JP6791750B2 - 多重化アッセイを行うための改良された方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
それぞれの開示を参照によってその全体として本明細書に組み入れる、それぞれ２０１３年３月１１日に出願した米国特許仮出願第６１／７７５８６０号、２０１３年３月１３日に出願した第６１／７７８７２７号を参照する。

連邦政府資金による研究の記載
本発明は、アメリカ国立癌研究所により授与された５ＲＣＡ１３０３９１−０４のもとに連邦政府の支援により行われた。米国政府は、本発明における特定の権利を有する。

結合アッセイを実施するための改良された方法および生成物を提供する。これらの方法は、使用者が標準的な一連のアッセイ材料からその必要を満たすアッセイを構成することを可能にする連結剤複合体の使用を含む。本発明の生成物および方法は、アッセイの開発における生産性および柔軟性を著しく増大させる。

試料中の対象の分析対象物質の高感度の測定のための結合反応、例えば、抗原抗体反応、核酸ハイブリダイゼーションおよび受容体リガンド反応を用いる技術に関する実質的な文献の集合が構築された。多くの生化学的結合システムの高度の特異性は、基礎研究、ヒトおよび獣医学診断、環境モニタリングならびに工業試験を含む様々な需要における有用な多くのアッセイ方法およびシステムにつながった。対象の分析対象物質の存在は、結合反応における分析対象物質の関与を直接的に測定することにより測定することができる。いくつかのアプローチにおいて、この関与は、１つまたは複数の結合物質に結合した観測可能な標識の測定により示すことができる。

市販のアッセイは、使用者にとって唯一の関心事であり得る標的（単数または複数）を評価する柔軟性を使用者にほとんどまたは全く与えない事前にセットされた構成で一般的に供給される。そのような市販のパネルは、ほとんどもしくは全く関心のない標的分析対象物質を含む可能性があり、かつ／または所望の標的分析対象物質を含まない可能性がある。したがって、標準セットのアッセイ材料および方法を用いて使用者により規定される多重化アッセイを構成する柔軟な方法を使用者に提供する必要がある。

本発明は、以下の特定の実施形態を企図する。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書で述べる実施形態に対する様々な修正、追加および変更を当業者が行うことができる。そのような修正、追加および変更は、特許請求の範囲内に入るものとする。

実施形態（１）：以下の工程を含む対象の複数の分析対象物質の多重化結合アッセイを行う方法：
１つまたは複数の工程で、以下の成分：対象の第１の分析対象物質および対象の第２の分析対象物質を含む試料、第１の結合ドメイン上に固定化された第１の標的物質、連結剤に接続された、第１の標的物質の結合相手である第１の標的物質相補体、補助連結剤に接続された、第１の分析対象物質の結合相手である第１の結合試薬、第２の結合ドメイン上に固定化された第２の標的物質、連結剤に接続された、第２の標的物質の結合相手である第２の標的物質相補体、補助連結剤に接続された、第２の分析対象物質の結合相手である第２の結合試薬ならびに場合により架橋剤の少なくとも２つのコピーを混ぜ合わせる工程であって、架橋剤が除外される場合には、各連結剤が補助連結剤の結合相手であり、架橋剤が含められる場合には、架橋剤が連結剤の１つに対する第１の結合部位および補助連結剤の１つに対するさらなる結合部位を有する、工程と、
第１の標的物質、第１の標的物質相補体、第１の結合試薬および第１の分析対象物質を含む第１の結合ドメイン上の第１の結合複合体ならびに第２の標的物質、第２の標的物質相補体、第２の結合試薬および第２の分析対象物質を含む第２の結合ドメイン上の第２の結合複合体を形成する工程と、
第１および第２の結合ドメイン上の第１および第２の分析対象物質の量をそれぞれ測定する工程。

実施形態（１）（ａ）と呼ぶ、実施形態（１）の１つの例において、試料は、対象の１つまたは複数のさらなる分析対象物質を含み、対象のそれぞれのさらなる分析対象物質について、混ぜ合わせ工程は、１つまたは複数の工程で、さらなる結合ドメイン上に固定化されたさらなる標的物質、連結剤に接続されたさらなる標的物質相補体、および補助連結剤に接続されたさらなる結合試薬、ならびにさらなる標的物質、さらなる標的物質相補体、さらなる結合試薬およびさらなる分析対象物質を含むさらなる結合ドメイン上のさらなる結合複合体を混ぜ合わせることをさらに含み；形成工程は、さらなる標的物質、さらなる標的物質相補体、さらなる結合試薬およびさらなる分析対象物質を含むさらなる結合ドメイン上のさらなる結合複合体を形成することをさらに含み；測定は、さらなる結合ドメイン上のさらなる分析対象物質の量を測定することをさらに含む。

実施形態（１）（ｂ）と呼ぶ、実施形態（１）のさらなる例において、第１の標的物質相補体および第１の結合試薬は、連結剤と補助連結剤との間の結合相互作用により連結された第１の標的物質相補体および第１の結合試薬を含む事前に結合させた第１の標的複合体として準備し；第２の標的物質相補体および第２の結合試薬は、連結剤と補助連結剤との間の結合相互作用により連結された第２の標的物質相補体および第２の結合試薬を含む事前に結合させた第２の標的複合体として準備する。

さらに、実施形態（１）（ｃ）と呼ぶ、実施形態（１）の他の例において、第１の標的複合体は、第１の結合ドメイン上に固定化させた第１の標的物質に事前に結合させて準備し；第２の標的複合体は、第２の結合ドメイン上に固定化させた第２の標的物質に事前に結合させて準備する。この例において、混ぜ合わせ工程は、第１および第２の標的複合体を試料と混ぜ合わせて、その混合物を形成し、第１の分析対象物質を第１の標的複合体における第１の結合試薬と結合させ、第２の分析対象物質を第２の標的複合体における第２の結合試薬と結合させ、第１および第２の分析対象物質に結合した第１および第２の標的複合体の混合物をそれぞれ第１および第２の結合ドメインと接触させ；第１の標的複合体を第１の結合ドメイン上の第１の標的物質に結合させ、第２の標的複合体を第２の結合ドメイン上の第２の標的物質に結合させることをさらに含む。

実施形態（１）（ｄ）と呼ぶ、実施形態（１）の特定の例において、混ぜ合わせ工程は、第１の容積の液体中で、前記第１の標的物質相補体、前記第１の結合試薬および、用いる場合、前記架橋試薬を混ぜ合わせ、前記第１の標的物質相補体と前記第１の結合試薬をそれらの結合した連結剤を介して連結し、第１の標的複合体を形成すること；第２の容積の液体中で、前記第２の標的物質相補体、前記第２の結合試薬および、用いる場合、前記架橋試薬を混ぜ合わせ、前記第２の標的物質相補体と前記第２の結合試薬をそれらの結合した連結剤を介して連結し、第２の標的複合体を形成することをさらに含む。

実施形態（１）（ｅ）と呼ぶ、実施形態（１）の特定の例において、混ぜ合わせ工程は、前記第１および第２の標的複合体を混ぜ合わせ、前記第１および第２の標的複合体の配合物を前記第１および第２の結合ドメインと接触させ、前記第１の標的複合体を前記第１の結合ドメイン上の前記第１の標的物質に結合させ、前記第２の標的複合体を前記第２の結合ドメイン上の前記第２の標的物質に結合させることをさらに含む。この例において、混ぜ合わせ工程は、第１および第２の標的複合体を試料と混ぜ合わせて、その混合物を形成し、第１の分析対象物質を第１の標的複合体における第１の結合試薬と結合させ、第２の分析対象物質を第２の標的複合体における第２の結合試薬と結合させ、第１および第２の分析対象物質に結合した第１および第２の標的複合体の混合物をそれぞれ第１および第２の結合ドメインと接触させ；第１の標的複合体を第１の結合ドメイン上の第１の標的物質に結合させ、第２の標的複合体を第２の結合ドメイン上の第２の標的物質に結合させることをさらに含む。

実施形態（１）（ｃ）および（１）（ｅ）において、第１および第２の標的複合体を第１および第２の結合ドメインと接触させる前に第１および第２の標的複合体を試料と混ぜ合わせることができる。さらに、これらの特定の実施形態において、第１および第２の標的複合体を第１および第２の結合ドメインと接触させた後に第１および第２の標的複合体を試料と混ぜ合わせることができ；または第１および第２の標的複合体を試料と混ぜ合わせ、同時に第１および第２の結合ドメインと接触させることができる。

実施形態（１）（ｄ）において、混ぜ合わせ工程は、前記第１および第２の結合ドメイン上の前記第１および第２の標的複合体を前記試料と接触させ、前記第１の分析対象物質を前記第１の標的複合体における第１の結合試薬に結合させ、前記第２の分析対象物質を前記第２の標的複合体における前記第２の結合試薬に結合させる工程をさらに含み得る。

実施形態（１）および（１）（ａ）〜（ｅ）において、架橋剤を除外することができ、（ａ）チオール基とマレイミドもしくはヨードアセトアミド基との間；（ｂ）アルデヒドとヒドラジドとの間；または（ｃ）アルキンとアジドとの間の結合相互作用により連結剤を補助連結剤に結合させることができる。

実施形態（１）および（１）（ａ）〜（ｅ）において、架橋剤を除外することができ、（ａ）連結剤は、ビオチンであり、補助連結剤は、ストレプトアビジンもしくはアビジンである；（ｂ）連結剤は、ストレプトアビジンもしくはアビジンであり、補助連結剤は、ビオチンである；（ｃ）連結剤は、ペプチドであり、補助連結剤は、抗ペプチド抗体である；または（ｄ）連結剤は、抗ペプチド抗体であり、補助連結剤は、ペプチドである。

あるいはまたはさらに、実施形態（１）および（１）（ａ）〜（ｅ）において、架橋剤を含めることができ、架橋剤は、ストレプトアビジンもしくはアビジンであり得、連結剤および補助連結剤は、それぞれビオチンを含み得る。

実施形態（１）および（１）（ａ）〜（ｅ）において述べた第１および第２の結合試薬はそれぞれ、前記第１および第２の分析対象物質にそれぞれ結合することができる受容体、リガンド、抗体、ハプテン、抗原、エピトープ、ミミトープ、アプタマーまたはインターカレーターを含み得る。例えば、第１および第２の結合試薬は、抗原である。あるいはまたはさらに、第１および第２の結合試薬は、抗体である。

実施形態（１）および（１）（ａ）〜（ｅ）において、方法はサンドイッチ結合アッセイを行うことを含む。

実施形態（１）および（１）（ａ）〜（ｅ）の１つの特定の例において、混ぜ合わせ工程において混ぜ合わされた成分は、第１の分析対象物質に結合する第１の検出試薬および第２の分析対象物質に結合する第２の検出試薬をさらに含み、第２の工程において形成された第１および第２の複合体は、それぞれ第１および第２の検出試薬をさらに含む。例えば、第１および第２の検出試薬は、それぞれ検出可能な標識を含む。この実施形態の他の例において、第１および第２の結合試薬ならびに第１および第２の検出試薬は、抗体である。さらに、第１および第２の検出試薬は、第１または第２の分析対象物質に結合することができ、場合により、第１および第２の検出試薬は、それぞれ検出可能な標識を含む。特定の例において、第１および第２の結合試薬は、抗原であり、分析対象物質は、抗原に対する抗体であり、検出試薬は、抗免疫グロブリン抗体、プロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＬを含む。

実施形態（１）および（１）（ａ）〜（ｅ）の方法は、競合的結合アッセイを行うことを含み得る。

さらに、実施形態（１）および（１）（ａ）〜（ｅ）において混ぜ合わされた成分は、第１の結合試薬への結合について第１の分析対象物質と競合する第１の検出試薬および第２の結合試薬への結合について第２の分析対象物質と競合する第２の検出試薬をさらに含み得る。

実施形態（１）および（１）（ａ）〜（ｅ）において、方法の１つまたは複数の次のさらなる要素が含まれる：第１および第２の検出試薬は、検出可能な標識を含み得る；第１および第２の結合試薬は抗体であり、第１および第２の検出試薬は、分析対象物質の構造類似体である；測定工程は、吸光度、蛍光、リン光、化学発光、電気化学発光、光散乱または磁気により第１および第２の検出可能な標識の存在を測定することを含み得る；第１および第２の検出可能な標識は、電気化学発光標識であり、測定工程は、電気化学発光シグナルを測定し、シグナルを試料中の第１および第２の分析対象物質の量と相関させることをさらに含む；第１および第２の結合ドメインは、電極上に配置され、測定工程は、電極に電圧波形を印加して、電気化学発光を発生させることをさらに含む；第１および第２の結合ドメインのそれぞれは、結合ドメインのアレイの要素であり、場合により、アレイは、多ウエルプレートのウエル内に配置されている；第１および第２の結合ドメインのそれぞれは、１つまたは複数のミクロ粒子の表面上にそれぞれ配置され、場合により、粒子は、個別の粒子の特定ならびに第１および第２の結合ドメイン間の識別を可能にするようにコード化されている。

実施形態（１）（ｆ）：実施形態（１）の要素および実施形態（１）（ａ）〜（ｅ）の１つまたは複数のさらなる特徴を含み、ここで、第１の標的物質および第１の標的物質相補体ならびに第２の標的物質および第２の標的物質相補体がそれぞれ相補的オリゴヌクレオチド対を含む。この特定の例において、第１および第２の結合試薬は、それぞれ抗体であり得る。さらに、この特定の例において、第１および第２の結合ドメインのそれぞれに配置されている相補的オリゴヌクレオチド対は、異なっており、以下から選択される：

実施形態（１）（ｇ）：実施形態（１）の要素および実施形態（１）（ａ）〜（ｅ）の１つまたは複数のさらなる特徴を含み、ここで、第１の標的物質および第１の標的物質相補体ならびに第２の標的物質および第２の標的物質相補体がそれぞれ相補的オリゴヌクレオチド対を含む。この特定の例において、第１および第２の結合試薬は、それぞれ抗体であり得る。さらに、この特定の例において、第１および第２の結合ドメインのそれぞれに配置されている相補的オリゴヌクレオチド対は、異なっており、以下から選択される：

実施形態（１）（ｆ）および／または（１）（ｇ）において、少なくとも７個の結合ドメイン、または少なくとも１０個の結合ドメイン；または少なくとも１６個の結合ドメイン；または少なくとも２５個の結合ドメインが存在する。

実施形態（１）（ａ）において、第１および第２の相補的標的物質のそれぞれは、それぞれ第１および第２の結合ドメインの１つに選択的に結合することができる。例えば、相補的標的物質の他の結合ドメインへの結合の交差反応性は、結合ドメインの１つへの結合の５％未満である；または第１および第２の相補的標的物質のそれぞれの第３の結合ドメインへの結合の交差反応性は、結合ドメインの１つへの結合の１％未満である；または第１および第２の相補的標的物質のそれぞれの第３の結合ドメインへの結合の交差反応性は、結合ドメインの１つへの結合の０．５％未満である；または第１および第２の相補的標的物質のそれぞれの第３の結合ドメインへの結合の交差反応性は、結合ドメインの１つへの結合の０．１％未満である。

実施形態（１）および（１）（ａ）において、第１および第２の結合試薬は、対象の異なる分析対象物質にそれぞれ結合することができる；または第１および第２の結合試薬は、対象の異なる分析対象物質に対してそれぞれ優先的に選択的である。

前述の実施形態のいずれか１つの第１および第２の結合試薬は、対象の異なる分析対象物質に対する親和性および／または選択性が異なり得るものであり、例えば、第２の結合試薬に対する第１の分析対象物質の交差反応性は、第１の結合試薬への結合の５％未満である、または第２の結合試薬に対する第１の分析対象物質の交差反応性は、第１の結合試薬への結合の１％未満である、または第２の結合試薬に対する第１の分析対象物質の交差反応性は、第１の結合試薬への結合の０．５％未満である、または第２の結合試薬に対する第１の分析対象物質の交差反応性は、第１の結合試薬への結合の０．１％未満である、または非特異的結合試薬に対する対象の分析対象物質の観測される交差反応性は、当分析対象物質への結合について選択される結合試薬への結合の５％未満である、または非特異的結合試薬に対する対象の分析対象物質の観測される交差反応性は、当分析対象物質への結合について選択される結合試薬への結合の１％未満である、または非特異的結合試薬に対する対象の分析対象物質の観測される交差反応性は、当分析対象物質への結合について選択される結合試薬への結合の０．５％未満である、または非特異的結合試薬に対する対象の分析対象物質の観測される交差反応性は、当分析対象物質への結合について選択される結合試薬への結合の０．１％未満である。さらに前述の実施形態のこの特定の例において、第２の結合ドメインに配置されている結合試薬に対する第１の分析対象物質の交差反応性は、第１の結合ドメインに配置されている結合試薬への結合の５％未満である、または第２の結合ドメインに配置されている結合試薬に対する第１の分析対象物質の交差反応性は、第１の結合ドメインに配置されている結合試薬への結合の１％未満である、または第２の結合ドメインに配置されている結合試薬に対する第１の分析対象物質の交差反応性は、第１の結合ドメインに配置されている結合試薬への結合の０．５％未満である、または第２の結合ドメインに配置されている結合試薬に対する第１の分析対象物質の交差反応性は、第１の結合ドメインに配置されている結合試薬への結合の０．１％未満である、または非特異的結合ドメインに配置されている結合試薬に対する対象の分析対象物質の観測される交差反応性は、当分析対象物質に割り当てられた結合ドメインにおける結合試薬への結合の５％未満である、または非特異的結合ドメインに配置されている結合試薬に対する対象の分析対象物質の観測される交差反応性は、当分析対象物質に割り当てられた結合ドメインにおける結合試薬への結合の１％未満である、または非特異的結合ドメインに配置されている結合試薬に対する対象の分析対象物質の観測される交差反応性は、当分析対象物質に割り当てられた結合ドメインにおける結合試薬への結合の０．５％未満である、または非特異的結合ドメインに配置されている結合試薬に対する対象の分析対象物質の観測される交差反応性は、当分析対象物質に割り当てられた結合ドメインにおける結合試薬への結合の０．１％未満である。

実施形態（１）および（１）（ａ）において、第１および第２の標的物質ならびに第１および第２の標的物質相補体は、それぞれ一組の結合試薬を一組の結合ドメインに位置づけるために用いることができ、該組における結合試薬のそれぞれは、対象の異なる分析対象物質に結合する。例えば、該組における結合試薬のそれぞれは、対象の異なる分析対象物質に対して優先的に選択的であるか、あるいは該組における結合試薬のそれぞれは、対象の異なる分析対象物質に対する親和性および／または選択性が異なる。

実施形態（２）：以下から選択されるオリゴヌクレオチド：

実施形態（３）：以下から選択されるオリゴヌクレオチド：

実施形態（４）：それぞれが以下から選択される異なる配列を含む、別個のバイアル入りの、少なくとも４種のオリゴヌクレオチドを含むキット：

実施形態（５）：それぞれが以下から選択される異なる配列を含む、別個のバイアル入りの、少なくとも４種のオリゴヌクレオチドを含むキット：

実施形態（４）および（５）のキットにおいて、キットは、少なくとも７種のオリゴヌクレオチド、または少なくとも１０種のオリゴヌクレオチド、または少なくとも１６種のオリゴヌクレオチド、または少なくとも２５種のオリゴヌクレオチドを含み得る。さらに、これらの特定の実施形態のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、ヒドラジド基、アジド基、アルキン基、マレイミド基またはヨードアセトアミド基を含む連結剤で修飾することができる。実施形態（４）および（５）の他の特定の例において、少なくとも４種のオリゴヌクレオチドのそれぞれを異なる抗体に結合させることができ、場合により、それぞれの異なる配列は、少なくとも４種のオリゴヌクレオチドのさらなる異なる配列の相補体でない。

実施形態（６）：それぞれが以下から選択される異なる配列を含む、少なくとも４種のオリゴヌクレオチドを含む混合物：

ここで、異なる配列のそれぞれが異なる抗体に結合される。

実施形態（７）：それぞれが以下から選択される異なる配列を含む、少なくとも４種のオリゴヌクレオチドを含む混合物：

ここで、異なる配列のそれぞれが異なる抗体に結合される。

実施形態（６）および（７）において、混合物は、少なくとも７種のオリゴヌクレオチド、または少なくとも１０種のオリゴヌクレオチド、または少なくとも１６種のオリゴヌクレオチド、または少なくとも２５種のオリゴヌクレオチドを含み得る。さらに、実施形態（６）および（７）の特定の例において、それぞれの異なる配列は、少なくとも４種のオリゴヌクレオチドのさらなる異なる配列の相補体でない。

