PT1423400E

PT1423400E - Evolução de nova função molecular

Info

Publication number: PT1423400E
Application number: PT02753671T
Authority: PT
Inventors: David R Liu; Zev J Gartner; Mattew W Kanan
Original assignee: Harvard College
Priority date: 2001-03-19
Filing date: 2002-03-19
Publication date: 2006-12-29
Also published as: JP4128453B2; DK1423400T3; AU2002306777B2; DE60213826D1; US20050281819A9; DE60213826T3; EP1832567A2; IL206586A; WO2002074929A3; ES2271306T5; IL158000A0; JP2004536162A; IL206585A0; US7070928B2; AU2008200027A1; EP2332896A2; US20050227281A1; US20120165228A1; IL206586A0; CA2441820C

Description

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DESCRIÇÃO "Evolução de nova função molecular"

Informação Sobre Prioridade O presente pedido de patente reivindica prioridade de acordo com 35 U.S.C. §119(e) dos pedidos de patente U.S. provisórios 60/277081, apresentado em 19 de Março, 2001, intitulado "Nucleic Acid Directed Synthesis of Chemical Compounds", 60/277094, apresentado em 19 de Março, 2001, intitulado "Approaches to Generating New Molecular Function"; e 60/306691, apresentado em 20 de Julho, 2001, intitulado "Approaches to Generating New Molecular Function", e a totalidade dos conteúdos de cada um destes pedidos é aqui incorporada por referência.

Antecedentes da Invenção A "abordagem química" clássica à geração de moléculas com novas funções tem sido utilizada extensamente ao longo do ultimo século em aplicações que vão desde a identificação de drogas à metodologia sintética da ciência de materiais. Nesta abordagem (Fig. 1, negro), os investigadores sintetizam ou isolam moléculas candidatas, ensaiam estes candidatos quanto a propriedades desejadas, determinam as estruturas de compostos activos, se desconhecidas, formulam relações entre estrutura e actividade com base no ensaio e nos dados estruturais, e depois sintetizam uma nova geração de moléculas desenhadas para possuir propriedades melhoradas. Embora os métodos de química combinatória (veja-se, por exemplo, A.V. Eliseev e J.M. Lehn. Combinatorial Chemistry In Biology 1999, 243, 159-172; K.W. Kuntz, M.L. Snapper e A.H. Hoveyda. Current Opinion in Chemical Biology 1999, 3, 313-319; D.R. Liu e P.G. Schultz. Angew. Chem. Intl. Ed. Eng. 1999, 38, 36) tenham aumentado o rendimento desta abordagem, as suas limitações fundamentais permanecem inalteradas. Vários factores limitam a eficácia da abordagem química à geração de função molecular. Primeiro, a nossa capacidade para prever com exactidão as alterações estruturais que conduzirão a uma nova função é frequentemente inadequada devido a subtis rearranjos conformacionais de moléculas, interacções imprevistas com solventes, ou requisitos estereoquímcos de ligação ou eventos de reacção desconhecidos. A resultante complexidade de relações estrutura-actividade limita frequentemente o sucesso do 2 ΕΡ 1 423 400 /PT desenho racional de ligandos ou catalisadores, incluindo os esforços conduzidos num modo de alto rendimento. Em segundo lugar, a necessidade de ensaiar ou rastrear, em vez de seleccionar, cada membro de uma colecção de candidatos limita o número de moléculas que podem ser rastreadas em cada experiência. Finalmente, a falta de um modo de amplificar moléculas sintéticas coloca requisitos na quantidade mínima de material que tem que ser produzido para caracterização, rastreio e elucidação da estrutura. Em resultado, pode ser difícil gerar bibliotecas de mais do que aproximadamente 106 diferentes compostos sintéticos.

Em contraste, a Natureza gera proteínas com novas funções utilizando um método fundamentalmente diferente que supera muitas destas limitações. Nesta abordagem (Fig. 1, cinzento), uma proteína com as propriedades desejadas induz a sobrevivência e a amplificação da informação que codifica essa proteína. Esta informação é diversificada através de mutação espontânea e recombinação de ADN, e depois é traduzida numa nova geração de proteínas candidatas utilizando o ribossoma. O poder deste processo é bem notado (veja-se, F. Arnold Acc. Chem. Res. 1998, 31, 125; F.H. Arnold et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 54-59; J. Minshull et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 284-90) e é evidenciado pelo facto de proteínas e ácidos nucleicos dominarem as soluções de muitos problemas químicos complexos apesar da sua limitada funcionalidade química. Claramente, ao contrário da abordagem química linear atrás descrita, os passos utilizados pela Natureza formam um ciclo de evolução molecular. As proteínas que emergem deste processo foram directamente seleccionadas, em vez de simplesmente rastreadas, quanto às actividades desejadas. Como a informação que codifica proteínas em evolução (ADN) pode ser amplificada, uma única molécula de proteína com a actividade desejada pode, em teoria, conduzir à sobrevivência e à propagação do ADN que codifica a sua estrutura. As muito pequenas quantidades de material necessárias para participar num ciclo de evolução molecular permitem gerar e seleccionar quanto a uma função desejada bibliotecas muito maiores em diversidade do que as sintetizadas por abordagens químicas, em pequenos volumes. 3

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Reconhecendo o poder e a eficiência da abordagem da Natureza, os investigadores utilizaram a evolução molecular para gerar muitas proteínas e ácidos nucleicos com novas propriedades de ligação ou catalíticas (veja-se, por exemplo, J. Minshull et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 284-90; C. Schmidt-Dannert et al. Trends Biotechnol. 1999, 17, 135-6; D. S. Wilson et al. Annu. Rev. Biochem. 1999, 68, 611-47). As proteínas e ácidos nucleicos evoluídos pelos investigadores demonstraram ter valor como ferramentas de pesquisa, diagnóstico, como reagentes industriais e terapêuticos e expandiram grandemente o nosso entendimento das interacções moleculares que dotam as proteínas e ácidos nucleicos de propriedades de ligação ou catalíticas (veja-se, M. Famulok et al. Curr. Opln. Chem. Biol. 1998, 2, 320-7).

Apesar da eficiente abordagem da Natureza para gerar a função, a evolução molecular da Natureza está limitada a dois tipos de moléculas "naturais" - proteínas e ácidos nucleicos -porque até agora a informação no ADN pode apenas ser traduzida em proteínas ou noutros ácidos nucleicos. Contudo, muitas moléculas sintéticas de interesse não representam em geral estruturas principais de ácido nucleico, e a utilização de síntese modelada por ADN para traduzir sequências de ADN em moléculas pequenas sintéticas seria amplamente útil apenas se moléculas sintéticas, outras que não ácidos nucleicos e análogos de ácido nucleico, pudessem ser sintetizadas de uma maneira modelada por ADN. Uma abordagem ideal para gerar moléculas funcionais reuniria os aspectos mais poderosos de evolução molecular com a flexibilidade da química sintética. Claramente, permitir a evolução de moléculas pequenas e polímeros sintéticos não naturais, de modo similar ao que a natureza evolui biomoléculas, conduziria a métodos muito mais eficazes de identificação de novos ligandos, receptores e catalisadores sintéticos difíceis ou impossíveis de gerar utilizando o desenho racional.

Sumário da Invenção O reconhecimento da necessidade de ser capaz de amplificar e evoluir classes de moléculas para além de ácidos nucleicos e proteínas conduziu à presente invenção que proporciona métodos e composições para a síntese dirigida por moldes, amplificação e evolução de moléculas. Em geral, estes 4 ΕΡ 1 423 400 /PT métodos utilizam um molde evoluivel para dirigir a sintese de um composto químico ou uma biblioteca de compostos químicos (i.e., o molde na realidade codifica a síntese de um composto químico). Com base numa biblioteca codificada e sintetizada utilizando um molde tal como um ácido nucleico, são proporcionados métodos para amplificação, evolução e rastreio da biblioteca. Em certas concretizações de interesse especial, os compostos químicos são compostos que não são, ou não se assemelham a, ácidos nucleicos ou seus análogos. Em certas concretizações, os compostos químicos destas bibliotecas combinatórias codificadas por moldes são polímeros e mais preferivelmente são polímeros não naturais (i.e., excluindo péptidos naturais, proteínas e polinucleótidos). Noutras concretizações, os compostos químicos são moléculas pequenas.

Em certas concretizações, o método de síntese de um composto ou de uma biblioteca de compostos compreende, primeiro, proporcionar um ou mais moldes de ácido nucleico, em que um ou mais moldes de ácido nucleico opcionalmente possuem uma unidade reactiva associada. O molde de ácido nucleico é então colocado em contacto com uma ou mais unidades de transferência desenhadas para ter uma primeira porção, um anti-codão, que híbrida com uma sequência de ácido nucleico, e está associada a uma segunda porção, uma unidade reactiva, que inclui um bloco de construção do composto a sintetizar. Uma vez que estas unidades de transferência tenham hibridado com o molde de ácido nucleico de uma maneira específica da sequência, a síntese do composto químico pode ocorrer devido à interacção de porções reactivas presentes nas unidades de transferência e/ou no molde de ácido nucleico. Significativamente, a sequência do ácido nucleico pode mais tarde ser determinada para descodificar a história sintética do composto ligado e assim a sua estrutura. Notar-se-á que o método aqui descrito pode ser utilizado para sintetizar uma molécula de cada vez ou pode ser utilizado para sintetizar milhares a milhões de compostos utilizando métodos combinatórios.

Notar-se-á que bibliotecas sintetizadas desta maneira (i.e., tendo sido codificadas por um ácido nucleico) têm a vantagem de ser amplificáveis e evoluíveis. Uma vez identificada uma molécula, o seu molde de ácido nucleico para 5 ΕΡ 1 423 400 /PT além de actuar como um marcador utilizado para identificar o composto ligado, pode também ser amplificado utilizando técnicas de ADN Standard tais como a reacção em cadeia com polimerase (PCR). O ácido nucleico amplificado pode então ser utilizado para sintetizar mais do composto desejado. Em certas concretizações, durante o passo de amplificação são introduzidas mutações no ácido nucleico de modo a gerar uma população de compostos químicos que estão relacionados com o composto progenitor mas estão modificados num ou mais locais. Os ácidos nucleicos mutados podem então ser utilizados para sintetizar uma nova biblioteca de compostos relacionados. Desta maneira, a biblioteca a rastrear pode ser evoluída para conter mais compostos com a actividade desejada ou para conter compostos com um maior grau de actividade.

Os métodos da presente invenção podem ser utilizados para sintetizar uma ampla variedade de compostos químicos. Em certas concretizações, os métodos são utilizados para sintetizar e evoluir polímeros não naturais (i.e., excluindo polinucleótidos e péptidos), que não podem ser amplificados e evoluídos utilizando técnicas Standard correntemente disponíveis. Em certas outras concretizações, os métodos e composições da invenção são utilizados para a síntese de moléculas pequenas que não são tipicamente poliméricas. Em ainda outras concretizações, o método é utilizado para gerar polímeros de ácido nucleico não naturais. A presente invenção proporciona também a transferência de moléculas (e.g., moldes de ácido nucleico e/ou unidades de transferência) úteis na prática dos métodos da invenção. Estas moléculas de transferência tipicamente incluem uma porção capaz de hibridar com uma sequência de ácido nucleico e uma segunda porção com monómeros, outros blocos de construção, ou reagentes, a incorporar no composto final que está a ser sintetizado. Notar-se-á que as duas porções da molécula de transferência estão preferivelmente associadas uma com a outra directamente ou através de uma porção ligante. Notar-se-á também que a unidade reactiva e o anti-codão podem estar presentes na mesma molécula (e.g., um nucleótido não natural possuindo uma funcionalidade incorporada). 6

ΕΡ 1 423 400 /PT A presente invenção também proporciona kits e composições úteis na prática dos métodos da invenção. Estes kits podem incluir moldes de ácido nucleico, moléculas de transferência, monómeros, solventes, tampões, enzimas, reagentes para PCR, nucleótidos, esqueletos de molécula pequena, etc. O kit pode ser utilizado na síntese de um tipo particular de polímero não natural ou molécula pequena.

Definições O termo anticorpo refere-se a uma imunoglobulina, quer natural quer totalmente ou parcialmente sintética. Todos os seus derivados que mantêm capacidade de ligação específica estão também incluídos no termo. O termo também cobre qualquer proteína possuindo um domínio de ligação que é homólogo ou largamente homólogo a um domínio de ligação de imunoglobulina. Estas proteínas podem ser derivadas de fontes naturais, ou parcial ou totalmente sintéticas. Um anticorpo pode ser monoclonal ou policlonal. O anticorpo pode ser um membro de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo qualquer das classes humanas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Os derivados da classe da IgG, contudo, são preferidos na presente invenção. A expressão, associado a/com, utiliza-se para descrever a interacção entre dois ou mais grupos, porções, compostos, monómeros, etc. Quando duas ou mais entidades estão "associadas" umas com as outras como aqui se descreve, estão ligadas através de uma interacção directa ou indirecta, covalente ou não covalente. Preferivelmente, a associação é covalente. A associação covalente pode ser através de uma ligação amida, éster, carbono-carbono, dissulfureto, carbamato, éter ou carbonato. A associação covalente pode também incluir uma porção ligante tal como um ligante fotoclivável. As interacções não covalentes desejáveis incluem ligação de hidrogénio, interacções de van der Waals, interacções hidrófobas, interacções magnéticas, interacções electrostáticas, etc. Também, duas ou mais entidades ou agentes podem estar "associadas" umas às outras estando presentes juntas na mesma composição.

Uma macromolécula biológica é um polinucleótido (e.g., ARN, ADN, híbrido ARN/ADN), uma proteína, um péptido, um lípido, um produto natural ou um polissacárido. A 7 ΕΡ 1 423 400 /PT macromolécula biológica pode ser de ocorrência natural ou não ocorrer naturalmente. Numa concretização preferida, uma macromolécula biológica tem um peso molecular superior a 500 g/mol.

Polinucleótido, ácido nucleico ou oligonucleótido referem-se a um polímero de nucleótidos. O polímero pode incluir nucleósidos naturais (i.e., adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina e desoxicitidina), análogos de nucleósidos (e.g., 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-iodouridina, C5-propiniluridina, C5-propinilcitidina, C5-metilcitidina, 7- desaza-adenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8- oxoguanosina, O(6)-metilguanina e 2-tiocitidina), bases quimicamente modificadas, bases biologicamente modificadas (e.g., bases metiladas), bases intercaladas, açúcares modificados (e.g., 2'-fluororribose, ribose, 2'-desoxirribose, arabinose e hexose), ou grupos fosfato modificados (e.g., ligações fosforotioato e 5'-N-fosforamidito).

Uma proteína compreende um polímero de resíduos de aminoácido ligados mutuamente por ligações peptídicas. O termo, como aqui se utiliza, refere-se a proteínas, polipéptidos e péptidos de qualquer dimensão, estrutura ou função. Tipicamente, uma proteína terá pelo menos três aminoácidos de comprimento. Uma proteína pode referir-se a uma proteína individual ou a uma colecção de proteínas. Uma proteína pode referir-se a uma proteína de comprimento completo ou a um fragmento de uma proteína. As proteínas da invenção preferivelmente contêm apenas aminoácidos naturais, embora possam ser alternativamente empregues aminoácidos não naturais (i.e., compostos que não ocorrem na natureza mas que podem ser incorporados numa cadeia polipeptídica; veja-se, por exemplo, http://www.cco.caltech.edu/~dadgrp/Unnatstruct.gif, que apresenta estruturas de aminoácidos não naturais que foram incorporados com sucesso em canais iónicos funcionais) e/ou análogos de aminoácidos como são conhecidos na especialidade. Também, um ou mais dos aminoácidos numa proteína da invenção podem ser modificados, por exemplo, pela adição de uma entidade química tal como um grupo hidrato de carbono, um 8 ΕΡ 1 423 400 /PT grupo hidroxilo, um grupo fosfato, um grupo farnesilo, um grupo isofarnesilo, um grupo ácido gordo, um ligante para conjugação, funcionalização ou outra modificação, etc. Uma proteína pode também ser uma molécula simples ou pode ser um complexo plurimolecular. Uma proteína pode ser apenas um fragmento de uma proteína ou péptido de ocorrência natural. Uma proteína pode ser de ocorrência natural, recombinante ou sintética, ou qualquer combinação destas. A expressão molécula pequena, como aqui se utiliza, refere-se a um composto orgânico não peptídico, não oligomérico, quer sintetizado no laboratório quer encontrado na natureza. As moléculas pequenas, como aqui se utiliza, podem-se referir a compostos que são "semelhantes a produtos naturais", contudo, a expressão "molécula pequena" não se limita a compostos "semelhantes a produtos naturais". Pelo contrário, uma molécula pequena é tipicamente caracterizada por possuir uma ou mais das seguintes características incluindo possuir várias ligações carbono-carbono, possuir múltiplos centros estereoquímicos, possuir múltiplos grupos funcionais, possuir pelo menos dois tipos diferentes de grupos funcionais, e possuir um peso molecular inferior a 1500, embora esta caracterização não se pretenda limitante para os fins da presente invenção. A expressão esqueleto de molécula pequena, como aqui se utiliza, refere-se a um composto químico possuindo pelo menos um local para funcionalização. Numa concretização preferida, o esqueleto de molécula pequena pode possuir uma pluralidade de locais para funcionalização. Estes locais de funcionalização podem ser protegidos ou mascarados como será notado por um perito na especialidade. Os locais podem-se encontrar também numa estrutura ou esqueleto de anel subjacente. A expressão unidade de transferência, como aqui se utiliza, refere-se a uma molécula compreendendo uma porção anti-codão associada a uma unidade reactiva, incluindo, mas não se lhes limitando, um bloco de construção, um monómero, uma unidade monomérica ou um reagente, utilizada na síntese das moléculas codificadas por ácido nucleico. 9

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Descrição das Figuras A Figura 1 representa a abordagem da Natureza (cinzento) e a abordagem química clássica (negro) para gerar uma função molecular. A Figura 2 representa certas reacções modeladas por ADN para ácidos nucleicos e seus análogos. A Figura 3 representa o método geral para a síntese de um polímero utilizando síntese modelada por ácido nucleico. A Figura 4 mostra um conjunto quadrupleto e tripleto de codão sem desvio de enquadramento. Cada conjunto proporciona nove codões possíveis. A Figura 5 mostra métodos de rastreio de uma biblioteca para catalisadores de clivagem de ligação e de formação de ligação. Estes métodos tiram vantagem da afinidade natural da estreptavidina pela biotina. A Figura 6A representa a síntese dirigida por moldes de ADN em "gancho de cabelo" (H - haipin) e em "final-de-hélice" (E - end-of-helix) . As reacções foram analisadas por PAGE desnaturante após os tempos de reacção indicados. As pistas 3 e 4 continham moldes extintos com excesso de β-mercaptoetanol antes da reacção. A Figura 6B representa reagentes emparelhados (M matched) ou mal emparelhados (X - mismatched) ligados a tióis (S) ou a aminas primárias (N) . Misturaram-se com 1 equiv. de molde funcionalizado com a variedade de electrófilos mostrada. As reacções com reagentes de tiol foram conduzidas a pH 7,5 sob as seguintes condições: SIAB e SBAP: 37°C, 16 h; SIA: 25 °C, 16 h, SMCC, GMBS, BMPS, SVSB: 25°C, 10 min. As reacções com reagentes de amina foram conduzidas a 25°C, pH 8,5 durante 75 minutos. A Figura 7 representa (a) moldes H ligados a um grupo a-iodoacetamida que reagiram com reagentes de tiol contendo 0, 1 ou 3 erros de emparelhamento a 25°C. (b) As reacções em (a) foram repetidas à temperatura indicada durante 16 h. Tm 10 ΕΡ 1 423 400 /PT calculada do reagente: 38°C (emparelhado), 28°C (um único erro de emparelhamento). A Figura 8 representa uma reacção realizada utilizando um molde E de 41 bases e um reagente de 10 bases desenhado para hibridar a 1-30 bases da extremidades 5' do molde. Os perfis cinéticos no gráfico mostram a média de dois ensaios (desvios <10%). O reagente "η = 1 mis" contém três erros de emparelhamento. A Figura 9 representa a reacção repetida n = 10 na Figura 8 em que as nove bases após 5'-NH2-dT foram substituídas pelos análogos de esqueleto mostrados. Cinco equivalentes de um oligonucleótido de ADN complementar às bases intervenientes foram adicionados à reacção "ADN + grampo". Os reagentes estavam emparelhados (0) ou continham três erros de emparelhamento (3). O gel mostra reacções a 25°C após 25 min. A Figura 10 representa as reacções de n = 1, n = 10 e n = 1 (mis) descritas na Figura 8 que foram repetidas com concentrações de molde e reagente de 12,5, 25, 62,5 ou 125 nM. A Figura 11 representa um modelo de tradução, selecção e amplificação de moléculas sintéticas que se ligam a estreptavidina de uma biblioteca codificada por ADN. A Figura 12 representa (a) Pistas 1 e 5: PCT: biblioteca amplificada entes da selecção por ligação a estreptavidina. Pistas 2 e 6: biblioteca amplificada por PCR após selecção. Pistas 3 e 7: molde de codificação de biotina autêntico amplificado por PCR. Pista 4: "escada" de 20 bp. As pistas 5-7 foram digeridas com Tsp45I. Os traços de sequenciação de ADN dos moldes amplificados antes e após a selecção estão também mostrados, juntamente com as sequências dos moldes de codificação de biotina e de não codificação de biotina. (b) Esquema geral para a criação e evolução de bibliotecas de moléculas não naturais utilizando síntese modelada por ADN, onde -Ri representa a biblioteca de funcionalidade de produto transferida da biblioteca 1 de reagentes e -RiB representa um produto seleccionado. 11

ΕΡ 1 423 400 /PT A Figura 13 representa reacções modeladas por ADN exemplificativas. Para todas as reacções sob as condições especificadas, os rendimentos de produto das reacções com sequências de molde e de reagente emparelhadas foram superiores a 20 vezes mais do que os das reacções de controlo com sequências de reagentes desordenadas. As reacções foram conduzidas a 25°C com um equivalente de cada molde e reagente a 60 nM de concentração final a menos que especificado de outro modo. Condições: a) NaBH3CN 3 mM, tampão MES 0,1 M, pH 6,0, NaCl 0,5 M, 1,5 h; b) tampão TAPS 0,1 M, pH 8,5, NaCl 300 mM, 12 h; c) tampão TAPS 0,1 M, pH 8,0, NaCl 1 M, 5°C, 1,5 h; d) tampão MOPS 50 mM, pH 7,5, NaCl 2,8 M, 22 h; e) 120 nM 19, Na2PdCl4 1,4 mM, tampão NaOAc 0,5 M, pH 5,0, 18 h; f) Pré-mistura de Na3PdCl4 com dois equivalentes de P(p-S03C6H4)3 em água 15 min., depois adiciona-se aos reagentes em tampão NaOAc 0,5 M, pH 5,0, NaCl 75 mM, 2 h ([Pd] final = 0,3 mM, [19] = 120 nM). A geometria olefinica dos produtos de 13 e as regioquimicas de produtos da cicloadição de 14 e 16 estão presumidas mas não verificadas. A Figura 14 representa a análise por electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante de reacções modelada por ADN representativas enumeradas nas Figuras 13 e 15. As estruturas de reagentes e moldes correspondem à numeração nas Figuras 13 e 15. Pistas 1, 3, 5, 7, 9, 11: reacção de reagentes e moldes emparelhados (complementares) sob as condições enumeradas nas Figuras 13 e 15 (a reacção de 4 e 6 foi mediada por DMT-MM) . Pistas 2, 4, 6, 8, 10, 12: reacção de reagentes e moldes mas emparelhados (não complementares) sob condições idênticas às das pistas 1, 3, 5, 7, 9 e 11, respectivamente. A Figura 15 representa a formação de ligações amida modelada por ADN mediada por EDC e sulfo-NHS ou por DMT-MM para uma variedade de ácidos carboxilicos e aminas substituídos. Em cada linha, os rendimentos de reacções mediadas por DMT-MM entre reagentes e moldes complementares em sequência estão seguidos pelos rendimentos de reacções mediadas por EDC e sulfo-NHS. Condições: molde 60 nM, reagente 120 nM, DMT-MM 50 mM em tampão MOPS 0,1 M, pH 7,0, NaCl 1 M, 16 h, 25°C; ou molde 60 nM, reagente 120 nM, EDC 20 mM, sulfo-NHS 15 mM, tampão MES 0,1 M, pH 6,0, NaCl 1 M, 16 h, 25°C. Em todos os casos, reacções de controlo com sequências de 12 ΕΡ 1 423 400 /PT reagentes mal emparelhados renderam pouco ou nenhum produto detectável. A Figura 16 representa (a) Modelo conceptual para síntese modelada por ADN independente da distância. À medida que a distância entre os grupos reactivos de um reagente e molde hibridados (n) aumenta, a velocidade de formação de ligações presume-se que diminui. Para os valores de n em que a velocidade de formação de ligações é significativamente superior à velocidade de hibridação molde-reagente, a velocidade de formação de produto permanece constante. Neste regime, a reacção modelada por ADN apresenta independência relativamente à distância. (b) Electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante de uma olefinação de Wittig modelada por ADN entre 11 e 13 complementares com zero bases (pistas 1-3) ou dez bases (pistas 4-6) a separar os reagentes hibridados. Embora as constantes de velocidade de segunda ordem aparentes para as reacções n = 0 e n = 10 difiram em três vezes (kap (n = 0) = 9,9 x 103 M_1s_1 enquanto kap (n = 10) = 3,5 x 103 M-1s-1) , os rendimentos de produto após 13 h para ambas as distâncias são quase quantitativos. As reacções de controlo contendo erros de emparelhamento de sequência não renderam produto detectável (não mostrado). A Figura 17 representa certas reacções de construção de complexidade modeladas por ADN exemplificativas. A Figura 18 representa certos ligantes exemplificativos para utilização no método da invenção. A Figura 19 representa certos ligantes exemplificativos adicionais para utilização no método da invenção. A Figura 20 representa um ligante tioéster exemplificativo para utilização no método da invenção. A Figura 21 representa reacções de formação de ligações amida modeladas por ADN em que os reagentes e os moldes são complexados com catiões dimetildidodecilamónio. 13

ΕΡ 1 423 400 /PT A Figura 22 representa a montagem de unidades de transferência juntamente com o molde de ácido nucleico e polimerização das porções de nucleótidos anti-codão. A Figura 23 representa a polimerização das unidades dicarbamato juntamente com o molde de ácido nucleico para formar um policarbamato. Para iniciar a polimerização o monómero de "partida" que termina num o-nitrobenzilcarbamato é fotodesprotegido para revelar a amina primária que inicia a polimerização de carbamato. A polimerização prossegue então no sentido 5' para 3' juntamente com o esqueleto de ADN, com cada ataque nucleófilo resultando no subsequente desmascarar de um novo nucleófilo de amina. O ataque do monómero de "paragem" liberta uma acetamida em vez de uma amina, terminando desse modo a polimerização. A Figura 24 representa a clivagem do policarbamato do esqueleto de nucleótidos. A dessililação do ligante éter enólico que se liga à porção anti-codão da unidade monomérica e a eliminação de fosfato conduzida pela resultante libertação de fenol proporciona o policarbamato ligado covalentemente no seu terminal carboxi ao seu ADN de codificação de cadeia simples. A Figura 25 representa componentes de uma biblioteca de ácidos nucleicos de péptidos funcionalizados, amplificável e evoluivel. A Figura 26 representa reagentes de teste utilizados para optimizar reagentes e condições para acoplamento de PNA modelado por ADN. A Figura 27 representa um conjunto simples de monómeros de PNA derivados de blocos de construção comercialmente disponíveis úteis para a evolução de um sensor de Ni2+ fluorescente à base de PNA. A Figura 28 representa dois esquemas para a selecção de um PNA funcionalizado terminado com biotina capaz de catalisar uma reacção aldólica ou retroaldólica. 14

