JP4803933B2 - インビトロ翻訳タンパク質の符号化方法および選別方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の背景
本発明は一般に、タンパク質を固定化したアレイ、タンパク質を接合させた微粒子の符合セットを作製する方法に関する。
【０００２】
タンパク質を始めとするある種の巨大分子は、その3次元的な形状および電子分布に基づいて他の分子と特異的に相互作用することが知られている。例えばタンパク質は、他のタンパク質、核酸、および小分子と選択的に相互作用する。タンパク質と相互作用する分子を同定することは、疾患および疾患に随伴する症状の治療に用いる化合物を開発する基礎となる。
【０００３】
一つの薬剤候補を発見するためには、数千種類の化合物をスクリーニングする必要がある。したがって、多数の化合物を迅速かつ効率よくスクリーニング可能であることが重要である。多数の化合物をスクリーニングする一つの方法では、タンパク質等の候補結合パートナーを固相支持体に固定する。
【０００４】
発明の概要
本発明の特徴は、個々のインビトロ翻訳タンパク質、またはインビトロ翻訳タンパク質群に、固有の極めて小さな符号化用分子のタグを付ける、または「符号化する」方法であり、続けて、符号化分子を固相支持体上または微粒子上で選別する関連した方法である。本発明はまた、本発明で符号化して選別したタンパク質を用いて、所望の結合パートナー（例えばタンパク質または他の化合物）を同定する方法を特徴とする。本発明により、部分的または完全にランダムなアミノ酸配列の大規模プールから所望の性質を有するタンパク質を単離しやすくなる。本発明により、タンパク質または化合物をスクリーニングする方法に対する自動化アプローチの採用も容易になる。
【０００５】
したがって本発明の最初の局面の特徴は、インビトロ翻訳タンパク質を符号化して選別する方法であり、この方法は、核酸リンカーに付着させたインビトロ翻訳タンパク質を提供する段階、および核酸リンカーを介して同タンパク質を符号化用分子に付着させることによってタンパク質を符号化する段階を含む。
【０００６】
一つの態様において本方法は、符号化タンパク質を固相支持体上に固定化する段階をさらに含む。別の態様においては、候補タンパク質はRNAタンパク質融合分子に由来する。さらに別の態様においては、符号化用分子は核酸または核酸類似体から作られる。この符号化用分子は、好ましくは固有のアドレス指定用要素、リンカーに特異的な整列要素、およびアドレス指定用要素とリンカーに特異的な整列要素とをつなぐ連結要素を含む。さらに、符号化用分子の連結要素には、ポリエチレングリコールのユニット（好ましくはヘキサエチレンオキシド）を含めることができる。さらに別の態様においては、符号化用分子のリンカー特異的整列要素と、候補タンパク質の核酸リンカーまたは候補タンパク質そのものとの間にハイブリッドを形成させることで、候補タンパク質と符号化用分子とを付着させる。
【０００７】
本発明の第2の局面は、インビトロ翻訳タンパク質を符号化する方法であって、インビトロ翻訳タンパク質を提供する段階、およびアドレス指定用要素を含む核酸リンカーをタンパク質に結合させることでタンパク質を符号化する段階を含む方法を特徴とする。
【０００８】
好ましい態様において本方法は、符号化タンパク質を固相支持体上に固定化する段階をさらに含む。別の好ましい態様においては、候補タンパク質はRNAタンパク質融合分子に由来する。
【０００９】
本発明の第3の局面は、インビトロ翻訳タンパク質を符号化する方法であって、インビトロ翻訳タンパク質を提供する段階、およびアドレス指定用要素が核酸リンカーから分枝したタンパク質に核酸リンカーを結合させることでタンパク質を符号化する段階を含む方法を特徴とする。
【００１０】
一つの態様において本方法は、本発明の最終段階で形成した符号化タンパク質を固相支持体上に固定化する段階をさらに含む。別の態様においては、候補タンパク質はRNAタンパク質融合分子に由来する。さらに別の態様においては、連結要素を用いてアドレス指定用要素を核酸リンカーに結合させる。符号化用分子の連結要素には、ポリエチレングリコールのユニットを含めることができる。ポリエチレングリコールのユニットは、好ましくはヘキサエチレンオキシドである。
【００１１】
本発明の上述した各局面のさらに別の態様において、固相支持体はガラスまたはシリカを基材とするチップまたはビーズである。捕捉用プローブは固相支持体に付着させることが可能であり、また同プローブには核酸または核酸類似体を含めることができる。符号化候補タンパク質と核酸捕捉用プローブのハイブリッドを形成させることで、すなわち符号化用分子に含まれる情報にしたがってタンパク質を選別することで、符号化候補タンパク質を固相支持体上に固定化することができる。
【００１２】
本発明のすべての局面のさらなる態様においては、候補タンパク質をレポータータグ、好ましくはフルオロフォアで標識する。アフィニティータグを符号化用分子に付着させることもできる。アフィニティータグの一例はビオチンである。
【００１３】
さらなる態様においては、符号化用分子および固相支持体を、架橋成分で機能化する。架橋成分は、好ましくはソラレン、アジド化合物、または硫黄含有分子である。一つの態様においては、符号化用分子の5'末端を、対象タンパク質の求核性アミノ酸側鎖を位置選択的に架橋する求電子試薬で機能化する。
【００１４】
本発明の第4の局面は、タンパク質と化合物との間の相互作用を検出する方法を特徴とする。この方法は、固相支持体上に固定化した、符号化インビトロ翻訳タンパク質を提供する段階；タンパク質と化合物との相互作用が可能な条件下で、このタンパク質を候補化合物に接触させる段階；およびタンパク質と化合物との間の相互作用を示す化合物が固相支持体に存在するか否かを分析する段階を含む。対象化合物は、核酸、タンパク質、治療用物質、または酵素とすることができる。
【００１５】
本発明の第5の局面は、核酸リンカーに付着し、符号化用分子に結合したインビトロ翻訳タンパク質を特徴とする。
【００１６】
本発明の第6の局面は、符号化核酸リンカー分子に付着したインビトロ翻訳タンパク質を特徴とする。
【００１７】
本発明の第7の局面は、分枝状符号化核酸リンカー分子に付着したインビトロ翻訳タンパク質を特徴とする。
【００１８】
様々な好ましい態様において、捕捉用プローブを有する固相支持体にタンパク質を付着させる。他の態様においては、ハイブリッドの形成や共有結合を介して符号化タンパク質を捕捉用プローブに付着させる。
【００１９】
本明細書で使用する「タンパク質」とは、一つまたは複数のペプチド結合で連結された、任意の2個またはそれ以上の天然型または修飾型のアミノ酸を意味する。「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は同じ意味で用いる。
【００２０】
「符号化用分子（encoding molecule）」とは、タンパク質またはペプチドに付着可能で、タンパク質集団に含まれるタンパク質を認識しやすくする固有のタグを意味する。符号化用分子は、核酸、核酸類似体、または非ヌクレオシドで構成されうるが、翻訳されて対象タンパク質そのものを生じるRNAは含まない。「符号化（encoded）」とは、符号化用分子を付着させることを意味する。
【００２１】
「アドレス指定用要素（addressing element）」とは、任意の集団内における他のそのような要素とは配列を十分異にすることで固有の特性（unique identity）を符号化用分子に付与する符号化用分子の一部分を意味する。アドレス指定用要素の長さは、好ましくは4〜40ヌクレオチド単位である。さらにアドレス指定用要素は、核酸または核酸類似体を含む場合がある。
【００２２】
「リンカーに特異的な整列要素」とは、インビトロ翻訳タンパク質の核酸リンカーとハイブリッドを形成する、またはタンパク質そのものとハイブリッドを形成する、符号化用分子の一部分を意味する。アドレス指定用要素は、核酸または核酸類似体を含む場合がある。
【００２３】
「連結要素（linkage element）」とは、アドレス指定用要素とリンカーに特異的な整列要素を連結する符号化用分子の一部分を意味する。連結要素は、核酸、核酸類似体、および非ヌクレオシドで構成されうる。連結要素は好ましくはポリエチレングリコールのユニットを含み、さらに好ましくは、ポリエチレングリコールのユニットはヘキサエチレンオキシドである。
【００２４】
「選別する」とは、系統だったかたちで位置を定めることを意味し、または同定もしくは分離することを意味する。符号化タンパク質を、固相支持体上に選別することができる。
【００２５】
「固相支持体」とは、任意のチップ（例えばシリカを基材とするチップ、ガラス製チップ、または金製チップ）、ガラス製スライド、メンブレン、ビーズ、固体粒子（例えばアガロース、セファロース、ポリスチレン、または磁性ビーズ）、カラム（またはカラム材料）、試験管、またはマイクロタイターディッシュを含むがこれらに限定されない任意の固相表面を意味する。
【００２６】
「マイクロアレイ」とは、固相表面またはメンブレン上に固定化された対象物の一定のパターンを意味する。通常アレイは、固体表面またはメンブレン上に固定化された捕捉用プローブに結合する符号化タンパク質から作られる。「マイクロアレイ」および「チップ」は同じ意味で用いる。マイクロアレイの密度は、好ましくは10〜1000 対象物/cm2である。
【００２７】
「捕捉用プローブ」とは、集団内の固有の符号化用分子のアドレス指定用要素に依存してハイブリッドを形成するデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの類似体の配列を意味する。捕捉用プローブには、核酸または核酸類似体を含めることができる。
【００２８】
「核酸リンカー」とは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの類似体の配列を意味する。核酸リンカーには、翻訳されて結合対象となるタンパク質を作るRNAを含まない。
【００２９】
「符号化DNAリンカー（encoded DNA linker）」とは、アドレス指定用要素を含むデオキシリボヌクレオチドの配列を意味する。「分枝状符号化DNAリンカー（branched encoded DNA linker）」では、リンカー内部のデオキシリボヌクレオチド成分からアドレス指定用要素が分枝する。符号化DNAリンカーには、核酸類似体を含めることもできる。
【００３０】
「レポータータグ」とは、存在がモニターできる、または検出できる分子を意味する。例えばレポータータグはフルオロフォアとすることができる。
【００３１】
「治療用物質」とは、疾患または疾患の症状の治療、回復、改善、予防、または安定化に使用する分子を意味する。
【００３２】
「RNA」とは、2つまたはそれ以上の共有結合した天然型または修飾型のリボヌクレオチド配列を意味する。この用語に含まれる修飾型RNAの一例には、ホスホロチオエートRNAがある。
【００３３】
「RNAタンパク質融合体」とは、タンパク質と共有結合したRNA分子を意味する。
【００３４】
「機能化する（functionalize）」とは、官能基または官能性成分の付着を可能とするように化学的な修飾を施すことを意味する。例えば符号化用分子を、タンパク質またはペプチドの求核性アミノ酸側鎖を位置特異的に架橋する求電子試薬で機能化することができる。別の例では、固相支持体の符号化用分子または捕捉用プローブを、ソラレン、アジド化合物、または硫黄含有ヌクレオシドなどの架橋成分で機能化することができる。
【００３５】
本発明には利点がいくつかある。例えば本発明により、事前に作製した、核酸または核酸類似体などの一連の汎用性の高い（ユニバーサルな；universal）符号化用分子を使用することが可能となる。これらの符号化用分子は、対応するユニバーサルなマイクロアレイまたは一連の微粒子とともに使用して、新しいタンパク質ディスプレイシステムを構築することができる。事前に作製した符号化用分子のシステムには柔軟性、モジュール形成性、拡張性、および、優れた経済性がある。本発明の別の利点は、酵素反応を介した取り込みまたは重合化には適していないが、いくつかの点で従来のDNAまたはRNAより優れた核酸類似体の使用を選択できることである。本発明のさらなる利点は、リアルタイムにおけるタンパク質のモニターに使用可能な蛍光成分でタンパク質を標識可能なことである。
【００３６】
本発明のさらに別の利点は、符号化して選別した産物が、最終的にタンパク質をコードするRNAを含まないことである。これはいくつかの点で重要である。特に、化学的に安定であり、かつヌクレアーゼに対して耐性をもつDNAは、その扱いが単純である。さらにタンパク質のRNAの長さは、タンパク質のサイズに直接関連し、大きなタンパク質ほどRNAのメッセージは長くなる。このような長いRNA領域は時に、予測困難な安定な2次構造をとる傾向があり、このような2次構造が、ハイブリダイゼーション段階ならびにタンパク質の折りたたみおよび機能と干渉する場合がある。したがって、タンパク質をコードするRNAの非存在下において、タンパク質を符号化して選別する方法が開発されれば、この分野における大きな進歩となる。
【００３７】
本発明の他の性質および利点は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から明瞭になる。
【００３８】
詳細な説明
図面については添付の図面の簡単な説明で簡潔に説明する。
【００３９】
本明細書は、インビトロ翻訳タンパク質の符号化方法および選別方法を開示する。本発明の各方法を実行する手法を、特定の実施例を用いて詳細に説明する。実施例は本発明を説明することを目的として提供するものであって、本発明を制限するものと解釈すべきではない。
【００４０】
実施例 1
符号化用分子を用いたインビトロ翻訳タンパク質の符号化および選別
インビトロ翻訳タンパク質は例えば図1A〜図1Dに示すようを符号化して選別することができる。個々のRNA配列（または複数の配列）をインビトロで翻訳し、RNAタンパク質融合体を、例えばロバーツ（Roberts）およびショステック（Szostak）の方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94： 12297〜12302、1997）およびショステック（Szostak）らの方法（国際公開公報第98/31700号；米国特許出願第09/247,190号）で形成する（両文献は参照として本明細書に組み入れられる）。インビトロ翻訳反応用のRNAは、通常の細胞合成法、組換え法、および化学合成法を含む任意の標準的な方法で作製することができ、かつ、これには、細胞由来のRNA、mRNAライブラリー、およびランダムな合成RNAライブラリーが含まれるがこれらに限定されない。ペプチドアクセプター（例えばピューロマイシン）を、核酸または核酸類似体のリンカーを介してRNAに結合させる。例示的な核酸類似体には例えばPNA（Nielsenら、Science 254：1497〜1500、1991）、P-RNA（Krishnamurthy、Agnew. Chem. 35： 1537、1996）、または3'Nホスホラミデート（GryaznovおよびLetsinger、Nucleic Acids Res. 20： 3403〜3409、1992）がある。これらのペプチドアクセプター分子は、例えばロバーツおよびショステック（前掲）およびショステックら（前掲）の論文に記載された方法を始めとする任意の標準的な方法で作製することができる。
【００４１】
RNAタンパク質融合分子は、好ましくは候補タンパク質のコード配列に機能的に連結された翻訳開始配列および開始コドン、ならびに、当該候補タンパク質のコード配列の3‘末端にペプチドアクセプターを含む、RNA分子を含む。DNA配列またはRNA分解酵素に耐性の核酸類似体の配列は、メッセージの末端とペプチドアクセプターとの間に含まれる。必要に応じ、例えば特定の源に由来する、または任意のタイプのRNA配列の群または集合体は、同じ一般的な方法によって一つの反応混合物中でともに翻訳することができる。
【００４２】
