma de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30) ou todas as pirimidinas em pelo menos um, ou cada, ácido nucleico da mistura candidata é quimicamente modificada na posição 5. Opcionalmente, todos os resíduos C nos ácidos nucleicos da mistura candidata são quimicamente modificados na posição 5. Opcionalmente, todos os resíduos T nos ácidos nucleicos da mistura candidata são quimicamente modificado na posição 5. Opcionalmente, todos os resíduos U nos ácidos nucleicos da mistura candidata são quimicamente modificado na posição 5. Num outro arranjo, os aptâmeros com taxas de dissociação lentas são misturados ou expostos a uma amostra. 0 aptâmero com taxa de dissociação lenta é deixada a reagir com, ou ligam-se ao seu alvo específico na amostra para formar um complexo. Uma variedade de métodos podem ser usados para a deteção quer do alvo quer do aptâmero. 0 alvo pode ser detetado no complexo ou após libertação do complexo. 0 aptâmero pode ser detetado no complexo ou após libertação do complexo. 0 complexo aptâmero/alvo pode ser utilizado para isolar o alvo específico de outros componentes na amostra de ensaio. Várias aptâmeros podem ser usados quando um ensaio multiplexado para a deteção de uma variedade de alvos é desejável. 0 método da presente divulgação é ilustrado, em geral, nos Exemplos 1-7. 0 método da presente divulgação é ilustrado, em geral, nos Exemplos 1-6. 0 Exemplo 1 descreve o método SELEX de afinidade geral utilizando uma mistura candidata que compreende nucleótidos modificados. 0 Exemplo 2 descreve um método fotoSELEX utilizando uma mistura candidata compreendendo nucleótidos modificados e um grupo fotorreativo no terminal 5', e o método SELEX melhorado no qual a diluição é utilizada para proporcionar o processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas à mistura aptâmero:alvo equilibrada . 0 Exemplo 3 estende-se ao método descrito no Exemplo 2 com a adição de um competidor à etapa de diluição. 0 Exemplo 4 ilustra a eficácia do processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas. 0 valor de semivida de dissociação médio (ti/2) para aptâmeros utilizando os nucleótidos modificados 5-benzil-dUTP (BzdUTP), 5-isobutil-dUTP (iBdUTP), ou 5-triptamino-dUTP selecionados na ausência de um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas foi 20 minutos, com alguns aptâmeros tendo um valor ti/2 de até uma hora. Este é substancialmente mais longo do que o que foi anteriormente descrito com bases naturais ou outros nucleótidos modificados. A média para aptâmeros selecionados com um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas foi superior a 85 minutos. Mais especificamente, em referência à Figura 3B, pode ser visto que a introdução de um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas produziu aptâmeros com valores ti/2 de cerca de 1 30 min., > 60 min., > 90 min., > 120 min., > 150 min., > 180 min., > 210 e 1 240 min. Estas taxas de dissociação para complexos aptâmero:alvo são sem precedentes. O Exemplo 5 descreve a geração de aptâmeros com taxas de dissociação lentas utilizando uma mistura candidata de NpdUTP. O Exemplo 6 descreve a geração de um aptâmero com taxa de dissociação lenta para um alvo peptídico.
EXEMPLOS
Os seguintes exemplos são proporcionados apenas para fins ilustrativos e não pretendem limitar o âmbito da invenção conforme definida nas reivindicações anexas. EXEMPLO 1. Incorporação de Nucleótidos Modificados em Bibliotecas de Ácidos Nucleicos Conduz a Bibliotecas Enriquecidas de Maior Afinidade em SELEX de Afinidade A. Preparação de misturas candidatas
As misturas candidatas foram preparadas com dATP, dGTP, 5-metil-dCTP (MedCTP) e ou dTTP ou um dos três análogos de dUTP: 5-benzil-dUTP (BzdUTP) , 5-isobutil-dUTP (iBdUTP), ou 5-triptamino-dUTP (TrpdUTP) . As misturas candidatas foram preparadas por extensão da polimerase de um iniciador emparelhado com um modelo biotinilado (FIG. 2) . Para cada composição da mistura candidata, 4,8 nmol de iniciador direto de PCR e 4 nmol de modelo foram combinados em 100 μΐ de tampão de ADN polimerase ROD IX (Novagen) , aquecidos até 95 °C durante 8 minutos, e arrefecidos em gelo. Cada 100 μΐ de mistura iniciador:modelo foram adicionados a 400 μΐ de uma reação de extensão contendo tampão de ADN polimerase KOD IX, ADN polimerase KOD a 0,125 U/μΙ, e dATP, MedCTP, dGTP, e dTTP ou um análogo de dUTP, cada a 0,5 mM, e incubados a 70 °C, 30 minutos. Um produto de cadeia dupla foi capturado através das biotinas da cadeia modelo adicionando 1 ml de esferas magnéticas revestidas com estreptavidina (MagnaBind Streptavidin, Pierce, 5 mg/ml em NaCl a 1 M + TWEEN-20 a 0,05%) e incubando a 25 °C durante 10 minutos misturando. As esferas foram lavadas três vezes com 0,75 ml de tampão SB1T (HEPES a 4 0 mM, pH 7,5, NaCl a 125 mM, KC1 a 5 mM, MgCl2 a 1 mM, CaCl2 a 1 mM, TWEEN-20 a 0,05%) . A cadeia do aptâmero foi eluída a partir das esferas com 1,2 ml de NaOH a 20 mM, neutralizada com 0,3 ml de HC1 a 80 mM, e tamponada com 15 μΐ de HEPES a 1 M, pH 7,5. As misturas candidatas foram concentradas com Centricon-30 para aproximadamente 0,2 ml, e quantificadas por espectroscopia de absorção UV. B. Imobilização de proteínas alvo
As proteínas alvo foram compradas com etiquetas de poli-His, tais como, etiquetas (His)6 (R&D Systems) e imobilizadas sobre esferas paramagnéticas de Co+2-NTA (TALON, Invitrogen). As proteínas alvo foram diluídas a 0,2 mg/ml em 0,5 ml de Tampão B/W (fosfato de Na a 50 mM, pH 8,0, NaCl a 300 mM, TWEEN-20 a 0,01%), e adicionadas a 0,5 ml de esferas TALON (pré-lavadas três vezes com tampão B/W e ressuspensas até 10 mg/ml em tampão B/W) . A mistura foi submetida a rotação durante 30 minutos a 25 °C armazenada a 4 °C até à utilização. Esferas TALON revestidas com péptido (His)6 foram também preparadas e armazenadas como acima. Antes da utilização, as esferas foram lavadas 3 vezes com tampão B/W, uma vez com SB1T e ressuspensas em SB1T. C. Esquema de seleção de aptâmeros
As seleções de afinidade foram realizadas separadamente com cada mistura candidata, comparando a ligação entre esferas de proteínas alvo (sinal, S) e esferas de (His)6 (fundo, B). Para cada amostra, uma mistura candidata de ADN a 0,5 μΜ foi preparada em 40 μΐ de SB1T. 1 μΐ de (His)6_oligo complemento (1 mM) (FIG. 2) foi adicionado ao ADN, juntamente com 10 μΐ de uma mistura competidora proteica (HSA a 0,1%, caseína a 10 mM, e protrombina a 10 μΜ em SB1T).