実施形態（８）：複数の少なくとも４個の結合ドメインを含むアレイであって、１つまたは複数の、また場合により、それぞれの結合ドメインがその上に固定化された以下から選択される異なるオリゴヌクレオチド配列を有する：

実施形態（９）：複数の少なくとも４個の結合ドメインを含むアレイであって、１つまたは複数の、また場合により、それぞれの結合ドメインがその上に固定化された以下から選択される異なるオリゴヌクレオチド配列を有する：

実施形態（８）および（９）において、アレイは、少なくとも７個の結合ドメイン、または少なくとも１０個の結合ドメイン、または少なくとも１６個の結合ドメイン、または少なくとも２５個の結合ドメインを含み得、場合により、それぞれの異なる配列は、少なくとも４種のオリゴヌクレオチドのさらなる異なる配列の相補体でない。

実施形態（１０）：プレートの少なくとも１つのウエル内にオリゴヌクレオチドアレイの１つまたは複数のコピーを有し、アレイが複数の結合ドメイン上に配置されている多ウエルプレートであって、１つまたは複数の、また場合により、少なくとも４個の結合ドメインがその上に固定化された以下から選択される異なるオリゴヌクレオチド配列を有する：

実施形態（１１）：プレートの少なくとも１つのウエル内にオリゴヌクレオチドアレイの１つまたは複数のコピーを有し、アレイが複数の結合ドメイン上に配置されている多ウエルプレートであって、１つまたは複数の、また場合により、少なくとも４個の結合ドメインがその上に固定化された以下から選択される異なるオリゴヌクレオチド配列を有する：

実施形態（１０）および（１１）のプレートは、少なくとも２４ウエル、または少なくとも９６ウエル、または少なくとも３８４ウエルを含み得、かつ／または場合により、アレイは、少なくとも７種のオリゴヌクレオチド、または少なくとも１０種のオリゴヌクレオチド、または少なくとも１６種のオリゴヌクレオチド、または少なくとも２５種のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、場合により、それぞれの異なる配列は、少なくとも４種のオリゴヌクレオチドのさらなる異なる配列の相補体でない。

実施形態（１２）：１つまたは複数のバイアル入りの一組の少なくとも４つのミクロ粒子試薬を含むキットであって、当該組のそれぞれのミクロ粒子試薬がその上に固定化された以下から選択される異なるオリゴヌクレオチド配列を有するミクロ粒子を含む：

実施形態（１３）：１つまたは複数のバイアル入りの一組の少なくとも４つのミクロ粒子試薬を含むキットであって、当該組のそれぞれのミクロ粒子試薬がその上に固定化された以下から選択される異なるオリゴヌクレオチド配列を有するミクロ粒子を含む：

実施形態（１２）および（１３）のキットは、一組の少なくとも７個のミクロ粒子、または一組の少なくとも少なくとも１０個のミクロ粒子、または一組の少なくとも少なくとも１６個のミクロ粒子、または一組の少なくとも少なくとも２５個のミクロ粒子を含み得、かつ／または場合により、それぞれの異なる配列は、少なくとも４種のオリゴヌクレオチドのさらなる異なる配列の相補体でない。

実施形態（１２）および（１３）のミクロ粒子は、コード化することができ、異なるミクロ粒子試薬は、異なる識別コードを有し得る。

実施形態（１４）：プレートの少なくとも１つのウエル内にオリゴヌクレオチドアレイの１つまたは複数のコピーを有し、アレイが複数の結合ドメイン上に配置されている多ウエルプレートを含むキットであって、１つまたは複数の、また場合により、少なくとも４個の結合ドメインがその上に固定化された以下から選択される異なるオリゴヌクレオチド配列：

および
（ｉ）以下から選択される２つ以上のオリゴヌクレオチドからなる一組のオリゴヌクレオチドを有し：

ここで、成分（ｉｉ）におけるオリゴヌクレオチドが成分（ｉ）におけるオリゴヌクレオチドと相補的である。

実施形態（１５）：プレートの少なくとも１つのウエル内にオリゴヌクレオチドアレイの１つまたは複数のコピーを有し、アレイが複数の結合ドメイン上に配置されている多ウエルプレートを含むキットであって、１つまたは複数の、また場合により、少なくとも４個の結合ドメインがその上に固定化された以下から選択される異なるオリゴヌクレオチド配列：

および
（ｉ）以下から選択される２つ以上のオリゴヌクレオチドからなる一組のオリゴヌクレオチドを有し：

ここで、成分（ｉｉ）におけるオリゴヌクレオチドが成分（ｉ）におけるオリゴヌクレオチドと相補的である。

実施形態（１６）：以下の工程を含む複数の分析対象物質の結合アッセイを行う方法：（ａ）試料を、それぞれが複数の分析対象物質のうちのそれぞれ第１および第２の分析対象物質に結合する少なくとも第１および第２の結合試薬に連結された２つ以上の結合ドメインと接触させて、第１の結合試薬に結合した第１の分析対象物質および第２の結合試薬に結合した第２の分析対象物質を含む複合体を形成する工程であって、（ｘ）第１の結合ドメインが、（ｉ）第１の結合ドメインおよび第１の標的物質相補体に結合した第１の標的物質ならびに（ｉｉ）連結複合体を介して第１の標的物質相補体に結合した第１の結合試薬を含む第１の結合試薬複合体を含み、（ｙ）第２の結合ドメインが、（ｉ）第２の結合ドメインおよび第２の標的物質相補体に結合した第２の標的物質ならびに（ｉｉ）連結複合体を介して第２の標的物質相補体に結合した第２の結合試薬を含む第２の結合試薬複合体を含む、工程と、
（ｂ）第１および第２の結合試薬複合体を、第１の分析対象物質または第１の分析対象物質を含む複合体に結合する第１の検出試薬および第２の分析対象物質または第２の分析対象物質を含む複合体に結合する第２の検出試薬を含む複数の検出試薬と接触させる工程と、（ｃ）２つ以上の結合ドメインに結合した第１および第２の分析対象物質の量を測定する工程。

実施形態（１６）において、１つまたは複数の以下の特徴を採用することができる：第１および第２の結合試薬はそれぞれ、第１および第２の分析対象物質にそれぞれ結合することができる受容体、リガンド、抗体、ハプテン、抗原、エピトープ、ミミトープ、アプタマーまたはインターカレーターを含む、例えば、第１および第２の結合試薬はそれぞれ、第１および第２の分析対象物質にそれぞれ結合することができる抗体を含む；第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドおよび相補的オリゴヌクレオチド、受容体−リガンド対、抗原−抗体対、ハプテン−抗体対、エピトープ−抗体対、ミミトープ−抗体対、アプタマー−標的分子対、ハイブリダイゼーションパートナーまたはインターカレーター−標的分子対を含む；第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドおよび相補的オリゴヌクレオチド、受容体−リガンド対、抗原−抗体対、ハプテン−抗体対、エピトープ−抗体対、ミミトープ−抗体対、アプタマー−標的分子対、ハイブリダイゼーションパートナーまたはインターカレーター−標的分子対を含む；第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、それぞれオリゴヌクレオチドおよび相補的オリゴヌクレオチドを含む；第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、それぞれオリゴヌクレオチドおよび相補的オリゴヌクレオチドを含む；連結複合体は、連結剤およびそれに接続された補助連結剤を含み、例えば、連結複合体は、（ａ）チオール基とマレイミドもしくはヨードアセトアミドとの間；（ｂ）アルデヒドとヒドラジドとの間；または（ｃ）アルキンとアジドとの間の結合相互作用により形成される；あるいは（ａ）連結剤は、ビオチンであり、補助連結剤は、ストレプトアビジンもしくはアビジンである；（ｂ）連結剤は、ストレプトアビジンもしくはアビジンであり、補助連結剤は、ビオチンである；（ｃ）連結剤は、ペプチドであり、補助連結剤は、抗ペプチド抗体である；または（ｄ）連結剤は、抗ペプチド抗体であり、補助連結剤は、ペプチドである。

さらに、実施形態（１６）は、１つまたは複数の以下の特徴を場合により含み得る：複数の検出試薬のそれぞれは、検出可能な標識を含む；複数の検出試薬のサブセットは、検出可能な標識を含む；測定工程は、吸光度、蛍光、リン光、化学発光、電気化学発光、光散乱または磁気により試料中の検出可能な標識の存在を測定することを含む；検出可能な標識は、電気化学発光標識であり、測定工程は、電気化学発光シグナルを測定し、シグナルを試料中の分析対象物質の量と相関させることを含み、例えば、２つ以上の結合ドメインが電極上に配置され、測定工程は、電極に電圧波形を印加して、電気化学発光を発生させることをさらに含み、場合により、２つ以上の結合ドメインが多ウエルプレートの１つまたは複数のウエル内に配置されている。

実施形態（１６）は、サンドイッチ免疫測定法または競合的免疫測定法を実施することを含み得る。

実施形態（１６）において、第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドの対を含み得、該対は、以下から選択される：

さらに、実施形態（１６）において、第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドの対を含み得、該対は、以下から選択される：

実施形態（１６）の１つの例において、第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドの対を含み得、該対は、以下から選択される：

実施形態（１６）の１つの例において、第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドの対を含み得、該対は、以下から選択される：

実施形態（１６）は、１つまたは複数の以下の要素を含み得る：第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、それぞれ第１のオリゴヌクレオチドおよび第１の相補的オリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第１の相補的オリゴヌクレオチドはそれぞれ、約１０〜５０塩基を含む；第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、それぞれ第１のオリゴヌクレオチドおよび第１の相補的オリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第１の相補的オリゴヌクレオチドはそれぞれ、約１０〜２５塩基を含む；第１の結合試薬は、ビオチン分子を含む抗体であり、第１の標的物質は、ストレプトアビジン分子を含む第１のオリゴヌクレオチドであり、連結複合体は、ビオチン分子とストレプトアビジン分子との間の反応により形成され；かつ／または第２の結合試薬は、さらなるビオチン分子を含む抗体であり、第２の標的物質は、さらなるストレプトアビジン分子を含む第２のオリゴヌクレオチドであり、連結複合体は、さらなるビオチン分子とさらなるストレプトアビジン分子との間の反応により形成される。

実施形態（１７）：以下の工程を含む複数の分析対象物質の結合アッセイを行う方法：（ａ）複数の分析対象物質における第１の分析対象物質に対して特異的な第１の結合試薬および第１の標的物質を含む第１の結合試薬複合体を形成する工程であって、第１の結合試薬が連結剤に結合し、第１の標的物質が補助連結剤に結合しており、第１の結合試薬複合体が連結剤と補助連結剤との間の反応により形成される、工程と、（ｂ）複数の分析対象物質における第２の分析対象物質に対して特異的な第２の結合試薬および第２の標的物質を含む第２の結合試薬複合体を形成する工程であって、第２の結合試薬が第２の連結剤に結合し、第２の標的物質が第２の連結剤相補体に結合しており、第２の結合試薬複合体が第２の連結剤と第２の連結剤相補体との間の反応により形成される、工程と、（ｃ）第１の標的物質を第１の標的物質相補体に、第２の標的物質を第２の標的物質相補体に結合させるのに十分な条件下で、第１および第２の結合試薬複合体を、それぞれがそれぞれ第１の標的物質相補体および第２の標的物質相補体に連結された２つ以上の結合ドメインと混合する工程と、（ｄ）複数の分析対象物質を含む試料を工程（ｃ）で形成された混合物と混合する工程と、（ｅ）複数のさらなる結合試薬を工程（ｄ）で形成された混合物に加える工程であって、複数のさらなる結合試薬が（ｉ）第１の分析対象物質および／または第１の結合試薬−第１の分析対象物質複合体に対して特異的な第１の検出試薬ならびに（ｉｉ）第２の分析対象物質および／または第２の結合試薬−第２の分析対象物質複合体に対して特異的な第２の検出試薬を含む、工程と、（ｆ）結合ドメインに結合した第１および第２の分析対象物質の量を測定する工程。

実施形態（１７）は、１つまたは複数の以下の特徴を含むことができる：第１および第２の結合試薬はそれぞれ、第１および第２の分析対象物質にそれぞれ結合することができる受容体、リガンド、抗体、ハプテン、抗原、エピトープ、ミミトープ、アプタマーまたはインターカレーターを含む、例えば、第１および第２の結合試薬はそれぞれ、第１および第２の分析対象物質にそれぞれ結合することができる抗体を含む；第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドおよび相補的オリゴヌクレオチド、受容体−リガンド対、抗原−抗体対、ハプテン−抗体対、抗原−抗体対、エピトープ−抗体対、ミミトープ−抗体対、アプタマー−標的分子対、ハイブリダイゼーションパートナーまたはインターカレーター−標的分子対を含む；第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドおよび相補的オリゴヌクレオチド、受容体−リガンド対、抗原−抗体対、ハプテン−抗体対、抗原−抗体対、エピトープ−抗体対、ミミトープ−抗体対、アプタマー−標的分子対、ハイブリダイゼーションパートナーまたはインターカレーター−標的分子対を含む；第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドおよび相補的オリゴヌクレオチドを含む；第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドおよび相補的オリゴヌクレオチドを含む；連結複合体は、連結剤およびそれに接続された補助連結剤を含み、例えば、連結複合体は、（ａ）チオール基とマレイミドもしくはヨードアセトアミド基との間；（ｂ）アルデヒドとヒドラジドとの間；または（ｃ）アルキンとアジドとの間の結合相互作用により形成される；（ａ）連結剤は、ビオチンであり、補助連結剤は、ストレプトアビジンもしくはアビジンである；（ｂ）連結剤は、ストレプトアビジンもしくはアビジンであり、補助連結剤は、ビオチンである；（ｃ）連結剤は、ペプチドであり、補助連結剤は、抗ペプチド抗体である；または（ｄ）連結剤は、抗ペプチド抗体であり、補助連結剤は、ペプチドである。

さらに、実施形態（１７）は、１つまたは複数の以下の特徴をさらに含み得る：複数の検出試薬のそれぞれは、検出可能な標識を含み、例えば、複数の検出試薬のサブセットは、検出可能な標識を含む；測定工程は、吸光度、蛍光、リン光、化学発光、電気化学発光、光散乱または磁気により試料中の検出可能な標識の存在を測定することを含む；検出可能な標識は、電気化学発光標識であり、測定工程は、電気化学発光シグナルを測定し、シグナルを試料中の分析対象物質の量と相関させることを含む；２つ以上の結合ドメインが電極上に配置され、測定工程は、電極に電圧波形を印加して、電気化学発光を発生させることをさらに含み、例えば、２つ以上の結合ドメインが多ウエルプレートの１つまたは複数のウエル内に配置されている。

実施形態（１７）は、サンドイッチ免疫測定法または競合的免疫測定法を実施することを含み得る。

実施形態（１７）において、第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドの対を含み、該対は、以下から選択される：

実施形態（１７）の特定の例において、第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドの対を含み、該対は、以下から選択される：

実施形態（１７）のさらなる例において、第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドの対を含み、該対は、以下から選択される：

実施形態（１７）のさらなる例において、第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドの対を含み、該対は、以下から選択される：

実施形態（１７）は、１つまたは複数の以下の要素を含み得る：第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、それぞれ第１のオリゴヌクレオチドおよび第１の相補的オリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第１の相補的オリゴヌクレオチドはそれぞれ、約１０〜５０塩基を含む；第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、それぞれ第１のオリゴヌクレオチドおよび第１の相補的オリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第１の相補的オリゴヌクレオチドはそれぞれ、約１０〜２５塩基を含む；第１の結合試薬は、ビオチン分子を含む抗体であり、第１の標的物質は、ストレプトアビジン分子を含む第１のオリゴヌクレオチドを含み、連結複合体は、ビオチン分子とストレプトアビジン分子との間の反応により形成される；第２の結合試薬は、さらなるビオチン分子を含む抗体であり、第２の標的物質は、さらなるストレプトアビジン分子を含む第２のオリゴヌクレオチドを含み、連結複合体は、さらなるビオチン分子とさらなるストレプトアビジン分子との間の反応により形成される；第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、それぞれ第２のオリゴヌクレオチドおよび第２の相補的オリゴヌクレオチドを含み、第２のオリゴヌクレオチドおよび第２の相補的オリゴヌクレオチドはそれぞれ、約１０〜５０塩基を含む；第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、それぞれ第２のオリゴヌクレオチドおよび第２の相補的オリゴヌクレオチドを含み、第２のオリゴヌクレオチドおよび第２の相補的オリゴヌクレオチドはそれぞれ、約１０〜２５塩基を含む；第２の結合試薬は、ビオチン分子を含む抗体であり、第２の標的物質は、ストレプトアビジン分子を含む第２のオリゴヌクレオチドを含み、連結複合体は、ビオチン分子とストレプトアビジン分子との間の反応により形成される；かつ／または方法は、混合工程（ｄ）の前に工程（ｃ）で形成された混合物を洗浄する工程をさらに含む。

実施形態（１８）：以下の工程を含む試料中で複数の分析対象物質の結合アッセイを行う方法：（ａ）複数の分析対象物質における第１の分析対象物質に対して特異的な第１の結合試薬および第１の標的物質を含む第１の結合試薬複合体を形成する工程であって、第１の結合試薬が連結剤に結合し、第１の標的物質が補助連結剤に結合しており、第１の結合試薬複合体が連結剤と補助連結剤との間の反応により形成される、工程と、（ｂ）複数の分析対象物質における第２の分析対象物質に対して特異的な第２の結合試薬および第２の標的物質を含む第２の結合試薬複合体を形成する工程であって、第２の結合試薬が第２の連結剤に結合し、第２の標的物質が第２の連結剤相補体に結合しており、第２の結合試薬複合体が第２の連結剤と第２の連結剤相補体との間の反応により形成される、工程と、（ｃ）第１の標的物質を第１の標的物質相補体に、第２の標的物質を第２の標的物質相補体に結合させるのに十分な条件下で、第１および第２の結合試薬複合体と試料を、それぞれがそれぞれ第１の標的物質相補体および第２の標的物質相補体に連結された２つ以上の結合ドメインと混合する工程と、（ｄ）複数のさらなる結合試薬を工程（ｃ）で形成された混合物に加える工程であって、複数のさらなる結合試薬が（ｉ）第１の分析対象物質および／または第１の結合試薬−第１の分析対象物質複合体に対して特異的な第１の検出試薬ならびに（ｉｉ）第２の分析対象物質および／または第２の結合試薬−第２の分析対象物質複合体に対して特異的な第２の検出試薬を含む、工程と、（ｅ）結合ドメインに結合した第１および第２の分析対象物質の量を測定する工程。

さらに、実施形態（１８）は、１つまたは複数の以下の特徴を含むことができる：第１および第２の結合試薬はそれぞれ、第１および第２の分析対象物質にそれぞれ結合することができる受容体、リガンド、抗体、ハプテン、抗原、エピトープ、ミミトープ、アプタマーまたはインターカレーターを含む；第１および第２の結合試薬はそれぞれ、第１および第２の分析対象物質にそれぞれ結合することができる抗体を含む；第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドおよび相補的オリゴヌクレオチド、受容体−リガンド対、抗原−抗体対、ハプテン−抗体対、抗原−抗体対、エピトープ−抗体対、ミミトープ−抗体対、アプタマー−標的分子対、ハイブリダイゼーションパートナーまたはインターカレーター−標的分子対を含む；第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドおよび相補的オリゴヌクレオチド、受容体−リガンド対、抗原−抗体対、ハプテン−抗体対、抗原−抗体対、エピトープ−抗体対、ミミトープ−抗体対、アプタマー−標的分子対、ハイブリダイゼーションパートナーまたはインターカレーター−標的分子対を含む；第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドおよび相補的オリゴヌクレオチドを含む；第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドおよび相補的オリゴヌクレオチドを含む；連結複合体は、連結剤およびそれに接続された補助連結剤を含み、例えば、連結複合体は、（ａ）チオール基とマレイミドもしくはヨードアセトアミドとの間；（ｂ）アルデヒドとヒドラジドとの間；または（ｃ）アルキンとアジドとの間の結合相互作用により形成される；例えば（ａ）連結剤は、ビオチンであり、補助連結剤は、ストレプトアビジンもしくはアビジンである；（ｂ）連結剤は、ストレプトアビジンもしくはアビジンであり、補助連結剤は、ビオチンである；（ｃ）連結剤は、ペプチドであり、補助連結剤は、抗ペプチド抗体である；または（ｄ）連結剤は、抗ペプチド抗体であり、補助連結剤は、ペプチドである。