必要に応じ、RNAタンパク質融合体をレポーター基、例えば蛍光レポーター基で標識する。DNAリンカーを組み立てる際に、例えばロバーツおよびショステックの論文（前掲）に記載された一般的な手順を改変して、DNAリンカーの一つまたは複数のヌクレオチドを蛍光性dT（Glen Research、バージニア州、スターリング）と置換することで、蛍光レポーター基をピューロマイシン含有DNAリンカーに組み入れることができる。
【００４３】
次にDNA分解酵素活性がない適切なRNA分解酵素、例えばアンビオン（Ambion）（テキサス州、オースティン）から入手可能なRNA分解酵素Iを融合反応物に添加してRNAタンパク質融合分子のRNA部分を分解する。
【００４４】
次に個々の残りのタンパク質を、以下の手順で符号化する。符号化段階では、個々のタンパク質がそれぞれ固有の符号化用分子をもつように符号化することができる。この方法では、各符号化タンパク質を、選別過程で唯一の捕捉用プローブに対応するように設計することにより、固相支持体上における各タンパク質の正確な「アドレス」を識別することができる。または、複数のタンパク質をプールして、一つまたは複数の符号化用分子で符号化することができる。この方法では、同じ符号化用要素に、一つまたは複数の異なるタンパク質を符号化することができる。また符号化タンパク質を選別する際に、一つ以上の符号化タンパク質を特定の捕捉用プローブに結合させることができる。したがって、固相支持体上の各「アドレス」には、それぞれ同じ符号化用分子を有するタンパク質の混合物を含むことができる。
【００４５】
次に、例えば図2Aおよび図2Bに示した、入力RNAに対してモル比が約1：1の固有の符号化用分子を各ウェルに添加する。個々の固有のタンパク質は、異なる固有の符号化用分子の受け手となり、かつ固有の符号化用分子の特性は既知であることから、タンパク質の特性を決定することができる。図2Aに示すように、固有の符号化用分子はそれぞれ3種類の非常に重要な要素を含む：「リンカーに特異的な整列要素」は、核酸または核酸類似体からなり、ペプチドアクセプターとインビトロ翻訳タンパク質間に位置するDNAリンカーに結合するか、またはタンパク質部分に直接に結合し；「アドレス指定用要素」は、核酸または核酸類似体からなり、固相支持体上の特定の位置、または特定の微粒子に結合し；「連結要素」は、リンカーに特異的な整列要素と固有の符号化用要素を連結する。
【００４６】
単純な固有の符号化用分子は、例えばボーケージ（Beaucage）およびカルサース（Caruthers）（Tetrahedron Letters 22： 1859、1981）に記載の従来の自動固相支持体結合ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド化学法で3'→5'方向に組み立てることができる。例えば図2Bに示す例示的な符号化用分子の合成は、A単量体で、当該ヌクレオシドの3'-ヒドロキシル基において機能化された固相支持体（例えば多孔性球状ガラスビーズ（controlled-pore glass）またはポリスチレン）から始まる。さらに単量体を段階的に結合させて、所望の符号化用配列を構築する。特異的な符号化用配列の設計上の規則は米国特許第5,863,722号に記載されている。符号化用配列を組み立てた後に、4個のヘキサエチレンオキシド単量体ユニット（Glen Research）を添加して、柔軟性のある連結要素を得る。次に、リンカーに特異的な整列要素を添加する。融合体をロバーツおよびショステック（前掲）に記載の標準的な30P DNAリンカーとともに調製する場合は、15量体のポリT整列要素を付加する。他のDNAリンカーを融合体（すなわち30P以外）の調製に使用する場合は、整列要素はDNAリンカー配列の一部の領域の逆相補でなければならない。最後に、必要に応じソラレンホスホラミダイト（Glen Research）、または同等のホスホラミダイト部分を5'末端に付加して第1架橋成分として機能させる。
【００４７】
合成が完了したら、符号化用分子を支持体から切り離し、当技術分野で既知の方法で水酸化アンモニウムを用いて脱保護処理を行う。最終的な精製は、標準的なクロマトグラフィー法または電気泳動法で行う。
【００４８】
単純な固有の符号化用分子に手を加えることで、容易に広範な符号化用分子を得ることができる。例えば上述したように、固有の符号化用分子は、通常はリンカーに特異的な整列要素において、固有の符号化種をインビトロ翻訳タンパク質と恒久的に架橋するために使用する第1架橋成分、例えばソラレンにより機能化することができる。アドレス指定用要素についても、第2架橋成分、例えば4-チオTにより機能化して、固相支持体と固有の符号化用分子との間に共有結合を形成させることができる。またアドレス指定用要素を、符号化タンパク質を単離および濃縮する際に使用するアフィニティータグ、例えばビオチンでさらに標識することができる。アフィニティータグを3'の支持体（Glen Research）として組み入れ、符号化用分子の残りの部分を上述の手順で構築する。一つの特定の態様においては、唯一の符号化用分子の連結要素はポリエチレングリコールユニット、例えばヘキサエチレンオキシドを含む。
【００４９】
固有の符号化用分子を、当技術分野で周知の例えば図1Cに示した標準的なハイブリダイゼーションの条件下で、符号化用分子のリンカーに特異的な整列要素とタンパク質融合体のDNAリンカー間の相互作用を介してタンパク質とハイブリッドを形成させる。次に固有の符号化用分子を、タンパク質のDNAリンカー、またはタンパク質そのもののいずれかに対し、紫外線（通常350 nm）を照射して共有結合で架橋する。符号化用分子をタンパク質のDNAリンカーに共有結合で架橋させる場合は、例えばガスパッロ（Gasparro）らの方法（Nucleic Acids Research、 22：2845〜2852、1994）にしたがって、ソラレンなどの架橋剤を使用することができる。または符号化用分子をタンパク質に共有結合で直接架橋させる場合は、例えばベイレイ（Bayley）の方法（「生化学および分子生物学における光生成試薬（Photogenerated Reagents in Biochemistry and Molecular Biology）」、エルゼビア、ニューヨーク、1983）にしたがって、アジド化合物などの架橋剤を使用することができる。
【００５０】
次に、固有の符号化用分子に架橋させたタンパク質を含む溶液を混合し、例えばビオチン化したタンパク質を、標準的な方法でストレプトアビジンカラムに添加して、標準的なアフィニティー分離法で単離する。符号化用分子に付着するアフィニティータグを用いた他の標準的なアフィニティー分離法を使用することができる。
【００５１】
次に、符号化用タンパク質を含むアフィニティー分離した溶液を、例えば図1Dに示すように固相支持体に添加する。この固相支持体は好ましくは、例えばフルトン（Fulton）らの論文（Clinical Chemistry 43： 1749〜1756、1997）ならびに図3Aおよび図3Bに示されるような、符号化タンパク質と相互作用するように設計した捕捉用プローブを含むユニバーサルなチップまたはユニバーサルな符号化微粒子セットである。捕捉用プローブは好ましくは、符号化用分子の固有の符号化用要素に配列特異的に結合して、タンパク質を固相支持体に連結してタンパク質を選別する核酸または核酸類似体である。固相支持体上の各捕捉用プローブは、各配列が異なる符号化用分子タンパク質複合体と結合する種々のヌクレオチド配列を含むように設計する。第2架橋成分（上述）を介して、捕捉用プローブと符号化用分子とを架橋するために酸化反応で使用可能な分子、例えば4-チオTを含めることもできる。
【００５２】
捕捉用プローブは、例えばクイメリス（Kuimelis）らの方法（米国特許出願第09/282,734号、1999年3月31日出願、および国際公開公報第99/51773号、1999年10月14日発行）を始めとする任意の方法で固相支持体に付着させることができる。捕捉用プローブを固相支持体に付着させる一つの例示的な方法では、100mMの炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.0）中で捕捉用プローブの濃度を500μMに調整し、固相支持体の誘導体化した表面の定めた位置に添加する。微量液体送達システムに接続した3軸モーションコントロール装置を使用して、捕捉用プローブを正確に固着（deposit）させることができる。固着させた捕捉用プローブを含む固相支持体を、水分飽和状態において少なくとも2時間室温でインキュベートする。この付着反応は、ガラス表面を1%アンモニア水に5分間軽く攪拌しながら浸して終了させる。次にガラス表面を対象に5分間の洗浄を3回、各洗浄に新鮮な蒸留水を用いて行う。次にアレイを1 Mのリン酸緩衝食塩水（PBS）に2時間室温で浸した後に蒸留水で再び5分間洗浄する。
【００５３】
「選別した」タンパク質を、例えばカイン（Cain）らの方法（Nucleic Acids Research、23：2153〜2160、1995）により、二重鎖の末端にジスルフィド結合形成を誘発することにより、捕捉用プローブと共有結合で連結することができる。
【００５４】
実施例2
符号化用DNAリンカーを用いたインビトロ翻訳タンパク質の符号化および選別
符号化過程をさらに単純化するために、インビトロ翻訳タンパク質を図4A〜図4Cに示すような符号化DNAリンカーの状態で固有の符号化用分子に直接連結させたRNA分子から作製することもできる。符号化DNAリンカーには、核酸または核酸類似体、および固相支持体上の特定の位置または特定の微粒子に結合する核酸または核酸類似体を含む「アドレス指定用要素」を含めることができる。
【００５５】
単純な符号化DNAリンカー分子を、例えばボーケージ（Beaucage）およびカルサース（Caruthers）の論文（前掲）に記載された、従来の自動化固相支持体結合ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド化学法で3'→5'方向に組み立てることができる。例えば、図5Bに示す例示的な符号化DNAリンカー分子の合成は、ペプチドアクセプター（例えばピューロマイシン）で、当該ヌクレオシドの2’-ヒドロキシル基において機能化された固相支持体（例えば多孔性球状ガラスまたはポリスチレン）から始まる（Glen Research）。次に2個のC単量体を添加する。次に適切な単量体を段階的に添加して所望の符号化用配列を構築する。特定の符号化用配列の設計上の規則は、米国特許第5,863,722号に開示されている。12個のA単量体を段階的に結合させて、DNAリンカーの構築を終了する。符号化DNAリンカー分子の全長は、ロバーツおよびショステックの方法（前掲）で使用される30P DNAリンカーと同じであることが好ましい。合成が完了したら、符号化用分子を支持体から切り離し、通常の手順で水酸化アンモニウムを用いて脱保護処理を行う。最終的な精製は、標準的なクロマトグラフィー法または電気移動法で行う。
【００５６】
必要に応じ、単純な符号化DNAリンカー分子に、アフィニティータグ（例えばビオチン）および/またはフルオロフォア（例えばフルオレセイン）を用いて手を加えることで容易に広範な符号化DNAリンカー分子を得ることができる。アフィニティータグおよびフルオロフォアは、核酸塩基を機能化したT単量体（Glen Research）として符号化用分子のポリA領域中にそれぞれ組み入れられ、図5Bに示す12個のA単量体のうち1個/2個を置換する。符号化用分子の残りの部分は、単純な符号化DNAリンカーについて既に記載した通りに構築する。
【００５７】
5'末端がリン酸化された符号化DNAリンカーを、例えば図4Aに示すようにT4 DNAリガーゼを用いてRNAに連結する。次に、連結産物を、ロバーツおよびショステックの方法（前掲）およびショステックらの方法（前掲）でインビトロで翻訳し、RNAタンパク質融合分子を形成させ、次にこの分子のRNA部分を実施例1で示した方法で、また、図4Bに示したように分解する。このRNA分解過程を経てインビトロ翻訳タンパク質は符号化DNAリンカーに付着する。
【００５８】
符号化したインビトロ翻訳タンパク質は、図4Cに示すように、ユニバーサルなチップまたはビーズセットとハイブリッドを形成させることができる。ハイブリッド形成は、DNAリンカーのアドレス指定用要素と、固相支持体の捕捉用プローブとの間で図1に示すように生じる。
【００５９】
基本的に上述された手法を用いて、TNF-αを結合するポリペプチド、およびIL-13を結合するポリペプチドを、以下のようにインビトロで翻訳し、符号化して選別し、TNF-αおよびIL-13を結合することを示した。
【００６０】
4組の連続した4ヌクレオチドブロックに基づく固有の配列を、符号化ポリペプチドの選別および固定の両方における捕捉点として働くように選択した。使用した捕捉（選別）用配列の一覧を以下に示す（5'→3'方向に記載）：
【００６１】
オリゴヌクレオチドは、従来のホスホラミダイト化学法で、グレンリサーチ社（Glen Research）から入手した試薬を用いて、自動化DNA合成装置（PE BioSystems Expedite 8909）で調製した。合成は、3'末端のアミンが最終脱保護段階まで露出状態とならないように直交的に保護されたアミノ基を有する固相支持体から開始させた。添加する先頭の4個の単量体はヘキサエチレンオキシドのユニット（HEO）とし、それに続けて標準的なA、G、C、およびTの各単量体を添加した。オリゴヌクレオチドを固相支持体から切り離して水酸化アンモニウムで脱保護処理を行い、濃縮して乾燥し、エタノールで沈殿させ、トリエチルアンモニウムアセテート緩衝液中、アセトニトリル勾配を用いた逆相HPLC法で精製した。HPLC法から適切な分画を回収し、真空遠心して蒸発乾固した後、水で共蒸発させた。
【００６２】
精製したアミン標識オリゴヌクレオチドの濃度を、50mMの炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.0）中、500μMに調製した。この選別配列を、アミン反応性ガラス表面（3D-Link、Surmodics）上の定位置に5×5×4のアレイパターンを形成するように、3軸ロボット（MicroGrid、BioRobotics）によりスポットした。4ピンツールを使用して、384ウェルのマイクロタイタープレートから液体を移し、600ミクロンのピッチで200ミクロンのフィーチャー（feature）をもたせた。24フィーチャーのサブグリッドはそれぞれ、一つのオリゴヌクレオチド（すなわち24回の重複スポット）を示す。プリント後のアレイを、水分飽和状態で12〜18時間室温でインキュベートした。この結合反応を、チップを2%の水酸化アンモニウム水溶液に5分間軽く攪拌しながら浸して終了させ、次に蒸留水で洗浄した（5分間を3回）。
【００６３】
次に固有の符号化DNAリンカーを5'末端のdA11トラクトを用いて合成し、4ヌクレオチドブロック群からなる固有の16量体、dC2、および3'末端のピューロマイシンと続けて合成した。これは図5Bの符号化用分子と同様である。符号化用配列は以下の通りであり、上述の捕捉用プローブ配列と接合して作用するように設計した（5'→3'の方向に記載）：
【００６４】
基本的に上述されたとおり自動化DNA合成装置を用いて、従来のホスホラミダイト化学法で符号化DNAリンカーを調製した。すべての試薬はグレンリサーチ社（Glen Research）から入手した。保護されたピューロマイシン成分をもつ固相支持体から合成を開始させた。オリゴヌクレオチドを固相支持体から切り離し、水酸化アンモニウムで脱保護処理を行い、濃縮して乾燥させた後に、エタノールで沈殿させた。純度と完全性は陰イオン交換HPLC法で確認した。
【００６５】
共通のPCRプライマーを使用して、TNF-αおよびIL-13を結合したポリペプチド配列をコードするDNA領域を増幅し、それぞれFnTNFおよびFnIL13と命名した。3'プライマーは付加的な
配列を末端に含むものとした。標準的なPCR増幅は、PCR試薬（Ready-to-goビーズ、Amersham）を用いてプライマーおよび鋳型とともに25サイクルにわたって行った。PCR産物の完全性は2%アガロースゲルで確認した。次にFnTNFおよびFnIL13の配列を、標準的なプロトコールにしたがってPCR産物からインビトロで転写（Mega Short Script、Ambion）し、NAP-25サイズ排除カラム（Amersham Pharmacia）を用いて精製した。結果として得られたRNA含有画分を沈殿させ、H2Oに再懸濁した。
