JP5254934B2 - 進化する新しい分子機能 - Google Patents
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Description
この出願は、(i)米国仮特許出願第60/404,395号(2002年8月19日出願)、(ii)米国仮特許出願第60/419,667号(2002年10月18日出願)、(iii)米国仮特許出願第60/432,812号(2002年12月11日出願)、(iv)米国仮特許出願第60/444,770号(2003年2月4日出願)、(v)米国仮特許出願第60/457,789号(2003年3月26日出願)、(vi)米国仮特許出願第60/469,866号(2003年5月12日出願)、(vii)米国仮特許出願第60/479,494号(2003年6月18日出願)の利益を主張する。これらの各々の開示は、本明細書中で参考として援用される。本出願はまた、米国仮特許出願第60/277,081号(2001年3月19日出願)、同第60/277,094号(2001年3月19日出願)、同第60/306,691号(2001年6月20日出願)、および同第60/353,565号(2002年2月1日出願)、ならびに米国特許出願第10/101,030号(2002年3月19日出願)、および同第10/102,056号(2002年3月19日出願)、そして国際特許出願第US02/08546(2002年3月19日出願)に関する。
本出願に記載される研究は、部分的に、契約番号N00014−00−1−0596、およびグラント番号00014−03−1−0749の下で、the Office for Naval Researchによって資金援助された。米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
新機能を有する分子を生成することへの古典的な「化学的アプローチ」が、前世紀を通して、創薬から材料科学の合成方法論に及ぶ範囲での適用に、広く使用されてきた。このアプローチにおいては、研究者らは、候補分子を合成もしくは単離し、これらの候補分子を所望の特性に関してアッセイし、活性化合物の構造を(未知であった場合)決定し、利用可能なアッセイおよび構造データに基づいて構造−活性関係を説明し、次いで、改善された特性を有するように設計された新世代の分子を合成する。コンビナトリアルケミストリー法(例えば、Eliseevら、(1999)COMBINATORIAL CHEMISTRY IN BIOLOGY 243:159−172;Kuntzら、(1999)CURRENT OPINION IN CHEMICAL BIOLOGY 3:313−319;Liuら、(1999)ANGEW.CHEM.INTL.ED.ENG.38:36、を参照のこと)がこのアプローチのスループットを上昇させた一方で、その基本的な限界は、依然として変化していない。いくつかの要因が、分子機能をもたらすこの化学的アプローチの有効性を制限する。第一に、新機能をもたらす構造変化を正確に予測する能力は、分子のわずかな高次構造上の再構成、不測の溶媒の相互作用、または結合もしくは反応現象の未知の立体化学的要求のために、しばしば無力である。結果として生じる構造−活性関係の複雑さは、推論的なリガンドの設計もしくは触媒の設計の成功(ハイスループット様式で行われるこれらの努力を含む)をしばしば制限する。第二に、候補化合物の収集物の各メンバーを、選択するよりもむしろアッセイもしくはスクリーニングする必要性は、各実験で探索され得る分子の数を制限する。最後に、合成分子を増幅する方法の欠如は、特徴化、スクリーニング、および構造解明のために生成されなければならない物質の最小量の必要性を課す。結果として、およそ106個を超える、異なる合成化合物のライブラリを生成することは、困難であり得る。
本発明は、目的の分子の、テンプレートに指向する合成、選択、増幅、および進化の範囲を拡張する種々の方法および組成物を提供する。核酸をテンプレートとする合成の間、核酸テンプレート内にコードされる情報は、2つ以上の反応物を、反応の近傍内に集めるために使用される。これらの方法は、例えば、従来のコンビナトリアル化学を用いて作製することがこれまで可能でなかった低分子およびポリマーライブラリの作製を可能にする。
(項目1)
核酸テンプレート化学反応の間の第一反応単位と第二反応単位との間の反応を誘導する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)(i)コドンを含む第一オリゴヌクレオチドと結合する第一反応単位を含むテンプレートおよび(ii)該コドンをアニーリング可能なアンチコドンを含む第二オリゴヌクレオチドと結合する第二反応単位を含む移動単位を提供する工程であって、ここで該コドンまたは該アンチコドンは、第一間隙領域および第二間隙領域を含む、工程;
(b)該第一反応単位および該第二反応単位を反応性近傍に導くため該オリゴヌクレオチドを共にアニーリングする工程であって、ここで該第一間隙領域および第二間隙領域を有する該コドンまたは該アンチコドンは、対応するアンチコドンまたはコドンとアニールされないオリゴヌクレオチドのループを生じる、工程;ならびに
(c)反応生成物を産生するために該反応単位との間に共有結合形成反応を誘導する工程、を包含する方法。
(項目2)
前記反応単位の少なくとも一つは、その対応するオリゴヌクレオドの隣接した末端領域に付着される、項目1に記載の方法。
(項目3)
それぞれの前記反応単位は、その対応するオリゴヌクレオチドの隣接する末端部分に付着される、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記コドンまたは前記アンチコドンは、その対応する反応単位から少なくとも10塩基離れて配置される、項目1、2、または3に記載の方法。
(項目5)
前記コドンまたは前記アンチコドンは、その対応する反応単位から少なくとも20塩基離れて配置される、項目1、2、または3に記載の方法。
(項目6)
前記コドンまたは前記アンチコドンは、その対応する反応単位に直接的に隣接して配置される、項目1、2、または3に記載の方法。
(項目7)
前記第一間隙領域および前記第二間隙領域を含む前記コドンまたは前記アンチコドンにおいて、該第一領域は、その対応するオリゴヌクレオチドの末端に直接的に隣接して配置される、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記コドンまたは前記アンチコドンの前記第一領域は、3、4、または5個の隣接したヌクレオチドを含む、項目1または7に記載の方法。
(項目9)
前記コドンまたは前記アンチコドンの前記第一領域は、5個の隣接したヌクレオチドを含む、項目1または7に記載の方法。
(項目10)
前記第二領域は、前記反応単位から少なくとも20塩基離れて配置される、項目1または7に記載の方法。
(項目11)
前記第二領域は、前記反応単位から少なくとも30塩基離れて配置される、項目1または7に記載の方法。
(項目12)
前記第一反応単位は、前記第一オリゴヌクレオチドに対して共有結合される、項目1に記載の方法。
(項目13)
前記第二反応単位は、前記第二オリゴヌクレオチドに対して共有結合される、項目1または12に記載の方法。
(項目14)
核酸テンプレート化学反応の間の第一反応単位と第二反応単位との間の反応を誘導する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)(i)近位端および遠位端を有する第一オリゴヌクレオチドと結合する第一反応単位を含み、ならびにコドン含むテンプレート、そして(ii)該コドンを用いてアニーリング可能なアンチコドンを含む第二オリゴヌクレオチドと結合する第二反応単位を含む移動単位を提供する工程であって、ここで該第一反応単位は、該第一オリゴヌクレオチドの該近位端および該遠位端の中間にある付着部位に付着される、工程;
(b)該第一反応単位および該第二反応単位を反応性近傍に導くため該オリゴヌクレオチドを共にアニーリングする工程、;ならびに
(c)反応生成物を産生するために該反応単位の間に共有結合形成反応を誘導する工程、を包含する方法。
(項目15)
前記テンプレートは、第二の、異なるアンチコドン配列をアニーリングすることが可能な第二の、異なるコドンを含む、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記第一反応単位の前記付着部位に対して、前記第一コドンは、近位に位置され、そして前記第二コドンは、遠位に位置される、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記第二コドンをアニーリングすることが可能である第二の、異なるアンチコドン配列を含む第三オリゴヌクレオチドと結合する第三反応単位を含む第二移動単位を提供することをさらに包含する、項目15または16に記載の方法。
(項目18)
前記第一移動単位の前記第一アンチコドンは、前記テンプレートの前記第一コドンをアニールし、前記第二移動単位の前記第二アンチコドンは、該テンプレートの前記第二コドンをアニールする、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記第一移動単位は、前記第二移動単位と同時に、前記テンプレートとアニールし、その結果、前記第二反応単位および前記第三反応単位は、前記第一反応単位と反応する、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記第一反応単位は、前記第一オリゴヌクレオチドに対して、共有結合される、項目14に記載の方法。
(項目21)
前記第二反応単位は、前記第二オリゴヌクレオチドに対して、共有結合される、項目14または20に記載の方法。
(項目22)
前記第三反応単位は、前記第三オリゴヌクレオチドに対して、共有結合される、項目17に記載の方法。
(項目23)
前記第一反応単位は、足場分子である、項目14に記載の方法。
(項目24)
核酸テンプレート合成における複数の反応物の中で反応選択性を増加する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)(i)所定のコドン配列を含む第一オリゴヌクレオチドと結合する第一反応単位を含むテンプレート、(ii)該コドン配列をアニーリングすることが可能なアンチコドン配列を含む第二オリゴヌクレオチドと結合する第二反応単位を含む第一移動単位、および(iii)該コドン配列をアニーリングすることが可能であるアンチコドン配列を有しない第三オリゴヌクレオチドと結合する第二反応単位とは異なる第三反応単位を含む第二移動単位を提供する工程;ならびに
(b)該第三反応単位と該第一反応単位との間の共有結合形成と比較して該第二反応単位と該第一反応単位との間の共有結合形成を高めるために、該テンプレートの該第一オリゴヌクレオチドに対する該第一移動単位の該第二オリゴヌクレオチドのアニーリングを可能とする条件の下、該テンプレート、該第一移動単位および第二移動単位を混合する工程、
を包含する、方法。
(項目25)
前記テンプレートは、捕捉可能な部分と結合される、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記第一移動単位は、捕捉可能な部分と結合される、項目24に記載の方法。
(項目27)
前記第二移動単位は、捕捉可能な部分と結合される、項目24に記載の方法。
(項目28)
前記捕捉可能な部分は、ビオチン、アビジン、およびストレプトアビジンよりなる群から選択される、項目25、26、または27に記載の方法。
(項目29)
前記捕捉可能な部分を捕捉する工程をさらに包含する、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記第一反応単位は、前記第一オリゴヌクレオチドに対して共有結合される、項目24に記載の方法。
(項目31)
前記第二反応単位は、前記第二オリゴヌクレオチドに対して共有結合される、項目24に記載の方法。
(項目32)
前記第三反応単位は、前記第三オリゴヌクレオチドに対して共有結合される、項目24に記載の方法。
(項目33)
前記第二反応単位および前記第三反応単位は、前記第一反応単位と独立に反応することが可能である、項目24に記載の方法。
(項目34)
前記第二反応単位および前記第三反応単位は、相互に反応することが可能である、項目24または33に記載の方法。
(項目35)
前記第二反応単位と前記第三反応単位との間の反応は、前記第一反応単位との、これらそれぞれの反応と両立しない、項目34に記載の方法。
(項目36)
複数の移動単位を提供する工程を包含する、項目24に記載の方法。
(項目37)
核酸テンプレート合成における複数の反応物の中で反応選択性を増加する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)(i)第一コドン配列および第二コドン配列を含む第一オリゴヌクレオチドを含むテンプレート、(ii)該第一コドン配列をアニーリングすることが可能な第一アンチコドン配列を含む第二オリゴヌクレオチドと結合する第一反応単位を含む第一移動単位、(iii)前記第二コドン配列をアニーリングすることが可能である第二アンチコドン配列を含む第三オリゴヌクレオチドと結合する第二反応単位を含む第二移動単位、および(iv)該第一コドン配列または該第二コドン配列をアニーリングすることが可能であるアンチコドン配列を有しない第四オリゴヌクレオチドと結合する第三反応単位を含む第三移動単位を提供する工程;ならびに
(b)該第三反応単位と該第一反応単位との間または、該第三反応単位と該第二反応単位との間の共有結合形成と比較して該第一反応単位と該第二反応単位との間の共有結合形成を高めるために、該第一コドン配列に対する該第一アンチコドン配列のアニーリングならびに該第二コドン配列に対する該第二アンチコドン配列のアニーリングを可能とする条件の下、該テンプレート、該第一移動単位、第二移動単位、および第三移動単位を混合する工程、
を包含する、方法。
(項目38)
前記テンプレートは、捕捉可能な部分と結合される、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記捕捉可能な部分は、ビオチン、アビジン、およびストレプトアビジンよりなる群から選択される、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記捕捉可能な部分は、前記第一移動単位および前記第二移動単位が、前記テンプレートにアニールされる場合、前記第一反応単位と前記第二反応単位との間反応より生じる反応生成物である、項目38に記載の方法。
(項目41)
前記第一反応単位は、前記第二オリゴヌクレオチドに対して共有結合される、項目37に記載の方法。
(項目42)
前記第二反応単位は、前記第三オリゴヌクレオチドに対して共有結合される、項目37に記載の方法。
(項目43)
前記第三反応単位は、前記第四オリゴヌクレオチドに対して共有結合される、項目37に記載の方法。
(項目44)
前記第三反応単位は、前記第一反応単位または第二反応単位と反応することが可能である、項目37に記載の方法。
(項目45)