As reações de ligação foram realizadas adicionando 50 μΐ de esferas revestidas com proteína alvo ou esferas revestidas com (His) 6 (5 mg/ml em SB1T) à mistura de ADN e incubando a 37 °C durante 15 minutos misturando. A solução de ADN foi removida e as esferas foram lavadas 5 vezes a 37 °C com SB1T contendo ADN de esperma de arenque a 0,1 mg/ml (Sigma-Aldrich). A menos que indicado, todas as lavagens foram realizadas por ressuspensão das esferas em 100 μΐ de solução de lavagem, misturando durante 30 segundos, separação das esferas com um iman, e remoção da solução de lavagem. Os aptâmeros ligados foram eluídos das esferas adicionando 100 μΐ de SB1T + guanidina-HCl a 2 M e incubando a 37 °C, 5 minutos misturando. O eluído de aptâmeros foi transferido para um novo tubo depois da separação magnética. Após os dois primeiros ciclos de seleção, as ultimas duas de cinco lavagens das esferas alvo foram feitas durante 5 minutos em vez de 30 segundos.
As esferas de iniciador foram preparadas imobilizando o iniciador de PCR reverso a esferas paramagnéticas revestidas com estreptavidina (MyOne-SA, Invitrogen). 5 ml de esferas MyOne-SA (10 mg/ml) foram lavados uma vez com NaCIT (NaCl a 5 M, TWEEN-20 a 0,01%), e ressuspensos em 5 ml de iniciador de PCR reverso biotinilado (5 μΜ em NaCIT). A amostra foi incubada a 25 °C, 15 minutos, lavada duas vezes com 5 ml de NaCIT, ressuspensa em 12,5 ml de NaCIT (4 mg/ml), e armazenada a 4 °C. 25 μΐ de esferas de iniciador (4 mg/ml em NaCIT) foram adicionados aos 100 μΐ de solução de aptâmeros em tampão de
guanidina e incubados a 50 °C, 15 minutos misturando. A solução de aptâmeros foi removida e as esferas foram lavadas 5 vezes com SB1T. Os aptâmeros foram eluidos das esferas adicionando 85 μΐ de NaOH a 20 mM e incubando a 37°C, 1 minuto misturando. 80 μΐ de eluido de aptâmeros foram transferidos para a novo tubo após separação magnética, neutralizados com 20 μΐ de HC1 a 80 mM, e tamponados com 1 μΐ de Tris-HCl a 0,5 M, pH 7,5. D. Amplificação e purificação de aptâmeros O ADN de aptâmero selecionado foi amplificado e quantificado por QPCR. 48 μΐ de ADN foram adicionados a 12 μΐ de mistura de QPCR (tampão de ADN polimerase ROD 5X, MgCl2 a 25 mM, iniciado direto de PCR a 10 μΜ, iniciador reverso de PCR biotinilado a 10 μΜ, SYBR Verde I 5X, ADN polimerase KOD a 0,125 U/μΙ, e dATP, dCTP, dGTP, e dTTP, cada a 1 mM) e ciclizado termicamente num instrumento de QPCR ABI5700 com o seguinte protocolo: 1 ciclo de 99,9 °C, 15 segundos, 55 °C, 10 segundos, 70 °C, 30 minutos; 30
ciclos de 99,9 °C, 15 segundos, 72 °C, 1 minuto. A quantificação foi feita com o software do instrumento e o número de cópias de ADN selecionadas com esferas alvo e esferas de (His)6 foram comparadas para determinar as razões sinal/fundo.
Na sequência da amplificação, o produto de PCR foi capturado em esferas MyOne-SA através da cadeia antissentido biotinilada. 1,25 ml de esferas MyOne-SA (10 mg/ml) foram lavados duas vezes com 0,5 ml de NaOH a 20 mM, uma vez com 0,5 ml de SB1T, ressuspensos em 2,5 ml de NaCl a 3 M, e armazenados a 4 °C. 25 μΐ de esferas MyOne-SA (4 mg/ml em NaCl a 3 M) foram adicionados a 50 μΐ de produto de QPCR de cadeia dupla e incubados a 25 °C, 5 minutos misturando. As esferas foram lavadas uma vez com SB1T, e a cadeia em sentido foi aluída das esferas adicionando 200 μΐ de NaOH a 20 mM, e incubando a 37 °C, 1 minuto misturando. A cadeia eluída foi descartada e as esferas foram lavadas 3 vezes com SB1T e uma vez com NaCl a 16 mM. A cadeia sentido de aptâmero foi preparada com a composição nucleotidica apropriada por extensão de iniciador da cadeia antissentido imobilizada. As esferas foram ressuspensas em 20 μΐ de mistura de reação de extensão de iniciador (tampão de ADN polimerase ROD IX, MgCl2 a 1,5 mM, iniciador direto de PCR a 5 μΜ, ADN polimerase KOD a 0,125 U/pL, dATP, MedCTP, dGTP, e ou dTTP ou análogo de dUTP, cada a 0,5 mM) e incubadas a 68 °C, 30 minutos misturando. As esferas foram lavadas 3 vezes com SB1T, e a cadeia de aptâmero foi aluída das esferas adicionando 85 μΐ de NaOH a 20 mM, e incubando a 37 °C, 1 minuto misturando. 80 μΐ de eluído de aptâmero foram transferidos para a novo tubo após separação magnética, neutralizados com 20 μΐ de HC1 a 80 mM, e tamponados com 5 μΐ de HEPES a 0,5 M, pH 7,5. E. Rigor e avaliação da seleção A concentração relativa de proteína alvo da etapa de seleção foi reduzida a cada ciclo em resposta à razão S/B como se segue, onde o sinal S e fundo B são definidos na Secção C acima: se S/B < 10, [P] (i+1) = [P] i se 10 < S/B < 100, [P] (i+1) = [P]i /3.2 se S/B > 100, [P] (i+1) = [P]i /10 onde [P] = concentração proteica e i = número atual do ciclo. A concentração de proteína alvo foi reduzida ajustando a massa de esferas de proteína alvo (e esferas de (His)6 para determinação de fundo) adicionadas à etapa de seleção.