さらに、実施形態（１８）は、１つまたは複数の以下の要素を含み得る：複数の検出試薬のそれぞれは、検出可能な標識を含む；複数の検出試薬は、検出可能な標識を含む；測定工程は、吸光度、蛍光、リン光、化学発光、電気化学発光、光散乱または磁気により試料中の検出可能な標識の存在を測定することを含む；検出可能な標識は、電気化学発光標識であり、測定工程は、電気化学発光シグナルを測定し、シグナルを試料中の分析対象物質の量と相関させることを含む；２つ以上の結合ドメインが電極上に配置され、測定工程は、電極に電圧波形を印加して、電気化学発光を発生させることをさらに含む；および／または２つ以上の結合ドメインが多ウエルプレートの１つまたは複数のウエル内に配置されている。

実施形態（１８）は、サンドイッチ免疫測定法または競合的免疫測定法を実施することを含み得る。

実施形態（１８）の特定の例において、第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドの対を含み、該対は、以下から選択される：

実施形態（１８）の他の例において、第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドの対を含み、該対は、以下から選択される：

実施形態（１８）の他の例において、第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドの対を含み、該対は、以下から選択される：

実施形態（１８）のさらなる例において、第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドの対を含み、該対は、以下から選択される：

実施形態（１８）は、１つまたは複数の以下の特徴を含み得る：第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、それぞれ第１のオリゴヌクレオチドおよび第１の相補的オリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第１の相補的オリゴヌクレオチドはそれぞれ、約１０〜５０塩基を含む；第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、それぞれ第１のオリゴヌクレオチドおよび第１の相補的オリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第１の相補的オリゴヌクレオチドはそれぞれ、約１０〜２５塩基を含む；第１の結合試薬は、ビオチン分子を含む抗体であり、第１の標的物質は、ストレプトアビジン分子を含む第１のオリゴヌクレオチドを含み、連結複合体は、ビオチン分子とストレプトアビジン分子との間の反応により形成される；第２の結合試薬は、さらなるビオチン分子を含む抗体であり、第２の標的物質は、さらなるストレプトアビジン分子を含む第２のオリゴヌクレオチドを含み、連結複合体は、さらなるビオチン分子とさらなるストレプトアビジン分子との間の反応により形成される；第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、それぞれ第２のオリゴヌクレオチドおよび第２の相補的オリゴヌクレオチドを含み、第２のオリゴヌクレオチドおよび第２の相補的オリゴヌクレオチドはそれぞれ、約１０〜５０塩基を含む；第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、それぞれ第２のオリゴヌクレオチドおよび第２の相補的オリゴヌクレオチドを含み、第２のオリゴヌクレオチドおよび第２の相補的オリゴヌクレオチドはそれぞれ、約１０〜２５塩基を含む；第２の結合試薬は、ビオチン分子を含む抗体であり、第２の標的物質は、ストレプトアビジン分子を含む第２のオリゴヌクレオチドを含み、連結複合体は、ビオチン分子とストレプトアビジン分子との間の反応により形成される；かつ／または方法は、混合工程（ｄ）の前に工程（ｃ）で形成された混合物を洗浄する工程をさらに含む。

実施形態（１９）：以下を含むキット：（ａ）それぞれがそれぞれ第１および第２のオリゴヌクレオチドを含む複数の別個の結合ドメインを含む多ウエルプレート；（ｂ）別個のバイアル、容器またはコンパートメント入りの、連結剤に結合した第１のオリゴヌクレオチド相補体および第２の連結剤に結合した第２のオリゴヌクレオチド相補体を含む一組の標的試薬、ここで、（ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第１のオリゴヌクレオチド相補体は、オリゴヌクレオチドの第１の対を含み、（ｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド相補体は、オリゴヌクレオチドの第２の対を含み、オリゴヌクレオチドの第１および第２の対は、それぞれ以下から選択される：

実施形態（２０）：以下を含むキット：（ａ）それぞれがそれぞれ第１および第２のオリゴヌクレオチドを含む複数の別個の結合ドメインを含む多ウエルプレート；（ｂ）別個のバイアル、容器またはコンパートメント入りの、連結剤に結合した第１のオリゴヌクレオチド相補体および第２の連結剤に結合した第２のオリゴヌクレオチド相補体を含む一組の標的試薬、ここで、（ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第１のオリゴヌクレオチド相補体は、オリゴヌクレオチドの第１の対を含み、（ｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド相補体は、オリゴヌクレオチドの第２の対を含み、オリゴヌクレオチドの第１および第２の対は、それぞれ以下から選択される：

実施形態（１９）および（２０）は、（ｂ）以下のものを含む１つまたは複数のさらなる容器、器またはコンパートメントをさらに含み得る：（ｉ）第１の結合試薬が試料中の第１の分析対象物質に対して特異的である、連結剤を含む第１の結合試薬、（ｉｉ）別個の容器、器もしくはコンパートメント入りでまたは（ｂ）（ｉ）の成分として提供される、補助連結剤を含む第１の標的物質相補体、（ｉｉｉ）第２の結合試薬が試料中の第２の分析対象物質に対して特異的である、第２の連結剤を含む第２の結合試薬、および（ｉｖ）別個の容器、器もしくはコンパートメント入りでまたは（ｂ）（ｉｉｉ）の成分として提供される、第２の補助連結剤を含む第２の標的物質相補体。

実施形態（２１）：試料中の複数の異なる分析対象物質を測定するためのキットであって、キットは以下のものを含む：（ａ）固体担体の第１の領域に固定化された第１の標的物質および固体担体の第２の領域に固定化された第２の標的物質を固体担体上に含む容器、器またはコンパートメント；ならびに（ｂ）以下のものを含む１つまたは複数のさらなる容器、器またはコンパートメント：（ｉ）第１の結合試薬が試料中の第１の分析対象物質に対して特異的である、連結剤を含む第１の結合試薬、（ｉｉ）別個の容器、器もしくはコンパートメント入りでまたは（ｂ）（ｉ）の成分として提供される、補助連結剤を含む第１の標的物質相補体、（ｉｉｉ）第２の結合試薬が試料中の第２の分析対象物質に対して特異的である、第２の連結剤を含む第２の結合試薬、および（ｉｖ）別個の容器、器もしくはコンパートメント入りでまたは（ｂ）（ｉｉｉ）の成分として提供される、第２の連結剤相補体を含む第２の標的物質相補体。

実施形態（２２）：試料中の複数の異なる分析対象物質を測定するためのキットであって、キットは以下のものを含む：（ａ）固体担体の第１の領域に固定化された第１の標的物質および固体担体の第２の領域に固定化された第２の標的物質を固体担体上に含む容器、器またはコンパートメント；ならびに（ｂ）以下のものを含む４つ以上のさらなる容器、器またはコンパートメント：（ｉ）第１の結合試薬が試料中の第１の分析対象物質に対して特異的である、第１の連結剤を含む第１の結合試薬を含む第１の容器、（ｉｉ）別個の容器、器もしくはコンパートメント入りで提供される、補助連結剤を含む第１の標的物質相補体を含む第２の容器、（ｉｉｉ）第２の結合試薬が試料中の第２の分析対象物質に対して特異的である、第２の連結剤を含む第２の結合試薬を含む第３の容器、および（ｉｖ）別個の容器、器もしくはコンパートメント入りで提供される、第２の連結剤相補体を含む第２の標的物質相補体を含む第４の容器。

実施形態（２３）：試料中の複数の異なる分析対象物質を測定するためのキットであって、キットは以下のものを含む：固体担体の第１の領域に固定化された第１の標的物質および固体担体の第２の領域に固定化された第２の標的物質を固体担体上に含む容器、器またはコンパートメント；ならびに（ｂ）以下のものを含む２つ以上のさらなる容器、器またはコンパートメント：（ｉ）第１の結合試薬が試料中の第１の分析対象物質に対して特異的である、第１の連結剤を含む第１の結合試薬、および第１の連結剤相補体を含む第１の標的物質相補体を含む第１の容器、ならびに（ｉｉ）第２の結合試薬が試料中の第２の分析対象物質に対して特異的である、第２の連結剤を含む第２の結合試薬、および第２の連結剤相補体を含む第２の標的物質相補体を含む第２の容器。

実施形態（２４）：（ａ）それぞれがそれぞれ第１および第２のオリゴヌクレオチドを含む複数の別個の結合ドメインを含む多ウエルプレートを含み、第１および第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれが以下から選択される、キット：

実施形態（２４）のキットは、１つまたは複数の以下の配列を含み得る：

実施形態（２４）は、複数の分析対象物質の結合アッセイを行う方法における多ウエルプレートの使用説明書をさらに含み得、該方法は、以下の工程を含む：（ａ）複数の分析対象物質における第１の分析対象物質に対して特異的な第１の結合試薬および第１のオリゴヌクレオチドを含む第１の結合試薬複合体を形成する工程であって、第１の結合試薬が連結剤に結合し、第１のオリゴヌクレオチドが補助連結剤に結合し、第１の結合試薬複合体が連結剤と補助連結剤との間の反応により形成される、工程と、（ｂ）複数の分析対象物質における第２の分析対象物質に対して特異的な第２の結合試薬および第２のオリゴヌクレオチドを含む第２の結合試薬複合体を形成する工程であって、第２の結合試薬が第２の連結剤に結合し、第２のオリゴヌクレオチドが第２の連結剤相補体に結合し、第２の結合試薬複合体が第２の連結剤と第２の連結剤相補体との間の反応により形成される、工程と、（ｃ）第１および第２の結合試薬複合体を、それぞれがそれぞれ第１のオリゴヌクレオチド相補体および第２のオリゴヌクレオチド相補体に連結された２つ以上の結合ドメインと、第１のオリゴヌクレオチドを第１のオリゴヌクレオチド相補体に、第２のオリゴヌクレオチドを第２のオリゴヌクレオチド相補体に結合させるのに十分な条件下で、混合する工程と、（ｄ）複数の分析対象物質を含む試料を工程（ｃ）で形成された混合物と混合する工程と、（ｅ）複数のさらなる結合試薬を工程（ｄ）で形成された混合物に加える工程であって、複数のさらなる結合試薬が（ｉ）第１の分析対象物質および／または第１の結合試薬−第１の分析対象物質複合体に対して特異的な第１の検出試薬ならびに（ｉｉ）第２の分析対象物質および／または第２の結合試薬−第２の分析対象物質複合体に対して特異的な第２の検出試薬を含む、工程と、（ｆ）結合ドメインに結合した第１および第２の分析対象物質の量を測定する工程。

さらに、実施形態（２４）は、１つまたは複数の以下の要素を含むことができる：第１および第２の結合試薬はそれぞれ、第１および第２の分析対象物質にそれぞれ結合することができる受容体、リガンド、抗体、ハプテン、抗原、エピトープ、ミミトープ、アプタマーまたはインターカレーターを含み、例えば、第１および第２の結合試薬はそれぞれ、第１および第２の分析対象物質にそれぞれ結合することができる抗体を含む；第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドおよび相補的オリゴヌクレオチド、受容体−リガンド対、抗原−抗体対、ハプテン−抗体対、抗原−抗体対、エピトープ−抗体対、ミミトープ−抗体対、アプタマー−標的分子対、ハイブリダイゼーションパートナーまたはインターカレーター−標的分子対を含む；第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドおよび相補的オリゴヌクレオチド、受容体−リガンド対、抗原−抗体対、ハプテン−抗体対、抗原−抗体対、エピトープ−抗体対、ミミトープ−抗体対、アプタマー−標的分子対、ハイブリダイゼーションパートナーまたはインターカレーター−標的分子対を含む；第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドおよび相補的オリゴヌクレオチドを含む；第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドおよび相補的オリゴヌクレオチドを含む；連結複合体は、連結剤およびそれに接続された補助連結剤を含み、例えば、連結複合体は、（ａ）チオール基とマレイミドもしくはヨードアセトアミドとの間；（ｂ）アルデヒドとヒドラジドとの間；または（ｃ）アルキンとアジドとの間の結合相互作用により形成される；あるいは（ａ）連結剤は、ビオチンであり、補助連結剤は、ストレプトアビジンもしくはアビジンである；（ｂ）連結剤は、ストレプトアビジンもしくはアビジンであり、補助連結剤は、ビオチンである；（ｃ）連結剤は、ペプチドであり、補助連結剤は、抗ペプチド抗体である；または（ｄ）連結剤は、抗ペプチド抗体であり、補助連結剤は、ペプチドである。

さらに、実施形態（２４）は、別個のバイアル、容器またはコンパートメント入りの、複数の検出試薬をさらに含み得る。例えば、複数の検出試薬は、検出可能な標識を含み得る。例えば、複数の検出試薬のサブセットが検出可能な標識を含む。１つの例において、検出可能な標識は、電気化学発光標識である。２つ以上の結合ドメインを電極上に配置することができる。場合により、２つ以上の結合ドメインが多ウエルプレートの１つまたは複数のウエル内に配置されている。

実施形態（２４）の特定の例において、第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドの対を含み、該対は、以下から選択される：

実施形態（２４）において、第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドの対を含み、該対は、以下から選択される：

実施形態（２４）の他の特定の例において、第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドの対を含み、該対は、以下から選択される：

実施形態（２４）はまた、１つまたは複数の以下の要素を含み得る：第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、それぞれ第１のオリゴヌクレオチドおよび第１の相補的オリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第１の相補的オリゴヌクレオチドはそれぞれ、約１０〜５０塩基を含む；第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、それぞれ第１のオリゴヌクレオチドおよび第１の相補的オリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第１の相補的オリゴヌクレオチドはそれぞれ、約１０〜２５塩基を含む；第１の結合試薬は、ビオチン分子を含む抗体であり、第１の標的物質は、ストレプトアビジン分子を含む第１のオリゴヌクレオチドを含み、連結複合体は、ビオチン分子とストレプトアビジン分子との間の反応により形成される；第２の結合試薬は、さらなるビオチン分子を含む抗体であり、第２の標的物質は、さらなるストレプトアビジン分子を含む第２のオリゴヌクレオチドを含み、連結複合体は、さらなるビオチン分子とさらなるストレプトアビジン分子との間の反応により形成される；第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、それぞれ第２のオリゴヌクレオチドおよび第２の相補的オリゴヌクレオチドを含み、第２のオリゴヌクレオチドおよび第２の相補的オリゴヌクレオチドはそれぞれ、約１０〜５０塩基を含む；第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、それぞれ第２のオリゴヌクレオチドおよび第２の相補的オリゴヌクレオチドを含み、第２のオリゴヌクレオチドおよび第２の相補的オリゴヌクレオチドはそれぞれ、約１０〜２５塩基を含む；および／または第２の結合試薬は、ビオチン分子を含む抗体であり、第２の標的物質は、ストレプトアビジン分子を含む第２のオリゴヌクレオチドを含み、連結複合体は、ビオチン分子とストレプトアビジン分子との間の反応により形成される。

いずれか１つまたは複数の先行する実施形態において、第２の結合ドメイン上の第１の結合試薬の量は、第１の結合ドメイン上の第１の結合試薬の量の１％未満であり得る。

実施形態（２５）：以下のものを含むキット：プレートの少なくとも１つのウエル内にオリゴヌクレオチドアレイの１つまたは複数のコピーを有し、アレイが複数の結合ドメイン上に配置されている多ウエルプレートであって、少なくとも４つの結合ドメインが、その上に固定化された以下から選択される異なるオリゴヌクレオチド配列を有する：

ここで、異なるオリゴヌクレオチド配列のそれぞれが連結剤により修飾される。

実施形態（２６）：以下のものを含むキット：プレートの少なくとも１つのウエル内にオリゴヌクレオチドアレイの１つまたは複数のコピーを有し、アレイが複数の結合ドメイン上に配置されている多ウエルプレートであって、少なくとも４つの結合ドメインが、その上に固定化された以下から選択される異なるオリゴヌクレオチド配列を有する：

実施形態（２５）および（２６）は、１つまたは複数の以下の要素を含み得る：連結剤は、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、ヒドラジド基、アジド基、アルキン基、マレイミド基またはヨードアセトアミド基を含む；連結剤は、ストレプトアビジンである；キットは、１つまたは複数の別個のバイアル、容器またはコンパートメント入りの、（ａ）一組の結合試薬対を含み、該組の各結合試薬は、複数の分析対象物質を含む試料中の分析対象物質に対して特異的であり、場合により、組内の結合試薬対は、補助連結剤を含む第１の結合試薬を含み、さらに場合により、キットは、１つまたは複数の別個のバイアル、容器またはコンパートメント入りの、補助連結剤をさらに含む。１つの例において、結合試薬は、抗体である。

先行する実施形態、例えば、実施形態（２５）および（２６）のキットは、１つまたは複数の別個のバイアル、容器またはコンパートメント入りの、ラベリングキットならびにアッセイ緩衝液、希釈剤、読み取り緩衝液またはそれらの組合せを含む１つまたは複数のさらなる試薬をさらに含み得る。ラベリングキットは、１つまたは複数の別個のバイアル、容器またはコンパートメント入りの、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）ＮＨＳエステル、ＬＣ−ビオチンＮＨＳエステル、スピンカラム、ラベリング緩衝液、ＥＣＬ読み取り緩衝液、アッセイおよび抗体緩衝液、アッセイおよび抗体希釈剤またはそれらの組合せを含み得る。

実施形態（２５）および（２６）において、アレイは、少なくとも７個の結合ドメイン、または少なくとも１０個の結合ドメイン、または少なくとも１６個の結合ドメイン、または少なくとも２５個の結合ドメインを含む。さらに、プレートは、少なくとも２４個のウエル、または９６個のウエル、または３８４個のウエルを含み得る。アレイは、少なくとも１０種のオリゴヌクレオチド、または少なくとも１６種のオリゴヌクレオチド、または少なくとも２５種のオリゴヌクレオチドも含み得る。

いずれか１つの先行する実施形態の特定の例において、当該組における結合試薬対の数は、アレイにおける結合ドメインの数と同等であるか、または当該組における結合試薬対の数は、アレイにおける結合ドメインの数よりも少ない。