ΕΡ 1 423 400 /PT A Figura 29 representa a síntese dirigida por moldes de ADN de uma biblioteca combinatória de moléculas pequenas. A Figura 30 mostra esquematicamente como esqueletos de molécula pequena ligados a ADN podem ser funcionalizados de modo específico da sequência por reacção com reagentes sintéticos ligados a oligonucleótidos de ácido nucleico complementares; este processo pode ser repetido para completar as transformações sintéticas que conduzem a uma molécula completamente funcionalizada. A Figura 31 mostra a funcionalização de um esqueleto de molécula pequena de cefalosporina com vários reagentes. A Figura 32 representa uma maneira de medir a velocidade da reacção entre um nucleófilo fixo e um electrófilo hibridados a várias distâncias ao longo de um molde de ácido nucleico para definir uma janela de reacção essencial em que pode ocorrer a síntese modelada por ácido nucleico de estruturas não poliméricas. A Figura 33 representa três estratégias de ligantes para a síntese modelada por ADN. Na estratégia do ligante autoclivante, a ligação que liga o produto ao oligonucleótido reagente é clivada como uma consequência natural da reacção. Nas estratégias de ligante "sem resíduo" (scarless) e "com resíduo útil" (use fui scar), esta ligação é clivada após a reacção modelada por ADN. As reacções representadas foram analisadas por electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (adiante). As pistas 1-3 foram visualizadas utilizando luz UV sem coloração do ADN; as pistas 4-10 foram visualizadas por coloração com brometo de etídio seguida de transiluminação UV. Condições: 1 a 3: um equivalente de cada, de reagente e molde, tampão TAPS 0,1 M, pH 8,5, NaCl 1 M, 25°C, 1,5 h; 4 a 6: três equivalentes de 4, tampão MES 0,1 M, pH 7,0, NaNCú 1 M, AgN03 10 mM, 37°C, 8 h; 8 a 9: tampão CAPS 0,1 M, pH 11,8, BME 60 mM, 37°C, 2 h; 11 a 12: NaI04 aquoso 50 mM, 25 °C, 2 h. Ri = NH (CH2) 2NH-dansilo; R2 = biotina. A Figura 34 representa estratégias para a purificação de produtos de síntese modelada por ADN. Utilizando oligonucleótidos reagentes biotinilados, os produtos que 15 ΕΡ 1 423 400 /PT surgem de um ligante autoclivante são parcialmente purificados por lavagem da mistura reaccional em bruto com contas ligadas a avidina (topo). Os produtos gerados de reacções modeladas por ADN utilizando os ligantes "sem resíduo" ou "com resíduo útil" podem ser purificados utilizando oligonucleótidos reagentes biotinilados, capturando os produtos de reacção em bruto com contas ligadas a avidina, e eluindo os produtos desejados por indução da clivagem do ligante (fundo). A Figura 35 representa a geração de um conjunto de moldes inicial para uma síntese de biblioteca exemplificativa. A Figura 36 representa a síntese modelada por ADN de uma biblioteca de péptidos não naturais. A Figura 37 representa um aminoácido ligante de ADN reagente a 5'. A Figura 38 representa a síntese modelada por ADN de uma biblioteca bicíclica orientada de diversidade evoluível. A Figura 39 representa a síntese de tripéptidos em múltiplos passos, modelada por ADN. Cada formação de amida modelada por ADN utilizou reagentes contendo o ligante sulfona descritos no texto. Condições: passo 1: activar dois equivalentes de 13 em EDC 20 mM, sulfo-NHS 15 mM, tampão MES 0,1 M, pH 5,5, NaCl 1 M, 10 min, 25°C, depois adicionar a molde em MOPS 0,1 M, pH 7,5, NaCl 1M, 25°C, 1 h; passos 2 e 3: dois equivalentes de reagente, DMT-MM 50 mM, tampão MOPS 0,1 M, pH 7,0, NaCl 1 M, 6 h, 25°C. O produto desejado após cada passo foi purificado por captura em contas ligadas a avidina e eluição com tampão CAPS 0,1 M, pH 11,8, BME 60 mM, 37°C, 2 h. A progressão de cada reacção e purificação foi seguida por electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (fundo). Pistas 3, 6 e 9: reacções de controlo utilizando reagentes contendo sequências de oligonucleótidos desordenadas. A Figura 40 representa a síntese em múltiplos passos não peptídica modelada por ADN. Os ligantes reagentes utilizados nos passos 1, 2 e 3 foram o ligante diol, ligante de Wittig autoclivante e ligante sulfona, respectivamente; veja-se a 16

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Figura 1 para as condições de clivagem do ligante. Condições: 17 a 18: activar dois equivalentes de 17 em EDC 20 mM, sulfo-NHS 15 mM, tampão MES 0,1 M, pH 5,5, NaCl 1 M, 10 min, 25°C, depois adicionar ao molde em MOPS 0,1 M, pH 7,5, NaCl 1M, 16°C, 8 h; 19 a 21: três equivalentes de 20, TAPS 0,1 M, pH 9,0, NaCl 3 M, 48 h, 25°C; 22 a 23: três equivalentes de 22, TAPS 0,1 M, pH 8,5, NaCl 1 M, 21 h, 25°C. A progressão de cada reacção e purificação foi seguida por electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (fundo). Pistas 3, 6 e 9: reacções de controlo utilizando reagentes contendo sequências de oligonucleótidos desordenadas. A Figura 41 representa a utilização de ácidos nucleicos para dirigir a síntese de novos polímeros e plásticos ligando o ácido nucleico ao ligando de um catalisador de polimerização. O ácido nucleico pode-se dobrar numa estrutura complexa que pode afectar a selectividade e a actividade do catalisador. A Figura 42 representa a utilização de catálise da polimerização de metatese de abertura do anel de Grubbs na evolução de plásticos. É mostrado o esquema sintético de um ligando di-hidroimidazole ligado a ADN assim como o monómero a utilizar na reacção de polimerização. A Figura 43 representa a evolução de plásticos através de ciclos iterativos de diversificação, selecção e amplificação de ligandos para criar polímeros com propriedades desejadas. A Figura 44 representa um esquema exemplificativo para a síntese, selecção in vitro e amplificação de uma biblioteca de compostos. A Figura 45 representa moldes exemplificativos para utilização em recombinação. A Figura 46 representa vários exemplos de desoxirribonucleótidos e ribonucleótidos com modificações em grupos que não participam nas ligações de hidrogénio de Watson-Crick e que se sabe serem inseridos com elevada fidelidade de sequência em oposição a moldes de ADN naturais. 17

ΕΡ 1 423 400 /PT A Figura 47 representa análogos de 7-desaza-adenosina e uridina, de ligação a metais, exemplificativos. A Figura 48 representa a síntese do análogo (7). A Figura 49 representa a síntese do análogo (30). A Figura 50 representa a síntese de desoxiadenosina-trifosfatos modificados em 8. A Figura 51 representa os resultados de um ensaio que avalia a aceitação de nucleótidos modificados por ADN-polimerases. A Figura 52 representa a síntese de derivados de 7-desaza-adenosina. A Figura 53 representa certos nucleótido-trifosfatos exemplificativos. A Figura 54 representa um método geral para a criação de bibliotecas de polímeros que se ligam a metais. A Figuras 55 e 56 representa esquemas exemplificativos para as selecções in vitro de catalisadores poliméricos não naturais. A Figura 57 representa um esquema exemplificativo para a selecção in vitro de catalisadores de reacções de Heck, reacções de hetero-Diels-Alder e adições aldólicas.

Descrição de Certas Concretizações da Invenção

Como atrás discutido, seria desejável ser-se capaz de evoluir e amplificar compostos químicos incluindo, mas não se lhes limitando, moléculas pequenas e polímeros, da mesma maneira que biopolímeros, como polinucleótidos e proteínas, podem ser amplificados e evoluídos. Demonstrou-se que a síntese modelada por ADN proporciona um meio possível de tradução da informação numa sequência de ADN numa molécula pequena sintética. Em geral, moldes de ADN ligados a um reagente podem ser capazes de recrutar um segundo grupo reactivo ligado a uma molécula de ADN complementar para 18 ΕΡ 1 423 400 /PT originar um produto. Como a hibridação de ADN é específica da sequência, o resultado de uma reacção modelada por ADN é a tradução de uma sequência de ADN específica num correspondente produto de reacção. Como mostrado na Figura 2, demonstrou-se a capacidade de moldes de ácido nucleico de cadeia simples para catalisar a oligomerização específica da sequência de oligonucleótidos complementares (T. Inoue et al. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 7666; T. Inou et al. J. Mol. Biol. 1984, 178, 669-76). Esta verificação foi cedo seguida por verificações de que moldes de ADN ou ARN podiam catalisar a oligomerização de mono-, di-, tri- ou oligonucleót idos de ADN ou ARN complementares (T. Inoue et al. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 7666; L. E. Orgel et al. Acc. Chem. Res. 1995, 28, 109-118; H. Rembold et al. J. Mol. Evol. 1994, 38, 205; L. Rodriguez et al. J. Mol. Evol. 1991, 33, 477; C.B. Chen et al. J. Mol. Biol. 1985, 181, 271). Desde aí demonstrou-se que os moldes de ADN ou ARN aceleram a formação de uma variedade de análogos de ácido nucleico não naturais, incluindo ácidos nucleicos de péptidos (C. Bohler et al. Nature 1995, 376, 578), ácidos nucleicos contendo fosforotioato (M.K. Herrlein et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 10151-10152), fosforo-selenato (Y. Xu et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 9040-9041; Y. Xu et al. Nat. Biotechnol. 2001, 19, 148-152) e fosforamidato (A. Luther et al. Nature 1998, 396, 245-8), ácidos nucleicos sem ribose (M. Bolli et al. Chem. Biol. 1997, 4, 309-20), e análogos de ADN em que uma ligação fosfato foi substituída por um grupo aminoetilo (Y. Gat et al. Biopolymers 1998, 48, 19-28). Os moldes de ácido nucleico podem também catalisar a acilação de aminas entre análogos de nucleótidos (R.K. Bruick et al. Chem. Biol. 1996, 3, 49-56).

Contudo, embora se tenha demonstrado a capacidade de moldes de ácido nucleico para acelerar a formação de uma variedade de análogos de ácido nucleico não naturais, quase todas estas reacções que previamente se mostrou serem catalisadas por moldes de ácido nucleico foram desenhadas para prosseguir através de estados de transição que se assemelham estreitamente com a estrutura do esqueleto de ácido nucleico natural (Fig. 2), tipicamente produzindo produtos que conservam o mesmo esqueleto de seis ligações entre as unidades de nucleótido. A motivação por trás deste desenho foi presumivelmente o pressuposto de que o aumento de velocidade 19 ΕΡ 1 423 400 /PT proporcionado por moldes de ácido nucleico depende de um alinhamento preciso de grupos reactivos, e a precisão deste alinhamento é maximizada quando os reagentes e produtos imitam a estrutura dos esqueletos de ADN e ARN. As evidências que suportam a hipótese de que a síntese modelada por ADN pode apenas gerar produtos que se assemelham ao esqueleto de ácido nucleico advém da bem conhecida dificuldade de macrociclização na síntese orgânica (G. Illuminati et al. Acc. Chem. Res. 1981, 14, 95-102; R.B. Woodward et al. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 3210-3213). Sabe-se que o aumento de velocidade de reacções de fecho de anel intramolecular comparada com as suas contrapartidas intermoleculares diminui rapidamente à medida que ligações com possibilidade de rotação são adicionadas entre grupos reactivos, de modo que reagentes de ligação com um ligante flexível de 14 carbonos dificilmente produzem qualquer aceleração da velocidade (G. Illuminati et al. Acc. Chem. Res. 1981, 14, 95-102).

Como as moléculas sintéticas de interesse não se assemelham em geral a esqueletos de ácido nucleico, a utilização de síntese modelada por ADN para traduzir sequências de ADN em moléculas pequenas sintéticas seria muito útil apenas se moléculas sintéticas outras que não ácidos nucleicos e análogos de ácido nucleico pudessem ser sintetizadas de uma maneira modelada por ADN. A capacidade da síntese modelada por ADN para traduzir sequências de ADN em moléculas pequenas arbitrárias não naturais requer portanto a demonstração de que a síntese modelada por ADN é um fenómeno muito mais geral do que foi previamente descrito.

De forma significativa, foi aqui demonstrado pela primeira vez que a síntese modelada por ADN é de facto um fenómeno geral e pode ser utilizada para uma variedade de reacções e condições para gerar uma gama diversa de compostos, especificamente incluindo pela primeira vez, compostos que não são, ou não se assemelham a, ácidos nucleicos ou seus análogos. Mais especificamente, a presente invenção estende-se à capacidade de amplificar e evoluir bibliotecas de compostos químicos para além de biopolímeros naturais. A capacidade para sintetizar compostos químicos de estrutura arbitrária permite aos investigadores escrever os seus próprios códigos genéticos incorporando uma ampla gama de funcionalidade química em novas 20 ΕΡ 1 423 400 /PT estruturas principais e de cadeia lateral, que permitem o desenvolvimento de novos catalisadores, drogas e polímeros, para nomear alguns exemplos. Por exemplo, a capacidade para amplificar directamente e evoluir estas moléculas por selecção genética permite a identificação de famílias inteiramente novas de catalisadores artificiais que possuem actividade, biodisponibilidade, estabilidade térmica ou aos solventes, ou outras propriedades físicas (tais como fluorescência, marcação de spin ou f otodisponibilidade) que são difíceis ou impossíveis de conseguir utilizando o conjunto limitado de blocos de construção de ácidos nucleicos e proteínas naturais. Similarmente, o desenvolvimento de métodos para amplificar e evoluir directamente moléculas pequenas sintéticas por ciclos iterados de mutação e selecção permite o isolamento de novos ligandos ou drogas com propriedades superiores aos isolados por desenho racional tradicional ou métodos de descoberta de drogas por pesquisa combinatória. Adicionalmente, estendendo as abordagens aqui descritas a polímeros de significado em ciência de materiais permitiria a evolução de novos plásticos.

Em geral, o método da invenção envolve 1) proporcionar um ou mais moldes de ácido nucleico, em que estes um ou mais moldes de ácido nucleico opcionalmente têm uma unidade reactiva associada; e 2) colocar em contacto o um ou mais moldes de ácido nucleico com uma ou mais unidades de transferência desenhadas para possuir uma primeira porção, um anti-codão que híbrida com uma sequência do ácido nucleico, e está associada a uma segunda porção, uma unidade reactiva, que inclui funcionalidade específica, um bloco de construção, reagente, etc. para o composto a sintetizar. Será notado que em certas concretizações da invenção, a unidade de transferência compreende uma porção incorporando a capacidade de hibridação da unidade anti-codão e a funcionalidade química da unidade de reacção. Uma vez que as unidades de transferência tenham hibridado com o molde de ácido nucleico de uma maneira específica da sequência, a síntese do composto químico pode ocorrer devido à interacção de unidades reactivas presentes nas unidades de transferência e/ou no molde de ácido nucleico. Significativamente, a sequência do ácido nucleico pode mais tarde ser determinada para descodificar a história sintética do composto ligado e assim a sua estrutura. Será notado que o método aqui descrito pode ser utilizado para 21 ΕΡ 1 423 400 /PT sintetizar uma molécula de cada vez ou pode ser utilizado para sintetizar milhares a milhões de compostos utilizando métodos combinatórios.

Será notado que podem ser preparados e evoluídos uma variedade de compostos químicos de acordo com o método da invenção. Em certas concretizações da invenção, contudo, os métodos são utilizados para a síntese de compostos químicos que não são, ou não se assemelham a, ácidos nucleicos ou análogos de ácido nucleico. Por exemplo, em certas concretizações da invenção, compostos de molécula pequena podem ser sintetizados proporcionando um molde que possui uma unidade reactiva (e.g., bloco de construção ou esqueleto de molécula pequena) associada (ligada directamente ou através de um ligante como descrito com mais detalhes nos Exemplos 5), e colocando o molde em contacto simultânea ou sequencialmente com uma ou mais unidades de transferência possuindo uma ou mais unidades reactivas associadas. Em certas outras concretizações, podem-se sintetizar polímeros não naturais proporcionando um molde e colocando o molde em contacto simultaneamente com uma ou mais unidades de transferência possuindo uma ou mais unidades reactivas associadas sob condições adequadas para efectuar a reacção das unidades reactivas adjacentes em cada uma das unidades de transferência (veja-se, por exemplo, Figura 3 e Exemplos 5 e 9, como descrito com mais detalhes adiante).

Certas concretizações são discutidas com mais detalhes adiante; contudo, notar-se-á que a presente invenção não se pretende limitada às concretizações discutidas adiante. Pelo contrário, a presente invenção pretende abranger essas concretizações e seus equivalentes.

Moldes

Como discutido atrás, utilizam-se um ou mais moldes de ácido nucleico no método da invenção e hibridam-se com as unidades de transferência para dirigir a síntese do composto químico. Como será notado por um perito na especialidade, qualquer molde de ácido nucleico pode ser utilizado nos métodos e composições da presente invenção. Os moldes que podem ser mutados e desse modo evoluídos, podem ser utilizados para guiar a síntese de outro composto químico ou biblioteca 22 ΕΡ 1 423 400 /PT de compostos químicos como descrito na presente invenção. Como aqui se descreve com mais detalhes, o molde evoluível codifica a síntese de um composto químico e pode ser utilizado mais tarde para descodificar a história sintética do composto químico, para indirectamente amplificar o composto químico, e/ou para evoluir (i.e., diversificar, seleccionar e amplificar) o composto químico.

Os moldes de ácido nucleico utilizados na presente invenção são feitos de ADN, ARN, um híbrido de ADN e ARN, ou um derivado de ADN e ARN, e podem ser se cadeia simples ou dupla. A sequência do molde é utilizada no método da invenção para codificar a síntese de um composto químico, preferivelmente um composto que não é, ou não se assemelha a, um ácido nucleico ou análogo de ácido nucleico (e.g., um polímero não natural ou uma molécula pequena) . No caso de certos polímeros não naturais, o molde de ácido nucleico é utilizado para alinhar as unidades monoméricas na sequência em que surgirão no polímero e para os levar a estreita proximidade com unidades monoméricas adjacentes ao longo do molde de modo que irão reagir e unir-se por ligação covalente. No caso de uma molécula pequena, o molde é utilizado para levar reagentes particulares à proximidade do esqueleto de molécula pequena de modo a que possam modificar o esqueleto de uma maneira particular. Em certas outras concretizações, o molde pode ser utilizado para gerar polímeros não naturais por amplificação por PCR de uma biblioteca de moldes de ADN sintéticos consistindo numa região aleatória de nucleótidos, como descrito no Exemplo 9.

Como será notado por um perito na especialidade, a sequência do molde pode ser desenhada de várias maneiras sem ultrapassar o âmbito da presente invenção. Por exemplo, o comprimento do codão tem que ser determinado e as sequências de codão têm que ser estabelecidas. Quando se utiliza um comprimento de codão de dois, então, utilizando as quatro bases de ocorrência natural é apenas possível utilizar 16 combinações na codificação da biblioteca. Se o comprimento do codão for aumentado para três (o número que a Natureza utiliza na codificação de proteínas), o número de combinações possíveis aumenta para 64. Outros factores a considerar na determinação do comprimento do codão são erros de 23 ΕΡ 1 423 400 /PT emparelhamento, desvios de enquadramento, complexidade da biblioteca, etc. À medida que o comprimento do codão é aumentado até uma determinada extensão, o número de erros de emparelhamento diminui; contudo, codões excessivamente longos hibridarão apesar de pares de bases mal emparelhados. Em certas concretizações de interesse especial, o comprimento do codão varia entre 2 e 10 bases.

Outro problema associado à utilização de um molde de ácido nucleico é o desvio de enquadramento. Na Natureza, o problema do desvio de enquadramento na tradução de uma proteína a partir de um ARNm é evitado por utilização da complexa maquinaria do ribossoma. Os métodos da invenção, contudo, não têm a vantagem desta maquinaria complexa. Em vez disso, o desvio de enquadramento pode ser remediado aumentando o comprimento de cada codão de modo a que a hibridação de um codão fora do enquadramento garanta um erro de emparelhamento. Por exemplo, cada codão pode começar com uma G, e as subsequentes posições podem ser restringidas a T, C e A (Figura 4). Noutro exemplo, cada codão pode começar e terminar com uma G, e as posições subsequentes podem ser restringidas a T, C e A. Outra maneira de evitar o desvio de enquadramento é ter os codões suficientemente compridos para que a sequência do codão se encontre apenas no interior da sequência do molde "em enquadramento". Sequências espaçadoras podem também ser colocadas entre os codões para evitar o desvio de enquadramento.

Notar-se-á que o molde pode variar grandemente em número de bases. Por exemplo, em certas concretizações, o molde pode ter 10 a 10 000 bases de comprimento, preferivelmente entre 10 e 1 000 bases de comprimento. O comprimento do molde dependerá evidentemente do comprimento dos codões, da complexidade da biblioteca, do comprimento do polímero não natural a sintetizar, da complexidade da molécula pequena a sintetizar, da utilização de sequências espaçadoras, etc. A sequência de ácido nucleico pode ser preparada utilizando qualquer método conhecido na especialidade para preparar sequências de ácido nucleico. Estes métodos incluem métodos in vivo e in vitro incluindo PCR, preparação de plasmídeos, digestão com endonucleases, síntese em fase sólida, transcrição in vitro, separação de cadeias, etc. Em certas concretizações, o molde 24 ΕΡ 1 423 400 /PT de ácido nucleico é sintetizado utilizando um sintetizador automático de ADN.

Como discutido atrás, em certas concretizações da invenção, o método é utilizado para sintetizar compostos químicos que não são, ou não se assemelham a, ácidos nucleicos ou análogos de ácido nucleico. Embora se tenha demonstrado que a síntese modelada por ADN pode ser utilizada para dirigir a síntese de ácidos nucleicos e seus análogos, não foi anteriormente demonstrado que o fenómeno de síntese modelada por ADN é suficientemente geral para se estender a outros compostos químicos mais complexos (e.g., moléculas pequenas, polímeros não naturais). Como aqui descrito com detalhes, demonstrou-se que a síntese modelada por ADN é de facto um fenómeno mais geral e que podem ser utilizadas uma variedade de reacções.

Assim, em certas concretizações da presente invenção, o molde de ácido nucleico compreende sequências de bases que codificam a síntese de um polímero não natural ou de uma molécula pequena. A mensagem codificada no molde de ácido nucleico começa preferivelmente com um codão específico que coloca no lugar um local quimicamente reactivo a partir do qual pode ocorrer a polimerização, ou no caso da síntese de uma molécula pequena o codão de "iniciação" pode codificar para um anti-codão associado a um esqueleto de molécula pequena ou um primeiro reagente. O codão de "iniciação" da presente invenção é análogo ao codão de "iniciação", ATG, encontrado na Natureza, que codifica para o aminoácido metionina. Apenas para dar um exemplo para utilização na síntese de uma biblioteca de polímeros não naturais, o codão de iniciação pode codificar para uma unidade monomérica de iniciação compreendendo uma amina primária mascarada por um grupo protector fotolábil, como mostrado adiante no Exemplo 5A.

Em ainda outras concretizações da invenção, o molde de ácido nucleico pode ele próprio ser modificado para incluir um local de iniciação para a síntese de polímeros (e.g., um nucleófilo) ou um esqueleto de molécula pequena. Em certas concretizações, o molde de ácido nucleico inclui uma ansa em "gancho de cabelo" numa das suas extremidades, terminando num 25

ΕΡ 1 423 400 /PT grupo reactivo utilizado para iniciar a polimerização das unidades monoméricas. Por exemplo, um molde de ADN pode compreender uma ansa em "gancho de cabelo" terminando num grupo 5' -amino, que pode estar ou não protegido. A partir do grupo amino, pode começar a polimerização do polímero não natural. O grupo amino reactivo pode também ser utilizado para ligar um esqueleto de molécula pequena no molde de ácido nucleico de modo a sintetizar uma biblioteca de moléculas pequenas.

Para terminar a síntese do polímero não natural deve ser incluído um codão de "paragem" no molde de ácido nucleico preferivelmente no fim da sequência de codificação. O codão de "paragem" da presente invenção é análogo aos codões de "paragem" (i.e., TAA, TAG, TGA) encontrados em transcritos de ARNm. Na Natureza, estes codões conduzem à terminação da síntese da proteína. Em certas concretizações, é escolhido um codão de "paragem" que é compatível com o código genético artificial utilizado para codificar o polímero não natural. Por exemplo, o codão de "paragem" não deve ter conflitos com nenhuns outros codões utilizados para codificar a síntese, e deve ter o mesmo formato geral que os outros codões utilizados no molde. O codão de "paragem" pode codificar para uma unidade monomérica que termina a polimerização mas não proporcionando um grupo reactivo para outra ligação. Por exemplo, uma unidade monomérica de paragem pode conter um grupo reactivo bloqueado tal como uma acetamida em vez de uma amina primária como mostrado no Exemplo 5A adiante. Em ainda outras concretizações, a unidade monomérica de paragem compreende um terminal biotinilado que proporciona uma maneira conveniente de terminar o passo de polimerização e a purificação do polímero resultante.

Unidades de transferência

Como descrito atrás, no método da invenção, são também proporcionadas unidades de transferência que compreendem um anti-codão e uma unidade reactiva. Notar-se-á que os anti-codões utilizados na presente invenção são desenhados para serem complementares dos codões presentes no molde de ácido nucleico, e deverão ser desenhados com o molde de ácido nucleico e os codões utilizados em mente. Por exemplo, as sequências utilizadas no molde, assim como o comprimento dos 26 ΕΡ 1 423 400 /PT codões, deverão ser tidos em conta no desenho dos anti-codões. Qualquer molécula que é complementar a um codão utilizado no molde pode ser utilizada nos métodos da invenção (e.g., nucleótidos ou nucleótidos não naturais). Em certas concretizações, os codões compreendem uma ou mais bases encontradas na Natureza (i.e., timidina, uracilo, guanidina, citosina, adenina). Em certas outras concretizações, o anti-codão compreende um ou mais nucleótidos normalmente encontrados na Natureza com uma base, um açúcar, e um grupo fosfato opcional. Em ainda outras concretizações, as bases são estendidas ao longo de uma estrutura principal que não é a estrutura principal de açúcar-fosfato normalmente encontrado na Natureza (e.g., nucleótidos não naturais).

Como discutido atrás, o anti-codão é associado a um tipo particular de unidade reactiva para formar uma unidade de transferência. Notar-se-á que esta unidade reactiva pode representar uma entidade distinta ou pode ser parte da funcionalidade da unidade anti-codão (veja-se o Exemplo 9). Em certas concretizações, cada sequência de anti-codão está associada a um tipo de monómero. Por exemplo, a sequência de anti-codão ATTAG pode estar associada a um resíduo de carbamato com uma cadeia lateral de isobutilo, e a sequência de anti-codão CATAG pode estar associada a um resíduo de carbamato com uma cadeia lateral de fenilo. Este mapeamento de um-para-um entre anti-codão e unidades monoméricas permite descodificar qualquer polímero da biblioteca por sequenciação do molde de ácido nucleico utilizado na síntese e permite sintetizar o mesmo polímero ou um polímero relacionado conhecendo a sequência do polímero original. Será notado por um perito na especialidade que alterando (e.g., mutando) a sequência do molde, serão colocadas no lugar diferentes unidades monoméricas, deste modo permitindo a síntese de polímeros relacionados, que podem subsequentemente ser seleccionados e evoluídos. Em certas concretizações preferidas, vários anti-codões podem codificar para uma unidade monomérica como no caso da Natureza.

Em certas outras concretizações da presente invenção quando se pretende criar uma biblioteca de moléculas pequenas em vez de uma biblioteca de polímeros, o anti-codão é associado a um reagente utilizado para modificar o esqueleto 27

ΕΡ 1 423 400 /PT da molécula pequena. Em certas concretizações, o reagente é associado ao anti-codão através de um ligante com comprimento suficiente para permitir que o reagente entre em contacto com o esqueleto da molécula pequena. O ligante deverá preferivelmente ter um comprimento e uma composição que permitam reacções intramoleculares e minimizem reacções intermoleculares. Os reagentes incluem uma variedade de reagentes como demonstrado pela ampla gama de reacções que podem ser utilizadas na síntese modelada por ADN (veja-se Exemplo 2, 3 e 4) e podem ser qualquer grupo químico, catalisador (e.g., compostos organometálicos), ou porção reactiva (e.g., electrófilos, nucleófilos) conhecidos nas especialidades químicas.

Adicionalmente, a associação entre o anti-codão e a unidade monomérica ou o reagente na unidade de transferência pode ser covalente ou não covalente. Em certas concretizações com interesse especial, a associação é através de uma ligação covalente, e em certas concretizações a ligação covalente é dissociável. A ligação pode ser clivável pela luz, por oxidação, hidrólise, exposição a ácidos, exposição a bases, redução, etc. Para exemplos de ligações utilizadas nesta especialidade, por favor veja-se Fruchtel et al. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 35:17, 1996. O anti-codão e a unidade monomérica ou o reagente podem também ser associados através de interacções não covalentes tais como ligações iónicas, electrostáticas, de hidrogénio, interacções de van der Waals, interacções hidrófobas, empilhamento pi, etc. e suas combinações. Apenas para dar um exemplo, o anti-codão pode estar ligado a biotina, e a unidade monomérica ligada a estreptavidina. A propensidade da estreptavidina para ligar biotina conduz à associação não covalente entre o anti-codão e a unidade monomérica para formar a unidade de transferência Síntese de Certos Compostos Exemplificativos

Notar-se-á que se podem preparar uma variedade de compostos e/ou bibliotecas utilizando o método da invenção. Como discutido atrás, em certas concretizações de interesse especial, compostos que não são, ou não se assemelham a, ácidos nucleicos ou seus análogos, são sintetizados de acordo com o método da invenção. 28

ΕΡ 1 423 400 /PT

Em certas concretizações, polímeros, especificamente polímeros não naturais, são preparados de acordo com o método da presente invenção. Os polímeros não naturais que podem ser criados utilizando o método e o sistema da invenção incluem quaisquer polímeros não naturais. Polímeros não naturais exemplificativos incluem, mas não se lhes limitam, policarbamatos, poliureias, poliésteres, poliacrilato, polialquileno (e.g., polietileno, polipropileno), policarbonatos, polipéptidos com estereoquímica não natural, polipéptidos com aminoácidos não naturais, e suas combinações. Em certas concretizações, os polímeros compreendem pelo menos 10 unidades monoméricas. Em certas outras concretizações, os polímeros compreendem pelo menos 50 unidades monoméricas. Em ainda outras concretizações, os polímeros compreendem pelo menos 100 unidades monoméricas. Os polímeros sintetizados utilizando o sistema da invenção podem ser utilizados como catalisadores, farmacêuticos, quelantes de metais, materiais, etc.

