JP3978187B2 - 機能性分子及びその製造方法 - Google Patents
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Description
しかしながら、前記蛋白質を解析するための分子を作製乃至入手等するための効率的な方法が現在知られていないのが現状である。従来より知られており、ある特定の蛋白質に対して親和性のある分子を得る最も一般的な方法としては、動物の免疫系を用いてアフィニティー抗体を選別する方法がある。ところが、この方法の場合、動物を使っているため、多量の蛋白質が必要となり、工程数が多く、高コストである。しかも、この方法で選別し入手したアフィニティー抗体は、モノクローナル抗体にし、その細胞を維持することにより複製可能であるものの、高コストであり、改良を行うことができない。また、同一標的に対し親和性を有するアフィニティー抗体しか選別することができない、という問題がある。したがって、細胞内に存在する全種類の蛋白質に対し親和性を有する各アフィニティー抗体を選別し入手することは極めて困難である。
しかしながら、ヌクレオチドの構成単位数はRNA及びDNAのどちらも4個であり、これらの重合体に存在する官能基の種類は著しく制限され、その働きも制限されたものにならざるを得なかった。この問題を打開するために修飾ヌクレオチドを用いた研究もなされているが、特定の部位に選択的に、あるヌクレオチドを導入したものが前記分子であることを決定するためには、修飾ヌクレオチドに対応する天然のヌクレオチドを実験系から除く必要があり、結局、ヌクレオチドの構成単位数は4+1−1=4個のままであり、根本的な問題の解決にはなっていない。また、RNAは酵素的に非常に不安定であり、同様の働きを持つ前記分子を安定なDNAで合成する試みもなされているが成功するには至っていない。これらの場合、特定の標的に対し親和性を有する分子を得るためには、増幅及び精製の操作を繰り返して行う必要があり、前記分子を多種合成することは依然として困難である。
一方、アミノ酸や人工物質を構成単位にし、コンビナトリアルケミストリーにより前記分子を選別する研究においては、構成単位からなる該分子自体が遺伝情報を持たないために、配列情報を増幅することができず、前記分子の配列を決定するためには多大な工程が必要であった。
また、遺伝情報を持つ蛋白質の合成に関しては、mRNAの3’末端にピューロマイシンを導入した研究がある(例えば、特許文献1参照)。これはピューロマイシンが翻訳系においてアミノ酸と間違われて蛋白質に組み込まれやすいという性質を利用したものである。しかしながら、この場合、現在までのところ、ピューロマイシンの組み込み効率が悪く、ランダムなアミノ酸3残基のライブラリーから前記分子を選別できたという報告がなされている程度である。また仮に、ピューロマイシンの組み込み効率が改善できたとしても、DNAランダム配列には3/64の割合で終止コドンが存在し、細胞が好まないレアーコドンの存在まで考慮に入れるとDNAランダムプールの内、最終的に遺伝情報を持つ蛋白質になる可能性のあるライブラリープールの数は非常に小さくなってしまう、という問題がある。
本発明は、前記機能性分子を煩雑な増幅、精製等の操作を繰り返して行う必要がなく、効率よく一括して製造可能な機能性分子の製造方法を提供することを目的とする。
本発明の機能性分子は、本発明の前記機能性分子の製造方法により製造される。該機能性分子は、標的に対する親和性や特異性が、抗原に対する抗体の親和性や特異性に匹敵し、多種の標的を認識可能であり、薬品、ドラッグデリバリー、バイオセンサー、遺伝子の発現量の制御、遺伝子異常による疾病の克服やその遺伝子により翻訳される蛋白質の機能解明、反応触媒の開発などの広い分野に好適に使用可能である。
本発明の機能性分子は、本発明の機能性分子の製造方法により製造される。以下、本発明の機能性分子の製造方法の説明を通じて本発明の機能性分子の内容を明らかにする。
本発明の機能性分子の製造方法は、修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程を少なくとも含み、選別工程、配列解読工程、翻訳工程を含むのが好ましく、更に目的に応じて適宜選択したその他の工程を含む。
前記修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程は、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドn量体(ただし、nは、整数を表す)をランダムに重合させて修飾オリゴヌクレオチド配列を製造する工程である。
なお、前記修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程を行った結果、得られた前記修飾オリゴヌクレオチド配列を含む反応物は、精製・分離等することなくそのまま、該修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールとして前記選別工程等において使用可能である。
前記修飾ヌクレオチドは、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入されてなる。
前記修飾ヌクレオチドn量体におけるnは、整数を表し、2以上が好ましく、2〜10がより好ましく、2〜3が特に好ましい。
前記nが、2未満であると、前記修飾ヌクレオチドの種類が核酸を構成する4種類のヌクレオチドと差がなく、標的に対する認識力を向上させることができなくなることがある。なお、前記nが、4以上であると、増幅過程に起こる可能性のある1塩基欠損や1塩基付加を塩基配列類似性から判別し難くなり、nが3であっても最大64種類もの異なる側鎖を導入することができるので、アミノ酸20種類から多種多様な蛋白質ができていることを考慮すると、nが3でも十分であり、nが4以上であってもそれに見合う効果が十分には期待できない一方、合成の負荷の増大が懸念される。