Depois de cada ciclo de seleção, o estado de convergência da mistura de ADN enriquecida foi determinado. 5 μΐ de produto de QPCR de cadeia dupla foram diluídos até 200 μΐ com MgCl2 a 4 mM contendo SYBR Verde I IX. As amostras foram cobertas com 75 μΐ de óleo de silicone e analisadas quanto à convergência usando uma análise Cot que mede o tempo de hibridização para misturas de complexos de oligonucleótidos de cadeia dupla. A amostra é ciclizada termicamente com o seguinte protocolo: 3 ciclo de 98 °C, 1 minuto, 85 °C, 1 minuto; 1 ciclo de 93 °C, 1 minuto, 85 °C, 15 minutos. Durante os 15 minutos a 85 °C, imagens fluorescentes são medidas em intervalos de 5 segundos. A intensidade de fluorescência é representada graficamente como uma função de log (tempo) para avaliar a diversidade das sequências. F. Medição da constante de ligação em equilíbrio (Kd)
As constantes de ligação em equilíbrio das bibliotecas enriquecidas foram medidas utilizando a partição de esferas TALON. 0 ADN foi renaturado por aquecimento até 95 °C e arrefecimento lento até 37 °C. Os complexos formaram-se misturando uma baixa concentração de ADN radiomarcado (-lxlCT11 M) com um intervalo de concentrações de proteína alvo (lxlCT7 M a lxlCT12 M final) em tampão SB1 (descrito anteriormente) , e incubando a 37 °C. Uma porção de cada reação foi transferida para uma membrana de nylon e seca para determinar as contagens totais em cada reação. Uma pequena quantidade de esferas MyOne TALON (Invitrogen) a 5 mg/ml foi adicionada ao restante de cada reação e misturado a 37 °C durante um minuto. Uma porção passou através de uma placa Multiscreen HV (Millipore) sob vácuo para separar os complexos ligados a proteínas de ADN não ligado e lavada com 100 pL de tampão SB1. As membranas de nylon e placas Multiscreen HV foram lidas num Phosphorlmager e a quantidade de radioatividade em cada amostra quantificada utilizando um FLA-3000 FUJI . A fração de ADN capturado foi representada graficamente como uma função da concentração proteica e um algoritmo de ajustamento de curva não linear foi utilizado para extrair as constantes de ligação em equilíbrio (valores de Kd) a partir dos dados. A Tabela 1 mostra os valores de Kd determinados para cada mistura candidata enriquecida para um conjunto de alvos. NT indica que a biblioteca enriquecida para uma composição de bases particular não pareceu ter-se alterado relativamente à mistura candidata original, conforme determinado por análise Cot (descrita anteriormente), e foi, por conseguinte, Não Testada (NT). A Tabela 1 mostra as constantes de ligação em equilíbrio (Kd) para conjuntos enriquecidos para quinze alvos proteicos diferentes e quatro bibliotecas de ADN diferentes: bases de ocorrência natural (dT), benzilo (BzdU), isobutilo (iBdU) ou triptofano (TrpdU). Um aptâmero com um Kd menor que 1 x 1CT8 é desejável. A utilização de bases modificadas no processo SELEX produz uma percentagem significativamente mais elevada de aptâmeros de elevada afinidade desejáveis. Observou-se que apenas 2 dos 14 aptâmeros produzidos com os nucleótidos normais tiveram as desejadas taxas de dissociação lentas. Aptâmeros com taxas de dissociação lentas produzidos com os nucleotídeos modificados foram identificados 9 de 14, 7 de 14, e 14 de 14 para BzdUTP, iBdUTP e TRPdUTP, respetivamente.
Tabela 1. Constantes de ligação em equilíbrio (Kd) das bibliotecas enriquecidas selecionadas com diferentes nucleótidos modificados, reportadas em unidades de molaridade. NT = não testado.
EXEMPLO 2. Geração de Fotoaptâmeros Utilizando FotoSELEX Fixo em 5' e um Processo de Enriquecimento de Taxas de Dissociação Lentas por Diluição A. Preparação de misturas candidatas
As misturas candidatas contendo dATP, dCTP, dGTP e BzdUTP foram preparadas por extensão da polimerase de um iniciador emparelhado com um modelo biotinilado (FIG. 4A-B) . Para cada modelo, quatro iniciadores diretos diferentes foram utilizados, cada um possuindo um cromóforo único na terminação 5' (FIG. 5). 5). Para cada mistura candidata, 11 nmol de iniciador direto (com cromóforo em 5') e 10 nmol de modelo foram combinados em 250 μΐ de tampão de extensão do iniciador (Tris-HCl a 120 mM, pH 7,8, KC1 a 10 mM, (NH4)2S04 a 6 mM, MgS04 a 7 mM, BSA a 0,1 mg/ml, Triton X-100 a 0,1%), aquecidos até 95 °C durante 5 minutos, arrefecidos em gelo. 125 ml de cada mistura iniciador:modelo foram adicionados a 1 ml de reação de extensão contendo tampão de extensão do iniciador, ADN polimerase KOD a 0,125 U/μΙ, e dATP, dCTP, dGTP, e BzdUTP, cada a 0,5 mM, e incubados a 70 °C, 30 minutos. Cada 1 ml de reação foi dividido em quarto aliquotas de 250 μΐ e refrigeradas em gelo. O produto de cadeia dupla foi capturado através das biotinas na cadeia modelo adicionando 1 ml de esferas magnéticas revestidas com estreptavidina (MagnaBind-Streptavidin, Pierce, 5 mg/ml em NaCl a 1 M + TWEEN-20 a 0,05%) a cada alíquota de 250 μΐ e incubando a 25 °C durante 60 minutos misturando. As esferas foram lavadas três vezes com 0,5 ml de tampão SB17T (HEPES a 40 mM, pH 7,5, NaCl a 125 mM, KC1 a 5 mM, MgCl2 a 5 mM, EDTA a 1 mM, TWEEN-20 a 0,05%) . A cadeia de aptâmero foi eluida das esferas com 1 ml de NaOH a 20 mM, neutralizada com 0,25 ml de HC1 a 80 mM, e tamponada com 10 μΐ de HEPES a 1 M, pH 7,5. As misturas candidatas foram concentradas com Centricon-30 até aproximadamente 0,2 ml, e quantificadas por espectroscopia de absorção UV. B. Preparação de proteínas alvo
Proteínas alvo não marcadas foram biotiniladas por acoplamento covalente de NHS-PE04-biotina (Pierce) a resíduos de lisina. As proteínas (300 pmol em 50 μΐ) foram mudadas para SB17T com uma coluna MicroSpin Sephadex G-25. NHS-PE04-biotina foi adicionado até 1,5 mM e a reação foi incubada a 4 °C durante 16 horas. NHS-PE04-biotina não reagido foi removido com uma coluna MicroSpin Sephadex G-25. C. Seleção de aptâmeros com processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas e fotoligação cruzada
As seleções foram realizadas separadamente com cada mistura candidata, comparando a ligação entre amostras com proteína alvo (sinal, S) e amostras sem proteína alvo (fundo, B) . Os primeiros três ciclos foram realizados com seleção para afinidade (não fotoligação cruzada); os segundo e terceiro incluíram um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas. Os ciclos quarto a oito incluíram tanto um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas como fotoligação cruzada.
Para cada amostra, uns 90 μΐ de mistura de ADN foram preparados em SB17T com 10-20 pmol de mistura candidata (100 pmol no primeiro ciclo) e 100 pmol de iniciador reverso. As amostras foram aquecidas até 95 °C durante 3 minutos e arrefecidas até 37 °C a uma taxa de 0,1 °C/segundo. As amostras foram combinadas com 10 μΐ de mistura competidora proteica (HAS a 0,1%, caseína a 10 μΜ, e protrombina a 10 μΜ em SB17T) , adicionadas a 0,5 mg de esferas com estreptavidiva Dynal MyOne (pré-lavadas duas vezes com NaOH a 20 mM e uma vez com SB17T), e incubadas a 37 °C durante 5 minutos misturando. As esferas foram removidas por separação magnética.