Na preparação de certos polímeros não naturais, as unidades monoméricas ligadas aos anti-codões e utilizadas na presente invenção podem ser quaisquer monómeros ou oligómeros capazes de ser unidos mutuamente para formar um polímero. As unidades monoméricas podem ser carbamatos, D-aminoácidos, aminoácidos não naturais, ureias, hidroxiácidos, ésteres, carbonatos, acrilatos, éteres, etc. Em certas concretizações, as unidades monoméricas possuem dois grupos reactivos utilizados para ligar a unidade monomérica à cadeia de polímero em crescimento. Preferivelmente, os dois grupos reactivos não são iguais de modo a que a unidade monomérica possa ser incorporada no polímero num sentido direccional, por exemplo, numa extremidade pode ser um electrófilo e na outra extremidade um nucleófilo. Os grupos reactivos podem incluir, mas não se lhes limitam, ésteres, amidas, ácidos carboxílicos, grupos carbonilo activados, cloretos ácidos, aminas, grupos hidroxilo, tióis, etc. Em certas concretizações, os grupos reactivos estão mascarados ou protegidos (Greene & Wuts Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition Wiley, 1999;) de modo que a polimerização apenas possa ocorrer num momento desejado quando os grupos reactivos são desprotegidos. Uma vez montadas as unidades monoméricas ao longo do molde de ácido nucleico, a iniciação da sequência de polimerização 29 ΕΡ 1 423 400 /PT resulta numa cascata de passos de polimerização e desprotecção em que o passo de polimerização resulta na desprotecção de um grupo reactivo a utilizar no passo de polimerização subsequente (veja-se a Figura 3).

As unidades monoméricas a polimerizar podem compreender duas ou mais unidades dependendo da geometria ao longo do molde de ácido nucleico. Como será notado por um perito na especialidade, as unidades monoméricas a polimerizar têm que ser capazes de se estender ao longo do molde de ácido nucleico e particularmente através da distância coberta pelo se anti-codão de codificação e sequência espaçadora opcional. Em certas concretizações, a unidade monomérica compreende realmente dois monómeros, por exemplo, um dicarbamato, uma diureia, um dipéptido, etc. Em ainda outras concretizações, a unidade monomérica compreende realmente três ou mais monómeros.

As unidades monoméricas podem conter quaisquer grupos quimicos conhecidos na especialidade. Como será notado por um perito na especialidade, os grupos quimicos reactivos, especialmente aqueles que interfeririam na polimerização, hibridação, etc., são mascarados utilizando grupos protectores conhecidos (Greene & Wuts Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition Wiley, 1999;)· Em geral, os grupos protectores utilizados para mascarar estes grupos reactivos são ortogonais aos utilizados na protecção dos grupos utilizados nos passos de polimerização.

Na síntese de um polímero não natural, em certas concretizações, é proporcionado um molde que codifica a sequência de unidades monoméricas. As unidades de transferência são então colocadas em contacto com o molde sob condições que permitem a hibridação dos anti-codões com o molde. A polimerização das unidades monoméricas ao longo do molde é então permitida para formar o polímero não natural. 0 polímero recém-sintetizado pode então ser clivado dos anti-codões e/ou do molde. 0 molde pode ser utilizado como um marcador para elucidar a estrutura do polímero ou pode ser utilizado para amplificar e evoluir o polímero não natural. Como será descrito com mais detalhes adiante, o presente método pode ser utilizado para preparar uma biblioteca de 30

ΕΡ 1 423 400 /PT polímeros não naturais. Por exemplo, em certas concretizações, como descrito com mais detalhes no Exemplo 9, uma biblioteca de moldes de ADN pode ser utilizada para preparar polímeros não naturais. Em geral, o método toma vantagem do facto de certas ADN-polimerases serem capazes de aceitar certos substratos nucleótido-trifosfato modificados e de se saber que vários desoxirribonucleótidos e ribonucleótidos portadores de grupos modificados que não participam nas ligações de Watson-Crick são inseridos com elevada especificidade de sequência em oposição aos moldes de ADN naturais. Deste modo, ADN de cadeia simples contendo nucleótidos modificados podem servir como moldes eficientes para a incorporação catalisada por ADN-polimerase de nucleótidos naturais ou modificados.

Notar-se-á que os métodos da invenção podem também ser utilizados para sintetizar outras classes de compostos químicos para além de polímeros não naturais. Por exemplo, moléculas pequenas podem ser preparadas utilizando os métodos e composições proporcionados pela presente invenção. Estas moléculas pequenas podem ser semelhantes a um produto natural, não poliméricas e/ou não oligoméricas. O interesse substancial em moléculas pequenas deve-se em parte à sua utilização como ingrediente activo em muitas preparações farmacêuticas embora possam também ser utilizadas como catalisadores, materiais, aditivos, etc.

Na síntese de moléculas pequenas utilizando o método da presente invenção, é também proporcionado um molde evoluível. O molde pode compreender ou um esqueleto de molécula pequena sobre o qual a molécula pequena é construída, ou um esqueleto de molécula pequena pode ser adicionado ao molde. O esqueleto de molécula pequena pode ser qualquer composto químico com locais para funcionalização. Por exemplo, o esqueleto de molécula pequena pode compreender um sistema de anel (e.g., o sistema de anel esteróide ABCD encontrado no colesterol) com grupos funcionalizáveis a partir dos átomos que perfazem o anel. Noutro exemplo, a molécula pequena pode ser a estrutura subjacente a um agente farmacêutico tal como morfina ou um antibiótico de cefalosporina (vejam-se os Exemplos 5C e 5D adiante). Os locais ou grupos a funcionalizar sobre o esqueleto de molécula pequena podem ser protegidos utilizando métodos e grupos protectores conhecidos na especialidade. Os 31 ΕΡ 1 423 400 /PT grupos protectores utilizados num esqueleto de molécula pequena podem ser ortogonais uns em relação aos outros de modo a que os grupos protectores possam ser removidos um de cada vez.

Nesta concretização, as unidades de transferência compreendem um anti-codão similar aos descritos na síntese de polímeros não naturais; contudo, estes anti-codões estão associados com reagentes ou blocos de construção a utilizar para modificar, adicionar ou remover do esqueleto de molécula pequena. Os reagentes ou blocos de construção podem ser electrófilos (e.g., acetilo, amidas, cloretos ácidos, ésteres, nitrilos, iminas), nucleófilos (e.g., aminas, grupos hidroxilo, tióis), catalisadores (e.g., catalisadores organometálicos), cadeias laterais, etc. Veja-se, por exemplo reacções em meios aquosos e orgânicos como aqui descrito nos Exemplos 2 e 4. As unidades de transferência são deixadas contactar com o molde sob condições de hibridação, e o reagente ou bloco de construção ligado é deixado reagir com um local no esqueleto de molécula pequena. Em certas concretizações, grupos protectores no molde da molécula pequena são removidos um de cada vez dos locais a funcionalizar de modo a que o reagente da unidade de transferência reaja apenas na posição desejada no esqueleto. Como será notado por um perito na especialidade, o anti-codão pode estar associado ao reagente através de uma porção ligante (veja-se o Exemplo 3). O ligante facilita o contacto do reagente com o esqueleto de molécula pequena e em certas concretizações, dependendo da reacção desejada, posiciona o ADN como grupo rejeitado (estratégia "autoclivável"), ou pode ligar grupos reactivos ao molde por via da estratégia de ligantes "sem resíduo" ("scarless") (que originam o produto sem deixar para trás funcionalidade química adicional), ou uma estratégia de "resíduo útil" ("useful scar") (em que o ligante é deixado para trás e pode ser funcionalizado em passos subsequentes após a clivagem do ligante). As condições reaccionais, o ligante, o reagente, e o local a funcionalizar, são escolhidos para evitar reacções intermoleculares e acelerar reacções intramoleculares. Será também notado que o método da presente invenção contempla o contacto tanto sequencial como simultâneo do molde com unidades de transferência dependendo do composto particular a sintetizar. 32

ΕΡ 1 423 400 /PT

Em certas concretizações de interesse especial, é proporcionada a síntese em múltiplos passos de compostos químicos em que o molde é colocado em contacto sequencialmente com duas ou mais unidades de transferência para facilitar a síntese em múltiplos passos de compostos químicos complexos.

Depois de os locais no esqueleto estarem modificados, a molécula pequena recém-sintetizada é ligada ao molde que codificava a sua síntese. A descodificação do molde marcador permitirá elucidar a história sintética e desse modo a estrutura da molécula pequena. O molde pode também ser amplificado de modo a criar mais da molécula pequena desejada e/ou o molde pode ser evoluído para criar moléculas pequenas relacionadas. A molécula pequena pode também ser clivada do molde para purificação ou rastreio.

Como será notado por um perito na especialidade, podem ser utilizados uma pluralidade de moldes para codificar a síntese de uma biblioteca combinatória de moléculas pequenas utilizando o método atrás descrito. Isto permitiria a amplificação e a evolução de uma biblioteca de moléculas pequenas, um feito que não foi conseguido antes da presente invenção. Método de Síntese de Bibliotecas de Compostos

No método da invenção, é proporcionado um molde de ácido nucleico, como atrás descrito, para dirigir a síntese de um polímero não natural, uma molécula pequena, ou qualquer outro tipo de molécula de interesse. Em geral, é proporcionada uma pluralidade de moldes de ácido nucleico em que o número de sequências diferentes proporcionadas varia de 2 a 1015. Numa concretização da presente invenção, é proporcionada uma pluralidade de moldes de ácido nucleico, preferivelmente pelo menos 100 moldes de ácido nucleico diferentes, mais preferivelmente pelo menos 10000 moldes de ácido nucleico diferentes, e o mais preferivelmente pelo menos 1000000 moldes de ácido nucleico diferentes. Cada molde proporcionado compreende uma sequência de ácido nucleico única utilizada para codificar a síntese de um polímero não natural ou molécula pequena particulares. Como atrás descrito, o molde pode também possuir uma funcionalidade tal como uma amina primária, a partir da qual a polimerização é iniciada, ou um 33 ΕΡ 1 423 400 /PT esqueleto de molécula pequena. Em certas concretizações, os moldes de ácido nucleico são proporcionado num só "vaso". Em certas outras concretizações, os moldes são proporcionados em meios aquosos, e as subsequentes reacções são realizadas em meios aquosos.

Adicionam-se ao molde unidades de transferência com anti-codões, como descrito atrás, associadas à unidade monomérica, como descrito atrás. Em certas concretizações, são proporcionadas uma pluralidade de unidades de transferência de modo que existe um anti-codão para cada codão representado no molde. Numa concretização preferida, são utilizados certos anti-codões como locais de iniciação e de paragem. Em geral, é proporcionado um número suficientemente grande de unidades de transferência para que todos os correspondentes locais de codão no molde sejam preenchidos após a hibridação.

Deixam-se os anti-codões das unidades de transferência hibridar com o molde de ácido nucleico, juntando deste modo as unidades monoméricas numa sequência especifica conforme determinado pelo molde. Na situação em que se está a sintetizar uma biblioteca de moléculas pequenas, os reagentes são levados à proximidade de um esqueleto de molécula pequena. As condições de hibridação, como será notado pelos peritos na especialidade, deverão preferivelmente permitir apenas emparelhamentos perfeitos entre o codão e o seu anti-codão. Mesmo erros de emparelhamento de um único par de bases deverão ser evitados. As condições de hibridação podem incluir, mas não se lhes limitam, temperatura, concentração de sais, pH, concentração de molde, concentração de anti-codões e solvente. As condições de hibridação utilizadas na síntese da biblioteca podem depender do comprimento do codão/anti-codão, da semelhanças entre os codões presentes no moldes, do teor de pares de bases G/C versus A/T, etc (para mais informação em relação às condições de hibridação, por favor veja-se, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. de Sambrook, Fritsch, e Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); o tratado, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999);)· 34

ΕΡ 1 423 400 /PT

Após a ocorrência da hibridação dos anti-codões com os codões no molde, as unidades monoméricas são então polimerizadas no caso da síntese de polímeros não naturais. A polimerização das unidades monoméricas pode ocorrer espontaneamente ou pode necessitar se ser iniciada, por exemplo, pela desprotecção de grupos reactivos tais como um nucleófilo ou proporcionando luz com um determinado comprimento de onda. Em certas outras concretizações, os polímeros podem ser catalisados por ADN-polimerase capaz de efectuar a polimerização de nucleótidos não naturais (veja-se o Exemplo 9). A polimerização ocorre preferivelmente num sentido ao longo do molde com as unidades monoméricas adjacentes ficando unidas através de uma ligação covalente. A terminação do passo de polimerização ocorre pela adição de uma unidade monomérica que não é capaz de ser adicionada. No caso da síntese de moléculas pequenas, os reagentes são deixados reagir com o esqueleto de molécula pequena. O reagente pode reagir espontaneamente, ou pode ser necessário remover grupos protectores no reagente e/ou no esqueleto de molécula pequena. Outros reagentes (e.g., ácido, base, catalisador, hidrogénio gasoso, etc.) podem também ser necessários para efectuar a reacção (vejam-se os Exemplos 5A-5E).

Depois de criados os polímeros não naturais ou as moléculas pequenas com o auxílio do molde de ácido nucleico, podem ser clivados do molde de ácido nucleico e/ou dos anti-codões utilizados para os sintetizar. Em certas concretizações, os polímeros ou moléculas pequenas são ensaiados antes de serem completamente desligados dos moldes de ácido nucleico que os codificam. Uma vez seleccionado o polímero ou a molécula pequena, a sequência do molde, ou do seu complemento, pode ser determinada para elucidar a estrutura do polímero ou molécula pequena ligados. Esta sequência pode então ser amplificada e/ou evoluída para criar novas bibliotecas de polímeros ou moléculas pequenas relacionados que por sua vez podem ser rastreadas e evoluídas.

Utilizações

Os métodos e composições da presente invenção representam uma nova maneira de gerar moléculas com propriedades desejadas. Esta abordagem conjuga os métodos genéticos extremamente poderosos, dos quais os biólogos moleculares há 35

ΕΡ 1 423 400 /PT décadas tomam vantagem, com a flexibilidade e poder da química orgânica. A capacidade de preparar, amplificar e evoluir polímeros não naturais por selecção genética pode conduzir a novas classes de catalisadores que possuem actividade, biodisponibilidade, estabilidade, fluorescência, fotolabilidade ou outras propriedades que são difíceis ou impossíveis de conseguir utilizando o conjunto limitado de blocos de construção encontrados em proteínas e ácidos nucleicos. Similarmente, o desenvolvimento de novos sistemas para a preparação, a amplificação e a evolução de moléculas pequenas por ciclos iterados de mutação e selecção pode conduzir ao isolamento de novos ligandos ou drogas com propriedades superiores às do isolados por métodos de descoberta de drogas tradicionais, mais lentos (veja-se o Exemplo 7). A realização da síntese de bibliotecas orgânicas à escala da biologia molecular constitui uma abordagem fundamentalmente diferente da síntese de bibliotecas em fase sólida tradicional e possui vantagens significativas. Uma biblioteca criada utilizando o método da invenção pode ser rastreada utilizando qualquer método conhecido na especialidade (e.g., ensaio de ligação, ensaio catalítico). Por exemplo, a selecção baseada na ligação a uma molécula alvo pode ser realizada na biblioteca completa passando a biblioteca sobre uma resina ligada covalentemente ao alvo. Os biopolímeros que possuem afinidade pelo alvo ligado à resina podem ser eluídos com moléculas alvo livres, e os compostos seleccionados podem ser amplificados utilizando os métodos atrás descritos. Ciclos subsequentes de selecção e amplificação podem resultar num conjunto de compostos enriquecido com sequências que se ligam à molécula alvo. Em certas concretizações, a molécula alvo imita um estado de transição de uma reacção química, e os compostos químicos seleccionados podem servir como catalisadores para a reacção química. Como a informação que codifica a síntese de cada molécula está ligada covalentemente à molécula numa extremidade, pode ser rastreada uma biblioteca completa de uma só vez e mesmo assim cada molécula é seleccionada numa base individual.

Uma tal biblioteca pode também ser evoluída introduzindo mutações ao nível do ADN utilizando PCR propensa a erros 36 ΕΡ 1 423 400 /PT ("error-prone PCR") (Cadwell et al. PCR Methods Appl. 2:28, 1992;) ou submetendo o ADN a recombinação homóloga in vitro (Stemmer Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747, 1994; Stemmer, Nature 370:389, 1994;). Ciclos repetidos de selecção, amplificação e mutação podem produzir biopolimeros com afinidade de ligação grandemente aumentada para com moléculas alvo ou com propriedades catalíticas significativamente melhoradas. O conjunto final de biopolimeros evoluídos possuindo as propriedades desejadas pode ser sequenciado por sequenciação do ácido nucleico clivado dos polímeros. Os polímeros isentos de ácido nucleico podem ser purificados utilizando qualquer método conhecido na especialidade incluindo HPLC, cromatografia em coluna, FLPC, etc., e as suas propriedades de ligação ou catalíticas podem ser verificadas na ausência de ácido nucleico ligado covalentemente. A polimerização de unidades monoméricas geradas sinteticamente independente da maquinaria ribossómica permite a incorporação de uma enorme variedade de cadeias laterais com novas propriedades químicas, biofísicas ou biológicas. A terminação de cada biopolímero com uma cadeia lateral de biotina, por exemplo, permite a fácil purificação de apenas biopolimeros de comprimento completo que foram completamente traduzidos, por passagem da biblioteca através de uma resina ligada a avidina. Os biopolimeros terminados com biotina podem ser seleccionados pela real catálise de reacções de quebra de ligações passando estes biopolimeros sobre resina ligada através do substrato da avidina (Figura 5). Os biopolimeros que catalisam a clivagem do substrato irão auto-eluir da coluna carregada com esta resina. Similarmente, os biopolimeros terminados com biotina podem ser seleccionados pela catálise de reacções de formação de ligações (Figura 5). Um substrato é ligado à resina e o segundo substrato é ligado a avidina. Os biopolimeros que catalisam a formação de ligações entre os substratos são seleccionados pela sua capacidade de ligar mutuamente os substratos, resultando a ligação do biopolímero à resina. Podem também utilizar-se novas cadeias laterais para introduzir um cofactor nos biopolimeros. Uma cadeia lateral contendo um quelante de metal, por exemplo, pode proporcionar biopolimeros com propriedades catalíticas mediadas por metais, enquanto uma 37 ΕΡ 1 423 400 /PT cadeia lateral contendo flavina pode equipar biopolimeros com potencial para catalisar reacções redox.

Desta maneira, podem-se isolar biopolimeros não naturais que servem de receptores artificiais para ligar selectivamente moléculas ou que catalisam reacções químicas. A caracterização destas moléculas proporcionará importantes discernimentos sobre a capacidade de policarbamatos, poliureias, poliésteres, policarbonatos, polipéptidos com cadeias laterais e estereoquímicas não naturais, ou outros polímeros não naturais, para formar estruturas secundárias ou terciárias com propriedades de ligação ou catalíticas.

Kits

Podem também ser proporcionados kits e composições para utilização nos métodos da invenção. Os kits podem conter qualquer item ou composição úteis na prática da presente invenção. Os kits podem incluir, mas não se lhes limitam, moldes, anti-codões, unidades de transferência, unidades monoméricas, blocos de construção, reagentes, esqueletos de molécula pequena, tampões, solventes, enzimas (e.g., polimerase estável ao calor, transcritase inversa, ligase, endonuclease de restrição, exonuclease, fragmento de Klenow, polimerase, fosfatase alcalina, polinucleótido-quinase), ligantes, grupos protectores, polinucleótidos, nucleósidos, nucleótidos, sais, ácidos, bases, suportes sólidos ou quaisquer suas combinações.

Como será notado por um perito na especialidade, um kit para a preparação de polímeros não naturais conterá itens necessários para preparar polímeros não naturais utilizando os métodos da invenção aqui descritos. Estes kits podem incluir moldes, anti-codões, unidades de transferência, unidades monoméricas ou suas combinações. Um kit para a síntese de moléculas pequenas pode incluir moldes, anti-codões, unidades de transferência, blocos de construção, esqueletos de molécula pequena ou suas combinações. O kit pode também ser equipado com itens necessários para amplificar e/ou evoluir um polinucleótido molde tal como uma polimerase estável ao calor para PCR, nucleótidos, tampão e iniciadores. O kit pode também incluir itens vulgarmente 38 ΕΡ 1 423 400 /PT utilizados na realização de rearranjo de ADN (DNA shuffling) tais como polinucleótidos, ligase e nucleótidos.

Em adição aos moldes e às unidades de transferência aqui descritos, a presente invenção também inclui composições compreendendo moléculas pequenas complexas, esqueletos ou polímero não natural preparados por qualquer um ou mais dos métodos da invenção como aqui descrito.

Equivalentes

Os exemplos representativos que se seguem destinam-se a ajudar a ilustrar a invenção, e não se pretendem, nem devem ser entendidos como, limitantes do âmbito da invenção. De facto, várias modificações da invenção e muitas outras suas concretizações, em adição às aqui mostradas e descritas, serão evidentes para os peritos na especialidade a partir do conteúdo deste documento, incluindo os exemplos que se seguem e as referências à literatura científica e de patentes aqui citada.

Os exemplos que se seguem contêm importante informação, exemplificação e orientação adicionais que podem ser adaptadas à prática da presente invenção nas suas várias concretizações e os seus equivalentes.

Exemplificação

Exemplo 1: A Generalidade da Síntese modelada por ADN:

Claramente, a implementação da abordagem da evolução de moléculas pequenas descrita atrás requer o estabelecimento da generalidade da síntese modelada por ADN. A presente invenção, pela primeira vez, estabelece a generalidade desta abordagem e assim permite a síntese de uma variedade de compostos químicos utilizando síntese modelada por ADN. Como mostrado na Figura 6a, foi estabelecida a capacidade de duas arquitecturas de ADN para suportar síntese modelada por ADN em fase de solução. Tanto moldes em “gancho de cabelo" (H) como em "final-de-hélice" (E) portadores de grupos maleimida electrófilos reagiram eficientemente com um equivalente de reagente de tiol ligado a um oligonucleótido de ADN complementar para originar o produto tioéter em minutos a 25 °C. As velocidades das reacções modeladas por ADN (Aapp = 39 ΕΡ 1 423 400 /PT ~105 M^s”1) foram similares para as arquitecturas H e E apesar de significativas diferenças na orientação relativa dos seus grupos reactivos. Em contraste, não se observou produto quando se utilizaram reagentes contendo erros de emparelhamento de sequência, ou quando se utilizaram moldes pré-extintos com excesso de β-mercaptoetanol (Fig. 6a) . Ambos os moldes suportam portanto a adição modelada por ADN específica da sequência de um tiol a uma maleimida ainda que as estruturas dos produtos resultantes difiram marcadamente da estrutura principal do ADN natural. São observados poucos ou nenhuns produtos de reacção intermolecular não modelada sob as condições de reacção (pH 7,5, 25°C, NaCl 250 mM, molde e reagente 60 nM).

Adicionalmente, as reacções modeladas por ADN especificas da sequência que englobam uma variedade de tipos de reacção (substituições SN2, adições a sistemas carbonilo a,β-insaturados, e adições a vinilsulfonas), nucleófilos (tióis e aminas), e estruturas de reagentes, prosseguiram todas com bons rendimentos com excelente selectividade de sequência (Fig. 6b). As massas dos produtos esperadas foram verificadas por espectrometria de massa. Em cada caso, reagentes emparelhados, mas não os mal emparelhados, produziram produto eficientemente apesar de consideráveis variações na sua geometria do estado de transição, impedimento estereoquímico e flexibilidade conformacional. Colectivamente, estas verificações indicam que a síntese modelada por ADN é um fenómeno geral capaz de suportar uma gama de tipos de reacção, e não se limita à criação de estruturas que se assemelham a estruturas principais de ácido nucleico como descrito previamente.

Como a discriminação de sequências é importante para a tradução fiel de ADN em estruturas sintéticas, mediu-se a velocidade da reacção de um reagente emparelhado em comparação com a de um reagente portador de uma única base mal emparelhada próximo do centro do seu oligonucleótido de 10 bases. A 25°C, a velocidade de reacção inicial de reagentes de tiol emparelhado com moldes H ligados a iodoacetamida é 200 vezes mais rápida do que a de reagentes portadores de um único erro de emparelhamento (Jcap P = 2,4 x 104 M^s”1 vs. 1,1 x 102 M_1s_1, Fig. 7) . Em adição, pequenas quantidades de 40 ΕΡ 1 423 400 /PT produtos que surgem da hibridação de reagentes mal emparelhados podem ser eliminadas elevando a temperatura da reacção acima da Tm dos reagentes mal emparelhados (Fig. 7). A diminuição da velocidade de formação de produto à medida que a temperatura aumenta indica adicionalmente que a formação de produto prossegue através de um mecanismo modelado por ADN e não de um mecanismo intermolecular simples.

Em adição à generalidade da reacção e à especificidade da sequência, a síntese modelada por ADN também demonstra uma notável independência da distância. Tanto moldes H como E ligados a grupos maleimida ou α-iodoacetamida promovem a reacção específica da sequência com reagentes de tiol emparelhados, mas não com os mal emparelhados, hibridados em qualquer parte nos moldes examinados até agora (até 30 bases afastados do grupo reactivo no molde). Os reagentes hibridados a uma base de distância reagem com velocidades similares aos hibridados a 2, 3, 4, 6, 8, 10, 15, 20 ou 30 bases de distância (Fig. 8) . Em todos os casos, as velocidades de reacções modeladas são várias centenas de vezes superiores à velocidade da reacção não modelada (não emparelhada) (A:app = 104-105 M_1s_1 vs. 5 x 101 M_1s_1) . A distâncias intermédias de 30 bases, os produtos são eficientemente formados presumivelmente através de estados de transição que se assemelham a anéis de 200 membros. Estas verificações contrastam marcadamente com a bem conhecida dificuldade da macrociclização (veja-se, por exemplo, G. Illuminati et al. Acc. Chem. Res. 1981, 14, 95-102; R.B. Woodward et al. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 3210-3213) em síntese orgânica.

Para determinar a base da independência da distância da síntese modelada por ADN, foram primeiro sintetizados uma série de moldes E modificados em que as bases intermédias foram substituídas por uma série de análogos de ADN desenhados para avaliar a possível contribuição de (i) interacções interbases, (ii) preferências conformacionais da estrutura principal do ADN, (iii) a estrutura principal de fosfato carregado, e (iv) a hidrofilicidade da estrutura principal. Os moldes em que as bases intermédias foram substituídas por quaisquer dos análogos na Fig. 9 tinham pouco efeito sobre as velocidades da formação do produto. Estas verificações indicam que os elementos estruturais da estrutura principal 41 ΕΡ 1 423 400 /PT específicos do ADN não são responsáveis pela observada independência da distância da síntese modelada por ADN. Contudo, a adição de um oligonucleótido "grampo" de ADN de 10 bases complementar à região intermédia de cadeia simples reduziu significativamente a formação do produto (Fig. 9), sugerindo que a flexibilidade desta região é crítica para uma eficiente síntese modelada por ADN.

As velocidades de reacção independentes da distância podem ser explicadas se os eventos de formação de ligações num formato modelado por ADN forem suficientemente acelerados relativamente às suas contrapartidas não modeladas de modo a que a hibridação de ADN, em vez da formação de ligações, seja determinante da velocidade. Se a hibridação do ADN for pelo menos parcialmente limitante da velocidade, então a velocidade de formação de produto deverá diminuir à medida que a concentração de reagentes diminui porque a hibridação, ao contrário da formação de ligações modelada, é um processo bimolecular. A diminuição da concentração de reagentes no caso do molde E com uma ou dez bases intermédias entre grupos reactivos resultou numa diminuição marcada na velocidade de reacção observada (Fig. 10). Esta observação sugere que efeitos de proximidade na síntese modelada por ADN podem aumentar as velocidades de formação de ligações até ao ponto em que a hibridação do ADN se torna determinante da velocidade.

Estas verificações levantam a possibilidade da utilização da síntese modelada por ADN para traduzir num só vaso bibliotecas de ADN em bibliotecas em fase de solução de moléculas sintéticas adequadas para amplificação por PCR e selecção. A capacidade da síntese modelada por ADN para suportar uma variedade de geometrias de estados de transição sugere o seu potencial para dirigir uma gama de poderosas reacções sintéticas compatíveis com água (veja-se, Li, C.J.