前記DNAは、アデニン(A)、チミン(T)、グアニン(G)及びシトシン(C)の4種の塩基を有し、DNAポリヌクレオチド鎖において前記塩基は、中心軸に対して垂直な平面内で互いに内側に突出した形で存在して、いわゆるワトソン−クリック型塩基対を形成し、アデニンに対してはチミンが、グアニンに対してはシトシンが、それぞれ特異的に水素結合している。その結果、前記2本鎖DNAにおいては、2本のポリペプチド鎖が互いに相補的に結合している。
前記DNAの4種のヌクレオシド(デオキシリボヌクレオシド)としては、デオキシアデノシン(dA)、デオキシグアノシン(dG)、デオキシシチジン(dC)、デオキシチミジン(dT)等が挙げられる。
前記RNAは、アデニン(A)、チミン(T)、ウラシル(U)及びシトシン(C)の4種の塩基を有し、リボソームRNA(rRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)の3種に大別できる。
前記RNAの4種のヌクレオシド(リボヌクレオシド)としては、アデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)等が挙げられる。
前記修飾ヌクレオシドにおいて前記置換基が導入される位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ピリミジンにおける5位、プリンにおける7位、プリンにおける8位、環外アミンの置換、4−チオウリジンの置換、5−ブロモの置換、5−ヨード−ウラシルの置換、などが挙げられる。これらの中でも、増幅(複製)の際の酵素反応を阻害し難い点で、ピリミジンにおける5位、プリンにおける7位などが好ましく、合成の容易さの点で、ピリミジンにおける5位がより好ましい。
前記ヌクレオシドに置換基を導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記式で示されるヌクレオシドのピリミジン塩基における5位に置換基Rを導入する方法、などが好適に挙げられる。
前記金属錯体としては、金属イオンに配位子が配位した化合物であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ruビピリジル錯体、フェロセン錯体、ニッケルイミダゾール錯体、などが挙げられる。
前記蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン系列、ローダミン系列、エオシン系列、NBD系列等の蛍光色素、などが挙げられる。
前記酸化還元色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ロイコアニリン、ロイコアントシアニン、等のロイコ色素、などが挙げられる。
前記スピンラベル体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、鉄N−(ジチオカルボキシ)サルコシン(sarcosine)、TEMPO(テトラメチルピペリジン)誘導体、などが挙げられる。
前記炭素数1〜10のアルキル基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、tert−ブチル基、ペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、などが挙げられる。
これらは、置換基で更に置換されていてもよい。
前記ホスホロアミダイト法は、一般的には、テトラゾールを促進剤としたヌクレオシドホスホロアミダイトとヌクレオシドとの縮合反応を鍵反応として用いる。この反応は、通常、糖部分の水酸基とヌクレオシド塩基部のアミノ基との両方に競合的に起こるが、所望のヌクレオチド合成のためには、糖部分の水酸基にのみ選択的に反応を起こさせる。したがって、アミノ基への副反応を防止するため、保護基で修飾する。例えば、修飾ヌクレオチド2量体(AU1)は、下記式で示したように、デオキシアデノシンと修飾デオキシウリジンとから合成することができる。
なお、後述する下記表1の対応表に示す、修飾ヌクレオチド2量体(AC1、C2A、C3C、C4G、C5T、GC6、GU2、U3A、U4C、U5G、U6T)についても同様の方法により合成することができる。
前記修飾ヌクレオチド2量体の種類が、5未満であると、核酸を構成する4種のヌクレオチドと大差がなく、標的に対する認識力を十分に向上させることができないことがある。
具体的には、塩基配列は、5’側から3’側方向に読み取り、塩基配列ACには修飾ヌクレオチド2量体AC1が対応する。配列ATには修飾ヌクレオチド2量体AU1が対応する。塩基配列CAには修飾ヌクレオチド2量体C2Aが対応する。塩基配列CCには修飾ヌクレオチド2量体C3Cが対応する。塩基配列CGには修飾ヌクレオチド2量体C4Gが対応する。塩基配列CTには修飾ヌクレオチド2量体C2Aが対応する。塩基配列GCには修飾ヌクレオチド2量体GC6が対応する。塩基配列GTには修飾ヌクレオチド2量体GU2が対応する。塩基配列TAには修飾ヌクレオチド2量体U3Aが対応する。塩基配列TCには修飾ヌクレオチド2量体U4Cが対応する。塩基配列TGには修飾ヌクレオチド2量体U5Gが対応する。塩基配列TTには修飾ヌクレオチド2量体U6Tが対応する。
なお、表1の対応表における、塩基配列と修飾ヌクレオチド2量体との条件付けとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、表1はあくまでもその一例である。また、修飾ヌクレオチド2量体を12種作製することが困難であれば、一部が重複してもよいが、その分、標的に対する認識力は低下することがある。
