CN116507738A - 用于检测样品中的一种或多种靶分析物的试剂盒及其制造和使用方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用于检测、鉴别或定量样品中的一种或多种靶分析物的寡核苷酸、方法和试剂盒以及用于将寡核苷酸固定到支撑表面上的方法。
Description
技术领域
本公开涉及用于检测样品中的一种或多种靶分析物的试剂盒及其制造和使用方法。
背景技术
单核苷酸多态性(SNP)是指生物体的基因组中的单核苷酸变异，其中存在各自在群体的相当大部分(>1％)中出现的两个或更多个不同核苷酸残基(等位基因)。SNP是个体间序列变异的最常见形式，并且与许多遗传性疾病的病因有关。Wang等人(1998),《人类基因组中单核苷酸多态性的大规模鉴别、作图和基因分型(Large-Scale Identification,Mapping,and Genotyping of Single-Nucleotide Polymorphisms in the HumanGenome)》,《科学(Science)》,280:1077-1082。人类基因组中估计存在1000万个SNP，其可能发生在编码区和非编码区中。Kruglyak等人(2001)《变异是生命的额外趣味(Variation isthe Spice of Life)》,《自然·遗传学(Nat.Genet.)》,27:234-236。许多SNP对细胞功能没有影响，但其它SNP与遗传性状、遗传疾病、年龄相关疾病以及对药物和环境因素的反应相关。
基因分型分析是用于检测样品中核苷酸序列的存在的基因测试，并且可以用于检测样品中SNP或其它序列变异的存在，包括但不限于缺失和插入、重复和易位。高密度寡核苷酸阵列使用排列在芯片上的数十万个探针以允许同时探询许多核苷酸序列。
因为需要对样品中的核苷酸序列进行大规模分析以使序列与疾病或对疾病的易感性相关联、将序列与药物反应中的个体变异性联系起来或进行群体研究，所以仍然需要用于鉴别样品中的核苷酸序列的试剂盒。
发明内容
本文提供一种用于检测样品中包含靶核酸序列的靶寡核苷酸的方法。在一个方面中，所述方法包括：
(a)使所述样品与包含寡核苷酸标签、靶互补序列和检测寡核苷酸的检测探针在如下条件下接触：所述靶互补序列与所述靶寡核苷酸的所述靶核酸序列杂交，以形成反应产物；
(b)使上面固定有捕获寡核苷酸的支撑表面与含有所述反应产物的混合物在如下条件下接触：所述反应产物的所述寡核苷酸标签与所述捕获寡核苷酸杂交，以形成固定化检测复合物；
(c)使所述固定化检测复合物与包含扩增模板的检测混合物接触；
(d)扩增所述扩增模板以形成包含一个或多个包含检测标记位点的核酸序列的扩增子；
(e)使所述扩增子与包含标记和与所述检测标记位点互补的核酸序列的检测试剂在如下条件下接触：所述检测试剂的所述核酸序列与所述扩增子的所述检测标记位点杂交；以及
(f)检测结合到所述检测标记位点的所述标记。在一个方面中，在(a)中使样品与锚定试剂和检测探针接触。在一个方面中，锚定试剂包括寡核苷酸标签和锚定序列。在一个方面中，检测探针包括单链DNA寡核苷酸标签、单链RNA靶互补序列和单链DNA检测寡核苷酸。在一个方面中，锚定试剂包括单链DNA寡核苷酸标签和单链DNA锚定序列。
在一个方面中，所述方法包括在(c)之前使固定化检测复合物与RNA酶接触以消化未结合探针的单链RNA。
在一个方面中，提供一种用于检测样品中包括靶核酸序列的靶寡核苷酸的方法。在一个方面中，所述方法包括：
(a)使所述样品与以下接触：
(i)检测探针，其包括包含单链DNA序列的寡核苷酸标签、包含单链RNA序列的靶互补序列和包含单链DNA序列的检测寡核苷酸；和
(ii)锚定试剂，其包括包含单链DNA序列的寡核苷酸标签和包含单链DNA序列的锚定序列，
其中所述检测探针的所述靶互补序列与所述靶寡核苷酸的所述靶核酸序列杂交以形成反应产物，其包括所述寡核苷酸标签、包括所述靶寡核苷酸的所述靶核酸序列和所述靶互补序列的双链RNA双链体；
(b)使包括上面在离散结合域中固定有多种捕获寡核苷酸的一个或多个电极的支撑表面与包括所述反应产物的混合物在如下条件下接触：所述反应产物的所述寡核苷酸标签与所述捕获寡核苷酸杂交，以在所述支撑表面上形成检测复合物；
(c)使所述支撑表面与RNA酶接触以消化未结合检测探针的单链RNA；
(d)使固定化检测复合物与包括滚环扩增(RCA)模板和聚合酶的检测混合物接触；
(e)通过RCA扩增所述模板以形成连接到所述检测复合物的延伸序列，其中所述延伸序列包括多个包括检测标记位点的核酸序列；
(f)使所述延伸序列与包括电化学发光(ECL)标记和与所述延伸序列的所述检测标记位点互补的核酸序列的检测试剂在如下条件下接触：所述检测试剂的所述核酸序列与所述检测标记位点杂交；以及
(g)通过使所述ECL标记与包括ECL共反应物的ECL读取缓冲液接触并且向所述电极施加电势来检测结合到所述延伸序列的所述ECL标记。
在一个方面中，提供一种用于检测样品中的靶核苷酸序列的方法。在一个方面中，所述方法包括：
(a)使所述样品与包括以下的混合物接触：
(i)靶向探针，其包括单链寡核苷酸标签和与所述样品中的所述靶核苷酸序列的第一区互补的第一核酸序列；和
(ii)检测探针，其包括检测寡核苷酸和与所述靶核苷酸序列的第二区互补的第二核酸序列，
其中所述靶向探针的所述第一核酸序列和所述检测探针的所述第二核酸序列与所述靶寡核苷酸的相邻核酸序列互补；
(b)在核酸连接酶存在下，在如下条件下培育包括所述靶寡核苷酸、靶向探针和检测探针的所述混合物：所述靶向探针和所述检测探针结合到其相应的所述靶寡核苷酸的核苷酸序列，并且所述核酸连接酶连接所述靶向探针和所述检测探针，以形成包括所述寡核苷酸标签和所述检测寡核苷酸的反应产物；
(c)使上面固定有捕获寡核苷酸的支撑表面与包括所述反应产物的所述混合物在如下条件下接触：所述反应产物的所述寡核苷酸标签与所述捕获寡核苷酸杂交，以形成固定化检测复合物；
(d)使所述固定化检测复合物与包括扩增模板的检测混合物接触；
(e)扩增所述扩增模板以形成包括一个或多个包括检测标记位点的核酸序列的扩增子；
(f)使所述扩增子与包括标记和与所述检测标记位点互补的核酸序列的检测试剂在如下条件下接触：所述检测试剂的所述核酸序列与所述检测标记位点杂交；以及
(g)检测结合到所述支撑表面的所述标记。
在一个方面中，检测探针具有与和靶向探针的3'端相邻的靶核苷酸序列杂交的5'端。
在一个方面中，所述方法包括使(b)中形成的反应产物暴露于变性条件以使反应产物与靶寡核苷酸解离。
在一个方面中，扩增模板通过聚合酶链反应(PCR)扩增。在一个方面中，扩增模板通过滚环扩增(RCA)扩增。在一个方面中，扩增模板包括环状扩增模板。
在一个方面中，由RCA生成的扩增子包括连接到固定化检测复合物的延伸序列。在一个方面中，扩增子包括多个检测标记位点。
在一个方面中，扩增模板包括线性扩增模板，其包括5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中5'和3'末端核苷酸序列能够与检测序列杂交；以及能够与检测试剂的核酸序列的互补序列杂交的内部核苷酸序列，其中扩增模板的5'和3'末端核苷酸序列不与内部序列重叠。
在一个方面中，扩增模板包括线性扩增模板，其包括5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中5'和3'末端核苷酸序列能够与检测序列杂交；能够与锚定寡核苷酸序列的互补序列杂交的第一内部序列以及能够与检测试剂的核酸序列的互补序列杂交的第二内部序列，其中扩增模板的5'和3'末端核苷酸序列不与第一和第二内部序列重叠。
在一个方面中，3'和5'末端序列的长度的总和为约14到约24个核苷酸的长度。在一个方面中，3'和5'末端序列的长度的总和为约14或约15个核苷酸的长度。
在一个方面中，扩增模板包括5'-GTTCTGTC-3'(SEQ ID NO:1666)的5'末端序列和5'-GTGTCTA-3'(SEQ ID NO:1667)的3'末端序列。
在一个方面中，检测寡核苷酸包括与扩增模板的5'末端序列互补的第一序列和与扩增模板的3'末端序列互补的相邻第二序列。