Organic Reactions in Aqueous Media, Wiley and Sons, New York: 1997). A especificidade de sequências atrás descrita sugere que misturas de reagentes podem ser capazes de reagir de modo previsível com misturas complementares de moldes. Finalmente, a independência da distância observada sugere que podem ser utilizadas diferentes regiões de "codões" de ADN para codificar diferentes grupos no mesmo esqueleto sintético sem 42 ΕΡ 1 423 400 /PT prejudicar as velocidades das reacções. Como demonstração desta abordagem, sintetizou-se uma biblioteca de 1 025 moldes ligados a maleimida, cada um com uma diferente sequência de ADN numa região de codificação de oito bases (Fig. 11). Uma destas sequências, 5'-TGACGGGT-3', foi arbitrariamente escolhida para codificar a ligação de um grupo biotina ao molde. Foi também gerada uma biblioteca de reagentes de tiol ligados a 1 025 oligonucleótidos diferentes. O reagente ligado a 3'-ACTGCCCA-5' continha um grupo biotina, enquanto os outros 1 024 reagentes não continham biotina. Misturaram-se razões equimolares de todos os 1 025 moldes e 1 025 reagentes num só vaso durante 10 minutos a 25°C e os produtos resultantes foram seleccionados in vitro quanto a ligação a estreptavidina. As moléculas que sobreviveram a selecção foram amplificadas por PCR e analisadas por digestão de restrição e sequenciação de ADN. A digestão com a endonuclease de restrição Tsp45I, que cliva GTGAC e portanto corta o molde que codifica a biotina mas nenhum dos outros moldes, revelou uma razão de 1:1 entre molde que codifica biotina e moldes que não codificam biotina após a selecção (Fig. 12) . Isto representa um enriquecimento de 1 000 vezes em comparação com a biblioteca não seleccionada. A sequenciação do ADN do conjunto amplificado por PCR antes e depois da selecção sugere um grau similar de enriquecimento e indicou que o molde que codifica biotina é o produto principal após a selecção e a amplificação (Fig. 12). A capacidade de síntese modelada por ADN para suportar a reacção específica da sequência simultânea de 1 025 reagentes, cada um face a uma razão de 1 024:1 de moldes sem parceiro para moldes com parceiro, demonstra o seu potencial como método para criar bibliotecas sintéticas num só vaso. A demonstração de tradução, selecção e amplificação anteriores de um membro de biblioteca sintética possuindo uma propriedade específica (afinidade com avidina neste exemplo) consagra vários requisitos chave para a evolução de bibliotecas de moléculas pequenas não naturais no sentido das propriedades desejadas.

Em conjunto, estes resultados sugerem que a síntese modelada por ADN é um fenómeno surpreendentemente geral capaz de dirigir, e não simplesmente codificar, uma gama de reacções 43 ΕΡ 1 423 400 /PT químicas para formar produtos não relacionados em estrutura com a estrutura principal de ácido nucleico. Para várias reacções examinadas, o formato modelado por ADN acelera a velocidade da formação de ligações acima da velocidade a que um oligonucleótido de ADN de 10 bases híbrida com o seu complemento, resultando numa surpreendente independência da distância. A fácil natureza das reacções modelada por ADN de longa distância pode também surgir em parte da tendência da água para contrair o volume de reagentes não polares /veja-se, C.-J. Li et al. Organic Reactions in Aqueous Media, Wiley and Sons: New York, 1997) e da possível compacidade do ADN de cadeia simples intermédia entre grupos reactivos. Estas verificações podem ter implicações na evolução pré-biótica e no entendimento dos mecanismos de ácidos nucleicos catalíticos, que tipicamente localizam substratos numa cadeia de ARN ou ADN. Métodos: Síntese de ADN. Os oligonucleótidos de ADN foram sintetizados num sintetizador de ADN PerSeptive Biosystems Expedite 8909 utilizando protocolos Standard e foram purificados por HPLC de fase inversa. Os oligonucleótidos foram quantificados espectrofotometricamente e por electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) desnaturante seguidas por coloração com brometo de etídio ou verde SYBR (Molecular Probes) e quantificação utilizando um densitómetro Stratagene Eagle Eye II. Fosforamiditos que permitem a síntese de 5'-NH2-dT, 5'-tetraclorofluoresceína, um espaçador de estrutura principal abásica, um espaçador de estrutural principal C3, um espaçador de polietilenoglicol ligado em 9, um espaçador de hidrocarboneto saturado ligado em 12, e grupos biotina a 5', foram adquiridos a Glen Research. Os reagentes oligonucleótidos ligados a tiol foram sintetizados sobre vidro de poro controlado de dissulfureto C3 (Glen Research).

Funcionalização de moldes. Moldes portadores de grupos 5 '-NH2-dT foram transformados numa variedade de grupos funcionais electrófilos por reacção com o electrófilo-éster NHS apropriado (Pierce). As reacções foram realizadas em fosfato de sódio 200 mM, pH 7,2 com 2 mg/mL de electrófilo-éster NHS, DMSO a 10%, e até 100 pg de molde 5'-amino a 25°C 44 ΕΡ 1 423 400 /PT durante 1 h. Purificaram-se os produtos desejados por HPLC de fase inversa e caracterizaram-se por electroforese em gel e espectrometria de massa MALDI.

Reacções de síntese modelada por ADN. As reacções foram iniciadas misturando quantidades equimolares de reagente e molde em tampão contendo MOPS 50 mM, pH 7,5 e NaCl 250 mM à temperatura desejada (25°C a menos que afirmado de outro modo). As concentrações de reagentes e moldes eram de 60 nM a menos que indicado de outro modo. Em vários pontos de tempo, removeram-se alíquotas, extinguiram-se com excesso de β-mercaptoetanol e analisaram-se por PAGE desnaturante. Quantificaram-se os produtos da reacção por densitometria utilizando a sua fluorescência intrínseca ou por coloração seguida por densitometria. Os produtos representativos foram também verificados por espectrometria de massa MALDI.

Selecção in vitro por ligação a avidina. Os produtos da reacção de tradução da biblioteca foram isolados por precipitação com etanol e dissolveram-se em tampão de ligação (Tris 10 mM, pH 8, NaCl 1 M, EDTA 10 mM) . Os produtos foram incubados com 30 pg de contas magnéticas ligadas a estreptavidina (Roche Biosciences) durante 10 min à temperatura ambiente em 100 uL de volume total. Lavaram-se as contas 16 vezes com tampão de ligação e eluíram-se por tratamento com 1 pmol de biotina livre em 100 uL de tampão de ligação a 70°C durante 10 minutos. As moléculas eluídas foram isoladas por precipitação com etanol e amplificadas por protocolos Standard de PCR (MgCl2 2 mM, hibridação a 55°C, 20 ciclos) utilizando os iniciadores 5'-TGGTGCGGAGCCGCCG e 5'-CCACTGTCCGTGGCGCGACCCCGGCTCCTCGGCTCGG. Na sequenciação automática do ADN utilizou-se o iniciador 5'-CCACTGTCCGTGGCGCGACCC.

Sequências de ADN. As sequências não proporcionadas nas figuras são as seguintes: reagente emparelhado nas reacções SIAB e SBAP da Fig. 6b: 5'-CCCGAGTCGAAGTCGTACC-SH; reagente mal emparelhado nas reacções SIAB e SBAP da Fig. 6b:

5'-GGGCTCAGCTTCCCCATAA-SH; reagentes mal emparelhados para outras reacções nas Fig. 6b, 6c, 6d e 8a; 5' -FAAATCTTCCC-SH (F= tetraclorofluoresceína); reagentes nas Fig. 6c e 6d contendo um erro de emparelhamento: 5'-FAATTCTTACC-SH; moldes 45

ΕΡ 1 423 400 /PT Ε nas reacções SMCC, GMBS, BMPS e SVSB da Fig. 6a, 6b, e 8a: 5 ' - (NH2dT)-CGCGAGCGTACGCTCGCGATGGTACGAATTCGACTCGGGAATACCACCTT CGACTCGAGG; molde H nas reacções SIAB, SBAP e SAI da Fig. 6b: 5 ' - (NH2dT)-CGCGAGCGTACGCTCGCGATGGTACGAATTC; oligonucleótido

"grampo" na Fig 8b: 5'-ATTCGTACCA

Exemplo 2: Reacções Exemplificativas para Utilização na Síntese modelada por ADN:

Como discutido atrás, foi examinada a generalidade da química sintética modelada por ADN (veja-se, Liu et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961). Especificamente, demonstrou-se a capacidade da síntese modelada por ADN para dirigir uma colecção modesta de reacções químicas sem necessidade do alinhamento preciso de grupos reactivos em conformações semelhantes ao ADN. De facto, a independência da distância e a fidelidade da sequência da síntese modelada por ADN permitiram a tradução simultânea, num só vaso, de uma biblioteca modelo de mais de 1 000 moldes nos correspondentes produtos tioéter, um dos quais foi enriquecido por selecção in vitro por ligação à proteína estreptavidina e amplificado por PCR.

Como descrito aqui com detalhes, a generalidade da síntese modelada por ADN foi adicionalmente expandida e demonstrou-se que se podem utilizar uma variedade de reacções químicas para a construção de moléculas pequenas e em particular, pela primeira vez, acoplamentos organometálicos e reacções de formação de ligações carbono-carbono outras que não a fotodimerização de pirimidina, modelados por ADN. Estas reacções representam claramente um importante passo no sentido da evolução in vitro de moléculas sintéticas não naturais ao permitir a construção modelada por ADN de um conjunto muito mais diverso de estruturas do que anteriormente se conseguia. A capacidade da síntese modelada por ADN para dirigir reacções que requerem um activador, um catalisador ou outro reagente, não ligados a ADN, em adição aos reagentes principais foi aqui também demonstrada. Para testar a capacidade da síntese modelada por ADN para mediar estas reacções sem necessidade de imitação estrutural da estrutura principal modelada por ADN, podem-se realizar aminações redutoras modeladas por ADN entre um molde ligado a amina (1) e reagentes ligados a benzaldeído ou glioxal (3) com

ΕΡ 1 423 400 /PT 4 6 concentrações milimolares de NaBH3CN à temperatura ambiente em soluções aquosas. Significativamente, formaram-se eficientemente produtos quando as sequências do molde e do reagente eram complementares, enquanto reacções de controlo em que a sequência do reagente não é complementar à do molde, ou em que se omitiu o NaBH3CN, não originaram produto significativo (vejam-se as Figuras 13 e 14). Embora as aminações redutoras modeladas por ADN para gerar produtos que imitam de próximo a estrutura de ADN de cadeia dupla tenham sido anteriormente relatadas (veja-se, por exemplo, X. Li et al. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 746 e Y. Gat et al. Biopolymers 1998, 48, 19), os resultados anteriores demonstram que a aminação redutora para gerar estruturas não relacionadas com a estrutura principal de fosforribose podem ocorrer eficientemente e de modo especifico da sequência. Com referência à Figura 15, os moldes de ADN ajudam à formação de ligações entre moldes ligados a amina 4 e 5 e reagentes ligados a carboxilato 6-9 mediadas por l-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC) e N-hidroxilsulfossuccinimida (sulfo-NHS) para gerar produtos amida com bons rendimentos a pH 6,0, 25°C (Figura 15). A formação de produto foi especifica da sequência, dependente da presença de EDC, e surpreendentemente insensível ao impedimento estereoquímico da amina ou do carboxilato. A eficiente formação de amida modelada por ADN foi também mediada pelo activador estável à água, cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-trizin-2-il)-4-metilmorfolínio (DMT-MM) em vez de EDC e sulfo-NHS (Figuras 14 e 15) . A eficiência e a generalidade da formação de ligações amida modelada por ADN sob estas condições, juntamente com o grande número de aminas e ácidos carboxílicos quirais comercialmente disponíveis, tornam esta reacção uma atractivo candidato em futuras sínteses modeladas por ADN de bibliotecas de moléculas pequenas estruturalmente diversas.

Será notado que as reacções de formação de ligações carbono-carbono são também importantes tanto em sínteses químicas como biológicas e assim várias destas reacções são utilizadas no formato modelado por ADN. Tanto a reacção de reagente ligado a nitroalcano (10) com molde ligado a aldeído (11) (nitro-aldol ou reacção de Henry) como a adição de conjugados de 10 a molde ligado a maleimida (12) (nitroadição 47 ΕΡ 1 423 400 /PT de Michael) prosseguiram eficientemente e com elevada especificidade de sequência a pH 7,5-8,5, 25°C (Figuras 13 e 14). Em adição, a reacção de Wittig modelada por ADN e especifica da sequência entre reagente ileto de fósforo estabilizado 13 e os moldes ligados a aldeído 14 ou 11 proporcionou os correspondentes produtos olefínicos com excelentes rendimentos a pH 6,0-8,0, 25°C (Figuras 13 e 14) . Similarmente, a cicloadição 1,3-dipolar modelada por ADN entre reagentes ligados a nitrona 15 e 16 e moldes ligados a olefina 12, 17 ou 18 também produziu produtos específicos da sequência a pH 7,5, 25°C (Figuras 13 e 14).

Em adição às reacções atrás descritas, reacções de acoplamento organometálico podem também ser utilizadas na presente invenção. Por exemplo, reacções de Heck modeladas por ADN foram realizadas na presença de pré-catalisador de Pd solúvel em água. Na presença de Na2PdCl4 170 mM, o reagente ligado a iodeto de arilo 19 e uma variedade de moldes ligados a olefina incluindo maleimida 12, acrilamida 17, vinilsulfona 8 ou cinamamida 20 originaram produtos de acoplamento de Heck com rendimentos modestos a pH 5,0, 25°C (Figuras 13 e 14). Para acoplamentos com as olefinas 17, 18 e 20, a adição de dois equivalentes de P (p-S03C6H4) 3 por equivalente de Pd antes da adição do molde e do reagente tipicamente aumentou os rendimentos globais em 2 vezes. As reacções de controlo contendo erros de emparelhamento de sequência ou sem o pré-catalisador de Pd não originaram produto. Tanto quanto sabemos, a adição de nitroaldol modelada por ADN anterior, a nitroadição de Michael, a olefinação de Wittig, a cicloadição dipolar e o acoplamento de Heck, representam as primeiras reacções organometálicas e reacções de formação de ligações carbono-carbono, modeladas por ácido nucleico, relatadas, para além da fotodimerização da pirimidina.

Verificou-se anteriormente que as mesmas reacções modeladas por ADN demonstram independência da distância, a capacidade para formar produto a uma velocidade independente do número de bases intermédias entre reagentes hibridados. Colocou-se a hipótese (Figura 16a) de que a independência da distância surge quando a velocidade de formação de ligações na reacção modelada por ADN é maior do que a velocidade de 48 ΕΡ 1 423 400 /PT hibridação molde-reagente. Embora apenas um subconjunto de químicas caiam nesta categoria, qualquer reacção modelada por ADN que produza rendimentos comparáveis de produto quando o reagente é hibridado a várias distâncias da extremidade reactiva do molde tem especial interesse porque pode ser codificada numa variedade de posições do molde. Para avaliar a capacidade das reacções modeladas por ADN atrás desenvolvidas para ocorrer eficientemente quando os reagentes estão separados por distâncias relevantes para codificação da biblioteca, compararam-se os rendimentos de aminação redutora, formação de amida, adição nitroaldólica, nitroadição de Michael, olefinação de Wittig, cicloadição dipolar e acoplamento de Heck, quando zero ou dez bases separavam os grupos reactivos hibridados (Figura 16a, n=0 versus n=10). Entre as reacções descritas atrás ou em trabalhos anteriores, à formação de ligações amida, a adição de nitroaldol, a olefinação de Wittig, o acoplamento de Heck, a adição conjugada de tióis a maleimidas e a reacção SN2 entre tióis e (X-iodamidas, demonstram formação de produto comparável quando os grupos reactivos estão separados por zero ou dez bases (Figura 16b) . Estas verificações indicam que estas reacções podem ser codificadas durante a síntese por nucleótidos que estão distais da extremidade reactiva do molde sem prejudicar significativamente a formação de produto.

Em adição a reacção SN2, a adição conjugada, a adição de vinilsulfona, a formação de ligações amida, a aminação redutora, as reacções nitroaldólicas (reacção de Henry), nitro de Michael, a olefinação de Wittig, a cicloadição 1,3-dipolar e o acoplamento de Heck modeladas por ADN descritas atrás directamente, podem também ser utilizados uma variedade de reagentes adicionais no método da presente invenção. Por exemplo, como representado na Figura 17, poderosas reacções sintéticas aquosas modeladas por ADN incluindo, mas não se lhes limitando, a adição de aldol catalisada por ácido de Lewis, reacção de Mannich, reacções de anulação de Robinson, adições de alil-índio, zinco e estanho a cetonas e aldeídos, substituição alílica assistida por Pd, cicloadições de Diels-Alder e reacções de hetero-Diels-Alder, podem ser utilizadas eficientemente em solvente aquoso e são importantes reacções de construção de complexidade. 49

ΕΡ 1 423 400 /PT

Em conjunto, estes resultados expandem consideravelmente o âmbito reaccional da síntese modelada por ADN. Uma ampla variedade de reacções prosseguiu eficientemente e selectivamente apenas quando os correspondentes reagentes são programados com sequências complementares. Aumentando o repertório de reacções modeladas por ADN conhecidas para incluir agora a formação de ligações carbono-carbono e reacções organometálicas (adição de nitroaldóis, nitroadições de Michael, olefinações de Wittigs, cicloadições dipolares e acoplamento de Hecks) em adição às anteriormente relatadas formação de ligações amida (veja-se, Schmidt et al. Nucleic Acids Res. 1997, 25, 4792; Bruick et al. Chem. Biol. 1996, 3, 49), formação de imina (Czlapinski et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 8618), aminação redutora (Li et al. J. Am. Chem.

Soc. 2002,124, 746; Gat et al. Biopolymers, 1998, 48, 19), reacções SN2 (Gartner et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961; Xu et al. Nat. Biotechnol. 2001,19, 148; Herrlein et al. J. Am. Chem. Soc. 1995,117, 10151) adição conjugada de tióis (Gartner et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961), e formação de fosfoéster ou fosfonamida (Orgel et al. Acc. Chem. Res. 1995, 28, 109; Luther et al. Nature, 1998, 396, 245), estes resultados podem permitir a tradução específica da sequência de bibliotecas de ADN em bibliotecas de produtos sintéticos estrutural e funcionalmente diversos. Como quantidades diminutas de moldes que codificam moléculas desejadas podem ser amplificadas por PCR, os rendimentos das reacções modeladas por ADN são argumentativamente menos críticos do que os rendimentos de transformações sintéticas tradicionais. Apesar disso, muitas das reacções atrás desenvolvidas prosseguem eficientemente. Em adição, demonstrando que a síntese modelada por ADN na ausência de proteínas pode dirigir uma grande diversidade de reacções químicas, estas verificações suportam as hipóteses anteriormente colocadas de que a síntese modelada por ácido nucleico pode ter traduzido informação replicável em algumas das primeiras moléculas funcionais tais como policetidas, terpenos e polipéptidos, antes da evolução de enzimas à base de proteína. A diversidade da química aqui mostrada como sendo controlável simplesmente juntando os reagentes por hibridação de ADN sem requisitos estruturais óbvios proporciona uma base experimental para estas possibilidades. A tradução de informação amplificável numa ampla gama de estruturas é um requisito chave para a 50 ΕΡ 1 423 400 /PT aplicação da abordagem de evolução molecular da Natureza à identificação de moléculas não naturais com novas funções. Métodos para Reacções Exemplificativas para Utilização em Síntese Modelada por ADN:

Os moldes e reagentes funcionalizados foram tipicamente preparados por reacção de oligonucleótidos terminados com 5'-NH2 (para o molde 1), oligonucleótidos terminados com 5'-NH2-(CH2O)2 (para todos os outros moldes) ou nucleótidos terminados com 3' -OPO3-CH2CH (CH2OH) (CH2) 4NH2 (para todos os reagentes) com os ésteres de NHS apropriados (0,1 volumes de uma solução a 20 mg/mL em DMF) em tampão fosfato de sódio 0,2 M, pH 7,2, 25°C, 1 h para proporcionar as estruturas do molde e do reagente mostradas nas Figuras 13 e 15. Para reagentes ligados a aminoácidos, 6-9, oligonucleótidos terminados com 3 ' -0P03CH2CH (CH2OH) (CH2) 4NH2 em tampão fosfato de sódio 0,2 M, pH 7,2 foram feitos reagir com 0,1 volumes de uma solução 100 mM de bis[2-(succinimidiloxicarboniloxi)-etiljsulfona (BSOCOES, Pierce) em DMF durante 10 min a 25°C, seguida de 0,3 volumes de um aminoácido 300 mM em NaOH 300 mM durante 30 min a 25°C.

Os moldes e os reagentes funcionalizados foram purificados por filtração em gel utilizando Sephadex G-25 seguida por HPLC de fase inversa (0,1 gradiente de acetato de trietilamónio-acetonitrilo) e caracterizados por espectrometria de massa MALDI. As reacções modeladas por ADN foram conduzidas sob as condições descritas nas Figuras 13 e 15 e os produtos foram caracterizados por electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante e espectrometria de massa MALDI. 13 16,

As seguências de moldes oligonucleotidicos e reagentes são as seguintes (no sentido de 5' para 3', n refere-se ao número de bases entre grupos reactivos guando molde e reagente estão hibridados como mostrado na Figura 16). 1: TGGTACGAATTCGACTCGGG; 2 e 3 emparelhadas: GAGTCGAATTCGTACC; 2 e 3 mal emparelhadas: GGGCTCAGCTTCCCCA; 4 e 5: GGTACGAATTCGACTCGGGAATACCACCTT; 6-9 emparelhadas (n = 10) : TCCCGAGTCG; 6 emparelhadas (n = 0): AATTCGTACC; 6-9 mal emparelhadas: TCACCTAGCA; 11, 12, 14, 17, 18, 20: GGTACGAATTCGACTCGGGA; 10, 13, 16, 19 emparelhadas: 51

ΕΡ 1 423 400 /PT TCCCGAGTCGAATTCGTACC; 10, 13 16, 19 mal emparelhadas: GGGCTCAGCTTCCCCATAAT; 15 emparelhadas: AATTCGTACC; 15

emparelhadas: TCGTATTCCA; molde para comparação de n = 10 vs. n = 0: TAGCGATTACGGTACGAATTCGACTCGGGA

Os rendimentos da reacção quantificaram-se por electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante seguida por coloração com brometo de etidio, visualização sob UV e densitometria baseada em CCD de bandas de material de partida de molde produto. Nos cálculos do rendimento assumiu-se que os moldes e produtos coraram com igual intensidade por base; para os casos em que produtos formam parcialmente cadeias duplas durante a quantificação, alterações na intensidade de coloração podem resultar em rendimentos aparentes superiores.

Exemplo 3: Desenvolvimento de Ligantes Exemplificativos:

Como será notado por uma pessoa competente na matéria, é frequentemente útil deixar a porção de ADN dos reagentes ligada aos produtos durante o desenvolvimento da reacção para facilitar a análise por electroforese em gel. A utilização de sintese modelada por ADN para traduzir bibliotecas de ADN nas correspondentes bibliotecas de moléculas pequenas sintéticas adequadas para selecção in vitro, contudo, requer o desenvolvimento de ligantes cliváveis a ligar grupos reactivos de reagentes com os seus oligonucleótidos de ADN de descodificação. Como descrito adiante e aqui, foram desenvolvidos três tipos exemplificativos de ligantes (veja-se a Figura 18) . Para reagentes com um grupo reactivo, seria desejável posicionar o ADN como grupo rejeitado relativamente à porção reactiva. Nesta estratégia de ligante "auto-clivável", a ligação ADN-grupo reactivo é clivada como consequência natural da reacção. Apenas como um exemplo desta abordagem, sintetizou-se uma reagente fosforano de Wittig fluorescente (14, com referência à Figura 19) em que o oligonucleótido de ADN de descodificação foi ligado a um dos grupos arilo da fosfina (veja-se a Figura 19, à esquerda). A reacção de Wittig modelada por ADN com moldes ligados a aldeído resultou na transferência quase quantitativa do grupo fluorescente do reagente de Wittig para o molde e na libertação simultânea do produto alceno da porção ADN do reagente. Adicionalmente, reagentes portadores de mais do que um grupo reactivo podem ser ligados aos seus oligonucleótidos 52

ΕΡ 1 423 400 /PT de ADN de descodificação através de uma de duas estratégias de ligantes adicionais. Na estratégia de ligante "sem resíduo", a reacção modelada por ADN de um grupo reactivo é seguida por clivagem do ligante ligado através de um segundo grupo reactivo para obter os produtos sem deixar para trás uma funcionalidade química adicional. Por exemplo, sintetizaram-se uma série de reagentes aminoácidos que foram ligados através de um ligante carbamoíletilsulfona aos seus oligonucleótidos de ADN de descodificação (Figura 19, ao centro). Os produtos da formação modelada por ADN de ligações amida utilizando estes reagentes aminoácidos foram tratados com tampão alcalino aquoso para efectuar a eliminação quantitativa e a descarboxilação espontânea do grupo carbamoílo. O produto que deixa este ligante "sem resíduo" é portanto a porção aminoácido transferida de forma limpa. Em ainda outra concretização da invenção, numa terceira estratégia de ligantes, pode ser utilizado um "resíduo útil", na teoria de que pode ser vantajoso introduzir grupos químicos úteis como consequência da clivagem de ligantes. Em particular, um "resíduo útil" pode ser funcionalizado em passos subsequentes e é deixado para trás após a clivagem do ligante. Por exemplo, foram gerados reagentes aminoácido ligados através de 1,2-dióis aos seus oligonucleótidos de ADN de descodificação. Após a formação de ligações amida, este ligante foi clivado quantitativamente por oxidação com NaI04 para produzir produtos portadores de grupos aldeído úteis (veja-se a Figura 19, à direita). Em adição aos ligantes directamente descritos atrás, podem-se utilizar uma variedade de ligantes adicionais. Por exemplo, como mostrado na Figura 20, pode ser gerado um ligante tioéster por acoplamento mediado por carbodiimida de ADN terminado com tiol com reagentes contendo carboxilato e pode ser clivado com base aquosa. Como o grupo carboxilato proporciona uma entrada nas reacções de formação de ligações amida modeladas por ADN descritas atrás, este ligante libertará um "resíduo útil" quando clivado (veja-se a Figura 20). Alternativamente, o ligante tioéster pode ser utilizado como ligante autoclivável durante uma reacção de acilação de amina na presença de catiões Ag(I) (veja-se, Zhang et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 3311-3320) pois a porção tiol-DNA do reagente é libertada como consequência natural da reacção. Notar-se-á que um ligante tioéter que pode ser oxidado e eliminado a pH 11 para libertar uma vinilsulfona 53 ΕΡ 1 423 400 /PT pode ser utilizado como ligante de "resíduo útil". Como aqui demonstrado, o grupo vinilsulfona serve como substrato em várias reacções modeladas por ADN subsequentes.

Exemplo 4: Reacções Exemplificativas em Solventes Orgânicos:

Como aqui demonstrado, podem ocorrer uma variedade de reacções modeladas por ADN em meios aquosos. Demonstrou-se também, como discutido adiante, que as reacções modeladas por ADN podem ocorrer em solventes orgânicos, expandindo assim grandemente o âmbito da síntese modelada por ADN. Especificamente, moldes de ADN e reagentes foram complexados com catiões tetra-alquilamónio de cadeia longa (veja-se, Jost et al. Nucleic Acids Res. 1989, 17, 2143; Mel'nikov et al.

Langmuir, 1999, 15, 1923-1928) para permitir a dissolução quantitativa de componentes da reacção em solventes orgânicos anidros incluindo CH2CI2, CHCI3, DMF e MeOH. Surpreendentemente, verificou-se que a síntese modelada por ADN pode de facto ocorrer em solventes orgânicos anidros com elevada selectividade de sequência. Estão representadas na Figura 21 reacções modeladas por ADN de formação de ligações amida em que reagentes e moldes são complexados com catiões dimetildidodecilamónio quer em vasos separados quer após pré-hibridação em água, liofilizados até à secura, dissolvidos em CH2CI2 e misturados. Reacções emparelhadas, mas não mal emparelhadas, proporcionaram produtos tanto quando os reagentes eram pré-hibridados em solução aquosa como quando eram misturados pela primeira vez em CH2CI2 (veja-se a

Figura 21) . A formação de amidas e o acoplamento de Heck mediado por Pd em DMF anidra, modelados por ADN, também prosseguiram de modo específico da sequência. Claramente, estas observações de síntese modelada por ADN específica da sequência em solventes orgânicos implicam a presença de pelo menos alguma estrutura secundária no ADN complexado com tetra-alquilamónio em meios orgânicos, e deverão permitir que sejam evoluídos receptores e catalisadores de ADN no sentido da ligação estereosselectiva ou propriedades catalíticas em solventes orgânicos. Especificamente, as reacções modeladas por ADN que se sabe ocorrerem em meios aquosos, incluindo adições de conjugados, cicloadições, reacções de deslocamento e acoplamentos mediados por Pd, podem também ser realizadas em solventes orgânicos. Em certas outras concretizações, podem ser utilizadas reacções em solventes orgânicos que são 54

ΕΡ 1 423 400 /PT ineficientes ou impossíveis de realizar em água. Por exemplo, embora a metatese de olefinas catalisada por Ru em água tenha sido relatada por Grubbs e colaboradores (veja-se, Lynn et al. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1627-1628; Lynn et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 6601-6609; Mohr et al. Organometallics 1996, 15, 4317-4325) , o sistema de metatese aquosa é extremamente sensível aos grupos funcionais. A tolerância ao grupo funcional da metatese de olefinas catalisada por Ru em solventes orgânicos, contudo, é significativamente mais robusta. Algumas reacções exemplificativas para utilização em solventes orgânicos incluem, mas não se lhes limitam, cicloadição 1,3-dipolar entre nitronas e olefinas, que pode prosseguir através de estados de transição que são menos polares do que os materiais de partida no estado fundamental.