【００６６】
FnTNFのRNA構築物およびFnIL13のRNA構築物を、5'末端がリン酸化された固有の符号化用配列に酵素を用いて連結した。FnTNF RNAはTAG_LN-8に連結させ、FnIL13はTAG_LN-16に連結させて、RNA-DNAリンカーピューロマイシンキメラ分子：それぞれFnTNF_LN-8およびFnIL13_LN-16を得た。連結は1ナノモルスケールで、等モル量のRNAと5'端がリン酸化された符号化DNAピューロマイシンリンカーとを対象に、100ユニットのT4 DNAリガーゼ（Promega）を用いて、1ナノモルの共通DNAスプリント（splint）
の存在下で行った。16℃で12〜18時間インキュベートし、連結産物を変性PAGE（6% TBE-尿素）で分離した。連結産物をUVシャドウイング法で可視化し、ゲルから切り出して溶出し、破砕および浸漬した後に沈殿させてH2Oに再懸濁した。
【００６７】
精製後の連結産物のインビトロ翻訳を以下の手順で行った：H2O中、83μLの連結RNA（120pmol）に15μLのマスターミックス（Ambion、メチオニン非含有）、2μLの35S-メチオニン（15μM）および200μLのウサギ網状赤血球溶解物（Ambion）を添加して総量を300μLとした。この反応混合物を30分間30℃でインキュベートした後に、100μLの2M KClおよび20μLの1M MgCl 2 を添加した。さらに60分間室温でインキュベートした後に47μLの0.5M EDTAを添加した。
【００６８】
結果として得られた符号化RNAリンカータンパク質融合体であるFNTNF_LN-8およびFNIL13_LN-16を次にオリゴdTクロマトグラフィーで単離した。等量の2×オリゴdT結合緩衝液（200mM Tris；pH8、2M NaCl、20mM EDTA、および0.1% ツイーン20）を反応系に添加した後に、RNAリンカー融合体を100mgのオリゴdTセルロース（Pharmacia）に結合させ、洗浄用緩衝液（100mM Tris pH8、1M NaCl、0.05% ツイーン20）で洗浄してH2Oで溶出した。RNA-DNAリンカー融合体の定量は、シンチレーション測定で行い、融合体の完全性はPAGE（4〜20%のTris-グリシン）で確認した。
【００６９】
次にFNTNF_LN-8 DNAタンパク質融合体をマイクロアレイ上に選別した。50fmolの融合体を、0.05%のツイーン20を含む5×SSCに調製した（総容量は350μL）。次にこのRNAに2uLのRNA分解酵素A（Ambion）を添加して37℃で15分間かけて切断し、16ヌクレオチドの符号化配列（この場合はタンパク質に融合させたTAG_LN-8）を含む29量体のDNAを残した。全体量を400μLのガスケット装置を用いてマイクロアレイにアプライし、アセンブリーを連続18時間にわたって室温で回転させた。選別後に、攪拌済みの500mLの2.5×SSC、1×SSC、および0.5×SSCを用いて、5分間かけてそれぞれ室温でスライドを連続的に洗浄した。微量の液体を遠心して除去し、スライドを風乾させた。
【００７０】
モレキュラーダイナミクスストームシステム（Molecular Dynamics Storm system）を用いたホスホイメージ（phosphorimage）分析で融合タンパク質上の35Sメチオニンを直接検出し、選別したポリペプチドを可視化した。露出時間は48時間とし、マイクロアレイとホスホストレージスクリーン（phosphor strage screen）とを直接接触させた。ホスホイメージスキャニングを50μmの解像度の設定で行い、イメージクワント（ImageQuant）ソフトウェアのバージョン4.3を用いてデータを抽出した。
【００７１】
選別したポリペプチドが機能することを、標識したTNF-αタンパク質に結合させて明らかにした。組換え型のヒトTNF-α（500μg、PeproTech）を、230μLの1×PBSに溶解し、700mLの攪拌済みの1×PBSでマイクロダイアライザー（Microdialyzer）ユニット（3,500MWCO、Pierce）を用いて4℃で18時間かけて透析した。透析したTNF-αタンパク質を、EZ-LinkのNHS-LC-LCビオチン化試薬（20μg、Pierce）を用いて0℃で2時間かけて処理し、再び700mLの攪拌済みの1×PBSを用いて4℃で18時間かけてマイクロダイアライザーユニット（3,500MWCO、Pierce）で透析した。結果として得られた接合体をMALDI-TOF質量分析計で分析し、それが一つのビオチン部分によりほぼ完全に機能化されていることを確認した。
【００７２】
以下に示す各工程を室温で連続的に回転または混合しながら行った。タンパク質のマイクロアレイ表面を、0.05% ツイーン20および1% BSA（200μL）を含む1×TBSで60分間かけて処理して不動態化した。ビオチン化したTNF-α（1×TBS中に100nM 、0.02% ツイーン20、および0.2% BSA）をマイクロアレイに120分間室温で接触させた。このマイクロアレイを0.05% ツイーン20を含む1×TBSで洗浄した（50mLを3回、各洗浄を5分間）。蛍光標識した2°試薬（2.5μg/mLのCy3標識した抗ビオチンモノクローナル抗体（Sigma）を0.05% ツイーン20および0.2% BSAを含む1×TBS中で調製したもの）をマイクロアレイに60分間接触させた。このマイクロアレイを、0.05% ツイーン20（50mLを2回、各洗浄を5分間）を含む1×TBSで洗浄後に1×TBSで3分間かけて洗浄した。微量の液体は遠心して除去し、室温でスライドを風乾させた。
【００７３】
蛍光レーザースキャニングを、10μMのピクセル解像度でCy3色素の励起および放出波長にプリセットしたGSI Lumonics ScanArray 5000システムで行った。図6Aおよび図6Bはそれぞれ、選別したFNTNF_LN-8を含むマイクロアレイのホスホイメージと蛍光スキャンである。ホスホイメージは、35Sメチオニンシグナルに基づいて選別したポリペプチドの位置を示す。蛍光スキャンは、標識したTNP-aタンパク質の標的が結合した位置を示し、選別したポリペプチドが機能することを証明している。
【００７４】
符号化IL-13バインダーコンストラクトであるFNIL13_LN-16を上述の方法で調製し、上述のように、符号化DNAタンパク質融合体であるFNTIL13_LN-16で選別を行った。選別したポリペプチドは、融合タンパク質上の35Sメチオニンを、上述のホスホイメージ分析で直接検出して可視化した。
【００７５】
選別したポリペプチドが機能することは、標識したIL-13タンパク質に結合することから証明された。組換え型のヒトIL-13（500μg、PeproTcch）を上述の方法でビオチン化した。結果として得られた接合体をMALDI-TOF質量分析計で分析し、それが一つのビオチン部分によりほぼ完全に機能化されていることを確認した。ビオチン化したIL-13タンパク質の結合後に、Cy3で標識した抗ビオチンモノクローナル抗体による検出を上述の方法で行った。
【００７６】
図7Aと図7Bはそれぞれ、選別したFNIL13_LN-16を含むマイクロアレイのホスホイメージと蛍光スキャンである。このホスホイメージは、35Sメチオニンシグナルに基づく、選別したポリペプチドの位置を示す。蛍光スキャンは、標識したIL-13タンパク質標的が結合している位置を示し、選別したポリペプチドが機能することを証明している。
【００７７】
実施例3
分枝状符号化DNAリンカーを用いたインビトロ翻訳タンパク質の符号化および選別
インビトロ翻訳タンパク質を符号化するさらに別の方法を図8A〜図8Cに示す。このアプローチでは、インビトロ翻訳の対象となる所望のタンパク質をコードするRNAを、分枝状符号化DNAリンカーの形状の固有の符号化用分子に連結させる。このDNAリンカーは図9A〜図9Bに示す核酸または核酸類似体を含む。核酸または核酸類似体を含むアドレス指定用要素がDNAリンカーから分枝し、そこにリンカー要素が連結する。
【００７８】
単純な分枝状符号化DNAリンカー分子を、例えばボーケージ（Beaucage）およびカルサース（Caruthers）による前掲の論文に記載の従来の自動化固相支持体結合ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド化学法によって3'→5'の方向に組み立てることができる。例えば図9Bに示す例示的な分枝状符号化DNAリンカー分子の合成は、ペプチドアクセプター（例えばピューロマイシン）で、当該ヌクレオシドの2’-ヒドロキシル基において機能化された固相支持体（例えば多孔性球状ガラスまたはポリスチレン）から始まる（Glen Research）。次に2個のC単量体を付加した後に、18個のA単量体を付加する。次に、差次的に保護された非対称の分枝状単量体（Clontech、カリフォルニア州、パロアルト）を付加してDMT保護基を除去する。次に9個のA単量体を付加する。次に分枝状の単量体上にあるLev保護基を除去し、4個のヘキサエチレンオキシド単量体ユニット（Glen Research）を添加して柔軟性のある連結要素を得る。次に適切な単量体を段階的に添加して所望の符号化配列を構築する。特定の符号化配列の設計上の規則は、米国特許第5,863,722号に開示されている。完成時に分枝状符号化DNAリンカー分子は2か所の5'末端を含む。合成が終了したら、通常の方法で水酸化アンモニウムを用いて符号化用分子を支持体から切り離して脱保護処理を行う。最終的な精製は、標準的なクロマトグラフィー法または電気泳動法で行う。
【００７９】
上述の単純な分枝状符号化DNAリンカー分子に、アフィニティータグ（例えばビオチン）および/またはフルオロフォア（例えばフルオレセイン）を用いて手を加えることで、容易に広範な分枝状符号化DNAリンカー分子を得ることができる。好ましくは、アフィニティータグおよびフルオロフォアはそれぞれ、核酸塩基を機能化したT単量体（Glen Research）として符号化用分子のポリA領域に組み入れられ、27個のA単量体のうち1個または2個を置換する。符号化用分子の残りの部分は、単純な場合について既に述べたように構築される。RNAおよび分枝状DNAリンカーを、例えばT4 DNAリガーゼを用いて連結させる。次に連結産物を、ロバーツおよびショステックの方法（前掲）、およびショステックらの方法（前掲）でインビトロで翻訳し、RNAタンパク質融合分子を形成させ、次にこの分子のRNA部分を実施例1に記述した方法で、または図8Bに示すように分解する。このRNAの分解段階で、インビトロ翻訳タンパク質が分枝状符号化DNAリンカーに付着する。
【００８０】
符号化したインビトロ翻訳タンパク質は、ユニバーサルなチップまたはビーズセットと図8Cに示すようにハイブリッドを形成させることができる。ハイブリッド形成は、分枝状DNAリンカーのアドレス指定用要素と、固相支持体の捕捉用プローブとの間で、実施例1に示すように形成される
【００８１】
他の態様は、特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 符号化して選別したインビトロ翻訳タンパク質の生産にかかわる一つの例示的段階を示す略図である。この段階では、DNAリンカーを介してペプチドアクセプターに付着するRNA分子が、インビトロで翻訳されてRNAタンパク質融合分子を形成する。次に融合分子のRNA部分をRNaseで分解する。融合分子の残りの部分は、DNAリンカーに付着したタンパク質からなる。
【図１Ｂ】 図1Aで説明したRNAの分解後に残る融合分子のタンパク質部分を示す略図である。
【図１Ｃ】 符号化して選別したインビトロ翻訳タンパク質の生産に関与する他の例示的段階を示す略図である。この段階は、符号化タンパク質の作製にかかわる後続の手順を表し、（i）DNAリンカーと「固有の符号化用分子」とのハイブリッドを形成させる段階、（ii）符号化用分子とDNAリンカー分子との共有結合による架橋を誘導する段階、（iii）全符号化タンパク質を一つの溶液中に混合する段階、および（iv）アフィニティーを利用した分離で符号化タンパク質を単離した後に、タンパク質産物を濃縮する段階を含む。以上の段階で得られる最終的な産物は、符号化インビトロ翻訳タンパク質の混合物である。
【図１Ｄ】 符号化して選別したインビトロ翻訳タンパク質の生産に関与するさらなる例示的段階を示す略図である。この別の段階は、（i）図1Cで形成された分子が固有の符号化用分子を介してユニバーサルなチップまたはビーズとのハイブリッドを形成する段階、および（ii）チップまたはビーズと唯一の符号化用要素との間に共有結合による架橋を誘導する段階を含む。この段階はまた、符号化タンパク質を固相支持体の捕捉用プローブに特異的に結合させること、および符号化タンパク質と、符号化タンパク質に対応しない捕捉用プローブとの間には結合がないことを示している。
【図２Ａ】 一般的な意味では図1A〜1Dに示すタンパク質を符号化するために使用する例示的な符号化用分子を示す略図である。この分子は、第1架橋成分を含むリンカー特異的な整列要素に、連結要素を介して付着したアドレス指定用要素を含む。
【図２Ｂ】 図1A〜1Dに示すタンパク質を符号化する際に使用する例示的な符号化用分子を示す略図であり、アフィニティータグがビオチンであり、第2架橋成分が硫黄含有ヌクレオシドであり、囲み中のヌクレオチド配列はアドレス指定用要素を示し、第1架橋成分はソラレンである。アドレス指定用要素は、ヘキサエチレンオキシドの連結要素を介してリンカー特異的な整列要素に連結される。
【図３Ａ】 固相支持体の一例として、タンパク質ディスプレイシステムを作製するために本発明で使用可能なビーズを示す略図である。捕捉用プローブの配列は、実施例2Bの符号化用分子を結合するように設計されている。
【図３Ｂ】 固相支持体の一例として、タンパク質ディスプレイシステムを作製するために本発明で使用可能なチップを示す略図である。チップの指定位置における捕捉用プローブの配列は、実施例2Bの符号化用分子に結合するように設計されている。
【図４Ａ】 符号化DNAリンカーを用いて符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産にかかわる一つの例示的段階を示す略図である。この段階では、RNA分子と、符号化DNAリンカーを連結させる。このリンカーは、符号化タンパク質を固相支持体に結合させる際に使用される符合を有する。
【図４Ｂ】 符号化DNAリンカーを用いて符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産にかかわる他の例示的段階を示す略図である。この段階は、RNAタンパク質融合分子を形成させるために符号化DNAリンカーを介してペプチドアクセプターに付着したRNA分子の翻訳と、それに続くRNA分解酵素による融合分子のRNA部分の分解とを示す。融合分子の残りの部分は、符号化DNAリンカーに付着したタンパク質を含む。
【図４Ｃ】 符号化DNAリンカーを用いて符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産にかかわる最終的な例示的段階を示す略図である。この段階は、図4Bで形成された分子が、符号化DNAリンカーを介して一般的なチップまたはビーズセットとハイブリッドを形成することを示す。
【図５Ａ】 図4A〜4Cに示すタンパク質を符号化する際に使用する例示的な符号化用分子を示す略図であり、一般的にはアドレス指定用要素およびペプチドアクセプター、例えばピューロマイシンを含むDNAリンカーを含む。
【図５Ｂ】 図4A〜4Cに示すように、本発明でタンパク質を符号化する際に使用する符号化用分子の一例を示す略図であり、囲み中のヌクレオチド配列はアドレス指定用要素を示す。
【図６Ａ】 本発明の方法で得られた例示的なマイクロアレイのホスホイメージ（phsophorimage）である。
【図６Ｂ】 本発明の方法で得られた例示的なマイクロアレイの蛍光スキャン画像である。