在一个方面中，扩增模板包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:1668)的核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:1669)的核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板包括由5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAG TGTCTA-3'(SEQ ID NO:1670)组成的序列。在一个方面中，扩增模板包括5'-GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA-3'(SEQ ID NO:1671)的核苷酸序列。
在一个方面中，检测寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:1664)的14或15个连续核苷酸。
在一个方面中，扩增模板包括长度为约50到约78个核苷酸的非天然存在的寡核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板的非天然存在的寡核苷酸序列的长度为约53到约76个核苷酸、约50到约70个核苷酸、约53到约61个核苷酸或约54到约61个核苷酸。在一个方面中，扩增模板的非天然存在的寡核苷酸序列的长度为约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75或约76个核苷酸。在一个方面中，扩增模板的非天然存在的寡核苷酸序列的长度为约61个核苷酸。
在一个方面中，检测试剂的核酸序列包括与以下的14或15个连续核苷酸具有至少90％序列同一性的核酸序列：5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:1672)。在一个方面中，检测试剂的核酸序列包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:1672)。在一个方面中，检测试剂的核酸序列包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:1668)。
在一个方面中，锚定试剂的锚定序列包括长度为约10到约30个核酸的寡核苷酸。在一个方面中，锚定试剂的锚定序列包括长度为约17或约25个寡核苷酸的寡核苷酸。在一个方面中，锚定试剂的锚定序列包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:1669)。在一个方面中，锚定试剂的锚定序列由5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(SEQ ID NO:1665)组成。
在一个方面中，支撑表面包括一个或多个碳基电极。在一个方面中，支撑表面包括多孔板，其包括一个或多个碳基电极。在一个方面中，电极包括碳墨电极。
在一个方面中，支撑表面包括多孔板，其包括一个或多个碳基电极，并且其中多种捕获寡核苷酸固定在碳基电极上的离散域中。在一个方面中，多种捕获寡核苷酸固定支撑表面上阵列中的离散结合域中。
在一个方面中，标记包括电化学发光(ECL)标记。在一个方面中，所述方法包括通过使电极与包括电化学发光共反应物的电化学发光读取缓冲液接触并且向电极施加电势来生成分析信号的步骤。
在一个方面中，固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸选自符合以下要求中的一者或多者的非交叉反应性寡核苷酸的集合：
(a)约40％与约50％之间的GC含量；
(b)约30％与约70％之间的AG含量；
(c)约30％与约70％之间的CT含量；
(d)不超过三个的序列中的最大碱基重复串；
(e)没有不需要的与连续超过7个互补碱基对匹配的串的寡核苷酸-寡核苷酸相互作用；
(f)没有不需要的与18个连续碱基或更少的串的寡核苷酸-寡核苷酸相互作用，其中：
(i)每一端的末端碱基是互补匹配；和
(ii)互补碱基对匹配之和减错配之和大于7；
(g)没有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个碱基对或更长的串匹配基因组中或自然界中的序列或序列的互补序列或两者；
(h)序列与其互补序列的杂交自由能差异小于约1kCal/mol、约2kCal/mol、约3kCal/mol或约4kCal/mol；
(i)没有在茎中具有4个或更多个连续匹配的预测发夹环；以及
(j)没有在茎中具有4个或更多个连续匹配且环大小大于6个碱基的预测发夹环。
在一个方面中，固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸选自：
(a)具有选自SEQ ID No:1-64的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；
(b)包括与选自SEQ ID No:1-64的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的捕获寡核苷酸；
(c)具有与选自SEQ ID No:1-64的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；
(d)包括选自SEQ ID No:1-64的序列的捕获寡核苷酸；以及
(e)选自(a)-(d)中的任一者的捕获寡核苷酸。
在一个方面中，固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸选自：
(a)包括具有选自SEQ ID No:1-10的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的序列的捕获寡核苷酸；
(b)包括与选自SEQ ID No:1-10的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的捕获寡核苷酸；
(c)具有与选自SEQ ID No:1-10的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；
(d)包括选自SEQ ID No:1-10的序列的捕获寡核苷酸；以及
(e)选自(a)-(d)中的任一者的捕获寡核苷酸。
在一个方面中，提供一种用于检测样品中的靶核苷酸序列的试剂盒。在一个方面中，所述试剂盒包括：
(a)支撑表面，其包括一种或多种固定化捕获寡核苷酸；
(b)检测探针，其包括寡核苷酸标签、靶互补序列和检测寡核苷酸；
(c)扩增模板；
(d)核酸连接酶；
(e)核酸聚合酶；以及
(f)检测试剂，其包括标记和核酸序列。
在一个方面中，试剂盒包括锚定试剂，其包括寡核苷酸标签和锚定寡核苷酸。在一个方面中，锚定试剂固定在支撑表面上。在一个方面中，锚定寡核苷酸的长度为约10到约30个核酸。在一个方面中，锚定寡核苷酸的长度为17或25个寡核苷酸。
在一个方面中，试剂盒中的锚定寡核苷酸包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ IDNO:1669)。在一个方面中，锚定寡核苷酸由5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(SEQ IDNO:1665)组成。
在一个方面中，试剂盒中的扩增模板包括线性扩增模板，其包括5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中5'和3'末端核苷酸序列能够与检测序列杂交；以及能够与锚定试剂的锚定序列的互补序列杂交的内部核苷酸序列，其中扩增模板的5'和3'末端核苷酸序列不与内部序列重叠。
在一个方面中，试剂盒中的扩增模板包括线性扩增模板，其包括5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中5'和3'末端核苷酸序列能够与检测序列杂交；能够与锚定试剂的锚定序列的互补序列杂交的第一内部核苷酸序列以及能够与检测试剂的核酸序列的互补序列杂交的第二内部核苷酸序列，其中扩增模板的5'和3'末端核苷酸序列不与第一和第二内部序列重叠。在一个方面中，扩增模板包括5'末端磷酸基。
在一个方面中，试剂盒中的扩增模板的长度为约53到约61个核苷酸。在一个方面中，5'和3'末端序列的长度的总和为约14到约24个核苷酸的长度。在一个方面中，3'和5'末端序列的长度的总和为约14到约19个核苷酸的长度。在一个方面中，3'和5'末端序列的长度的总和为约14或约15个核苷酸的长度。