上記表1の対応表に基づいて、12種の2量体修飾ヌクレオシドを対応付けることにより、従来の核酸では4種でしかなかったものが、一挙に12種にまで拡がり、その結果、数多くの種の標的に対して識別力を発揮し得るものである。
前記修飾オリゴヌクレオチド配列のヌクレオチド数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、10〜100個が好ましく、10〜50個がより好ましい。
前記固定オリゴヌクレオチド配列のヌクレオチド数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、通常15個以上が好ましく、20〜40個がより好ましい。
前記DNAシンセサイザー(DNA自動合成機)を用いる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、図2に示すようなDNAシンセサイザー(DNA自動合成機)を用い、合成した前記修飾ヌクレオチド2量体を複数種混合したもの(図2に示す例では12種であり、図2中「X」で表される)を試薬とし、この試薬をコントローラーによる制御の下、ノズル15により吸い上げて重合させることにより、ランダムであらゆる配列順序の修飾オリゴヌクレオチド配列を有する前記ランダム重合体プールを作製する方法などが好ましい。この場合、前記ランダム重合体プールを効率よく作製することができる点で有利である。
なお、前記固定ヌクレオチド配列を合成する場合には、アデニン(A)、チミン(T)、グアニン(G)及びシトシン(C)の4種により同様に合成することができる。
前記DNAライゲースは、DNAリガーゼともいい、隣接したヌクレオチドの5’リン酸基と3’水酸基の間の、共有結合の形成を触媒する酵素である。
前記RNAライゲースは、RNAリガーゼともいい、5’リン酸基末端のポリヌクレオチドと3’水酸基末端のポリヌクレオチドを連結させる酵素である。RNAリガーゼの基質は本来はRNAであるが、5’リン酸基末端のポリデオキシリボヌクレオチドと3’端のみがリボヌクレオチドであるポリデオキシリボヌクレオチドも効率的に連結する。
前記選別工程は、前記修飾オリゴヌクレオチド配列の中から標的と親和性のあるものを選別する工程である。
前記選別の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法から適宜選択することができ、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、フィルター結合、液−液分割、ろ過、ゲルシフト、密度勾配遠心分離、などの各種方法が挙げられる。これらは、1種単独で行ってもよいし、2種以上を行ってもよい。これらの中でも、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい。
前記マトリックス上に前記標的を固定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記標的が蛋白質である場合には、該標的をポリアクリルアミド電気泳動(例えば、SDS−PAGEなど)した後で膜状の該マトリックスに転写するウエスタンブロット法、膜状の該マトリックスに前記標的又はその希釈液を直接染み込ませるドットブロット法やスロットブロット法、などが挙げられる。これらの中でも、細胞抽出液などの複雑な組成の溶液中に微量に含まれる蛋白質でも明瞭に検出可能な点で、前記ウエスタンブロット法が好ましい。
なお、前記ウエスタンブロット法は、電気泳動の優れた分離能と抗原抗体反応の高い特異性を組み合わせて、蛋白質混合物から特定の蛋白質を検出する手法であり、SDS−PAGE、等電点電気泳動、二次元電気泳動等の後、ゲルから蛋白質を電気的に膜状の前記マトリックスに移動・固定化させる方法である。該膜状のマトリックスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記蛋白質が結合し易い疎水性の高いニトロセルロース膜、疎水性に優れたPVDF(Polyvinylidene difluoride)膜、などが好適に挙げられる。
前記放射性同位元素としては、例えば、32P、33P、35S、等が挙げられる。
前記化学発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノール又はこれらの誘導体、等が挙げられる。前記化学発光による検出には、X線フィルムへの露光検出、あるいは化学発光を検出可能なスキャナーを必要としますが、他の発色法に比べて10〜50倍以上も感度が高いので、微量蛋白質の検出が容易であるとい利点がある。
前記酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、等が挙げられる。
更に前記標識物質としては、ビオチン、リガンド、特定の核酸、蛋白質、ハプテン等が挙げられる。なお、前記標識物質がビオチンである場合にはこれに特異的に結合するアビジン又はストレプトアビジンが、前記標識物質がハプテンである場合にはこれに特異的に結合する抗体が、前記標識物質がリガンドである場合にはレセプターが、前記標識物質が特定の核酸、蛋白質、ハプテン等である場合にはこれらと特異的に結合する核酸、核酸結合蛋白質、特定の蛋白質と親和性を有する蛋白質等が、それぞれ組合せ可能である。
なお、前記切断片から前記修飾オリゴヌクレオチド配列を回収は、イオン性溶液を用い電圧を印加してエレクトロエリューションにより行うことができ、また、熱水を用いて行うことができる。