Reações de ligação foram realizadas adicionando 10 μΐ de proteína alvo (0,5 μΜ em SB17T) ou SB17T a 40 μΐ de mistura de AND e incubando a 37 °C durante 30 minutos.
Quando um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas foi utilizado, as amostras foram diluídas 20 X adicionando 950 μΐ de SB17T (pré-aquecido até 37 °C) , e incubadas a 37 °C durante 30 minutos antes da captura de complexos.
Os complexos foram capturados sobre esferas SA através de biotinas proteicas adicionando 0,25 mg de esferas MyOne-SA (Invitrogen) e incubando a 37 °C durante 15 minutos misturando. ADN livre foi removido lavando as esferas cinco vezes com SB17T. A menos que indicado, todas as lavagens foram realizadas ressuspendendo as esferas em 100 μΐ de solução de lavagem, misturando durante 30 segundos a 25 °C, separando as esferas com um íman, e removendo a solução de lavagem. A cadeia de aptâmero foi eluída das esferas adicionado 85 μΐ de NaOH a 20 mM, e incubando a 37 °C, 1 minuto misturando. 80 μΐ de eluído de aptâmero foram transferidos para um novo tubo após separação magnética, neutralizados com 20 μΐ de HC1 a 80 mM, e tamponados com 1 μΐ de Tris-HCl a 0,5 M, pH 7,5.
Quando fotosseleção foi utilizada, os 50 μΐ de reações de ligação, (ou 1 ml de reações de ligação após um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas opcional por diluição) foram irradiadas desde cima com uma lâmpada de mercúrio de alta pressão (Optical Associates, Inc. model 0131-0003-01, 500 W, com conjunto de espelho de 310 nm). As misturas candidatas possuindo um cromóforo BrdU foram irradiadas durante 37 segundos, aquelas possuindo um cromóforo ANA foram irradiadas durante 60 segundos, e aquelas possuindo um cromóforo AQ ou psoraleno foram irradiadas durante 10 minutos. Um filtro adicional (fibra de vidro de 5 mm) foi utilizado para os cromóforos ANA, AQ e psoraleno para eliminar comprimentos de onda desnecessários, mas potencialmente prejudiciais abaixo de 320 nm. Os complexos foram capturados conforme acima, e o ADN que não realizou fotoligação cruzada foi removido lavando as esferas uma vez com guanidina-HCl a 4 M + TWEEN-20 a 0,05% a 50 °C durante 10 minutos, uma vez com NaOH a 20 mM a 25 °C durante 2 minutos, duas vezes com SB17T, e uma vez com NaCl a 16 mM. O ADN que realizou ligação cruzada não foi removido da superfície das esferas para as etapas de amplificação. D. Amplificação e purificação de aptâmeros O ADN de aptâmero selecionado foi amplificado e quantificado por QPCR. O ADN de aptâmero selecionado foi amplificado e quantificado por QPCR. 48 μΐ de ADN foram adicionados a 12 pL de mistura de QPCR (tampão de ADN polimerase ROD 5X, MgCÍ2 a 25 mM, iniciador direto de PCR a 10 μΜ, iniciador reverso de PCR biotinilado a 10 μΜ, SYBR Verde I 5X, ADN polimerase KOD a 0,125 U/μΙ, e dATP, dCTP, dGTP, e dTTP cada a 1 mM) e ciclizados termicamente num instrumento de QPCR Bio-Rad MylQ com o seguinte protocolo: 1 ciclo de 99, 9 °C, 15 s, 55 °C, 10 s, 68 °C, 30 min, 30 ciclos de 99,9 °C, 15 s, 72 °C, 1 minuto. Para ciclos de fotoSELEX, 30 min iniciais de incubação são realizados. A quantificação foi efetuada com o software do instrumento e o número de cópias de ADN selecionadas e sem proteína alvo foram compradas para determinar as razões sinal/fundo.
Quando fotosseleção foi utilizada, uma cópia de ADNc do ADN selecionado foi preparada por extensão do iniciador na superfície das esferas. As esferas lavadas foram ressuspensas em 20 μΐ de mistura de extensão de ADNc (tampão de extensão do iniciador contendo iniciador reverso de PCR a 5 μΜ, dATP, dCTP, dGTP, e dTTP, cada a 0,5 mM e ADN polimerase KOD a 0,125 U/μΙ) e incubadas a 68 °C durante 30 minutos misturando. As esferas foram lavadas 3 vezes com SB17T, e a cadeia de aptâmero foi eluida das esferas adicionando 85 pL de NaOH a 20 mM, e incubando a 37 °C, 1 minuto misturando. 80 μΐ de eluido de aptâmero foram transferidos para um novo tubo após separação magnética, neutralizados com 20 μΐ de HC1 a 80 mM, e tamponados com 1 μΐ de Tris-HCl a 0,5 M, pH 7,5. O ADNc foi amplificado e quantificado por QPCR conforme acima durante os 30 ciclos a 99,9 °C, 15 segundos, 72 °C, 1 minuto.
Na sequência da amplificação, o produto de PCR foi capturado em esferas MyOne-SA através da cadeia antissentido biotinilada. 1,25 ml de esferas MyOne-SA (10 mg/ml) foram lavados duas vezes com 0,5 ml de NaOH a 20 mM, uma vez com 0,5 ml de SB17T, ressuspensos em 1,25 ml de NaCl a 3 M + Tween a 0,05%, e armazenados a 4 °C. 25 μΐ de esferas MyOne-SA (10 mg/ml em NaCIT a 3 M) foram adicionados a 50 μΐ de produto de QPCR de cadeia dupla e incubados a 25 °C, 5 minutos misturando. As esferas foram lavadas uma vez com SB17T, e a cadeia em "sentido" foi eluida das esferas adicionando 200 μΐ de NaOH a 20 mM, e incubando a 37 °C, 1 minuto misturando. A cadeia eluida foi descartada e as esferas foram lavadas 3 vezes com SB17T e uma vez com NaCl a 16 mM. A cadeia em sentido de aptâmero foi preparada com o cromóforo apropriado por extensão do iniciador a partir da cadeia antissentido imobilizada. As esferas foram ressuspensas em 20 μΐ de mistura de reação de extensão do iniciador (tampão de extensão do iniciador 1, MgCl2 a 1,5 mM, iniciador direto a 5 μΜ com cromóforo em 5' apropriado, dATP, dCTP, dGTP, e BzdUTP, cada a 0,5 mM e ADN polimerase KOD a 0,125 U/μΙ) e incubadas a 68 °C, 30 minutos misturando. As esferas foram lavadas 3 vezes com SB17T, e a cadeia de aptâmero foi eluida das esferas adicionando 85 μΐ de NaOH a 20 mM, e incubando a 37 °C, 1 minuto misturando. 80 μΐ de eluído de aptâmero foram transferidos para a novo tubo após separação magnética, neutralizados com 20 μΐ de HC1 a 80 mM, e tamponados com 5 μΐ de HEPES a 0,5 M, pH 7,5. E. Rigor e avaliação da seleção A proteína alvo foi ajustada em cada ciclo, conforme descrito no Exemplo 1. Após cada ciclo de seleção, o estado de convergência do conjunto enriquecido foi determinado conforme descrito no Exemplo 1. F. Constantes de ligação em equilíbrio de bibliotecas enriquecidas A afinidade de ligação foi determinada conforme descrita no Exemplo 1 acima, mas com esferas de captura MyOne-SA. A seguinte tabela, Tabela 2, resume as constantes de ligação em equilíbrio (Kd) obtidas usando o protocolo fotoSELEX com um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas.