在一个方面中，试剂盒中的扩增模板包括5'-GTTCTGTC-3'(SEQ ID NO:1666)的5'末端序列和5'-GTGTCTA-3'(SEQ ID NO:1667)的3'末端序列。在一个方面中，扩增模板包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:1668)的核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:1669)的核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板包括由5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGA GTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'(SEQ ID NO:1670)组成的序列。在一个方面中，扩增模板包括5'-GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCG TCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA-3'(SEQ ID NO:1671)的核苷酸序列。
在一个方面中，试剂盒中的扩增模板包括环状扩增模板。
在一个方面中，试剂盒中的检测探针包括单链DNA寡核苷酸标签、单链RNA靶互补序列和单链DNA检测寡核苷酸。
在一个方面中，试剂盒中的锚定试剂包括单链DNA寡核苷酸标签和单链DNA锚定序列。
在一个方面中，试剂盒包括RNA酶。
在一个方面中，试剂盒中的检测探针的检测寡核苷酸包括与扩增模板的5'末端序列互补的第一序列和与扩增模板的3'末端序列互补的相邻第二序列。
在一个方面中，试剂盒中的检测试剂的核酸序列包括与以下的14或15个连续核苷酸具有至少90％序列同一性的序列：5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:1672)。在一个方面中，检测试剂的核酸序列包括序列5'-CAGTGAATGCGAGT CCGTCT-3'(SEQ ID NO:1672)。在一个方面中，检测试剂的核酸序列包括序列5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:1668)。
在一个方面中，试剂盒中的检测试剂的标记包括电化学发光(ECL)标记。
在一个方面中，试剂盒中的支撑表面包括碳基支撑表面。在一个方面中，支撑表面包括碳基电极。在一个方面中，支撑表面包括碳墨电极。在一个方面中，支撑表面包括多孔板分析消耗品，并且板的每个孔包括碳墨电极。在一个方面中，支撑表面包括珠粒。
在一个方面中，多种捕获寡核苷酸固定在试剂盒的固相支撑物上的离散结合域中以形成阵列。在一个方面中，多种捕获寡核苷酸和至少一种锚定试剂固定在固相支撑物上的离散结合域中以形成阵列，其中每个结合域包括多种捕获寡核苷酸中的一者和至少一种锚定试剂。
在一个方面中，固定在试剂盒的支撑表面上的捕获寡核苷酸选自符合以下要求中的一者或多者的非交叉反应性寡核苷酸的集合：
(a)约40％与约50％之间的GC含量；
(b)约30％与约70％之间的AG含量；
(c)约30％与约70％之间的CT含量；
(d)不超过三个的序列中的最大碱基重复串；
(e)没有不需要的与连续超过7个互补碱基对匹配的串的寡核苷酸-寡核苷酸相互作用；
(f)没有不需要的与18个连续碱基或更少的串的寡核苷酸-寡核苷酸相互作用，其中：
(i)每一端的末端碱基是互补匹配；和
(ii)互补碱基对匹配之和减错配之和大于7；
(g)没有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个碱基对或更长的串匹配基因组中或自然界中的序列或序列的互补序列或两者；
(h)序列与其互补序列的杂交自由能差异小于约1kCal/mol、约2kCal/mol、约3kCal/mol或约4kCal/mol；
(i)没有在茎中具有4个或更多个连续匹配的预测发夹环；以及
(j)没有在茎中具有4个或更多个连续匹配且环大小大于6个碱基的预测发夹环。
在一个方面中，固定在试剂盒的支撑表面上的捕获寡核苷酸选自：
(a)具有选自SEQ ID No:1-64的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；
(b)包括与选自SEQ ID No:1-64的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的捕获寡核苷酸；
(c)具有与选自SEQ ID No:1-64的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；
(d)包括选自SEQ ID No:1-64的序列的捕获寡核苷酸；以及
(e)选自(a)-(d)中的任一者的捕获寡核苷酸。
在一个方面中，固定在试剂盒的支撑表面上的捕获寡核苷酸选自：
(a)包括具有选自SEQ ID No:1-10的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的序列的捕获寡核苷酸；
(b)包括与选自SEQ ID No:1-10的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的捕获寡核苷酸；
(c)具有与选自SEQ ID No:1-10的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；
(d)包括选自SEQ ID No:1-10的序列的捕获寡核苷酸；以及
(e)选自(a)-(d)中的任一者的捕获寡核苷酸。
在一个方面中，提供一种用于检测样品中的靶核苷酸序列的试剂盒，其包括：
(a)支撑表面，其包括一种或多种固定化捕获寡核苷酸；
(b)锚定试剂，其包括寡核苷酸标签和锚定寡核苷酸；
(c)检测探针，其包括寡核苷酸标签、靶互补序列和单链DNA检测寡核苷酸；
(d)检测试剂，其包括电化学发光(ECL)标记和核酸序列；
(e)线性扩增模板，其包括5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中所述5'和3'末端核苷酸序列能够与检测序列杂交，能够与所述锚定试剂的锚定序列的互补序列杂交的第一内部核苷酸序列以及能够与所述检测试剂的核酸序列的互补序列杂交的第二内部核苷酸序列，其中所述扩增模板的所述5'和3'末端核苷酸序列不与所述第一和第二内部序列重叠；
(f)核酸连接酶；以及
(g)核酸聚合酶。
在一个方面中，锚定试剂固定在试剂盒的支撑表面上。在一个方面中，锚定试剂包括单链DNA寡核苷酸标签和单链DNA锚定寡核苷酸；并且检测探针包括单链DNA寡核苷酸标签、单链RNA靶互补序列和单链DNA检测寡核苷酸；并且其中试剂盒进一步包括RNA酶。
在一个方面中，提供一种用于检测样品中的靶核苷酸序列的试剂盒，其包括：
(a)支撑表面，其包括固定化捕获寡核苷酸；
(b)靶向探针，其包括单链寡核苷酸标签和与所述样品中的所述靶核苷酸序列的第一区互补的第一核酸序列；
(c)检测探针，其包括检测寡核苷酸和与所述靶核苷酸序列的第二区互补的第二核酸序列，其中所述靶向探针的所述第一核酸序列和所述检测探针的所述第二核酸序列与靶核苷酸的相邻序列互补；
(d)扩增模板；
(e)核酸连接酶；
(f)核酸聚合酶；以及
(g)检测试剂，其包括标记和核酸序列。
在一个方面中，靶向探针具有与靶核苷酸序列的区互补的末端3'核苷酸，所述区与检测探针的5'末端核苷酸所互补的区相邻。在一个方面中，靶向探针的末端3'核苷酸与靶核苷酸序列的多态性核苷酸互补。
在一个方面中，提供一种用于检测样品中的靶核苷酸序列的试剂盒，其包括：
(a)支撑表面，其包括固定化捕获寡核苷酸；
(b)锚定试剂，其包括寡核苷酸标签和锚定寡核苷酸；
(c)靶向探针，其包括单链寡核苷酸标签和与所述样品中的所述靶核苷酸序列的第一区互补的第一核酸序列；
(d)检测探针，其包括检测寡核苷酸和与所述靶核苷酸序列的第二区互补的第二核酸序列，其中所述靶向探针的所述第一核酸序列和所述检测探针的所述第二核酸序列与靶核苷酸的相邻序列互补；
(e)线性扩增模板，其包括5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中所述5'和3'末端核苷酸序列能够与检测序列杂交，能够与所述锚定试剂的锚定序列的互补序列杂交的第一内部核苷酸序列以及能够与所述检测试剂的核酸序列的互补序列杂交的第二内部核苷酸序列，其中所述扩增模板的所述5'和3'末端核苷酸序列不与所述第一和第二内部序列重叠；