本発明においては、前記選別工程において、例えば、解離定数の異なる2種以上の分子の相互作用を利用し、小さい解離定数に適応した洗浄操作で前記機能性分子を選別する一方、大きい解離定数に適応する過激な洗浄操作により、選別する担体の再生を行うことできる。この方法の場合、前記標的が2種以上あっても、再生が可能となるので1枚の基板を用いて複数種の前記機能性分子を一括して効率よく選別することができ、無駄を省くことができコストダウンが図られる。
また、前記選別工程において、複数種の分子と反応性の異なるリンカーを一対一に対応させることにより、異なる後処理により各々の分子を認識することができる前記機能性分子を順次選び出すこともできる。これにより、前記機能性分子を選別することができる。この場合、前記ランダム重合体プールを共通に用いて複数種の前記機能性分子を効率よく選別することができる。
前記異なる後処理としては、リンカーの結合強度を調整することができる試薬を流す方法、リンカーの結合の切れ易さを調整できる試薬を流す方法、光反応や電極反応により特定の位置を選択的に切断する反応を利用する方法、などが挙げられる。
前記血漿蛋白としては、例えば、免疫グロブリン(IgG,IgA,IgM,IgD,IgE)、補体成分(C3,C4,C5,C1q)、CRP、α1−アンチトリプシン、α1−マイクログロブリン、β2−マイクログロブリン、ハプトグロビン、トランスフェリン、セルロプラスミン、フェリチンなどが挙げられる。
前記腫瘍マーカーとしては、例えば、α−フェトプロテイン(AFP)、癌胎児性抗原(CEA)、CA19−9、CA125、CA15−3、SCC抗原、前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)、PIVKA−II、γ−セミノプロテイン、TPA、エラスターゼI、神経特異エノラーゼ(NSE)、免疫抑制酸性蛋白(IAP)などが挙げられる。
前記アポ蛋白としては、例えば、アポA−I、アポA−II、アポB、アポC−II、アポC−III、アポEなどが挙げられる。
前記ウイルスとしては、例えば、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HBC)、HTLV−I、HIVなどが挙げられる。また、ウイルス以外の感染症としては、ASO、トキソプラズマ、マイコプラズマ、STDなどが挙げられる。
前記自己抗体としては、例えば、抗マイクロゾーム抗体、抗サイログロブリン抗体、抗核抗体、リュウマチ因子、抗ミトコンドリア抗体、ミエリン抗体などが挙げられる。
前記凝固・線溶因子としては、例えば、フィブリノゲン、フィブリン分解産物(FDP)、プラスミノゲン、α2−プラスミンインヒビター、アンチトロンビンIII、β−トロンボグロブリン、第VIII因子、プロテインC、プロテインSなどが挙げられる。
前記ホルモンとしては、例えば、下垂体ホルモン(LH、FSH、GH、ACTH、TSH、プロラクチン)、甲状腺ホルモン(T3、T4、サイログロブリン)、カルシトニン、副甲状腺ホルモン(PTH)、副腎皮質ホルモン(アルドステロン、コルチゾール)、性腺ホルモン(hCG、エストロゲン、テストステロン、hPL)、膵・消化管ホルモン(インスリン、C−ペプチド、グルカゴン、ガストリン)、その他(レニン、アンジオテンシンI,II、エンケファリン、エリスロポエチン)などが挙げられる。
前記環境ホルモンは、外界に広く存在して生物の生活活動と共に体内に取り込まれてその生殖、発生、行動などを含む生理的な内分泌の諸現象に影響を及ぼす外因性内分泌撹乱化学物質であり、該環境ホルモンとしては、例えば、ノニルフェノール、オクチルフェノール、ビスフェノールA、フタル酸ブチルベンジル、トリブチルスズ、PCB、ポリ塩化ジベンゾジオキシン、ポリ塩化ジベンゾフラン、ダイオキシン類、DDT、DDE、DDD、エンドスルファン、メトキシクロル、ヘプタクロル、トキサフェン、ディルドリン、リンデン、ジエチルスチベロール(DES)、エチニルエストラジオール(ピルの成分)、クメストロール、フォルモノネテイン、ゲニステイン、などが挙げられる。
前記血中薬物としては、例えば、カルバマゼピン、プリミドン、バルプロ酸等の抗てんかん薬、ジゴキシン、キニジン、ジギトキシン、テオフィリン等の循環器疾患薬、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン等の抗生物質などが挙げられる。
前記核酸としては、癌関連遺伝子、遺伝病に関連する遺伝子、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子及び病気のリスクファクターと呼ばれる多型性を示す遺伝子、などが挙げられる。
前記癌関連遺伝子としては、例えば、k−ras遺伝子、N−ras遺伝子、p53遺伝子、BRCA1遺伝子、BRCA2遺伝子、src遺伝子、ros遺伝子又はAPC遺伝子などが挙げられる。
前記遺伝病に関連する遺伝子としては、例えば、各種先天性代謝異常症、例えばフェニールケトン尿症、アルカプトン尿症、シスチン尿症、ハンチントン舞踏病、Down症候群、Duchenne型筋ジストロフィー、血友病などが挙げられる。
前記ウイルス及び細菌遺伝子としては、例えば、C型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、HIVウイルス、マイコプラズマ、リケッチア、レンサ球菌、サルモネラ菌などが挙げられる。
前記多型性を示す遺伝子とは、病気等の原因とは必ずしも直接は関係のない個体によって異なる塩基配列を持つ遺伝子、例えば、PS1(プリセリニン1)遺伝子、PS2(プリセリニン2)遺伝子、APP(ベーターアミロイドプレカーサー蛋白質)遺伝子、リポプロテイン遺伝子、HLA(Human Leukocyte Antigen)や血液型に関する遺伝子、あるいは高血圧、糖尿病等の発症に関係するとされている遺伝子などが挙げられる。