前記第三反応単位は、前記第一反応単位および第二反応単位と反応することが可能である、項目37に記載の方法。
(項目46)
前記第三反応単位と前記第一反応単位との間の反応は、該第一反応単位と該第二反応単位との間の反応と両立しない、項目44または45に記載の方法。
(項目47)
前記第三反応単位と前記第二反応単位との間の反応は、該第一反応単位と該第二反応単位との間の反応と両立しない、項目44または45に記載の方法。
(項目48)
前記第一反応単位と第二反応単位との間の前記共有結合形成は、位置選択的距離依存性反応を介する、項目37に記載の方法。
(項目49)
立体選択的核酸テンプレート合成を実施する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)(i)反応単位と必要に応じて結合する第一オリゴヌクレオチドを含むテンプレート、および(ii)反応単位と結合する第二オリゴヌクレオチドをそれぞれ含む一以上の移動単位を提供する工程;
(b)少なくとも二つの該反応単位を、反応性近傍へと導き、反応生成物を形成するために該反応単位との間の共有結合の形成を誘導するために、該第一オリゴヌクレオチドおよび該第二ヌクレオチドをアニーリングする工程であって、ここで該反応生成物は、キラル中心を含み、そして該キラル中心で少なくとも60%の立体化学的な純度である、工程、
を包含する、方法。
(項目50)
前記反応生成物は、前記キラル中心で少なくとも80%の立体化学的な純度である、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記反応生成物は、前記キラル中心で少なくとも95%の立体化学的な純度である、項目49に記載の方法。
(項目52)
前記反応生成物は、前記キラル中心で少なくとも99%の立体化学的な純度である、項目49に記載の方法。
(項目53)
前記キラル中心は、前記反応生成物における前記共有結合に関係する原子にある、項目49に記載の方法。
(項目54)
立体選択的核酸テンプレート合成を実施する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)(i)一つのテンプレートは、第一の立体化学的な構造を有する第一反応単位と結合する第一オリゴヌクレオチドを含み、およびその他のテンプレートは、第二の、異なる立体化学的な構造を有する第一反応単位と結合する第一オリゴヌクレオチドを含む、少なくとも、二つのテンプレート、ならびに(ii)第二オリゴヌクレオチドと結合する第二反応単位を含む少なくとも一つの移動単位、を提供する工程であって、ここで該第二オリゴヌクレオチドの配列は、該第一オリゴヌクレオチドの配列に相補的である、工程;ならびに、
(b)該移動性単位の該第一反応単位が、反応生成物を産生するために該第一の立体化学的な構造を有する該第一反応単位または、第二の立体化学的な構造を有する該第二反応単位のいずれかと優先的に反応することを可能とする条件の下、該第一オリゴヌクレオチドおよび該第二オリゴヌクレオチドを共にアニーリングする工程、
を包含する、方法。
(項目55)
立体選択的の核酸テンプレート合成を実施する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)(i)第一反応単位に結合する第一オリゴヌクレオチドを含むテンプレート、ならびに(ii)一つの移動単位は、第一の立体化学的な構造を有する第二反応単位と結合する第二オリゴヌクレオチドを含み、およびその他の移動単位は、第二の、異なる立体化学的な構造を有する第二反応単位と結合する該第二オリゴヌクレオチドを含む、少なくとも二つの移動単位、を提供する工程であって、ここで該第二オリゴヌクレオチドの配列は、該第一オリゴヌクレオチドの配列に相補的である、工程;ならびに
(b)該テンプレートの該第一反応単位が、反応生成物を産生するために該第一の立体化学的な構造を有する該第二反応単位または、第二の立体化学的な構造を有する該第二反応単位のいずれかと優先的に反応することを可能とする条件の下、該第一オリゴヌクレオチドおよび該第二オリゴヌクレオチドを共にアニーリングする工程、
を包含する、方法。
(項目56)
前記反応生成物は、特定の立体化学的な構造を有する、項目54または、55に記載の方法。
(項目57)
前記第一オリゴヌクレオチドの立体化学的な構造または、高分子のコンフォメーションは、どの前記第一反応単位が、前記第二反応単位と優先的に反応するのかを、決定する、項目54に記載の方法。
(項目58)
前記第二オリゴヌクレオチドの立体化学的な構造または、高分子のコンフォメーションは、どの前記第二反応単位が、前記第一反応単位と優先的に反応するのかを、決定する、項目55に記載の方法。
(項目59)
項目54〜58の任意の一つの方法により、産生される反応生成物。
(項目60)
立体選択的核酸テンプレート合成を実施する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)(i)第一コドン配列および第二コドン配列を含む第一オリゴヌクレオチドを含むテンプレート、(ii)移動単位の第一対であって、ここで、該第一対の一つの移動単位は、第一の立体化学的な構造を有する第一反応単位と結合する第一アンチコドン配列を伴う第二オリゴヌクレオチドを含み、該第一対のその他の移動単位は、第二の立体化学的な構造を有する該第一反応単位と結合する該第二オリゴヌクレオチドを含む、第一対、ならびに(iii)移動単位の第二対であって、ここで、該第二対の一つの移動単位は、第一の立体化学的な構造を有する第二反応単位と結合する第二アンチコドン配列を伴う第三オリゴヌクレオチドを含み、該第二対のその他の移動単位は、第二の立体化学的な構造を有する該第二反応単位と結合する該第三オリゴヌクレオチドを含む、第二対、を提供する工程;そして、
(b)移動単位の該第一対のメンバーが、反応生成物を産生するために移動単位の該第二対のメンバーと優先的に反応することを可能とする条件の下、該テンプレート、移動単位の該第一対、および移動単位の該第二対をアニーリングする工程、
を包含する、方法。
(項目61)
前記反応生成物は、特定の立体化学的な構造を有する、項目60に記載の方法。
(項目62)
前記第二オリゴヌクレオチドの立体化学的な構造または、高分子のコンフォメーションは、どの移動単位の前記第一対のメンバーが、前記反応生成物を産生するために優先的に反応するのかを、決定する、項目60に記載の方法。
(項目63)
前記第三オリゴヌクレオチドの立体化学的な構造または、高分子のコンフォメーションは、どの移動単位の前記第二対のメンバーが、前記反応生成物を産生するために優先的に反応するのかを、決定する、項目60または62に記載の方法。
(項目64)
項目60〜63の任意の一つの方法により、産生される反応生成物。
(項目65)
核酸テンプレート合成生成物を濃縮する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)対応する複数のオリゴヌクレオチドに結合す複数の反応生成物を含む、分子の第一ライブラリーを提供する工程であって、ここで、各オリゴヌクレオチドは、該ヌクレオチドと共に結合する反応生成物を示すヌクレオチド配列を含み、およびここで、該反応生成物の一部は、予め選択された結合部分に結合することが可能である工程;
(b)該結合部分に結合可能な反応生成物が該結合部分に対して結合することを可能とする条件の下、該結合部分に分子の該第一ライブラリーを曝す工程;
(c)非結合性の反応生成物を除去する工程;ならびに
(d)該第一ライブラリーと比較して該結合部分に結合する反応生成物について少なくとも50倍に濃縮された分子の第二ライブラリーを産生するため該結合部分から結合性の反応生成物を溶出する工程、
を包含する、方法。
(項目66)
工程(b)において、前記結合部分は、固体支持体上に固定化される、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記結合部分は、標的生体分子である、項目65または66に記載の方法。
(項目68)
前記標的生体分子は、タンパク質である、項目67に記載の方法。
(項目69)
工程(d)において、前記第二ライブラリーは、前記結合部分に結合する反応生成物について少なくとも100倍に濃縮される、項目65に記載の方法。
(項目70)
工程(d)において、前記第二ライブラリーは、前記結合部分に結合する反応生成物について少なくとも1,000倍に濃縮される、項目65に記載の方法。
(項目71)
工程(b)、(c)、および(d)の繰り返しをさらに含む、項目65に記載の方法。
(項目72)
工程(b)、(c)、および(d)の繰り返しは、前記結合部分に結合する反応生成物について少なくとも10,000倍まで濃縮された第三のライブラリーを産生する、項目71に記載の方法。
(項目73)
前記ライブラリーは、前記結合部分に結合する反応生成物について少なくとも100,000倍まで濃縮される、項目72に記載の方法。
(項目74)
前記オリゴヌクレオチドは、前記予め選択された結合部分に結合可能な前記反応生成物を産生する第一反応単位を同定する第一配列を含む、項目65に記載の方法。
(項目75)
前記オリゴヌクレオチドは、前記予め選択された結合部分に結合可能な前記反応生成物を産生する第二反応単位を同定する第二配列を含む、項目74に記載の方法。
(項目76)
濃縮された反応生成物に結合するオリゴヌクレオチドを増幅するさらなる工程を包含する、項目65または71に記載の方法。
(項目77)
濃縮された反応生成物に結合するオリゴヌクレオチドの配列を決定するさらなる工程を包含する、項目65、71、74、または75に記載の方法。
(項目78)
増幅されたオリゴヌクレオチドの配列を決定するさらなる工程を包含する、項目76に記載の方法。
(項目79)
前記オリゴヌクレオチドの前記配列の情報から前記反応生成物を特徴付ける工程をさらに含む、項目77に記載の方法。
(項目80)
前記反応生成物を産生する新しい化学反応を同定する工程をさらに含む、項目79に記載の方法。
(項目81)
前記オリゴヌクレオチドの前記配列の情報から反応生成物を特徴付ける工程をさらに含む、項目78に記載の方法。
(項目82)
前記反応生成物を産生する新しい化学反応を同定する工程をさらに含む、項目81に記載の方法。
(項目83)
前記反応生成物は、対応する複数のオリゴヌクレオチドに対して共有結合される、項目65に記載の方法。
(項目84)
新しい化学反応を同定する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)対応する複数のオリゴヌクレオチドに結合する複数の反応生成物を含む分子のライブラリーを提供する工程であって、ここで各オリゴヌクレオチドは、該ヌクレオチドに結合する反応生成物を示すヌクレオチド配列を含む工程;
(b)その対応するオリゴヌクレオチドに結合する特定の反応生成物を選択する工程;
(c)反応生成物を特徴付ける工程;および
(d)該対応するオリゴヌクレオチドによりコードされる情報を使用することにより、反応生成物を生じる新しい化学反応を同定する工程、
を包含する、方法。
(項目85)
工程(c)は、どの反応単位が、反応生成物を産生するか同定するために前記対応するオリゴヌクレオチドの配列を決定する工程を含む、項目84に記載の方法。
(項目86)
その前記対応するオリゴヌクレオチドを増幅する、工程(b)の後のさらなる工程を包含する、項目84に記載の方法。
(項目87)
反応生成物は、その対応するオリゴヌクレオチドに対して共有結合される、項目84に記載の方法。
(項目88)
新しい化学反応を同定する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)(i)コドンを含む第一オリゴヌクレオチドに結合する第一反応単位を含むテンプレート、ならびに(ii)アンチコドンを含む第二オリゴヌクレオチドに結合する第二反応単位を含む移動単位、を提供する工程であって、ここで該コドンおよび該アンチコドンは、共にアニーリング可能である工程;
(b)該第一反応単位および該第二反応単位を反応性近傍へ導くために、オリゴヌクレオチドを共にアニーリングする工程;
(c)反応生成物を産生するために該反応単位との間に共有結合形成反応を誘導する工程;
(d)反応生成物を特徴付ける工程;そして
(e)反応生成物を産生するために反応された第一反応単位および第二反応単位を同定するためのテンプレートによりコードされる情報を使用することにより、反応生成物を生じるための新しい化学反応を同定する工程、
を、包含する方法。
(項目89)
工程(c)の後であるが工程(d)の前である反応生成物を選択する、工程をさらに含む、項目88に記載の方法。
(項目90)
工程(a)において、移動単位またはテンプレートは、捕捉可能な部分に結合する、項目89に記載の方法。
(項目91)
前記捕捉可能な部分は、ビオチン、アビジン、およびストレプトアビジンよりなる群から選択される、項目90に記載の方法。
(項目92)
前記捕捉可能な部分は、ビオチンである、項目91に記載の方法。
(項目93)
反応生成物に結合した前記ビオチンは、固体支持体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンにより、捕捉される、項目92に記載の方法。
(項目94)
前記第一反応単位は、前記第一オリゴヌクレオチドに対して共有結合される、項目88に記載の方法。
(項目95)
前記第二反応単位は、前記第二オリゴヌクレオチドに対して共有結合される、項目88または94に記載の方法。
(項目96)
新しい化学反応を同定する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)(i)第一オリゴヌクレオチドに結合する第一反応単位を含む第一移動単位、(ii)第二オリゴヌクレオチドに結合する第二反応単位を含む第二移動単位、および(iii)該第一オリゴヌクレオチドおよび該第二オリゴヌクレオチドに対してアニーリング可能な配列を有するテンプレート、を提供する工程;
(b)該第一反応単位および該第二反応単位を反応性近傍へ導く、該テンプレートへ該オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程;
(c)反応生成物を産生するために該反応単位との間に共有結合形成反応を誘導する工程;
(d)該反応生成物を特徴付ける工程;そして
(e)反応生成物を産生するために反応する該第一反応単位および該第二反応単位を同定するためのテンプレートによりコードされる情報を使用することにより、反応生成物を生じるための新しい化学反応を同定する工程、
を、包含する方法。
(項目97)
工程(c)の後であるが工程(d)の前に、反応生成物を選択する、工程をさらに含む、項目96に記載の方法。
(項目98)
工程(a)において、前記テンプレート、前記第一移動単位または前記第二移動単位は、捕捉可能な部分に結合される、項目96に記載の方法。
(項目99)
前記捕捉可能な部分は、ビオチン、アビジン、およびストレプトアビジンよりなる群から選択される、項目98に記載の方法。
(項目100)
前記捕捉可能な部分は、ビオチンである、項目99に記載の方法。
(項目101)