Como detalhado atrás, a generalidade da síntese modelada por ADN foi estabelecida realizando vários tipos distintos de reacções modeladas por ADN, nenhum limitado à produção de estruturas que se assemelham à estrutura principal do ácido nucleico natural, e muitas sendo reacções altamente úteis de formação de ligações carbono-carbono ou sintéticas de construção de complexidade. Mostrou-se que a independência da distância da síntese modelada por ADN permite que diferentes regiões de um molde de ADN codifiquem diferentes reacções sintéticas. A síntese modelada por ADN pode manter a fidelidade da sequência mesmo num formato de biblioteca em que mais de 1 000 moldes e 1 000 reagentes reagem simultaneamente num só vaso. Como descrito atrás e adiante, foram desenvolvidas estratégias de ligantes, as quais, juntamente com as reacções desenvolvidas como se descreveu atrás, permitiram a primeira síntese modelada por ADN em múltiplos passos de moléculas pequenas sintéticas simples.

Adicionalmente, a síntese modelada por ADN específica da sequência em solventes orgânicos foi demonstrada, expandindo adicionalmente o âmbito desta abordagem.

Exemplo 5: Síntese de Compostos e Bibliotecas de Compostos Exemplificativos: A) Síntese de uma Biblioteca de Policarbamato: Uma concretização da estratégia descrita atrás é a criação de uma biblioteca de policarbamato amplificável. Dos dezasseis 55

ΕΡ 1 423 400 /PT possíveis dinucleótidos utilizados para codificar a biblioteca, um é atribuído a uma função de codão de iniciação, e um é atribuído para servir como codão de paragem. É então criado um código genético artificial atribuindo cada um dos até 14 dinucleótidos restantes a um monómero diferente. Por razões geométricas, um monómero contém realmente um dicarbamato contendo duas cadeias laterais. No interior de cada monómero, o dicarbamato é ligado ao correspondente dinucleótido (análogo a um anti-codão de ARNt) através de um ligante de éter de sililenol que liberta o ADN nativo e o carbamato livre por tratamento com fluoreto. A porção dinucleótido existe na forma de fosfato de 5'-2-metilimidazole activado, que se demonstrou (Inoue et al. J. Mol. Biol. 162:201, 1982; Rembold et al. J. Mol. Evol. 38:205, 1994; Chen et al. J. Mol. Biol. 181:271, 1985; Acevedo et al. J. Mol.

Biol. 197:187, 1987; Inoue et al. J. Am. Chem. Soc. 103:7666, 1981; servir como um excelente grupo rejeitado para oligomerização de nucleótidos dirigida por moldes e ainda relativamente estável sob condições aquosas neutras ou básicas (Schwartz et al. Science 228:585, 1985;). A porção dicarbamato existe numa forma cíclica ligado através de um ligante de viniloxicarbonato. Demonstrou-se que o grupo vinilcarbonato é estável em condições aquosas neutras ou básicas (Olofson et al. Tetrahedron Lett. 18:1563, 1977; Olofson et al.

Tetrahedron Lett. 18:1567, 1977; Olofson et al. Tetrahedron

Lett. 18:1571, 1977;) e mostrou-se ainda que proporciona carbamatos com rendimentos muito elevados por adição de aminas (Olofson et al. Tetrahedron Lett. 18:1563, 1977;). 56

ΕΡ 1 423 400 /PT r

Me grupo rejeitado para polimerização . de ADN

O aceita o nucleófilo para a polimerização de carbamato; liberta um novo nucleófilo quando atacado

Quando atacado por uma amina a partir de uma cadeia policarbamato nascente, o ligante vinilcarbonato, conduzido pela aromatização de m-cresol, liberta uma amina livre. Esta amina livre serve subsequentemente como nucleófilo para atacar o viniloxicarbonato seguinte, propagando a polimerização da cadeia carbamato crescente. Esta estratégia minimiza o potencial para polimerização com reactividade cruzada e bidireccional assegurando que apenas um nucleófilo está presente em cada momento durante a polimerização.

Utilizando o monómero descrito atrás, a tradução artificial de ADN num policarbamato pode ser vista como um processo em três etapas. Na primeira etapa, utilizam-se moldes de ADN de cadeia simples que codificam a biblioteca para guiar a montagem e a polimerização das porções dinucleótido dos monómeros, terminando com o monómero de "paragem" que possui um éter 3'-metilico em vez de um grupo 3'-hidroxilo (Figura 22) .

Uma vez montados e polimerizados os nucleótidos no ADN de cadeia dupla, o monómero de "iniciação" que termina num o-nitrobenzilcarbamato é fotodesprotegido para revelar a amina 57

ΕΡ 1 423 400 /PT

primária que inicia a polimerização de carbamato. A polimerização prossegue no sentido de 5' para 3' ao longo da estrutura principal de ADN, com cada ataque nucleófilo resultando no subsequente desmascarar de um novo nucleófilo de amina. O ataque do monómero de "paragem" liberta uma acetamida em vez de uma amina, terminando deste modo a polimerização (Figura 23) . Como o ADN nesta etapa existe numa forma de cadeia dupla estável, variáveis como temperatura e pH podem ser exploradas para optimizar a eficiência da polimerização.

Após a polimerização o policarbamato é clivado da estrutura principal de fosfato do ADN por tratamento com fluoreto. A dessililação do ligante enoléter e a eliminação do fosfato conduzidas pela resultante libertação de fenol proporcionam o policarbamato ligado covalentemente pelo seu terminal carboxi ao seu ADN de codificação de cadeia simples (Figura 24).

Nesta etapa o policarbamato pode ser completamente libertado do ADN por hidrólise básica da ligação éster. O policarbamato libertado pode ser purificado por HPLC e novamente testado para verificar que as suas propriedades desejadas estão intactas. O ADN livre pode ser amplificado utilizando PCR, mutado com PCR propensa a erros (Cadwell et al. PCR Methods Appl. 2:28, 1992;) ou rearranjo de ADN (Stemmer Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747, 1994; Stemmer

Nature 370:389, 1994; Patente U.S. 5 811 238, concedida em 22 de Setembro, 1998;), e/ou sequenciado para revelar a estrutura primária do policarbamato. Síntese de unidades monoméricas. Depois de sintetizados os monómeros, a montagem e a polimerização dos monómeros sobre o esqueleto de ADN deverá ocorrer espontaneamente. Ácido chiquímico 1, disponível comercialmente, biossinteticamente (Davis Adv. Enzymol. 16:287, 1955; incorporado aqui por referência), ou por sínteses curtas a partir de D-manose (Fleet et al. J. Chem. Soc., Perkins Trans. I 905, 1984;

Harvey et al. Tetrahedron Lett. 32:4111, 1991;), serve como um conveniente ponto de partida para a síntese de monómeros. Os grupos hidroxilo syn são protegidos na forma de p-metoxibenzilideno, e o remanescente grupo hidroxilo na forma de éter terc-butildimetilsilílico para produzir 2. A porção 58 ΕΡ 1 423 400 /PT carboxilato do ácido chiquímico protegido é então reduzida completamente por redução com LAH, tosilação do álcool resultante e redução adicional com LAH para proporcionar 3.

1 2 3

Aminoácidos N-protegidos comercialmente disponíveis e sinteticamente acessíveis servem como materiais de partida para a porção dicarbamato de cada monómero. As cadeias laterais reactivas são protegidas como éteres, ésteres, acetais, carbamatos ou tioéteres fotolábeis. Seguindo químicas previamente desenvolvidas (Cho et al. Science 261:1303, 1993;), um aminoácido 4 desejado é convertido no correspondente aminoálcool 5 por formação de anidrido misto com cloroformato de isobutilo seguida de redução com boro-hidreto de sódio. O aminoálcool é então convertido no carbonato activado por tratamento com p-nitrofenilcloroformato para produzir 6, que é então acoplado a um segundo aminoálcool 7 para proporcionar, após sililação do grupo hidroxilo e desprotecção de FMOC, o carbamato 8. || !)<-Buocoa ^yvruoc t )ρ>^. piridina

O

»OrT *z

O 2) TESCl, imid. 3) piperidina O acoplamento do carbamato 8 ao ligante derivado de ácido chiquímico prossegue como se segue. O grupo hidroxilo alílico de 3 é desprotegido com TBAF, tratado com anidrido tríflico para formar o triflato secundário, depois é deslocado com aminocarbamato 8 para originar 9. A presença do grupo metilo 59

ΕΡ 1 423 400 /PT vinílico em 3 deve ajudar a minimizar a quantidade de produto indesejado resultante da adição SN2' (Magid Tetrahedron 36:1901, 1980;). As adições de Michael de carbamatos

desprotonados a ésteres a,β-insaturados foram bem documentadas (Collado et al. Tetrahedron Lett. 35:8037, 1994; Hirama et al. J. Am. Chem. Soc. 107:1797, 1985; Nagasaka et ai. Heterocycles 29:155, 1989; Shishido et ai. J. Chem. Soc. Perkins Trans. I 993, 1987; Hirama et al. Heterocycles 28:1229, 1989; ). Em

analogia, a amina secundária é protegida como carbamato de o-nitrobenzilo (NBOC), e o composto resultante é desprotonado no azoto do carbamato. Esta desprotonação pode tipicamente ser realizada com hidreto de sódio ou terc-butilóxido de potássio (Collado et al. Tetrahedron Lett. 35:8037, 1994; Hirama et al. J. Am. Chem. Soc. 107:1797, 1985; Nagasaka et al. Heterocycles 29:155, 1989; Shishido et al. J. Chem. Soc. Perkins Trans. I 993, 1987; Hirama et al. Heterocycles 28:1229, 1989;), embora possam ser utilizadas outras bases para minimizar a desprotonação dos protões nitrobenzilicos. As adições do carbamato desprotonado na cetona a,β-insaturada 10, seguida de aprisionamento do enolato resultante com TBSC1, deverão originar o sililenoléter 11. A estereosselectividade previamente encontrada de adições de conjugados a enonas substituídas em 5 tais como 10 (House et ai. J. Org. Chem. 33:949, 1968; Still et al. Tetrahedron 37:3981, 1981;) sugere a formação preferencial de 11 relativamente ao seu diastereómero. A cetona 10, o precursor do ligante carbamato-fosfato clivável com fluoreto, pode ser sintetizado a partir de 2 por descarboxilação num só vaso (Barton et ai. Tetrahedron 41:3901, 1985;) seguida por tratamento com TBAF, oxidação de Swem do álcool resultante para produzir 12, desprotecção com DDQ, formação selectiva de éter nitrobenzílico do álcool menos impedido, e redução do grupo α-hidroxilo com iodeto de samário (Molander em Organic Reactions, Paquette, Ed. 46:211, 1994; ). 60

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Ο grupo p-metoxibenzilidieno de 11 é transformado no éter OC-hidroxi-PMB utilizando cianoboro-hidreto de sódio e cloreto de TMS (Johansson et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 2371, 1984;) e o grupo TES desprotegido com HF a 2% (condições que não deverão afectar o éter TBS (Boschelli et al. Tetrahedron Lett. 26:5239, 1985;)) para proporcionar 13. O grupo PMB, seguindo o precedente (Johansson et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 2371, 1984; Sutherlin et al. Tetrahedron Lett. 34:4897, 1993; ), deverá permanecer no álcool secundário mais impedido. Os dois grupos hidroxilo livres podem ser macrociclizados por adição muito lenta de 13 a uma solução de cloroformato de p-nitrofenilo (ou outro análogo de fosgénio), proporcionando 14. O éter PMB é desprotegido, e o álcool resultante é convertido num triflato e eliminado sob condições cinéticas com uma base estereoquimicamente impedida para produzir o viniloxicarbonato 15. A fotodesprotecção do éter de nitrobenzilo e do carbamato de nitrobenzilo originam o álcool 16. 61

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A síntese do monómero é completada pelo acoplamento sequencial de três componentes. A clorodiisopropilaminofosfina 17 é sintetizada pela reacção de PCI3 com diisopropilamina (King et al. J. Org. Chem. 49:1784, 1984;) . O nucleósido 18 ligado à resina (ou protegido com 3'-o-nitrobenziléter) é acoplado a 17 para originar o fosforamidito 19. O subsequente acoplamento de 19 com o nucleósido 20 (Inoue et ai. J. Am. Chem. Soc. 103:7666, 1981;) proporciona 21. O álcool 16 é então feito reagir com 21 para obter, após cuidadosa oxidação utilizando MCPBA ou I2 seguida de clivagem da resina (ou fotodesprotecção) , o monómero 22 completo. Esta estratégia de acoplamento sequencial de 17 com álcoois foi utilizada com sucesso para gerar fosfatos portadores de três diferentes substituintes alcoxi com excelentes rendimentos (Bannwarth et ai. Helv. Chim. Acta 70 :175, 1987;) . 62

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Os únicos monómeros de iniciação e paragem utilizados para iniciar e terminar a polimerização de carbamato podem ser sintetizados por modificação simples do esquema anterior. B) Péptido-Ácido Nucleico (PNA) Funcionalizados Evoluíveis: Noutra concretização é criada uma biblioteca de péptido-ácido nucleico amplificável. Orgel e colaboradores demonstraram que os oligómeros péptido-ácido nucleico (PNA) são capazes de polimerização eficiente sobre moldes de ARN ou ADN complementar (Bõhler et al. Nature 376:578, 1995; Schmidt et al. Nucl. Acids Res. 25:4792, 1997;). Esta verificação, juntamente com a recente síntese e caracterização de péptido-ácido nucleico quirais portadores de cadeias laterais de aminoácidos (Haaima et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:1939-1942, 1996; Puschl et al. Tetrahedron Lett. 39:4707, 1998;), permitem a união do esqueleto do polímero com a cadeia de ácido nucleico em crescimento numa única estrutura. Neste exemplo, cada molde consiste num "gancho de cabelo" de ADN terminando num grupo 5'-amino; as sínteses em fase sólida e em solução destas moléculas foram previamente descritas (Uhlmann et al. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 35:2632, 1996;)· Cada monómero de extensão consiste num trímero de PNA (ou maior) portador de cadeias laterais contendo a funcionalidade de interesse. É escrito um código genético artificial para atribuir cada trinucleótido a um diferente conjunto de cadeias laterais. A montagem, a activação (com uma carbodiimida e um grupo rejeitado apropriados, por exemplo), e a polimerização dos dímeros de PNA juntamente com o molde de 63

ΕΡ 1 423 400 /PT ADN complementar no sentido do terminal carboxi para o amino produzem o polímero não natural (Figura 20). Escolhendo um monómero de "paragem" com um terminal N biotinilado proporciona-se uma maneira conveniente de terminação da extensão e purificação dos polímeros de comprimento completo. Os polímeros resultantes, ligados covalentemente ao seus ADN de codificação, estão prontos para selecção, sequenciação ou mutação. A abordagem experimental no sentido da implementação de uma biblioteca de péptido-ácido nucleico funcionalizados evoluível compreende (i) melhorar e adaptar químicas conhecidas para a polimerização de alta eficiência dirigida por moldes de PNA; (ii) definir um formato de codão (comprimento e composição) adequado para o acoplamento de PNA de um número de diversos monómeros numa cadeia complementar de ADN de codificação livre de infidelidade, desvio de enquadramento ou falsa iniciação da polimerização significativas; (iii) escolher um conjunto inicial de cadeias laterais que definem o nosso novo código genético e sintetizar os monómeros correspondentes; e (iv) submeter uma biblioteca de PNA funcionalizados a ciclos de selecção, amplificação e mutação e caracterizar as moléculas evoluídas resultantes para entender a base das suas novas actividades. (1) Melhorar a química do acoplamento: Embora Orgel e colaboradores tenham relatado a polimerização de PNA dirigida por moldes, os rendimentos e números de acoplamentos bem sucedidos relatados são significativamente inferiores aos que seriam desejados. Uma via promissora no sentido de melhorar este processo de acoplamento chave consiste em explorar novos reagentes, temperaturas e solventes de acoplamento que não foram anteriormente investigados (presumivelmente porque os esforços anteriores se focaram em condições que poderiam ter existido na terra pré-biótica). O desenvolvimento de polímeros de PNA funcionalizados evoluíveis envolve o emprego de activadores (DCC, DIC, EDC, HATU/DIEA, HBTU/DIEA, ByBOP/DIEA, cloroacetonitrilo), grupos rejeitados (2-metilimidazole, imidazole, pentafluorofenol, fenol, tiofenol, trifluoroacetato, acetato, ácidos toluenossulfónicos, coenzima A, DMAP, ribose), solventes (aquosos a vários valores de pH, DMF, DMSO, clorofórmio, TFE), e temperatura (0°C, 4°C,

ΕΡ 1 423 400 /PT 6 4 25°C, 37°C, 55°C) num grande rastreio combinatório para isolar novas condições de acoplamento. Cada poço de uma placa de 384 poços é atribuído a uma combinação específica de um activador, um grupo rejeitado, um solvente e uma temperatura. Contas de síntese em fase sólida ligadas covalentemente a moldes em “ganchos de cabelo" de ADN são colocadas em cada poço, juntamente com um monómero de PNA marcado com fluorescência complementar ao molde. Um evento de acoplamento bem sucedido resulta na ligação covalente do fluoróforo às contas (Figura 26); o acoplamento indesejado não modelado pode ser distinguido por reacções de controlo com monómeros mal emparelhados. Após a lavagem das contas e a clivagem do produto do suporte sólido, cada poço é ensaiado num leitor de fluorescência para placas. (ii) Definir um formato de codão: Embora a Natureza tenha empregue com sucesso um codão tripleto na biossíntese de proteínas, um novo polímero montado sob condições muito diferentes sem o auxílio de enzimas pode requerer um formato de codão inteiramente novo. O desvio de enquadramento pode ser remediado pelo alongamento de cada codão de modo a que a hibridação de um codão fora do enquadramento garanta um erro de emparelhamento (por exemplo, começando cada codão com uma G e restringindo as posições subsequentes no codão a T, C e A) . Termodinamicamente, poder-se-ia também esperar que a fidelidade melhorasse à medida que o comprimento do codão aumenta até um certo ponto. Os codões que são excessivamente longos, contudo, serão capazes de hibridar apesar de bases mal emparelhadas e além disso complicar a síntese dos monómeros. Um comprimento de codão óptimo para elevada fidelidade de tradução artificial pode ser definido utilizando um rastreio combinatório à base de placas optimizado desenvolvido atrás. O comprimento e a composição de cada codão no molde é variada por síntese em fase sólida do “gancho de cabelo" de ADN apropriado. Estes “ganchos de cabelo" molde são então deixados acoplar com monómeros de PNA marcados com fluorescência de várias sequências. O formato de codão ideal permite que apenas monómeros portadores de sequências exactamente complementares acoplem com os moldes, mesmo na presença de monómeros de PNA mal emparelhados (que são marcados de forma diferente para facilitar o ensaio de acoplamento emparelhado versus mal emparelhado). Codões tripleto e quadrupleto em que duas bases 65 ΕΡ 1 423 400 /PT são variadas entre A, T e C enquanto as restante base ou bases são fixadas como G para assegurar o registo correcto durante a polimerização são estudadas primeira. (iii) Escrever um novo código genético: São escolhidas cadeias laterais que proporcionam funcionalidades interessantes não necessariamente presentes em biopolimeros naturais, que são sinteticamente acessíveis, e que são compatíveis com as condições de acoplamento. Por exemplo, um código genético simples que pode ser utilizado para evoluir um PNA quelante de Ni+2 consiste numa variedade de cadeias laterais portadoras de carboxilato protegidas assim como um conjunto de pequenas cadeias laterais para equipar os polímeros com flexibilidade conformacional e diversidade estrutural (Figura 27). A selecção bem sucedida de PNA capazes de ligar Ni+2 com elevada afinidade pode ser seguida por uma expansão deste código genético para incluir um fluoróforo assim como um extintor de fluorescência. Os polímeros resultantes podem então ser evoluídos no sentido de um sensor fluorescente de Ni+2 que possui diferentes propriedades fluorescentes na ausência ou na presença de níquel. A substituição da cadeia lateral fluorescente por uma fotocapturada pode permitir a evolução de polímeros que formam quelatos de Ni+2 na presença de certos comprimentos de onda de luz ou que libertam Ni+2 por fotólise. Estes exemplos simples demonstram a tremenda flexibilidade de potenciais propriedades químicas de moléculas não naturais evoluíveis conferida pela liberdade de incorporar blocos de construção sintéticos já não limitados aos compatíveis com a maquinaria do ribossoma. (iv) Seleccionar os polímeros não naturais desejados: Muitos dos métodos desenvolvidos para a selecção de moléculas biológicas podem ser aplicados a selecções de PNA evoluídos com propriedades desejadas. Tal como as selecções de ácido nucleico ou de exibição em fagos, as bibliotecas de polímeros não naturais geradas pelos métodos de polimerização modelada por ADN atrás descritos são auto-marcados e portanto não necessitam de estar espacialmente separados ou ser sintetizados sobre pinos ou contas. A ligação de Ni+2 a PNA pode ser realizada simplesmente passando toda a biblioteca resultante da tradução ou um oligonucleótido aleatório através 66 ΕΡ 1 423 400 /PT de uma resina comercialmente disponível de Ni-NTA ("His-Tag") pré-carregada com níquel. As moléculas desejadas ligam-se à resina e são eluídas com EDTA. A sequenciação destes PNA após vários ciclos de selecção, mutagénese e amplificação revela quais das cadeias laterais inicialmente escolhidas se podem montar para formar um receptor de Ni+2. Em adição, o isolamento de um PNA quelante de Ni+2 representa o PNA equivalente de um marcador de histidina que se pode provar útil para a purificação de subsequentes polímeros não naturais. Esforços posteriores envolverão selecções mais ambiciosas. Por exemplo, os PNA que fluorescem na presença de ligandos específicos podem ser seleccionados por classificação FACS de polímeros traduzidos ligados através dos seus moldes de ADN a contas. Essas contas que fluorescem na presença, mas não na ausência, do ligando alvo, são isoladas e caracterizadas. Finalmente, a utilização de um monómero de "paragem" biotinilado como descrito atrás permite a selecção directa para a catálise de muitas reacções de formação de ligações ou de quebra de ligações. Dois exemplos representados na Figura 28 delineiam uma selecção de um PNA funcionalizado que catalisa a clivagem retroaldólica de frutose-1,6-bifosfato em gliceraldeído-3-fosfato e di-hidroxiacetona-fosfato, um passo essencial na glicólise, assim como uma selecção de PNA que catalisam a reacção aldólica inversa. C) Bibliotecas de Moléculas Pequenas Evoluíveis: Em ainda outra concretização da presente invenção, os métodos da invenção são utilizados na preparação de moléculas amplificáveis e evoluíveis não poliméricas não naturais incluindo esqueletos de drogas sintéticos. Os grupos nucleófilos ou electrófilos são individualmente desmascarados num esqueleto de molécula pequena ligado por ligação covalente simples ou através de um suporte sólido comum a um molde oligonucleotídico de codificação. Os reagentes electrófilos ou nucleófilos ligados a sequências de ácido nucleico curtas são hibridados com os moldes correspondentes. A reacção específica da sequência com o reagente apropriado ocorre por catálise de proximidade (Figura 29) .

Após a funcionalização sintética de todas as posições de uma maneira determinada pela sequência do ADN ligado (Figuras 30 & 31), as contas codificadas resultantes podem ser 67 ΕΡ 1 423 400 /PT submetidas a uma ampla gama de rastreios biológicos que foram desenvolvidos para ensaiar compostos sobre resinas. (Gordon et al. J. Med. Chem. 37:1385, 1994; Gallop et al. J. Med. Chem. 37:1233-1251, 1994; ) O ADN de codificação é clivado de cada conta identificada no rastreio e submetido a PCR, mutagénese, sequenciação ou recombinação homóloga antes da nova ligação a um suporte sólido. Finalmente, este sistema é muito flexível quando o ADN de codificação é ligado directamente ao esqueleto combinatório sintético sem uma conta intermédia. Neste caso, bibliotecas de compostos inteiras podem ser rastreadas ou seleccionadas quanto a actividades desejadas, o seu ADN de codificação libertado, amplificado, mutado e recombinado, e novos compostos sintetizados todos numa pequena série de reacções massivamente paralelas, num só vaso. Sem uma conta de suporte, contudo, as reactividades de reagentes hibridados têm que ser altamente eficientes pois apenas uma molécula molde dirige a síntese da molécula pequena completa. O desenvolvimento de bibliotecas de moléculas pequenas sintéticas evoluíveis assenta na catálise química proporcionada pela proximidade dos reagentes hibridados ao ADN. Notar-se-á que as distâncias aceitáveis entre reagentes hibridados e grupos reactivos desmascarados têm que ser primeiro definidas para uma eficiente funcionalização modelada por ADN por hibridação com electrófilos radiomarcados (ésteres activados nas primeiras tentativas) ligados a oligonucleótidos curtos a várias distâncias do nucleófilo reactivo (uma amina primária) numa cadeia de ADN. Em determinados pontos temporais, alíquotas são submetidas a electroforese em gel e autorradiografia para monitorar o decorrer da reacção. A representação da reacção em função da distância (em bases) entre o nucleófilo e o electrófilo definirá uma janela de distâncias aceitáveis dentro da qual a catálise baseada na proximidade de uma reacção hibridada a ADN pode ocorrer. A largura desta janela determinará o número de reacções distintas que se podem codificar numa cadeia de ADN (uma janela mais larga permite mais reacções) assim como a natureza dos codões (é necessária uma janela mais larga para codões maiores) (Figura 32). 68

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Uma vez determinadas as distâncias aceitáveis entre grupos funcionais num esqueleto sintético combinatório e reagentes hibridados, é determinado o formato do codão. A natureza não polimérica da síntese das moléculas pequenas simplifica a leitura dos codões pois o desvio de enquadramento não é uma questão e podem ser utilizados codões relativamente grandes para assegurar que cada conjunto de reagentes híbrida apenas com uma região da cadeia de ADN de codificação.

Uma vez determinados a distância do ligante entre o grupo funcional e o esqueleto de molécula pequena sintética e o formato de codão, podem-se sintetizar moléculas pequenas baseadas num esqueleto de molécula pequena tal como o esqueleto de cefalosporina mostrado na Figura 31. A amina primária do ácido 7-aminocefalosporânico é primeiro protegida utilizando FMOC-C1, e depois o grupo acetilo é hidrolisado por tratamento com base. O molde de ADN de codificação é então ligado através de uma ligação amida utilizando EDC e HOBt ao grupo ácido carboxílico. Uma molécula de transferência com um anti-codão capaz de hibridação com o molde de ADN ligado é então deixada hibridar com o molde. A molécula de transferência tem associada, através de uma ligação dissulfureto, uma amina primária possuindo Ri. A activação do grupo hidroxilo primário no esqueleto de cefalosporina com DSC após tratamento com TCEP produz a amina ligada covalentemente ao esqueleto através de uma ligação carbamato. O tratamento adicional com outra unidade de transferência possuindo um aminoácido conduz à funcionalização da amina primária desprotegida do esqueleto de cefalosporina. As moléculas do tipo da cefalosporina sintetizadas desta maneira podem então ser seleccionadas, amplificadas e/ou evoluídas utilizando os métodos e composições da invenção. O molde de ADN pode ser diversificado e evoluído utilizando rearranjo de ADN. D) Síntese de Moléculas Pequenas em Múltiplos Passos Programada por Moldes de ADN: A evolução molecular requer a tradução específica da sequência de um transportador de informação amplificável nas estruturas das moléculas em evolução. Este requisito tem limitado os tipos de moléculas que foram evoluídas directamente em duas classes, proteínas e ácidos nucleicos, porque apenas estas classes de moléculas podem ser traduzidas a partir de sequências de ácido nucleico. 69

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Como descrito genericamente atrás, uma abordagem promissora à evolução de moléculas outras gue não proteínas e ácidos nucleicos utiliza a síntese modelada por ADN como método de tradução de seguências de ADN em moléculas peguenas sintéticas. A síntese modelada por ADN pode dirigir uma ampla variedade de poderosas reacções guímicas com elevada especificidade de seguência e sem reguerer mímica estrutural da estrutura principal do ADN. A aplicação desta abordagem a moléculas sintéticas de complexidade útil, contudo, reguer o desenvolvimento de métodos gerais para permitir gue o produto da reacção modelada por ADN sofra subseguentes transformações modeladas por ADN. A primeira síntese de moléculas peguenas modelada por ADN em múltiplos passos é aqui descrita com detalhes. Juntamente com recentes avanços no âmbito reaccional da síntese modelada por ADN, estas verificações estabelecem a etapa para a evolução in vitro de bibliotecas sintéticas de moléculas pequenas. A síntese de moléculas pequenas modelada por ADN em múltiplos passos enfrenta dois desafios importantes para além daqueles associados à síntese modelada por ADN em geral. Primeiro, o ADN utilizado para dirigir reagentes para moldes apropriados tem que ser removido do produto da reacção modelada por ADN antes de subsequentes passos sintéticos modelados por ADN de modo a evitar hibridação indesejada com o molde. Em segundo lugar, a síntese em múltiplos passos requer frequentemente a purificação e isolamento de produtos intermediários, e ainda os métodos comuns utilizados para purificar e isolar produtos reaccionais não são apropriados para a síntese em múltiplos passos à escala da biologia molecular. Para abordar estes desafios, foram implementadas três estratégias distintas em síntese orgânica em fase sólida, para ligação de reagentes químicos com os seus oligonucleótidos de ADN de descodificação e foram desenvolvidas duas abordagens gerais para purificação do produto após qualquer passo sintético modelado por ADN.