前記標的を含む検体としては、例えば、細菌、ウイルス等の病原体、生体から分離された血液、唾液、組織病片等、あるいは糞尿等の排泄物が挙げられる。更に、出生前診断を行う場合は、羊水中に存在する胎児の細胞や、試験管内での分裂卵細胞の一部などであってもよい。また、これらの検体は、直接、又は必要に応じて遠心分離操作等により沈渣として濃縮した後、例えば、酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、超音波処理、これらの組合せ等による細胞破壊処理を予め施されていてもよい。
前記配列解読工程は、前記選別工程により選別した前記修飾オリゴヌクレオチド配列を増幅し、その塩基配列を決定する工程である。
前記増幅の方法としては、対象となる前記修飾オリゴヌクレオチド配列の数を増やすことができれば、特に制限はなく、当該技術分野において公知の方法の中から適宜選択することができ、例えば、PCR(Polymerase Chain Reaction)法、LCR(Ligase chain Reaction)法、3SR(Self−sustained Sequence Replication)法、SDA(Strand Displacement Amplification)法、RT−PCR法、ICAN法、LAMP法、などが挙げられる。これらは、1種単独で行ってもよいし、2種以上を行ってもよい。
前記PCR法は、ポリメラーゼ連鎖反応法を意味し、DNA合成酵素によるDNA合成反応の試験管内での繰り返しにより、その特定のオリゴヌクレオチド領域を数10万倍に増幅可能な方法である。該PCR法においては、使用するプライマーの伸長反応は、4種又は5種のヌクレオチド三リン酸(デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸、及びチミジン三リン酸あるいはデオキシウリジン三リン酸(これらの混合物をdNTPということもある))を基質として該プライマーに取り込ませることにより行われる。
この伸長反応を行う場合、通常核酸鎖を増幅するために上記単位核酸及び核酸伸長酵素を含む増幅反応試薬が用いられ、この場合、核酸伸長酵素としてはE.coliDNAポリメラーゼI、E.coliDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、T4 DNAポリメラーゼ等の任意のDNAポリメラーゼを用いることができるが、特にTaq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ等の熱安定性DNAポリメラーゼを用いることが好ましく、これによりサイクル毎に新たな酵素の添加の必要性がなくなり、自動的にサイクルを繰り返すことが可能になり、更にアニーリング温度を50〜60℃に設定することが可能なためプライマーによる標的塩基配列認識の特異性を高めることができ、迅速かつ特異的に遺伝子増幅反応を行うことができる(特開平1−314965号、同1−252300号公報等参照)。
また、この反応を行う際、反応溶液の水分の蒸発を防止するためにオイルを添加することができる。この場合、オイルは水と分配可能で、かつ水より比重の軽いものであればよく、具体的にはシリコーンオイル、ミネラルオイル等が例示される。また、遺伝子増幅装置によってはこのような媒体を必要としないものもあり、このような遺伝子増幅装置を用いてプライマーの伸長反応を行うこともできる。
このように、前記プライマーを用いて伸長反応を繰り返すことにより、目的とするオリゴヌクレオチドを効率的に遺伝子増幅させることができオリゴヌクレオチドを大量に作製することができる。なお、この遺伝子増幅反応を行う条件等の具体的な方法については、実験医学、羊土社、8,No.9(1990)、PCR テクノロジー ストックトン プレス(PCR Technology Stockton press(1989))等の文献に記載された公知の方法が挙げられる。
なお、PCR法を行うことにより、前記修飾オリゴヌクレオチド配列は、置換基の修飾のない天然のオリゴヌクレオチド配列に置換される。
前記遺伝子クローニングでは、増幅したオリゴヌクレオチド配列を組み込んだ発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、この形質転換体を培養すること等により製造することができる。
前記発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、プラスミドとファージとのキメラベクター、などが挙げられる。
前記宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核微生物、酵母菌等の真核微生物、動物細胞などが挙げられる。
前記翻訳工程は、塩基配列を決定した前記修飾オリゴヌクレオチド配列の配列を、4種のヌクレオシドを1対1に組合せた対応表における4n種のヌクレオチドn量体の少なくとも1種と、前記修飾ヌクレオチドn量体の1種とを対応させた対応表に基づき翻訳する工程である。
前記翻訳は、塩基配列が決定された修飾ヌクレオチドn量体からなる修飾オリゴヌクレオチド配列の5’末端側からn塩基ずつ対応表に基づいて行われることが好ましく、定期的にブロックを規定する固定塩基を入れることがより好ましい。例えば、修飾ヌクレオチドn量体が修飾ヌクレオチド2量体である場合、該修飾ヌクレオチド2量体からなる塩基配列が決定された修飾オリゴヌクレオチド配列の5’末端側から2塩基ずつ対応表に基づいて翻訳することができる。具体的には、上記表1で表される対応表に基づいて翻訳される。
前記修飾ヌクレオチドn量体が修飾ヌクレオチド3量体である場合、該修飾ヌクレオチド3量体からなる塩基配列が決定された修飾オリゴヌクレオチド配列の5’末端側から3塩基ずつ対応表に基づいて翻訳することができる。具体的には、上記表2で表される対応表を用いて翻訳される。