【図７Ａ】 本発明の方法で得られた例示的なマイクロアレイのホスホイメージである。
【図７Ｂ】 本発明の方法で得られた例示的なマイクロアレイの蛍光スキャン画像である。
【図８Ａ】 分枝状符号化DNAリンカーを用いて、符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産に関与する一つの例示的段階を示す略図である。この段階は、RNA分子の分枝状DNAリンカーとの連結を示す。
【図８Ｂ】 分枝状符号化DNAリンカーを用いて、符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産に関与する他の例示的段階を示す略図である。この段階は、分枝状DNAリンカーを介してペプチドアクセプターに付着させてRNAタンパク質融合分子を作製するRNA分子の翻訳、およびそれに続く、RNA分解酵素による融合分子のRNA部分の分解を含む。融合分子の残りの部分は、分枝状DNAリンカーに付着したタンパク質を含む。この段階の産物は、RNA分解後に残る融合分子のタンパク質部分である。
【図８Ｃ】 分枝状符号化DNAリンカーを用いて、符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産に関与する最終的な例示的段階を示す略図である。この段階では、図8Bで形成された分子が、分枝状DNAリンカーのアドレス指定用要素を介して、一般的なチップまたはビーズセットとハイブリッドを形成する。
【図９Ａ】 一般的には図8A〜8Cに示したタンパク質の符号化に使用する例示的な符号化用分子を示す略図である。
【図９Ｂ】 本発明で使用し、図8A〜8Cに示した符号化用分子の一例を示す略図である。Xはこの分子の分枝点を示し、囲み中のヌクレオチド配列はアドレス指定用要素を示す。アドレス指定用要素は、ヘキサエチレンオキシドの連結要素を介してDNAリンカーに付着する。
発明の背景
本発明は一般に、タンパク質を固定化したアレイ、タンパク質を接合させた微粒子の符合セットを作製する方法に関する。
【０００２】
タンパク質を始めとするある種の巨大分子は、その3次元的な形状および電子分布に基づいて他の分子と特異的に相互作用することが知られている。例えばタンパク質は、他のタンパク質、核酸、および小分子と選択的に相互作用する。タンパク質と相互作用する分子を同定することは、疾患および疾患に随伴する症状の治療に用いる化合物を開発する基礎となる。
【０００３】
一つの薬剤候補を発見するためには、数千種類の化合物をスクリーニングする必要がある。したがって、多数の化合物を迅速かつ効率よくスクリーニング可能であることが重要である。多数の化合物をスクリーニングする一つの方法では、タンパク質等の候補結合パートナーを固相支持体に固定する。
【０００４】
発明の概要
本発明の特徴は、個々のインビトロ翻訳タンパク質、またはインビトロ翻訳タンパク質群に、固有の極めて小さな符号化用分子のタグを付ける、または「符号化する」方法であり、続けて、符号化分子を固相支持体上または微粒子上で選別する関連した方法である。本発明はまた、本発明で符号化して選別したタンパク質を用いて、所望の結合パートナー（例えばタンパク質または他の化合物）を同定する方法を特徴とする。本発明により、部分的または完全にランダムなアミノ酸配列の大規模プールから所望の性質を有するタンパク質を単離しやすくなる。本発明により、タンパク質または化合物をスクリーニングする方法に対する自動化アプローチの採用も容易になる。
【０００５】
したがって本発明の最初の局面の特徴は、インビトロ翻訳タンパク質を符号化して選別する方法であり、この方法は、核酸リンカーに付着させたインビトロ翻訳タンパク質を提供する段階、および核酸リンカーを介して同タンパク質を符号化用分子に付着させることによってタンパク質を符号化する段階を含む。
【０００６】
一つの態様において本方法は、符号化タンパク質を固相支持体上に固定化する段階をさらに含む。別の態様においては、候補タンパク質はRNAタンパク質融合分子に由来する。さらに別の態様においては、符号化用分子は核酸または核酸類似体から作られる。この符号化用分子は、好ましくは固有のアドレス指定用要素、リンカーに特異的な整列要素、およびアドレス指定用要素とリンカーに特異的な整列要素とをつなぐ連結要素を含む。さらに、符号化用分子の連結要素には、ポリエチレングリコールのユニット（好ましくはヘキサエチレンオキシド）を含めることができる。さらに別の態様においては、符号化用分子のリンカー特異的整列要素と、候補タンパク質の核酸リンカーまたは候補タンパク質そのものとの間にハイブリッドを形成させることで、候補タンパク質と符号化用分子とを付着させる。
【０００７】
本発明の第2の局面は、インビトロ翻訳タンパク質を符号化する方法であって、インビトロ翻訳タンパク質を提供する段階、およびアドレス指定用要素を含む核酸リンカーをタンパク質に結合させることでタンパク質を符号化する段階を含む方法を特徴とする。
【０００８】
好ましい態様において本方法は、符号化タンパク質を固相支持体上に固定化する段階をさらに含む。別の好ましい態様においては、候補タンパク質はRNAタンパク質融合分子に由来する。
【０００９】
本発明の第3の局面は、インビトロ翻訳タンパク質を符号化する方法であって、インビトロ翻訳タンパク質を提供する段階、およびアドレス指定用要素が核酸リンカーから分枝したタンパク質に核酸リンカーを結合させることでタンパク質を符号化する段階を含む方法を特徴とする。
【００１０】
一つの態様において本方法は、本発明の最終段階で形成した符号化タンパク質を固相支持体上に固定化する段階をさらに含む。別の態様においては、候補タンパク質はRNAタンパク質融合分子に由来する。さらに別の態様においては、連結要素を用いてアドレス指定用要素を核酸リンカーに結合させる。符号化用分子の連結要素には、ポリエチレングリコールのユニットを含めることができる。ポリエチレングリコールのユニットは、好ましくはヘキサエチレンオキシドである。
【００１１】
本発明の上述した各局面のさらに別の態様において、固相支持体はガラスまたはシリカを基材とするチップまたはビーズである。捕捉用プローブは固相支持体に付着させることが可能であり、また同プローブには核酸または核酸類似体を含めることができる。符号化候補タンパク質と核酸捕捉用プローブのハイブリッドを形成させることで、すなわち符号化用分子に含まれる情報にしたがってタンパク質を選別することで、符号化候補タンパク質を固相支持体上に固定化することができる。
【００１２】
本発明のすべての局面のさらなる態様においては、候補タンパク質をレポータータグ、好ましくはフルオロフォアで標識する。アフィニティータグを符号化用分子に付着させることもできる。アフィニティータグの一例はビオチンである。
【００１３】
さらなる態様においては、符号化用分子および固相支持体を、架橋成分で機能化する。架橋成分は、好ましくはソラレン、アジド化合物、または硫黄含有分子である。一つの態様においては、符号化用分子の5'末端を、対象タンパク質の求核性アミノ酸側鎖を位置選択的に架橋する求電子試薬で機能化する。
【００１４】
本発明の第4の局面は、タンパク質と化合物との間の相互作用を検出する方法を特徴とする。この方法は、固相支持体上に固定化した、符号化インビトロ翻訳タンパク質を提供する段階；タンパク質と化合物との相互作用が可能な条件下で、このタンパク質を候補化合物に接触させる段階；およびタンパク質と化合物との間の相互作用を示す化合物が固相支持体に存在するか否かを分析する段階を含む。対象化合物は、核酸、タンパク質、治療用物質、または酵素とすることができる。
【００１５】
本発明の第5の局面は、核酸リンカーに付着し、符号化用分子に結合したインビトロ翻訳タンパク質を特徴とする。
【００１６】
本発明の第6の局面は、符号化核酸リンカー分子に付着したインビトロ翻訳タンパク質を特徴とする。
【００１７】
本発明の第7の局面は、分枝状符号化核酸リンカー分子に付着したインビトロ翻訳タンパク質を特徴とする。
【００１８】
様々な好ましい態様において、捕捉用プローブを有する固相支持体にタンパク質を付着させる。他の態様においては、ハイブリッドの形成や共有結合を介して符号化タンパク質を捕捉用プローブに付着させる。
【００１９】
本明細書で使用する「タンパク質」とは、一つまたは複数のペプチド結合で連結された、任意の2個またはそれ以上の天然型または修飾型のアミノ酸を意味する。「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は同じ意味で用いる。
【００２０】
「符号化用分子（encoding molecule）」とは、タンパク質またはペプチドに付着可能で、タンパク質集団に含まれるタンパク質を認識しやすくする固有のタグを意味する。符号化用分子は、核酸、核酸類似体、または非ヌクレオシドで構成されうるが、翻訳されて対象タンパク質そのものを生じるRNAは含まない。「符号化（encoded）」とは、符号化用分子を付着させることを意味する。
【００２１】
「アドレス指定用要素（addressing element）」とは、任意の集団内における他のそのような要素とは配列を十分異にすることで固有の特性（unique identity）を符号化用分子に付与する符号化用分子の一部分を意味する。アドレス指定用要素の長さは、好ましくは4〜40ヌクレオチド単位である。さらにアドレス指定用要素は、核酸または核酸類似体を含む場合がある。
【００２２】
「リンカーに特異的な整列要素」とは、インビトロ翻訳タンパク質の核酸リンカーとハイブリッドを形成する、またはタンパク質そのものとハイブリッドを形成する、符号化用分子の一部分を意味する。アドレス指定用要素は、核酸または核酸類似体を含む場合がある。
【００２３】
「連結要素（linkage element）」とは、アドレス指定用要素とリンカーに特異的な整列要素を連結する符号化用分子の一部分を意味する。連結要素は、核酸、核酸類似体、および非ヌクレオシドで構成されうる。連結要素は好ましくはポリエチレングリコールのユニットを含み、さらに好ましくは、ポリエチレングリコールのユニットはヘキサエチレンオキシドである。
【００２４】
「選別する」とは、系統だったかたちで位置を定めることを意味し、または同定もしくは分離することを意味する。符号化タンパク質を、固相支持体上に選別することができる。
【００２５】
「固相支持体」とは、任意のチップ（例えばシリカを基材とするチップ、ガラス製チップ、または金製チップ）、ガラス製スライド、メンブレン、ビーズ、固体粒子（例えばアガロース、セファロース、ポリスチレン、または磁性ビーズ）、カラム（またはカラム材料）、試験管、またはマイクロタイターディッシュを含むがこれらに限定されない任意の固相表面を意味する。
【００２６】
「マイクロアレイ」とは、固相表面またはメンブレン上に固定化された対象物の一定のパターンを意味する。通常アレイは、固体表面またはメンブレン上に固定化された捕捉用プローブに結合する符号化タンパク質から作られる。「マイクロアレイ」および「チップ」は同じ意味で用いる。マイクロアレイの密度は、好ましくは10〜1000 対象物/cm2である。
【００２７】
「捕捉用プローブ」とは、集団内の固有の符号化用分子のアドレス指定用要素に依存してハイブリッドを形成するデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの類似体の配列を意味する。捕捉用プローブには、核酸または核酸類似体を含めることができる。
【００２８】
「核酸リンカー」とは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの類似体の配列を意味する。核酸リンカーには、翻訳されて結合対象となるタンパク質を作るRNAを含まない。
【００２９】
「符号化DNAリンカー（encoded DNA linker）」とは、アドレス指定用要素を含むデオキシリボヌクレオチドの配列を意味する。「分枝状符号化DNAリンカー（branched encoded DNA linker）」では、リンカー内部のデオキシリボヌクレオチド成分からアドレス指定用要素が分枝する。符号化DNAリンカーには、核酸類似体を含めることもできる。
【００３０】
「レポータータグ」とは、存在がモニターできる、または検出できる分子を意味する。例えばレポータータグはフルオロフォアとすることができる。
【００３１】
「治療用物質」とは、疾患または疾患の症状の治療、回復、改善、予防、または安定化に使用する分子を意味する。
【００３２】
「RNA」とは、2つまたはそれ以上の共有結合した天然型または修飾型のリボヌクレオチド配列を意味する。この用語に含まれる修飾型RNAの一例には、ホスホロチオエートRNAがある。
【００３３】
「RNAタンパク質融合体」とは、タンパク質と共有結合したRNA分子を意味する。
【００３４】
「機能化する（functionalize）」とは、官能基または官能性成分の付着を可能とするように化学的な修飾を施すことを意味する。例えば符号化用分子を、タンパク質またはペプチドの求核性アミノ酸側鎖を位置特異的に架橋する求電子試薬で機能化することができる。別の例では、固相支持体の符号化用分子または捕捉用プローブを、ソラレン、アジド化合物、または硫黄含有ヌクレオシドなどの架橋成分で機能化することができる。
【００３５】
本発明には利点がいくつかある。例えば本発明により、事前に作製した、核酸または核酸類似体などの一連の汎用性の高い（ユニバーサルな；universal）符号化用分子を使用することが可能となる。これらの符号化用分子は、対応するユニバーサルなマイクロアレイまたは一連の微粒子とともに使用して、新しいタンパク質ディスプレイシステムを構築することができる。事前に作製した符号化用分子のシステムには柔軟性、モジュール形成性、拡張性、および、優れた経済性がある。本発明の別の利点は、酵素反応を介した取り込みまたは重合化には適していないが、いくつかの点で従来のDNAまたはRNAより優れた核酸類似体の使用を選択できることである。本発明のさらなる利点は、リアルタイムにおけるタンパク質のモニターに使用可能な蛍光成分でタンパク質を標識可能なことである。
【００３６】
本発明のさらに別の利点は、符号化して選別した産物が、最終的にタンパク質をコードするRNAを含まないことである。これはいくつかの点で重要である。特に、化学的に安定であり、かつヌクレアーゼに対して耐性をもつDNAは、その扱いが単純である。さらにタンパク質のRNAの長さは、タンパク質のサイズに直接関連し、大きなタンパク質ほどRNAのメッセージは長くなる。このような長いRNA領域は時に、予測困難な安定な2次構造をとる傾向があり、このような2次構造が、ハイブリダイゼーション段階ならびにタンパク質の折りたたみおよび機能と干渉する場合がある。したがって、タンパク質をコードするRNAの非存在下において、タンパク質を符号化して選別する方法が開発されれば、この分野における大きな進歩となる。
【００３７】
本発明の他の性質および利点は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から明瞭になる。
【００３８】
詳細な説明
図面については添付の図面の簡単な説明で簡潔に説明する。
【００３９】
本明細書は、インビトロ翻訳タンパク質の符号化方法および選別方法を開示する。本発明の各方法を実行する手法を、特定の実施例を用いて詳細に説明する。実施例は本発明を説明することを目的として提供するものであって、本発明を制限するものと解釈すべきではない。
【００４０】
実施例 1
符号化用分子を用いたインビトロ翻訳タンパク質の符号化および選別