添付図面は、本発明の範囲を限定するのではなく、例示するために収載する。

（ａ）〜（ｄ）それぞれ標的物質Ａ’’、Ｂ’’およびＣ’’と標的物質相補体Ａ’’’、Ｂ’’’およびＣ’’’との間の反応によるそれぞれ複数の結合ドメインＸ、ＹおよびＺへの結合試薬Ａ’、Ｂ’およびＣ’の直接的コンジュゲーションを含むアッセイ方式を示す図である。標的物質が一連の結合ドメインＸ、ＹおよびＺ上で結合試薬Ａ’、Ｂ’およびＣ’に結合して、それぞれ結合試薬複合体Ａ_ＲＣ、Ｂ_ＲＣおよびＣ_ＲＣを形成し（パネル（ｂ））、これがそれぞれ分析対象物質Ａ、ＢおよびＣと反応する。固体担体上の分析対象物質Ａ、ＢおよびＣの存在は、それぞれ分析対象物質Ａ、ＢおよびＣと反応する、標識検出試薬Ａ^＊、Ｂ^＊およびＣ^＊の添加により検出される（パネル（ｃ））。図１（ｄ）は、それぞれ結合ドメインＸ、ＹおよびＺ上に形成された結合試薬複合体、結合試薬複合体Ａ_ＲＣ、Ｂ_ＲＣおよびＣ_ＲＣの拡大図である。 図１−１の続き。 （ａ）〜（ｄ）それぞれオリゴヌクレオチド標的物質Ａ’’、Ｂ’’およびＣ’’とオリゴヌクレオチド標的物質相補体Ａ’’’、Ｂ’’’およびＣ’’’との間の反応によるそれぞれ複数の結合ドメインＸ、ＹおよびＺへの結合試薬、例えば、抗体Ａ’、Ｂ’およびＣ’の直接的コンジュゲーションを含むアッセイ方式を示す図である。オリゴヌクレオチド標的物質が一連の結合ドメインＸ、ＹおよびＺ上で結合試薬Ａ’、Ｂ’およびＣ’に結合して、それぞれ結合試薬複合体Ａ_ＲＣ、Ｂ_ＲＣおよびＣ_ＲＣを形成し（パネル（ｂ））、これがそれぞれ分析対象物質Ａ、ＢおよびＣと反応する。固体担体上の分析対象物質Ａ、ＢおよびＣの存在は、それぞれ分析対象物質Ａ、ＢおよびＣと反応する、標識検出試薬Ａ^＊、Ｂ^＊およびＣ^＊の添加により検出される（パネル（ｃ））。図２（ｄ）は、それぞれ結合ドメインＸ、ＹおよびＺ上に形成された結合試薬複合体、結合試薬複合体Ａ_ＲＣ、Ｂ_ＲＣおよびＣ_ＲＣの拡大図である。 図２−１の続き。 （ａ）〜（ｅ）一連の連結複合体を介するそれぞれ複数の結合ドメインＸ、ＹおよびＺへの複数の結合試薬Ａ’、Ｂ’およびＣ’のコンジュゲーションを含むアッセイ方式を示す図である。パネル（ａ）に示すように、結合試薬Ａ’、Ｂ’およびＣ’は、連結剤Ｌ_Ａ、Ｌ_ＢおよびＬ_Ｃに結合しているが、標的物質Ａ’’、Ｂ’’およびＣ’’は、それぞれ補助連結剤Ｌ_Ａ’、Ｌ_Ｂ’およびＬ_Ｃ’に結合している。結合試薬Ａ’、Ｂ’およびＣ’を標的物質と混合して、それぞれ結合試薬複合体Ａ_ＲＣ、Ｂ_ＲＣおよびＣ_ＲＣを形成する。パネル（ａ）で形成された結合試薬複合体を、標的物質相補体Ａ’’’、Ｂ’’’およびＣ’’’が結合している複数の結合ドメインＸ、ＹおよびＺと混合して（パネル（ｂ））、結合試薬複合体を結合ドメインに接着させる（パネル（ｃ）参照）。分析対象物質Ａ、ＢおよびＣを含む試料を混合物に加え、同時または連続的に、一組の検出試薬Ａ^＊、Ｂ^＊およびＣ^＊も加えて、結合ドメインに結合した分析対象物質を検出する。図３（ｅ）は、それぞれ結合ドメインＸ、ＹおよびＺ上に形成された結合試薬複合体、結合試薬複合体Ａ_ＲＣ、Ｂ_ＲＣおよびＣ_ＲＣの拡大図である。 図３−１の続き。 （ａ）〜（ｅ）一連の連結複合体を介するそれぞれ複数の結合ドメインＸ、ＹおよびＺへの複数の結合試薬Ａ’、Ｂ’およびＣ’のコンジュゲーションを含むアッセイ方式を示す図である。パネル（ａ）に示すように、結合試薬Ａ’、Ｂ’およびＣ’は、連結剤Ｌ_Ａ、Ｌ_ＢおよびＬ_Ｃに結合しているが、オリゴヌクレオチド標的物質Ａ’’、Ｂ’’およびＣ’’は、それぞれ補助連結剤Ｌ_Ａ’、Ｌ_Ｂ’およびＬ_Ｃ’ に結合している。結合試薬Ａ’、Ｂ’およびＣ’をオリゴヌクレオチド標的物質と混合して、それぞれ結合試薬複合体Ａ_ＲＣ、Ｂ_ＲＣおよびＣ_ＲＣを形成する。パネル（ａ）で形成された結合試薬複合体を、オリゴヌクレオチド標的物質相補体Ａ’’’、Ｂ’’’およびＣ’’’が結合している複数の結合ドメインＸ、ＹおよびＺと混合して（パネル（ｂ））、結合試薬複合体を結合ドメインに接着させる（パネル（ｃ）参照）。分析対象物質Ａ、ＢおよびＣを含む試料を混合物に加え、同時または連続的に、一組の検出試薬Ａ^＊、Ｂ^＊およびＣ^＊も加えて、結合ドメインに結合した分析対象物質を検出する。図４（ｅ）は、それぞれ結合ドメインＸ、ＹおよびＺ上に形成された結合試薬複合体、結合試薬複合体Ａ_ＲＣ、Ｂ_ＲＣおよびＣ_ＲＣの拡大図である。 図４−１の続き。 （ａ）〜（ｄ）本発明のアッセイ方式に用いることができる試薬の様々な組合せを示す図である。図５（ａ）では、すべての試薬を単一段階で試料と混合するのに対して、図５（ｂ）では、すべての試薬を混合し、次に表面に加え、５（ｃ）では、修飾結合試薬および修飾標的物質相補体を混合し、それぞれが標的物質を含む複数の結合ドメインを有する表面に加え、表面−混合物を試料および検出試薬と１段階または２段階で混合する（試料および検出試薬の１段階添加を図５（ｃ）に示し、試料および検出試薬の連続的添加を図５（ｄ）に示す）。 図５−１の続き。 図５−２の続き。 図５−３の続き。 （ａ）〜（ｆ）本発明のアッセイ方式に用いることができる複数の結合ドメインを有する様々な修飾表面、例えば、粒子および基材を示す図である。 図６−１の続き。 オリゴヌクレオチド上のチオール基を介してオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができるマレイミド活性化抗体を得るためにスルホ−ＳＭＣＣで抗体を化学修飾する手順を示す図である。 （ａ）〜（ｇ）７プレックスケモカインパネルおよび１０プレックＴＨ１／ＴＨ２パネルに関する直接アッセイ方式の結果を示す図である。 （ａ）〜（ｃ）ストレプトアビジン分子で修飾したオリゴヌクレオチドを有するビオチニル化捕捉抗体を用いた間接アッセイ方式における多ウエルアッセイプレートの製造および使用の手順を示す図である。 （ａ）〜（ｃ）ビオチニル化捕捉抗体、ニート（neat）ストレプトアビジンおよびビオチニル化オリゴヌクレオチドを用いた間接アッセイ方式における多ウエルアッセイプレートの製造および使用の手順を示す図である。 （ａ）〜（ｇ）サイトカインＢパネルの３種のオリゴヌクレオチド媒介アッセイ方式におけるＬＯＤ値の比較を示す図である。

本明細書で別途定義しない限り、本発明に関連して用いた科学技術用語は、当業者により一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除いて、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数を含むものとする。冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）の冠詞の文法上の目的語を意味するように本明細書で用いる。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素または複数の要素を意味する。

本発明は、使用者または製造業者が特定の使用者の要求に基づいてアッセイを構成することを可能にする柔軟な固相結合アッセイ方式を提供する。本明細書で述べる方法およびキットは、複数の標的分析対象物質の多重化結合アッセイを構築するための柔軟なプラットフォームを提供する。一連の一般的な標的物質相補体を有する複数の結合ドメインを含む担体により、あらゆる組の分析対象物質の多重化アッセイを構成することが可能である。１つの唯一の必要なことは、どの結合ドメインにおけるどの分析対象物質を評価するかを選択し、適切な結合試薬および標的物質を選択した結合ドメインとひと組にすることである。このプラットフォームを用いて、使用者は、個別のアッセイパネルを構築することができる。

そのような柔軟な多重化アッセイ方式は、本明細書で開示する方法および生成物を用いて実現することができる。例えば、対象の複数の分析対象物質の多重化結合アッセイを行う方法は、以下の工程を用いて実施することができる：
（ａ）１つまたは複数の工程で、以下の成分を混ぜ合わせる工程：
（ｉ）対象の第１の分析対象物質および対象の第２の分析対象物質を含む試料、
（ｉｉ）第１の結合ドメイン上に固定化された第１の標的物質、
（ｉｉｉ）連結剤に接続され、第１の標的物質の結合相手である、第１の標的物質相補体、
（ｉｖ）補助連結剤に接続され、第１の分析対象物質の結合相手である、第１の結合試薬、
（ｖ）第２の結合ドメイン上に固定化された第２の標的物質、
（ｖｉ）連結剤に接続され、第２の標的物質の結合相手である、第２の標的物質相補体、
（ｖｉｉ）補助連結剤に接続され、第２の分析対象物質の結合相手である、第２の結合試薬、および
（ｖｉｉｉ）場合により、架橋剤の少なくとも２つのコピー、ここで、架橋剤が除外される場合には、各連結剤は、補助連結剤の結合相手であり、または架橋剤が含められる場合には、架橋剤は、連結剤の１つに対する第１の結合部位および補助連結剤の１つに対するさらなる結合部位を有する；
（ｂ）以下のものを形成する工程
（ｉ）第１の標的物質、第１の標的物質相補体、第１の結合試薬および第１の分析対象物質を含む第１の結合ドメイン上の第１の結合複合体、ならびに
（ｉｉ）第２の標的物質、第２の標的物質相補体、第２の結合試薬および第２の分析対象物質を含む第２の結合ドメイン上の第２の結合複合体、
ならびに
（ｃ）それぞれ第１および第２の結合ドメイン上の第１および第２の分析対象物質の量を測定する工程。

１つの実施形態において、架橋剤を用いない場合、該方法は、（ａ）１つまたは複数の工程で成分（ｉ）〜（ｖｉｉ）を混ぜ合わせる工程、（ｂ）それぞれ第１および第２の結合ドメイン上に第１および第２の結合複合体を形成する工程、ならびに（ｃ）それぞれ第１および第２の結合ドメイン上の第１および第２の分析対象物質の量を測定する工程を含む。例えば、第１の標的物質相補体および第１の結合試薬は、連結剤と補助連結剤との間の結合相互作用により連結された第１の標的物質相補体および第１の結合試薬を含む事前に結合させた第１の標的複合体として準備することができ、同様に、第２の標的物質相補体および第２の結合試薬は、連結剤と補助連結剤との間の結合相互作用により連結された第２の標的物質相補体および第２の結合試薬を含む事前に結合させた第２の標的複合体として準備することができる。この実施形態において、第１の標的複合体は、第１の結合ドメイン上に固定化された第１の標的物質に事前に結合させて準備することができ、同様に、第２の標的複合体は、第２の結合ドメイン上に固定化された第２の標的物質に事前に結合させて準備することができる。第１および第２の結合試薬を事前に結合させた標的複合体として準備する場合、混ぜ合わせ工程は、第１および第２の標的複合体を試料と混ぜ合わせて、その混合物を形成し、第１の分析対象物質を第１の標的複合体における第１の結合試薬に結合させ、第２の分析対象物質を第２の標的複合体における第２の結合試薬に結合させ、それぞれ第１および第２の分析対象物質に結合した第１および第２の標的複合体の混合物を第１および第２の結合ドメインと接触させることをさらに含み得る。第１および第２の結合ドメイン上の結合複合体は、それにより、第１の標的複合体を第１の結合ドメイン上の第１の標的物質に結合させ、第２の標的複合体を第２の結合ドメイン上の第２の標的物質に結合させることにより形成される。さらに、混ぜ合わせ工程は、第１および第２の標的複合体を試料と混ぜ合わせ、第１の分析対象物質を第１の標的複合体における第１の結合試薬に結合させ、第２の分析対象物質を第２の標的複合体における第２の結合試薬に結合させることをさらに含み得る。

他の代替実施形態において、混ぜ合わせ工程（ａ）は、第１の容積の液体中で、前記第１の標的物質相補体、前記第１の結合試薬および、用いる場合には、前記架橋剤を混ぜ合わせ、前記第１の標的物質相補体と前記第１の結合試薬を、それらの結合した連結剤を介して連結して、第１の標的複合体を形成し；第２の容積の液体中で、前記第２の標的物質相補体、前記第２の結合試薬および、用いる場合には、前記架橋剤を混ぜ合わせ、前記第２の標的物質相補体と前記第２の結合試薬を、それらの結合した連結剤を介して連結して、第２の標的複合体を形成する工程を含む。この実施形態において、混ぜ合わせ工程（ａ）はまた、前記第１および第２の標的複合体を混ぜ合わせ、前記第１および第２の標的複合体の配合物を前記第１および第２の結合ドメインと接触させ、前記第１の標的複合体を前記第１の結合ドメイン上の前記第１の標的物質に結合させ、前記第２の標的複合体を前記第２の結合ドメイン上の前記第２の標的物質に結合させる工程を含み得る。この実施形態において、混ぜ合わせ工程は、第１および第２の標的複合体の組合せを試料と混ぜ合わせ、第１の分析対象物質を第１の標的複合体における第１の結合試薬に結合させ、第２の分析対象物質を第２の標的複合体における第２の結合試薬に結合させることをさらに含む。第１および第２の標的複合体は、第１および第２の標的複合体を第１および第２の結合ドメインと接触させる前に、試料と混ぜ合わせることができ；第１および第２の標的複合体は、第１および第２の標的複合体を第１および第２の結合ドメインと接触させた後に、試料と混ぜ合わせることができ；または第１および第２の標的複合体は、試料と混ぜ合わせ、同時に第１および第２の結合ドメインと接触させることができる。

架橋剤を該方法に含める場合、連結剤および補助連結剤は、それぞれ架橋剤に結合し、したがって、混ぜ合わせ工程は、それらの要素が連結剤および補助連結剤に一緒に結合した状態にする。例えば、混ぜ合わせ工程（ａ）は、第１の容積の液体中で、（ｘｉ）第１の標的物質相補体、第１の結合試薬および架橋剤を混ぜ合わせる工程を含み、補助連結剤が結合している架橋剤に結合した連結剤を含む架橋複合体を介して第１の標的物質相補体と第１の結合試薬を連結することによって第１の標的複合体を形成する工程をさらに含む。混ぜ合わせ工程（ａ）はまた、第２の容積の液体中で、（ｘｉｉ）第２の標的物質相補体、第２の結合試薬および架橋剤を混ぜ合わせる工程を含み、補助連結剤が結合している架橋剤に結合した連結剤を含む架橋複合体を介して第２の標的物質相補体と第２の結合試薬を連結することによって第２の標的複合体を形成する工程をさらに含む。この実施形態において、混ぜ合わせ工程（ａ）はまた、（ｘｉｉｉ）第１および第２の標的複合体を混ぜ合わせ、第１および第２の標的複合体の配合物を第１および第２の結合ドメインと混ぜ合わせ、第１の標的複合体を第１の結合ドメイン上に結合させ、第２の標的複合体を第２の結合ドメイン上に結合させることも含み得る。この実施形態において、混ぜ合わせ工程は、（ｘｉｖ）第１および第２の標的複合体を試料と混ぜ合わせ、第１の分析対象物質を第１の標的複合体における第１の結合試薬に結合させ、第２の分析対象物質を第２の標的複合体における第２の結合試薬に結合させることをさらに含む。第１および第２の標的複合体は、第１および第２の標的複合体を第１および第２の結合ドメインと接触させる前に、試料と混ぜ合わせることができ；第１および第２の標的複合体は、第１および第２の標的複合体を第１および第２の結合ドメインと接触させた後に、試料と混ぜ合わせることができ；または第１および第２の標的複合体は、試料と混ぜ合わせ、同時に第１および第２の結合ドメインと接触させることができる。

本明細書で述べた方法は、試料中の対象の複数の分析対象物質を多重化するために用いることができる。この点については、試料は、対象の１つまたは複数のさらなる分析対象物質を含み、対象のそれぞれのさらなる分析対象物質について、混ぜ合わせ工程（ａ）は、１つまたは複数の工程で、（ｉｘ）さらなる結合ドメイン上に固定化されたさらなる標的物質、連結剤に接続されたさらなる標的物質相補体、および補助連結剤に接続されたさらなる結合試薬、ならびに（ｘ）さらなる標的物質、さらなる標的物質相補体、さらなる結合試薬およびさらなる分析対象物質を含むさらなる結合ドメイン上のさらなる結合複合体を混ぜ合わせる工程をさらに含み；形成工程（ｂ）は、（ｉｉｉ）さらなる標的物質、さらなる標的物質相補体、さらなる結合試薬およびさらなる分析対象物質を含むさらなる結合ドメイン上のさらなる結合複合体を形成する工程をさらに含み；工程（ｃ）における測定は、さらなる結合ドメイン上のさらなる分析対象物質の量を測定する工程をさらに含む。

特定の実施形態において、本発明は、（ａ）試料をそれぞれが複数の分析対象物質のうちのそれぞれ第１および第２の分析対象物質に結合する少なくとも第１および第２の結合試薬に連結された２つ以上の結合ドメインと接触させて、第１の結合試薬に結合した第１の分析対象物質および第２の結合試薬に結合した第２の分析対象物質を含む複合体を形成する工程であって、（ｘ）第１の結合ドメインが、（ｉ）第１の結合ドメインおよび第１の標的物質相補体に結合した第１の標的物質ならびに（ｉｉ）連結複合体を介して第１の標的物質相補体に結合した第１の結合試薬を含む第１の結合試薬複合体を含み、（ｙ）第２の結合ドメインが、（ｉ）第２の結合ドメインおよび第２の標的物質相補体に結合した第２の標的物質ならびに（ｉｉ）連結複合体を介して第２の標的物質相補体に結合した第２の結合試薬を含む第２の結合試薬複合体を含む、工程と、（ｂ）第１および第２の結合試薬複合体を、第１の分析対象物質または第１の分析対象物質を含む複合体に結合する第１の検出試薬および第２の分析対象物質または第２の分析対象物質を含む複合体に結合する第２の検出試薬を含む複数の検出試薬と接触させる工程と、（ｃ）２つ以上の結合ドメインに結合した第１および第２の分析対象物質の量を測定する工程とを含む複数の分析対象物質の結合アッセイを行う方法を含む。

他の特定の実施形態において、以下の工程を含む方法：（ａ）複数の分析対象物質における第１の分析対象物質に対して特異的な第１の結合試薬および第１の標的物質を含む第１の結合試薬複合体を形成する工程であって、第１の結合試薬が連結剤に結合し、第１の標的物質が補助連結剤に結合しており、第１の結合試薬複合体が連結剤と補助連結剤との間の反応により形成される、工程と、（ｂ）複数の分析対象物質における第２の分析対象物質に対して特異的な第２の結合試薬および第２の標的物質を含む第２の結合試薬複合体を形成する工程であって、第２の結合試薬が第２の連結剤に結合し、第２の標的物質が第２の連結剤相補体に結合しており、第２の結合試薬複合体が第２の連結剤と第２の連結剤相補体との間の反応により形成される、工程と、（ｃ）第１の標的物質を第１の標的物質相補体に、第２の標的物質を第２の標的物質相補体に結合させるのに十分な条件下で、第１および第２の結合試薬複合体を、それぞれがそれぞれ第１の標的物質相補体および第２の標的物質相補体に連結された２つ以上の結合ドメインと混合する工程と、（ｄ）複数の分析対象物質を含む試料を工程（ｃ）で形成された混合物と混合する工程と、（ｅ）複数のさらなる結合試薬を工程（ｄ）で形成された混合物に加える工程であって、複数のさらなる結合試薬が（ｉ）第１の分析対象物質および／または第１の結合試薬−第１の分析対象物質複合体に対して特異的な第１の検出試薬ならびに（ｉｉ）第２の分析対象物質および／または第２の結合試薬−第２の分析対象物質複合体に対して特異的な第２の検出試薬を含む、工程と、（ｆ）結合ドメインに結合した第１および第２の分析対象物質の量を測定する工程。