(f)核酸连接酶；
(g)核酸聚合酶；以及
(h)检测试剂，其包括电化学发光(ECL)标记和核酸序列。
在一个方面中，试剂盒包括检测混合物，其包括线性扩增模板和一种或多种额外组分，所述额外组分选自：连接缓冲液、腺苷三磷酸(ATP)、牛血清白蛋白(BSA)、吐温(Tween)20、T4 DNA连接酶以及其组合。在一个方面中，检测混合物包括一种或多种用于滚环扩增的组分，其选自BSA、缓冲液、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、吐温20、Phi29 DNA聚合酶或其组合。在一个方面中，检测混合物包括乙酰BSA。
在一个方面中，试剂盒包括ECL读取缓冲液。
附图说明
图1A为寡核苷酸连接分析(OLA)杂交步骤的示意图；图1B为OLA连接步骤的示意图；图1C为OLA检测步骤的示意图；图1D为其中不发生杂交的OLA探针错配的示意图。
图2A为引物延伸分析(PEA)的示意图，其中标记的ddNTP添加到探针的3'端；图2B为PEA的示意图，其中未标记的ddNTP添加到探针的3'端。
图3为展示改变捕获寡核苷酸与电极之间的接头(或间隔子)的长度对探针与捕获寡核苷酸的杂交和使用电化学发光检测的影响的图。
图4为展示不同捕获寡核苷酸阵列洗涤条件对所测量的对阵列的一个元件具有特异性的寡核苷酸探针的交叉反应性的影响的图。
图5为比较随含有靶BRAF基因区的核酸模板的浓度而变的BRAF突变的电化学发光OLA的分析信号的图，并且比较突变序列与野生型序列生成的信号。
图6为展示由一组电化学发光OLA生成的分析信号随其特定靶序列的浓度而变的图。
图7为展示可以通过包括封闭寡核苷酸来减少一组电化学发光OLA的桥接背景信号的图。
图8为展示可以通过包括封闭寡核苷酸或额外高严格性热浸步骤来减少电化学发光OLA中由于探针与捕获寡核苷酸的非特异性结合而升高的背景的图。
图9展示来自从突变和野生型细胞的混合物提取的PCR扩增基因组DNA的电化学发光OLA的突变BRAF和NRAS序列的预测百分比与突变序列的实际百分比。
图10展示随表示突变和野生型序列的模板核酸的浓度而变的BRAF 1799T>A突变的电化学发光PEA的分析信号，展示分析对突变序列具有特异性。
图11为展示BRAF和NRAS SNP的一组电化学发光PEA对输入DNA浓度具有线性响应的图。
图12展示使用电化学发光BRAF 1799T>A OLA分析测量从突变和野生型细胞的混合物提取的PCR扩增基因组DNA的突变BRAF 1799T>A序列的预测百分比与突变序列的实际百分比。
图13展示使用电化学发光NRAS 181C>A OLA分析测量从突变和野生型细胞的混合物提取的PCR扩增基因组DNA的突变NRAS 181C>A序列的预测百分比与突变序列的实际百分比。
图14展示使用电化学发光182A>T OLA分析测量从突变和野生型细胞的混合物提取的PCR扩增基因组DNA的突变182A>T序列的预测百分比与突变序列的实际百分比。
图15展示用于检测、鉴别和/或定量可能含有寡核苷酸代谢物的样品中的靶核苷酸序列(例如治疗性寡核苷酸)的寡核苷酸连接扩增(OLA)分析，如本文中的实施例中所描述。
图16展示用于检测、鉴别和/或定量可能含有寡核苷酸代谢物的样品中的靶核苷酸序列(例如治疗性寡核苷酸)的直接杂交方法，如本文中的实施例中所描述。
图17展示用于检测、鉴别和/或定量可能含有寡核苷酸代谢物的样品中的靶核苷酸序列(例如治疗性寡核苷酸)的具有直接表面涂层的核酸酶保护分析(NPA)，如本文中的实施例中所描述。
图18展示用于检测、鉴别和/或定量可能含有寡核苷酸代谢物的样品中的靶核苷酸序列(例如治疗性寡核苷酸)的杂交/保护分析，如本文中的实施例中所描述。
图19展示用于检测、鉴别和/或定量样品中的抗体(例如抗药物抗体(ADA))的夹心分析。
图20展示由包括与ASO序列互补的核苷酸序列的阳性对照寡核苷酸桥接的靶向探针和检测探针的示意图。
图21展示对图19中所示的用于检测、鉴别和/或定量样品中的抗体(例如抗药物抗体(ADA))的夹心分析的修改。
图22为如本文所描述的利用检测寡核苷酸进行信号放大的检测靶寡核苷酸序列的方法的示意图。
图23A为如本文所描述的用于将包括检测寡核苷酸的反应产物固定到支撑表面的方法的示意图。
图23B为通过滚环扩增(RCA)检测检测复合物的方法的示意图，其中检测复合物通过锚定寡核苷酸固定在支撑表面上。
图24提供用于图23A和B中所示的方法的探针和锚定试剂的寡核苷酸序列的实例。
具体实施方式
A.定义
除非另外定义，否则本文所使用的科学和技术术语应具有所属领域的普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数，例如“一(a)”或“一(an)”包括多个，例如“一个或多个”或“至少一个”，并且术语“或”可以意指“和/或”，除非明确指示仅指替代方案或替代方案相互排斥。术语“包括(including)”、“包括(includes)”和“包括(included)”不是限制性的。本文所提供的任何类型的范围包括所描述的特定范围内的所有值和关于特定范围的端点的值。
如本文所用，术语“约”用于修饰例如在描述本发明中使用的组合物中成分的数量、浓度、体积、工艺温度、工艺时间、产率、流速、压力以及它们的范围。术语“约”是指可能发生的数值量的变化，例如通过用于制备化合物、组合物、浓缩物或配制物的典型的测量和处置程序；通过这些程序中无意的误差；通过用于进行这些方法的起始材料或成分的制造、来源或纯度中的差异以及其它类似考虑因素。术语“约”还涵盖由于配制物的老化而与特定起始浓度或混合物不同的量，以及由于混合或加工配制物而与特定起始浓度或混合物不同的量。当利用术语“约”修饰时，在此随附的权利要求书包括这些等效量。
如本文所用，使用词语“之间”表达的范围包括范围端点。因此，举例来说，50℃与70℃之间的范围包括50℃到70℃，即，其包括50℃和70℃的端点。
一般来说，本文所描述的与细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交结合使用的命名法和技术为所属领域中众所周知并且常用的命名法和技术。氨基酸在本文中可以由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名法委员会(Biochemical Nomenclature Commission)所推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸可以由其通常接受的单字母编码来提及。
“靶分析物”可以包括能够通过本文所描述的方法和试剂盒检测和分析的任何所关注分子并且可以包括生物分子，如核酸、蛋白质、碳水化合物、糖和脂质。在一个方面中，靶分析物为靶核苷酸序列。在另一方面中，靶分析物为蛋白质。在一个方面中，靶分析物为DNA结合蛋白。术语“靶分析物”可以指整个所关注分子或所关注分子的区段或部分。在一个方面中，靶分析物包括修饰的分子，例如所关注分子的标记、裂解或化学或酶促处理的形式。
“靶核苷酸序列”可以包括任何所关注核苷酸序列，包括但不限于在原核或真核DNA生物体的DNA或RNA中发现的序列。这些可以包括单链或双链DNA、单链或双链RNA、DNA/RNA杂交体或DNA/RNA嵌合体。靶核苷酸序列可以包括miRNA、治疗性RNA、mRNA、RNA病毒或其组合。对于双链核苷酸序列，可以在任一链中鉴别靶核苷酸序列。靶核苷酸序列可能需要提取，例如核DNA或病毒基因组DNA或RNA，或可以在样品中直接操纵，例如血清或血浆中的游离胚胎DNA或游离肿瘤DNA或循环中的治疗性寡核苷酸。靶核苷酸序列可以直接从生物样品分离或可以包括来自生物样品的扩增序列。扩增方法是已知的并且包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、全基因组扩增(WGA)、逆转录后接聚合酶链反应(RT-PCR)、链置换扩增(SDA)或滚环扩增(RCA)。适用于本文中的扩增方法的聚合酶包括例如Taq、Phi、Bst和Vent-exo，例如用于DNA扩增，以及T7RNA聚合酶，例如用于RNA扩增。