インビトロ翻訳タンパク質は例えば図1A〜図1Dに示すようを符号化して選別することができる。個々のRNA配列（または複数の配列）をインビトロで翻訳し、RNAタンパク質融合体を、例えばロバーツ（Roberts）およびショステック（Szostak）の方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94： 12297〜12302、1997）およびショステック（Szostak）らの方法（国際公開公報第98/31700号；米国特許出願第09/247,190号）で形成する（両文献は参照として本明細書に組み入れられる）。インビトロ翻訳反応用のRNAは、通常の細胞合成法、組換え法、および化学合成法を含む任意の標準的な方法で作製することができ、かつ、これには、細胞由来のRNA、mRNAライブラリー、およびランダムな合成RNAライブラリーが含まれるがこれらに限定されない。ペプチドアクセプター（例えばピューロマイシン）を、核酸または核酸類似体のリンカーを介してRNAに結合させる。例示的な核酸類似体には例えばPNA（Nielsenら、Science 254：1497〜1500、1991）、P-RNA（Krishnamurthy、Agnew. Chem. 35： 1537、1996）、または3'Nホスホラミデート（GryaznovおよびLetsinger、Nucleic Acids Res. 20： 3403〜3409、1992）がある。これらのペプチドアクセプター分子は、例えばロバーツおよびショステック（前掲）およびショステックら（前掲）の論文に記載された方法を始めとする任意の標準的な方法で作製することができる。
【００４１】
RNAタンパク質融合分子は、好ましくは候補タンパク質のコード配列に機能的に連結された翻訳開始配列および開始コドン、ならびに、当該候補タンパク質のコード配列の3‘末端にペプチドアクセプターを含む、RNA分子を含む。DNA配列またはRNA分解酵素に耐性の核酸類似体の配列は、メッセージの末端とペプチドアクセプターとの間に含まれる。必要に応じ、例えば特定の源に由来する、または任意のタイプのRNA配列の群または集合体は、同じ一般的な方法によって一つの反応混合物中でともに翻訳することができる。
【００４２】
必要に応じ、RNAタンパク質融合体をレポーター基、例えば蛍光レポーター基で標識する。DNAリンカーを組み立てる際に、例えばロバーツおよびショステックの論文（前掲）に記載された一般的な手順を改変して、DNAリンカーの一つまたは複数のヌクレオチドを蛍光性dT（Glen Research、バージニア州、スターリング）と置換することで、蛍光レポーター基をピューロマイシン含有DNAリンカーに組み入れることができる。
【００４３】
次にDNA分解酵素活性がない適切なRNA分解酵素、例えばアンビオン（Ambion）（テキサス州、オースティン）から入手可能なRNA分解酵素Iを融合反応物に添加してRNAタンパク質融合分子のRNA部分を分解する。
【００４４】
次に個々の残りのタンパク質を、以下の手順で符号化する。符号化段階では、個々のタンパク質がそれぞれ固有の符号化用分子をもつように符号化することができる。この方法では、各符号化タンパク質を、選別過程で唯一の捕捉用プローブに対応するように設計することにより、固相支持体上における各タンパク質の正確な「アドレス」を識別することができる。または、複数のタンパク質をプールして、一つまたは複数の符号化用分子で符号化することができる。この方法では、同じ符号化用要素に、一つまたは複数の異なるタンパク質を符号化することができる。また符号化タンパク質を選別する際に、一つ以上の符号化タンパク質を特定の捕捉用プローブに結合させることができる。したがって、固相支持体上の各「アドレス」には、それぞれ同じ符号化用分子を有するタンパク質の混合物を含むことができる。
【００４５】
次に、例えば図2Aおよび図2Bに示した、入力RNAに対してモル比が約1：1の固有の符号化用分子を各ウェルに添加する。個々の固有のタンパク質は、異なる固有の符号化用分子の受け手となり、かつ固有の符号化用分子の特性は既知であることから、タンパク質の特性を決定することができる。図2Aに示すように、固有の符号化用分子はそれぞれ3種類の非常に重要な要素を含む：「リンカーに特異的な整列要素」は、核酸または核酸類似体からなり、ペプチドアクセプターとインビトロ翻訳タンパク質間に位置するDNAリンカーに結合するか、またはタンパク質部分に直接に結合し；「アドレス指定用要素」は、核酸または核酸類似体からなり、固相支持体上の特定の位置、または特定の微粒子に結合し；「連結要素」は、リンカーに特異的な整列要素と固有の符号化用要素を連結する。
【００４６】
単純な固有の符号化用分子は、例えばボーケージ（Beaucage）およびカルサース（Caruthers）（Tetrahedron Letters 22： 1859、1981）に記載の従来の自動固相支持体結合ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド化学法で3'→5'方向に組み立てることができる。例えば図2Bに示す例示的な符号化用分子の合成は、A単量体で、当該ヌクレオシドの3'-ヒドロキシル基において機能化された固相支持体（例えば多孔性球状ガラスビーズ（controlled-pore glass）またはポリスチレン）から始まる。さらに単量体を段階的に結合させて、所望の符号化用配列を構築する。特異的な符号化用配列の設計上の規則は米国特許第5,863,722号に記載されている。符号化用配列を組み立てた後に、4個のヘキサエチレンオキシド単量体ユニット（Glen Research）を添加して、柔軟性のある連結要素を得る。次に、リンカーに特異的な整列要素を添加する。融合体をロバーツおよびショステック（前掲）に記載の標準的な30P DNAリンカーとともに調製する場合は、15量体のポリT整列要素を付加する。他のDNAリンカーを融合体（すなわち30P以外）の調製に使用する場合は、整列要素はDNAリンカー配列の一部の領域の逆相補でなければならない。最後に、必要に応じソラレンホスホラミダイト（Glen Research）、または同等のホスホラミダイト部分を5'末端に付加して第1架橋成分として機能させる。
【００４７】
合成が完了したら、符号化用分子を支持体から切り離し、当技術分野で既知の方法で水酸化アンモニウムを用いて脱保護処理を行う。最終的な精製は、標準的なクロマトグラフィー法または電気泳動法で行う。
【００４８】
単純な固有の符号化用分子に手を加えることで、容易に広範な符号化用分子を得ることができる。例えば上述したように、固有の符号化用分子は、通常はリンカーに特異的な整列要素において、固有の符号化種をインビトロ翻訳タンパク質と恒久的に架橋するために使用する第1架橋成分、例えばソラレンにより機能化することができる。アドレス指定用要素についても、第2架橋成分、例えば4-チオTにより機能化して、固相支持体と固有の符号化用分子との間に共有結合を形成させることができる。またアドレス指定用要素を、符号化タンパク質を単離および濃縮する際に使用するアフィニティータグ、例えばビオチンでさらに標識することができる。アフィニティータグを3'の支持体（Glen Research）として組み入れ、符号化用分子の残りの部分を上述の手順で構築する。一つの特定の態様においては、唯一の符号化用分子の連結要素はポリエチレングリコールユニット、例えばヘキサエチレンオキシドを含む。
【００４９】
固有の符号化用分子を、当技術分野で周知の例えば図1Cに示した標準的なハイブリダイゼーションの条件下で、符号化用分子のリンカーに特異的な整列要素とタンパク質融合体のDNAリンカー間の相互作用を介してタンパク質とハイブリッドを形成させる。次に固有の符号化用分子を、タンパク質のDNAリンカー、またはタンパク質そのもののいずれかに対し、紫外線（通常350 nm）を照射して共有結合で架橋する。符号化用分子をタンパク質のDNAリンカーに共有結合で架橋させる場合は、例えばガスパッロ（Gasparro）らの方法（Nucleic Acids Research、 22：2845〜2852、1994）にしたがって、ソラレンなどの架橋剤を使用することができる。または符号化用分子をタンパク質に共有結合で直接架橋させる場合は、例えばベイレイ（Bayley）の方法（「生化学および分子生物学における光生成試薬（Photogenerated Reagents in Biochemistry and Molecular Biology）」、エルゼビア、ニューヨーク、1983）にしたがって、アジド化合物などの架橋剤を使用することができる。
【００５０】
次に、固有の符号化用分子に架橋させたタンパク質を含む溶液を混合し、例えばビオチン化したタンパク質を、標準的な方法でストレプトアビジンカラムに添加して、標準的なアフィニティー分離法で単離する。符号化用分子に付着するアフィニティータグを用いた他の標準的なアフィニティー分離法を使用することができる。
【００５１】
次に、符号化用タンパク質を含むアフィニティー分離した溶液を、例えば図1Dに示すように固相支持体に添加する。この固相支持体は好ましくは、例えばフルトン（Fulton）らの論文（Clinical Chemistry 43： 1749〜1756、1997）ならびに図3Aおよび図3Bに示されるような、符号化タンパク質と相互作用するように設計した捕捉用プローブを含むユニバーサルなチップまたはユニバーサルな符号化微粒子セットである。捕捉用プローブは好ましくは、符号化用分子の固有の符号化用要素に配列特異的に結合して、タンパク質を固相支持体に連結してタンパク質を選別する核酸または核酸類似体である。固相支持体上の各捕捉用プローブは、各配列が異なる符号化用分子タンパク質複合体と結合する種々のヌクレオチド配列を含むように設計する。第2架橋成分（上述）を介して、捕捉用プローブと符号化用分子とを架橋するために酸化反応で使用可能な分子、例えば4-チオTを含めることもできる。
【００５２】
捕捉用プローブは、例えばクイメリス（Kuimelis）らの方法（米国特許出願第09/282,734号、1999年3月31日出願、および国際公開公報第99/51773号、1999年10月14日発行）を始めとする任意の方法で固相支持体に付着させることができる。捕捉用プローブを固相支持体に付着させる一つの例示的な方法では、100mMの炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.0）中で捕捉用プローブの濃度を500μMに調整し、固相支持体の誘導体化した表面の定めた位置に添加する。微量液体送達システムに接続した3軸モーションコントロール装置を使用して、捕捉用プローブを正確に固着（deposit）させることができる。固着させた捕捉用プローブを含む固相支持体を、水分飽和状態において少なくとも2時間室温でインキュベートする。この付着反応は、ガラス表面を1%アンモニア水に5分間軽く攪拌しながら浸して終了させる。次にガラス表面を対象に5分間の洗浄を3回、各洗浄に新鮮な蒸留水を用いて行う。次にアレイを1 Mのリン酸緩衝食塩水（PBS）に2時間室温で浸した後に蒸留水で再び5分間洗浄する。
【００５３】
「選別した」タンパク質を、例えばカイン（Cain）らの方法（Nucleic Acids Research、23：2153〜2160、1995）により、二重鎖の末端にジスルフィド結合形成を誘発することにより、捕捉用プローブと共有結合で連結することができる。
【００５４】
実施例2
符号化用DNAリンカーを用いたインビトロ翻訳タンパク質の符号化および選別
符号化過程をさらに単純化するために、インビトロ翻訳タンパク質を図4A〜図4Cに示すような符号化DNAリンカーの状態で固有の符号化用分子に直接連結させたRNA分子から作製することもできる。符号化DNAリンカーには、核酸または核酸類似体、および固相支持体上の特定の位置または特定の微粒子に結合する核酸または核酸類似体を含む「アドレス指定用要素」を含めることができる。
【００５５】
単純な符号化DNAリンカー分子を、例えばボーケージ（Beaucage）およびカルサース（Caruthers）の論文（前掲）に記載された、従来の自動化固相支持体結合ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド化学法で3'→5'方向に組み立てることができる。例えば、図5Bに示す例示的な符号化DNAリンカー分子の合成は、ペプチドアクセプター（例えばピューロマイシン）で、当該ヌクレオシドの2’-ヒドロキシル基において機能化された固相支持体（例えば多孔性球状ガラスまたはポリスチレン）から始まる（Glen Research）。次に2個のC単量体を添加する。次に適切な単量体を段階的に添加して所望の符号化用配列を構築する。特定の符号化用配列の設計上の規則は、米国特許第5,863,722号に開示されている。12個のA単量体を段階的に結合させて、DNAリンカーの構築を終了する。符号化DNAリンカー分子の全長は、ロバーツおよびショステックの方法（前掲）で使用される30P DNAリンカーと同じであることが好ましい。合成が完了したら、符号化用分子を支持体から切り離し、通常の手順で水酸化アンモニウムを用いて脱保護処理を行う。最終的な精製は、標準的なクロマトグラフィー法または電気移動法で行う。
【００５６】
必要に応じ、単純な符号化DNAリンカー分子に、アフィニティータグ（例えばビオチン）および/またはフルオロフォア（例えばフルオレセイン）を用いて手を加えることで容易に広範な符号化DNAリンカー分子を得ることができる。アフィニティータグおよびフルオロフォアは、核酸塩基を機能化したT単量体（Glen Research）として符号化用分子のポリA領域中にそれぞれ組み入れられ、図5Bに示す12個のA単量体のうち1個/2個を置換する。符号化用分子の残りの部分は、単純な符号化DNAリンカーについて既に記載した通りに構築する。
【００５７】
5'末端がリン酸化された符号化DNAリンカーを、例えば図4Aに示すようにT4 DNAリガーゼを用いてRNAに連結する。次に、連結産物を、ロバーツおよびショステックの方法（前掲）およびショステックらの方法（前掲）でインビトロで翻訳し、RNAタンパク質融合分子を形成させ、次にこの分子のRNA部分を実施例1で示した方法で、また、図4Bに示したように分解する。このRNA分解過程を経てインビトロ翻訳タンパク質は符号化DNAリンカーに付着する。
【００５８】
符号化したインビトロ翻訳タンパク質は、図4Cに示すように、ユニバーサルなチップまたはビーズセットとハイブリッドを形成させることができる。ハイブリッド形成は、DNAリンカーのアドレス指定用要素と、固相支持体の捕捉用プローブとの間で図1に示すように生じる。
【００５９】
基本的に上述された手法を用いて、TNF-αを結合するポリペプチド、およびIL-13を結合するポリペプチドを、以下のようにインビトロで翻訳し、符号化して選別し、TNF-αおよびIL-13を結合することを示した。
【００６０】
4組の連続した4ヌクレオチドブロックに基づく固有の配列を、符号化ポリペプチドの選別および固定の両方における捕捉点として働くように選択した。使用した捕捉（選別）用配列の一覧を以下に示す（5'→3'方向に記載）：
オリゴヌクレオチドは、従来のホスホラミダイト化学法で、グレンリサーチ社（Glen Research）から入手した試薬を用いて、自動化DNA合成装置（PE BioSystems Expedite 8909）で調製した。合成は、3'末端のアミンが最終脱保護段階まで露出状態とならないように直交的に保護されたアミノ基を有する固相支持体から開始させた。添加する先頭の4個の単量体はヘキサエチレンオキシドのユニット（HEO）とし、それに続けて標準的なA、G、C、およびTの各単量体を添加した。オリゴヌクレオチドを固相支持体から切り離して水酸化アンモニウムで脱保護処理を行い、濃縮して乾燥し、エタノールで沈殿させ、トリエチルアンモニウムアセテート緩衝液中、アセトニトリル勾配を用いた逆相HPLC法で精製した。HPLC法から適切な分画を回収し、真空遠心して蒸発乾固した後、水で共蒸発させた。
【００６２】
精製したアミン標識オリゴヌクレオチドの濃度を、50mMの炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.0）中、500μMに調製した。この選別配列を、アミン反応性ガラス表面（3D-Link、Surmodics）上の定位置に5×5×4のアレイパターンを形成するように、3軸ロボット（MicroGrid、BioRobotics）によりスポットした。4ピンツールを使用して、384ウェルのマイクロタイタープレートから液体を移し、600ミクロンのピッチで200ミクロンのフィーチャー（feature）をもたせた。24フィーチャーのサブグリッドはそれぞれ、一つのオリゴヌクレオチド（すなわち24回の重複スポット）を示す。プリント後のアレイを、水分飽和状態で12〜18時間室温でインキュベートした。この結合反応を、チップを2%の水酸化アンモニウム水溶液に5分間軽く攪拌しながら浸して終了させ、次に蒸留水で洗浄した（5分間を3回）。