さらなる特定の実施形態は以下の工程を含む：（ａ）複数の分析対象物質における第１の分析対象物質に対して特異的な第１の結合試薬および第１の標的物質を含む第１の結合試薬複合体を形成する工程であって、第１の結合試薬が連結剤に結合し、第１の標的物質が補助連結剤に結合しており、第１の結合試薬複合体が連結剤と補助連結剤との間の反応により形成される、工程と、（ｂ）複数の分析対象物質における第２の分析対象物質に対して特異的な第２の結合試薬および第２の標的物質を含む第２の結合試薬複合体を形成する工程であって、第２の結合試薬が第２の連結剤に結合し、第２の標的物質が第２の連結剤相補体に結合しており、第２の結合試薬複合体が第２の連結剤と第２の連結剤相補体との間の反応により形成される、工程と、（ｃ）第１の標的物質を第１の標的物質相補体に、第２の標的物質を第２の標的物質相補体に結合させるのに十分な条件下で、第１および第２の結合試薬複合体と試料を、それぞれがそれぞれ第１の標的物質相補体および第２の標的物質相補体に連結された２つ以上の結合ドメインと混合する工程と、（ｄ）複数のさらなる結合試薬を工程（ｃ）で形成された混合物に加える工程であって、複数のさらなる結合試薬が（ｉ）第１の分析対象物質および／または第１の結合試薬−第１の分析対象物質複合体に対して特異的な第１の検出試薬ならびに（ｉｉ）第２の分析対象物質および／または第２の結合試薬−第２の分析対象物質複合体に対して特異的な第２の検出試薬を含む、工程と、（ｅ）結合ドメインに結合した第１および第２の分析対象物質の量を測定する工程。

本発明の方法の特定の実施形態を図３〜６に例示する。図１および２に連結複合体を含まない直接アッセイ方法を例示する。これらの図は、比較の目的のために収載する。図１に分析対象物質Ａ、ＢおよびＣの直接多重化アッセイを例示する。これらの分析対象物質に対して特異的な結合試薬であるそれぞれＡ’、Ｂ’およびＣ’を標的物質Ａ’’、Ｂ’’およびＣ’’に結合させる。それらの対応する標的物質に結合したこれらの結合試薬を含む溶液を、標的物質相補体Ａ’’’、Ｂ’’’およびＣ’’’がそれぞれ一連の別個の結合ドメインに結合している固相と混合する。結合試薬は、表面に吸着されて、それぞれの結合試薬が標的物質相補体を介して表面上の別個の結合ドメインに結合した結合試薬複合体Ａ_ＲＣ、Ｂ_ＲＣおよびＣ_ＲＣを形成する。表面を分析対象物質Ａ、ＢおよびＣを含む試料ならびにそれぞれ分析対象物質Ａ、ＢおよびＣおよび／またはそれらの分析対象物質を含む複合体に結合することができる検出結合試薬Ａ^＊、Ｂ^＊およびＣ^＊と接触させる。検出結合試薬は、検出可能な標識を含む。あるいは、表面を複数の分析対象物質を含む試料と接触させ、その後、検出結合試薬の混合物と接触させる。検出結合試薬を表面に結合させ、場合により、表面を洗浄して、非結合試薬を除去したならば、各分析対象物質の存在をそれぞれの別個の結合ドメインに結合した検出試薬により検出する。図２に結合試薬としての抗体および標的物質／標的物質相補体対としてのオリゴヌクレオチド／相補的オリゴヌクレオチド対の使用を含む図１の特定の実施形態を例示する。図１および２に示す直接法が使用者によって構成することができないことは、当業者には明らかであろう。それぞれの個別の結合ドメインは、単一の結合試薬−標的物質のみがアレイにおける単一の結合ドメインに結合することができるように、既定の標的物質相補体を含む。

図３〜４に使用者により規定されるアッセイ構成における最適な柔軟性を使用者にもたらす本発明の特定の実施形態を例示する。図３に使用者がアッセイを使用者の必要に適応させることを可能にする一連の連結複合体を組み込んだ、分析対象物質Ａ、ＢおよびＣに対する間接的結合方式を例示する。図３（ａ）〜（ｂ）に本発明の標的複合体を調製するための一般的なアプローチを示し、連結剤（それぞれＬ_Ａ、Ｌ_ＢおよびＬ_Ｃ）に結合した結合試薬（Ａ’、Ｂ’およびＣ’）の１つを含む一連の溶液を調製する。溶液は、補助連結剤（それぞれＬ_Ａ’、Ｌ_Ｂ’およびＬ_Ｃ’）に結合した対応する標的物質（Ａ’に対するＡ’’、Ｂ’に対するＢ’’およびＣ’に対するＣ’’）も含む。溶液を混合して、パネル（ｂ）に示す結合試薬−連結複合体−標的物質複合体の混合物を形成する。このアプローチの利点は、それが、各標的複合体が非交差反応性であるための連結試薬を必要としないことであり、実際、連結剤を各標的複合体に用いることを可能にすることである（すなわち、Ｌ_Ａ＝Ｌ_Ｂ＝Ｌ_ＣおよびＬ_Ａ’＝Ｌ_Ｂ’＝Ｌ_Ｃ’）。図３（ｃ）〜（ｅ）に示す実施形態において、結合試薬−連結複合体−標的物質複合体の混合物を標的物質相補体Ａ’’’、Ｂ’’’およびＣ’’’が結合している複数の別個の結合ドメインを含む表面と混合する。結合試薬−連結複合体−標的物質複合体を、パネル（ｃ）に示すように吸着させて、結合試薬複合体Ａ_ＲＣ、Ｂ_ＲＣおよびＣ_ＲＣを形成する。結合試薬複合体の拡大図を図３（ｅ）に示す。表面を、分析対象物質Ａ、ＢおよびＣを含む試料、ならびにそれぞれ分析対象物質Ａ、ＢおよびＣ、および／またはそれらの分析対象物質を含む複合体に結合することができる検出結合試薬Ａ^＊、Ｂ^＊およびＣ^＊と接触させる。検出結合試薬は、検出可能な標識を含む。あるいは、表面を複数の分析対象物質を含む試料と接触させ、その後、検出結合試薬の混合物と接触させる。検出結合試薬を表面に結合させ、場合により、表面を洗浄して、非結合試薬を除去したならば、各分析対象物質の存在をそれぞれの別個のドメインに結合した検出試薬により検出する（パネル３（ｄ））。図４に結合試薬としての抗体および標的物質／標的物質相補体対としてのオリゴヌクレオチド−相補的オリゴヌクレオチド対の使用を含む図３の特定の実施形態を例示する。図３について述べたように、各結合試薬に対する連結剤は、同じであってもよく、各標的物質に対する連結剤相補体は、同じであってもよい。

当業者は、図３〜４に示したアッセイ方式の様々な並べ替えが可能であることを容易に理解するであろう。特定の好ましい実施形態を図５（ａ）〜（ｃ）に示す。例えば、すべての試薬、すなわち、補助連結剤により修飾された結合試薬、連結剤により修飾された標的物質相補体、検出試薬および試料を標的物質修飾結合ドメインを有する表面と一緒に単一工程で混合して、図３（ｄ）および４（ｄ）に示す複合体を形成し、場合により洗浄し、表面に結合した分析対象物質Ａ、ＢおよびＣの存在について分析する（図５（ａ））。あるいは、補助連結剤により修飾された結合試薬および連結剤により修飾された標的物質相補体を単一工程で混合し、標的物質修飾結合ドメインを有する表面にその後の工程で加え、試料および検出試薬を加え、最終工程で分析することができる（図５（ｂ））。他の実施形態において、補助連結剤により修飾された結合試薬および連結剤により修飾された標的物質相補体を混合し、別個の結合ドメインにおいて標的物質を有する表面に加え、試料と混合し、次いで検出試薬を加える（図５（ｃ））。個々の分析対象物質溶液は、単一混合物中の各結合ドメインに連続的または同時に加えることができ、同様に、個々の検出試薬は、単一混合物中の各結合ドメインに連続的または同時に加えることができる。表面結合工程には、次の工程に進む前にアッセイの非結合成分を除去するための洗浄工程を場合により後続させることができる。

本発明はまた、本明細書で述べた方法を実施するために用いることができるキット、成分および消耗品を提供する。以下の材料／方法を本発明で用いる。

（ｉ）試料／分析対象物質
本発明の方法により分析することができる試料の例は、食物試料（食物抽出物、食物ホモジネート、飲料等を含む）、環境試料（例えば、土壌試料、環境汚泥、収集環境エアゾール、環境ワイプ、ろ過水等）、工業試料（例えば、出発物質、工業生産工程からの製品または中間体）、ヒト臨床試料、獣医学試料および生体起源の他の試料を含むが、これらに限定されない。分析することができる生体試料は、糞便、粘膜スワブ、生理液および／または細胞の懸濁液を含む試料を含むが、これらに限定されない。生体試料の特定の例は、血液、血清、血漿、糞便、粘膜スワブ、組織吸引物、組織ホモジネート、細胞培養および細胞培養上清（真核および原核細胞の培養を含む）、尿、唾液、痰ならびに脳脊髄液を含む。

本発明の方法を用いて測定することができる分析対象物質は、タンパク質、毒素、核酸、微生物、ウイルス、細胞、真菌、胞子、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、薬物、ホルモン、ステロイド、栄養素、代謝物および上記の分子の修飾誘導体、または１つもしくは複数の上記の分子を含む複合体またはそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。試料中の対象の分析対象物質のレベルは、疾患もしくは疾患状態を示すものである可能性があるか、または患者が当分析対象物質に曝露したかどうかを単に示すものである可能性がある。

本発明のアッセイは、試料中の１つまたは複数、例えば、２つ以上の分析対象物質の濃度を決定するために用いることができる。したがって、２つ以上の分析対象物質を同じ試料で測定することができる。同じ試料で測定することができる分析対象物質のパネルは、例えば、疾患状態または生理状態に関連する分析対象物質または活性のアッセイのパネルを含む。特定のそのようなパネルは、サイトカインおよび／またはそれらの受容体（例えば、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＩＬ１−アルファ、ＩＬ１−ベータ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−ｙ等のうちの１つまたは複数のもの）、成長因子および／またはそれらの受容体（例えば、ＥＧＦ、ＶＧＦ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ等のうちの１つまたは複数のもの）、乱用の薬物、治療薬、ビタミン、病原体特異抗体、自己抗体（例えば、Ｓｍ、ＲＮＰ、ＳＳ−Ａ、ＳＳ−アルファ、Ｊ０−１およびＳｃ１−７０抗原に対する１つまたは複数の抗体）、アレルゲン特異抗体、腫瘍マーカー（例えば、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＣＡ−１２５ＩＩ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＮＳＥ、ＡＦＰ等のうちの１つまたは複数のもの）、うっ血性心疾患および／または急性心筋梗塞を含む心疾患のマーカー（トロポニンＴ、トロポニンＩ、ミオグロビン、ＣＫＭＢ、ミエロペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、β−ナトリウム利尿タンパク質（ＢＮＰ）、α−ナトリウム利尿タンパク質（ＡＮＰ）、エンドセリン、アルドステロン、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）等）、止血に関連するマーカー（例えば、フィブリンモノマー、Ｄダイマー、トロンビン抗トロンビン複合体、プロトロンビン画分１および２、抗Ｘａ因子等のうちの１つまたは複数のもの）、急性ウイルス性肝炎感染のマーカー（例えば、Ａ型肝炎ウイルスに対するＩｇＭ抗体、Ｂ型肝炎コア抗原に対するＩｇＭ抗体、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体等のうちの１つまたは複数のもの）、アルツハイマー病のマーカー（例えば、アルファ−アミロイド、ベータ−アミロイド、Ａβ４２、Ａβ４０、Ａβ３８、Ａβ３９、Ａβ３７、Ａβ３４、タウタンパク質等）、骨粗鬆症のマーカー（例えば、架橋ノルＣテレペプチド、総デオキシピリジノリン、遊離デオキシピリジノリン、オステオカルシン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲンのＣ末端プロペプチド、骨特異アルカリホスファターゼ等のうちの１つまたは複数のもの）、受胎能状態または受胎能関連障害のマーカー（例えば、エストラジオール、プロゲステロン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、プロラクチン、ｈＣＧ、テストステロン等のうちの１つまたは複数のもの）、甲状腺障害のマーカー（例えば、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、総Ｔ３、遊離型Ｔ３、総Ｔ４、遊離型Ｔ４および逆Ｔ３のうちの１つまたは複数のもの）ならびに前立腺癌のマーカー（例えば、総ＰＳＡ、遊離型ＰＳＡ、結合型ＰＳＡ、前立腺酸性ホスファターゼ、クレアチンキナーゼ等のうちの１つまたは複数のもの）を含む。本発明の特定の実施形態は、特定の疾患状態または生理状態に関連する例えば、１つもしくは複数、２つ以上、４つ以上または１０以上の分析対象物質を測定することを含む（例えば、上に列挙したようなパネルにグループ分けした分析対象物質；例えば、甲状腺障害の診断に有用なパネルは、例えば、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、総Ｔ３、遊離型Ｔ３、総Ｔ４、遊離型Ｔ４および逆Ｔ３のうちの１つまたは複数のものを含み得る）。

本発明の方法は、上述のような、多種多様な生物学的および生化学的物質の検出を可能にするように計画されている。１つの実施形態において、該方法は、血液、痰、糞便、フィルター、スワブ等を含み、制限のない、様々な関連する臨床および環境マトリックスにおける生物兵器剤（「ＢＷＡｓ」）を含む病原性および／または潜在的に病原性のウイルス、細菌および毒素を検出するために用いることができる。本発明の方法を用いて分析することができる（単独または組み合わせて）病原体および毒素の非限定的なリストは、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）（ペスト）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病）、ブルセラ属種（ブルセラ症）、コクシエラ・ブルネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｕｎｅｔｉｉ）（Ｑ熱）、リステリア菌、サルモネラ菌、赤痢菌、コレラ菌、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、痘瘡ウイルス（痘瘡）を含むオルトポックスウイルス、ウイルス性脳炎、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、ウエスタンウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥ）、イースタンウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、アルファウイルス属（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス属（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ブンヤウイルス属（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス属（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス属（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、エボラウイルス、ブドウ球菌腸内毒素、リシン、ボツリヌス毒素（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、マイコトキシン、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ミロテシウム属（Ｍｙｒｏｔｅｃｉｕｍ）、セファロスポリウム属（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ベルチシモノスポリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｍｏｎｏｓｐｏｒｉｕｍ）、スタキボトリス属（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）、鼻疽、コムギカビ、バシラス・グロビギイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｏｂｉｇｉｉ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、黄色い雨、トリコテシンマイコトキシン、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、アフラトキシン、インドネズミノミ（Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ ｃｈｅｏｐｉｓ）、ディアマヌス・モンタヌス（Ｄｉａｍａｎｕｓ ｍｏｎｔａｎｕｓ）、小痘瘡、サル痘、アレナウイルス、ハンタウイルス、ラッサ熱、アルゼンチン出血熱、ボリビア出血熱、リフトバレー熱ウイルス、クリミア−コンゴウイルス、ハンタウイルス、マールブルグ出血熱、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザを含むヒトおよび動物株、Ａ型インフルエンザ、Ｈ１特異的Ａ型インフルエンザ、Ｈ３特異的Ａ型インフルエンザ、Ｈ５特異的Ａ型インフルエンザ、２００９−Ｈ１Ｎ１特異的Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザを含む）、ＲＳＶ、ヒト免疫不全ウイルスＩおよびＩＩ（ＨＩＶ ＩおよびＩＩ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、肝炎（非Ａ、ＢまたはＣ）、エンテロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、単純疱疹ウイルス、トラコーマクラミジア、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヒト乳頭ウイルス、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎マイコプラスマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）、アブリン、志賀毒素１、志賀毒素２、モクセラ・カタラーリス、化膿連鎖球菌（Ｓｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｉｃｉｌｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ａ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）Ｏ１５７、コロナウイルス、コクサッキーＡ群ウイルス、ライノウルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）、メタニューモウイルス、ワクシニアおよびアデノウイルスである。

（ｉｉ）結合試薬
結合アッセイの分野の技術者は、本発明の方法に用いることができる結合剤および随伴（companion）結合相手の範囲を容易に理解するであろう。そのような対の非限定的なリストは、（いずれかの順序で）オリゴヌクレオチドおよび相補体、受容体／リガンド対、抗体／抗原、天然または合成受容体／リガンド対、アミンおよびカルボニル化合物（すなわち、シッフ塩基の形成による結合）、ハプテン／抗体対、抗原／抗体対、エピトープ／抗体対、ミニトープ／抗体対、アプタマー／標的分子対、ハイブリダイゼーションパートナーおよびインターカレーター／標的分子対を含む。

好ましい実施形態において、本発明の方法の結合アッセイは、抗体または他の受容体タンパク質を結合試薬として用いる。「抗体」という用語は、完全な抗体分子（抗体サブユニットのｉｎ ｖｉｔｒｏでの再結合により組み立てられたハイブリッド抗体を含む）、抗体断片および抗体の抗原結合ドメインを含む組換えタンパク質構築物（例えば、Ｐｏｒｔｅｒ Ｒ．Ｒ．およびＷｅｉｒ Ｒ．Ｃ． Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、６７（Ｓｕｐｐｌ）；５１〜６４頁（１９６６）ならびにＨｏｃｈｍａｎ １．Ｉｎｂａｒ Ｄ．およびＧｉｖｏｌ Ｄ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：１１３０頁（１９７３）に記載されているような）ならびに例えば、検出可能な標識の導入により化学的に修飾された抗体構築物を含む。

（ｉｉｉ）標的物質、連結剤および架橋剤
結合試薬は、直接的または間接的に、互いおよび／または固相へのそれらの結合を可能にする成分に連結される。これらの成分は、本明細書では標的物質および連結剤と呼ぶ。本明細書で用いているように、標的物質およびそれらの相補体は、結合試薬を表面または担体に接着するために用いられるが、連結剤および補助連結剤は、もし架橋剤を用いる場合には架橋剤を介して直接的または間接的に、結合試薬を標的物質に結合させるために用いられる。

１つの実施形態において、標的物質およびその相補体は、第１のオリゴヌクレオチドおよび相補的オリゴヌクレオチド、受容体−リガンド対、抗原−抗体対、ハプテン−抗体対、エピトープ−抗体対、ミミトープ−抗体対、アプタマー−標的分子対、ハイブリダイゼーションパートナーまたはインターカレーター−標的分子対を含む。アッセイに用いる標的物質および相補体は、アッセイにより測定される分析対象物質（例えば、第１の分析対象物質）に対する結合試薬と関連する標的物質および相補体がアッセイにより測定される他の分析対象物質（例えば、第２の分析対象物質）に対する結合試薬と関連する標的物質および相補体と実質的に非交差反応性であるように選択する。したがって、本発明のアッセイにおいて、結合試薬のその関連結合ドメインへの結合（その関連する標的物質および標的物質相補体を介する）は、他の分析対象物質と関連する結合ドメイン（および存在する異なる標的物質相補体）へのその結合よりも実質的に大きいものであるべきである。好ましくは、適正な結合ドメインへの結合と比較した他の分析対象物質と関連する結合ドメインへの分析対象物質に対する結合試薬の結合の交差反応性は、１％未満、より好ましくは０．１％未満、より好ましくは０．０１％未満である。好ましい実施形態において、標的物質／標的物質相補体は、相補的配列を含むオリゴヌクレオチドの対を含み、標的物質とその相補体を、標的物質をその相補体にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させる。

好ましい長さは、約５〜１００塩基、好ましくは約１０〜５０塩基、より好ましくは約１０〜２５塩基である。さらに、標的オリゴヌクレオチド配列は、長さが同じである必要がなく、特定の実施形態において、その結合相手より例えば、最大２５塩基、または最大１５塩基、または最大１０塩基長い１つの標的オリゴヌクレオチド配列を準備することが有益であり得る。オリゴヌクレオチド配列およびそれらの相補体は、同様の結合エネルギー（または溶融温度）および低い対間交差反応性を有する相補的オリゴヌクレオチドの対を作製するための当技術分野で公知の技術（例えば、多重化核酸アッセイ用のプローブまたはプライマーを選択するための商業または公共ソフトウエア）により作製することができる。オリゴヌクレオチド配列は、天然に存在する核酸塩基ならびに天然に存在しない塩基および／または修飾塩基を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチド配列は、ＥｒａＧｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ（ｗｗｗ．ｅｒａｇｅｎ．ｃｏｍ）から入手できるそれぞれシトシンおよびグアニンの化学的変異体である、Ｉｓｏ−ｄＣおよび／またはＩｓｏ−ｄＧを含み得る。そのような修飾塩基のオリゴヌクレオチド配列への組み込みは、遺伝情報を拡大し、高い特異性と低いミスマッチハイブリダイゼーションの可能性を有するオリゴヌクレオチドの合成を可能にするものである。例えば、Ｉｓｏ−ｄＣを含むオリゴヌクレオチドは、Ｉｓｏ−ｄＣを含む相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするが、天然に存在する核酸配列にはハイブリダイズしないように設計することができる。