靶核苷酸序列可以是寡核苷酸，例如治疗性寡核苷酸。如本文所用，“治疗性寡核苷酸”是指能够与生物分子相互作用以提供治疗效果的寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸为反义寡核苷酸(ASO)。ASO能够影响RNA加工和/或调节蛋白质表达。ASO是结合到单链RNA以使RNA失活的单链寡核苷酸。ASO是长度典型地为约5、10、15、20或25个核苷酸到约30、35、40、45或50个核苷酸的单链寡核苷酸。在一个方面中，ASO结合到基因的信使RNA(mRNA)，从而使所述基因失活。在一个方面中，所述基因为疾病基因。因此，ASO可以使疾病基因的mRNA失活，以防止或改善特定致病蛋白质的产生。在一个方面中，ASO包括DNA、RNA或其组合。治疗性寡核苷酸和ASO进一步描述于例如Goodchild,《分子生物学方法(MethodsMol Biol)》764:1-15(2011)；Smith等人,《药理学和毒理学年度评论(Ann Rev PharmacolToxicol)》59:605-630(2019)；以及Stein等人,《分子治疗学(Mol Ther)》25(5):1069-1075(2017)中。
在一个方面中，靶分析物为抗药物抗体(ADA)。如本文所用，“抗药物抗体”或“ADA”是生物体中针对生物药物产品体内引发的抗体。ADA可以针对生物药物引发，生物药物如治疗性多肽，包括但不限于蛋白质和抗体，以及治疗性寡核苷酸，包括但不限于反义寡核苷酸(ASO)、短干扰RNA、微RNA和CRISPR/Cas的合成引导链。ADA可以包括能够结合到生物药物产品的任何抗体同种型，称为结合抗体，并且还可以包括能够抑制治疗产品的功能活性的结合抗体亚群，称为中和抗体。ADA的检测可以是免疫原性的重要量度，其会影响生物药物产品的安全性与功效。
归因于如核酸酶的存在、温度、pH、盐浓度等各种因素，样品中的靶核苷酸序列(如治疗性寡核苷酸)可能随时间推移降解，即缩短。靶核苷酸序列的降解产物也称为寡核苷酸代谢物。在一个方面中，寡核苷酸代谢物比靶核苷酸序列短1个或更多个核苷酸、2个或更多个核苷酸、3个或更多个核苷酸、4个或更多个核苷酸、5个或更多个核苷酸、6个或更多个核苷酸、7个或更多个核苷酸、8个或更多个核苷酸、9个或更多个核苷酸、10个或更多个核苷酸、15个或更多个核苷酸或20个或更多个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸代谢物比靶核苷酸序列短约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。在一个方面中，本公开的样品包括靶核苷酸序列，例如治疗性寡核苷酸，和一种或多种寡核苷酸代谢物，例如治疗性寡核苷酸代谢物。
在一个方面中，靶核苷酸序列为治疗性寡核苷酸。在某些方面中，样品中治疗性寡核苷酸的降解指示对治疗性寡核苷酸的药效学反应。降解或缩短的治疗性寡核苷酸，在本文中也称为治疗性寡核苷酸代谢物，可能失去治疗有效性。本公开的方法可以用于测量靶核苷酸序列(例如治疗性寡核苷酸)相对于寡核苷酸代谢物(例如治疗性寡核苷酸代谢物)的量。在一个方面中，本公开的方法用于确定靶核苷酸序列(例如治疗性寡核苷酸)的药代动力学参数。在一个方面中，靶核苷酸序列(例如治疗性寡核苷酸)的药代动力学参数通过测量靶核苷酸序列(例如治疗性寡核苷酸)在生物环境(例如患者)中的降解速率和/或量来确定。在一个方面中，测量的药代动力学参数为清除率、体积分布、血浆浓度、半衰期、峰时间、峰浓度、可用率或其组合。药代动力学参数的测量和解释的进一步论述可见于例如Benet,《欧洲呼吸系统疾病杂志增刊(Eur J Respir Dis Suppl)》134:45-61(1984)和Le等人,“药代动力学概述(Overview of Pharmacokinetics)”,《默克手册专业版(MerckManual Professional Version)》,2019年5月修订。样品中存在的寡核苷酸代谢物也可能干扰样品中靶核苷酸序列的检测、鉴别和/或定量。因此，可能需要从样品中去除寡核苷酸代谢物。因此，本公开的方法也可以用于从样品中减少和/或去除寡核苷酸代谢物，例如以便获得对靶核苷酸序列的量的更准确测量。
在一个方面中，靶分析物是可以用于生成包括寡核苷酸标签和标记的“反应产物”的靶寡核苷酸。各种方法可以用于生成反应产物。在一个方面中，反应产物通过包括但不限于夹心分析、寡核苷酸连接分析(OLA)、引物延伸分析(PEA)、直接杂交分析、基于聚合酶链反应(PCR)的分析或其它靶向扩增分析以及核酸酶保护分析生成。在一个方面中，反应产物是包括与检测探针和/或靶向探针杂交的靶寡核苷酸的“杂交复合物”。在一个方面中，杂交复合物可以在核酸连接酶存在下在核酸连接酶连接靶向探针和检测探针的条件下培育。在一个方面中，反应产物包括寡核苷酸标签和标记。在一个方面中，反应产物包括寡核苷酸和检测寡核苷酸。在一个方面中，反应产物包括靶寡核苷酸和检测探针，所述检测探针包括寡核苷酸标签、靶互补序列和检测寡核苷酸。在一个方面中，靶互补序列包括与靶寡核苷酸的核酸序列互补的核酸序列。在一个方面中，检测探针通过靶互补序列与靶寡核苷酸之间的杂交而与靶寡核苷酸杂交。在另一方面中，反应产物为如本文所描述的“夹心复合物”。
在一个方面中，通过将反应产物固定在支撑表面上来形成“检测复合物”。在一个方面中，反应产物通过固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸与反应产物上存在的寡核苷酸标签的互补核苷酸序列之间的杂交而固定在支撑表面上。
“聚合酶链反应”或“PCR”是指用于扩增靶核苷酸序列的技术，其涉及三个步骤的重复循环：(1)变性，其中双链DNA模板被加热以分离链；(2)退火，其中引物结合侧接靶DNA序列的区；以及(3)延伸，其中DNA聚合酶沿模板链延伸每个引物的3'端。PCR可以采用热稳定DNA聚合酶，如Taq聚合酶。
“核苷酸”是指包括含氮碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)和至少一个磷酸基的单体单元。核苷酸包括核苷三磷酸，如RNA中发现的ATP、UTP、CTG和GTP；脱氧核苷三磷酸，最常见的是DNA中发现的dATP、dCTP、dGTP、dTTP；以及双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，其缺乏聚合酶介导的伸长所需的3'-OH，包括例如ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP。
“寡核苷酸(Oligonucleotide)”或“寡核苷酸(oligo)”是指具有长度在约5与约100、约10与约50或约10与约25个核苷酸之间或长度为至少约10、15、20、25、30、35、40、45或50并且至多约50、75或100个核苷酸的核苷酸序列的核酸。寡核苷酸，包括但不限于本文所描述的探针、引物、标签或捕获寡核苷酸，可以使用已知方法制备，包括例如Beaucage和Carruthers(1981)《脱氧核苷氨基亚磷酸酯-脱氧多核苷酸合成的一类新的关键中间体(Deoxynucleoside phosphoramidites-a new class of key intermediates fordeoxypolynucleotide synthesis)》.《四面体通讯(Tetrahedron Lett.)》,22(2):1859-1862所描述的氨基亚磷酸酯方法，或根据Matteucci和Caruthers(1981)《在聚合物支撑物上合成脱氧核苷酸(Synthesis of deoxynucleotides on a polymer support)》.《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》,103(11):3185-3191的三酯方法。
本公开的核苷酸和核酸，包括例如本公开的靶序列或寡核苷酸试剂中的那些，可以包括结构类似物，其包括也可以参与杂交反应的非天然存在的化学结构。在一个实例中，核苷酸或核酸可以包括将其连接到标记或提供可以连接到标记的反应性官能团的化学修饰，例如通过使用胺或硫醇修饰的核苷酸碱基、磷酸酯或糖。术语“反应性官能团”是指可以经历另一化学反应，例如以与另一官能团形成共价键的原子或相关的原子团。反应性官能团的实例包括但不限于氨基、硫醇基、羟基和羰基。在一个方面中，反应性官能团包括硫醇基。可以通过这些化学修饰连接到核苷酸或核酸的标记包括但不限于可检测部分，如生物素、半抗原、荧光团和电化学发光(ECL)标记。