Quando possível, um ligante reagente-oligonucleótido ideal para síntese modelada por ADN posiciona o oligonucleótido como grupo rejeitado do reagente. Nesta estratégia de ligante "autoclivante", a ligação oligonucleótido-reagente é clivada como consequência química 70 ΕΡ 1 423 400 /PT natural da reacção (Fig. 33). Como primeiro exemplo desta abordagem aplicada à química modelada por ADN, sintetizou-se um reagente de fosforano de Wittig dansilado (1) em que o oligonucleótido de ADN de descodificação foi ligado a um dos grupos arilfosfina (I. Hughes, Tetrahedron Lett. 1996, 37, 7595). A olefinação de Wittig modelada por ADN (como descrito atrás) com molde ligado a aldeído 2 resultou na transferência eficiente do grupo dansilo fluorescente do reagente para o molde para proporcionar a olefina 3 (Fig. 33) . Como segundo exemplo de um ligante autoclivante, o tioéster ligado a ADN 4, quando activado com Ag(I) a pH 7,0 (Zhang et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 3311) acilou o molde terminado com amina 5 para produzir o produto amida 6 (Fig. 33) . A biossíntese de proteínas ribossómicas utiliza ARNt aminoacilados num formato de ligante autoclivante similar para mediar a formação de ligações peptídicas modelada por ARN. Para purificar os produtos desejados dos reagentes que não reagiram e dos oligonucleótidos clivados após as reacções modeladas por ADN utilizando ligantes autoclivantes, utilizaram-se oligonucleótidos reagentes biotinilados e lavagem das misturas reaccionais em bruto com contas magnéticas ligadas a estreptavidina (Fig. 34). Embora esta abordagem não separe moldes que reagiram de moldes que não reagiram, os moldes que não reagiram podem ser removidos em passos subsequentes de reacção modelada por ADN e purificação (veja-se adiante).

Os reagentes portadores de mais do que um grupo funcional podem ser ligados aos seus oligonucleótidos de ADN de descodificação através de uma segunda e uma terceira estratégias de ligantes. Na abordagem de "ligante sem resíduo", um grupo funcional do reagente é reservado para a formação de ligações modelada por ADN, enquanto o segundo grupo funcional é utilizado para ligar um ligante que pode ser clivado sem introdução de uma funcionalidade química adicional não desejada. A reacção modelada por ADN é seguida por clivagem do ligante ligado através do segundo grupo funcional para originar os produtos desejados (Fig. 33). Por exemplo, sintetizaram-se uma série de reagentes de aminoacilação tais como o derivado de (D)-Phe 7 em que a α-amina é ligada através de um ligante carbamoíletilsulfona (Zarling et al. J Immunology 1980, 124, 913) ao seu oligonucleótido de ADN de descodificação. O produto (8) da formação de ligações amida 71 ΕΡ 1 423 400 /PT modelada por ADN (como aqui descrito) utilizando este reagente e um molde terminado com amina (5) foi tratado com base aquosa para efectuar a eliminação quantitativa e a descarboxilação espontânea do ligante, produzindo o produto 9 contendo o grupo aminoácido transferido de forma limpa (Fig. 33). Este ligante de sulfona é estável em tampão de pH 7,5 ou mais baixo a 25°C durante mais de 24 h e ainda sofre clivagem quantitativa quando exposto a tampão de pH 11,8 durante 2 h a 37°C.

Em alguns casos pode ser vantajoso introduzir novos grupos químicos como consequência da clivagem do ligante. Numa terceira estratégia de ligante, a clivagem do ligante gera um "resíduo útil" que pode ser funcionalizado em passos subsequentes. Como exemplo desta classe de ligante, geraram-se reagentes aminoácido tais como o derivado de (L)-Phe 10 ligados através de 1,2-dióis (Fruchart et al Tetrahedron Lett. 1999, 40, 6225) aos seus oligonucleótidos de ADN de descodificação. Após a formação de ligações amida modelada por ADN com molde terminado com amina (5), este ligante foi quantitativamente clivado por oxidação com NaI04 aquoso 50 mM a pH 5,0 para originar o produto 12 contendo um grupo aldeído apropriado para a subsequente funcionalização (por exemplo, numa olefinação de Wittig, aminação redutora ou adição nitrolaldólica, modeladas por ADN (Fig. 33).

Os produtos desejados gerados por reacções modeladas por ADN utilizando os ligantes "sem resíduo" ou "com resíduo útil" podem ser prontamente purificados utilizando oligonucleótidos reagentes biotinilados (Fig. 34). Os oligonucleótidos reagentes juntamente com os produtos desejados são primeiro capturados em contas magnéticas ligadas a estreptavidina. Qualquer molde que não tenha reagido ligado ao reagente por emparelhamento de bases é removido por lavagem das contas com tampão contendo cloreto de guanidínio 4 M. As moléculas biotiniladas permanecem ligadas às contas de estreptavidina sob estas condições. O produto desejado é depois isolado na forma pura por eluição das contas com tampão de clivagem do ligante (nos exemplos atrás, tampão de pH 11 ou contendo NalCg) , enquanto os reagentes, que reagiram e que não reagiram, permanecem ligados às contas. 72

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Integrando o repertório recentemente expandido de reacções sintéticas compatíveis com a síntese modelada por ADN e as estratégias de ligante atrás descritas, pode-se conduzir a síntese de moléculas pequenas modelada por ADN em múltiplos passos.

Numa concretização, a síntese modelada por ADN em fase de solução de uma biblioteca de péptidos não naturais é descrita genericamente adiante e é mostrada genericamente na Figura 35. Como mostrado na Figura 35, para gerar o conjunto inicial de moldes para a biblioteca, trinta 5'-amino-oligonucleótidos sintéticos biotinilados com o formato de sequência mostrado na Figura 35 são acilados com um de trinta diferentes aminoácidos naturais ou não naturais utilizando procedimentos de acoplamento de EDC Standard. Quatro bases representando um "codão" no interior de cada iniciador amino acilado são designados a identidade da cadeia lateral (Ri) . O "código genético" para estas cadeias laterais é protegido com grupos protectores lábeis aos ácidos similares ao vulgarmente utilizados na síntese de péptidos. Os trinta iniciadores de ADN aminoacilados resultantes são hibridados com uma biblioteca de oligonucleótidos moldes de ADN gerada por síntese automática de ADN. A extensão de iniciadores com uma ADN-polimerase seguida de desnaturação da cadeia e purificação com contas magnéticas ligadas a estreptavidina originaram a biblioteca de moldes de partida (veja-se, Figura 35) . Como apenas um exemplo geral, uma síntese modelada por ADN em fase de solução de uma biblioteca de péptidos não naturais está representada na Figura 36. A biblioteca de moldes é submetida a três reacções de formação de ligações peptídicas modeladas por ADN utilizando reagentes aminoácido ligados a oligonucleótidos de ADN de descodificação de 10 bases através do ligante sulfona atrás descrito. Os produtos de cada passo são purificados por electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante preparativa antes da clivagem do ligante se desejado, embora isto possa não ser necessário. Cada reagente ligado a ADN pode ser sintetizado por acoplamento de um oligonucleótido de ADN terminado com 3'-amino ao aminoácido codificado através do derivado carbonato bis-NHS do ligante sulfona como mostrado na Figura 37. Os codões são novamente escolhidos de modo a que os codões relacionados codifiquem aminoácidos quimicamente similares. Após cada reacção de 73 ΕΡ 1 423 400 /PT formação de ligações peptídicas, utiliza-se anidrido acético para rematar materiais de partida que não reagiram e utiliza-se tampão de pH 11 para efectuar a clivagem do ligante para expor um novo grupo amino para a reacção de formação de ligações peptídicas seguinte. Uma vez completado o tetrapéptido, os membros da biblioteca portadores de cadeias laterais carboxilato podem também ser ciclizados com os seus terminais amino para formar péptidos macrociclicos, enquanto os membros péptidos lineares podem simplesmente ser N-acetilados (veja-se a Figura 36).

Notar-se-á que uma colecção virtualmente ilimitada de blocos de construção aminoácidos podem ser incorporados numa biblioteca de péptidos não naturais. Ao contrário de bibliotecas de péptidos geradas utilizando a maquinaria biossintética das proteínas, tal como bibliotecas exibidas sobre fagos (0'Neil et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 1995, 5, 443-9), bibliotecas exibidas em ARNm (Roberts et al. Proc. Natl. Acad. Sei, USA 1997, 94, 12297-12302) bibliotecas exibidas em ribossomas (Roberts et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 268-73; Schaffitzel et al. J. Immunol Methods 1999, 231, 119-35), ou bibliotecas de péptidos intracelulares (Norman et al. Science 1999, 285, 591-5), aminoácidos com cadeias laterais não proteinogénicas, estereoquímica de cadeias laterais não naturais ou esqueletos não peptídicos podem todos ser incorporados nesta biblioteca. Em adição, os muitos di-, tri- e oligopéptidos comercialmente disponíveis podem também ser utilizados como blocos de construção para gerar membros da biblioteca maiores. A presença de péptidos não naturais nesta biblioteca pode conferir propriedades farmacológicas melhoradas tais como resistência a proteases, em comparação com péptidos gerados no ribossoma. Similarmente, os membros de bibliotecas macrocíclicas podem originar ligandos com maior afinidade pois a perda de entropia por ligação aos seus alvos pode ser inferior à das suas contrapartidas lineares, mais flexíveis. Com base na enorme variedade de aminoácidos comercialmente disponíveis que se enquadram nestas descrições, a diversidade máxima desta biblioteca de tetrapéptidos cíclicos e lineares não naturais pode exceder 100 x 100 x 100 x 100 =108 membros. 74

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Outro exemplo de uma biblioteca que utiliza a abordagem atrás descrita inclui a síntese modelada por ADN de uma biblioteca macrobicíclica orientada pela diversidade contendo anéis de 5 e 14 membros (Figura 38) . O material de partida para esta biblioteca consiste em moldes de ADN aminoacilados com uma variedade de derivados de lisina com cadeia lateral protegida e análogos de lisina comercialmente disponíveis (incluindo aminoetilcisteína, aminoetilserina e 4-hidroxilisina). No primeiro passo, a formação de ligações amida modelada por ADN com uma variedade de aminoácidos ligados a ADN ocorre como descrito na biblioteca de péptidos não naturais, excepto que se utiliza o ligante diol vicinal 16 descrito atrás em vez do ligante sulfona sem rasto. Após a formação de ligações amida, o ligante diol é oxidativamente clivado com periodato de sódio. A desprotecção da amina da cadeia lateral do análogo de lisina é seguida por formação de ligações amida modelada por ADN catalisada por trifluoroacetato de prata entre a amina livre e uma biblioteca de tioésteres derivados de ácido acrílico. As olefinas resultantes são tratadas com uma hidroxilamina para formar nitronas, que sofrem cicloadição 1,3-dipolar para originar a biblioteca bicíclica (Figura 38). Os reagentes ligados a ADN para esta biblioteca são preparados por acoplamento de análogos de lisina a iniciadores de moldes terminados com 5'-amina (Figura 35), acoplamento de ligantes diol aminoacilados a oligonucleótidos de ADN terminados com 3'-amina (Figura 38), e acoplamento de ácidos acrílicos a oligonucleótidos de ADN terminados com 3'-tiol (Figura 38).

Apenas como um exemplo de uma biblioteca específica gerada a partir da primeira abordagem geral atrás descrita, utilizaram-se três ciclos iterados de formação de amida modelada por ADN, clivagem de ligante sem rasto e purificação com contas ligadas a estreptavidina para gerar um tripéptido não natural (Fig. 39) . Cada reagente aminoácido foi ligado a um único oligonucleótido de ADN biotinilado de 10 bases através do ligante sulfona atrás descrito. O molde terminado com amina de 30 bases programado para dirigir a síntese do tripéptido continha três regiões consecutivas de 10 bases que eram complementares aos três reagentes, imitando a estratégia que seria utilizada na síntese de uma biblioteca de moléculas pequenas em múltiplos passos modelada por ADN. O primeiro 75

ΕΡ 1 423 400 /PT reagente aminoácido (13) foi combinado com o molde e o activador cloreto de 4-(4, 6-dimetoxi-l,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (DMT-MM) (Kunishima et ai. Tetrahedron 2001, 57, 1551) para efectuar a formação de ligações peptídicas modelada por ADN. O produto desejado foi purificado misturando a reacção em bruto com contas magnéticas ligadas a estreptavidina, lavagem com cloreto de guanidinio 4 M, e eluindo com tampão de pH 11 para efectuar a clivagem do ligante sulfona, proporcionando o produto 14. O grupo amina livre em 14 foi depois elaborado num segundo e num terceiro ciclos de formação de amida modelada por ADN e clivagem de ligante para originar o dipéptido 15 e o tripéptido 16 (Figura 39). A progressão de cada passo de reacção, purificação e clivagem do ligante sulfona foi seguida por electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante. 0 tripéptido final ligado ao molde (16) foi digerido com a endonuclease de restrição EcoRI e o fragmento da digestão contendo o tripéptido foi caracterizado por espectrometria de massa MALDI. Começando com 2 nmol (~20 pg) de material de partida, foi gerado produto tripéptido suficiente para servir como molde para mais do que 106 selecções in vitro e reacções PCR (Kramer et al. em Current Protocols in Molecular Biology, Vol 3 (Ed.: F.M. Ausubel), Wiley, 1999, pp. 15.1) (assumindo que 1/10 000 moléculas sobrevivem à selecção). Não foi gerado produto significativo quando o molde do material de partida foi rematado com anidrido acético, ou quando os reagentes de controlo contendo erros de emparelhamento de sequência foram utilizados em vez dos reagentes complementares (Fig. 39).

Foi também realizada uma síntese de moléculas pequenas não peptídicas em múltiplos passos modelada por ADN (Fig. 40) que utiliza todas as três estratégias de ligantes desenvolvidas atrás. Um molde terminado com amina de 30 bases foi submetido a formação de ligações amida modelada por ADN utilizando um reagente dador de aminoacilo (17) contendo o ligante diol e um oligonucleótido biotinilado de 10 bases para originar a amida 18. O produto desejado foi isolado por captura da mistura reaccional em bruto em contas de estreptavidina seguida de clivagem do ligante com NaIC>4 para gerar o aldeído 19. A reacção de Wittig modelada por ADN de 19 76

ΕΡ 1 423 400 /PT com o reagente fosforano biotinilado auto-clivável 20 produziu a fumaramida 21. Os produtos da segunda reacção modelada por ADN foram parcialmente purificados por lavagem com contas de estreptavidina para remover reagente que reagiu e que não reagiu. No terceiro passo modelado por ADN, a fumaramida 21 foi submetida a uma adição de conjugado modelada por ADN (Gartner et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961) utilizando o reagente tiol 22 ligado através do ligante sulfona a um oligonucleótido biotinilado. O produto desejado da adição de conjugado (23) foi purificado por imobilização com contas de estreptavidina. A clivagem do ligante com tampão de pH 11 produziu o produto final 24 com 5-10% de rendimento global isolado para as três reacções de formação de ligações, dois passos de clivagem do ligante e três purificações (Figura 40). Este produto final foi digerido com EcoRI e a massa do fragmento de molde ligado à molécula pequena foi confirmada por espectrometria de massa MALDI (massa exacta: 2568, massa observada: 2566±5). Como no exemplo do tripéptido, cada um dos três reagentes utilizados durante esta síntese em múltiplos passos hibridou numa única localização no molde de ADN, e as reacções de controlo com erros de emparelhamento de sequência não originaram produto (Fig. 40) . Como esperado, as reacções de controlo em que o reagente de Wittig foi omitido (passo 2) também não geraram produto após o terceiro passo. Tomadas em conjunto, as sínteses modeladas por ADN de 16 e 24 demonstram a capacidade do ADN para dirigir a síntese programada pela sequência em múltiplos passos de moléculas pequenas, tanto oligoméricas como não oligoméricas, não relacionadas em estrutura com ácidos nucleicos. A disponibilidade comercial de muitos substratos para reacções modeladas por ADN incluindo aminas, ácidos carboxílicos, compostos de α-halogenocarbonilo, olefinas, alcoxiaminas, aldeídos e nitroalcanos, pode permitir a tradução de grandes bibliotecas de ADN em diversas bibliotecas de moléculas pequenas. A selecção directa num só vaso destas bibliotecas, para membros com actividades de ligação ou catalíticas desejadas, seguida de amplificação por PCR e diversificação do ADN que codifica moléculas activas, podem permitir que moléculas pequenas sintéticas evoluam de uma maneira paralela aos poderosos métodos que a Natureza usa para gerar novas funções moleculares. Em adição, a síntese modelada 77 ΕΡ 1 423 400 /PT por ácido nucleico em múltiplos passos é um requisito dos modelos anteriormente propostos (A.I. Scott, Tetrahedron Lett. 1997, 38, 4961; Li et al. Nature 1994, 369, 218; Tamura et al. Proc. Natl. Acad. Sei USA 2001, 98, 1393) para a tradução pré-biótica de informação replicável em moléculas funcionais. Estas verificações demonstram que os moldes de ácido nucleico são de facto capazes de dirigir a síntese iterativa ou não iterativa em múltiplos passos de moléculas pequenas mesmo quando os reagentes hibridam a distâncias amplamente variáveis da molécula em crescimento (nos exemplos anteriores, zero a vinte bases) . Como descrito com mais detalhes adiante, as bibliotecas de moléculas sintéticas podem então ser evoluídas no sentido de ligandos e catalisadores activos através de ciclos de tradução, selecção, amplificação e mutagénese. E) Evoluir Plásticos: Em ainda outra concretização da presente invenção, um ácido nucleico (e.g., ADN, ARN, seu derivado) é ligado a um catalisador de polimerização. Como os ácidos nucleicos se podem dobrar em estruturas complexas, o ácido nucleico pode ser utilizado para dirigir e/ou afectar a polimerização de uma cadeia polimérica em crescimento. Por exemplo, o ácido nucleico pode influenciar a selecção de unidades monoméricas a polimerizar assim como o modo como a reacção de polimerização ocorre (e.g., estereoquímica, tacticidade, actividade). Os polímeros sintetizados podem ser seleccionados quanto a propriedades específicas tais como peso molecular, densidade, hidrofobicidade; tacticidade, estereosselectividade, etc., e o ácido nucleico que formou uma parte integral do catalisador que dirigiu a sua síntese pode ser amplificado e evoluído (Figura 41). Ciclos iterados de diversificação de ligandos, selecção e amplificação permitem a verdadeira evolução de catalisadores e polímeros no sentido das propriedades desejadas.

Para dar apenas um exemplo, uma biblioteca de moléculas de ADN é ligada a catalisador de polimerização de metatese de abertura do anel (ROMP) à base de ruténio de Grubbs através de um ligando di-hidroimidazole (Scholl et al. Org. Lett. 1(6):953, 1999;) criando um grande e diverso conjunto de potenciais moléculas catalíticas, cada uma única por natureza do ligando funcionalizado. Indubitavelmente, a funcionalização do catalisador com um ligando relativamente grande ADN- 78

ΕΡ 1 423 400 /PT desidroimidazole (ADN-DHI) irá alterar a actividade do catalisador. Cada molécula de ADN tem potencial para se dobrar num único formato estereoelectrónico que potencialmente possui diferentes selectividades e/ou actividades na reacção de polimerização (Figura 42). Portanto, a biblioteca de ligandos de ADN pode ser "traduzida" numa biblioteca de plásticos por adição de vários monómeros. Em certas concretizações, são utilizados ligandos ADN-DHI capazes de se inserir covalentemente no polímero em crescimento, criando assim um polímero marcado com o ADN que codificou a sua criação. Utilizando o esquema sintético mostrado na Figura 42, são produzidos ligandos de DHI contendo duas "alças" químicas, uma utilizada para ligar o ADN ao ligando, a outra utilizada para ligar uma olefina pendente ao esqueleto de DHI. Sabe-se que as velocidades da metatese variam amplamente com base na substituição da olefina assim como na identidade do catalisador. Através de alteração destas variáveis, a velocidade da incorporação de olefina pendente pode ser modulada de modo a que Amatatese da olefina pendente Aromp, deste modo permitindo a formação de polímeros de pesos moleculares moderados a elevados, antes da inserção do ADN marcador e da correspondente terminação do polímero. Os éteres vinílicos são vulgarmente utilizados em ROMP para funcionalizar os terminais do polímero (Gordon et al. Chem. Biol. 7: 9-16, 2000;), assim como para produzir polímeros de peso molecular menor. A subsequente selecção de um polímero a partir da biblioteca é baseada numa propriedade desejada, por electroforese, filtração em gel, sedimentação centrífuga, partição em solventes de diferentes hidrofobicidades, etc. A amplificação e a diversificação do ácido nucleico de codificação por via de técnicas tais como PCR propensa a erros ou rearranjo de ADN seguidas de ligação a um esqueleto de DHI permitirão a produção de outro conjunto de potenciais catalisadores de ROMP enriquecido na actividade seleccionada (Figura 43) . Este método proporciona uma nova abordagem para gerar materiais poliméricos e os catalisadores que os criam.

Exemplo 6: Caracterização de Bibliotecas de Moléculas Pequenas Sintéticas Modeladas por ADN:

As bibliotecas de péptidos não naturais e biciclicas atrás descritas são caracterizadas em várias etapas. Cada 79 ΕΡ 1 423 400 /PT reagente candidato é conjugado com o seu oligonucleótido de ADN de descodificação, depois é submetido a reacções modelo com moldes emparelhados e mal emparelhados. Os produtos destas reacções são analisados por electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante para avaliar a eficiência da reacção, e por espectrometria de massa para verificar as estruturas antecipadas para o produto. Uma vez identificado um conjunto completo de reagentes robustos, é realizada a síntese completa em múltiplos passos modelada por ADN dos membros individuais representativos da biblioteca em grande escala e os produtos finais são caracterizados por espectrometria de massa.

Mais especificamente, a fidelidade da sequência de cada síntese em múltiplos passos modelada por ADN de biblioteca é testada seguindo o destino de reagentes individuais quimicamente marcados através do decorrer de reacções de síntese da biblioteca num único vaso. Por exemplo, produtos provenientes de blocos de construção portadores de um grupo cetona são capturados com resina ligada a hidrazida comercialmente disponível e analisados por sequenciação de ADN para verificar a fidelidade da sequência durante a síntese modelada por ADN. Similarmente, quando se utilizam modelos de moldes não biotinilados, blocos de construção portadores de grupos biotina são purificados após a síntese modelada por ADN utilizando contas magnéticas com estreptavidina e submetidos a sequenciação do ADN (Liu et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961-6963). Codões que apresentam maior propensidade para hibridar com ADN mal emparelhado são identificados por rastreio desta maneira e removidos do código genético destas bibliotecas sintéticas.

Exemplo 7: Selecção In Vitro de Ligandos Proteína de Bibliotecas Sintéticas Evoluíveis:

Como todos os membros de bibliotecas geradas nesta abordagem estão covalentemente ligados a um oligonucleótido de ADN que codifica e dirige a sua síntese, as bibliotecas podem ser submetidas a verdadeiras selecções in vitro. Embora as selecções directas de catalisadores de molécula pequena de reacções de formação de ligações ou de clivagem de ligações, sejam uma excitante aplicação potencial desta abordagem, a selecção mais simples in vitro que se pode utilizar para 80 ΕΡ 1 423 400 /PT evoluir estas bibliotecas é uma selecção quanto a ligação a uma proteína alvo. Uma proteína alvo inicial ideal para a selecção da biblioteca sintética desempenha um papel biológico importante e possui ligandos conhecidos de várias afinidades para validar os métodos de selecção.

Um receptor com interesse especial para utilização na presente invenção é o receptor ανβ3· O receptor ανβ3 é um membro da família da integrina dos receptores de glicoproteínas heterodiméricas transmembranares (Miller et al. Drug Discov Today 2000, 5, 397-408; Berman et al. Membr Cell

Biol. 2000, 13, 207-44). 0 receptor integrina ανβ3 é expresso sobre a superfície de muitos tipos de células tais como osteoclastos, células do músculo liso vascular, células endoteliais e algumas células tumorais. Este receptor medeia vários processos biológicos importantes incluindo adesão de osteoclastos à matriz óssea (van der Pluijm et al. J. Bone Miner. Res. 1994, 9, 1021-8), migração de células do músculo liso (Choi et al. J. Vasc. Surg. 1994, 19, 125-34) e angiogénese induzida por tumores (Brooks et al. Cell 1994, 19, 1157-64) (a excrescência de novos vasos sanguíneos). Durante a angiogénese induzida por tumores, células endoteliais invasivas ligam-se a componentes da matriz extracelular através dos seus receptores integrina (Χνβ3 · Vários estudos (Brooks et al. Cell 1994, 19, 1157-64; Brooks et al. Cell 1998, 92, 391-400; Friedlander et al. Science 1995, 210, 1500-2; Varner et al. Cell Adhes Commun 1995, 3, 367-74; Brooks et al. J. Clin Invest 1995, 96, 1815-22) demonstraram que a inibição deste evento de ligação a integrina com anticorpos ou pequenos péptidos sintéticos induz a apoptose das células vasculares angiogénicas proliferativas e pode inibir a metástase de tumores.

Foram relatados vários ligandos peptídicos de várias afinidades e selectividades para com o receptor integrina ανβ3· Dois antagonistas de integrina (Χνβ3 de referência são o péptido linear GRGDSPK (IC50 = 210 nM (Dechantsreiter et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 3033-40; Pfaff et al. J. Biol. Chem. 1994, 269, 20233-8) e o péptido cíclico ciclo-RGDfV (Pfaff et al. J. Biol. Chem. 1994, 269, 20233-8) (f = (D)-Phe, IC50 =

10 nM). Embora os antagonistas peptídicos para integrinas contenham vulgarmente RGD, nem todos os péptidos contendo RGD 81 ΕΡ 1 423 400 /PT são ligandos de integrina de elevada afinidade. Pelo contrário, o contexto conformacional de RGD e outras sequências peptídicas pode ter um efeito profundo sobre a afinidade e a especificidade da integrina (Wermuth et ai. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 1328-1335; Geyer et al. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 7735-7743; Rai et al. Bioorg. Med Chem. Lett 2001, 11, 1797-800; Rai et al. Curr. Med Chem. 2001, 8, 101-19). Por esta razão, as abordagens combinatórias no sentido da identificação de antagonistas de receptores integrina ανβ3 são especialmente promissoras. O papel biologicamente importante e medicamente relevante do receptor integrina ανβ3 juntamente com os seus antagonistas peptidicos conhecidos e a sua disponibilidade comercial (Chemicon International, Inc., Temecula, CA) tornam o receptor integrina ανβ3 um alvo inicial ideal para as bibliotecas de moléculas pequenas sintéticas modeladas por ADN. O receptor integrina ανβ3 pode ser imobilizado por adsorção em poços de placas de microtitulo sem prejudicar a sua capacidade ou especificidade de ligação a ligandos (Dechantsreiter et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 3033-40; Wermuth et al. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 1328-1335; Haubner et al. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7461-7472). Alternativamente, o receptor pode ser imobilizado por conjugação com grupos éster NHS ou maleimida covalentemente ligados a contas de Sepharose e pode ser verificada a capacidade da resina de afinidade de integrina resultante para manter propriedades de ligação a ligandos conhecidas.

Para realizar as selecções por ligação a proteína, bibliotecas sintéticas de péptidos ou macrocíclicas ligadas a moldes de ADN são dissolvidas em tampão de ligação aquoso num só vaso e equilibradas na presença de receptor integrina (Χνβ3 imobilizado. Os não ligantes são lavados com tampão. As moléculas que se podem ligar através dos seus moldes de ADN ligados em vez de através das suas porções sintéticas são eliminadas por lavagem da biblioteca ligada com moldes de ADN não funcionalizados a que faltam locais de ligação de iniciadores de PCR. Os restantes ligandos ligados ao receptor integrina (Χνβ3 imobilizado são eluídos por desnaturação ou pela adição de excesso de ligando peptídico contendo RGD de elevada afinidade. Os moldes de ADN que codificam e dirigem as 82 ΕΡ 1 423 400 /PT sínteses de ligantes de integrina ανβ3 são amplificados por PCR utilizando um iniciador desenhado para se ligar a uma região constante a 3' do molde e um conjunto de iniciadores biotinilados funcionalizados na sua extremidade 5' com os materiais de partida da biblioteca (Fig. 44). A purificação da cadeia biotinilada completa um ciclo de tradução, selecção e amplificação da molécula sintética, originando uma subpopulação de moldes de ADN enriquecida em sequências que codificam ligandos de integrina (Χγβ3 sintéticos.