１つのアプローチにおいて、コンピュータアルゴリズムを用いて、以下の規則の１つまたは複数、好ましくはすべてに基づくオリゴヌクレオチド配列対を作製することができる：（ｉ）約４０〜６０％、例えば、４０〜５０％のＧＣ含量；（ｉｉ）３つ以下の配列における塩基反復配列の最大ストリング（maximum string of base repeats）；（ｉｉｉ）異なる対における配列間の塩基対マッチの最大数が６で、列におけるマッチが４以下；（ｉｖ）ステム領域に４以上の塩基対マッチを有する場合、２〜５オリゴヌクレオチドの予測ヘアピンループサイズを有する配列の棄却（６以上のループサイズが保持されている）；および（ｖ）４０〜６０％または４０〜５０％のＧＣ含量に起因する特異的相互作用のより高い自由エネルギー（ΔＧ^ｏ）（ΔＧ^ｏは、温度および塩濃度に依存し、２３℃および２００ｍＭの一価カチオン、ｐＨ７．０において、ΔＧ^ｏは、好ましくは−１５ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える）。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの選択に際して、上で特定した１つまたは複数の規則とともに、少なくとも関連するＧＣ含量およびΔＧ^ｏを考慮する。１つの実施形態において、非特異的結合を最小限にするオリゴヌクレオチド配列を設計することが有利である可能性があり、これは、様々な方法により達成することができる。例えば、アッセイに用いる他のオリゴヌクレオチドとの３以下の連続Ｇ／Ｃ対を形成するオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオチド対を設計することができる。あるいはまたはさらに、１つまたは複数の以下の構造を避けることができる：アッセイに用いる他のオリゴヌクレオチドと対合させる場合、Ｇ／Ｃに富む配列間に位置する単一ヌクレオチドループまたは単一ヌクレオチドミスマッチの形成。

１つの実施形態において、標的物質および標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドの対を含み、該対は、表１（ａ）における以下の配列対の１つから選択される：

特定の実施形態において、標的物質および標的物質相補体は、オリゴヌクレオチドの対を含み、該対は、表１（ｂ）における以下の配列対の１つから選択される：

標的物質および標的物質相補体は、１：１の比で存在し得る。あるいは、標的物質がその相補体に結合する可能性を増大させるために、標的物質は、過剰に、例えば、標的物質の標的物質相補体に対する２：１の比で存在し得る。

１つの実施形態において、適切な連結剤および補助連結剤は、反応して連結複合体を形成する化学的構成部分を含む。例えば、連結複合体は、連結剤および補助連結剤に存在する化学的構成部分の間、例えば、チオール基とマレイミドもしくはヨードアセトアミド基の間；アルデヒドとヒドラジドとの間；またはアルキンとアジドとの間の結合相互作用により形成される。

あるいは、連結複合体は、連結剤と補助連結剤との間のタンパク質−タンパク質結合反応に形成され得る。例えば、タンパク質−タンパク質結合反応は、受容体／リガンド対、ハプテン／抗体対、抗原／抗体対、エピトープ／抗体対、ミミトープ／抗体対、アプタマー／標的分子対、ハイブリダイゼーションパートナーおよびインターカレーター／標的分子対の間の結合により構成され得る。１つの実施形態において、連結剤がビオチンであり、補助連結剤がストレプトアビジンもしくはアビジンである（または逆）；または連結剤がペプチドであり、補助連結剤が抗ペプチド抗体である（または逆）。

本明細書で述べた特定の実施形態は、補助連結剤に直接結合する連結剤を用いる。これらおよび他のそのような実施形態において、互いに結合する連結および補助連結剤は、架橋剤に同時に結合し得る連結および補助連結剤により置換することができる。これらの代替実施形態において、標的複合体を形成する場合、架橋剤を連結剤および補助連結剤の混合物に含める。架橋剤は、用いられる場合、連結剤および補助連結剤に結合する。例えば、架橋剤は、連結剤に対する結合部位および補助連結剤に対する結合部位を含み、３つの成分、すなわち、架橋剤、連結剤および補助連結剤の組合せは、架橋複合体を含む。１つの実施形態において、架橋剤は、ストレプトアビジンまたはアビジン（それらのそれぞれがビオチンに対する４つの独立した結合部位を有するテトラマーである）であり、連結剤および補助連結剤は、架橋複合体が（ビオチン−（ストレプトアビジン（またはアビジン））−ビオチン）を含むように、それぞれビオチンである。

好ましい実施形態において、連結複合体は、連結剤Ｌ_Ａと補助連結剤Ｌ_Ａ’との間の結合反応により形成される。多重アッセイ方式は、分析対象物質Ａ、ＢおよびＣを検出するように構成することができ、したがって、それらの個々の分析対象物質と相互作用するように設計された試薬複合体は、Ｌ_ＡおよびＬ_Ａ’、Ｌ_ＢおよびＬ_Ｂ’ならびにＬ_ＣおよびＬ_Ｃ’から選択される連結剤および補助連結剤を含み得る。結合複合体を構築するために用いる連結剤／補助連結剤対のそれぞれは、同じまたは異なっていてもよい。好ましい実施形態において、連結剤／補助連結剤対のそれぞれは、同じ一組の試薬を含む。特に好ましい実施形態において、連結剤／補助連結剤対のそれぞれは、例えば、結合試薬上の連結剤としてのビオチン分子および補助連結剤としての標的物質上のストレプトアビジンもしくはアビジン分子を含む（または逆もまた同様に）。さらに、連結複合体は、結合試薬上のビオチン分子と標的物質上のストレプトアビジンもしくはアビジンとの間の結合反応によっても形成させることができ、ストレプトアビジンもしくはアビジン分子が、標的物質上のビオチン分子（架橋剤として作用する）との反応により標的物質に結合する。好ましい実施形態において、連結複合体がそれぞれ結合試薬および標的物質上のビオチン分子とストレプトアビジン分子との間（または逆もまた同様に）に形成されたならば、溶液中で化合し得るさらなる結合試薬と標的物質との間の交差反応性を防ぐために、過剰な遊離ビオチン分子を加えることができる。

（ｉｖ）固相
多種多様な固相が、結合アッセイの分野の通常の固相を含む本発明の方法に用いるのに適している。固相は、ポリマー（例えば、ポリスチレンおよびポリプロピレン）、セラミック、ガラス、複合材料（例えば、炭素ベースのインクのような炭素−ポリマー複合材料）を含む多種の材料により製造することができる。適切な固相は、アッセイ容器（例えば、試験管、キュベット、フローセル、カートリッジ、多ウエルプレートにおけるウエル等）の内面、スライド、アッセイチップ（遺伝子またはタンパク質チップ測定に用いられるものなど）などの巨視的物体の表面、ピンまたはプローブ、ビーズ、ろ過媒体、側方流動媒体（例えば、側方流動試験ストリップに用いられるろ過膜）等を含む。

適切な固相は、他の種類の粒子ベースのアッセイに一般的に用いられる粒子（コロイドまたはビーズを含むが、これらに限定されない）、例えば、磁気、ポリプロピレンおよびラテックス粒子、固相合成に一般的に用いられる材料、例えば、ポリスチレンおよびポリアクリルアミド粒子、ならびにクロマトグラフ応用分野で一般的に用いられる材料、例えば、シリカ、アルミナ、ポリアクリルアミド、ポリスチレンも含む。材料は、炭素小繊維であってもよい。ミクロ粒子は、無生物であってもよく、あるいは、細胞、ウイルス、細菌などのような有生の生物学的存在を含み得る。本発明の方法に用いる粒子は、１つまたは複数の結合試薬への結合に適し、例えば、遠心分離、重力、ろ過または磁気収集により収集することができる材料からなり得る。結合試薬に接着させることができる様々な異なる種類の粒子が結合アッセイ用に市販されている。これらは、非磁性粒子ならびに粒子を磁場により収集することを可能にする磁化できる材料を含む粒子を含む。１つの実施形態において、粒子は、導電性および／または半導電性物質、例えば、コロイド金粒子からなる。ミクロ粒子は、様々なサイズおよび形状を有し得る。例として、また制限なしに、ミクロ粒子は、５ｎｍから１００μｍまでのサイズであり得る。好ましくはミクロ粒子は、２０ｎｍから１０μｍまでのサイズを有する。粒子は、球形、楕円形、棒状等であってもよく、または形状が不規則であってもよい。

図６（ａ）〜（ｃ）に本発明に用いることができる様々な組の粒子を示す。図６（ａ）にそれぞれが異なる標的物質により修飾されている、１つまたは複数のバイアル、容器またはコンパートメント入りで提供される、一組の粒子を示す。あるいは、図６（ｂ）に示すように、結合試薬が、粒子の表面上の標的物質に結合している標的物質相補体との結合試薬を含む標的複合体（補助連結剤を連結することによる）で粒子に接着している、それぞれが異なる結合試薬により修飾されている、一組の粒子を１つまたは複数のバイアル、容器またはコンパートメント入りで提供することができる。さらに、図６（ｃ）に、サブセットがそれぞれが異なる結合試薬により修飾されている（図６（ｂ）に示すように）粒子を含み、サブセットがそれぞれが異なる標的物質により修飾されている（図６（ａ）に示すように）粒子を含む、一組の混合粒子を提供する他の実施形態を示す。図６（ｃ）に示す粒子は、事前に定められた一組の分析対象物質に対する結合試薬によりあらかじめ構成された粒子のサブセットおよびさらなる一組の分析対象物質に対するさらなる一組の結合試薬を接着させるように使用者により、すなわち、さらなる結合試薬を含むさらなる一組の標的複合体に粒子を結合させることにより修飾することができる構成されていない粒子のサブセットを含む。これらのさらなる試薬は、使用者により準備することができ、それにより、使用者が使用者により規定される一組のアッセイを事前に規定された一組のアッセイを加えることを可能にする。

本発明の方法に用いる粒子は、粒子の混合物中の特定の粒子または粒子の副次集団の識別を可能にするためにコード化することができる。そのようなコード化粒子の使用は、結合アッセイ用の固相担体として粒子を用いるアッセイの多重化を可能にするために用いられている。１つのアプローチにおいて、粒子を１つまたは複数の蛍光染料を含むように製造し、粒子の特定の集団を１つまたは複数の波長の蛍光発光の強度および／または相対強度に基づいて識別する。このアプローチは、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＭＡＰシステム（例えば、米国特許第６，９３９，７２０号参照）およびＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙシステムに用いられている。あるいは、粒子は、サイズ、形状、組み込まれた光学的パターンなどのような他の物理的特性の差によりコード化することができる。図６（ａ）〜（ｃ）における粒子の平行線模様により示されているように、粒子の混合物または組で準備される１つまたは複数の粒子は、粒子の光学的特性、サイズ、形状、組み込まれた光学的パターンなどにより混合物中の他の粒子と識別されるようにコード化することができる。

あるいはまたはさらに、別個のアッセイシグナルが各結合ドメイン上で発生し、したがって、それらのドメインに結合した異なる分析対象物質を独立に測定することができるように、結合試薬は、結合アッセイにおけるように、結合試薬複合体を介して１つまたは複数の固相上の異なる別個の結合ドメインに結合させることができる。そのような実施形態の１つの例において、結合ドメインは、個々のドメイン上に構築された結合試薬複合体を介して、対象の分析対象物質に結合するように構成されている標的物質の別個のドメインを、１つまたは複数の表面上に固定化することによって準備する。場合により、表面（単数または複数）は、試料を保持しているまたは試料が通過する容器（例えば、フローセル、ウエル、キュベット等）の１つまたは複数の境界を一部定義し得る。好ましい実施形態において、個々の結合ドメインは、電気化学または電気化学発光アッセイに用いる電極上に形成させる。電気化学発光を用いた複数の結合ドメインを含む表面上の分析対象物質の多重化測定は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ、ＭＵＬＴ−ＡＲＲＡＹ（登録商標）およびＳＥＣＴＯＲ（登録商標）イメージャーラインおよび製品において用いられている（その開示を参照によってその全体として本明細書に組み入れる、例えば、米国特許第７，８４２，２４６号および第６，９７７，７２２号参照）。

図６（ｄ）〜（ｆ）に本発明に用いることができる異なる結合ドメインを含む様々な代替プレート方式を例示する。図６（ｄ）にそれぞれが異なる標的物質で修飾されている複数の結合ドメインを有する表面を示す。あるいは、図６（ｅ）に示すように、結合試薬が、結合ドメイン上の標的物質に結合している標的物質相補体に対する結合試薬（補助連結剤を連結することによる）を含む標的複合体における結合ドメインに結合している、それぞれが異なる結合試薬で修飾されている複数の結合ドメインを有する表面を準備することができる。さらに、図６（ｆ）に、サブセットが、それぞれが異なる結合試薬で修飾されている（図６（ｅ）におけるように）結合ドメインを含み、サブセットが、それぞれが異なる標的物質で修飾されている（図６（ｄ）におけるように）結合ドメインを含む、表面上の混合された一組の結合ドメインを準備する他の実施形態を示す。図６（ｆ）に示す結合ドメインは、事前に定められた一組の分析対象物質に対する結合試薬を用いて事前に構成された結合ドメインのサブセットと、さらなる一組の分析対象物質に対するさらなる一組の結合試薬を結合するように、すなわち、これらの構成されていない結合ドメインをさらなる結合試薬を含むさらなる一組の標的複合体に結合させることによって、使用者により修飾することができる構成されていない結合ドメインのサブセットとを含む。これらのさらなる試薬は、使用者により準備され、それにより、使用者が事前に規定されたアッセイに一組の使用者により規定されるアッセイを加えることを可能にし得る。

試薬、すなわち、標的物質は、公知の方法、例えば、粒子を修飾するためのまたはアッセイを構成するための確立された方法により表面に結合させることができる。表面にタンパク質またはオリゴヌクレオチドを接着させる方法の１つの非限定的な例を図７に示す。この方法は、十分に確立されたヘテロ二官能性架橋剤である、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）を使用する。ＳＭＣＣのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）との反応は、ＢＳＡをチオール反応性マレイミド基で標識する。マレイミド基は、次に、チオール修飾オリゴヌクレオチドと反応して、安定なチオエーテル基を介して連結しているＢＳＡ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを形成する。これらの試薬のアレイは、タンパク質（ＢＳＡなどの）を吸着するまたはそれと反応し、それにより関連オリゴヌクレオチドのパターン化されたアレイを発生させる、表面上の試薬の印刷パターンにより形成することができる。１つの特定の例において、アレイは、黒鉛状炭素表面、好ましくはスクリーン印刷カーボンインク電極上にＢＳＡ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのアレイを印刷することにより形成する。驚くべきことに、我々は、チオール修飾オリゴヌクレオチドを含むチオール修飾試薬がスクリーン印刷カーボンインク電極を含む黒鉛状炭素表面と不可逆的に反応すること（ＢＳＡなどのタンパク質にコンジュケートされていない場合でさえ）を見いだした。したがって、チオール修飾試薬（チオール修飾オリゴヌクレオチドおよびペプチドを含む）は、炭素表面を試薬を含む溶液とともにインキュベートし、試薬を表面と不可逆的に反応させることによって炭素表面上に固定化することができる。さらに、そのようなチオール修飾試薬のアレイ（チオール修飾オリゴヌクレオチドおよび／またはペプチドを含むアレイを含む）は、これらの試薬を含む溶液を炭素表面上に印刷し、表面上のパターン化溶液をインキュベートし、試薬を表面と不可逆的に反応させることによって形成することができる。

（ｖ）アッセイ装置および補助試薬
本発明の方法は、様々なアッセイ装置および／または方式に用いることができる。アッセイ装置は、例えば、アッセイが進行するときに加えられるまたはアッセイモジュールのウエル、チャンバーもしくはアッセイ領域に事前に装入されるアッセイ試薬（標的物質または他の結合試薬を含み得る）を有するアッセイプレート、カートリッジ、多ウエルプレート、反応容器、試験管、キュベット、フローセル、アッセイチップ、側方流動装置等のようなアッセイモジュールを含み得る。これらの装置は、特異的結合アッセイ、例えば、免疫測定法または免疫クロマトグラフ測定法の様々なアッセイ方式を用い得る。例示のアッセイ装置および方式が、本明細書において以下で述べられる。特定の実施形態において、本発明の方法は、乾燥状態で保存されているアッセイ試薬を用い得るものであり、アッセイ装置／キットは、アッセイ試薬を乾燥状態に維持するための乾燥材料をさらに含みまたは乾燥材料とともに供給され得る。アッセイ試薬を事前に装入したアッセイ装置は、保存中の優れた安定性を維持すると同時にアッセイ測定の迅速性を著しく改良し、その複雑さを低減し得る。乾燥アッセイ試薬は、乾燥し、アッセイに使用する前に再構成することができる。これらは、結合アッセイに有用な結合試薬、酵素、酵素基質、指示染料および対象の分析対象物質を検出するために用いることができる他の反応性化合物を含むが、これらに限定されていない。アッセイ試薬はまた、ブロッキング剤、安定化剤、洗剤、塩、ｐＨ緩衝剤、保存剤等を含むが、これらに限定されない、検出の機構に直接関与しないが、アッセイにおいて補助的役割を果たす物質を含み得る。試薬は、遊離形で、あるいはアッセイモジュールにおけるコンパートメント（例えば、チャンバー、チェンネル、フローセル、ウエル等）の表面またはコロイド、ビーズもしくは他の粒子状担体の表面を含む固相上に担持されて存在し得る。

（ｖｉ）測定方法
本発明の方法は、分析対象物質の量を測定する、特に、固相に結合した分析対象物質の量を測定する様々な方法とともに用いることができる。用いることができる技術は、培養ベースのアッセイ、結合アッセイ（凝集試験、免疫測定法、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ等を含む）、酵素アッセイ、比色分析等のような当技術分野で公知の技術を含むが、これらに限定されない。他の適切な技術は、当技術分野の平均的技術者には直ちに明らかであろう。一部の測定技術は、測定を目視検査により行うことを可能にし、他の測定技術は、測定を行うための機器を必要としまたはその使用が有効であり得る。

分析対象物質の量を測定する方法は、ｉ）表面への分析対象物質の結合の後の表面における質量または屈折率の変化を測定する技術（例えば、弾性表面波技術、表面プラズモン共鳴センサー、偏光技術等）、ｉｉ）質量分析技術（表面上の分析対象物質を測定することができるＭＡＬＤＩ、ＳＥＬＤＩ等のような技術を含む）、ｉｉｉ）クロマトグラフまたは電気泳動技術、ｉｖ）蛍光技術（分析対象物質の固有蛍光に基づき得る）等を含むが、これらに限定されない、標識を用いない技術を含む。

分析対象物質の量を測定する方法は、分析対象物質に直接または間接的に付着させることができる（例えば、分析対象物質の標識付き結合相手の使用により）標識の検出により分析対象物質を測定する技術も含む。適切な標識は、直接的に視覚化することができる標識（例えば、視覚的に見ることができる粒子ならびに光散乱、吸光度、蛍光、化学発光、電気化学発光、放射能、磁場等のような測定可能なシグナルを発生する標識）を含む。用いることができる標識は、光散乱、吸光度、蛍光等のような測定可能なシグナルをもたらす化学活性を有する酵素または他の化学的に反応性の種も含む。標識としての酵素の使用は、ＥＬＩＳＡｓ、酵素免疫測定法またはＥＩＡｓとも呼ばれている、酵素結合免疫吸着測定法において十分に確立されている。ＥＬＩＳＡ方式において、未知量の抗原を表面に付着させ、次いで、特異抗体が抗原に結合し得るように特異抗体を表面上に流す。この抗体を酵素に結合させ、最終工程において、酵素が、検出可能なシグナルの変化をもたらす生成物に変換する物質を加える。生成物の形成は、例えば、吸光度、蛍光、化学発光、光散乱等のような測定可能な特性の基質と比較した差により検出することができる。本発明による固相結合法とともに用いることができる特定の（ただし、すべてではない）測定方法は、固相から非結合成分（例えば、標識）を除去するための洗浄工程が有効または必要である。したがって、本発明の方法は、そのような洗浄工程を含み得る。