在另一方面中，可以修饰核苷酸以防止其所并入的核酸链的酶促或化学延伸，例如通过用双脱氧核糖置换核糖或脱氧核糖基团。在另一实例中，将核苷酸碱基连接在一起的主链组分(例如糖或磷酸基)可以被修饰或置换，例如通过使用肽核酸(PNA)或通过并入核糖类似物，如2'-O-甲基取代的RNA、锁核酸、桥接核酸和吗啉代核酸中发现的那些。这些“主链”类似物可以存在于核酸或寡核苷酸的主链连接中的一者、一些或全部中，并且可以提供某些优点，如具有改进的结合稳定性或与核酸酶连接的稳定性的杂交产物。在核苷酸和核酸结构类似物的另一实例中，可以包括非天然核苷酸碱基。非天然(也称为“非规范”碱基)可以与天然(规范)碱基杂交或其可以与另一非天然碱基杂交。
“分离的”是指靶分析物，例如多肽或蛋白质，或寡核苷酸或核酸序列，其大体上或基本上不含在其天然存在的环境中通常伴随或与其相互作用的其它序列或组分。在一个方面中，分离的核苷酸序列包括在其天然环境中未与核酸序列一起发现的组分或序列。术语“分离的”还包括非天然存在或重组产生的寡核苷酸或蛋白质序列，因为此类非天然存在或重组产生的序列未在自然界中发现。特别地，非天然存在或重组产生的寡核苷酸可以具有未发现天然存在的紧邻序列。
如本文所用，术语“变异体”是指与参考多肽或寡核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同或包括参考序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续氨基酸或核苷酸的多肽或寡核苷酸序列。
术语“相同”意指两个多核苷酸或两个多肽序列分别在比较窗口内的相同位置处包括相同核酸碱基或相同氨基酸残基。术语“序列同一性％”可以通过以下来确定：在比较窗口内比较两个经过比对的序列，确定相同核酸碱基或氨基酸残基出现在这两个序列中的位置的数量以产生匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以比较窗口中的位置的总数，以及将结果乘以100以产生序列同一性百分比。比较窗口可以包括全长序列或可以是较大序列的子部分。已知用于确定两个或序列之间的同一性百分比的各种方法和算法，包括但不限于MEGALIGN(威斯康星州麦迪逊(Madison,Wis.)DNASTAR,Inc.)、FASTA、BLAST或ENTREZ。
“捕获寡核苷酸”是指可以固定在支撑表面上并且被设计成与互补寡核苷酸杂交(并且因此将互补寡核苷酸捕获在表面上)的寡核苷酸试剂。在一个方面中，捕获寡核苷酸是可以例如在严格杂交条件下与靶反应产物上存在的单链寡核苷酸标签选择性杂交的单链序列。捕获寡核苷酸可以固体形式提供(例如冻干)、以溶液形式提供或固定到支撑表面，例如在粒子(例如微粒、珠粒)上或在阵列中。可以一起提供两种或更多种捕获寡核苷酸。一起提供两种或更多种捕获寡核苷酸的实例包括如本文所描述的捕获寡核苷酸的父集或子集(在本文中也称为集合)。
“锚定试剂”是指可以固定在支撑表面上以帮助将检测复合物锚定到支撑表面的化合物。锚定试剂可以包括寡核苷酸序列、适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位或模拟表位。在一个方面中，锚定试剂包括锚定寡核苷酸。在一个方面中，锚定寡核苷酸包括单链寡核苷酸。在一个方面中，锚定寡核苷酸包括锚定序列，其具有与连接到检测复合物的延伸序列或扩增子的锚定序列互补序列的核酸序列互补的核酸序列。在一个方面中，锚定试剂包括锚定序列和寡核苷酸标签。在一个方面中，锚定序列直接连接到支撑表面。在一个方面中，锚定序列通过寡核苷酸标签与固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸之间的杂交间接连接到支撑表面。在一个方面中，锚定序列为DNA序列。在一个方面中，锚定序列为RNA序列。在一个方面中，寡核苷酸标签为DNA序列。在一个方面中，寡核苷酸标签为DNA序列。在一个方面中，锚定序列为DNA序列并且寡核苷酸标签序列为DNA序列。
“探针”或“引物”是指包括能够与靶核苷酸序列杂交的寡核苷酸序列的试剂。探针可以包括与靶核苷酸序列的一部分互补或大体上互补的单链序列。在一个方面中，探针包括与捕获寡核苷酸互补的寡核苷酸标签序列(其在本文中也可称为引导序列)。在一个方面中，探针包括标记。在一个方面中，探针包括寡核苷酸标签和标记。在一个方面中，探针包括寡核苷酸标签和检测寡核苷酸。在一个方面中，与靶核苷酸序列互补的序列和寡核苷酸标签序列存在于探针内的同一核酸链上。在一个方面中，与靶核苷酸序列互补的序列和寡核苷酸标签序列存在于探针内的不同链上，例如，探针可以包括具有与靶序列互补的序列和桥接序列的第一链以及具有标签序列和与第一链上的桥接序列互补的序列的第二链，其中第一链和第二链通过桥接序列杂交或可以通过桥接序列杂交。探针可以是DNA或RNA或其组合，并且可以含有修饰的含氮碱基类似物或已通过标记或适用于连接标记的接头修饰。探针应足够长以允许探针与靶核苷酸序列杂交，典型地长度为约5与约100、约10与约50、约20与约30之间，或至少约5、6、7、8、9、10、15、20或25并且至多约30、35、40、45、50、75或100个核苷酸。探针可以通过所属领域中已知的任何合适方法制备，包括化学或酶促合成，或通过使用非特异性核酸裂解化学品或酶或用位点特异性限制性核酸内切酶裂解较大核酸。在一些应用中，与靶序列中的互补区杂交的探针可以通过聚合酶引发探针延伸，充当靶序列上的相邻单链区复制的起点。
“靶向探针”是指包括靶互补序列和寡核苷酸标签的探针。在一个方面中，靶互补序列是具有可以与样品中的靶寡核苷酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列序列的寡核苷酸。在一个方面中，靶互补序列为单链寡核苷酸。在一个方面中，靶互补序列为DNA序列。在一个方面中，靶互补序列为RNA序列。在一个方面中，寡核苷酸标签为单链寡核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸标签具有与固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸的至少一部分互补的核苷酸序列。在一个方面中，寡核苷酸标签为DNA序列。在一个方面中，寡核苷酸标签为RNA序列。
“检测探针”是指包括靶互补序列和标记的寡核苷酸探针。在一个方面中，靶互补序列包括可以与样品中的靶寡核苷酸的寡核苷酸序列杂交的寡核苷酸序列。在一个方面中，标记包括可检测标记，例如电化学发光(ECL)标记。在一个方面中，标记包括适用于连接可检测标记的结合伴侣。在一个方面中，标记包括生物素并且可以结合到包括链霉亲和素或亲和素的可检测标记。在一个方面中，标记包括可以使用所属领域中已知的寡核苷酸扩增技术延伸或扩增的检测寡核苷酸序列。在一个方面中，检测寡核苷酸被延伸以形成包括一个或多个，或多个检测标记位点的延伸序列(或扩增子)，标记的检测试剂可以与所述位点杂交。在一个方面中，延伸序列(或扩增子)包括具有与锚定寡核苷酸的核酸序列互补并且可以与之杂交的核苷酸序列的锚定序列互补序列。在一个方面中，锚定序列互补序列与固定在支撑表面上的锚定寡核苷酸杂交以将检测复合物固定到支撑表面。在一个方面中，检测连接到固定在支撑表面上的检测复合物的延伸序列。在一个方面中，检测探针包括与固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸的至少一部分互补的单链寡核苷酸标签。在一个方面中，检测探针包括寡核苷酸标签、靶互补序列和标记。在一个方面中，检测探针包括寡核苷酸标签、靶互补序列和检测寡核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸标签为DNA序列。在一个方面中，寡核苷酸标签为RNA序列。在一个方面中，靶互补序列为DNA序列。在一个方面中，靶互补序列为RNA序列。在一个方面中，检测寡核苷酸为DNA序列。在一个方面中，检测寡核苷酸为RNA序列。在一个方面中，寡核苷酸标签为DNA序列，靶互补序列为RNA序列并且检测寡核苷酸为DNA序列。