【００６３】
次に固有の符号化DNAリンカーを5'末端のdA11トラクトを用いて合成し、4ヌクレオチドブロック群からなる固有の16量体、dC2、および3'末端のピューロマイシンと続けて合成した。これは図5Bの符号化用分子と同様である。符号化用配列は以下の通りであり、上述の捕捉用プローブ配列と接合して作用するように設計した（5'→3'の方向に記載）：
基本的に上述されたとおり自動化DNA合成装置を用いて、従来のホスホラミダイト化学法で符号化DNAリンカーを調製した。すべての試薬はグレンリサーチ社（Glen Research）から入手した。保護されたピューロマイシン成分をもつ固相支持体から合成を開始させた。オリゴヌクレオチドを固相支持体から切り離し、水酸化アンモニウムで脱保護処理を行い、濃縮して乾燥させた後に、エタノールで沈殿させた。純度と完全性は陰イオン交換HPLC法で確認した。
【００６５】
共通のPCRプライマーを使用して、TNF-αおよびIL-13を結合したポリペプチド配列をコードするDNA領域を増幅し、それぞれFnTNFおよびFnIL13と命名した。3'プライマーは付加的な
【００６６】
FnTNFのRNA構築物およびFnIL13のRNA構築物を、5'末端がリン酸化された固有の符号化用配列に酵素を用いて連結した。FnTNF RNAはTAG_LN-8に連結させ、FnIL13はTAG_LN-16に連結させて、RNA-DNAリンカーピューロマイシンキメラ分子：それぞれFnTNF_LN-8およびFnIL13_LN-16を得た。連結は1ナノモルスケールで、等モル量のRNAと5'端がリン酸化された符号化DNAピューロマイシンリンカーとを対象に、100ユニットのT4 DNAリガーゼ（Promega）を用いて、1ナノモルの共通DNAスプリント（splint）
【００６７】
精製後の連結産物のインビトロ翻訳を以下の手順で行った：H2O中、83μLの連結RNA（120pmol）に15μLのマスターミックス（Ambion、メチオニン非含有）、2μLの35S-メチオニン（15μM）および200μLのウサギ網状赤血球溶解物（Ambion）を添加して総量を300μLとした。この反応混合物を30分間30℃でインキュベートした後に、100μLの2M KClおよび20μLの1M MgCl 2 を添加した。さらに60分間室温でインキュベートした後に47μLの0.5M EDTAを添加した。
【００６８】
結果として得られた符号化RNAリンカータンパク質融合体であるFNTNF_LN-8およびFNIL13_LN-16を次にオリゴdTクロマトグラフィーで単離した。等量の2×オリゴdT結合緩衝液（200mM Tris；pH8、2M NaCl、20mM EDTA、および0.1% ツイーン20）を反応系に添加した後に、RNAリンカー融合体を100mgのオリゴdTセルロース（Pharmacia）に結合させ、洗浄用緩衝液（100mM Tris pH8、1M NaCl、0.05% ツイーン20）で洗浄してH2Oで溶出した。RNA-DNAリンカー融合体の定量は、シンチレーション測定で行い、融合体の完全性はPAGE（4〜20%のTris-グリシン）で確認した。
【００６９】
次にFNTNF_LN-8 DNAタンパク質融合体をマイクロアレイ上に選別した。50fmolの融合体を、0.05%のツイーン20を含む5×SSCに調製した（総容量は350μL）。次にこのRNAに2uLのRNA分解酵素A（Ambion）を添加して37℃で15分間かけて切断し、16ヌクレオチドの符号化配列（この場合はタンパク質に融合させたTAG_LN-8）を含む29量体のDNAを残した。全体量を400μLのガスケット装置を用いてマイクロアレイにアプライし、アセンブリーを連続18時間にわたって室温で回転させた。選別後に、攪拌済みの500mLの2.5×SSC、1×SSC、および0.5×SSCを用いて、5分間かけてそれぞれ室温でスライドを連続的に洗浄した。微量の液体を遠心して除去し、スライドを風乾させた。
【００７０】
モレキュラーダイナミクスストームシステム（Molecular Dynamics Storm system）を用いたホスホイメージ（phosphorimage）分析で融合タンパク質上の35Sメチオニンを直接検出し、選別したポリペプチドを可視化した。露出時間は48時間とし、マイクロアレイとホスホストレージスクリーン（phosphor strage screen）とを直接接触させた。ホスホイメージスキャニングを50μmの解像度の設定で行い、イメージクワント（ImageQuant）ソフトウェアのバージョン4.3を用いてデータを抽出した。
【００７１】
選別したポリペプチドが機能することを、標識したTNF-αタンパク質に結合させて明らかにした。組換え型のヒトTNF-α（500μg、PeproTech）を、230μLの1×PBSに溶解し、700mLの攪拌済みの1×PBSでマイクロダイアライザー（Microdialyzer）ユニット（3,500MWCO、Pierce）を用いて4℃で18時間かけて透析した。透析したTNF-αタンパク質を、EZ-LinkのNHS-LC-LCビオチン化試薬（20μg、Pierce）を用いて0℃で2時間かけて処理し、再び700mLの攪拌済みの1×PBSを用いて4℃で18時間かけてマイクロダイアライザーユニット（3,500MWCO、Pierce）で透析した。結果として得られた接合体をMALDI-TOF質量分析計で分析し、それが一つのビオチン部分によりほぼ完全に機能化されていることを確認した。
【００７２】
以下に示す各工程を室温で連続的に回転または混合しながら行った。タンパク質のマイクロアレイ表面を、0.05% ツイーン20および1% BSA（200μL）を含む1×TBSで60分間かけて処理して不動態化した。ビオチン化したTNF-α（1×TBS中に100nM 、0.02% ツイーン20、および0.2% BSA）をマイクロアレイに120分間室温で接触させた。このマイクロアレイを0.05% ツイーン20を含む1×TBSで洗浄した（50mLを3回、各洗浄を5分間）。蛍光標識した2°試薬（2.5μg/mLのCy3標識した抗ビオチンモノクローナル抗体（Sigma）を0.05% ツイーン20および0.2% BSAを含む1×TBS中で調製したもの）をマイクロアレイに60分間接触させた。このマイクロアレイを、0.05% ツイーン20（50mLを2回、各洗浄を5分間）を含む1×TBSで洗浄後に1×TBSで3分間かけて洗浄した。微量の液体は遠心して除去し、室温でスライドを風乾させた。
【００７３】
蛍光レーザースキャニングを、10μMのピクセル解像度でCy3色素の励起および放出波長にプリセットしたGSI Lumonics ScanArray 5000システムで行った。図6Aおよび図6Bはそれぞれ、選別したFNTNF_LN-8を含むマイクロアレイのホスホイメージと蛍光スキャンである。ホスホイメージは、35Sメチオニンシグナルに基づいて選別したポリペプチドの位置を示す。蛍光スキャンは、標識したTNP-aタンパク質の標的が結合した位置を示し、選別したポリペプチドが機能することを証明している。
【００７４】
符号化IL-13バインダーコンストラクトであるFNIL13_LN-16を上述の方法で調製し、上述のように、符号化DNAタンパク質融合体であるFNTIL13_LN-16で選別を行った。選別したポリペプチドは、融合タンパク質上の35Sメチオニンを、上述のホスホイメージ分析で直接検出して可視化した。
【００７５】
選別したポリペプチドが機能することは、標識したIL-13タンパク質に結合することから証明された。組換え型のヒトIL-13（500μg、PeproTcch）を上述の方法でビオチン化した。結果として得られた接合体をMALDI-TOF質量分析計で分析し、それが一つのビオチン部分によりほぼ完全に機能化されていることを確認した。ビオチン化したIL-13タンパク質の結合後に、Cy3で標識した抗ビオチンモノクローナル抗体による検出を上述の方法で行った。
【００７６】
図7Aと図7Bはそれぞれ、選別したFNIL13_LN-16を含むマイクロアレイのホスホイメージと蛍光スキャンである。このホスホイメージは、35Sメチオニンシグナルに基づく、選別したポリペプチドの位置を示す。蛍光スキャンは、標識したIL-13タンパク質標的が結合している位置を示し、選別したポリペプチドが機能することを証明している。
【００７７】
実施例3
分枝状符号化DNAリンカーを用いたインビトロ翻訳タンパク質の符号化および選別
インビトロ翻訳タンパク質を符号化するさらに別の方法を図8A〜図8Cに示す。このアプローチでは、インビトロ翻訳の対象となる所望のタンパク質をコードするRNAを、分枝状符号化DNAリンカーの形状の固有の符号化用分子に連結させる。このDNAリンカーは図9A〜図9Bに示す核酸または核酸類似体を含む。核酸または核酸類似体を含むアドレス指定用要素がDNAリンカーから分枝し、そこにリンカー要素が連結する。
【００７８】
単純な分枝状符号化DNAリンカー分子を、例えばボーケージ（Beaucage）およびカルサース（Caruthers）による前掲の論文に記載の従来の自動化固相支持体結合ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド化学法によって3'→5'の方向に組み立てることができる。例えば図9Bに示す例示的な分枝状符号化DNAリンカー分子の合成は、ペプチドアクセプター（例えばピューロマイシン）で、当該ヌクレオシドの2’-ヒドロキシル基において機能化された固相支持体（例えば多孔性球状ガラスまたはポリスチレン）から始まる（Glen Research）。次に2個のC単量体を付加した後に、18個のA単量体を付加する。次に、差次的に保護された非対称の分枝状単量体（Clontech、カリフォルニア州、パロアルト）を付加してDMT保護基を除去する。次に9個のA単量体を付加する。次に分枝状の単量体上にあるLev保護基を除去し、4個のヘキサエチレンオキシド単量体ユニット（Glen Research）を添加して柔軟性のある連結要素を得る。次に適切な単量体を段階的に添加して所望の符号化配列を構築する。特定の符号化配列の設計上の規則は、米国特許第5,863,722号に開示されている。完成時に分枝状符号化DNAリンカー分子は2か所の5'末端を含む。合成が終了したら、通常の方法で水酸化アンモニウムを用いて符号化用分子を支持体から切り離して脱保護処理を行う。最終的な精製は、標準的なクロマトグラフィー法または電気泳動法で行う。
【００７９】
上述の単純な分枝状符号化DNAリンカー分子に、アフィニティータグ（例えばビオチン）および/またはフルオロフォア（例えばフルオレセイン）を用いて手を加えることで、容易に広範な分枝状符号化DNAリンカー分子を得ることができる。好ましくは、アフィニティータグおよびフルオロフォアはそれぞれ、核酸塩基を機能化したT単量体（Glen Research）として符号化用分子のポリA領域に組み入れられ、27個のA単量体のうち1個または2個を置換する。符号化用分子の残りの部分は、単純な場合について既に述べたように構築される。RNAおよび分枝状DNAリンカーを、例えばT4 DNAリガーゼを用いて連結させる。次に連結産物を、ロバーツおよびショステックの方法（前掲）、およびショステックらの方法（前掲）でインビトロで翻訳し、RNAタンパク質融合分子を形成させ、次にこの分子のRNA部分を実施例1に記述した方法で、または図8Bに示すように分解する。このRNAの分解段階で、インビトロ翻訳タンパク質が分枝状符号化DNAリンカーに付着する。
【００８０】
符号化したインビトロ翻訳タンパク質は、ユニバーサルなチップまたはビーズセットと図8Cに示すようにハイブリッドを形成させることができる。ハイブリッド形成は、分枝状DNAリンカーのアドレス指定用要素と、固相支持体の捕捉用プローブとの間で、実施例1に示すように形成される
【００８１】
他の態様は、特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 符号化して選別したインビトロ翻訳タンパク質の生産にかかわる一つの例示的段階を示す略図である。この段階では、DNAリンカーを介してペプチドアクセプターに付着するRNA分子が、インビトロで翻訳されてRNAタンパク質融合分子を形成する。次に融合分子のRNA部分をRNaseで分解する。融合分子の残りの部分は、DNAリンカーに付着したタンパク質からなる。
【図１Ｂ】 図1Aで説明したRNAの分解後に残る融合分子のタンパク質部分を示す略図である。
【図１Ｃ】 符号化して選別したインビトロ翻訳タンパク質の生産に関与する他の例示的段階を示す略図である。この段階は、符号化タンパク質の作製にかかわる後続の手順を表し、（i）DNAリンカーと「固有の符号化用分子」とのハイブリッドを形成させる段階、（ii）符号化用分子とDNAリンカー分子との共有結合による架橋を誘導する段階、（iii）全符号化タンパク質を一つの溶液中に混合する段階、および（iv）アフィニティーを利用した分離で符号化タンパク質を単離した後に、タンパク質産物を濃縮する段階を含む。以上の段階で得られる最終的な産物は、符号化インビトロ翻訳タンパク質の混合物である。
【図１Ｄ】 符号化して選別したインビトロ翻訳タンパク質の生産に関与するさらなる例示的段階を示す略図である。この別の段階は、（i）図1Cで形成された分子が固有の符号化用分子を介してユニバーサルなチップまたはビーズとのハイブリッドを形成する段階、および（ii）チップまたはビーズと唯一の符号化用要素との間に共有結合による架橋を誘導する段階を含む。この段階はまた、符号化タンパク質を固相支持体の捕捉用プローブに特異的に結合させること、および符号化タンパク質と、符号化タンパク質に対応しない捕捉用プローブとの間には結合がないことを示している。
【図２Ａ】 一般的な意味では図1A〜1Dに示すタンパク質を符号化するために使用する例示的な符号化用分子を示す略図である。この分子は、第1架橋成分を含むリンカー特異的な整列要素に、連結要素を介して付着したアドレス指定用要素を含む。
【図２Ｂ】 図1A〜1Dに示すタンパク質を符号化する際に使用する例示的な符号化用分子を示す略図であり、アフィニティータグがビオチンであり、第2架橋成分が硫黄含有ヌクレオシドであり、囲み中のヌクレオチド配列はアドレス指定用要素を示し、第1架橋成分はソラレンである。アドレス指定用要素は、ヘキサエチレンオキシドの連結要素を介してリンカー特異的な整列要素に連結される。
【図３Ａ】 固相支持体の一例として、タンパク質ディスプレイシステムを作製するために本発明で使用可能なビーズを示す略図である。捕捉用プローブの配列は、実施例2Bの符号化用分子を結合するように設計されている。
【図３Ｂ】 固相支持体の一例として、タンパク質ディスプレイシステムを作製するために本発明で使用可能なチップを示す略図である。チップの指定位置における捕捉用プローブの配列は、実施例2Bの符号化用分子に結合するように設計されている。
【図４Ａ】 符号化DNAリンカーを用いて符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産にかかわる一つの例示的段階を示す略図である。この段階では、RNA分子と、符号化DNAリンカーを連結させる。このリンカーは、符号化タンパク質を固相支持体に結合させる際に使用される符合を有する。
【図４Ｂ】 符号化DNAリンカーを用いて符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産にかかわる他の例示的段階を示す略図である。この段階は、RNAタンパク質融合分子を形成させるために符号化DNAリンカーを介してペプチドアクセプターに付着したRNA分子の翻訳と、それに続くRNA分解酵素による融合分子のRNA部分の分解とを示す。融合分子の残りの部分は、符号化DNAリンカーに付着したタンパク質を含む。
【図４Ｃ】 符号化DNAリンカーを用いて符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産にかかわる最終的な例示的段階を示す略図である。この段階は、図4Bで形成された分子が、符号化DNAリンカーを介して一般的なチップまたはビーズセットとハイブリッドを形成することを示す。