(実施例1)
図3に示すようにして、特定の蛋白質に対し親和性を有する機能性分子の製造(合成及び同定)を行った。具体的には、先ず、下記式に示す方法により、シトシンにおける5位から6種の官能基を持つデオキシシチジン類縁体(C1−6)、及び、ウラシルにおける5位から6種の官能基を持つデオキシウリジン類縁体(U1−6)を各々合成(作製)した。
そして、図2に示すようなDNAシンセサイザーを用いて、固定オリゴヌレオチド配列20量体(N20)−修飾オリゴヌクレオチドランダム配列20量体(M20)−固定オリゴヌクレオチド配列20量体(N20)からなるランダムオリゴヌクレオチドN20−M20−N20(DNA80量体)を含むランダム重合体プールを作製した。以上が前記修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程である。
まず、標的としてヒトアルブミンを結合したビーズを充填したアフィニティーカラムを用意し、このカラムに前記ランダム重合体プールを含む溶液を流し一定条件に放置すると、該標的に対し親和性を示す修飾オリゴヌクレオチド配列がカラムに吸着し(図3B)、緩衝液で充分洗浄することにより、残留した修飾オリゴヌクレオチド配列以外の成分を除去し、ヒトアルブミンを含む溶液を流すことにより、前記修飾オリゴヌクレオチドランダム配列を含むオリゴヌクレオチドを選別し、回収した(図3C)。以上が前記選別工程である。
この選別された修飾オリゴヌクレオチド配列をPCRで増幅し、クローニングによりそのDNAの塩基配列を求めたところ、決定された修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の一部が“ATGCTCTAGCCCCT”であった(図3D)。以上が前記配列解読工程である。
この塩基配列を上記対応表に基づき翻訳すると“AU1GC6U4CU3AGC6C3CC5T”となり、機能性分子の構造が同定できた(図3D)。以上が前記翻訳工程である。
得られた機能性分子は、ヒトアルブミンと特異的に結合し、抗体と類似の働きを示すことが認められた。
前記修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールとして、実施例1で合成したDNAランダムプール(総量20OD){ヌクレオチド固定配列20量体DNA(N20)}の5’−32P放射性ラベル標品(予め修飾塩基を含むヌクレオチドモノマーに放射性元素をラベルしたもの)を作製した。以上が前記修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程である。
この放射性ラベルされた修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールであるN20M20N20(DNA80量体)の希釈溶液に、蛋白質混合物を固定したニトロセルロース膜を浸して1時間震盪した。その後、このニトロセルロース膜を緩衝溶液で洗浄して非特異的な残留物を除去し、X−rayフィルムを用いて該ニトロセルロース膜上における放射能の強い位置(放射性ラベルされた修飾オリゴヌクレオチドが強く結合した位置)を同定した。
前記ニトロセルロース膜上の放射能の強い位置30箇所を切り取り、イオン溶液(3M Na Acetate pH=4.8、0.1%ブロモフェノールブルー溶液)中で電圧を印加してエレクトロエリューションにより修飾オリゴヌクレオチドを回収した。各々の溶液中の放射能を確認した後、固定配列の相補鎖をプライマーとするPCR法によってDNAを増幅した。各々のPCR産物をアクリルアミドゲル電気泳動により確認した結果、28種類の修飾オリゴヌクレオチド配列の明確なバンドが確認できた。以上が前記選別工程である。
得られた修飾DNAは、二次元電気泳動で分離された蛋白質を特異的に認識できることが確認できた。また、入手可能な蛋白質について解離定数を表面プラズモン共鳴法により測定した結果、1.0×10−7〜1.0×10−9であり、親和性を示すことが確認された。
また、実施例2では、放射性ラベルしたランダム重合体プールを用いた標識物質としては、放射性同位元素以外にも、酵素、蛍光物質、化学発光物質等の標識物質から適宜選択することができる。更に、ブロッティングされたニトロセルロース膜などの転写用担体上の転写物を染色や分光等によって可視化し、転写物の多い部分からDNAの配列を抽出し、クローニングして配列を決定することもできる。
付記1. 標的に対し親和性を有する機能性分子の製造方法であって、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドn量体(ただし、nは、整数を表す)をランダムに重合させて修飾オリゴヌクレオチド配列を製造する修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程を含むことを特徴とする機能性分子の製造方法。
付記2. 修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程において、修飾オリゴヌクレオチド配列を製造し該修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールを作製する付記1に記載の機能性分子の製造方法。
付記3. 修飾オリゴヌクレオチド配列の中から標的と親和性のあるものを選別する選別工程を含む付記1から2のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記4. 選別した修飾オリゴヌクレオチド配列を増幅し、その塩基配列を決定する配列解読工程を含む付記3に記載の機能性分子の製造方法。