Tabela 2. Constantes de ligação em equilíbrio (Kd) das bibliotecas enriquecidas selecionadas com diferentes cromóforos, reportadas em unidades de molaridade. Não foram efetuadas medições em bibliotecas que falharam em convergir (indicadas com um x).
G. Ensaio de atividade de ligação cruzada 0 rendimento da ligação cruzada de bibliotecas enriquecidas foi determinado medindo a percentagem de ADN que realizou ligação cruzada com uma proteína sob condições de saturação de proteína e luz. 0 ADN radiomarcado (50 pM) foi misturado com iniciador reverso (16 nM) em SB17T, aquecido até 95 °C durante 3 minutos, e arrefecido até 37 °C a 0,1 °C/segundo. Proteína alvo foi adicionada à mistura de ADN para uma concentração final de 10 nM e incubada a 37 °C durante 30 minutos. Amostras controlo sem proteína foram preparadas em simultâneo. As amostras foram submetidas a ligação cruzada sob as condições específicas do cromóforo descritas acima, mas com uma dose de saturação (6 minutos para BrdU, 10 minutos para ANA, e 30 minutos para AQ e Psor) . As amostras foram analisadas por PAGE desnaturante, FIG. 6, e quantificadas e os resultados estão tabulados na Tabela 3. Rendimentos de ligação cruzada das bibliotecas enriquecidas selecionadas com diferentes cromóforos, reportados em unidades de percentagem de ADN total que realizou ligação cruzada com uma proteína. Não foram efetuadas medições em bibliotecas que falharam em convergir (indicadas com um x).
EXEMPLO 3. Geração de Aptâmeros com Taxas de Dissociação Lentas Utilizando um Processo de Enriquecimento de Taxas de Dissociação Lentas com um Competidor A. Preparação de misturas candidatas
Misturas candidatas contendo dATP, dCTP, dGTP, e BzdUTP foram preparadas por extensão da polimerase de um iniciador emparelhado com um modelo biotinilado para 94 alvos proteicos. 55 nmol de iniciador direto (com cromóforo ANA em 5') e 55 nmol de modelo foram combinados em 0,5 ml de tampão de extensão do iniciador (Tris-HCl a 120 mM, pH 7,8, KC1 a 10 mM, (NH4)2S04 a 6 mM, MgS04 a 7 mM, BSA a 0,1 mg/ml, Triton X-100 a 0,1%), aquecidos até 95 °C durante 5 minutos, 70 °C durante 5 minutos, 48 °C durante 5 minutos e arrefecidos em gelo. A mistura iniciador:modelo foi adicionada a 5,5 ml de reação de extensão contendo tampão de extensão do iniciador, ADN polimerase KOD a 0,125 U/μΙ, e dATP, dCTP, dGTP, e BzdUTP, cada a 0,5 mM, e incubados a 70°C, 60 minutos. Após a conclusão da reação de extensão, a solução foi resfriada em gelo. O produto de cadeia dupla foi capturado através das biotinas na cadeia modelo adicionando 25 ml de esferas magnéticas revestidas com estreptavidina (MagnaBind-Streptavidin, Pierce, 5 mg/ml em NaCl a 01 M + TWEEN-20 a 0,05%) ao produto da extensão do iniciador e incubando a 25 °C durante 15 minutos girando. As esferas foram lavadas três vezes com 40 ml de tampão SB17T (HEPES a 40 mM, pH 7,5, NaCl a 125 mM, KC1 a 5 mM, MgCl2 a 5 mM, EDTA a 1 mM, TWEEN-20 a 0,05%). A cadeia de aptâmero foi eluida das esferas adicionado 35,2 ml de NaOH a 20 mM, durante 5 minutos agitando. A cadeia eluida foi neutralizada com 8,8 ml de HC1 a 80 mM, e tamponada com 400 μΐ de HEPES a 1 M, pH 7,3. As misturas candidatas foram concentradas com Centricon-30 até aproximadamente 0,7 ml, e quantificadas por espectroscopia de absorção UV. B. Preparação de proteínas alvo
As proteínas alvo não marcadas foram biotiniladas conforme descrito no Exemplo 2. C. Seleção de aptâmeros com processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas e fotoligação cruzada
As seleções foram realizadas separadamente, conforme descrito no Exemplo 2, com a adição de sulfato de dextrano a 10 mM como um competidor para religação de aptâmeros durante o processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas nos ciclos seis a nove. O processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas foi empregue de três formas diferentes. Nos ciclos dois e três, as amostras foram diluídas 20X adicionando 950 μΐ de SB17T (pré-aquecido até 37 °C) , e incubadas a 37 °C durante 30 minutos antes da captura de complexos. Nos ciclos quatro e cinco, as amostras foram diluídas 20X adicionando 950 μΐ de SB17T (pré-aquecido até 37 °C) , e incubadas a 37 °C durante 30 minutos antes da captura da ligação cruzada. Nas rondas seis e sete, as amostras foram diluídas 20X adicionando 950 μΐ de SB17T (pré-aquecido até 37 °C) . 50 μΐ de cada amostra diluída foram diluídos novamente por transferência para 950 μΐ de SB17T + sulfato de dextrano 5000K a 10 mM (pré-aquecido até 37 °C) para dar uma diluição geral de 400X, e incubados a 37 °C durante 60 minutos antes da ligação cruzada. Nos ciclos oito e nove, as amostras foram diluídas 20X adicionando 950 μΐ de SB17T (pré-aquecido até 37 °C) , e 50 μΐ de cada amostra foram diluídos novamente por transferência para 950 μΐ de SB 17T (pré-aquecido até 37 °C) para dar uma diluição de 400X. Finalmente, 50 μΐ de cada amostra 400X diluída foram diluídos novamente por transferência para 950 μΐ de SB17T + sulfato de dextrano 5000K a 10 mM (pré-aquecido até 37 °C) para dar uma diluição geral de 8000X, e incubados a 37 °C durante 60 minutos antes da ligação cruzada. Os complexos foram capturados e lavados conforme descrito no Exemplo 2. Quando fotoligação cruzada foi utilizada, 1 ml de reações de ligação após o processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas foi irradiado desde cima com uma matriz de LEDs de 47 0 nm durante 60 segundos antes da captura de complexos como no Exemplo 2. D. Amplificação e purificação de aptâmeros A amplificação e purificação foram realizadas como no Exemplo 2. E. Rigor e avaliação da seleção A proteína alvo foi ajustada em cada ciclo, conforme descrito no Exemplo 1, exceto nos ciclos seis e oito. De forma a maximizar o sinal após estas diluições grandes, aumentou-se a proteína alvo até 100 nM para os ciclos seis e oito. Após cada ciclo de seleção, o estado de convergência do conjunto enriquecido foi determinado conforme descrito no Exemplo 1. F. Protocolo de determinação da constante da taxa de dissociação A constante da taxa para a dissociação (koff) do complexo aptâmero:proteína foi determinada para cada aptâmero por medição da fração de complexos aptâmero:proteína pré-formados que permanecem ligados após diluição como uma função do tempo. Um aptâmero radiomarcado (50 pM) foi equilibrado em SB17T-0.002 (SB17T com TWEEN-20 reduzido a 0,002%) a 37 °C com proteína a uma concentração 10X maior que o valor de Kd medido. As amostras foram diluídas 100X com SB17T-0.002 a 37 °C e alíquotas foram removidas em vários pontos temporais e submetidas a partição para separar complexos proteína:aptâmero de aptâmeros livres. A partição foi realizada adicionando resina ZORBAX (Agilent) à amostra, capturando os complexos sobre a resina, passando a amostra através de uma membrana DuraPore sob vácuo, e lavando a resina com SB17T-0.002. Para as proteínas não eficientemente capturadas com a resina ZORBAX, o ensaio foi realizado com a proteína biotinilada em SB17T e a partição foi realizada capturando os complexos com esferas Dyanal MyOne-SA. A quantidade de complexos que permanece em cada ponto temporal foi determinada por quantificação do aptâmero radiomarcado sobre a resina com um Phosphorlmager FLA-3000 FUJI. A fração de complexo foi representada graficamente como uma função do tempo e a constante da taxa de dissociação (kQff) e valor de semivida de dissociação (ti/2) foram determinados por ajuste dos dados a uma expressão analítica para cinéticas de dissociação biomolecular utilizando regressão não linear. G. Propriedades cinéticas de alguns aptâmeros A seguinte tabela, Tabela 4, resume os valores de semivida de dissociação (11/2) obtidos para aptâmeros selecionados contra 10 alvos utilizando este protocolo.