“接头”(在本文中也称为“间隔子”)是指将一个化学部分接合到另一化学部分的一个或多个原子，例如将反应性官能团或标记接合到寡核苷酸的一个或多个原子。接头可以是核苷酸或非核苷酸化合物，其包括一个或多个原子，例如约2、3、4、5、6、7、8、9或10个原子到约11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个原子，并且可以包括如碳、氧、硫、氮和磷以及其组合的原子。接头的实例包括低分子量基团，如酰胺、酯、碳酸酯和醚，以及较高分子量连接基团，如聚乙二醇(PEG)和烷基链。因此，接头可以包含一个或多个原子、单元或分子。
“标记”是指具有可检测物理特性或能够使化学基团或部分展现可检测物理特性的化学基团或部分，包括例如催化底物转化成可检测产物的酶。标记可以通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学、化学或其它方法检测。标记的实例包括但不限于放射性同位素、酶、底物、荧光分子、化学发光部分、电化学发光部分、磁性粒子和生物发光部分。在另一方面中，标记是作为结合对的成员的化合物，其中结合对的第一成员(其可称为“一级结合试剂”)连接到底物，例如寡核苷酸，并且结合对的另一成员(其可称为“二级结合试剂”)具有可检测物理特性。结合对的非限制性实例包括生物素和链霉亲和素或亲和素；互补寡核苷酸；半抗原和半抗原结合伴侣；以及抗体/抗原结合对。在一个方面中，标记包括检测寡核苷酸。“检测”是指基于标记的存在或不存在检测、观察或定量物质(如寡核苷酸)的存在。
“检测试剂”是指可以用于检测靶分析物、探针、反应产物或检测复合物的存在的化合物。在一个方面中，检测试剂包括可检测标记。在一个方面中，可检测标记包括电化学发光(ECL)标记。在一个方面中，检测试剂包括可检测标记和连接元件，其中连接元件将可检测标记连接到靶分析物、探针、反应产物或检测复合物。在一个方面中，连接元件是结合对的成员。在一个方面中，连接元件包括链霉亲和素，并且探针、反应产物或检测复合物包括生物素，使得检测试剂通过链霉亲和素与生物素的结合而结合到探针、反应产物或检测复合物。在一个方面中，连接元件包括具有与连接到检测复合物的延伸序列(或扩增子)上的检测标记位点的核苷酸序列互补的核苷酸序列的寡核苷酸。在一个方面中，延伸序列(或扩增子)由RCA生成。在一个方面中，检测试剂包括可检测标记和具有与连接到检测复合物的延伸序列(或扩增子)上的检测标记位点的核苷酸序列互补的核苷酸序列的寡核苷酸。在一个方面中，检测试剂包括电化学发光标记和具有与连接到检测复合物的延伸序列(或扩增子)上的检测标记位点的核苷酸序列互补的核苷酸序列的寡核苷酸。“互补”是指例如根据沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对模型通过形成氢键而相互作用的核酸分子或核酸分子序列。举例来说，杂交可以发生在两个互补DNA分子之间(DNA-DNA杂交)、两个RNA分子之间(RNA-RNA杂交)或互补DNA与RNA分子之间(DNA-RNA杂交)。杂交可以发生在与较长核苷酸序列的一部分互补的短核苷酸序列之间。杂交可以发生在不具有100％“序列互补性”的序列(即，基于碱基配对模型，如沃森-克里克碱基配对模型，小于100％核苷酸对齐的序列)之间，但与具有较大序列互补性的序列相比，具有较小序列互补性的序列较不稳定并且不大可能杂交。在一个方面中，基于沃森-克里克模型，互补序列的核苷酸具有100％序列互补性。在另一方面中，基于沃森-克里克模型，互补序列的核苷酸具有至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％序列互补性。
两个互补序列是否杂交可能取决于杂交条件的严格性，其可能根据如温度、溶剂、离子强度和其它参数的条件而不同。可以选择杂交条件的严格性以在其它潜在交叉反应或干扰序列存在下提供两个互补核酸序列的所需杂交产物的选择性形成或维持。严格条件是序列依赖性的，典型地，较长互补序列与较短互补序列相比在较高温度下特异性地杂交。一般来说，在确定的离子强度、化学变性剂浓度、pH和杂交伴侣的浓度下，严格杂交条件比特定核苷酸序列的热熔点(Tm)(即，50％的序列与大体上互补序列杂交的温度)低约5℃到约10℃之间。一般来说，具有较高百分比G和C碱基的核苷酸序列比具有较低百分比G和C碱基的核苷酸序列在更严格的条件下杂交。一般来说，可以通过提高温度、提高pH、降低离子强度或提高化学核酸变性剂(如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、乙二醇、丙二醇和碳酸亚乙酯)的浓度来提高严格性。严格杂交条件典型地包括小于约1M、500mM或200mM的盐浓度；高于约20℃、30℃、40℃、60℃或80℃的杂交温度；以及高于约10％、20％、30％、40％或50％的化学变性剂浓度。因为许多因素会影响杂交的严格性，所以参数的组合可能比任何单独参数的绝对值更重要。
术语“互补序列”或“互补”是指碱基逐碱基形成互补碱基对(例如，其中A与T或U配对并且C与G配对)两个寡核苷酸。完全互补性或100％互补性是指其中一个寡核苷酸序列或区的每个核苷酸都可以与第二个寡核苷酸链或区的每个核苷酸发生氢键结的情况。“大体互补性”是指部分互补并且能够在严格杂交条件下杂交的序列。大体上互补的序列不需要沿其整个长度杂交。
“相应”可以用于指捕获寡核苷酸与寡核苷酸标签之间的关系，其中寡核苷酸标签被设计成在严格杂交条件下特异性结合到特定捕获寡核苷酸序列。在一个方面中，寡核苷酸标签特异性结合到其相应捕获分子，并且在严格条件下不与其它捕获分子结合或交叉反应。在一个方面中，寡核苷酸标签特异性结合到其相应捕获分子，并且在严格条件下不与阵列中的其它捕获分子结合或交叉反应。在一个方面中，寡核苷酸标签是具有与其“相应”捕获寡核苷酸的序列的至少部分互补的序列的单链寡核苷酸。在一个方面中，基于沃森-克里克模型，“相应”寡核苷酸标签和捕获寡核苷酸序列的核苷酸具有100％序列互补性。在另一方面中，基于沃森-克里克模型，相应序列的核苷酸具有至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％序列互补性。
单链多核苷酸具有“方向”或“方向性”，因为相邻核苷酸由其3'与5'碳原子之间的磷酸二酯键接合，使得末端5'和3'碳暴露在多核苷酸的任一端，其可称为分子的5'-(磷酰基)和3'-(羟基)端。当在5'到3'方向上读取时，“反向”寡核苷酸具有与参考寡核苷酸反向的序列。举例来说，对于参考寡核苷酸序列5'-ACCGATCATG-3'(SEQ ID NO:1649)，“反向”寡核苷酸序列将为5'-GTACTAGCCA-3'(SEQ ID NO:1650)。
根据由沃森-克里克碱基配对定义的规则以及DNA-DNA、RNA-RNA和RNA-DNA双螺旋的反向平行性质，序列的互补序列包括作为(或大体上作为)原始序列中的碱基的沃森-克里克伴侣但从3'到5'排序的一串碱基。序列5'-ACCGATCATG-3'(SEQ ID NO:1649)的互补序列的一个实例将为5'-CATGATCGGT-3'(SEQ ID NO:1651)。当术语反向互补序列在本文中关于序列使用时，其用于指代原始序列的反向的互补序列。序列5'-ACCGATCATG-3'(SEQ IDNO:1649)的反向互补序列的一个实例将为5'-TGGCTAGTAC-3'(SEQ ID NO:1652)。
“交叉反应”或“交叉反应性”是指寡核苷酸序列与样品中的多于一个其它寡核苷酸序列杂交的能力。在一个方面中，术语“交叉反应”是指第一寡核苷酸序列与样品中的第二寡核苷酸序列杂交的能力，其中第二寡核苷酸序列与第一寡核苷酸序列不互补或大体上不互补。在一个方面中，术语“交叉反应”或“交叉反应性”是指捕获寡核苷酸与样品中的多于一个寡核苷酸标签或多于一个加标签的靶核苷酸序列杂交的能力。在一个方面中，交叉反应性捕获寡核苷酸在严格捕获杂交条件下与样品中的一个或多个寡核苷酸标签杂交。在一个方面中，严格捕获杂交条件包括27℃与47℃之间的温度、21％与41％之间的甲酰胺浓度、300mM与500mM之间的盐浓度以及7.5与8.5之间的pH。在一个方面中，严格捕获杂交条件包括约37℃的温度、约31％的甲酰胺浓度、约400mM的盐浓度以及8.0的pH。
“非交叉反应性”或“非交叉反应”是指仅与样品中的特定寡核苷酸序列杂交的第一寡核苷酸序列，例如第一寡核苷酸序列仅与样品中的其相应互补序列杂交的能力。在一个方面中，术语“非交叉反应性”是指捕获寡核苷酸仅与包括多于一个寡核苷酸标签或多于一个加标签的靶核苷酸序列的样品中的一个寡核苷酸标签杂交的能力。在一个方面中，非交叉反应性寡核苷酸探针在严格杂交条件下仅与样品中的一个寡核苷酸标签杂交。在一个方面中，非交叉反应性意指第一寡核苷酸在严格捕获杂交条件下结合到样品中除其互补序列以外的序列的比率小于0.05％。