付記5. 塩基配列を決定した修飾オリゴヌクレオチド配列の配列を、4種のヌクレオシドを1対1に組合せた対応表における4n種のヌクレオチドn量体の少なくとも1種と修飾ヌクレオチドn量体の1種とを対応させた対応表に基づき翻訳する翻訳工程を含む付記4に記載の機能性分子の製造方法。
付記6. 核酸が、DNA及びRNAのいずれかである付記1から5のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記7. 修飾ヌクレオチドn量体が5〜4n種である付記1から6のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記8. 修飾ヌクレオチドn量体が修飾ヌクレオチド2量体であり、該修飾ヌクレオチド2量体が5〜16種である付記1から7のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記9. 修飾ヌクレオチドn量体が修飾ヌクレオチド3量体であり、該修飾ヌクレオチド3量体が5〜56種である付記1から7のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
10. 置換基が、ヌクレオシドにおけるピリミジン塩基の5位に導入された付記1から9のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
11. 置換基が、下記構造式(I)で表される基から選択される付記1から10のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
但し、構造式(I)中、Rは、天然又は非天然のアミノ酸、金属錯体、蛍光色素、酸化還元色素、スピンラベル体、水素原子、炭素数1〜10のアルキル基、及び
下記式(1)〜(10)から選ばれるいずれかの基を表す。
Pは、ピリミジン塩基を表す。
付記12. 修飾ヌクレオチドn量体が修飾オリゴヌクレオチドアミダイトである付記1から11のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記13. 修飾オリゴヌクレオチド配列が、DNAシンセサイザーを用いて合成される付記1から12のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記14. 修飾オリゴヌクレオチド配列が、ヌクレオチドランダム配列に対しヌクレオチドモノマーをアニーリングさせ、該ヌクレオチドモノマーをDNAライゲース及びRNAライゲースの少なくともいずれかにより連結させて合成される付記1から12のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記15. 修飾オリゴヌクレオチド配列が、両端に固定オリゴヌクレオチド配列を有する付記1から14のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記16. 選別工程が、標的を結合させたビーズを充填したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行われる付記3に記載の機能性分子の製造方法。
付記17. 選別工程が、標的と修飾オリゴヌクレオチド配列との解離定数をモニターしながら該修飾オリゴヌクレオチドを前記標的から解離させることにより行われる付記3及び16のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記18. 選別工程が、2種以上の標的を一次元乃至三次元の空間配置を持つマトリックス上に固定し、前記標的が固定された該マトリックスに対し前記修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールを作用させた後、前記標的と結合した修飾オリゴヌクレオチド配列を精製することにより行われる付記3に記載の機能性分子の製造方法。
付記19. 標的のマトリックス上への固定が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法及びスロットブロット法から選択されるいずれかにより行われる付記18に記載の機能性分子の製造方法。
付記20. マトリックス上に固定された標的が、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、酵素、抗体、リガンド及びレセプターから選択される少なくとも1種の標識物質で標識されている付記18から19のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記21. ランダム重合体プールに含まれる修飾オリゴヌクレオチド配列が、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、酵素、抗体、リガンド及びレセプターから選択される少なくとも1種の標識物質で標識されている付記17から20のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記22. 選別工程が、マトリックス上に固定された標的と結合した修飾オリゴヌクレオチド配列を該マトリックスと共に切断して切断片を得た後、直接PCRを行うこと及び該切断片から修飾オリゴヌクレオチド配列を回収することのいずれかにより行われる付記17から21のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記23. 修飾オリゴヌクレオチド配列を切断片からの回収が、イオン性溶液を用い電圧を印加するエレクトロエリューション法、及び熱水を用いる方法のいずれかにより行われる付記22に記載の機能性分子の製造方法。