前記反応生成物に結合した前記ビオチンは、固体支持体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンにより、捕捉される、項目100に記載の方法。
(項目102)
前記第一反応単位は、前記第一オリゴヌクレオチドに対して共有結合される、項目96に記載の方法。
(項目103)
前記第二反応単位は、前記第二オリゴヌクレオチドに対して共有結合される、項目96または102に記載の方法。
本明細書中で使用される場合、用語「結合する」は、2つ以上の基、部分、化合物、モノマーなどの間(between)、もしくはそれらの中(among)での相互作用を説明する。2つ以上の実体が、本明細書中で記載されるように、互いに「結合する」場合、それらは、直接的もしくは間接的な共有結合性または非共有結合性相互作用によって連結される。好ましくは、この結合は、共有結合性である。共有結合は、例えば(しかし、限定ではない)、アミド、エステル、炭素−炭素、ジスルフィド、カルバメート、エーテル、チオエーテル、尿素、アミン、もしくは炭酸連結を通してであり得る。この共有結合はまた、リンカー部分、例えば、光開裂性リンカーであり得る。望ましい非共有結合性相互作用としては、水素結合、ファンデルワールス相互作用、双極−双極相互作用、πスタッキング相互作用、疎水性相互作用、磁気相互作用、静電気的相互作用などが挙げられる。また、2つ以上の実体もしくは薬剤は、同じ組成物中に共に存在することによって、互いに「結合」し得る。
本明細書中に記載される核酸テンプレート合成は、広い種々の化合物(例えば、合成低分子および非天然ポリマー)の生成、選択、増幅および進化を可能にする。核酸テンプレート合成において、DNAまたは多の核酸配列によりコードされる情報は、反応生成物の合成に翻訳される。その核酸テンプレートは、代表的には、反応単位と結合する相補的アンチコドン配列にアニールする複数のコード領域を含み、それによって、配列特異的様式で反応単位をともに結合して、反応生成物を作製する。核酸ハイブリダイゼーションは配列特異的であるので、核酸テンプレート反応の結果は、対応する反応生成物への特定の核酸配列の翻訳である。
核酸テンプレートが、相補的オリゴヌクレオチドへ連結される配列特異的に漸増する反応物質によって、明らかな構造的要件なしに、広範な種々の化学反応を指向し得る。議論されるように、その核酸媒介性形式は、従来の合成アプローチを使用してできなかった反応を可能にする。合成の間に、テンプレートは、1以上の移動単位にハイブリダイズまたはアニールして、反応生成物の合成を指向し、この反応生成物は、テンプレート合成の特定の工程の間に、テンプレートと結合したままである。次いで、反応生成物は、特定の基準(例えば、予め選択された標的分子に結合する能力)に基づいて、選択またはスクリーニングされる。一旦反応生成物が同定されると、その結合したテンプレートは配列決定されて、その反応生成物の合成履歴がデコードされ得る。さらに、以下により詳細に議論されるように、そのテンプレートは、別の化合物または化合物のライブラリーの合成をもたらすように、進化され得る。
そのテンプレートは、核酸配列、例えば、DNA、RNA、DNAとRNAのハイブリッド、またはDNAおよびRNAの誘導体に基づき得、そして一本鎖または二本鎖であり得る。特定のテンプレートの設計は、企図される核酸テンプレート合成の型に依存して変化し得る。
テンプレート配列が本発明の範囲を超えていくことなく、多くの方法で設計され得ることが企図される。例えば、コドンの長さは、決定されなければならず、コドン配列が設定されなければならない。2つのコドン長が使用される場合、4つの天然の塩基を使用すると、16個のみの可能な組み合わせが、ライブラリーをコードする際に使用されるために利用可能である。コドンの長さが3に増加する(タンパク質をコードする際に自然数(number Nature)を使用する)場合、可能な組み合わせの数が64に増加する。コドンの長さが4に増加する場合、可能な組み合わせの数は、256に増加する。コドンの長さを決定する際に考慮される他の因子は、ミスマッチ、フレームシフト、ライブラリーの複雑性などがある。コドンの長さが特定の点まで増加するので、ミスマッチの数は、減少する;しかし、過剰に長いコドンは、ミスマッチの塩基対にも関わらずハイブリダイズする。
4コドンを有する)は、異なるコドンセット内の任意の2つのコドン間の少なくとも2つ
のミスマッチおよび同じセットのコドン間の少なくとも4つのミスマッチを常に有するよ
うに選択され得る。
先に考察されるように、企図される核酸テンプレート型合成の型に依存して、テンプレートは、特定の反応単位とさらに結合し得る(例えば、共有結合し得る)。核酸テンプレート型合成において有用な種々のテンプレートが図7A〜7Gに示され、「らせんの末端」または「E」テンプレート(図7A〜Cを参照のこと)、「ヘアピン」または「H」テンプレート(図7Dを参照のこと)、「オメガ」または「Ω」テンプレート(図7E〜Fを参照のこと)、または「T」テンプレート(図7Gを参照のこと)として称されるテンプレートを含む。
Ω構造によって、距離依存性反応が、テンプレートの反応性末端から離れたヌクレオチド塩基によって効率的に指向され得、それらの距離依存性を効率的に克服する。例として、Ω構造において、テンプレートの5塩基は、テンプレートの5’末端において一定に保持される(図7Fを参照のこと)。移動単位は、それらの3’末端において、相補的な5塩基を含むが、そうでなければ、テンプレート遠位コード領域に相補的な配列を含む。これによって、移動単位が、テンプレートの遠位コード領域にアニールし得ながら、距離依存性反応が進行することを通常妨げる多数のテンプレート塩基をループではずす(looping out)ことによって近位に移動単位の反応性基をなお置換し得る。オメガ構造は、テンプレートの末端に相補的な移動単位の5塩基が室温でテンプレートにそれら事自体によってアニールするには不十分であるので、配列特異性を保持する。
T構造によって、単一のテンプレートが、2つの距離依存性反応をコードし得、さらに、テンプレートが、単一の溶液または「ワンポット」で2つの異なるヌクレオチド−テンプレート型反応を受け得る。この構造を使用して、テンプレートは、テンプレートの末端よりも中心に位置する塩基の非ワトソン−クリック面を介して、分子足場を提示し得る(図7Gを参照のこと)。これによって、2つの移動単位は、テンプレートに結合された反応単位のいずれかの側にアニールし得、そして2つのヌクレオチド−テンプレート型変換の生成物を与えるように、同時にまたは連続的な工程のいずれかで反応し得る。予期されるように、距離依存性反応は、反応性基が近位である場合、この構造を許容する。従って、T型構造によって、2つの配列特異的核酸テンプレート型反応が、1つの溶液中で1つのテンプレートで(すなわち、一工程で)行われ得る。標的構造を合成するために必要とされる別々のDNAテンプレート型工程の数を減少させることに加えて、この構造は、合成ライブラリーにおける構造的複雑性を構築するために通常使用される3つ以上の構成成分の反応を可能にし得る。
テンプレートは、当該分野で周知の方法論を使用して、合成され得る。例えば、核酸配列は、核酸配列を調製するために当該分野で公知の任意の方法を使用して調製され得る。これらの方法としては、インビボおよびインビトロの方法(PCR、プラスミド調製、エンドヌクレアーゼ消化、固相合成(例えば、自動化合成器を使用する)、インビトロ転写、鎖分離などを含む)が挙げられる。合成に続いて、テンプレートは、所望の場合、当該分野で公知の標準的なカップリング化学を使用して、目的の反応単位と結合し得る(例えば、共有結合または非共有結合)。
移動単位は、アンチコドン配列および反応単位を含むオリゴヌクレオチドを含む。アンチコドンは、テンプレート内に存在するコドンに相補的であるように設計される。テンプレートに使用される配列ならびにコドンの長さは、アンチコドンの設計する際に考慮する必要がある。テンプレートに使用されるコドンに相補的である任意の分子が、使用され得る(天然ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含む)。特定の他の実施形態において、コドンは、自然界で見出される1つ以上の塩基(すなわち、チミジン、ウラシル、グアニジン、シトシン、およびアデニン)を含む。従って、アンチコドンは、塩基、糖および任意のリン酸基を有する通常自然界で見出される1つ以上のヌクレオチドを含み得る。あるいは、塩基は、通常自然界で見出される糖−リン酸骨格でない骨格(例えば、非天然ヌクレオチド)を介して連結され得る。
種々の化合物および/またはライブラリーは、本明細書中に記載される方法を使用して調製され得る。特定の実施形態において、核酸またはそのアナログでなく、似てもいない化合物が、本発明の方法に従って合成される。特定の他の実施形態において、タンパク質、ペプチドまたはそのアナログでなく、似てもいない化合物が、本発明の方法に従って合成される。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法を使用して、低分子のような化合物を作製することが可能である。これらの低分子は、天然の産物様、非ポリマー、および/または非オリゴマーであり得る。低分子における実質的な目的は、多くの薬学的調製物における活性成分としてのその使用に一部起因するが、これらはまた、例えば、触媒、材料、または添加物などとして使用され得る。
特定の実施形態において、ポリマー(特に、非天然のポリマー)は、本発明の方法に従って調製される。本発明の方法および系を用いて作製され得る非天然のポリマーは、任意の非天然ポリマーを含む。例示的な非天然ポリマーとしては、ペプチド核酸(PNA)ポリマー、ポリカルバメート、ポリウレア、ポリエステル、ポリアクリレート、ポリアルキレン(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン)、ポリカルボネート、非天然の立体化学を有するポリペプチド、非天然のアミノ酸を有するポリペプチド、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。特定の実施形態において、ポリマーは、少なくとも10、25、75、100、125、150以上のモノマー単位を含む。本発明の系を用いて合成されるポリマーは、触媒、製薬、金属キレート剤、触媒などとして使用され得る。
核酸−テンプレート合成は、(i)アンマスク(unmask)されているか、または(ii)カップリング反応において使用される官能基に相互転換されるかのいずれかである、官能基形質転換をもたらすように使用され得る。ライブラリーの配列−プログラムされたサブセット内の反応性基を連続的に露出または作製することによって、核酸−テンプレート官能基の相互転換は、ライブラリーの多様性を連続的なアンマスキング(unmasking)によって生成し得る。連続的なアンマスキングアプローチは、分子間の非テンプレート反応様式において、核酸(例えば、単純なアルキルハライド)に連結され得る能力を通常欠いている反応物を、テンプレートの配列特異的サブセットと反応させることによってライブラリー多様性を構築することを可能にするという主要な利点をもたらす。この利点は、生成され得る構造型を有意に増加させる。
核酸テンプレート型反応は、水溶液または非水溶液(例えば、有機)、あるいは1つ以上の水溶液および非水溶液の混合物において生じ得る。水溶液において、反応は、約2〜約12、または好ましくは約2〜約10、またはより好ましくは約4〜約10のpH範囲で実施され得る。好ましくは、DNA−テンプレート型化学において使用される反応は、高塩基性条件(例えば、pH>12、pH>10)または高酸性条件(例えば、pH<1、pH<2、pH<4)を必ずしも必要としない。なぜなら、非常に厳しい条件は、合成される核酸テンプレートおよび/または分子(例えば、ポリマー、または低分子)の分解または改変をもたらし得る。水溶液は、1つ以上の無機塩(NaCl、Na2SO4、KCl、Mg+2、Mn+2などが挙げられるが、これらに限定されない)を種々の濃度で含み得る。
ポリマー、低分子または他の化合物を合成するための公知の化学反応が、核酸−テンプレート型反応において使用され得る。従って、以下に列挙されるような反応が使用され得る:March’s Advanced Organic Chemistry,Organic Reactions,Organic Syntheses,有機の教科書、雑誌(例えば、Journal of the American Chemical Society,Journal of Organic Chemistry, Tetrahedronなど)、およびCarruther’s Some Modern Methods of Organic Chemistry。好ましくは、選択された反応は、核酸(例えば、DNAまたはRNA)とマッチするか、またはテンプレートとして使用される改変された核酸とマッチする。
核酸のキラル性質は、核酸テンプレート合成が、核酸に存在するキラル基を超えるキラル基の補助なしで、立体選択性を進行させ得、それにより、配列のみならず、立体化学的情報もまた、テンプレートから生成物へ移る可能性を引き起こす。以前の研究により、核酸テンプレートのキラリティーが、(L)−ヌクレオチドよりも、(D)−ヌクレオチドのテンプレート指向性連結についての優先性を誘導し得ることが実証された(Kozlovら(2000)ANGEW.CHEM.INT.ED.39:4292−4295;Balliら(1997)A.CHEM.BIOL.4:309−320)。
核酸テンプレート合成の間に、オリゴヌクレオチドは、関与する反応が交差反応性であり、よって伝統的な合成条件下ではミスマッチであるとしても、同じ溶液内でいくつかの異なる型の合成反応を同時に指向し得ることが発見された(実施例7を参照のこと)。結果として、核酸テンプレート合成は、合成ライブラリー前駆体を複数の反応型の生成物へ1ポットで多様化することを可能にする。
本発明の別の局面において、図12に例示されるように、核酸テンプレート合成は、2以上の反応単位の間の以前は未知の化学反応を発見するために使用され得る。反応の発見を容易にするために、複数のテンプレートが合成され、各々、異なるオリゴヌクレオチドに連結される異なる反応単位を含む。各テンプレートオリゴヌクレオチドは、コード領域(これは、テンプレートに結合される反応単位を同定する)、およびアニーリング領域を含む。いくつかの実施形態において、他の配列は、例えば、PCRプライマー部位を含むテンプレートオリゴヌクレオチドに含まれる。複数の移動単位もまた調製され、各々、異なるオリゴヌクレオチドに連結される異なる試薬を含む。
伝統的なライブラリー合成と核酸テンプレートライブラリー合成との間の主な事実上の差異は、各操作の規模である。スクリーニングおよび化合物同定に必要とされる材料の量に起因して、伝統的なコンビナトリアル合成は、代表的には、1つのライブラリーメンバーにつき、nmol〜μmol規模で進められる。対照的に、核酸テンプレートライブラリー合成は、各核酸連結合成分子のごくわずかな量(例えば、約10−20mol)しか、選択およびPCR増幅に必要とされないので、fmol〜pmol規模で行われ得る。規模におけるこの非常に大きな差異は、核酸テンプレートライブラリーの単一溶液形式と合わせて、核酸テンプレートライブラリー合成に必要な材料の調製を有意に単純化する。