Por razões similares às que tornam o receptor integrina ανβ3 um alvo inicial atractivo para a abordagem à produção de moléculas sintéticas com propriedades desejadas, a serina-protease factor Xa também serve como proteína alvo promissora. A coagulação do sangue envolve uma complexa cascata de reacções catalisadas por enzimas que por último geram fibrina, a base dos coágulos do sangue (Rai et al. Curr. Med Chem. 2001, 8, 101-109; Vacca et al. Curr. Opin. Chem Biol. 2000, 4, 394-400). A trombina é a serina-protease que converte o fibrinogénio em fibrina durante a coagulação do sangue. A trombina, por sua vez, é gerada pela acção proteolítica de factor Xa sobre a protrombina. Como as doenças tromboembolíticas (coagulação do sangue) tais como icto permanecem uma principal causa de morte no mundo (Vacca et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 394-400) o desenvolvimento de drogas que inibem a trombina ou o factor Xa constitui uma área importante de investigação farmacêutica. A inibição de factor Xa é uma nova abordagem que se pensa evitar os efeitos secundários associados à inibição da trombina, que está também envolvida na hemóstase normal (Maignan et al. J. Med. Chem. 2000, 43, 3226-32; Leadley et al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 1999, 34, 791-9; Becker et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 2753-8; Choi-Sledeski et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 2539-44; Choi-Sledeski et al. J. Med Chem. 1999, 42, 3572-87; Ewing et al. J. Med Chem. 1999, 42, 3557-71; Bostwick et al. Thromb Haemost 1999, 81, 157-60). Embora se tenham desenvolvido muitos agentes incluindo heparina, hirudina e hirulog para controlar a produção de trombina, estes agentes geralmente têm a desvantagem de requerer injecção intravenosa ou subcutânea várias vezes por dia em adição a possíveis efeitos secundários, e a pesquisa de inibidores de factor Xa 83 ΕΡ 1 423 400 /PT de molécula pequena sintética permanece o objecto de grandes esforços de investigação.

Entre os inibidores de factor Xa com afinidades de ligação conhecidas estão uma série de tripéptidos que terminam com arginina-aldeido (Marlowe et al. Bioorg. Med Chem. Lett. 2000, 10, 13-16) que são facilmente incluídos na biblioteca de péptidos não naturais modelada por ADN atrás descrita. Dependendo das identidades dos primeiros dois resíduos, estes tripéptidos exibem valores de IC5o que variam de 15 nM a 60 μΜ (Marlowe et al. Bioorg. Med Chem. Lett. 2000, 10, 13-16) e portanto proporcionam controlos positivos ideais para a validação e calibração de uma selecção in vitro de ligandos factor Xa sintéticos (veja-se adiante). Tanto o factor Xa como o factor Xa activo imobilizados sobre resina estão comercialmente disponíveis (Protein Engineering Technologies, Dinamarca). 0 factor Xa ligado à resina é utilizado para seleccionar membros de bibliotecas modeladas por ADN tanto de péptidos não naturais como bicíclicas com afinidade para o factor Xa, de uma maneira análoga às selecções por ligação ao receptor de integrina atrás descritas.

Após a amplificação por PCR dos moldes de ADN que codificam moléculas sintéticas seleccionadas, são conduzidos ciclos adicionais de tradução, selecção e amplificação para enriquecer a biblioteca nos ligantes de maior afinidade. O rigor da selecção é gradualmente aumentado aumentando a concentração de sais dos tampões de ligação e de lavagem, diminuindo a duração da ligação, elevando as temperaturas de ligação e de lavagem, e aumentando a concentração de aditivos de lavagem tais como moldes de ADN ou proteínas não relacionadas. De modo importante, as selecções in vitro podem também ser seleccionadas quanto a especificidade em adição a afinidade de ligação. Para eliminar as moléculas que possuem propriedades de ligação indesejadas, os membros da biblioteca ligados a integrina ανβ3 ou factor Xa imobilizados, são lavados com proteínas não alvo tais como outras integrinas ou outras serina-proteases, deixando apenas as moléculas que se ligam à proteína alvo mas não se ligam a proteínas não alvo.

Ciclos iterados de tradução, selecção e amplificação resultam no enriguecimento da biblioteca em vez de evolução da 84 ΕΡ 1 423 400 /PT biblioteca, que requer diversificação entre os ciclos de selecção. A diversificação destas bibliotecas sintéticas é conseguida de pelo menos duas maneiras, ambas análogas a métodos utilizados pela Natureza para diversificar proteínas. Realiza-se mutagénese pontual aleatória conduzindo o passo de amplificação por PCR sob condições de PCR propensa a erros (Caldwell et al. PCR Methods Applic. 1992, 2, 28-33). Como o código genético destas moléculas é escrito para atribuir codões relacionados a grupos químicos relacionados, similarmente ao modo como o código genético de proteínas naturais é construído, as mutações pontuais aleatórias nos moldes que codificam moléculas seleccionadas irão diversificar a progénie no sentido de análogos quimicamente relacionados. Em adição à mutagénese pontual, as bibliotecas sintéticas geradas nesta abordagem são também diversificadas utilizando recombinação. Os moldes a recombinar possuem a estrutura mostrada na Fig. 45, em que os codões estão separados por locais de clivagem por endonucleases de restrição de cinco bases não palindrómicas, tais como os clivados por Avall (G/GWCC, W=A ou T), Sau961 (G/GNCC, N=A, G, T, ou C), Ddel (C/TNAG), ou HinFI (G/ANTC). Após as selecções, os moldes que codificam moléculas desejadas são enzimaticamente digeridos com estas enzimas de restrição comercialmente disponíveis. Os fragmentos digeridos são então recombinados em moldes intactos com ADN-ligase de T4. Como os locais de restrição que separam os codões são não palindrómicos, os fragmentos de moldes apenas se podem voltar a montar para formar moldes recombinados intactos (Fig. 45) . A tradução modelada por ADN de moldes recombinados proporciona moléculas pequenas recombinadas. Desta maneira, os grupos funcionais entre moléculas pequenas sintéticas com actividades desejadas são recombinados de uma maneira análoga à recombinação de resíduos de aminoácido entre proteínas na Natureza. Sabe-se bem que a recombinação explora o espaço de sequência de uma molécula muito mais eficientemente do que a mutagénese pontual sozinha (Minshull et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 284-90; Bogarad et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999, 96, 2591-5; Stemmer, W. Nature 1994, 370, 389-391). A evolução de moléculas pequenas utilizando mutação e recombinação oferece duas vantagens potenciais sobre o enriquecimento simples. Se a diversidade total da biblioteca 85 ΕΡ 1 423 400 /PT for muito inferior ao número de moléculas feitas (tipicamente 1012 a 1015), todos os possíveis membros da biblioteca estão presentes no início da selecção. Neste caso, a diversificação é ainda útil porque as condições de selecção quase sempre se alteram à medida que progridem os ciclos da evolução. Por exemplo, os últimos ciclos de selecção serão provavelmente conduzidos sob maior rigor, e podem envolver contra-selecções contra proteínas de ligação não alvo. A diversificação dá a membros da biblioteca que foram rejeitados durante ciclos anteriores de selecção a possibilidade de reaparecerem em ciclos posteriores sob condições de selecção alteradas em que o seu ajuste relativamente a outros membros pode ser maior. Em adição, é bem possível utilizando esta abordagem gerar uma biblioteca sintética que possui uma diversidade teórica maior que 1015 moléculas. Neste caso, a diversificação permite que moléculas que nunca existiam na biblioteca original possam emergir em ciclos posteriores de selecções com base na sua semelhança com moléculas seleccionadas, similarmente à maneira como a evolução de proteínas procura a enormidade do espaço de sequências de proteínas, um pequeno subconjunto de cada vez.

Exemplo 8: Caracterização de Compostos Evoluídos:

Após múltiplos ciclos de selecção, amplificação, diversificação e tradução, as moléculas que sobrevivem à selecção serão caracterizadas quanto à sua capacidade para ligar a proteína alvo. Para identificar as sequências de ADN que codificam moléculas sintéticas evoluídas que sobrevivem à selecção, moldes amplificados por PCR são clonados em vectores, transformados em células e sequenciados na forma de clones individuais. A sequenciação do ADN destes moldes subclonados revela a identidade das moléculas sintéticas que sobrevivem à selecção. Para obter informação geral acerca de grupos funcionais seleccionados durante ciclos de evolução, populações de moldes são sequenciados em conjuntos para revelar a distribuição de A, G, T e C em cada posição do codão. O cuidadoso desenho do código genético de cada grupo funcional permite obter informação considerável a partir da sequenciação da população. Por exemplo, uma G na primeira posição de um codão pode designar um grupo carregado, enquanto uma C nesta posição pode codificar um substituinte hidrófobo. 86

ΕΡ 1 423 400 /PT

Para validar a selecção por ligação a integrina e para comparar membros da biblioteca seleccionados com ligandos de integrina ανβ3 conhecidos, são também incluídos os análogos linear GRGDSPK e cíclico RGDfV (iso-ERGDfV cíclico) na biblioteca de péptidos cíclicos modelada por ADN. As condições de selecção são ajustadas até se verificar que as bibliotecas contendo estes ligandos de integrina conhecidos sofrem enriquecimento dos moldes de ADN que codificam os ligandos conhecidos por selecção quanto a ligação a integrina. Em adição, o grau de enriquecimento de sequências molde que codificam estes ligandos de integrina (Χνβ3 conhecidos, é correlacionado com as suas afinidades conhecidas e com o enriquecimento e a afinidade de ligandos de integrina ανβ3 identificados de novo.

Uma vez confirmado o enriquecimento de sequências molde que codificam ligandos de integrina conhecidos e novos, novos ligandos evoluídos serão sintetizados por síntese não modelada por ADN e ensaiados quanto à sua actividade e especificidade de antagonista de receptor integrina ανβ3. Realizam-se ensaios de ligação in vitro Standard para receptores integrina (Dechantsreiter et al. J. Med Chem. 1999, 42, 3033-40) por competição da ligação de fibrinogénio biotinilado (um ligando de integrina natural) a receptor integrina imobilizado com o ligando a ensaiar. A inibição da ligação a fibrinogénio é quantificada por incubação com um anticorpo anti-biotina conjugado com fosfatase alcalina e um substrato de fosfatase alcalina cromogénico. A comparação das afinidades de ligação de membros da biblioteca escolhidos aleatoriamente antes e após a selecção irá validar a evolução da biblioteca no sentido da ligação ao alvo. Os ensaios de ligação de proteínas não alvo revela a capacidade destas bibliotecas para serem evoluídas no sentido da especificidade, em adição à afinidade, de ligação.

Similarmente, a selecção por ligação a factor Xa é validada incluindo os inibidores tripeptídicos conhecidos de factor Xa no desenho da biblioteca e verificando que um ciclo de selecção por ligação a factor Xa e amplificação por PCR resulta no enriquecimento dos seus moldes de ADN associados. Os membros da biblioteca sintética evoluídos para ligar factor Xa são ensaiados in vitro quanto à sua capacidade para inibir 87 ΕΡ 1 423 400 /PT a actividade de factor Xa. A inibição do factor Xa pode ser facilmente ensaiada espectrofotometricamente utilizando o substrato cromogénico S-2765 comercialmente disponível (Chromogenix, Itália).

Embora a sequência de ADN sozinha de um membro de uma biblioteca de péptidos não naturais provavelmente revele a identidade exacta do péptido correspondente, o passo final na síntese da biblioteca bicíclica é uma cicloadição 1,3-dipolar intramolecular não modelada por ADN que pode originar pares diastereoméricos de regioisómeros. Embora a modelação sugira fortemente que apenas o regioisómero mostrado na Fig. 38 se pode formar por razões estereoquímicas, a selectividade facial é menos certa. A pureza diastereomérica não é um requisito para as selecções in vitro atrás descritas pois cada molécula é seleccionada com base num única molécula. Apesar disso, pode ser útil caracterizar a diastereosselectividade da cicloadição dipolar. Para o conseguir, é realizada a síntese não modelada por ADN de membros seleccionados da biblioteca bicíclica, os diastereómeros são separados por HPLC quiral preparativa, e a estereoquímica do produto é determinada por difracção de raios-X ou nOe.

Exemplo 9: Tradução de ADN em Polímeros Não Naturais Utilizando ADN-Polimerases:

Uma abordagem alternativa á tradução de ADN em polímeros não naturais, evoluíveis, toma vantagem da capacidade de algumas ADN-polimerases para aceitar certos substratos nucleótido-trifosfato modificados (D.M. Perrin et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1556; D.M. Perrin et al. Nucleosides

Nucleotides 1999, 18, 377-91; T. Gourlain et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1898-1905; S. E. Lee et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1565-73; K. Sakthievel et al. Angew. Chem. Int. Ed 1998, 37, 2872-2875) . Sabe-se que vários desoxirribonucleótidos (Fig. 45) e ribonucleótidos portadores de modificações em grupos que não participam nas ligações de hidrogénio de Watson-Crick são inseridos com elevada fidelidade de sequência em oposição a moldes de ADN naturais. De modo importante, ADN de cadeia simples contendo nucleótidos modificados pode servir como moldes eficientes para a incorporação catalisada por ADN-polimerase de mononucleótidos naturais ou modificados. Num dos primeiros exemplos de 88

ΕΡ 1 423 400 /PT incorporação de nucleótidos modificados por ADN-polimerase, Toole e colaboradores relataram a aceitação de 5-(1-pentinil)-desoxiuridina 1 por ADN-polimerase Vent sob condições de PCR (J.A. Latham et al. Nucleic Acids Res. 1994, 22, 2817-22).

Verificou-se subsequentemente que vários derivados de desoxiuridina funcionalizados em 5 (2—7) adicionais são aceites por ADN-polimerases termostáveis adequadas para PCR (K. Sakthievel et al. Angew. Chem. Int. Ed 1998, 37, 2872- 2875). A primeira purina funcionalizada aceite por ADN-polimerase, o análogo de desoxiadenosina 8, foi incorporado no ADN por ADN-polimerase de T7 juntamente com o análogo de desoxiuridina 7 (D.M. Perrin et al. Nucleosides Nucleotides 1999, 18, 377-91). Bibliotecas de ADN contendo tanto 7 como 8 foram seleccionadas com sucesso quanto a actividade de clivagem de ARN independente de metais (D.M. Perrin et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1556-63). Williams e colaboradores recentemente testaram vários derivados de desoxiuridina quanto à aceitação por ADN-polimerases Taq e concluíram que a aceitação é maior quando se utilizam uridinas modificadas em C5 portadoras de grupos alcino ou trans-alceno rígidos tais como 9 e 10 (S.E. Lee et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1565-73). Um estudo similar (T. Gourlain et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1898-1905) sobre 7-desaza-desoxiadenosinas funcionalizadas em C7 revelou a aceitação por ADN-polimerase Taq de 7-aminopropil- (11), cis-7-aminopropenil- (12), e 7-aminopropinil-7-desazadesoxiadenosina (13).

Os nucleótidos funcionalizados incorporados por ADN-polimerases até à data, mostrados na Fig. 46, focaram-se na adição de funcionalidade ácida e básica "tipo proteína" ao ADN. Embora equipar ácidos nucleicos com a funcionalidade ácida geral e básica geral como grupos amina primária e carboxilato possa aumentar a capacidade de catalisadores de ácido nucleico, os grupos funcionais presentes em bases de ácido nucleico natural já tinham demonstrado a capacidade de servir como ácidos e bases gerais. Pensa-se que a ribozima da hepatite delta, por exemplo, utiliza uma amina endocíclica da citosina 75 modulada por pKa como ácido geral (S. Nakano et al. Science 2000, 287, 1493-7) e a actividade de peptidil-transferase do ribossoma pode similarmente assentar em catálise básica geral ou ácida geral (G.W. Muth et al. Science 2000, 289, 947-50; P. Nissen et al. Science 2000, 289, 920- 89

ΕΡ 1 423 400 /PT 930; Ν. Ban et al. Science 2000, 289, 905-920) embora este último caso permaneça o objecto de debate actual (N. Polacek et al. Nature 2001, 411, 498-501). Equipar bases de ADN com grupos ácidos e básicos de Bronsted adicionais pode, portanto, não expandir profundamente o âmbito da catálise de ADN.

Em contraste com a simples funcionalidade ácida geral e básica geral, centros quirais metálicos expandiriam consideravelmente o âmbito químico de ácidos nucleicos. A funcionalidade pretendida na ligação química de centros metálicos potentes ainda não foi incorporada em polímeros de ácido nucleico. O ADN natural demonstrou a capacidade de se dobrar em estruturas tridimensionais complexas capazes de estereoespecificamente ligar moléculas alvo (C.H. Lin et al. Chem. Biol. 1997, 4, 817-32; C.H. Lin et al. Chem. Biol. 1998, 5, 555-72; P. Schultze et al. J. Mol. Biol. 1994, 235, 1532-47) ou catalisar a manipulação de ligações fosfodiéster (S.W. Santoro et al. Proc. Natl. Acad Sei. USA 1997, 94, 4262-6; R. R. Breaker et al. Chem. Biol. 1995, 2, 655-60; Y. Li et al. Biochemistry 2000, 39, 3106-14; Y. Li et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999, 96, 2746-51) . A despurinação de ADN (T.L. Sheppard et al. Proc. Natl. Acad Sei. USA 2000, 97, 7802-7807) e a metalação de porfirina (Y. Li et al. Biochemistry 1997, 36, 5589-99; Y. Li et al. Nat. Struct. Biol. 1996, 3, 743-7). Os ácidos nucleicos não naturais aumentados com a capacidade de ligar metais quimicamente potentes, compatíveis com água, tais como Cu, La, Ni, Pd, Rh, Ru ou Sc podem possuir propriedades catalíticas grandemente expandidas. Por exemplo, um oligonucleótido de ligação a Pd dobrado numa estrutura bem definida pode possuir a capacidade de catalisar reacções de acoplamento mediadas por Pd com um elevado grau de regioespecificidade ou estereoespecificidade. Similarmente, os ácidos nucleicos não natural que formam locais de ligação a Sc quirais podem servir como catalisadores de cicloadição ou adição aldólica enantiosselectivas. A capacidade de ADN-polimerases para traduzir sequências de ADN nestes polímeros não natural acoplados a selecções in vitro quanto a actividades catalíticas permitiria portanto a evolução directa de catalisadores desejados a partir de bibliotecas aleatórias. A evolução de catalisadores nesta abordagem aborda a dificuldade de desenhar racionalmente locais catalíticos 90

ΕΡ 1 423 400 /PT activos com propriedades químicas específicas que inspiraram recentes abordagens combinatórias (K.W. Kuntz et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 313-319; M.B. Francis et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 422-8) à identificação de catalisadores organometálicos. Por exemplo, Hoveyda e colaboradores identificaram catalisadores de epoxidação enantiosselectiva à base de Ti por rastreio em série de ligandos peptídicos (K.D. Shimizu et al. Angew. Chem. Int. Ed. 1997, 36) . O rastreio em série foi também utilizado por

Jacobsen e colaboradores para identificar ligandos peptídicos que formam catalisadores de epoxidação enantiosselectivos quando complexados com catiões metálicos (M.B. Francis et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999, 38, 937-941). Recentemente, uma biblioteca de péptidos contendo cadeias laterais de fosfina foi rastreada quanto à capacidade de catalisar adição de éster malonato a acetato de ciclopentenilo na presença de Pd (S.R. Gilbertson et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 6522- 6523). A presente abordagem difere fundamentalmente de esforços prévios de descoberta de catalisadores combinatórios, contudo, na medida em que permite que catalisadores com propriedades desejadas surjam espontaneamente de bibliotecas em fase de solução, num só vaso, após ciclos de evolução de diversificação, amplificação, tradução e selecção. Esta estratégia permite gerar e seleccionar quanto às propriedades desejadas, numa única experiência, até 1015 diferentes catalisadores. A compatibilidade da nossa abordagem com selecções in vitro num só vaso permite a selecção directa de catálise da reacção em vez de rastreio quanto a um fenómeno associado com catálise tal como ligação de metais ou geração de calor. Em adição, propriedades difíceis de rastrear rapidamente como a estereoespecificidade de substrato ou selectividade de metal, podem ser directamente seleccionadas utilizando a nossa abordagem (veja-se adiante).

Sintetizaram-se intermediários chave de vários análogos de uridina funcionalizados em C5 e análogos 7-desaza-adenosina funcionalizados em C7 para incorporação em polímeros de ADN não naturais. Em adição, foi completada a síntese de seis análogos de adenosina funcionalizados em C8 na forma de desoxirribonucleótido-trifosfatos. Como apenas existe informação limitada sobre a capacidade de ADN-polimerases aceitarem nucleótidos modificados, escolhemos sintetizar 91 ΕΡ 1 423 400 /PT análogos, que foram sintetizados, que não apenas irão levar a funcionalidade de ligação a metais aos ácidos nucleicos como também irão proporcionar entendimento dos determinantes da aceitação da ADN-polimerase. A estratégia para a síntese de análogos 7-desaza-adenosina e uridina de ligação a metais é mostrada na Fig. 47. Ambas as vias com formação de ligações amida entre ésteres NHS de grupos funcionais de ligação a metal e desoxirribonucleótido-trifosfatos modificados no amino (7 e 13) . Mostrou-se anteriormente que os análogos 7 e 13 assim como os derivados acetilados de 7, (D.M. Perrin et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1556-63; D.M. Perrin et al. Nucleosides Nucleotides 1999, 18, 377-91; J.A. Latham et al. Nucleic Acids Res. 1994, 22, 2817-22; T. Gourlain et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1898-1905; S.E. Lee et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1565-73; K. Sakthivel et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 2872-2875) são tolerados por ADN-polimerases, incluindo ADN-polimerases termostáveis adequadas para PCR. Esta abordagem convergente permite que uma ampla variedade de ligandos de ligação a metais seja rapidamente incorporadas em cada análogo de nucleótido. A síntese de 7 foi completada seguindo uma via anteriormente relatada (K. Sakthivel et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 2872-2875) (Fig. 48, Phillips, Chorba, Liu, resultados não publicados). O acoplamento de Heck de 5-iodo-2'-desoxiuridina (22) comercialmente disponível com N-aliltrifluoroacetamida proporcionou 23. O grupo 5'-trifosfato foi instalado por tratamento de 23 com trimetilfosfato, P0C13 e esponja de protões (1,8-bis(dimetilamino)naftaleno) seguidos de pirofosfato tri-n-butilamónio, e o grupo trifluoroacetamida foi então removido com amónia aquosa para originar 7.

Foram completados vários passos no sentido da síntese de 13, o intermediário chave para análogos de 7-desaza-adenosina (Fig. 49). Seguindo uma via conhecida (J. Davoll. J. Am. Chem. Soc. 1960, 82, 131-138) sintetizou-se dietoxietilcianoacetato (24) a partir de bromoacetal 25 e cianoacetato de etilo (26). A condensação de 24 com tioureia proporcionou a pirimidina 27, que foi dessulfurada com níquel de Raney e depois ciclizada em pirrolopirimidina 28 com HC1 aquoso diluído. 0 tratamento de 28 com POCI3 produziu 4-cloro- 92 ΕΡ 1 423 400 /PT 7-desaza-adenina (29). O grupo iodeto de arilo que servirá como um parceiro de acoplamento de Sonogashira para a instalação da amina propargílica em 13 foi instalado por reacção de 29 com N-iodossuccinimida para gerar 4-cloro-7-iodo-7-desaza-adenina (30) com 13% de rendimento global a partir do bromoacetal 25.

Como análogos de adenina funcionalizados alternativos que irão tanto sondar os requisitos estruturais de aceitação da ADN-polimerase como proporcionar uma funcionalidade de ligação a metais potencial, sintetizaram-se seis desoxiadenosina-trifosfatos modificados em 8 (Fig. 50). Todos os grupos funcionais foram instalados por adição a 8-bromo-desoxiadenosina (31), que foi preparada por bromação de desoxiadenosina na presença de SCCI3, que verificámos aumentar grandemente o rendimento de produto. Sintetizaram-se metil-(32), etil- (33), e viniladenosina (34) por acoplamento de Stille mediado por Pd do correspondente reagente de alquilestanho e 31 (P. Mamos et al. Tetrahedron Lett. 1992, 33, 2413-2416). Prepararam-se metilamino- (35) (E. Nandanan et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 1625-1638), etilamino- (36), e histaminoadenosina (37) por tratamento de 23 com a correspondente amina em água ou etanol. Os 5'-nucleótido-trifosfatos de 32-37 foram sintetizados como descrito atrás. A capacidade de ADN-polimerases termostáveis adequadas para amplificação por PCR para aceitar estes nucleótido-trifosfatos modificados contendo funcionalidade de ligação a metais. Purificaram-se nucleótido-trifosfatos não naturais por HPLC de permuta iónica e adicionaram-se a reacções PCR contendo ADN-polimerase Taq, três desoxinucleótido-trifosfatos naturais, ADN molde de pUC19, e dois iniciadores de ADN. Os iniciadores foram escolhidos para gerar produtos de PCR variando de 50 a 200 pares de bases de comprimento. As reacções de PCR de controlo continham os quatro desoxinucleótido-trifosfatos naturais e nenhum nucleótido não natural. Analisaram-se as reacções PCR por electroforese em gel de agarose ou acrilamida desnaturante. O derivado de uridina modificado no amino 7 foi eficientemente incorporado por ADN-polimerase Taq ao longo de 30 ciclos de PCR, enquanto o trifosfato de 23 não foi um substrato eficiente para a polimerase (Fig. 51) . Verificações anteriores sobre a 93 ΕΡ 1 423 400 /PT aceitação de 7 pela ADN-polimerase Taq estão em conflito, tanto com a não aceitação (K. Sakthivel et al. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 1998, 37, 2872-2875) como com a aceitação (S.E. Lee et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1565-73) relatadas. Síntese de Desoxirribonucleótido-Trifosfato Não Natural de Ligação a Metals: Serão completadas as sínteses de desoxinucleótido-trifosfatos de uridina funcionalizada C5, 7-desaza-adenosina funcionalizada em C7 e adenosina funcionalizada em C8. A síntese dos derivados de 7-desaza-adenosina a partir de 4-cloro-7-iodo-desaza-adenina (30) prossegue por glicosilação de 30 com cloreto de desoxirribosilo protegido 38 seguida por amonólise para originar 7-iodoadenosina (39) (Fig. 31) (Gourlain et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1898-1905). 0 cloreto de desoxirribosilo protegido 38 pode ser gerado a partir de desoxirribose como mostrado na Fig. 52. 0 acoplamento de Sonogashira mediado por Pd (Seela et al. Helv. Chem. Acta 1999, 82, 1878-1898) de 39 com N-propiniltrifluoroacetamida proporciona 40, que é então convertida no 5'-nucleótido-trifosfato e desprotegida com amónia como atrás descrito para originar 13.

Para gerar rapidamente uma colecção de análogos de uridina e adenosina de ligação a metais, uma variedade de grupos de ligação a metais como ésteres NHS serão acoplados ao intermediário de uridina modificada em C5 7 (já sintetizado) e ao intermediário de 7-desaza-adenosina modificado em C7 13. Os grupos de ligação a metais que serão examinados inicialmente estão mostrados na Fig. 47 e incluem fosfinas, grupos tiopiridilo e porções hemi-salen. Se os nossos ensaios iniciais de aceitação por polimerase (veja-se a secção seguinte) de trifosfatos de adenosinas modificadas em 8, 32-37 (Fig. 50) sugerirem que uma variedade de análogos de adenosina modificados em 8 são aceites por polimerases termostáveis, alquil- e viniltrifluoroacetamidas serão acopladas a 8-bromo-desoxiadenosina (31) para gerar nucleótido-trifosfatos tais como 41 e 42 (Fig. 53). Estes intermediários são então acoplados aos ésteres NHS mostrados na Fig. 46 para gerar uma variedade de desoxiadenosina-trifosfatos de ligação a metais funcionalizados em 8. 94

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Avaliação de Nucleótidos Não Naturais: Cada desoxirribonucleótido-trifosfato funcionalizado é então ensaiado quanto à sua adequabilidade como bloco de construção de uma biblioteca de polímeros não naturais evoluivel em duas etapas. Primeiro, a aceitação simples por ADN-polimerases termostáveis é medida por amplificação por PCR de fragmentos de ADN do plasmídeo pUC19 de vários comprimentos. As reacções PCR contêm iniciadores sintéticos desenhados para se ligarem nas extremidades do fragmento, uma pequena quantidade de ADN molde de pUC19, uma ADN-polimerase termostável (Taq, Pfu ou Vent), três desoxirribonucleótido-trifosfatos naturais e o nucleótido-trifosfato não natural a testar. A incorporação totalmente bem sucedida do nucleótido não natural resulta na produção de produtos de ADN de qualquer comprimento a uma velocidade similar à da reacção de controlo. Os nucleótidos que permitem pelo menos a incorporação de 10 ou mais nucleótidos não naturais numa só molécula produto com pelo menos uma modesta eficiência são submetidos à segunda etapa de avaliação.

Os nucleótidos não naturais aceites por ADN-polimerases termostáveis são avaliados quanto às suas possíveis propriedades mutagénicas. Se as ADN-polimerases inserem um nucleótido não natural oposto a uma base de molde incorrecta (que não de Watson-Crick), ou inserem um nucleótido natural incorrecto oposto a um nucleótido não natural no molde, a fidelidade da amplificação e tradução da biblioteca é comprometida. Para avaliar esta possibilidade, os produtos da PCR gerados no ensaio anterior são submetidos a sequenciação de ADN utilizando cada um dos iniciadores de PCR. Desvios à sequência do molde de pUC19 implicam que um ou ambos os mecanismos mutagénicos estão a ocorrer. Taxas de erro inferiores a 0,7% por base por 30 ciclos de PCR são aceitáveis, pois a PCR propensa a erros gera erros a aproximadamente esta taxa (Caldwell et al. PCT Methods Applic. 1992, 2, 28-33) e no entanto tem sido utilizada com sucesso para evoluir bibliotecas de ácido nucleico.