【図５Ａ】 図4A〜4Cに示すタンパク質を符号化する際に使用する例示的な符号化用分子を示す略図であり、一般的にはアドレス指定用要素およびペプチドアクセプター、例えばピューロマイシンを含むDNAリンカーを含む。
【図５Ｂ】 図4A〜4Cに示すように、本発明でタンパク質を符号化する際に使用する符号化用分子の一例を示す略図であり、囲み中のヌクレオチド配列はアドレス指定用要素を示す。
【図６Ａ】 本発明の方法で得られた例示的なマイクロアレイのホスホイメージ（phsophorimage）である。
【図６Ｂ】 本発明の方法で得られた例示的なマイクロアレイの蛍光スキャン画像である。
【図７Ａ】 本発明の方法で得られた例示的なマイクロアレイのホスホイメージである。
【図７Ｂ】 本発明の方法で得られた例示的なマイクロアレイの蛍光スキャン画像である。
【図８Ａ】 分枝状符号化DNAリンカーを用いて、符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産に関与する一つの例示的段階を示す略図である。この段階は、RNA分子の分枝状DNAリンカーとの連結を示す。
【図８Ｂ】 分枝状符号化DNAリンカーを用いて、符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産に関与する他の例示的段階を示す略図である。この段階は、分枝状DNAリンカーを介してペプチドアクセプターに付着させてRNAタンパク質融合分子を作製するRNA分子の翻訳、およびそれに続く、RNA分解酵素による融合分子のRNA部分の分解を含む。融合分子の残りの部分は、分枝状DNAリンカーに付着したタンパク質を含む。この段階の産物は、RNA分解後に残る融合分子のタンパク質部分である。
【図８Ｃ】 分枝状符号化DNAリンカーを用いて、符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産に関与する最終的な例示的段階を示す略図である。この段階では、図8Bで形成された分子が、分枝状DNAリンカーのアドレス指定用要素を介して、一般的なチップまたはビーズセットとハイブリッドを形成する。
【図９Ａ】 一般的には図8A〜8Cに示したタンパク質の符号化に使用する例示的な符号化用分子を示す略図である。
【図９Ｂ】 本発明で使用し、図8A〜8Cに示した符号化用分子の一例を示す略図である。Xはこの分子の分枝点を示し、囲み中のヌクレオチド配列はアドレス指定用要素を示す。アドレス指定用要素は、ヘキサエチレンオキシドの連結要素を介してDNAリンカーに付着する。
Claims (28)
- 以下の段階を含む、インビトロで翻訳されたタンパク質（以下、インビトロ翻訳タンパク質という）を符号化する方法：
（a）核酸リンカーに付着したインビトロ翻訳タンパク質を提供する段階であって、該インビトロ翻訳タンパク質は、インビトロ翻訳で形成されたRNAタンパク質融合分子のRNA部分を分解して得られたRNAタンパク質融合分子に由来することを特徴とする、段階；および
（b）認識タグを核酸リンカーに結合させることで、該タンパク質を符号化する段階。 - 認識タグが以下の要素を含む、請求項1記載の方法：
（a）認識タグに独自のアイデンティティを付与するのに十分な程度に配列が異なる、認識タグの一部（以下、アドレス指定用要素という）；
（b）インビトロ翻訳タンパク質の核酸リンカーまたはインビトロ翻訳タンパク質自体にハイブリダイズする、認識タグの一部（以下、リンカーに特異的な整列要素という）；および
（c）アドレス指定用要素とリンカーに特異的な整列要素とを連結させる、認識タグの一部（以下、連結要素という）であって、該アドレス指定用要素と、該リンカーに特異的な整列要素との間に位置する連結要素。 - 認識タグが核酸または核酸類似体を含む、請求項2記載の方法。
- 連結要素がポリエチレングリコールユニットを含む、請求項2記載の方法。
- ポリエチレングリコールユニットがヘキサエチレンオキシドである、請求項4記載の方法。
- 核酸リンカーとリンカーに特異的な整列要素とのハイブリッド形成を介して、タンパク質を認識タグに結合させる、請求項2記載の方法。
- 以下の段階を含む、インビトロで翻訳されたタンパク質（以下、インビトロ翻訳タンパク質という）を符号化する方法：
（a）インビトロ翻訳タンパク質を提供する段階であって、該インビトロ翻訳タンパク質は、インビトロ翻訳で形成されたRNAタンパク質融合分子のRNA部分を分解して得られたRNAタンパク質融合分子に由来することを特徴とする、段階；および
（b）核酸リンカーを該タンパク質に結合させることで、タンパク質を符号化する段階であって、該核酸リンカーが認識タグを含み、該認識タグの一部は該認識タグに独自のアイデンティティを付与するのに十分な程度に配列が異なる一部（以下、アドレス指定用要素という）である、段階。 - 以下の段階を含む、インビトロで翻訳されたタンパク質（以下、インビトロ翻訳タンパク質という）を符号化する方法：
（a）インビトロ翻訳タンパク質を提供する段階であって、該インビトロ翻訳タンパク質は、インビトロ翻訳で形成されたRNAタンパク質融合分子のRNA部分を分解して得られたRNAタンパク質融合分子に由来することを特徴とする、段階；および
（b）核酸リンカーを該タンパク質に結合させることで、該タンパク質を符号化する段階であって、該核酸リンカーから、認識タグに独自のアイデンティティを付与するのに十分な程度に配列が異なる、認識タグ中の独特な一部（以下、アドレス指定用要素という）が分枝している、段階。 - 連結要素が、該核酸リンカーを該アドレス指定用要素に結合させる、請求項8記載の方法。
- 連結要素がポリエチレングリコールユニットを含む、請求項9記載の方法。
- ポリエチレングリコールユニットがヘキサエチレンオキシドである、請求項10記載の方法。
- 段階（b）で形成されたタンパク質を固相支持体上に固定化する段階をさらに含む、請求項1、7、または8記載の方法。
- 該タンパク質がタンパク質混合物から選択される、請求項12記載の方法。
- 固相支持体がガラスまたはシリカを基材とするチップまたはビーズである、請求項12記載の方法。
- 段階(b)で形成されたタンパク質を、該固相支持体に付着した捕捉用プローブを介して該固相支持体に固定する、請求項12記載の方法。
- 捕捉用プローブが核酸または核酸類似体を含む、請求項15記載の方法。
- 段階(b)で形成されたタンパク質を、捕捉用プローブとハイブリッド形成させることで固相支持体上に固定する、請求項15記載の方法。
- タンパク質がレポータータグで標識される、請求項1、7、または8記載の方法。
- レポータータグがフルオロフォアである、請求項18記載の方法。
- アフィニティータグを認識タグに付着させ、アフィニティータグを用いて符号化タンパク質を単離する段階をさらに含む、請求項1、7、または8記載の方法。
- アフィニティータグがビオチンである、請求項20記載の方法。
- 認識タグを架橋成分で機能化し、かつ該認識タグとタンパク質とを架橋する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 核酸リンカーを架橋成分で機能化し、かつ該核酸リンカーとタンパク質とを架橋させる段階をさらに含む、請求項7または8記載の方法。
- 固相支持体を架橋成分で機能化し、かつ段階(b)で形成されたタンパク質を該タンパク質と固相支持体とを架橋させることにより固相支持体上に固定する、請求項12記載の方法。
- 架橋成分が、ソラレン、アジド化合物、および硫黄含有分子からなる群より選択される、請求項22〜24のいずれか一項記載の方法。
- タンパク質の求核性アミノ酸側鎖を位置特異的に架橋する求電子試薬で、認識タグの5'末端を機能化する、請求項22記載の方法 。
- 以下の段階を含む、タンパク質と化合物間の相互作用を検出する方法：
（a）固相支持体上に固定化した、符号化されたインビトロで翻訳されたタンパク質（以下、符号化インビトロ翻訳タンパク質という）を提供する段階であって、該符号化されたインビトロ翻訳タンパク質は、インビトロ翻訳で形成されたRNAタンパク質融合分子のRNA部分を分解して得られたRNAタンパク質融合分子に由来するインビトロ翻訳タンパク質を認識タグで符号化して得られることを特徴とする、段階；
（b）タンパク質と化合物との間の相互作用を可能とする条件下で、タンパク質を化合物に接触させる段階；および
（c）タンパク質と化合物との間の相互作用を示す指標として、化合物の存在について固相支持体を分析する段階。 - 化合物が核酸、タンパク質、治療用物質、および酵素からなる群より選択される、請求項27記載の方法。
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| DE19959857C1 (de) * | 1999-12-10 | 2001-06-28 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Testsystem zum Nachweis von Analyten sowie ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung |
| PT1423400E (pt) * | 2001-03-19 | 2006-12-29 | Harvard College | Evolução de nova função molecular |
| JP2004537312A (ja) * | 2001-07-31 | 2004-12-16 | フィロス インク． | 核酸−蛋白質融合多量体のモジュラーアッセンブリ |
| WO2003045975A2 (en) * | 2001-11-27 | 2003-06-05 | Compound Therapeutics, Inc. | Solid-phase immobilization of proteins and peptides |
| AU2003263937B2 (en) | 2002-08-19 | 2010-04-01 | The President And Fellows Of Harvard College | Evolving new molecular function |
| WO2004024084A2 (en) * | 2002-09-12 | 2004-03-25 | Massachusetts Institute Of Technology | Rb pahtway and chromatin remodeling genes that antagonize let-60 ras signaling |
| US20050019806A1 (en) * | 2003-06-30 | 2005-01-27 | Horvitz H. Robert | Nucleic acids and polypeptides required for cell survival in the absence of Rb |
| WO2005074417A2 (en) * | 2003-09-03 | 2005-08-18 | Salk Institute For Biological Studies | Multiple antigen detection assays and reagents |
| EP1692313A2 (en) * | 2003-11-20 | 2006-08-23 | Sanofi Pasteur Inc. | Methods for purifying pertussis toxin and peptides useful therefor |
| CA2558303A1 (en) | 2004-03-05 | 2005-09-22 | Medical College Of Ohio | Methods and compositions for assessing nucleic acids and alleles |
| EP1745157A4 (en) | 2004-04-12 | 2008-06-11 | Ohio Med College | METHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING ANALYTES |
| US20050260652A1 (en) * | 2004-04-15 | 2005-11-24 | The General Hospital Corporation | Compositions and methods that modulate RNA interference |
| US7635563B2 (en) * | 2004-06-30 | 2009-12-22 | Massachusetts Institute Of Technology | High throughput methods relating to microRNA expression analysis |
| US20090018029A1 (en) | 2005-11-16 | 2009-01-15 | Ambrx, Inc. | Methods and Compositions Comprising Non-Natural Amino Acids |
| US7749957B2 (en) | 2006-04-06 | 2010-07-06 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Clay-binding peptides and methods of use |
| US7678883B2 (en) | 2007-07-25 | 2010-03-16 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Solubility tags for the expression and purification of bioactive peptides |
| US7951559B2 (en) * | 2007-07-25 | 2011-05-31 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Recombinant peptide production using a cross-linkable solubility tag |
| US7829311B2 (en) | 2007-07-25 | 2010-11-09 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Ketosteroid isomerase inclusion body tag engineered to be acid-resistant by replacing aspartates with glutamate |
| US7794963B2 (en) | 2007-11-02 | 2010-09-14 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Use of tetracysteine tags in fluorescence-activated cell sorting analysis of prokaryotic cells producing peptides or proteins |
| CA2707483A1 (en) | 2007-11-30 | 2009-06-11 | Wolfgang Fraunhofer | Protein formulations and methods of making same |
| US8883146B2 (en) | 2007-11-30 | 2014-11-11 | Abbvie Inc. | Protein formulations and methods of making same |
| ES2566750T3 (es) | 2008-04-16 | 2016-04-15 | The Johns Hopkins University | Método para determinar el riesgo de recidiva de cáncer de próstata |