所望の活性(例えば、触媒活性、結合親和性、または活性アッセイにおける特定の影響)を有する反応生成物についての選択および/またはスクリーニングは、任意の標準的なプロトコルに従って行われ得る。例えば、親和性選択は、ライブラリーベースの選択法(例えば、ファージディスプレイ、ポリソームディスプレイ、およびmRNA融合タンパク質ディスプレイペプチド)において使用される原理に従って行われ得る。触媒活性についての選択は、遷移状態アナログアフィニティーカラムに対する親和性選択(Bacaら(1997)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 94(19):10063−8)または機能ベースの選択スキーム(Pedersenら(1998)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 95(18):10523−8)によって行われ得る。少量のDNA(約10−20mol)が、PCRによって増幅され得る(Kramerら(1999)CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,F.M.編)15.1−15.3,Wiley)ので、これらの選択は、現在の方法による反応分析について必要とされる10分の1より小さな規模で行われ得、よって、実に広い検索を経済的かつ効率的にする。
標的分子に結合する鋳型および反応生成物を、選択(またはスクリーニング)し得る。この文脈において、選択または分離とは、標的分子に結合したライブラリーメンバーを、標的分子に結合していないライブラリーメンバーから分離する任意のプロセスを意味する。選択は、当該分野に公知の種々の方法によって達成され得る。
結合アッセイは、例えば、表面(例えば、金属、プラスチック、合成物、ガラス、セラミックス、ゴム、皮膚または細胞);ポリマー;触媒;あるいは標的生体分子(例えば、核酸、タンパク質(酵素、レセプター、抗体および糖タンパクを含む)、シグナル分子(例えば、cAMP、イノシトール3リン酸、ペプチドまたはプロスタグランジン)、炭水化物、あるいは脂質)に結合する反応生成物を単離して、同定するのに敏速な方法を提供する。結合アッセイは、標的分子の機能に対する反応生成物の効果についての活性アッセイと有利に組み合わせられる。
本発明のテンプレート型合成は、他のディスプレイ方法(例えば、ファージディスプレイ(Smith(1985)Science 228:1315―1317)に類似した選択手順を容認する。ファージディスプレイ選択は、ペプチド(Wellsら、(1992)CURR.OP.STRUCT.Biol.2:597―604)、タンパク質(Marksら、(1992)J.Biol.Chem.267:16007―16010)および抗体(Winterら、(1994)ANNU.REV.IMMUNOL.12:433―455)においてうまく用いられる。同様な選択手順はまた、他の型のディスプレイシステム(例えば、リボソームディスプレイ(Mattheakisら、(1994)PROC.NATL.ACAD.Sci.91:9022−9026)およびmRNAディスプレイ(Robertsら、(1997)PROC.NATL.ACAD.Sci.94:12297−302))に活用される。しかしながら、本発明のライブラリーは、従来のリボソーム仲介翻訳を必要としないで、標的物特異的分子の直接的な選択を可能にする。本発明はまた、以前は核酸テンプレートから直接的に合成されなかった低分子のディスプレイを可能にする。
他の所望の特性(例えば、触媒活性または他の機能性活性)に関する選択もまた。実施され得る。一般的に、選択は、所望の活性を有するライブラリーメンバーが、この原理に基づいて、他のライブラリーメンバーから単離可能であるように、設計されるべきである。例えば、ライブラリーメンバーは、標的分子(例えば、金属イオン)の存在下で、または特定のpHまたは塩濃度条件下で、コンフォメーションを折りたたむ能力または、コンフォメーションを顕著に変化させる能力に関してスクリーニングされ得る。折りたたまれたライブラリーメンバーは、目的の条件下で、非変性ゲル電気泳動を実施することによって、単離され得る。折りたたまれたライブラリーメンバーは、ゲル中で異なる位置に移動し、そして、後に、ゲルから抽出され、単離され得る。
溶離液を一次選択から二次選択にロードすることによって、選択を反復することで、正味の濃縮度を増加させる。テンプレートの介在性増幅は、必要とされない。例えば、炭酸脱水酵素ビーズへの結合に関する選択は、リガンドの330倍の富化を可能にした。溶出液の新鮮な炭酸脱水素酵素ビーズへの直接的な適用(実施例11を参照のこと)は、炭酸脱水素酵素リガンドをコードするテンプレートを10,000倍以上富化する。その選択が3回繰り返される場合、5,000,000倍の正味のリガンドの富化が観察された。この結果は、ライブラリー選択を反復することによって、所望の分子の非常に大きな富化を生じ得ることを示す。特定の実施形態において、選択の1番目のラウンドは、結合するリガンドの数の少なくとも50倍の増加を提供する。好ましくは、富化における増加は、100倍より高く、より好ましくは、1000倍より高く、そして、さらにより好ましくは、100,000倍より高い。後の選択ラウンドは、さらに、元のライブラリーより100倍、好ましくは、1,000倍、より好ましくは100,000倍、そして最も好ましくは、1,000,000倍、富化を増加させる。
選択のラウンドが、一旦完了すると、現在あるいは、以前は、選択された反応生成物と結合しているか、または結合していたテンプレートは、配列決定を促進する任意の適切な技術、または他の後のテンプレートの操作を使用して増加される。天然のオリゴヌクレオチドは、当該分野の方法の任意の状態によって増幅され得る。これらの方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR);核酸配列ベースの増幅(例えば、Compton(1991)NATURE 350:91−92を参照のこと);増幅したアンチセンスRNA(例えば、van Gelderら、(1988)PROC.NATL.ACAD.Sci.USA 85:77652−77656を参照のこと)、自己維持配列複製系(self−sustained sequence replication system)(Gnatelliら、(1990)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 87:1874−1878);ポリメラーゼとは独立した増幅(例えば、Schmidtら、(1997) NUCLEIC ACIDS RES.25:4797−4802を参照のこと)、およびクローニングしたDNAフラグメントを保有するプラスミドのインビボでの増幅が挙げられる。PCR方法の記述は、例えば、Saikiら、(1985)SCIENCE 230:1350−1354;Scharfら、(1986)SCIENCE 233:1076−1078;および米国特許第4,683,202号中に見出される。リガーゼ媒介増幅方法(例えば、リガーゼ連鎖反応(LCR)もまた使用され得る。一般に、選択された核酸配列の正確で、効率の良い増幅を可能にする任意の方法が、本発明の方法において使用され得る。増幅後の配列の比例した発現量が、増幅前の混合物中の配列の相対的な比率を反映することが、必要ではないが、そうであることが好ましい。
配列決定は、標準的ジデオキシ鎖末端方法、または化学的配列決定(例えば、Maxam−Gilbert配列決定手順を使用する)によってなされ得る。あるいは、テンプレート(または、長いテンプレートが使用される場合、その可変部分)の配列は、チップへのハイブリダイゼーションによって決定され得る(実施例12を参照のこと)。例えば、検出可能部分(例えば、蛍光部分)と結合した一本鎖テンプレート分子は、一本鎖核酸または公知の配列の核酸アナログの多数のクローン集団を有するチップ上に露出され、各クローン集団は、チップ上の特定のアドレス可能な位置に存在する。テンプレート配列は、チップ配列にアニーリングすることが可能になる。次いで、検出可能部分のチップ上の位置が、決定される。検出可能部分の位置およびその位置に固定化された配列に基づいて、テンプレートの配列が決定され得る。多数のこのようなオリゴヌクレオチドが、チップまたは他の固体支持体上のアレイに固定され得ることが企図される。
本発明のライブラリーは、DNAレベルで変異を導入する(例えば、誤りがちのPCR(Error−Prone PCR)(Cadwellら(1992) PCR METHODS APPL.2:28))ことによって、またはDNAをインビトロの相同組み換えに供する(Stemmer(1994)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 91:10747;Stemmer(1994)NATURE 370:389)ことによって、展開され得る。
ランダム点変異形成は、誤りがちのPCR(Cadwellら、(1992)PCR METHODS APPLIC. 2 :28−33)条件下でのPCR増幅工程を行なうことにより実施される。これらの分子の遺伝子コードは、天然のタンパク質の遺伝子コードが構築される様式と類似して、関連する化学基に対する関連するコドンを指定するために記載されるので、選択された分子をコードするテンプレートのランダム点変異は、化学的に関連するアナログに対する結果を多様化する。誤りがちのPCRが、本質的に、通常のPCRより効率的ではないので、誤りがちのPCRによる多様化は、好ましくは、天然のdATP、天然のdTTP、天然のdCTP、天然のdGTPのみとともに、化学的ハンドル(chemical handle)またはビオチン基を欠如するプライマーを使用して実施される。
ライブラリーは、組換えを使用して多様化され得る。例えば、組換えられるべきテンプレートは、図14に示される構造を有し得、そのコドンは、5塩基の非パリンドローム制限エンドヌクレアーゼ切断部位(例えば、AvaII(G/GWCC、W=AまたはT)によって切断される部位、Sau96I(G/GNCC、N=A、G、T、またはC)によって切断される部位、DdeI(C/TNAG)によって切断される部位、または、HinFI(G/ANTC)によって切断される部位)によって分離される。選択後、所望の分子をコードするテンプレートは、市販の制限酵素を用いて、酵素的に消化される。次いで、消化されたフラグメントは、T4 DNAリガーゼを用いてインタクトなテンプレート中に組換えられる。コドンを分離する制限部位は、非パリンドロームであるので、テンプレートのフラグメントは、再結合のみして、インタクトな組換えテンプレートを形成し得る(図14)。DNAをテンプレートとした組換えテンプレートの翻訳は、組換え低分子を提供する。このような方法で、天然のタンパク質間でのアミノ酸残基の組換えと類似した様式で、所望の活性を有する合成低分子間の官能基が組換えられる。組換えが、点突然変異のみより効率的な分子の配列空間を探索することがよく理解される(Minshullら、(1999)CURR.OPIN.CHEM.BIOL.3:284−90;Bogaradら、(1999)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 96:2591−5;Stemmer NATURE 370: 389−391)。
ランダムカセット式変異形成は、固定した開始配列から多様化したライブラリーを作製するために有用である。従って、このような方法は、例えば、ライブラリーが選択に供され、一つ以上のライブラリーメンバーが単離され、そして配列決定された後に、使用され得る。一般に、開始配列上に変異を有するオリゴヌクレオチドのライブラリーは、従来の化学合成、誤りがちのPCR、または他の方法によって生成される。例えば、オリゴヌクレオチドのライブラリーは、コドンにおける各ヌクレオチド位置に対して、ヌクレオチドが、その位置の開始配列に対して90%の確率で同一性を有し、10%の確率で異なるように生成され得る。オリゴヌクレオチドは、合成される場合、完全なテンプレートであり得るか、またはテンプレートの多様なライブラリーを形成するために、他のオリゴヌクレオチドと後に連結したフラグメントであり得る。
本発明の方法および組成物は、所望の性質を有する分子を生成するための新規の方法を示す。このアプローチは、分子生物学者が数十年間利用してきた非常に強力な遺伝的方法と有機化学の可撓性および能力を結合させる。遺伝的選択による、非天然のポリマーを調製し、増幅し、そして展開する能力は、活性、バイオアベイラビリティー、安定性、蛍光性、感光性、または、タンパク質および核酸中に見出される限定された一連の成分を使用して達成するのが困難であるかもしくは不可能である他の性質を有する新規のクラスの触媒を生じ得る。同様に、変異形成および選択の周期を繰り返すことにより、低分子を調製し、増幅し、そして展開するための新規の系を展開することにより、よりゆっくりした従来の薬物発見方法によって単離された薬物より優れた性質を有する新規のリガンドまたは薬物の単離につながり得る。
本発明はまた、本発明の方法に使用するためのキットおよび組成物を提供する。キットは、本発明を実施するのに有用な任意のアイテムまたは組成物を含み得る。キットは、テンプレート(例えば、へリックスの末端構造、ヘアピン構造、オメガ構造、およびT構造)、アンチコドン、移動単位、モノマー単位、構築物、反応物質、低分子足場、緩衝液、溶媒、酵素(例えば、熱安定性ポリメラーゼ、逆転写酵素、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、Klenowフラグメント、ポリメラーゼ、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ)、リンカー、保護基、ポリヌクレオチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、塩、酸、塩基、固体支持体、またはこれらの任意の組合せを備え得るが、これらに限定されない。
核酸テンプレート合成は、極端に用途が広く、種々の化学的化合物の合成を可能にする。この実施例は、二つの異なるDNAテンプレート構築物を使用するDNAテンプレート合成を実施することが可能であることを示す。
(DNA合成)
DNAオリゴヌクレオチドを、標準的なプロトコルを用いてPerSeptive Biosystems Expedite 8909 DNA合成機で合成し、そして逆相HPLCによって精製した。オリゴヌクレオチドを、分光光度的および変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)に続くエチジウムブロマイドまたはSYBR Green(Molecular Probes)を用いる染色およびStratagene Eagle Eye II濃度計を用いる定量化によって定量化した。ホスホルアミダイト(5’−NH2−dT基、5’テトラクロロフルオレセイン基、無塩基の骨格スペーサー基、C3骨格スペーサー基、9−結合ポリエチレングリコールスペーサー基、12−結合飽和炭化水素スペーサー基、および5’ビオチン基の合成を可能にする)を、Glen Research、Sterling、Virginia、USAから購入した。チオール連結オリゴヌクレオチド試薬を、C3ジスルフィドコントロールドポアガラス(Glen Research、Sterling、Virginia、USA)上で合成した。