Promissores pares de análogos de adenosina não naturais e análogos de uridina não naturais são também testados conjuntamente quanto à sua capacidade para suportar a polimerização do ADN numa reacção PCR contendo ambos os 95

ΕΡ 1 423 400 /PT nucleótido-trifosfatos modificados juntamente com dGTP e dCTP. A formação bem sucedida de produto de PCR com dois nucleótido-trifosfatos não naturais permite a incorporação de duas bases de ligação a metais não naturais na mesma molécula polimérica. Os nucleótidos funcionalizados que são especialmente interessantes ainda que não sejam compatíveis com as ADN-polimerases termostáveis Taq, Pfu ou Vent, podem ainda ser utilizados nas bibliotecas desde que sejam aceites por uma ADN-polimerase comercialmente disponível tal como o fragmento de Klenow de ADN-polimerase I de E. coli, ADN-polimerase de T7, ADN-polimerase de T4 ou transcritase inversa de M-MuLV. Neste caso, os ensaios requerem a condução do passo de extensão de iniciadores da reacção PCR a 25-37°C, e polimerase fresca tem que ser adicionada a todos os ciclos após o passo de desnaturação a 94°C. A sequenciação de ADN para avaliar as possíveis propriedades mutagénicas do nucleótido não natural é ainda realizada como atrás descrito

Gerar Bibliotecas de Polímeros de Ligação a Metais: Com base nos resultados dos ensaios anteriores de nucleótidos não naturais, serão feitas várias bibliotecas de ~1015 diferentes sequências de ácido nucleico contendo uma ou duas das polimerases mais compatíveis e nucleótidos não naturais de ligação a metais quimicamente promissores. As bibliotecas são geradas por amplificação por PCR de uma biblioteca de moldes de ADN sintéticos consistindo numa região aleatória de 20 ou 40 nucleótidos flanqueada por duas regiões de iniciação constantes de 15 bases (Fig. 54). As regiões de iniciação contêm locais de clivagem para endonuclease de restrição para permitir a clonagem em vectores para sequenciação do ADN de conjuntos ou membros individuais da biblioteca. Um iniciador contém uma alça química tal como um grupo amina primária ou um grupo tiol no seu terminal 5' e torna-se a cadeia de codificação da biblioteca. 0 outro iniciador contém uma T biotinilada no seu terminal 5' e torna-se a cadeia não codificante. A reacção PCR inclui um ou dois desoxirribonucleótido-trifosfatos não naturais de ligação a metais, três ou dois desoxirribonucleótido-trifosfatos naturais, e uma ADN-polimerase compatível com o(s) nucleótido(s) não natural(ais). Após a reacção PCR para gerar a forma de cadeia dupla da biblioteca e purificação em gel para remover iniciadores não utilizados, as dúplices membros 96 ΕΡ 1 423 400 /PT da biblioteca são quimicamente desnaturadas. As cadeias não codificantes são removidas por várias lavagens com contas magnéticas ligadas a estreptavidina para assegurar que não permanecem cadeias biotiniladas na biblioteca. Bibliotecas de até 1015 diferentes membros são geradas por este método, excedendo de longe a diversidade combinada de esforços prévios de catalisadores combinatórios.

Cada biblioteca é então incubada em solução aquosa com um metal de interesse a partir da seguinte listagem não limitante de sais metálicos compatíveis com água (Fringueli et al. Eur. J. Org . Chem. 2001, 2001, 439-455 ; Zaitoun et a1. J. Phys. Chem. B 1997, 1857-1860): ScCl3, CrCl3, MnCl2, FeCl2, FeCl3, CoCl2, NiCl2, CuCl2, ZnCl2, GaCl3, YC13, RuC13, RhCl3, PdCl2,

AgCl, CdCl2, InCl3, SnCl2, La(OTf)3, Ce(OTf)3, Pr(OTf)3, Nd (OTf) 3, Sm (OTf) 3, Eu (OTf) 3, Gd(OTf)3, Tb(OTf)3, Dy(OTf)3, Ho (OTf) 3, Er (OTf) 3, Tm(OTf)3, Yb(OTf)3, Lu(OTf)3, IrCl3, PtCl2, AuCl, HgCl2, HgCl, PbCl2, ou BiCl3. Os metais são escolhidos com base nas reacções químicas específicas a catalisar. Por exemplo, bibliotecas com o objectivo de reacções tais como condensações aldólicas ou reacções de hetero-Diels-Alder que se sabe (Fringuelli et al. Eur. J. Org. Chem. 2001, 2001, 439-455) serem catalisadas por ácidos de Lewis são incubadas com ScCl3 ou com um dos triflatos de lantanídeo, enquanto as destinadas ao acoplamento de olefinas deficientes em electrões com halogenetos de arilo são incubadas com PdCl2. A biblioteca metalada é então purificada de sais de metais não ligados por filtração em gel utilizando cartuchos de Sephadex ou acrilamida, que separam oligonucleótidos de ADN de 25 bases ou mais de componentes de molécula pequena não ligados. A capacidade da biblioteca de polímeros (ou dos membros individuais da biblioteca) para ligarem metais de interesse é verificada tratando a biblioteca metalada livre de metais não ligados com reagentes de coloração de metal tais como ditiooxamida, dimetilglioxima, KSCN (Francis et al. Curr. Opin. Chem. Blol. 1998, 2, 422-8) ou EDTA (Zaitoun et al. J. Phys. Chem. B 1997, 101, 1857-1860) que ficam distintamente corados na presença de diferentes metais. O nível aproximado de ligação de metais é medido por comparação espectrofotométrica com soluções de metais livres de concentração conhecida e com soluções de controlo positivo de 97 ΕΡ 1 423 400 /PT oligonucleótidos contendo um grupo EDTA (que pode ser introduzido utilizando um fosforamidito comercialmente disponível de Glen Research).

Selecções In Vitro para Catalisadores Poliméricos Não Naturais: As bibliotecas metaladas de polímeros não naturais evoluíveis contendo grupos de ligação a metais são então submetidas a selecções em fase de solução num só vaso quanto a actividades catalíticas de interesse. Os membros da biblioteca que catalisam virtualmente qualquer reacção que causa a formação de ligações entre duas moléculas de substrato ou que resulta na quebra de ligações em duas moléculas de produto são seleccionados utilizando os esquemas propostos nas Fig. 54 e 55. Para seleccionar catalisadores de formação de ligações (por exemplo, catalisadores de hetero-Diels-Alder, acoplamento de Heck, reacção aldólica ou matatese de olefinas), os membros da biblioteca são ligados covalentemente a um substrato através dos seus terminais 5'-amino ou tiol. O outro substrato da reacção é sintetizado na forma de um derivado ligado a biotina. Quando soluções diluídas de conjugados biblioteca-substrato são feitas reagir com o conjugado substrato-biotina, os membros da biblioteca que catalisam a formação de ligações fazem com que o grupo biotina se ligue covalentemente a si próprios. Os catalisadores de formação de ligações activos podem então ser separados de membros da biblioteca inactivos por captura dos primeiros com estreptavidina imobilizada e lavagem dos polímeros inactivos (Fig. 55). contas. capazes

De uma maneira análoga, podem também ser seleccionados os membros da biblioteca que catalisam reacções de clivagem de ligações tais como reacções retro-aldólicas, hidrólise de amidas, reacções de eliminação ou di-hidroxilação de olefinas seguidas de clivagem por periodato. Neste caso, os membros da biblioteca metalada são covalentemente ligados a substratos biotinilados de modo a que a reacção de quebra de ligações cause o desligamento da porção biotina dos membros da biblioteca (Fig. 56). Por incubação sob as condições de reacção, os catalisadores activos, mas não os membros da biblioteca inactivos, induzem a perda dos seus grupos biotina. Contas ligadas a estreptavidina podem então ser utilizadas para capturar polímeros inactivos, enquanto os catalisadores activos são capazes de eluir das contas. Selecções 98 ΕΡ 1 423 400 /PT relacionadas de formação de ligações e clivagem de ligações foram utilizadas com sucesso em evolução de ARN e ADN catalíticos (Jâschke et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 257-62). Embora estas selecções não seleccionem explicitamente catálise de turnover múltiplo, os ARN e ADN seleccionados desta maneira provaram ser em geral catalisadores de turnover múltiplo quando separados das suas porções substrato (Jáschke et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 257-62; Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999, 96, 14712-7; Bartel et al. Science, 1993, 261, 1411-8; Sen et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 680-7).

Irão ser inicialmente evoluídos catalisadores de três importantes e diferentes reacções de formação de ligações: acoplamento de Heck, cicloadição de hetero-Diels-Alder, e adição aldólica. Todas as três reacções são compatíveis com água (Kobayashi et al. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8287-8288; Fringuelli et al. Eur. J. Org. Chem. 2001, 2001, 439-455; Li et al. Organic Reactions in Agueous Media: Wiley and Sons: New York, 1997) e sabe-se serem catalisadas por metais. Quanto a substratos do acoplamento de Heck, serão utilizadas tanto olefinas deficientes em electrões como inactivadas juntamente com iodetos de arilo e cloretos de arilo. Reacções de Heck com cloretos de arilo em solução aquosa, assim como reacções de Heck à temperatura ambiente com cloretos de arilo não activados, não foram ainda relatados tanto quanto sabemos. As bibliotecas para evolução de catalisadores de acoplamento de Heck utilizam PdCl2 como fonte de metal. Os substratos de hetero-Diels-Alder incluem dienos e aldeídos simples, enquanto os substratos da adição aldólica consistem em aldeídos e éteres sililenólicos assim como cetonas simples. Os esquemas de selecção representativos para catalisadores de acoplamento de Heck, hetero-Diels-Alder e adição aldólica estão representados na Fig. 57. 0 rigor destas selecções pode ser aumentado entre ciclos de selecção diminuindo os tempos de reacção, diminuindo as temperaturas de reacção ou utilizando substratos menos activados (por exemplo, cloreto de arilo com menor deficiências de electrões (Littke et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6989-7000) ou cetonas simples em vez de éteres sililenólicos). 99

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Evolução de Polímeros Não Naturais: Diversificação e Selecção quanto a Estereoespecificidade

Após cada ciclo de selecção, os membros activos da biblioteca são amplificados por PCR com os nucleótidos não naturais e submetidos a ciclos adicionais de selecção para enriquecer a biblioteca nos catalisadores desejados. Estas bibliotecas são verdadeiramente evoluídas por introdução de um passo de diversificação antes de cada ciclo de selecção. As bibliotecas são diversificadas por mutagénese aleatória utilizando PCR propensa a erros (Caldwell et al. PCR Methods Applic. 1992, 2, 28-33) ou por recombinação utilizando métodos de rearranjo de ADN modificados que recombinam pequenos fragmentos de ácido nucleico não homólogos. Como a PCR propensa a erros é inerentemente menos eficiente do que a PCR normal, a diversificação por PCR propensa a erros será conduzida com apenas dATP, dTTP, dCTP e dGTP naturais e utilizando iniciadores que não possuem alças químicas nem grupos biotina. Os produtos resultantes da mutagénese são então submetidos a tradução por PCR em polímeros de ácido nucleico não naturais utilizando reacções PCR Standard contendo o(s) nucleótido(s) não natural(ais), o iniciador biotinilado e o iniciador terminado com amino ou tiol.

Em adição à evolução simples de catalisadores activos, as selecções in vitro atrás descritas são utilizadas para evoluir bibliotecas de polímeros não naturais em sentidos poderosos difíceis de conseguir utilizando outras abordagens de identificação de catalisadores. Uma característica que permite estas selecções é a capacidade de seleccionar quer membros da biblioteca que estão biotinilados quer membros que não estão biotinilados. A especificidade para o substrato entre catalisadores pode portanto ser evoluída por selecção de catalisadores activos na presença do substrato desejado e depois selecção no mesmo vaso de catalisadores inactivos na presença de um ou mais substratos indesejados. Se os substratos desejados e indesejados diferem em configuração num ou mais estereocentros, podem surgir catalisadores enantiosselectivos ou diastereosselectivos dos ciclos de selecção. Similarmente, a selectividade para metais pode ser evoluída por selecção de catalisadores activos na presença de metais desejados e selecção de catalisadores inactivos na presença de metais indesejados. Inversamente, os catalisadores 100 ΕΡ 1 423 400 /PT com ampla tolerância a substratos podem ser evoluídos por variação das estruturas dos substratos entre ciclos sucessivos de selecção.

Finalmente, as observações de síntese específica da sequência modelada por ADN em DMF e CH2CI2 sugerem que os complexos ADN-catião tetralquilamónio podem formar estruturas de bases emparelhadas em solventes orgânicos. Esta verificação levanta a possibilidade de evolução dos nossos catalisadores de ácido nucleico não naturais em solventes orgânicos utilizando versões ligeiramente modificadas das selecções atrás descritas. As verdadeiras reacções de selecção de formação de ligações e clivagem de ligações serão conduzidas em solventes orgânicos, as misturas reaccionais em bruto serão precipitadas com etanol para remover os catiões tetra-alquilamónio, e será realizada a separação com avidina imobilizada de membros da biblioteca biotinilados e não biotinilados em solução aquosa. A amplificação por PCR de membros seleccionados ocorrerá então como atrás descrito. A evolução bem sucedida de catalisadores de reacção que funcionam em solventes orgânicos expandirá consideravelmente tanto o âmbito de reacções que podem ser catalisadas como a utilidade dos catalisadores poliméricos não naturais evoluídos resultantes.

Caracterização de Polímeros Não Naturais Evoluídos:

Bibliotecas submetidas a vários ciclos de evolução são caracterizadas quanto à sua capacidade de catalisar as reacções de interesse na forma de conjuntos de sequências mistas ou na forma de membros individuais da biblioteca. Membros individuais são subtraídos de conjuntos evoluídos por ligação de sequências amplificadas por PCR a vectores de ADN, transformação de soluções diluídas de vectores ligados em células bacterianas competentes, e escolha de colónias individuais de transformantes. São conduzidos ensaios de conjuntos ou de sequências individuais tanto no formato de turnover único como num verdadeiro formato catalítico de turnover múltiplo. Para os ensaios de turnover único, a velocidade a que os catalisadores de formação de ligações ligados ao substrato efectuam a sua própria biotinilação na presença de substrato biotinilado livre será medida, ou a velocidade a que os catalisadores de quebra de ligações 101 ΕΡ 1 423 400 /PT biotinilados efectuam a perda dos seus próprios grupos biotina. Ensaios de turnover múltiplo são conduzidos incubando catalisadores evoluídos com versões de molécula pequena de substratos e análise da velocidade de formação de produto por tlc, NMR, espectrometria de massa, HPLC ou espectrofotometria.

Uma vez evoluídos e verificados os catalisadores de turnover múltiplo por estes métodos, podem ser conduzidos estudos mecanísticos detalhados dos catalisadores. As sequências de ADN correspondentes aos catalisadores são reveladas por sequenciação de produtos de PCR ou vectores de ADN contendo os moldes de catalisadores activos. As preferências de metais são avaliadas por catalisadores de metalação com uma ampla variedade de catiões metálicos e medição das resultantes alterações de actividade. A especificidade e estereosselectividade para com o substrato destes catalisadores são avaliadas medindo as velocidades de turnover de uma série de análogos do substrato. As diastereosselectividades e enantiosselectividades de formação de produto são reveladas por comparação dos produtos da reacção com os de estereoquímica conhecida. Estudos prévios sugerem que os locais activos enterrados em grandes ambientes quirais possuem frequentemente elevados graus de estereosselectividade. Por exemplo, catalisadores à base de péptidos gerados em abordagens combinatórias demonstraram fracas a excelentes estereosselectividades que se correlacionam com a dimensão do ligando peptídico (Jarvo et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11638-11643) enquanto catalisadores à base de ARN e catalisadores à base de anticorpos frequentemente demonstram excelentes estereosselectividades (Jáschke et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 257-262; Seelig et al. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 2000, 39, 4576-4579; Hilvert, D. Annu. Rev. Biochem. 2000, 69, 751-93; Barbas et al. Science 1997, 278, 2085-92; Zhong et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999, 38, 3738-3741; Zhong et al. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 8131-8132; List et al. Org. Lett. 1999, 1, 59-61). As selecções directas quanto a estereosselectividade de substrato atrás descritas deverão ainda melhorar esta propriedade entre catalisadores evoluídos.

Estudos de estrutura-função de catalisadores evoluídos são grandemente facilitados pela facilidade da síntese

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automática de ADN. São introduzidas modificações estruturais especificas do local por síntese de sequências de ADN correspondentes a catalisadores "mutados" nos quais bases de interesse são alteradas para outras bases. Mudando as bases não naturais num catalisador para as bases naturais (U* para C ou A* G) e testando os mutantes resultantes pode-se os locais de ligação a metais quimicamente em cada catalisador. Os polímeros mínimos para uma eficiente catálise são determinados síntese e ensaio de versões progressivamente truncadas de catalisadores activos. Finalmente, as estruturas tridimensional da maioria dos catalisadores interessantes evoluídos complexados com metais são resolvidas em colaboração com espectroscopistas de RMN macromolecular ou cristalógrafos de raios-X locais. para identificar importantes necessários através da

Lisboa,

Claims

ΕΡ 1 423 400 /PT 1/9 REIVINDICAÇÕES 1. Método de realização de síntese modelada por ácido nucleico, o método compreendendo os passos de: (a) proporcionar (i) um molde compreendendo uma primeira unidade reactiva covalentemente associada a um primeiro oligonucleótido que define a sequência de um primeiro codão, e (ii) uma unidade de transferência compreendendo uma segunda unidade reactiva associada a um segundo oligonucleótido que define a sequência de um primeiro anti-codão complementar com a sequência do primeiro codão do molde; (b) hibridar as sequências do primeiro codão e do primeiro anti-codão para colocar a primeira unidade reactiva e a segunda unidade reactiva em proximidade reactiva; e (c) induzir uma reacção entre as primeira e segunda unidades reactivas para produzir um produto de reacção.
2. Método de realização de síntese modelada por ácido nucleico, o método compreendendo os passos de: (a) proporcionar (i) um molde amplificável compreendendo uma primeira unidade reactiva associada a um primeiro oligonucleótido que define a sequência de um primeiro codão, e (ii) uma primeira unidade de transferência compreendendo uma segunda unidade reactiva associada a um segundo oligonucleótido que define a sequência de um anti-codão complementar à sequência do primeiro codão; (b) hibridar as sequências de codão e anti-codão para colocar a primeira unidade reactiva e a segunda unidade reactiva em proximidade reactiva; (c) induzir uma reacção entre as primeira e segunda unidades reactivas para produzir um produto de reacção; e (d) amplificar o molde
3. Método de realização de síntese modelada por ácido nucleico, o método compreendendo os passos de: (a) proporcionar (i) um molde compreendendo uma primeira unidade reactiva associada a um primeiro oligonucleótido que define a sequência de um primeiro codão e a sequência de um segundo codão diferente, e (ii) uma primeira unidade de transferência compreendendo uma segunda unidade reactiva ΕΡ 1 423 400 /PT 2/9 associada a um segundo oligonucleótido que define a sequência de um primeiro anti-codão complementar à sequência do primeiro codão do molde; (b) hibridar a sequência do primeiro codão e a sequência do primeiro anti-codão para colocar a primeira unidade reactiva e a segunda unidade reactiva em proximidade reactiva; (c) induzir uma reacção entre as primeira e segunda unidades reactivas para produzir um produto de reacção; e (d) seleccionar o produto de reacção associado ao molde.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a segunda unidade reactiva está ligada covalentemente ao segundo oligonucleótido.
5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que o molde compreende ainda a sequência de um segundo codão diferente.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, compreendendo ainda proporcionar uma segunda unidade de transferência capaz de hibridar com a sequência do segundo codão diferente do molde.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que as primeira e segunda unidades de transferência são proporcionadas juntas no passo (b).
8. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda o passo adicional de selecção do produto de reacção associado ao molde.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o produto de reacção está covalentemente ligado ao molde.
10. Método de acordo com a reivindicação 8, compreendendo ainda o passo adicional de amplificar o molde.
11. Método de acordo com a reivindicação 8, compreendendo ainda o passo adicional de determinar a sequência do molde, para desse modo facilitar a identificação do produto de reacção. ΕΡ 1 423 400 /PT 3/9
12. Método de acordo com a reivindicação 2 ou a reivindicação 3, compreendendo ainda o passo adicional de determinar a sequência do molde, para desse modo facilitar a identificação do produto de reacção.
13. Método de acordo com a reivindicação 2 ou a reivindicação 3, em que a primeira unidade reactiva está ligada covalentemente ao primeiro oligonucleótido.
14. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a primeira unidade reactiva está ligada não covalentemente ao primeiro oligonucleótido.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a primeira unidade reactiva está ligada ao primeiro oligonucleótido por via de um terceiro oligonucleótido que hibrida com o primeiro oligonucleótido.
16. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o molde é amplificado por uma reacção em cadeia com polimerase.
17. Método de acordo com a reivindicação 2, compreendendo ainda o passo adicional de seleccionar o produto de reacção associado ao molde.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o produto de reacção está covalentemente ligado ao molde.
19. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o produto de reacção está ligado não covalentemente ao molde.
20. Método de acordo com a reivindicação 3, compreendendo ainda proporcionar uma segunda unidade de transferência compreendendo um terceiro oligonucleótido compreendendo a sequência de um segundo anti-codão capaz de hibridar com a sequência do segundo codão diferente do molde.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a segunda unidade de transferência compreende ainda uma terceira unidade reactiva. ΕΡ 1 423 400 /PT 4/9
22. Método de acordo com a reivindicação 21, compreendendo ainda, antes do passo (d), os passos de: (e) hibridar a sequência do segundo anti-codão com a sequência do segundo codão, diferente, do molde; e (f) induzir uma reacção entre a terceira unidade reactiva e o produto de reacção, para desse modo produzir um produto de reacção modificado para ser seleccionado no passo (d).
23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o passo (e) precede o passo (c).
24. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a primeira unidade reactiva está ligada covalentemente ao primeiro oligonucleótido.
25. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a primeira unidade reactiva está ligada não covalentemente ao primeiro oligonucleótido.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a primeira unidade reactiva está ligada não covalentemente ao primeiro oligonucleótido por via de uma sequência oligonucleotidica que híbrida com o primeiro oligonucleótido.
27. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a segunda unidade reactiva está ligada covalentemente ao segundo oligonucleótido.
28. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o produto de reacção está covalentemente ligado ao molde.
29. Método de acordo com a reivindicação 3, compreendendo ainda o passo adicional de amplificar o molde.
30. Método de acordo com a reivindicação 3, compreendendo ainda o passo adicional de determinar a sequência do molde, para desse modo facilitar a identificação do produto de reacção.
31. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a primeira unidade reactiva compreende uma molécula de esqueleto capaz de reagir com uma pluralidade de reagentes. ΕΡ 1 423 400 /PT 5/9
32. Método de realização de síntese modelada por ácido nucleico, o método compreendendo os passos de: (a) proporcionar (i) um molde compreendendo uma molécula de esqueleto associada a um primeiro oligonucleótido que define a sequência de um primeiro codão e a sequência de um segundo codão diferente, a molécula de esqueleto compreendendo uma pluralidade de locais para modificação, e (ii) uma primeira unidade de transferência compreendendo uma unidade reactiva ligada covalentemente a um segundo oligonucleótido que define a sequência de um primeiro anti-codão complementar à sequência do primeiro codão; (b) hibridar a sequência do primeiro codão e a sequência do primeiro anti-codão para colocar a molécula de esqueleto e a unidade reactiva em proximidade reactiva; e (c) induzir uma reacção de formação de ligação covalente entre a unidade reactiva e a molécula de esqueleto para produzir uma molécula de esqueleto modificada.
33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que a molécula de esqueleto está ligada covalentemente ao primeiro oligonucleótido.
34. Método de acordo com a reivindicação 32, em que a unidade reactiva está ligada covalentemente ao segundo oligonucleótido.
35. Método de acordo com a reivindicação 32, compreendendo ainda proporcionar uma segunda unidade de transferência compreendendo uma unidade reactiva associada a um terceiro oligonucleótido que define a sequência de um segundo anti-codão capaz de hibridar com a sequência do segundo codão diferente do molde.
36. Método de acordo com a reivindicação 32, compreendendo ainda o passo de hibridar a sequência do segundo anti-codão da segunda unidade de transferência com a sequência do segundo codão diferente do molde.
37. Método de acordo com a reivindicação 36, compreendendo ainda o passo de induzir uma ligação covalente ΕΡ 1 423 400 /PT 6/9 entre a molécula de esqueleto modificada e a segunda unidade reactiva.
38. Método de acordo com a reivindicação 32, compreendendo ainda o passo adicional de seleccionar uma molécula de esqueleto modificada associada ao molde.
39. Método de acordo com a reivindicação 38, em que a molécula de esqueleto modificada está ligada covalentemente ao molde.
40. Método de acordo com a reivindicação 38, compreendendo ainda o passo de amplificar o molde.
41. Método de acordo com a reivindicação 38, compreendendo ainda o passo de determinar a sequência do molde para facilitar a identificação da molécula de esqueleto modificada.
42. Método de acordo com a reivindicação 40, compreendendo ainda o passo de determinar a sequência do molde para facilitar a identificação da molécula de esqueleto modificada.
43. Método de acordo com a reivindicação 36, em que as primeira e segunda unidades de transferência são proporcionadas juntas no passo (b).
44. Método de acordo com a reivindicação 32, em que a molécula de esqueleto é capaz de reagir com uma pluralidade de reagentes.
45. Método de produção de uma pluralidade de produtos de reacção numa única solução, o método compreendendo os passos de: (a) proporcionar uma pluralidade de moldes compreendendo uma pluralidade de primeiras unidades reactivas associadas a uma pluralidade de primeiros oligonucleótidos correspondentes, em que cada primeiro oligonucleótido define pelo menos a sequência de um codão; (b) proporcionar uma pluralidade de unidades de transferência compreendendo uma pluralidade de segundas unidades reactivas ΕΡ 1 423 400 /PT 7/9 covalentemente ligadas a uma pluralidade de segundos oligonucleótidos correspondentes, em gue os segundos oligonucleótidos definem, cada um, a sequência de um anti-codão complementar à sequência de um codão; (c) hibridar oligonucleótidos possuindo sequências de codão e anti-codão complementares, para colocar as primeira e segunda unidades reactivas em proximidade reactiva; e (d) induzir reacções de formação de ligações covalentes entre as unidades reactivas sem a assistência de um ribossoma para produzir uma pluralidade de diferentes produtos de reacção.
46. Método de acordo com a reivindicação 45, compreendendo ainda o passo de seleccionar um produto de reacção possuindo uma propriedade desejada.
47. Método de acordo com a reivindicação 46, em que pelo menos um produto de reacção se liga a uma molécula alvo.
48. Método de acordo com a reivindicação 47, em que a molécula alvo é uma proteína.
49. Método de acordo com a reivindicação 47, em que a molécula alvo está imobilizada sobre um suporte sólido.
50. Método de acordo com a reivindicação 45, em que as primeiras unidades reactivas associadas com cada molde são diferentes.
51. Método de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos uma das unidades reactivas está ligada adjacente a uma região terminal do seu oligonucleótido correspondente.
52. Método de acordo com a reivindicação 1, em que cada uma das unidades reactivas está ligada adjacente a uma região terminal do seu oligonucleótido correspondente.
53. Método de acordo com a reivindicação 1, em que no molde o codão está disposto a pelo menos 10 bases de distância da sua unidade reactiva. ΕΡ 1 423 400 /PT 8/9
54. Método de acordo com a reivindicação 1, em que no molde o codão está disposto a pelo menos 20 bases de distância da sua unidade reactiva.
55. Método de acordo com a reivindicação 1, em que um dos oligonucleótidos compreende ainda um par de sequências complementares que hibridam uma com a outra para produzir um “gancho de cabelo".
56. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o molde proporcionado no passo (a) compreende ainda uma sequência oligonucleotidica que identifica a primeira unidade reactiva.
57. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a unidade reactiva da unidade de transferência está ligada através de um ligante ao segundo oligonucleótido.
58. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o produto de reacção permanece ligado através de um ligante ao segundo oligonucleótido da unidade de transferência.
59. Método de acordo com a reivindicação 57, em que a unidade de transferência compreende um ligante que, quando clivado, não deixa átomos no produto de reacção.
60. Método de acordo com a reivindicação 57, em que a unidade de transferência compreende um ligante que, quando clivado, deixa um átomo no produto de reacção.
61. Método de acordo com a reivindicação 57, em que o produto de reacção é automaticamente clivado do segundo oligonucleótido durante ou após a formação do produto de reacção.
62. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o molde é ADN ou ARN.
63. Método de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos um, entre o molde e a unidade de transferência, está imobilizado sobre uma superfície. ΕΡ 1 423 400 /PT 9/9 4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a primeira unidade reactiva e a segunda unidade reactiva reagem espontaneamente , após hibridaçao dos oligonucleótidos • 65. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a primeira unidade reactiva e a segunda unidade reactiva reagem após exposição a um catalisador. 66 . Método de acordo com a reivindicação 1, em que a primeira unidade reactiva e a segunda unidade reactiva reagem num solvente aquoso para produzir um produto de reacçao. 67. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a primeira unidade reactiva e a segunda unidade reactiva reagem num solvente orgânico para produzir um produto de reacção. Lisboa,