Tabela 4. Valores de semivida de dissociação (11/2) de aptâmeros utilizando o protocolo da etapa de enriquecimento de taxas de dissociação lentas com um competidor.
Exemplo 4: O Processo de Enriquecimento de Taxas de Dissociação Lentas Aumenta a Semivida de Dissociação de Aptâmeros Selecionados
Os valores de semivida de dissociação (11/2) foram medidos e representados graficamente para 65 aptâmeros que foram selecionadas ou pelo método SELEX de afinidade descrito no Exemplo 1 ou pelos métodos fotoSELEX descritos na Patente U.S. N.° 6.458.539, intitulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands" sem um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas (Fig. 3A) . Os valores de ti/2 também foram medidos e representados graficamente para 72 aptâmeros que foram selecionados pelo processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas descrito no Exemplo 2 com um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas através de diluição ou diluição com competidor (Fig. 3B) . 0 valor de semivida (11/2) médio para aptâmeros utilizando os nucleótidos modificados 5-benzil-dUTP (BzdUTP), 5-isobutil-dUTP (iBdUTP), ou 5-triptamino-dUTP selecionados na ausência de um processo de
enriquecimento de taxas de dissociação lentas foi 20 minutos, com alguns aptâmeros tendo um valor ti/2 de até uma hora. Este é substancialmente mais longo do que o que foi anteriormente descrito com bases naturais ou outros nucleótidos modificados. A média para aptâmeros selecionados com um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas foi acima de 85 minutos com alguns aptâmeros tendo um valor ti/2 superior a quatro horas. Exemplo 5: Geração de Aptâmeros a partir de uma Biblioteca Aleatória com NpdUTP A. Preparação de misturas candidatas
Misturas candidatas contendo dATP, dCTP, dGTP, e NpdUTP foram preparadas conforme descrito no Exemplo 3, mas sem o grupo fotorreativo ANA em 5'. B. Imobilização de proteínas alvo
As proteínas alvo continham uma etiqueta (His)6 e foram capturadas com esferas de Co+2-NTA conforme descrito no Exemplo 1. C. Seleção de aptâmeros com Processo de Enriquecimento de Taxas de Dissociação Lentas A seleção de aptâmeros foi realizada conforme descrita no Exemplo 3, mas sem fotoligação cruzada. D. Amplificação e purificação de aptâmeros A amplificação e purificação foram realizadas conforme descritas no Exemplo 3. E. Rigor e avaliação da seleção 0 rigor e avaliação da seleção foram realizados conforme descritos no Exemplo 3. F. Propriedades dos aptâmeros
As constantes de ligação em equilíbrio (Kd) de quatro aptâmeros desta seleção são listadas na Tabela 5.
EXEMPLO 6. Geração de Aptâmeros com Taxas de Dissociação Lentas para um Alvo Peptídico Utilizando um Processo de Enriquecimento de Taxas de Dissociação Lentas com um Competidor A. Preparação de misturas candidatas
Misturas candidatas contendo dATP, dCTP, dGTP, e BzdUTP foram preparadas por extensão da polimerase de um iniciador com um cromóforo ANA em 5' e purificadas conforme descrito no Exemplo 3. B. Seleção de aptâmeros com processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas e fotoligação cruzada A seleção de aptâmeros foi realizada conforme descrito no Exemplo 3, com o péptido alvo biotinilado de 29 aminoácidos SMAP29 (Péptido Antibacteriano Mieloide de Ovelha MAP-29, Anaspec). C. Amplificação e purificação de aptâmeros A amplificação e purificação foram realizadas conforme descritas no Exemplo 3. D. Rigor e avaliação da seleção 0 rigor e avaliação da seleção foram realizados conforme descritos no Exemplo 3. E. Propriedades dos aptâmeros A constante de ligação em equilíbrio (Kd) de um aptâmero desta seleção foi l,2e-8 M (medida de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 1). A semivida de dissociação (11/2) deste aptâmero foi 69 minutos (medida de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 3). Os resultados são mostrados na FIG. 12A e FIG. 12B. EXEMPLO 7: CAPTURA HÍBRIDA COM ESFERAS DE AFINIDADE Etapa 1: EXEMPLO 7: Medições proteicas em amostras de teste são possíveis através de aptâmeros com taxas de dissociação lentas
Etapa 1: Preparação de misturas aptâmero/iniciador e amostras de teste. Aptâmeros com um marcador de deteção de Cy3 e biotina (4 nM cada) são misturados com uma sonda de captura 3x em excesso (oligonucleótido complementar à região fixa 3' do aptâmero contendo uma etiqueta de biotina e elemento fotoclivável) em SB17T IX e aquecidos a 95 °C durante 4 minutos, em seguida, 37 °C durante 13 minutos, e diluídos 1:4 em SB17T IX. 55 ul de mistura aptâmero/iniciador são adicionados a uma placa de microtitulação (Hybaid # AB-0407) e selados com uma folha metálica. As amostras de teste são preparadas numa placa de microtitulação, misturando concentrações conhecidas de analitos proteicos em SB17T e diluindo de forma seriada com SB17T.
Etapa 2: Equilíbrio das amostras 55 ul de mistura aptâmero/iniciador são adicionados a 55 ul de amostra de teste e incubados a 37 °C durante 15 minutos numa placa de microtitulação selada com uma folha metálica. A concentração final de cada aptâmero na mistura de equilíbrio é 0,5 nM. Após equilíbrio, todas as etapas subsequentes deste método são realizadas à temperatura ambiente a menos que indicado em contrário.