5’−NH2−dT基を有するテンプレートを、適切な求電子性N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル(Pierce、Rockford、IL、USA)を用いる反応によって種々の求電子性官能基に変換した。反応を、2mg/mL求電子性NHSエステル、10% ジメチルスルホキシド(DMSO)、および100μgまでの5’−アミノテンプレートを含む200mMリン酸ナトリウム(pH7.2)中で25℃で1時間実施した。所望の生成物を、逆相HPLCによって精製し、そしてゲル電気泳動およびMALDI質量分析法によって特徴付けた。
反応を、所望の温度(他に述べられない限り25℃)で、50mM N−[3−モルホリノプロパン]スルホン酸(MOPS)(pH7.5)および250mM NaClを含む緩衝液中で、等モル量の試薬(移動単位)およびテンプレートを混合することによって開始した。試薬およびテンプレートの濃度は、他に示されない限り60nMであった。種々の時点で、アリコートを取り出し、過剰のβ−メルカプトエタノールでクエンチし、そして変性PAGEによって分析した。反応生成物を、これらの固有の蛍光を用いるデンシトメトリーによってか、染色後のデンシトメトリーによって定量化した。代表的な生成物をまた、MALDI質量分析法によって確認した。
ライブラリ翻訳反応の生成物(図21A〜図21B)を、エタノール沈澱によって単離し、そして結合緩衝液(10mM Tris(pH8)、1M NaCl、10mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)中に溶解した。生成物を、30μgのストレプトアビジン連結磁気ビーズ(Roche Biosciences)とともに100μLの全容積で室温で10分間インキュベートした。ビーズを、結合緩衝液で16回洗浄し、そして70℃で10分間100μLの結合緩衝液中の1μmolの遊離ビオチンでの処理によって溶出した。溶出した分子を、エタノール沈澱によって単離し、そしてプライマー5’−TGGTGCGGAGCCGCCG(配列番号35)およびプライマー5’−CCACTGTCCGTGGCGCGACCCCGGCTCCTCGGCTCGG(配列番号36)を用いて、標準的なPCRプロトコル(2mM MgCl2、55℃のアニーリング、20サイクル)によって増幅した。自動DNA配列決定は、プライマー5’−CCACTGTCCGTGGCGCGACCC(配列番号37)を使用した。
図において提供されていない配列は、以下の通りである:図16 SIAB反応およびSBAP反応においてマッチした試薬:5’−CCCGAGTCGAAGTCGTACC−SH(配列番号38);図16 SIAB反応およびSBAP反応においてミスマッチな試薬:5’−GGGCTCAGCTTCCCCATAA−SH(配列番号39);図16、および図17A〜図17Bにおける他の反応についてのミスマッチな試薬;5’−FAAATCTTCCC−SH(F=テトラクロロフルオレセイン)(配列番号40);1つのミスマッチを含む図16における試薬:5’−FAATTCTTACC−SH(配列番号41);図15、図16、SMCC反応、GMBS反応、BMPS反応、およびSVSB反応、ならびに図17A〜図17B:におけるEテンプレート:5’−(NH2dT)−CGCGAGCGTACGCTCGCGATGGTACGAATTCGACTCGGGAATACCACCTTCGACTCGAGG(配列番号42);図16、SIAB反応、SBAP反応、およびSIA反応におけるHテンプレート:5’−(NH2dT)−CGCGAGCGTACGCTCGCGATGGTACGAATTC(配列番号43);図19におけるクランプオリゴヌクレオチド:5’−ATTCGTACCA(配列番号44)。
この実施例は、DNAテンプレート合成が、反応基のDNAに類似する構造に対する正確な配列を必要とすることなく、化学反応の適度な収集に関連し得ることを示す。さらに、この実施例はまた、1000を越えるテンプレートのライブラリーを、対応するチオエステル生成物へと、同時にワンポットで同時に変換させ、これらの一つを、ストレプトアビジンへの結合についてインビトロでの選択によって富化し、そしてPCRによって増幅することが可能であることを示す。
官能化したテンプレートおよび試薬を、代表的には、5’−NH2末端化オリゴヌクレオチド(テンプレート1について)、5’−NH2−(CH2O)2末端化オリゴヌクレオチド(他の全てのテンプレートについて)または3’−OPO3−CH2CH(CH2OH)(CH2)4NH2末端化ヌクレオチド(全ての試薬について)を、0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)中の適切なNHSエステル(DMF中20mg/mL溶液の0.1容量)と25℃で1時間、反応させることによって調製して、図23A〜図23Dおよび図25A〜図25Bに示される構造のテンプレートおよび試薬を提供した。アミノ酸連結試薬6〜9について、0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)中の3’−OPO3CH2CH(CH2OH)(CH2)4NH2末端化オリゴヌクレオチドを、DMF中100mMビス[2−(スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(BSOCOES、Pierce、Rockford、IL、USA)溶液の0.1容量と25℃で10分間、続いて300mM 水酸化ナトリウム(NaOH)中の300mMアミノ酸の0.3容量と25℃で30分間反応させた。
この実施例は、DNAテンプレート化学反応による多工程の低分子合成を行なうことが可能であることを示す。
本明細書中に示されるように、種々のDNAテンプレート反応が、水性媒体中で生じ得る。DNAテンプレート反応が、有機溶媒中で生じ得、従って、DNAテンプレート合成の範囲を大いに拡大することもまた、発見されてきた。具体的には、DNAテンプレートおよびDNA試薬は、長鎖テトラアルキルアンモニウムカチオンと複合体を形成して(Jostら(1989)Nucleic Acids Res.17,2143;Mel’nikovら(1999)Langmuir,15,1923−1928を参照のこと)、CH2Cl2、CHCl3、DMFおよびメタノールを含む無水有機溶媒中の反応成分の定量的解離が可能になる。驚いたことに、DNAテンプレート合成が、実は、高い配列選択性を有する無水有機溶媒において生じ得ることが、見出された。
本実施例は、核酸テンプレート合成の範囲をさらに拡大する2つの異なるテンプレート構造を開示する。
(オリゴヌクレオチド合成)
他のように特定されない限り、5’官能化オリゴヌクレオチドについて、2−[2−(4−モノメトキシトリチル)アミノエトキシ]エチル−(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピル−ホスホロアミダイトを使用し(Glen Research,Sterling,Virginia,USA)、そして3’官能化オリゴヌクレオチドについて、(2−ジメトキシトリチルオキシメチル−6−フルオレニルメトキシカルボニルアミノ−ヘキサン−1−スクシノイル)−長鎖アルキルアミノ−CPGを使用し(Glen Research,Sterling,Virginia,USA)、DNAオリゴヌクレオチドを、以前に記載された通り(Calderoneら(2002)ANGEW.CHEM.INT.ED.ENGL.41:4104(2002)ANGEW.CHEM.114:4278)に合成および官能化した。T構造についてのテンプレートの場合、アミン基を、5’−ジメトキシトリチル−5−[N−(トリフルオロアセチルアミノヘキシル)−3−アクリルイミド]−2’−デオキシウリジン−3’−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト(Glen Research,Sterling,Virginia,USA)を使用し、その後、以前に報告された(Calderoneら(2002)上記)通り、アシル化した。
アミン標識DNAおよびカルボン酸標識DNAを、水性100mM MOPS緩衝液、1M NaCl(pH7.0)(テンプレートDNA中60nM、試薬DNA中120mM)中で、20mM DMT−MMの存在下で合わせた。反応は、25℃で12時間進行した。
アルデヒド標識DNAおよびホスホラン標識DNAを、水性100mM MOPS緩衝液、1M NaCl(pH7.5)(テンプレートDNA中60nM、試薬DNA中120mM)中で合わせた。反応は、30℃で2時間進行した。
ジアルデヒド標識DNAを、室温にて1時間、260mM塩酸N−メチルヒドロキシルアミン中でインキュベートした(Gartnerら(2002)J.AM.CHEM.SOC.124:10304)。その後、水性50mM MOPS、2.8M NaCl(pH7.5)(最終塩酸N−メチルヒドロキシルアミン濃度0.75mM、テンプレートDNA中60nMおよび試薬DNA中90nM)中でスクシンイミドDNAと合わせた。反応は、37℃にて12時間進行した。
アミン標識DNAおよびアルデヒド標識DNAを、水性100mM MES緩衝液、1M NaCl(pH6.0)(テンプレートDNA中60nM、試薬DNA中120mM)中で、合わせた。ナトリウムシアノボロヒドリドを、1M NaOH中の5Mストックとして、最終濃度38mMまで添加した。反応は、25℃で2時間進行した。反応を、15mMメチルアミンの存在下でエタノール沈殿により停止した。
5’−ホスフィン結合オリゴヌクレオチド(2)を、N−スクシンイミジルヨードアセテート(SIA)を、以下に列挙するT(n=−4)オリゴヌクレオチドを使用して、12−(4−モノメトキシトリチルアミノ)ドデシル−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)−ホスホロアミダイト由来のアミンに結合し(Glen Research、Sterling,Virginia,USA)、その後、以前に記載された(Gartnerら(2002)前出)通りに4−ジフェニルホスフィノ安息香酸で処理することによって、生成した。3’−Ω−ヨードアミド結合試薬(3)を、T(n=1)オリゴヌクレオチド(以下参照)とSIAとを以前に記載された(Gartnerら(2001)前出)のように反応させることによって調製した。アルデヒド標識テンプレート(1)、「Tテンプレート」オリゴヌクレオチド(以下参照)を、パラホルミル安息香酸N−ヒドロキシスクシイミジルエステルとして記載した(Gartnerら(2002)ANGEW.CHEM.INT.ED.41:1796(2002)ANGEW.CHEM.114:1874))通りに反応させることによって、調製した。テンプレート1を、1M NaClを含む水性200mM N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(2−エタンスルホン酸)(HEPES)緩衝液(pH8.5)中の試薬2および3と合わせた(63nMテンプレートおよび125nMの各試薬)。反応は、25℃にて1時間まで進行した。
5’−プロパルギルグリシン結合オリゴヌクレオチド(6)を、対応するT(n=−1)5’−アミン結合試薬オリゴヌクレオチド(以下参照)と、9:1の200mMリン酸ナトリウムpH7.2:DMF中の2mg/mLビス(スルホスクシンイミジル)スベレートと25℃にて10分間合わせ、その後、300mM NaOH中の300mMラセミプロパルギルグリシン0.3容量を用いて25℃にて2時間処理することによって、生成した。3’−アジド結合オリゴヌクレオチド(7)を、T(n=1)アミン結合試薬オリゴヌクレオチド(以下参照)と、9:1の200mMリン酸ナトリウムpH7.2:DMF中の2mg/mL (N−ヒドロキシスクシンイミジル)−4−アジドベンゾエートと25℃にて2時間合わせることによって、生成した。試薬6および7を、ゲル濾過および逆相HPLCにより精製した。テンプレート5と、試薬6および7とを、1M NaClおよび20mM DMT−MMの存在下で、水性100mM MOPS(pH7.0)中で、25℃にて12時間(60nMテンプレート、120nM試薬)合わせた。その後、硫酸銅(II)五水和物およびアスコルビン酸ナトリウムを、各々500μMまで添加した。25℃にて1時間後、反応を、エタノール沈殿により停止した。
EテンプレートまたはΩテンプレート:5’−H2N−GGT ACG AAT TCG ACT CGG GAA TAC CAC CTT[配列番号58]。Hテンプレート:5’−H2N−CGC GAG CGT ACG CTC GCG GGT ACG AAT TCG ACT CGG GAA TAC CAC CTT[配列番号59]。Tテンプレート:5’−GGT ACG AAT TCG AC(dT−NH2)CGG GAA TAC CAC CTT[配列番号60]。E試薬またはH試薬(n=1):5’−AAT TCG TAC C−NH2[配列番号61]。E試薬またはH試薬(n=10):5’−TCC CCA GTC G−NH2[配列番号62]。E試薬またはH試薬(n=20):5’−AAG GTG GTA T−NH2[配列番号63]。ミスマッチE試薬またはミスマッチH試薬:5’−TCC CTG ATC G−NH2[配列番号64]。Ω−3試薬(n=10):5’−TCC CGA GTC GAC C−NH2[配列番号65]。Ω−4試薬(n=10):5’−TCC CGA GTC GTA CC−NH2[配列番号66]。Ω−5試薬(n=10):5’−TCC CGA GTC GGT ACC−NH2[配列番号67]。Ω−3試薬(n=20):5’−AAG GTG GTA TAC C−NH2[配列番号68]。Ω−4試薬(n=20):5’−AAG GTG GTA TTA CC−NH2[配列番号69]。Ω−5試薬(n=20):5’−AAG GTG GTA TGT ACC−NH2[配列番号70]。ミスマッチΩ−3試薬:5’−TCC CTG ATC GAC C−NH2[配列番号71]。ミスマッチΩ−4試薬:5’−TCC CTG ATC GTA CC−NH2[配列番号72]。ミスマッチΩ−5試薬:5’−TCC CTG ATC GGT ACC−NH2[配列番号73]。T試薬(n=1):5’−GGT ATT CCC G−NH2[配列番号74]。T試薬(n=2):5’−TGG TAT TCC C−NH2[配列番号75]。T試薬(n=3):5’−GTG GTA TTC C−NH2[配列番号76]。T試薬(n=4):5’−GGT GGT ATT C−NH2[配列番号77]。T試薬(n=5):5’−AGG TGG TAT T−NH2[配列番号78]。T試薬(n=−1):5’−NH2−GTC GAA TTC G[配列番号79]。2についてのT試薬(n=−4):5’−[C12−アミンリンカー]−AAT TCG TAC C[配列番号80]。