付記24. 標的が、蛋白質、リポ蛋白質、糖蛋白質、ポリペプチド、脂質、多糖類、リポ多糖類、核酸、環境ホルモン、薬物、及びこれらの複合体から選択される少なくとも1種である付記1から23のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記25. 増幅工程が、PCR法、LCR法、3SR法、SDA法、RT−PCR法、ICAN法及びLAMP法から選択されるいずれかの方法により行われ、クローニングにより塩基配列が決定される付記4に記載の機能性分子の製造方法。
付記26. 翻訳工程が、修飾ヌクレオチドn量体をランダムに重合させてなり、かつ塩基配列が決定された修飾オリゴヌクレオチド配列における5’末端側からn塩基ずつ、対応表に基づいて行われる付記5に記載の機能性分子の製造方法。
付記27. 修飾ヌクレオチドn量体が修飾ヌクレオチド2量体であり、翻訳工程が、該修飾ヌクレオチド2量体をランダムに重合させてなり、かつ塩基配列が決定された修飾オリゴヌクレオチド配列における5’末端側から2塩基ずつ、対応表に基づいて行われる付記26に記載の機能性分子の製造方法。
付記28. 修飾ヌクレオチドn量体が修飾ヌクレオチド3量体であり、翻訳工程が、該修飾ヌクレオチド3量体をランダムに重合させてなり、かつ塩基配列が決定された修飾オリゴヌクレオチド配列における5’末端側から3塩基ずつ、対応表に基づいて行われる付記26に記載の機能性分子の製造方法。
付記29. 付記1から28のいずれかに記載の機能性分子の方法により製造されることを特徴とする機能性分子。
付記30. 標的に対し親和性を有し、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドn量体(ただし、nは、整数を表す)を有してなる付記29に記載の機能性分子。
本発明によると、前記機能性分子を煩雑な増幅、精製等の操作を繰り返して行う必要がなく、効率よく一括して製造可能な機能性分子の製造方法を提供することができる。
Claims (10)
- 標的に対し親和性を有する機能性分子の製造方法であって、
核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドn量体(ただし、nは、整数を表す)をランダムに重合させて修飾オリゴヌクレオチド配列を製造し該修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールを作製する修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程と、
前記修飾オリゴヌクレオチド配列の中から標的と親和性のあるものを選別する選別工程と、
選別した修飾オリゴヌクレオチド配列を増幅し、その塩基配列を決定する配列解読工程と、
塩基配列を決定した前記修飾オリゴヌクレオチド配列の配列を、4種のヌクレオシドを1対1に組合せた対応表における4 n 種のヌクレオチドn量体の少なくとも1種と修飾ヌクレオチドn量体の1種とを対応させた対応表に基づき翻訳する翻訳工程と、
を含み、
前記修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程において用いる前記修飾ヌクレオチドn量体が、前記対応表における前記修飾ヌクレオチドn量体である
ことを特徴とする機能性分子の製造方法。 - 修飾ヌクレオチドn量体が5〜4 n 種である請求項1に記載の機能性分子の製造方法。
- 修飾ヌクレオチドn量体が修飾ヌクレオチド2量体であり、該修飾ヌクレオチド2量体が5〜16種である、又は、修飾ヌクレオチドn量体が修飾ヌクレオチド3量体であり、該修飾ヌクレオチド3量体が5〜56種である請求項1に記載の機能性分子の製造方法。
- 置換基が、ヌクレオシドにおけるピリミジン塩基の5位に導入された請求項1から3のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
- 選別工程が、標的を結合させたビーズを充填したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行われる請求項1から5のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
- 選別工程が、標的と修飾オリゴヌクレオチド配列との解離定数をモニターしながら該修飾オリゴヌクレオチドを前記標的から解離させることにより行われる請求項1から6のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
- 選別工程が、2種以上の標的を一次元乃至三次元の空間配置を持つマトリックス上に固定し、前記標的が固定された該マトリックスに対し前記修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールを作用させた後、前記標的と結合した修飾オリゴヌクレオチド配列を精製することにより行われる請求項1から7のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
- 増幅が、PCR法、LCR法、3SR法、SDA法、RT−PCR法、ICAN法及びLAMP法から選択されるいずれかの方法により行われ、クローニングにより塩基配列が決定される請求項1から8のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
- 翻訳工程が、修飾ヌクレオチドn量体をランダムに重合させてなり、かつ塩基配列が決定された修飾オリゴヌクレオチド配列における5’末端側からn塩基ずつ、対応表に基づいて行われる請求項1から9のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
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