Etapa 3: Captura de aptâmeros e remoção de proteínas livres
Uma placa de filtração DuraPore (Millipore HV cat# MAHVN4550) foi lavada uma vez com 100 ul de SB17T IX por filtração sob vácuo, e 133,3 ul de resina de estreptavidina-agarose a 7,5% (Pierce) são adicionados a cada poço e lavados duas vezes com 200 ul de SB17T IX. 100 ul de amostras equilibradas são transferidos para uma placa DuraPore contendo a resina de estreptavidina-agarose e incubados num ThermoMixer (Eppendorf) a 800 rpm durante 5 minutos. A resina é lavada uma vez com 200 ul de SB17T IX + biotina a 100 uM e uma vez com 200 ul de SB17T IX.
Etapa 4: Marcação proteica com biotina 100 ul de NHS-PE04-biotina a 1,2 mM em SB17T, preparados imediatamente antes da utilização, são adicionados à resina com aptâmero e complexos aptâmero:proteína capturados num ThermoMixer a 800 rpm durante 20 minutos. A resina é lavada cinco vezes com 200 ul de SB17T IX por filtração sob vácuo.
Etapa 5: Processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas & Fotoclivagem O direcionador de goteio é removido da parte inferior da placa DuraPore e a placa é colocada sobre uma placa de recolha de microtitulação de 1 ml. A resina é lavada uma vez com 200 ul de SB17T IX por centrifugação a 1000 x g durante 30 s. 80 uL de SB17T IX + DxS04 a 10 mM são adicionados à resina e irradiados com uma lâmpada de mercúrio BlackRay num ThermoMixer a 800 rpm durante 10 minutos. A placa DuraPore é transferida para uma nova placa DeepWell de 1 ml e centrifugada a 1000 x g durante 30 segundos para recolher o aptâmero fotoclivável e complexos proteína:aptâmero.
Etapa 6: Captura proteica e remoção de aptâmeros livres 50 ul de esferas paramagnéticas com estreptavidina
MyOne Cl (Invitrogen) (10 mg/ml em SB17T IX ) são adicionados a uma placa de microtitulação. As esferas são separadas com um iman durante 60 segundos e o sobrenadante é removido. 225 ul de mistura fotoclivável são adicionados às esferas e misturados durante 5 minutos. As esferas são lavadas quatro vezes com 200 ul de SB17T IX, separando as esferas magnéticas e substituindo o tampão de lavagem. O tampão de lavagem final é removido.
Etapa 7: Eluição de aptâmeros 100 ul de tampão de eluição de fosfato sódico (Na2HPC>4 a 10 mM, pH 11 ) são adicionados às esferas e misturados durante 5 minutos. 90 ul de eluido são transferidos para uma placa de microtitulação e neutralizados com 10 ul de tampão de neutralização de fosfato sódico (NaH2PC>4 a 10 mM, pH 5) .
Etapa 8: Hibridização de aptâmeros para microarrays
Matrizes de ADN são preparadas com sondas de captura de oligonucleótidos que compreendem a sequência complementar da região variável de cada aptâmero imobilizado num suporte personalizado para lâminas de microscópio. Existem múltiplas matrizes (submatrizes) em cada lâmina, e as submatrizes estão fisicamente separadas por aposição de uma junta (Grace) para aplicação da amostra. As matrizes são pré-tratadas com 100 ul de tampão de bloqueio e incubadas durante 15 minutos a 65 °C num ThermoMixer. 30 ul de tampão de hibridização rico em sal são adicionados a 90 ul de eluido de aptâmero neutralizado numa placa de microtitulação, incubados a 95 °C durante 5 minutos num termociclador, e arrefecidos até 65 °C a 0,1 °C/segundo. O tampão de bloqueio é removido das matrizes e 110 ul de amostra de aptâmero são adicionados às matrizes e incubados numa câmara húmida a 65 °C durante 20 horas.
Etapa 9: Lavagem das matrizes A amostra de aptâmero é removida das matrizes e as matrizes são lavadas uma vez com 200 ul tampão de lavagem de fosfato de sódio e Tween-20 a 65 °C, com a junta no lugar, e três vezes com 25 ml de tampão de lavagem de fosfato de sódio e Tween-20 a 65 °C num frasco de Papanicolau com a junta removida. As matrizes são secas com uma pistola de nitrogénio.
Etapa 10: Quantificar sinal nas matrizes
As lâminas de matrizes são digitalizadas num LS300 Reloaded TECAN num canal apropriado para a deteção de Cy3 e o sinal de Cy3 em cada recurso da matriz é quantificado. Resultados:
Aptâmeros específicos para três alvos diferentes (bFGF, VEGF, e Mieloperoxidase) foram produzidos usando métodos e materiais SELEX tradicionais. Um segundo conjunto de aptâmeros específicos para o mesmo conjunto de alvos foi obtido usando nucleótidos modificados na posição 5' e selecionados para taxas de de dissociação dos seus respetivos alvos muito lentas. Os aptâmeros obtidos no processo tradicional tiveram taxas de dissociação medidas na ordem de menos de 5 minutos. Os aptâmeros obtidos a partir dos nucleótidos modificados e usando um processo de enriquecimento de taxas de dissociação lentas durante a seleção tiveram taxas de dissociação superiores a 20 minutos. Dois conjuntos de aptâmeros foram obtidos para cada alvo mediante os dois métodos diferentes num total de 4 populações de aptâmeros diferentes para cada alvo. A capacidade destas populações de aptâmeros para a medição de concentrações de analitos em amostras de teste foi avaliada conforme descrito acima sobre um intervalo de concentrações alvo. O sinal relativo a partir da deteção no chip de ADN foi representado graficamente contra a concentração alvo de entrada. Veja-se a FIG. 11A a 11C. A curva de resposta dos aptâmeros tradicionais é muito plana e a sensibilidade de deteção é bastante baixa. A sensibilidade de deteção dos respetivos alvos a partir dos aptâmeros com taxas de dissociação lentas é excelente. Os dados apoiam a necessidade de utilização de aptâmeros com taxas de dissociação lentas para o máximo desempenho analítico. EXEMPLO 8. Geração de Aptâmeros BsdU de Elevada Afinidade para Trombina Humana A. Preparação de misturas candidatas
Uma mistura candidata contendo dATP, dCTP, dGTP, e BzdUTP foi preparada por extensão da polimerase de um iniciador com um cromóforo ANA em 5' e purificada conforme descrito no Exemplo 3. B. Preparação de proteína alvo
Trombina humana foi marcada com biotina conforme descrito no Exemplo 2. C. Seleção de aptâmeros com enriquecimento de taxas de dissociação lentas e fotoligação cruzada A seleção de aptâmeros foi realizada conforme descrita no Exemplo 3 com trombina humana biotinilada como o alvo. D. Amplificação e purificação de aptâmeros A amplificação e purificação foram realizadas conforme descritas no Exemplo 3. E. Rigor e avaliação da seleção 0 rigor e avaliação da seleção foram realizados conforme descritos no Exemplo 3. F. Propriedades dos aptâmeros A constante de ligação em equilíbrio (Kd) do aptâmero 2336-17 desta seleção foi 4,4e-ll M (medida de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 1), como demonstrado na FIG. 15 .