本実施例は、立体選択的核酸テンプレート合成を実施することが可能であることを示す。DNAのキラル性質は、DNAテンプレート合成が、DNA中に存在するキラル基を超えるキラル基の補助を受けることなく、立体選択的に進行し得、それにより、配列だけではなく立体化学的情報もまた、テンプレートから生成物へと移り得る。
混合配列および(5−Me−C)Gリッチ配列を含むテンプレートおよび使用されるそれらの対応する試薬の実際の構造は、以下の通りである:
DNAオリゴヌクレオチドを、標準的なホスホラミダイトプロトコルを使用して、PerSeptive Biosystems Expedite 8090DNA合成機で合成し、そして酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)/CH3CN勾配を用いて逆相HPLCによって精製した。オリゴヌクレオチドは、UVによっておよびエチジウムブロマイドでの染色後の変性PAGEによって定量された。変性PAGEによるDNAの定量を、Stratagene Eagle Eye IIデンシトメーターを用いて行った。合成的に改変されたオリゴヌクレオチドアナログは、Glen Research,Sterling,Virgina,USAから購入した対応するホスホラミダイトまたは制御多孔性ガラス(CPG)ビーズを使用して組み込まれた。
(2−ブロモプロピオンアミド−NHSエステル)
200mgのN−ヒドロキシスクシンイミド(Pierce,Rockford,IL,USA)を、1.1当量の2−ブロモプロピオン酸(ラセミ、(R)−または(S)−のいずれか)および2当量の1−(3−ジエチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド(EDC)(Aldrich)とともに、無水CH2Cl2中に溶解した。2−ブロモプロピオン酸エナンチオマーは、キラルHPLC(ヘキサン中5%イソプロパノール、(R,R)WHELK O1キラル相、220nmで検出)によって判断した場合、>95%のエナンチオ純度であった。この反応を室温で維持し、TLC(EtOAc)によって判断して、1.5時間後に完了させた。粗反応混合物を、2.5%硫酸水素ナトリウム(NaHSO4)とともに抽出して、過剰のEDCを除去した。有機相をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウム(MgSO4)で乾燥し、そして減圧下で濃縮した。残渣を乾燥し、そしてDNA官能基化のために直接的に使用した。
上記のように調製されたNHSエステルを、DMSO中に溶解させた。150μgまでの5’アミノDNAオリゴヌクレオチドを、2時間、室温において、200mMリン酸ナトリウム(pH7.2)中で3mg/mL NHSエステル(最終反応=10%DMSO)と組み合わせた。官能基化オリゴヌクレオチドを、ゲル濾過および逆相HPLCによって精製し、そして変性PAGEおよびMALDI−TOF質量分析によって特徴付けた。
3’チオール基を、3’−ジスルフィド連結CPG(Glen Research,Sterling,Virgina,USA)を使用して、標準的な自動化DNA合成によって組み込んだ。オリゴヌクレオチド合成に続いて、ジスルフィドは、1時間、室温で、50mM DTT,1M TAPS(pH=8.0)で切断し、DNAテンプレート型反応において使用される前に、ゲル濾過によって精製した。
反応を、他に示さない限り、25℃で、50mM MOPS(pH=7.5)および250mM NaCl中の60nMテンプレートおよび60nM試薬で行った。反応アリコートを、2分〜120分の時点で取り出し、過剰のβ−メルカプトエタノールでクエンチした。開始物質および生成物を、クエンチした反応混合物からエタノール沈殿させ、変性PAGEによって分析し、上記のように定量した。生成物形成の相対的な初期速度を、生の収率対時間の当てはめから決定し、kS/kRを計算するために使用した。代表的なデータを図42に示す。
図39Aおよび42A:
kR,app=1.94×103M−1s−1;kS,app=7.07×103M−1s−1;krac,app=4.58×103M−1s−1
図39Bおよび42B:
kR,app=5.83×103M−1s−1;kS,app=21.9×103M−1s−1;krac,app=13.6×103M−1s−1
図42Cおよび44A、低塩:
kR,app=4.00×103M−1s−1;kS,app=17.6×103M−1s−1;krac,app=9.88×103M−1s−1
図42Cおよび44A、高塩:
kR,app=5.94×103M−1s−1;kS,app=18.8×103M−1s−1;krac,app=10.8×103M−1s−1
図42Dおよび44B、低塩:
kR,app=6.11×103M−1s−1;kS,app=25.4×103M−1s−1;krac,app=12.1×103M−1s−1
図42Dおよび44B:
kR,app=24.6×103M−1s−1;kS,app=7.66×103M−1s−1;krac,app=13.6×103M−1s−1
(ブロミド安定性の評価)
反応条件下でのブロミドの構造および構造的安定性を、いくつかの独立した方法によって確認した。各ブロミド連結テンプレートまたは試薬オリゴヌクレオチドを、25℃で72時間まで、37℃で48時間まで、チオールの非存在下での反応条件下で、予備的にインキュベートした。予備的インキュベーションに続いて、立体選択性を、上記のように測定し、常に、予備的インキュベーションの結果として変化しないことが見出された。さらに、ブロミド連結テンプレート((R)、(S)およびラセミック)の大スケール(250pmol)の量を、16時間の反応条件下で各々インキュベートし、そしてMALDI−TOF質量分析によって分析した。ブロミド置換(水またはクロリドによる)の証拠は、表11および12において示されるように、観察されなかった。
図43は、DNAテンプレート型SN2反応の間の立体選択性を失う改変テンプレートまたは試薬構造を示す。全ての場合において、kS,app/kR,app値は、0.95〜1.09(±0.09)の範囲内に入り、これは、少なくとも3つの独立した実験の平均および標準偏差を反映する。アキラルリンカーおよびそれらの対応する試薬を含むテンプレートの実際の構造は、以下の通りであった:
DNAテンプレートおよび試薬を上記のように調製した。チオール連結試薬は、脱保護されず、CD分析の間、それらのジスルフィド形態を保持した。CDサンプルは、100mMまたは5M NaClのいずれかととともに、50mM リン酸緩衝液(pH=7.5)中に215nMテンプレートおよび215nM保護試薬を含んだ。DNAを欠くバックグラウンドサンプルはまた、各サンプルについて調製された。CD測定を、2.0nm分解能を有するJASCO偏光分光計で360nm〜200nmを2nm/秒で走査して、25℃で1mm経路キュベット中で実行した。B−形態およびZ−形態テンプレート−試薬複合体の得られたCDを図44に示す。図44Aは、B−DNAの特徴である正常(混合組成)配列を含むテンプレート−試薬複合体の円偏光二色性(CD)スペクトルを示す。図44Bは、低塩濃度でのB−DNAコンホメーションを有する(5−Me−C)Gリッチ複合体および高塩濃度でのZ−DNAコンホメーションを有する(5−Me−C)Gリッチ複合体のCDスペクトルを示す。混合配列および(5−Me−C)Gリッチ配列を含むテンプレートの正確な構造、ならびに使用されるそれらの対応する試薬は、以下の通りである:
図45は、100mM NaCl(レーン1〜3)または5M NaCl(レーン4〜6)(6時間の時点)においてCGリッチ配列を使用する反応の、代表的な変性ゲル電気泳動分析を示す。レーン1および4:ラセミブロミド;レーン2および5:(R)−ブロミド;レーン3および6:(S)−ブロミド。ブロミド連結試薬は、可視ではない。類似の結果を、NaClの代わりに、Na2SO4を使用して観察した。
観察される立体選択性がクロライドの存在によって影響しなかったことを確認するために、図39および44に示される実験を、NaClの代わりに、Na2SO4の存在下で繰り返した(ナトリウムの濃度を一定に維持する)。3つの独立した試験の結果は、NaClの存在下で報告された結果と非常に類似し、以下の通りである:
NaClの代わりにNa2SO4での図39A:kS/kR=5.4±0.5
NaClの代わりにNa2SO4での図39B:kS/kR=3.9±0.3
NaClの代わりにNa2SO4での図39C:kS/kR=4.7±0.7
NaClの代わりにNa2SO4での低塩、図44A:kS/kR=3.7±0.7
NaClの代わりにNa2SO4での高塩、図44A:kS/kR=3.1±0.6
NaClの代わりにNa2SO4での低塩、図44B:kS/kR=3.6±0.5
NaClの代わりにNa2SO4での高塩、図44B:kS/kR=0.25±0.03
(代表的生成物のMALDI−TOF質量分析)
図39の代表的なDNAテンプレート型反応(240pmolスケール)からの生成物を、調製用変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、続いて、一晩37℃で、0.1M酢酸トリエチルアンモニウムで抽出した。凍結乾燥した生成物を、MALDI−TOF質量分析に供し、この結果を表13に要約する。全ての場合において、観察される質量が予期された質量と一致する。
この実施例は、たとえ関係する反応物が交差反応性であり、従って、従来の合成条件下でミスマッチであるとしても、オリゴヌクレオチドが、同じ溶液中でいくつかの異なる合成反応型を同時に指示し得ることを実証する。これらの知見はまた、複数の、必ずしも同時ではない適合性の反応型を使用して、生成物に合成ライブラリー前駆体のワンポット多様化を実行することが可能であることを実証する。
(テンプレートおよび試薬の合成)
オリゴヌクレオチドを、標準的な自動化固相技術を使用して合成した。改変ホスホラミダイトおよび制御多孔性ガラス支持体を、Glen Research,Sterling,Virginia,USAから得た。他に示さない限り、官能基化テンプレートおよび試薬を、5’−H2N(CH2O)2末端オリゴヌクレオチド(テンプレートのため)または3’−OPO3−CH2CH(CH2OH)(CH2)4NH2末端オリゴヌクレオチド(試薬のため)を、25℃で、2mg/mLの適切なN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(Pierce,Rockford,IL,USA)を含む水性200mM pH7.2リン酸ナトリウム緩衝液:DMFの9:1混合物中で反応させることによって合成した。
DNAオリゴヌクレオチドと1a〜6cにおける官能基との間のリンカーは、以下の通りである。1bおよび1c:DNA−5’−NH2;1a、2a〜2c、3aおよび3c:DNA−5’−O(CH2)2O(CH2)2−HN−;5a:DNA−3’−O−(CH2)3SH;4a〜4c、5b、5c、6aおよび6c:DNA−3’−O−CH2CH(CH2OH)(CH2)4NH−。図46における可能な全ての生成物(レーン5、9および14)を生成するために使用されるオリゴヌクレオチド配列にて、アニーリング領域に下線を付している:R−TATCTACAGAG−3’[配列番号106](1a〜1c);R−TATCTACAGAGTAGTCT−3’[配列番号107](2a〜2c);R−TATCTACAGAGTAGTCTAATGAC−3’[配列番号108](3a〜3c);5’−CAGCCTCTGTAGAT−R[配列番号109](4a〜4c);5’−CTCAGCCTCTGTAGAT−R[配列番号110](5a〜5c);5’−GGCTCAGCCTCTGTAGAT−R[配列番号111](6a〜6c)。官能化されたテンプレートおよび試薬を、ゲル濾過(Sephadex G−25)およびその後の逆相HPLC(0.1M酢酸トリエチルアンモニウム/アセトニトリル勾配)によって、精製した。代表的な官能化されたテンプレートおよび試薬を、MALDI質量分析法によりさらに特徴付けた。
すべての反応を、別個の容器にて純水中に試薬およびテンプレートを溶解した後にそれらを50mM水性TAPS緩衝液(pH8.0)、250mM NaCl中に25℃にて16時間、DNA結合反応物60nM(図47)または12.5nM(図47および48)と合わせることによって、実施した。NaBH3CN、EDCおよびスルホ−NHSが、記載したように適切な場合には存在した。生成物を、エチジウムブロマイド染色およびUV透過照明を使用して、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。荷電状態の変化、結合した官能基、および部分的二次構造は、同じ長さの種々の官能化されたオリゴヌクレオチドについて、穏やかなゲル移動度変化を生じた(図46〜48)。
カップリング反応は、分子の多様性を構築するために有用であるが、DNAテンプレート官能基変換の発達は、生成し得る構造の型を有意に拡大し得る。DNAテンプレート合成を使用して、カップリング反応において使用する官能基を脱マスクまたは相互変換することにより、官能基を変換し得る。配列をプログラムされたライブラリー部分集合内の反応性基を露出するかまたは作製することによって、DNAテンプレート官能基の相互変換により、ライブラリーの多様性が、配列脱マスクにより生成されることが可能になる(図49)。図49において、PG1〜PG3は、3つの異なる保護基を示し、A〜Fは、足場分子の脱保護された官能基と反応可能な反応物を示す。連続的脱マスクアプローチは、DNAに結合される能力を通常は欠く反応物(例えば、単純なアルキルハライド)が、分子内非テンプレート性反応様式で配列を特定されたテンプレート部分集合と反応することにより、ライブラリーの多様性に寄与すること可能にするという、大きな利点を提供する。この利点は、生成され得る構造の型を有意に増加する。他方、連続的脱マスクは、「工程」ごとにより多くの操作を必要とするという欠点を有する。なぜなら、以前に使用された低分子反応物は、DNAテンプレート官能基脱マスクの間に除去されなければならないからである。この除去は、単純なゲル濾過カートリッジを使用して、ライブラリー全体に対して迅速に実施され得る。
第1の種類のDNAテンプレート官能基変換は、保護形態からアミン基、チオール基、アルコール基、カルボキシレート基またはアルデヒド基を、配列特異的に脱マスクする。Staudinger反応において、アジドは、ホスフィンと反応して、アザイリドを生じる(Staudingerら(1919)HELV.CHIM.ACTA.2:635〜646)。この反応は、水性媒体において実施される場合に、そのアザイリドは、自然加水分解して、アミンおよびホスフィンオキシドを提供する(Scrivenら(1988)CHEM.REV.88:297〜368)。DNA結合アリールホスフィン試薬およびDNA結合アルキルホスフィン試薬は、アジド結合DNAテンプレートと合わされた場合に、配列特異的アミン脱保護を可能にする(図50A)。DNA結合ホスフィンおよびDNA結合アジドは、両方とも、以前のDNAテンプレート反応において首尾良く使用されている。代替的DNAテンプレートアミン脱保護として、o−ニトロベンゼンスルホンアミド(アミンと市販のo−ニトロベンゼンスルホニルクロライドとから調製する)の求核性芳香族ipso−置換は、遊離アミンを生じ得る(図50B)。この反応は、脱プロトン化チオフェノールの存在下で効率的に進行することが公知であり、従って、pH>8にて、o−ニトロベンゼンスルホンアミド結合テンプレートに対するチオフェノール結合試薬のDNAテンプレート攻撃により、配列特異的アミン脱保護が可能になり得る(Fukuyamaら(1999)SYNLETT 8:1301〜1303)。