１つの実施形態において、試料中の対象の分析対象物質（単数または複数）は、電気化学発光ベースのアッセイ方式、例えば、電気化学発光（ＥＣＬ）ベースの免疫測定法を用いて測定することができる。ＥＣＬの高い感度、広いダイナミックレンジおよび選択性は、医学診断の重要な因子である。市販のＥＣＬ機器は、例外的な性能を示し、それらの優れた感度、ダイナミックレンジ、精度および複雑試料マトリクスの耐性を含む理由のために広く用いられるようになった。ＥＣＬを放射するように誘導することができる種（ＥＣＬ活性種）は、ＥＣＬ標識として用いられており、例えば、ｉ）金属が例えば、トリスビピリジルルテニウム（ＲｕＢｐｙ）部分のようなＲｕ含有およびＯｓ含有有貴金属化合物を含むＶＩＩＩ族の金属に属する有機金属化合物ならびにｉｉ）ルミノールおよび関連化合物などである。ＥＣＬ標識とともにＥＣＬ過程に関与する種は、本明細書でＥＣＬ共反応物と呼ぶ。一般的に用いられる共反応物は、ＲｕＢｐｙからのＥＣＬ用の第三級アミン（例えば、米国特許第５，８４６，４８５号参照）、シュウ酸塩および過硫酸塩ならびにルミノールからのＥＣＬ用の過酸化水素（例えば、米国特許第５，２４０，８６３号参照）を含む。ＥＣＬ標識により発生する光は、診断処置におけるリポーターシグナルとして用いることができる（例えば、参照によって本明細書に組み入れる、Ｂａｒｄら、米国特許第５，２３８，８０８号）。例えば、ＥＣＬ標識は、抗体、核酸プローブ、受容体またはリガンドのような結合試薬に共有結合させることができ、結合相互作用における結合試薬の関与は、ＥＣＬ標識から放射されるＥＣＬを測定することによりモニターすることができる。あるいは、ＥＣＬ活性化合物からのＥＣＬシグナルは、化学的環境を示すものであり得る（例えば、ＥＣＬ共反応物の形成または破壊をモニターするＥＣＬアッセイを記載している、米国特許第５，６４１，６２３号参照）。ＥＣＬ、ＥＣＬ標識、ＥＣＬアッセイに関するさらなる背景およびＥＣＬアッセイを行うための器具類については、すべてを参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第５，０９３，２６８号、第５，１４７，８０６号、第５，３２４，４５７号、第５，５９１，５８１号、第５，５９７，９１０号、第５，６４１，６２３号、第５，６４３，７１３号、第５，６７９，５１９号、第５，７０５，４０２号、第５，８４６，４８５号、第５，８６６，４３４号、第５，７８６，１４１号、第５，７３１，１４７号、第６，０６６，４４８号、第６，１３６，２６８号、第５，７７６，６７２号、第５，３０８，７５４号、第５，２４０，８６３号、第６，２０７，３６９号、第６，２１４，５５２号および第５，５８９，１３６号ならびにＰＣＴ国際公開特許番号ＷＯ９９／６３３４７、ＷＯ００／０３２３３、ＷＯ９９／９８９６２、ＷＯ９９／３２６６２、ＷＯ９９／１４５９９、ＷＯ９８／１２５３９、ＷＯ９７／３６９３１およびＷＯ９８／５７１５４を参照のこと。

本発明の方法は、シングルプレックス方式または複数のアッセイ測定が単一試料において実施されるマルチプレックス方式に適用することができる。本発明により用いることができるマルチプレックス測定は、ｉ）複数のセンサーの使用を必要とする；ｉｉ）表面上の位置に基づいて識別することができる表面上の個別のアッセイドメイン（例えば、アレイ）を用いる；ｉｉｉ）サイズ、形状、色等のような粒子特性に基づいて識別することができる粒子上に被覆された試薬の使用を必要とする；ｉｖ）光学的特性に基づいて識別することができるアッセイシグナル（例えば、吸光度または発光スペクトル）をもたらすまたはｖ）アッセイシグナルの時間的特性（例えば、シグナルの時間、周波数または位相）に基づくマルチプレックス測定を含むが、これらに限定されない。

（ｖｉｉ）キット
１つの実施形態において、本発明は、それぞれが第１および第２の標的物質、例えば、第１および第２のオリゴヌクレオチドを含む複数の別個の結合ドメインを含む、表面、例えば、多ウエルプレートまたは複数の粒子ならびに別個のバイアル、容器またはコンパートメント入りの、連結剤に結合した第１のオリゴヌクレオチド相補体および第２の連結剤に結合した第２のオリゴヌクレオチド相補体を含むキットを提供する。好ましい実施形態において、（ｉ）第１の標的物質および第１の標的物質相補体は、標的物質の第１の対を構成し、（ｉｉ）第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、標的物質の第２の対を構成する。好ましくは、標的物質の第１および第２の対は、表１に示す配列の対から選択される、それぞれオリゴヌクレオチドの第１および第２の対を含む。

キットは、表１（ａ）および／または表１（ｂ）に示す配列から選択される異なる配列を含む少なくとも４種のオリゴヌクレオチドを、別個のバイアル、容器またはコンパートメント入りで、さらに含む。これらの配列は、異なる対から選択される４種の配列を含み得るまたは対の複数のメンバーを含み得る。

キットは、少なくとも７、１０、１６または２５種の表面結合オリゴヌクレオチドおよび対応するオリゴヌクレオチド相補体を含み得る。標的物質相補体として使用するために構成されたオリゴヌクレオチドは、抗体などの結合試薬に事前に結合された状態で準備することができまたは使用者による結合試薬への結合のために連結剤で修飾された状態で準備することができる。場合により、キットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチド相補体を異なる結合試薬、例えば、抗体に結合させる。表面結合オリゴヌクレオチドは、異なるオリゴヌクレオチド配列が別個の結合ドメインに固定化されるように各結合ドメインに固定化された複数の少なくとも５種（７、１０、１６または２５種）のオリゴヌクレオチドを含むアレイに組み込むことができる。特定の実施形態において、多ウエルプレートは、プレートの少なくとも１つのウエル内に本明細書で述べたオリゴヌクレオチドアレイの１つまたは複数のコピーを含み得る。ここで、該アレイは、複数の結合ドメインに配置されている。プレートは、少なくとも２４、９６または３８４ウエルを含み得、アレイは、少なくとも７種のオリゴヌクレオチド、または少なくとも１０、１６もしくは２５種のオリゴヌクレオチドを含み得る。

特定の実施形態において、キットは、プレートの少なくとも１つのウエル内にオリゴヌクレオチドアレイの１つまたは複数のコピーを有する多ウエルプレートを含み、アレイは、複数の結合ドメイン上に配置され、ここで、１つまたは複数、場合により、少なくとも４つの結合ドメインがその上に固定化された表１（ａ）に示す一連の配列対からの異なる配列対から選択される異なるオリゴヌクレオチド配列を有する。特定の実施形態において、キットは、プレートの少なくとも１つのウエル内にオリゴヌクレオチドアレイの１つまたは複数のコピーを有する多ウエルプレートを含み、アレイは、複数の結合ドメイン上に配置され、ここで、１つまたは複数、場合により、少なくとも４つの結合ドメインは、その上に固定化された表１（ａ）に示す配列対の組からの異なる配列対から選択される異なるオリゴヌクレオチド配列を有する。キットは、表１（ａ）、特定の実施形態において表１（ｂ）における配列対の組から選択される２つ以上のオリゴヌクレオチドからなるさらなる組のオリゴヌクレオチドをさらに含み得る。ここで、さらなるオリゴヌクレオチドは、固定化されたオリゴヌクレオチドに対して相補的である。

キットは、以下のものを含む１つまたは複数のさらなる容器、器またはコンパートメントをさらに含む：（ｉ）第１の結合試薬が試料中の第１の分析対象物質に対して特異的である、第１の連結剤を含む第１の結合試薬、（ｉｉ）別個の容器、器もしくはコンパートメント入りでまたは（ｉ）の成分として提供される、補助連結剤を含む第１の標的物質相補体、（ｉｉｉ）第２の結合試薬が試料中の第２の分析対象物質に対して特異的である、第２の連結剤を含む第２の結合試薬、および（ｉｖ）別個の容器、器もしくはコンパートメント入りでまたは（ｉｉｉ）の成分として提供される、第２の補助連結剤を含む第２の標的物質相補体。

あるいは、本発明は、試料中の複数の異なる分析対象物質を測定するためのキットを提供するものであって、キットは以下のものを含む：（ａ）固体担体の第１の領域に固定化された第１の標的物質および前記固体担体の第２の領域に固定化された第２の標的物質を含む固体担体を含む容器、器またはコンパートメント；ならびに（ｂ）以下のものを含む１つまたは複数のさらなる容器、器またはコンパートメント：（ｉ）第１の連結剤を含む第１の結合試薬で、前記第１の結合試薬が前記試料中の第１の分析対象物質に対して特異的である、（ｉｉ）別個の容器、器もしくはコンパートメント入りでまたは（ｂ）（ｉ）の成分として提供される、補助連結剤を含む第１の標的物質相補体、（ｉｉｉ）第２の連結剤を含む第２の結合試薬であって、前記第２の結合試薬が前記試料中の第２の分析対象物質に対して特異的である、および（ｉｖ）別個の容器、器もしくはコンパートメント入りでまたは（ｂ）（ｉｉｉ）の成分として提供される、第２の連結剤相補体を含む第２の標的物質相補体。

本発明はまた、試料中の複数の異なる分析対象物質を測定するためのキットを企図するものであって、キットは以下のものを含む：（ａ）前記固体担体の第１の領域に固定化された第１の標的物質および前記固体担体の第２の領域に固定化された第２の標的物質を固体担体上に含む容器、器またはコンパートメント；ならびに（ｂ）以下のものを含む４つ以上のさらなる容器、器またはコンパートメント：（ｉ）第１の連結剤を含む第１の結合試薬を含む第１の容器で、前記第１の結合試薬が前記試料中の第１の分析対象物質に対して特異的である、（ｉｉ）別個の容器、器もしくはコンパートメント入りで提供される、補助連結剤を含む第１の標的物質相補体を含む第２の容器、（ｉｉｉ）第２の連結剤を含む第２の結合試薬を含む第３の容器で、前記第２の結合試薬が前記試料中の第２の分析対象物質に対して特異的である、および（ｉｖ）別個の容器、器もしくはコンパートメント入りで提供される、第２の補助連結剤を含む第２の標的物質相補体を含む第４の容器。

さらに、本発明は、試料中の複数の異なる分析対象物質を測定するためのキットを提供するものであって、キットは以下のものを含む：（ａ）固体担体の第１の領域に固定化された第１の標的物質および固体担体の第２の領域に固定化された第２の標的物質を固体担体上に含む容器、器またはコンパートメント；ならびに（ｂ）以下のものを含む２つ以上のさらなる容器、器またはコンパートメント：（ｉ）第１の結合試薬が試料中の第１の分析対象物質に対して特異的である、第１の連結剤を含む第１の結合試薬、および補助連結剤を含む第１の標的物質相補体を含む第１の容器、ならびに（ｉｉ）第２の結合試薬が前記試料中の第２の分析対象物質に対して特異的である、第２の連結剤を含む第２の結合試薬、および第２の補助連結剤を含む第２の標的物質相補体を含む第２の容器。

特定の実施形態において、本発明は、以下のものを含むキットを提供する：それぞれが第１および第２のオリゴヌクレオチドをそれぞれ含む複数の別個の結合ドメインを含む多ウエルプレートで、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドが表１（ａ）および／または（ｂ）に示す配列からなる群から選択される。

キットは、複数の分析対象物質の結合アッセイを行う方法における多ウエルプレートの使用説明書も含み得るものであって、前記方法は、以下の工程を含む：
（ａ）前記複数の分析対象物質における第１の分析対象物質に対して特異的な第１の結合試薬および前記第１のオリゴヌクレオチドを含む第１の結合試薬複合体を形成する工程であって、前記第１の結合試薬が連結剤に結合し、前記第１のオリゴヌクレオチドが補助連結剤に結合し、前記第１の結合試薬複合体が前記連結剤と前記補助連結剤との間の反応により形成される、工程と、
（ｂ）前記複数の分析対象物質における第１の分析対象物質に対して特異的な第２の結合試薬および前記第２のオリゴヌクレオチドを含む第２の結合試薬複合体を形成する工程であって、前記第２の結合試薬が第２の連結剤に結合し、前記第２のオリゴヌクレオチドが第２の補助連結剤に結合し、前記第２の結合試薬複合体が前記第２の連結剤と前記第２の補助連結剤との間の反応により形成される、工程と、
（ｃ）第１および第２の結合試薬複合体を、それぞれがそれぞれ第１のオリゴヌクレオチド相補体および第２のオリゴヌクレオチド相補体に連結された２つ以上の結合ドメインと、前記第１のオリゴヌクレオチドを前記第１のオリゴヌクレオチド相補体に、前記第２のオリゴヌクレオチドを前記第２のオリゴヌクレオチド相補体に結合させるのに十分な条件下で、混合する工程と、
（ｄ）前記複数の分析対象物質を含む試料を工程（ｃ）で形成された混合物と混合する工程と、
（ｅ）複数のさらなる結合試薬を工程（ｄ）で形成された混合物に加える工程であって、前記複数のさらなる結合試薬が（ｉ）第１の分析対象物質および／または第１の結合試薬−第１の分析対象物質複合体に対して特異的な第１の検出試薬ならびに（ｉｉ）第２の分析対象物質および／または第２の結合試薬−第２の分析対象物質複合体に対して特異的な第２の検出試薬を含む、工程と、
（ｆ）前記結合ドメインに結合した第１および第２の分析対象物質の量を測定する工程。

１つの特定の実施形態において、多ウエルアッセイプレートは、最終使用者開発アッセイパネル、すなわち、プレートを用いるアッセイを行うために最終使用者の結合試薬を用いて最終使用者により構築されるアッセイパネルを構成するために用いることができる。この実施形態において、最終使用者は、どの結合試薬を各結合ドメインに結合させるかを指定する。第１の標的物質を含む第１の結合ドメインおよび第２の標的物質を含む第２の結合ドメインならびに、場合により、さらなる標的物質を含むさらなる結合ドメインを含む複数の別個の結合ドメインを含む多ウエルアッセイプレートを提供する。結合ドメインのそれぞれは、本明細書で述べたように、結合試薬複合体により複数の結合ドメインのそれぞれに結合する個々の結合試薬を選択することにより使用者により機能的にされる。別個のバイアル、容器またはコンパートメント入りで、第１の標的物質相補体、第２の標的物質相補体および場合によりさらなる標的物質相補体を含む一組の標的試薬（それぞれが連結剤に結合した）を提供する。第１の標的物質および第１の標的物質相補体ならびに第２の標的物質および第２の標的物質相補体は、それぞれ標的物質の第１および第２の対を構成する。同様に、あらゆるさらなる標的物質相補体は、結合ドメイン上の種々の標的物質と対を構成する。１つの好ましい実施形態において、標的物質および標的物質相補体は、オリゴヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチドおよびその相補体）である。この実施形態において、標的物質の第１および第２の対ならびに標的物質のさらなる対は、表１（ａ）および／または表１（ｂ）に収載した配列のリストから選択される。

したがって、使用者は、どの標的物質／標的物質相補体がそれぞれの特定の結合ドメインに結合するかを選択する。使用者はまた、どの結合試薬がそれぞれの特定の結合ドメインに結合し、指定の結合ドメインに結合した標的物質の標的物質相補体を含む結合試薬複合体を形成するかを選択する。

キットは、使用者が補助連結剤を使用者の結合試薬に結合させるための試薬を備え得る。ビオチンが補助連結剤である場合、キットは、ＮＨＳエステルまたはヒドラジドまたはマレイミドのような反応性官能基で修飾されたビオチンを含み得る。プレートおよび／または標的試薬の組は、検出可能な標識を検出試薬のようなアッセイ成分に結合させるためのラベリングキットをさらに含み得る。例えば、多ウエルアッセイプレートが電気化学発光反応を行うように構成されている場合、ラベリングキットは、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）ＮＨＳエステル、ＬＣ−ビオチンＮＨＳエステル、場合よるスピンカラムおよび場合よるラベリング緩衝液を含み得る。さらにＥＣＬ読み取り緩衝液ならびに場合よるアッセイおよび抗体希釈剤を提供することができる。

標的試薬の組は、好ましくは多ウエルプレートに存在する結合ドメインの数に見合う量の標的試薬を含む。例えば、多ウエルプレートが１０個の別個の結合ドメインを含む場合、１０種の標的試薬の一組を当該多ウエルプレートについて使用する。

標的物質は、補助連結剤に直接結合する連結剤、例えば、補助連結剤がビオチンである場合には、ストレプトアビジンまたはアビジンとともに提供することができる。連結剤および補助連結剤が架橋剤を介して連結されるように構成されている場合（例えば、連結および補助連結剤の両方がビオチンである場合）、キットは、結合試薬を標的物質相補体に結合させるために用いることができる架橋試薬溶液（例えば、ストレプトアビジンまたはアビジンの溶液）も備え得る。キットは、連結／架橋反応の適切な条件をもたらす反応緩衝液および反応停止溶液も備え得る。１つまたは複数の連結試薬がビオチンである場合、停止溶液は、連結剤、補助連結剤または架橋剤として存在するストレプトアビジンまたはアビジンにおける未使用のビオチン結合部位をブロックするための遊離のビオチンを含み得る。

この実施形態において、使用者は、結合試薬、例えば、捕捉および検出抗体を供給し、どの結合試薬が結合ドメインのそれぞれに結合するかを指定する。結合試薬、例えば、捕捉抗体を、選択された連結剤、例えば、ビオチンにより標識し、補助連結剤、例えば、ストレプトアビジンを介して標的物質対のメンバーに結合させる。その間に、標的物質を選択された結合ドメインに結合させることによってプレートを準備する。修飾結合試薬は、表面に接触して、結合試薬により認識される分析対象物質のその後の結合アッセイに用いることができる表面に結合した結合試薬複合体を形成する。対象の分析対象物質は、結合ドメインを標識結合試薬と接触させ、当該結合ドメインに存在する標識の存在を測定することによって検出される。

あるいは、多ウエルアッセイプレートを、例えば、入手可能な多重化アッセイパネルのカタログからの使用者の仕様に基づいて構成することができ、かつ／または使用者が一組の分析対象物質を選択して、当該一組の分析対象物質の使用者向けにカスタマイズされた多重化アッセイを構成することができる。多重化アッセイパネルは、個々のアッセイがともに十分に機能するように、選択し、最適化すべきである。例えば、試料は、アッセイする前に希釈を必要とし得る。試料マトリックス効果を最小限にし、パネルにおけるすべての分析対象物質がアッセイのダイナミックレンジ内にある可能性を最大限にするために、対象の特定の試料マトリックスの試料希釈度を所定のパネルについて最適化する。好ましい実施形態において、パネルにおけるすべての分析対象物質を少なくとも１つの試料型について同じ試料希釈度を用いて分析する。他の好ましい実施形態において、パネルにおけるすべての分析対象物質をほとんどの試料型について同じ希釈度を用いて測定する。

所定の免疫測定法について、検出抗体の濃度および検出抗体のタンパク質当たりの検出可能な標識の数（Ｌ／Ｐ比）は、すべての分析対象物質の予想されるレベルを同じ試料希釈度での定量可能な範囲に入れるように調整する。所定の分析対象物質の定量可能な範囲の上限を増加させることを望む場合、Ｌ／Ｐ比を低下させ、かつ／または検出抗体濃度を低下させることができる。他方で、定量可能な範囲の下限を増加させることを望む場合、Ｌ／Ｐを増加させることができ、検出抗体濃度は、飽和レベルでなく、かつ／またはバックグラウンドシグナルを低下させることができる場合、増加させることができる。