| WO2010011944A2 (en) | 2008-07-25 | 2010-01-28 | Wagner Richard W | Protein screeing methods |
| US20100158837A1 (en) | 2008-12-18 | 2010-06-24 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Iron oxide-binding peptides |
| US20100158846A1 (en) * | 2008-12-18 | 2010-06-24 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Hair-binding peptides |
| US8287845B2 (en) * | 2008-12-18 | 2012-10-16 | E I Du Pont De Nemours And Company | Hair-binding peptides |
| US20100158822A1 (en) | 2008-12-18 | 2010-06-24 | E .I. Du Pont De Nemours And Company | Peptides that bind to silica-coated particles |
| EP3211126B1 (en) | 2009-02-13 | 2020-10-21 | X-Chem, Inc. | Methods of creating and screening dna-encoded libraries |
| WO2010114638A1 (en) | 2009-03-30 | 2010-10-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Peptide-based tooth whitening reagents |
| JP2012522057A (ja) * | 2009-03-30 | 2012-09-20 | ジヨンソン・アンド・ジヨンソン・コンシユーマー・カンパニーズ・インコーポレーテツド | 化粧用剤の送達のためのペプチドに基づく系 |
| US9989533B2 (en) | 2009-05-28 | 2018-06-05 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Anti-TNF induced apoptosis (ATIA) diagnostic markers and therapies |
| CA2789125A1 (en) | 2010-02-10 | 2011-08-18 | Novartis Ag | Methods and compounds for muscle growth |
| EP2655413B1 (en) * | 2010-12-23 | 2019-01-16 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery |
| DE102010056289A1 (de) | 2010-12-24 | 2012-06-28 | Geneart Ag | Verfahren zur Herstellung von Leseraster-korrekten Fragment-Bibliotheken |
| AU2012217717B2 (en) | 2011-02-15 | 2017-03-02 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods for diagnosing ovarian cancer |
| EP2686349B1 (en) | 2011-03-15 | 2020-12-09 | X-Body, Inc. | Antibody screening methods |
| CN103732738A (zh) | 2011-04-28 | 2014-04-16 | 小利兰斯坦福大学托管委员会 | 与样品相关的多核苷酸的鉴定 |
| AU2012304387B2 (en) | 2011-09-07 | 2017-03-16 | X-Chem, Inc. | Methods for tagging DNA-encoded libraries |
| CN107353342B (zh) | 2011-12-05 | 2021-08-10 | X 博迪生物科学公司 | PDGF受体β结合多肽 |
| EA201992285A1 (ru) | 2012-07-13 | 2020-05-31 | Икс-Чем, Инк. | Днк-кодированные библиотеки, содержащие связи кодирующих олигонуклеотидов, не доступные для считывания полимеразами |
| EP2948775B1 (en) | 2013-01-23 | 2018-10-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Compositions and methods for detecting neoplasia |
| SG11201507093WA (en) | 2013-03-14 | 2015-10-29 | Univ Maryland Baltimore Office Of Technology Transfer | Androgen receptor down-regulating agents and uses thereof |
| US20140327460A1 (en) * | 2013-05-03 | 2014-11-06 | Second Sight Medical Products, Inc. | Test Apparatus and Method for Determining Long Term Reliability of an Implantable Device |
| US20160109455A1 (en) | 2013-05-10 | 2016-04-21 | Vermillion, Inc. | Compositions for ovarian cancer assessment having improved specificty |
| EP3014271B1 (en) | 2013-06-28 | 2020-03-18 | X-Body, Inc. | Target antigen discovery, phenotypic screens and use thereof for identification of target cell specific target epitopes |
| CA2924879C (en) | 2013-09-23 | 2023-01-10 | X-Body, Inc. | Methods and compositions for generation of binding agents against cell surface antigens |
| EP3146081B1 (en) | 2014-05-19 | 2020-10-28 | The Johns Hopkins University | Methods for identifying androgen receptor splice variants in subjects having castration resistant prostate cancer |
| EP3186393A4 (en) | 2014-08-25 | 2018-01-10 | The Johns Hopkins University | Methods and compositions related to prostate cancer therapeutics |
| JP6478392B2 (ja) * | 2014-12-26 | 2019-03-06 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 核酸リンカー |
| EP3386594B1 (en) | 2015-12-11 | 2023-05-03 | The General Hospital Corporation | Combination of a platelet-derived growth factor receptor alpha inhibitor and a histone lysine demethylase inhibitor for treating drug-tolerant glioblastoma |
| EA202090427A1 (ru) | 2017-08-16 | 2020-06-08 | МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи | Композиции и способы лечения атопического дерматита и выбора лечения |
| WO2020132074A1 (en) | 2018-12-18 | 2020-06-25 | The University Of Memphis Research Foundation | Compositions and methods for the detection and molecular profiling of membrane bound vesicles |
| WO2022197933A1 (en) | 2021-03-18 | 2022-09-22 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for characterizing lymphoma and related conditions |
| WO2023122723A1 (en) | 2021-12-23 | 2023-06-29 | The Broad Institute, Inc. | Panels and methods for diagnosing and treating lung cancer |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0627109A (ja) * | 1992-03-05 | 1994-02-04 | Sanyo Chem Ind Ltd | 免疫測定法及び免疫測定用試薬キット |
| WO1998031700A1 (en) * | 1997-01-21 | 1998-07-23 | The General Hospital Corporation | Selection of proteins using rna-protein fusions |
| JPH10253632A (ja) * | 1997-03-10 | 1998-09-25 | Nissui Pharm Co Ltd | 分析方法、キット及び装置 |
| US6537749B2 (en) * | 1998-04-03 | 2003-03-25 | Phylos, Inc. | Addressable protein arrays |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5639603A (en) | 1991-09-18 | 1997-06-17 | Affymax Technologies N.V. | Synthesizing and screening molecular diversity |
| GB2284208A (en) * | 1993-11-25 | 1995-05-31 | Pna Diagnostics As | Nucleic acid analogues with a chelating functionality for metal ions |
| US5695934A (en) * | 1994-10-13 | 1997-12-09 | Lynx Therapeutics, Inc. | Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides |
| US6261804B1 (en) * | 1997-01-21 | 2001-07-17 | The General Hospital Corporation | Selection of proteins using RNA-protein fusions |
| EP1073730A1 (en) * | 1998-04-17 | 2001-02-07 | Whitehead For Biomedical Research | Use of a ribozyme to join nucleic acids and peptides |
| US5965352A (en) * | 1998-05-08 | 1999-10-12 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods for identifying pathways of drug action |
| AU757955B2 (en) * | 1998-08-17 | 2003-03-13 | Bristol-Myers Squibb Company | Identification of compound-protein interactions using libraries of protein-nucleic acid fusion molecules |
| AU779653B2 (en) * | 1999-08-27 | 2005-02-03 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for encoding and sorting in vitro translated proteins |
-
2000
- 2000-08-25 AU AU69387/00A patent/AU779653B2/en not_active Expired
- 2000-08-25 EP EP00957818.8A patent/EP1212452B1/en not_active Expired - Lifetime
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- 2000-08-25 WO PCT/US2000/023414 patent/WO2001016352A1/en active IP Right Grant
- 2000-08-25 JP JP2001520897A patent/JP4803933B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-08-13 US US10/217,914 patent/US7892785B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0627109A (ja) * | 1992-03-05 | 1994-02-04 | Sanyo Chem Ind Ltd | 免疫測定法及び免疫測定用試薬キット |
| WO1998031700A1 (en) * | 1997-01-21 | 1998-07-23 | The General Hospital Corporation | Selection of proteins using rna-protein fusions |
| JPH10253632A (ja) * | 1997-03-10 | 1998-09-25 | Nissui Pharm Co Ltd | 分析方法、キット及び装置 |
| US6537749B2 (en) * | 1998-04-03 | 2003-03-25 | Phylos, Inc. | Addressable protein arrays |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2001016352A1 (en) | 2001-03-08 |
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