第2の種類のDNAテンプレート官能基変換は、DNAテンプレート反応により形成されるかまたは使用される基を、相互変換する。2つの官能基の相互変換が、図51に示される。2,6−二置換ピリジンN−オキシドの存在下でのルテニウム(II)ポルフィリンは、広範な種類の単純な電子欠乏オレフィンの顕著に効率的なエポキシド化を触媒する(Higuchiら(1989)TETRAHEDRON LETT.30:6545〜6548;Grovesら(1985)J.AM.CHEM.SOC.107:5790〜5792;Zhangら(2002)ORG.LETT.4:1911〜1914;Yuら(2000)J.AM.CHEM.SOC.122:5337〜5342)。一本鎖DNAは、Ru(II)と複合体化した水性テトラキス(4−カルボキシフェニル)ポルフィリン複合体の存在下で安定であり、Ru(II)−DNA結合体は、以前に報告されている(Hartmannら(1997)J.BIOL.INORG.CHEM.2:427〜432;Pascalyら(2002)J.AM.CHEM.SOC.124:9083〜9092)。DNA結合Ru(II)ポルフィリン触媒を使用するDNAテンプレートオレフィンエポキシド化が、図51Aに示される。これは、市販のテトラキス(4−カルボキシフェニル)ポルフィリンをアミン末端オリゴヌクレオチドに結合することによって、調製される(Holmlinら(1999)BIOCONJUG.CHEM.10:1122〜1130)。生じるDNA結合ポルフィリンは、以前に記載されるようにRu3(CO)12を用いて金属化される。この官能基の相互変換は、DNAテンプレートWittigオレフィン化およびHeckカップリングの生成物がエポキシド付加反応のための基質になることを可能にすることによって、いくつかの多様な反応を橋渡しする。
(A.ポリカルバメートライブラリーの合成)
本実施例は、増幅可能なポリカルバメートライブラリーを生成するためのストラテジーを示す。
上記ライブラリーをコードするために使用される可能な16種のジヌクレオチドコドンのうち、1種が、開始コドンの機能を割当てられ、1種が、終止コドンとして役立つように割当てられる。その後、人工的遺伝コードが、残りの14種までのジヌクレオチドの各々を異なるモノマーに割当てて作製される。幾何学的理由により、1つのモノマーは、実際には、2つの側鎖を含むジカルバメートを含む。各モノマー内において、上記ジカルバメートは、シリルエノールエーテルリンカーを介して、(tRNAアンチコドンと同様に)対応するジヌクレオチドに結合される。これは、フルオライドを用いる処理により、そのネイティブDNAと遊離カルバメートとを遊離させる。
モノマーが合成された後、DNA足場におけるモノマーのアセンブリおよび重合は、自然に生じるべきである。シキミ酸1(市販される、生合成(Davis(1955)ADV.ENZYMOL.16:287)により入手可能またはD−マンノースからの短い合成(Fleetら(1984)J.CHEM.soc.905;Harveyら(1991)TETRAHEDRON LETT.32:4111)によって入手可能)は、モノマー合成についての便利な開始点として作用する。synヒドロキシル基は、p−メトキシベンジリデンとして保護され、そして残りのヒドロキシル基は、tert−ブチルジメチルシリルエーテルとして作用して、2が得られる。次いで、保護されたシキミ酸のカルボキシレート部分は、塩化アルミニウムリチウム(LAH)還元、得られるアルコールのトシル化、およびLAHを用いたさらなる還元によって完全に除去されて、3を提供する。
本実施例は、DNAテンプレート合成を用いて、低分子のライブラリーを作製し得ることを実証する。特に、図55に示すとおり、DNAテンプレート大環状フマルアミドライブラリーを作製することが可能である。
有意な成功にもかかわらず、テンプレート依存性重合の一般性および配列特異性は、依然として、大部分が調査されていない。例えば、容易に官能基化される、リボース骨格を欠く合成モノマーの、効率および配列特異的テンプレート重合は、報告されていない。このような系は、これらの合成モノマーからなるポリマーの、現在DNA、RNAおよびタンパク質についてのみ利用可能な翻訳(重合)、選択、および増幅の反復されるサイクルを介する進化の可能性を生じる。
ペプチド核酸(PNA)は、それらが配列特異的にDNAを結合する公知の能力、およびそれらの合成的に接近可能なアミノ酸からの単純な調製に起因して、合成ポリマー進化のための魅力的な候補である。PNAをDNAテンプレートまたはRNAテンプレート上にオリゴマー化するための以前の努力は、カップリグ反応としてアミンアシル化を使用し、そして最も効率的に、かつ配列特異的に進行した(Boehlerら、(1995)Nature 376:578−581;Schmidtら、(1997)Nuc.Acids Res.25:4792−4796)。
本発明のなお別の実施形態において、核酸(例えば、DNA、RNA、これらの誘導体)は、重合化触媒に結合される。核酸が、複合体構造に折りたたまれ得るために、その核酸は成長する高分子鎖の重合化を指向するおよび/またはその重合化に影響を与えるために使用され得る。例えば、核酸は、重合されるモノマー単位の選択、およびどのような重合化反応がおこるか(例えば、立体化学、立体規則性、活性)に影響し得る。この合成高分子は、分子量、密度、疎水性、立体規則性、立体選択性などのような特定の特性について選択され得、そしてその合成を指向する触媒の不可欠な部分を形成する核酸は、増幅され、そして進化され得る(図65A)。リガンドの多様化、選択、および増幅の繰り返しサイクルは、所望の特性への、触媒および高分子の真の進化を可能にする。
DNAを非天然の進化可能なポリマーへと翻訳する代替のアプローチは、いくつかのDNAポリメラーゼが、特定の改変ヌクレオチド三リン酸基質を受け入れる能力を利用する(Perrinら(2001)、J.Am.Chem.Soc.123,1556;Perrinら(1999)、Nucleosides Nucleotides 18:377−91;Gourlainら(2001)、Nucleic Acids Res.29:1898−1905;Leeら(2001)、Nucleic Acids Res.29,1565−73;Sakthievelら(1998)、Angew.Chem.Int.Ed.37:2872−2875)。Watson−Crick水素結合に関与しない基への改変を保有する、いくつかのデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは、天然DNAテンプレートの反対側に、高い配列忠実度で挿入されることが公知である。重要なことには、改変されたヌクレオチドを含む一本鎖DNAは、DNAポリメラーゼによって触媒された、天然または改変のモノヌクレオチドの取込みに効率的なテンプレートとして役立ち得る。
金属結合ウリジンおよび7−デアザアデノシンアナログの合成についてのストラテジーを、図68に示す。両経路は、金属結合官能基のNHSエステルとアミノ修飾デオキシリボヌクレオチド三リン酸との間のアミド結合形成で終結する(7および13)。アナログ7およびアナログ13ならびに7のアセチル化誘導体は、PCRに適する熱安定性DNAポリメラーゼを含むDNAポリメラーゼによって許容されることが、これまで示されてきた(Perrinら(2001)前出;Perrinら(1999)前出;Lathamら(1994)、Nucleic Acids 12v1PRE 22:2817−22;Gourlainら(2001)、Nucleic Acids Res.29:1898−1905;Leeら(2001)、Nucleic Acids Res.29、1565−73;Sakthivelら(1998)、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.37:2872−2875)。このアプローチは、幅広い種類の金属結合配位子を、いずれかのヌクレオチドアナログに迅速に取り組むことを可能にする。以前に報告された(Sakthivelら(1998)前出)経路に従い、アミノ修飾されたデオキシリボヌクレオチド三リン酸7が合成されている。図69に示されるように、N−アリルトリフルオロアセトアミドとの市販の5−ヨード−2’−デオキシウリジン(22)のHeckカップリングは化合物23を生成した。トリメチルホスフェート、オキシ塩化リン(POCl3)、およびプロトンスポンジ(proton sponge)(1,8−ビス(ジメチルアミノ)−ナフタレン)、その後のトリ−n−ブチルアンモニウムピロホスフェートでの化合物23の処理により、5’−三リン酸基が導入され、次いでトリフルオロアセトアミド基が水性アンモニアで除去され、C5修飾ウリジン中間体7を生成した。
図75に示した金属結合官能基を含む修飾ヌクレオチド三リン酸の、DNAポリメラーゼ酵素によって受容される能力を研究した。合成ヌクレオチド三リン酸を、イオン交換および逆相HPLCによって精製し、そしてTaq DNAポリメラーゼ、3種の天然のデオキシヌクレオチド三リン酸、pUC19テンプレートDNA、および2種のDNAプライマーを含むPCR反応物に加えた。プライマーを、長さが50塩基対〜200塩基対の範囲のPCR産物を生成するように選択した。コントロールのPCR反応物は、4種の天然のデオキシヌクレオチド三リン酸を含み、そして非天然のヌクレオチドを含まなかった。PCR反応物を、ゲル電気泳動によって分析し、そしてその結果は、官能化ウリジンアナログ2、3、7、13、28、29、および30が、30回のPCRサイクルにわたってTaq DNAポリメラーゼによって効率良く取り込まれたが、ウリジンアナログ31および32は、効率良く取り込まれなかったことを示した(図75を参照のこと)。これらの結果は、金属結合官能基を含む合成ヌクレオチドが、鋳型として読み取られ得、かつ構築ブロックとしてDNAポリメラーゼを使用して非天然の核酸中に取り込まれ得ることを実証する。8修飾アデノシン三リン酸32および33は、Taq DNAポリメラーゼによって受容されなかった。このことは、C8での修飾の拒絶の可能性を示唆する(図75を参照のこと)。
DNAポリメラーゼにマッチする合成金属結合ヌクレオチドを含む非天然ポリマーライブラリーを、作製した。2つのプライマー結合領域に挟まれた40個のランダム塩基からなりかつ図76に示したイミダゾール結合チミン塩基を含む、1015個の様々な修飾核酸のライブラリーを作製した。これらのライブラリーを、3種の方法:標準的なPCR、誤りがちの(error−prone)PCR、および大量のテンプレートと化学量論的量のたった1種のプライマーを使用するプライマー伸長によって効率良く生成した。得られる二本鎖ライブラリーを変性し、そして上記に記載したアビジンベースの精製系を使用して、所望の鎖を単離した。Cu2+の存在下でのみ折りたたまるポリマーについて、このライブラリーにおける2ラウンドのインビトロ選択を、折りたたまれた核酸についてのゲル電気泳動を使用して実施した。
一旦、官能化DNAのライブラリーを、合成し特徴付けすると、これらは、(i)折りたたみ、(ii)標的結合性、または(iii)触媒作用について、3つの型のインビトロ選択に供される。
各々の選択のラウンドの後に、活性なライブラリーメンバーを、非天然のヌクレオチドを用いるPCRによって増幅し得、そしてさらなる選択のラウンドに供して、所望の触媒作用についてライブラリーを富化する。ライブラリーは、誤りがちなPCRを使用するランダムな変異誘発によってか、または非相同組換えによって多様化され得、そして選択前および選択後に、DNA配列決定によって特徴付けられ得る。誤りがちなPCRは、通常のPCRよりも本質的に効率が低いので、誤りがちなPCRは、天然のヌクレオチドのみを用いて行われる。次いで、変異誘発したDNA鋳型を、上記のように非天然の核酸ポリマーに翻訳する。
本実施例は、タンパク質結合親和性を有する、核酸に結合した合成低分子についてのインビトロ選択が実施され得ることを実証する。これらの選択は、(i)タンパク質結合性について、これまでに報告された合成分子スクリーニングよりも非常に大きな感度(10−20mol)を提供し、(ii)迅速に反復して、106倍よりも大きい活性分子の正味の富化を達成し得、そして(iii)結合特異性について選択するのに適し得る。
(DNA合成)
DNAオリゴヌクレオチドは、標準的なホスホラミダイトプロトコルを使用して、PerSeptive Biosystems Expedite 8090 DNA合成機で合成した。すべての試薬は、Glen Research,Sterling,Virginia,USAから購入した。グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)選択のためのテンプレートは、5’−アミノ修飾因子C12を使用して合成し、そして他のすべてのテンプレートは、5’−アミノ修飾因子C5を使用して合成した。
グルタチオンを、標準的なBoc化学を使用して、室温にて固相上で合成した。200mg PAM樹脂(Advanced Chem Tech)を、2mL DMF中で20分間膨潤させた。N−Boc−グリシン(Sigma、640μmol、112mg)、ジイソプロピルカルボジイミド(570μmol、89μL)、および4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、57μmol、7mg)を、樹脂に加え、そして4時間攪拌した。樹脂を、DMFで洗浄し、次いで、DMF/CH2Cl2(1:1)で洗浄した。N−Boc保護基を、トリフルオロ酢酸(TFA):m−クレゾール(95:5)の3分間の洗浄を2回行って除去した。次いで、樹脂を、DMF:CH2Cl2(1:1)およびDMF:ピリジン(1:1)で洗浄した。800μLの1−メチル−2ピロリジノン中の、N−Boc−Cys(Fm)−OH(ChemImpex、800μmol、320mg)、O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(Aldrich、720μmol、274mg)、2,6−ルチジン(1.2mmol、131μl)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、750μmol、131μl)の溶液を、15分間攪拌し、そして樹脂に加え、30分間攪拌した。次いで、樹脂をDMF/CH2Cl2(1:1)で洗浄した。システイン上のN−Boc保護基を除去するために、1.75mL CH2Cl2中の、トリメチルシリルトリフレート(TMS−Otf)(2.8mmol、0.5mL)および2,6−ルチジン(4.58mmol、0.5mL)の溶液を樹脂に加え、そして1時間攪拌した。次いで、樹脂を、メタノールで洗浄し、そしてDMF:CH2Cl2(1:1)で洗浄した。Fmoc−Glu−OFm(ChemImpex、800μmol、438mg)を上記ようにカップリングした。完全に保護したグルタチオンを、トリフルオロメタンスルホン酸:m−クレゾール:チオアニソール:TFA(2:1:1:8)の溶液を用いて樹脂から切り出し、1時間攪拌した。この混合物を濾過し、そして濾液をヘキサン中に抽出した。粗抽出物を、ヘキサン中で分取用の薄層クロマトグラフィーを使用して精製した。粗生成物(Rf=0.35)を含むシリカを、ヘキサン:酢酸エチル(4:1)を用いて広範に洗浄した。濾液を、減圧下で単離して、黄褐色の固体を得た。この合成についての収率は、最適化されなかった。