アッセイパネルとともに用いる校正標準は、パネルの推奨試料希釈度に対する適切な定量可能範囲を得るように選択する。校正標準は、パネルにおける既知濃度の１つまたは複数の分析対象物質を有する。未知試料中の分析対象物質の濃度は、これらの標準との比較により決定される。１つの実施形態において、校正標準は、アッセイパネルにより測定される異なる分析対象物質の混合物を含む。好ましくは、合成キャリブレータ（combined calibrator）中の分析対象物質レベルは、各分析対象物質のアッセイシグナルが同等、例えば、２倍、５倍または１０倍以内であるように選択する。他の実施形態において、校正標準は、複数の異なるアッセイパネルからの分析対象物質の混合物を含む。

校正曲線は、例えば、直線当てはめ、４パラメーターロジスティック（４−ＰＬ）および５パラメーター（５−ＰＬ）当てはめのような当技術分野で公知の曲線当てはめを用いて校正標準とともに測定したアッセイシグナルに当てはめることができる。そのような当てはめを用いて、測定アッセイシグナルを計算当てはめにバックフィトすることにより未知試料中の分析対象物質の濃度を決定することができる。校正標準を用いた測定は、検出限界（ＬＯＤ）、定量限界（ＬＯＱ）、ダイナミックレンジおよび直線性限界（ＬＯＬ）のようなアッセイ特性を決定するためにも用いることができる。

多重化パネルの開発の一部として、キャリブレータおよび検出抗体の非特異的結合を低減するためにアッセイを最適化する。サンドイッチ免疫測定法において、特異性は、主として捕捉抗体結合によってもたらされる。多重化パネルを評価するためのいくつかの考慮すべき事項は、以下の事項を含む：（ａ）捕捉抗体への検出抗体の非特異的結合をパネルにおけるアッセイのより低いバックグラウンドまで減少させる、これは、検出抗体の濃度およびＬ／Ｐを調整することによって達成することができる；（ｂ）パネルにおける他のキャリブレータへの検出抗体の非特異的結合も望ましくなく、最小限にすべきである；（ｃ）パネルにおける他のキャリブレータおよび他の関連分析対象物質の非特異的結合を最小限にすべきである；キャリブレータの非特異的結合が存在する場合、それは、パネルにおけるアッセイの全般的特異性を低下させることがあり得、また捕捉抗体に結合するキャリブレータの競合があるので、信頼できない結果ももたらし得る。

１つの特定の実施形態において、キットは、アッセイプロトコールの適正な工程が順守されることを保証するための１つまたは複数の試薬をさらに含む。さらに、アッセイ工程の変動は、アッセイに無関係に測定することができる。この実施形態において、アッセイを行うために用いられる希釈剤で希釈された一連の相補的オリゴヌクレオチドがキットに備えられている。適正な工程が実施されているとき、種々の希釈剤中のオリゴヌクレオチドは、結合して、鎖を伸長させる。最終希釈剤は、アッセイの成功した処理の検出可能な指標となるリポーターまたは標識付きの最終の相補的オリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、多ウエルプレートの第１の結合ドメインが配列Ａを有するＢＳＡ−オリゴヌクレオチドで被覆されている。アッセイ希釈剤は、配列Ａに相補的なオリゴヌクレオチド配列Ａ’およびさらなる配列Ｂを含む。ＡとＢは、互いに相互作用せず、それらの相補体とのみ特異的に相互作用する。最終希釈剤は、オリゴヌクレオチドＢの相補体Ｂ’を含む補助オリゴヌクレオチドおよび検出可能な標識を含む。したがって、第１の結合ドメインからの検出可能なシグナルは、試料が加えられたことまたは検出部分が加えられたことを確認するために用いることができる。発生したシグナルは、適正な容積および濃度の試薬が加えられたかどうか、ならびに試料の取り扱い手順および／または装置の変動が存在したかどうかを検出するためにも用いることができる。方法に用いられるオリゴヌクレオチド鎖は、複数の重複配列を含み得る。

パネルにおける異なるアッセイが異なるインキュベーション時間および最適な機能達成能力のための試料取扱い要件を必要とし得る。したがって、目標は、パネルにおける大部分のアッセイについて最適化されているプロトコールを選択することである。アッセイプロトコールの最適化は、１つまたは複数の以下のプロトコールパラメーターを調節することを含むが、これに限定されない：タイミング（各工程のインキュベーション時間）、調製手順（キャリブレータ、試料、対照等）および洗浄工程の数。

本発明のこれらおよび他の実施形態は、以下の非限定的な実施例で例示する。

直接アッセイ方式
直接アッセイ用の多ウエルプレートの調製および使用の手順を図２に例示する。実験レイアウト、すなわち、どのオリゴヌクレオチド配列を多ウエルアッセイプレートのどの結合ドメインに配置したかを示した。多ウエルアッセイプレートは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）の一部門であるＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙから入手した。それぞれの個別のオリゴヌクレオチド配列相補体の希釈標準溶液（５５０μＬ）は、配列相補体の保存溶液をＤｉｌｕｅｎｔ １００で約５０倍希釈することによって調製した（オリゴヌクレオチド配列相補体の保存溶液およびＤｉｌｕｅｎｔ １００は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙから入手できる）。

各捕捉抗体は、図５（ｄ）に示すように二官能性カップリング試薬（スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−１−シクロヘキサンカルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）および通常のカップリングプロトコールを用いて末端チオール基を有するオリゴヌクレオチドにより標識した。例えば、タンパク質をＳＭＣＣにおけるＮＨＳ−エステルと反応させて、タンパク質を標識し、得られた複合体をＳＭＣＣにおけるマレイミド基と反応するチオール化オリゴヌクレオチドと反応させる。次いで、一組の抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのプールした溶液（５０μＬ）を多ウエルプレートの各ウエルのハイブリダイゼーション緩衝液に室温で１時間加えて、相補的オリゴヌクレオチド配列をハイブリダイズし、それにより、捕捉抗体を多ウエルプレートに固定化して、複数の結合試薬複合体を形成した。

複数の分析対象物質を含む溶液（２５μＬのＭＳＤ Ｄｉｌｕｅｎｔ ２とＭＳＤ Ｄｉｌｕｅｎｔ ２の２５μＬキャリブレータ溶液）を調製済みプレートの各ウエルに加え、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、一組の標識検出抗体（５０μＬのＭＳＤ Ｄｉｌｕｅｎｔ ３）を多ウエルプレートの各ウエルに加えた。プレートを振とうしながらインキュベートし、ウエルをＰＢＳで３回洗浄し、１５０μＬのＲｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を満たし、ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ装置で分析した。

このプロトコールを用いて、７プレックスケモカインパネルについてアッセイを行い、結果を図８（ａ）〜（ｇ）に示す。この実験でアッセイした分析対象物質は、エオタキシン、ＭＩＰ−１ｂ、ＴＡＲＣ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−４、ＩＰ−１０およびＭＣＰ−１（すべてがヒト分析対象物質）であった。さらに、このプロトコールを用いて、ＩＦＮｇ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３およびＩＮＦａ（すべてがヒト分析対象物質）を含む１０プレックスＴＨ１／ＴＨ２パネルについてアッセイを行った。両アッセイの結果をオリゴヌクレオチドリンカーが存在しない標準直接免疫測定法と比較した。

オリゴヌクレオチド−ＳＡコンジュゲートを用いた間接アッセイ方式
オリゴヌクレオチド−ＳＡコンジュゲートを用いた間接アッセイ用の多ウエルプレートの調製および使用の手順を図９（ａ）〜（ｃ）に例示する。多ウエルアッセイプレートの実験レイアウトを実施例１と同様に示した。ストレプトアビジン（ＳＡ）に結合したそれぞれの個別のオリゴヌクレオチド配列相補体の希釈標準溶液（５５０μＬ）は、配列相補体の保存溶液をＤｉｌｕｅｎｔ １００で約５０倍希釈することによって調製した（オリゴヌクレオチド配列相補体の保存溶液およびＤｉｌｕｅｎｔ １００は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙから入手できる）。ビオチニル化抗体の溶液をオリゴヌクレオチド配列相補体の所望の希釈標準溶液に加えて、一組の個別のビオチニル化捕捉抗体／オリゴヌクレオチド−ＳＡ混合物を調製した。混合物中のビオチニル化抗体の濃度は、約５〜３０μｇ／ｍＬの範囲にあった。混合物を室温で３０〜４５分間緩やかに混合した。５０μＬのビオチン溶液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）（約３倍過剰のビオチン）をそれぞれの個別のビオチニル化抗体／オリゴヌクレオチド相補体混合物に加え、この混合物を室温で１０〜１５分間緩やかに混合した。等量（５５０μＬ）の個別のビオチニル化抗体／オリゴヌクレオチド相補体を混ぜ合わせ、溶液の総容積を、コンジュゲーション緩衝液（ｐＨ７．４の０．１Ｍ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）の添加により５５００μＬに調整した。

多ウエルプレートを室温まで加温した（約１０分）。５０μＬのビオチニル化抗体／オリゴヌクレオチド相補体をプレートの各ウエルに加えた。プレートを接着シールで覆い、プレート振とう機上で室温で１時間インキュベートした。各ウエルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、３Ｘ）で洗浄した。

複数の分析対象物質を含む溶液（２５μＬのＭＳＤ Ｄｉｌｕｅｎｔ ２とＭＳＤ Ｄｉｌｕｅｎｔ ２の２５μＬキャリブレータ溶液）を調製済みプレートの各ウエルに加え、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、一組の標識検出抗体（５０μＬのＭＳＤ Ｄｉｌｕｅｎｔ ３）を多ウエルプレートの各ウエルに加えた。プレートを振とうしながらインキュベートし、ウエルをＰＢＳで３回洗浄し、１５０μＬのＲｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を満たし、ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ装置で分析した。

ニートＳＡ／ビオチニル化オリゴヌクレオチドを用いた間接アッセイ方式
ビオチニル化捕捉抗体、ニートストレプトアビジンおよびビオチニル化オリゴヌクレオチドを用いた間接アッセイ用の多ウエルプレートの調製および使用の手順を図１０（ａ）〜（ｃ）に例示する。多ウエルアッセイプレートの実験レイアウトを実施例１と同様に示した。ストレプトアビジン（ＳＡ）に結合したそれぞれの個別のオリゴヌクレオチド配列相補体の過剰の希釈標準溶液（５５０μＬ）は、配列相補体の保存溶液をＤｉｌｕｅｎｔ １００で約５０倍希釈することによって調製した（オリゴヌクレオチド配列相補体の保存溶液およびＤｉｌｕｅｎｔ １００は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙから入手できる）。ビオチニル化抗体の溶液をオリゴヌクレオチド配列相補体の所望の希釈標準溶液に加えて、一組の個別のビオチニル化捕捉抗体／オリゴヌクレオチド−ＳＡ混合物を調製した。混合物中のビオチニル化抗体の濃度は、約５〜３０μｇ／ｍＬの範囲にあった。混合物を室温で３０〜４５分間緩やかに混合した。５０μＬのビオチン溶液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）（約３倍過剰のビオチン）をそれぞれの個別のビオチニル化抗体／オリゴヌクレオチド相補体混合物に加え、この混合物を室温で１０〜１５分間緩やかに混合した。等量（５５０μＬ）の個別のビオチニル化抗体／オリゴヌクレオチド相補体を混ぜ合わせ、溶液の総容積を、コンジュゲーション緩衝液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙから入手できる）の添加により５５００μＬに調整した。

多ウエルプレートを室温まで加温した（約１０分）。５０μＬのビオチニル化抗体／オリゴヌクレオチド相補体をプレートの各ウエルに加えた。プレートを接着シールで覆い、プレート振とう機上で室温で１時間インキュベートした。各ウエルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、３Ｘ）で洗浄した。

複数の分析対象物質を含む溶液（２５μＬのＭＳＤ Ｄｉｌｕｅｎｔ ２とＭＳＤ Ｄｉｌｕｅｎｔ ２の２５μＬキャリブレータ溶液）を調製済みプレートの各ウエルに加え、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、一組の標識検出抗体（５０μＬのＭＳＤ Ｄｉｌｕｅｎｔ ３）を多ウエルプレートの各ウエルに加えた。プレートを振とうしながらインキュベートし、ウエルをＰＢＳで３回洗浄し、１５０μＬのＲｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を満たし、ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ装置で分析した。

７プレックスサイトカインＢパネルを用いた３種のアッセイ方式の比較結果
７プレックスサイトカインＢパネル（ＩＬ−８、ｈＴＮＦ−ａ、ｈＥｏｔａｘｉｎ−３、ｈ−Ｅｏｔａｘｉｎ、ｈＭＣＰ−１、ＨＩＰ−１０およびｈＭＩＰ−１ａ）を実施例１、２および３で述べたアッセイ方式、すなわち、直接、オリゴヌクレオチド−ＳＡコンジュゲートを用いた間接およびニートＳＡ／ビオチニル化オリゴヌクレオチドを用いた間接アッセイ方式で試験した。アッセイのＬＯＤ値は、２５標準偏差を仮定する８ポイント校正曲線から推定した。結果を図１１（ａ）〜（ｇ）に示す。直接および間接アッセイ方式のＬＯＤ値を、すべての試験したアッセイについて標準受動吸着および免疫測定法で観測されたＬＯＤ値と比較している。ニートＳＡを用いた間接アプローチは、ＬＯＤ値のかなりの広がりを示し、一部のアッセイＩＬ−８およびｈＩＰ−１０は、残りのアッセイ方式と比較してより高いＬＯＤ値を示したが、エオタキシンＭＩＰ−１０は、より低いＬＯＤ値を示した。

本発明は、本明細書で述べた特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際、前述の説明および添付図面から、本明細書で述べたものに加えて、方法の様々な修正が当業者には明らかになるであろう。そのような修正は、特許請求の範囲内に入るものとする。様々な刊行物が本明細書において引用されており、その開示は、参照によってその全体として組み入れる。

Claims (10)

1. 対象の複数の分析対象物質の多重化結合アッセイを行う方法であって、
   （ａ）１つまたは複数の工程で、以下の成分を混ぜ合わせる工程：
   （ｉ）対象の第１の分析対象物質および対象の第２の分析対象物質を含む複数の分析対象物質を含む試料、
   （ｉｉ）第１の結合ドメイン上に固定化された第１の標的物質、ここで第１の標的物質はオリゴヌクレオチドを含み、
   （ｉｉｉ）第１の連結剤に接続され、第１の標的物質の結合相手である、第１の標的物質相補体、ここで第１の標的物質相補体は、第１のオリゴヌクレオチド対を形成する第１の標的物質オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを含み、
   （ｉｖ）第１の補助連結剤に接続され、第１の分析対象物質の結合相手である、第１の結合試薬、
   （ｖ）第２の結合ドメイン上に固定化された第２の標的物質、ここで第２の標的物質はオリゴヌクレオチドを含み、
   （ｖｉ）第２の連結剤に接続され、第２の標的物質の結合相手である、第２の標的物質相補体、ここで第２の標的物質相補体は、第１のオリゴヌクレオチド対とは異なる第２のオリゴヌクレオチド対を形成する第２の標的物質オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを含み、
   （ｖｉｉ）第２の補助連結剤に接続され、第２の分析対象物質の結合相手である、第２の結合試薬、および
   （ｖｉｉｉ）場合により、架橋剤の少なくとも２つのコピー、
   ここで、架橋剤が除外される場合には、ａ）第１および第２の連結剤はビオチンであり、第１および第２の補助連結剤はストレプトアビジンまたはアビジンであるか、またはｂ）第１および第２の連結剤はストレプトアビジンまたはアビジンであり、第１および第２の補助連結剤はビオチンであり、または
   架橋剤が含められる場合には、架橋剤はストレプトアビジンまたはアビジンであり、第１および第２の連結剤ならびに第１および第２の補助連結剤は各々ビオチンである；
   （ｂ）以下のものを形成する工程
   （ｉ）第１の標的物質、第１の標的物質相補体、第１の結合試薬および第１の分析対象物
   質を含む第１の結合ドメイン上の第１の結合複合体、ならびに
   （ｉｉ）第２の標的物質、第２の標的物質相補体、第２の結合試薬および第２の分析対象物質を含む第２の結合ドメイン上の第２の結合複合体、
   ならびに
   （ｃ）それぞれ第１および第２の結合ドメイン上の第１および第２の分析対象物質の量を測定する工程、ここで工程（ａ）において混ぜ合わされた成分が第１の分析対象物質に結合する第１の検出試薬および第２の分析対象物質に結合する第２の検出試薬をさらに含み、工程（ｂ）において形成された第１および第２の複合体がそれぞれ第１および第２の検出試薬をさらに含み、該測定する工程は、第１および第２の検出試薬の存在を測定する工程をさらに含み、第１の検出試薬は第１の検出可能な標識を含み、第１の検出試薬は抗体を含み、第２の検出試薬は第２の検出可能な標識を含み、第２の検出試薬は抗体を含む、を含む前記方法。
2. 試料がさらなる分析対象物質をさらに含み、混ぜ合わせ工程（ａ）が
   １つまたは複数の工程で、（ｉｘ）さらなる結合ドメイン上に固定化されたさらなる標的物質、さらなる連結剤に接続されたさらなる標的物質相補体、およびさらなる補助連結剤に接続されたさらなる結合試薬、ならびに（ｘ）さらなる標的物質、さらなる標的物質相補体、さらなる結合試薬およびさらなる分析対象物質を含むさらなる結合ドメイン上のさらなる結合複合体を混ぜ合わせる工程をさらに含み、
   ここで、架橋剤が除外される場合には、ａ）さらなる連結剤はビオチンであり、さらなる補助連結剤はストレプトアビジンまたはアビジンであるか、またはｂ）さらなる連結剤はストレプトアビジンまたはアビジンであり、さらなる補助連結剤はビオチンであり、または
   架橋剤が含められる場合には、架橋剤はストレプトアビジンまたはアビジンであり、さらなる連結剤およびさらなる補助連結剤は各々ビオチンである；
   形成工程（ｂ）が（ｉｉｉ）さらなる標的物質、さらなる標的物質相補体、さらなる結合試薬およびさらなる分析対象物質を含むさらなる結合ドメイン上のさらなる結合複合体を形成する工程をさらに含み、
   工程（ｃ）における測定がさらなる結合ドメイン上のさらなる分析対象物質の量を測定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 第１の標的物質相補体および第１の結合試薬を、第１の連結剤と第１の補助連結剤との間の結合相互作用により連結された第１の標的物質相補体および第１の結合試薬を含む事前に結合させた第１の標的複合体として準備し、
   第２の標的物質相補体および第２の結合試薬を、第２の連結剤と第２の補助連結剤との間の結合相互作用により連結された第２の標的物質相補体および第２の結合試薬を含む事前に結合させた第２の標的複合体として準備する、
   請求項１に記載の方法。
4. 工程（ａ）が
   第１の容積の液体中で、前記第１の標的物質相補体、前記第１の結合試薬および、用いる場合、前記架橋剤を混ぜ合わせ、前記第１の標的物質相補体と前記第１の結合試薬をそれらの結合した第１の連結剤および第１の補助連結剤を介して連結して、第１の標的複合体を形成し、
   第２の容積の液体中で、前記第２の標的物質相補体、前記第２の結合試薬および、用いる場合、前記架橋剤を混ぜ合わせ、前記第２の標的物質相補体と前記第２の結合試薬をそれらの結合した第２の連結剤および第２の補助連結剤を介して連結して、第２の標的複合体を形成する
   工程を含む、請求項１に記載の方法。
5. 第１および第２の結合試薬が抗体である、請求項１に記載の方法。
6. サンドイッチ結合アッセイを行うことを含む、請求項１に記載の方法。
7. 競合的結合アッセイを行なうことを含む、請求項１に記載の方法。
8. 少なくとも１０個の結合ドメインが存在する、請求項１または２に記載の方法。
9. 非特異的結合ドメインに配置されている結合試薬に対する対象の分析対象物質の観測される交差反応性が当分析対象物質に割り当てられた結合ドメインにおける結合試薬への結合の０．５％未満である、請求項１または２に記載の方法。
10. 非特異的結合ドメインに配置されている結合試薬に対する対象の分析対象物質の観測される交差反応性が当分析対象物質に割り当てられた結合ドメインにおける結合試薬への結合の０．１％未満である、請求項１または２に記載の方法。

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