Aptâmeros de ADN de cadeia simples para trombina humana foram selecionados a partir de uma biblioteca compreendendo nucleótidos naturais dA, dC, dG e dT (Bock, et al., 1992) . As afinidades de ligação dos aptâmeros tiveram valores de Kd variando de 2,5e-8 M a 2,0e-7 M. Utilizando um protocolo semelhante com uma biblioteca compreendendo dA, dC, dG naturais e 5- (1-pentinil)-dUTP modificado, foram selecionados aptâmeros com valores de Kd
variando de 4e-7 M a le-6 M (Latham et al., 1994) . O Exemplo 7 descreve a descoberta de aptâmeros de afinidade muito elevada para trombina humana selecionados a partir de uma biblioteca compreendendo dA, dC, dG e BzdU modificado. 0 aptâmero de maior afinidade desta biblioteca teve um valor de Kd de 4,4e-ll M
Uma série de patentes, publicações de pedidos de patentes e publicações cientificas são citados ao longo e/ou listados no final da descrição.
Os exemplos de publicações citadas e limitações relacionadas com os mesmos pretendem ser ilustrativos e não exclusivos. Outras limitações das publicações citadas tornar-se-ão evidentes para aqueles peritos na especialidade aquando da leitura da memória descritiva e estudo dos desenhos.
As palavras "compreendem", "compreende" e "compreendendo" são para ser interpretadas inclusivamente em vez de exclusivamente.
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Sintética" <400> 2 atatatatcc tcaccacact ccacc 25 <210> 3 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial:
Sintética" <22 0> <221> misc_feature <222> 2, 4 <223> t é dT-biotina <400> 3 atattttttt ttgtcttctt gtcgtttcgc 30 <210> 4 <211> 78 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: Sintética" <22 0> <221> misc_feature <222> 2, 4 <223> t é dT-biotina <22 0> <221> misc_feature <222> (22)..(61) <223> n é a, c, g ou t <400> 4
atatccgtcc tcctctccgt cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn SO ngggacactg ggtgcagg 78 <210> 5 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial:
Sintética" <4Ο0> 5 atatatatcc tgcacccagt gtccc 25 <210> 6 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: Sintética" <22 0> <221> misc_feature <222> 2, 4 <223> t é dT-biotina <400> 6 atattttttt ttccgtcctc ctctccgtc 29 <210> 7 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: Sintética" <400> 7 gtcttcttgt cgtttcgc 18 <210> 8 <211> 76 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: Sintética" <22 0> <221> misc_feature <222> 2, 4 <223> t é dT-biotina <22 0> <221> misc_feature <222> (20)..(59) <223> n é a, c, g ou t <400> 8 atatcccgct cgtcgtctgn nnmnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc 60 aggcagacgg tcactc 76 <210> 9 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: Sintética" <4Ο0> 9 atatatatga gtgaccgtct gcctg 25 <210> 10 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial:
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<210> 19 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: Sintética" <4 0 0> 19 atatatatcc tcaccacact ccacc 25 <210> 20 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial:
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DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • US 5475096 A [0003] • US 5270163 A [0003] • WO 9119813 A [0003] • US 5707796 A [0004] • US 5580737 A [0004] [0005] • US 5567588 A [0004] • US 5496938 A [0004] • US 5705337 A [0004] • US 5660985 A [0005] [0105] • US 5763177 A [0006] • US 6001577 A [0006] • US 6291184 B [0006] • US 6458539 B [0006] [0161] • WO 9927133 A [0007] • US 20050003362 A [0007] • US 17538808 A [0012] • US 6168778 B [0016] • US 6051698 A [0016] • US 6426335 B [0016] • US 6962784 B [0016] • US 5843653 A [0016] • US 5789163 A [0016] • US 5853984 A [0016] • US 5874218 A [0016] • US 6261783 B [0016] • US 5989823 A [0016] • US 6177555 B [0016] • US 6531286 B [0016] • US 6329145 B [0016] • US 6670132 B [0016] • US 7258980 B [0016] • US 6183967 B [0016] • US 6020130 A [0016] • US 5763173 A [0016] • US 5874557 A [0016] • US 5693502 A [0016] • US 5719273 A [0040] • US 5945527 A [0040] • US 6376190 B [0046] • US 50469604 A [0064] • US 175388 A [0082] • US 5428149 A [0105] • US 5580972 A [0105] • US 6300074 B [0105] • EP 08782010 A [0193] • US 2008070383 W [0193] • US 60950283 B [0193] • US 60950281 B [0193] • US 61031420 B [0193] • US 61051594 B [0193] • US 60950293 B [0193]
Documentos de não patente citados na descrição • LATHAM et al. Nucleic Acids Research Special
Publication, 1994, vol. 22 (14), 2817-2822 [0007] • SAMBROOK et al. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual [0023] • DNA Cloning: A Practical Approach, vol. Ι,ΙΙ [0023] • Oligonucleotide Synthesis [0023] • Nucleic Acid Hybridization [0023] • Transcription and Translation [0023]
Lisboa, 24 de Março de 2015

Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um aptâmero oligonucleotídico compreendendo, pelo menos, um nucleótido de uridina modificado na base, o nucleótido de uridina modificado na base tendo a seguinte estrutura:
    e Z = R mais grupo de conexão (CH2)n, onde n = 1, 2 ou 3, e
  2. 2. 0 aptâmero da reivindicação 1 em que n = 1.
  3. 3. 0 aptâmero da reivindicação 1 ou 2 em que o aptâmero compreende, pelo menos, dois dos ditos nucleótidos de uridina modificados na base.
  4. 4. 0 aptâmero da reivindicação 1 ou 2 em que o aptâmero compreende, pelo menos, três dos ditos nucleótidos de uridina modificados na base.
  5. 5. 0 aptâmero de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em que o aptâmero tem uma taxa de dissociação (t1/2) de um complexo aptâmero-alvo não covalente maior que ou igual a cerca de 30 minutos.
  6. 6. Um complexo não covalente de um aptâmero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e uma molécula alvo.
  7. 7. Um complexo não covalente de acordo com a reivindicação 6, em que a taxa de dissociação (11/2) do aptâmero da molécula alvo é maior que ou igual a 30 minutos.
  8. 8. Um complexo não covalente de acordo com a reivindicação 6 ou 7 em que a molécula alvo é um proteína.
  9. 9. Um complexo não covalente de acordo com a reivindicação 6 ou 7 em que a molécula alvo é um proteína selecionada a partir da FIG. 7.
  10. 10. O aptâmero ou complexo não covalente de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a taxa de dissociação (ti/2) do aptâmero de um complexo não covalente aptâmero-alvo está entre cerca de 30 minutos e cerca de 240 minutos; cerca de 30 minutos a cerca de 60 minutos; cerca de 60 minutos a cerca de 90 minutos; cerca de 90 minutos a cerca de 120 minutos; cerca de 120 minutos a cerca de 150 minutos; cerca de 150 minutos a cerca de 180 minutos; cerca de 180 minutos a cerca de 210 minutos; ou cerca de 210 minutos a cerca de 240 minutos.
  11. 11. Um kit de diagnóstico contendo um aptâmero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5. Lisboa, 24 de Março de 2015
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