N−ホルミル−Met−Leu−Phe(MLF)を、Sigmaから購入し、化合物(1)について記載した条件を使用して、CPGビーズ上の5’−アミノ末端保護DNAにカップリングした。
MLF(10μmol〜100μmol、0.17M)を、乾燥DMFに、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(1当量)(Novabiochem)、O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(0.9当量)(Aldrich)、およびDIPEA(2.3当量)と共に溶解させた。この溶液を、室温で1時間攪拌し、次いで、CPGビーズ上の固有配列の5’−アミノ末端保護DNAに加えた。この混合物を、室温で1時間攪拌した。次いで、ビーズをDMF、次いでCH3CNで洗浄し、そして窒素下で乾燥させた。
Fmoc−Lys(Mmt)−OH(Novabiochem)を、化合物(2b)について記載した方法を使用して、CPGビーズ上のアミノ末端保護DNAに付着させた。Fmoc基を、DMF中の20%ピペリジンでの2分間の洗浄を3回行って除去した。次いで、この混合物を、DMFで洗浄し、次いで、CH3CNで洗浄した。次いで、α−アミンを、アセトアルデヒド/ピリジン/テトラヒドロフラン(1:1.1:18)中の5% 1−メチルイミダゾールの溶液で、室温にて10分間キャップした。次いで、ビーズを、DMFおよびCH3CNで洗浄し、そしてCH2Cl2中の3%トリクロロ酢酸、1%チオアニソールで、室温にて5分間処理して、Mmt保護基を除去した。この混合物を、CH3CNで洗浄し、そして窒素で乾燥させた。Fmoc−Phg−OH(Novabiochem)を、化合物(2b)について記載した方法を使用して、Lys−結合DNAのε−アミンに付着させた。Fmoc保護基の除去後、4−カルボキシベンゼンスルホンアミド(Aldrich)を、化合物(2b)について記載した方法を使用して、ビーズに付着させた。このビーズを、DMFで洗浄し、次いで、CH3CNで洗浄し、そして窒素で乾燥させた。
5’−ビオチン修飾ホスホラミダイト(Glen Research,Sterling,Virginia,USA)を、DNA合成における最終モノマーとして使用した。
化合物(2b)について記載した条件を使用して、キモスタチン(Sigma)をCPGビーズ上のアミノ末端が保護されたDNAに結合した。
アンチパイン(Sigma,1.5μmol,0.9mg)を、DMF中300mM DCCおよび300mM NHSの溶液30μLに添加した。室温で1時間撹拌した後、この溶液を、0.1M MES緩衝液(pH6.0)中の5’アミノ終端DNA(約200〜300μM)45μLに添加した。このDNAは、予め、CPGビーズから取り除いており、次のセクションに記載したように、HPLCにより精製した。2時間後、この溶液を、Sephadex G−25を使用するゲル濾過およびその後の逆相HPLCによって精製した。
低分子−DNA結合体を、55℃にて1時間、メチルアミン:水酸化アンモニウム(1:1)の溶液を用いてCPGビーズから取り除いた。この溶液を、真空下で乾燥し、次いで、TEAA/CH3CN勾配を使用する逆相HPLCにより精製し、MALDI−TOF質量分析により分析した。ストック溶液の濃度を、UV−Vis分光法を使用して測定し、選択実験のために限界希釈物を調製した。サンプルを、−20℃にて水中に保存した。
NHS−活性型Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Pharmacia)を、製造業者の指示書に従って準備した。ウマGST、ウシ炭酸脱水酵素(CA)、パパイン、Nα−p−トシル−L−リジンクロロメチルケトン(TLCK)処理したウシキモトリプシン、およびN−p−トシル−L−フェニルアラニンクロロメチルケトン(TPCK)処理したウシトリプシンを、Sigmaから購入した。代表的に、タンパク質を、20〜100μMの濃度にて、リン酸緩衝化生理食塩(PBS)緩衝液(pH7.4〜7.6)中に溶解した。タンパク質濃度を、UV−Vis分光法を使用して測定した。タンパク質を4℃にて16時間ビーズと共にインキュベートした。このビーズを、Tris緩衝液で2時間キャッピングし、次いで、1M NaClを含有する適切な選択緩衝液で激しく洗浄し、次いで、適切な選択緩衝液(表14を参照のこと)中に移した。ビーズを、ビーズが使用される最初の容量と同じ容量の選択緩衝液中で、4℃にて最大1ヶ月間保存した。使用前に、パパインビーズを、5.5mM システインHCl、1.1mM EDTAおよび0.067mM β−メルカプトエタノールの溶液を使用して、4℃にて20分間活性化した。ストレプトアビジン磁性粒子(Roche)を、使用前に選択緩衝液で3回洗浄した。
化合物(1)(結合リガンド)の量を、103分子と107分子の間と見積もり、化合物(2a)(非結合リガンド)を102〜106モル過剰で使用した。(1)および(2a)を、40μLのGSTビーズに添加し、4℃にて1時間撹拌した。混合物を5.0μmの低結合Duraporeメンブレンスピンフィルター(Millipore)に移し、2×150μL PBS(pH7.4)、1×100μL 0.1M Tris(pH8.0)、0.5M NaClおよび1×150μL PBSで洗浄した。結合したリガンドを、室温にて、100μLの0.1Mグルタチオン(Sigma)を用いてビーズを撹拌するこよによって溶離した。溶離液を3M酢酸ナトリウムおよび1Lグリコーゲンを用いてエタノール沈殿した。沈殿を直接PCRに用いた。
化合物(2b)(非結合リガンド)および化合物(3)(結合リガンド)を、40μLの再懸濁ビーズに添加し、選択緩衝液を用いて400μLまで希釈した。比率は、GST選択についての比率と同様にした。この混合物を、4℃で1〜2時間攪拌した。次いで、室温にて選択を行った。各混合物を、スピンフィルターに移し、400μLの洗浄緩衝液で3回、400μLの選択緩衝液で1回洗浄した。この樹脂を、60μLの選択緩衝液でスピンフィルターから取り除き、得られたビーズをPCRに供した。
化合物(4a)(非結合リガンド)および化合物(5)または(6)(結合リガンド)を、パパインビーズと共にインキュベートし、炭酸脱水酵素選択について記載したように選択した。
化合物(4a)(非結合リガンド)および化合物(5)(結合リガンド)を、キモトリプシンビーズと共にインキュベートし、炭酸脱水酵素選択について記載したように選択した。
化合物(4a)(非結合リガンド)および化合物(6)(結合リガンド)を、トリプシンビーズと共にインキュベートし、炭酸脱水酵素選択について記載したように選択した。
化合物(3)(非結合リガンド)および化合物(4b)(結合リガンド)を、15μLのストレプトアビジン磁性粒子と共にインキュベートし、室温にて20分間撹拌した。MPC−Sマグネット(Dynal)を使用して、このビーズを、0.1M NaOH、1mM EDTA(100〜200μL)で2回、洗浄緩衝液(100〜200μL)で4回、そして、選択緩衝液で1回洗浄した。次いで、ビーズを、15μLの二重蒸留H2O中に再懸濁した。
108分子の化合物(3)および1011分子の化合物(2b)を、40μLの炭酸脱水酵素ビーズと共に1時間インキュベートし、次いで、記載したように選択した。最初の選択ラウンドの後、5μLの再懸濁アガロースビーズをPCRで除去した。6MのグアニジンHCl、10mM EDTA(40μL)をビーズに添加し、混合物を90℃まで15分間加熱した。Wizard Minicolumn(Promega)を使用してビーズをフィルターで取り除いた。濾液を、Centrisep Spin Column(Princeton Separations)を使用して選択緩衝液に緩衝液交換した。炭酸脱水酵素ビーズの新しいアリコートを溶離したテンプレートに添加した。2回目の選択ラウンドの後、アガロースビーズを30μLのH2O中に懸濁し、そのうちの15μLをPCRに使用した。PCR生成物をHindIIIで消化し、図84の結果を生じた。
親和性選択:6×109分子の化合物(6)、2.3×1010分子の化合物(5)および1.4×1011分子の化合物(4a)を、1時間、40μLのパパインビーズに添加した。ビーズを、パパイン洗浄緩衝液(100μL)で3回、100μLのパパイン選択緩衝液で1回洗浄した。ビーズを、30μLの二重蒸留H2Oでスピンフィルターから取り除いた。再懸濁したビーズの3μLのアリコートをPCRのために取った。DNA結合体を、70μLの6MグアニジンHClを添加し、混合物を90℃まで15分間加熱することによって、ビーズから溶離した。溶離した物質を、炭酸脱水酵素選択の反復に記載したように緩衝液交換した。2回目の選択ラウンド後、30μLのH2Oを用いてアガロースビーズをスピンフィルターから取り除き、再懸濁したビーズの15μLをPCRのために使用した。
これらの実験の高感度に起因して、これらの研究を通じて2つの重要な汚染コントロールを使用した。1つ目は、リガンド−DNA結合体をタンパク質結合ビーズに添加しなかったこと以外は、上記のように各選択を行い、緩衝液の汚染およびサンプル間の交差汚染の試験を可能にした。2つ目は、選択からの物質を加えないPCR反応を、プライマー、dNTPおよびPCR緩衝液中の汚染について試験するために使用した。
富化を、既知の濃度のストック溶液により決定した、選択に導入された結合リガンドの分画に対する、制限消化により決定した、選択で残った結合リガンドの分画の割合として算出する。
制限エンドヌクレアーゼの切断部位に下線を付す。
本実施例によって、核酸テンプレート型の合成を介した新規化学反応の存在を同定することが可能であることを実証する。新規化学反応を、結合形成反応を選択し、それを特徴づける為の実験の結果として同定する。
この実施例は、DNAテンプレート型合成を使用する、新しい化学反応を発見することが実際に可能であることを示す。図87に示されるDNA連結官能基を含有する25の反応混合物を、ω構造、プールAの反応物に対する1ポットアセンブリ法、および最適化したコドンセットを使用して、本質的に図9に記載されるように作製した。このセットの中でも25の可能性のある反応は、Huisgenのアジドとアルキンとの間の、1,3−二極環付加(Huisgenら(1989)PURE APPL.CHEM.61:613)である。Sharplessおよび共同実験者らは、最近、触媒量のCuSO4およびアスコルビン酸ナトリウムが、このプロセスの位置選択性および効率を劇的に改善し、室温での強固な反応を可能にすることを報告した(Rostoutseuら(2002)ANGEW CHEM.INT.ED.ENGL.41:2596)。反応発見の選択を、CuSO4およびアスコルビン酸ナトリウムの有無のいずれかでの、この25反応マトリクスを使用する1pmolスケールで実施した。
この実施例は、実施例Aで同定された反応がまた、96−反応マトリクスにおいて同定され得ることを示す。簡単には、図88に示されるDNA結合官能基を有する96−反応マトリクスが生成した。プールAは、12個の反応物(A1〜A12)を含み、プールBは、8個のビオチン化された反応物(B1〜B8)を含んだ。合わせると、96の異なる反応が可能であった。
この実施例は、テンプレート型核酸合成を用いて新規化学反応を発見し得ることを示す。詳細には、この実施例は、新規Pd媒介カップリング反応の発見を説明する。
本明細書中に引用される刊行物、特許、特許出願の各々の全内容は、あらゆる目的のために、本願に参考として援用される。
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態において実施され得る。したがって、以上の実施形態は、例示された全ての観点ではなく、むしろ、本明細書中に記載された本発明に限定しているとみなされるべきである。本発明の範囲は、従って、以上の説明ではなく、むしろ、添付の特許請求の範囲によって示され、添付の特許請求の範囲の意味および等価の範囲内の、全ての変更が、本発明に包含されることが意図される。
Claims (9)
- 核酸−テンプレート化学反応の間の第一反応単位と第二反応単位との間の反応を誘導するインビトロの方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)(i)近位端と遠位端とを有し、かつ第一コドンを含む第一オリゴヌクレオチドに共有結合された第一反応単位を含むテンプレート、および(ii)該第一コドンとアニーリング可能な第一アンチコドンを含む第二オリゴヌクレオチドと結合した第二反応単位を含む第一移動単位を提供する工程であって、ここで該第一反応単位は、該第一オリゴヌクレオチドの該近位端と該遠位端の中間にある付着部位に付着される、工程;ならびに
(b)該オリゴヌクレオチドを共にアニーリングさせることにより、該第一反応単位を該第二反応単位と反応させ、核酸ではない反応生成物を産生させる工程
を包含する、方法。 - 前記テンプレートが、第二アンチコドン配列にアニーリングすることが可能な第二コドンを含み、ここで、該第二コドンは前記第一コドンとは異なり、該第二アンチコドンは、前記第一アンチコドンとは異なる、請求項1に記載の方法。
- 前記第一コドンが、前記第一反応単位の前記付着部位の近位に位置し、そして、前記第二コドンが、該第一反応単位の該付着部位の遠位に位置する、請求項2に記載の方法。
- 前記第二コドンとアニーリングすることが可能な前記第二アンチコドン配列を含む第三オリゴヌクレオチドと結合した第三反応単位を含む第二移動単位を提供する工程をさらに包含する、請求項2または3に記載の方法。
- 前記第一移動単位の前記第一アンチコドンが、前記テンプレートの前記第一コドンにアニーリングし、そして、前記第二移動単位の前記第二アンチコドンが、該テンプレートの前記第二コドンにアニーリングする、請求項4に記載の方法。
- 前記第一移動単位が、前記第二移動単位と同時に前記テンプレートにアニールし、その結果、前記第二反応単位と前記第三反応単位が前記第一反応単位と反応する、請求項5に記載の方法。
- 前記第二反応単位が、前記第二オリゴヌクレオチドに共有結合される、請求項1に記載の方法。
- 前記第三反応単位が、前記第三オリゴヌクレオチドに共有結合される、請求項4に記載の方法。
- 前記第一反応単位が足場分子である、請求項1に記載の方法。
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