“连接酶”是指一类酶，其可以通过催化具有第二核苷酸序列的5'磷酸的一个核苷酸序列的3'羟基之间形成磷酸二酯键，将核苷酸序列接合在一起。连接酶包括大肠杆菌(E.coli)DNA连接酶、T4 DNA连接酶、T4 RNA连接酶、栖热水生菌(T.aquaticus；Taq)连接酶、极端嗜热菌(T.Thermophilus)DNA连接酶(例如HiFi连接酶)或火球菌属(Pyrococcus)DNA连接酶。在一个方面中，连接酶为热稳定连接酶。“连接”是指通过在一个核苷酸序列的3'羟基与第二核苷酸序列的5'磷酸之间形成磷酸二酯键而将两个核苷酸序列接合在一起的过程。
“阵列”是指具有多于一个空间不同(即，不重叠)的可寻址位置(在本文中称为结合域或阵列元件)的一个或多个支撑表面。在一个方面中，每个可寻址位置包括分析试剂，包括例如捕获分子。
“支撑表面”是指上面可以固定各种物质(例如寡核苷酸或多肽)的表面材料。“支撑表面”可以是平面或非平面的。在一个方面中，支撑表面包括平坦表面。在一个方面中，支撑表面是具有多个孔的板，即，“多孔板”。多孔板可以包括以任何图案或配置布置的任何数目个任何大小或形状的孔。在另一方面中，支撑表面具有弯曲表面。在一个方面中，支撑表面由一个或多个粒子、珠粒或微球提供。除非另外指示，否则术语粒子、珠粒或微球可互换使用。在一个方面中，支撑表面包括颜色编码的粒子、珠粒或微球。在一个方面中，支撑表面包括分析模块，如分析板、载玻片、盒、珠粒或芯片。在一个方面中，支撑表面包括分析流动池或分析流控。
在一个方面中，支撑表面包括多个可寻址位置(其可称为“点”)，例如，如“基因芯片”装置中典型的。在另一方面中，阵列包括多个支撑表面，其各自具有一个可寻址位置，如在“珠粒阵列”方法中，其中珠粒悬浮液中的每个珠粒代表可寻址位置(其例如可以使用流式细胞术或显微检测技术寻址)。在另一方面中，阵列包括多个支撑表面，其各自具有每个表面一个或多个，或两个或更多个可寻址位置。支撑表面上的可寻址位置可以均匀的行和列布置或可以形成其它图案。阵列上的可寻址位置的数目可以变化，例如从小于10到大于50、100、200、500或1000。“多重”是指在单一分析中同时分析多于一个分析靶。
“碳基”是指含有元素碳(C)作为主要组分的材料。含碳或碳基材料的实例包括但不限于碳、炭黑、石墨碳、玻璃碳、碳纳米管、碳原纤维、石墨、碳纤维和其混合物。碳基材料可以包括元素碳，包括例如石墨、炭黑或碳纳米管。在一个方面中，碳基材料包括导电碳-聚合物复合材料、导电聚合物或分散于基质中的导电粒子，例如碳墨、碳糊或金属墨。导电碳粒子包括例如碳原纤维、炭黑或石墨碳，其分散于基质中，例如聚合物基质，如乙烯乙酸乙烯酯(EVA)、聚苯乙烯、聚乙烯、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯或丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)。此类聚合物基质还可以包括具有多于一种类型的组分单体的共聚物，所述单体可以包括选自乙酸乙烯酯、乙烯、乙烯醇、氯乙烯、丙烯腈、丁二烯、苯乙烯或其它单体的单体。
“等位基因”是指靶核苷酸序列的基因组变异体，其在翻译时可以产生功能性或功能异常基因产物。两个等位基因形式可称为“野生型等位基因”和“突变”或“变异”等位基因。“野生型”是指群体中主导的核苷酸序列。“突变体”或“变异体”是指群体中频率较低的核苷酸序列。突变或变异核苷酸序列可能具有或可能不具有功能后果。
“多态性”或“多态性位点”是指一组两个或更多个核酸中的一个变异体。“单核苷酸变异体”(有时也称为“单核苷酸多态性”、“SNP”或“单核苷酸改变”)是指仅涉及单核苷酸的变异体。单核苷酸变异体可以涉及在多态性位点处将一个核苷酸取代为另一个核苷酸，或从参考核苷酸序列中缺失一个核苷酸，或将一个核苷酸插入参考核苷酸序列中。单核苷酸变异体可以是常见的(例如，存在于群体的至少1％中)或罕见的(例如，存在于群体的小于1％中)。
“试剂盒”是指被提供或聚集以共同地用于例如产生组合物、制造装置或进行方法的一组组分。试剂盒可以包括一种或多种组分。试剂盒的组分可以一个包装或多个包装提供，其中的每一者可以含有组分中的一者或多者。试剂盒的所列组分可转而又提供为单个物理部分或待组合以供试剂盒使用的多个部分。举例来说，试剂盒的仪器组件可完全组装地提供或以在使用前组装的多个仪器部件形式提供。类似地，试剂盒的液体试剂组分可提供为容器中的完整液体配制物、待组合以提供完整液体配制物的一种或多种干式试剂以及一种或多种液体稀释剂或待组合以提供完整液体配制物的两种或更多种液体溶液。如所属领域中已知，用于分析的试剂盒组分由于具有不同储存需求(例如，4℃与-70℃的储存温度)而通常分开运输和储存。
B.概述
本文描述用于鉴别、检测或定量样品中的一种或多种靶分析物的试剂盒及其制造和使用方法。在一个方面中，所述方法或试剂盒包括一种或多种捕获分子，其固定或可以固定在支撑表面上的离散结合域中。在一个方面中，捕获分子是具有与连接到探针或反应产物的单链寡核苷酸标签的核苷酸序列互补的核苷酸序列的单链捕获寡核苷酸。在一个方面中，包括寡核苷酸标签的探针与靶分析物缔合以将靶分析物引导到捕获分子。在一个方面中，靶分析物与包括寡核苷酸标签的第一探针和包括标记的第二探针缔合。在一个方面中，靶分析物与包括寡核苷酸标签和标记的检测探针缔合。在一个方面中，使用靶核苷酸序列作为模板生成反应产物。在一个方面中，反应产物包括寡核苷酸标签和标记。在一个方面中，反应产物包括与检测探针缔合的靶分析物，所述检测探针包括寡核苷酸标签和标记。在一个方面中，所述方法或试剂盒包括一个或多个寡核苷酸标签。在一个方面中，捕获寡核苷酸与反应产物上的标签的互补核苷酸序列之间的杂交将反应产物固定到支撑表面，形成检测复合物，其中可以基于所附标记鉴别、检测或定量捕获的反应产物。
在一个方面中，提供一种将一种或多种寡核苷酸固定在支撑表面上的方法。在一个方面中，所述方法包括将一种或多种包括硫醇反应性基团的寡核苷酸固定在支撑表面上。在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸固定在支撑表面上的一个或多个结合域中。在一个方面中，所述方法包括用含硫醇的洗涤溶液(在本文中也称为封闭溶液或封闭剂)洗涤支撑表面以去除未结合寡核苷酸的步骤。在一个方面中，每个结合域包括小于约0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％污染捕获寡核苷酸。
在一个方面中，本文所描述的用于鉴别、检测或定量样品中的一种或多种靶分析物的方法和试剂盒提供比常规方法更高的灵敏度。在一个方面中，本公开的方法和试剂盒能够检测样品中纳摩尔、适合地皮摩尔或更适合地飞摩尔浓度的靶分析物。在一个方面中，本公开的方法和试剂盒能够检测样品中至少约0.1fM、1fM、25fM、50fM、75fM或100fM并且至多约500fM、1pM、10pM、100pM、500pM或1nM，或约0.1fM至约1nM、约1fM至约100pM、约10fM至约10pM、约50fM至约1pM或约100fM至约500fM的靶分析物。在一个方面中，本公开的方法和试剂盒能够检测样品中约0.1fM、约1fM、约2.5fM、约5fM、约10fM、约25fM、约50fM、约100fM、约250fM、约500fM、约1pM、约2.5pM、约5pM、约10pM、约25pM、约50pM、约100pM或约1nM的靶分析物。
在一个特定方面中，本文所提供的方法和试剂盒能够检测样品中飞摩尔浓度的多核苷酸(例如，治疗性寡核苷酸或RNA，如mRNA)，其有利地允许在不需要扩增多核苷酸的情况下鉴别、检测和/或定量。
在一个方面中，与常规方法相比，本文所提供的方法和试剂盒能够减少鉴别、检测或定量样品中的一种或多种靶分析物所需的时间量。在一个方面中，本公开的方法和试剂盒能够在约1小时到约48小时、约1.5小时到约24小时、约2小时到约18小时、约2.5小时到约12小时、约3小时到约10小时、约3.5小时到约8小时、约4小时到约6小时或约4.5小时到约5小时内鉴别、检测或定量样品中的一种或多种靶分析物。在一个方面中，本公开的方法和试剂盒能够在小于约48小时、小于约36小时、小于约24小时、小于约18小时、小于约12小时、小于约10小时、小于约9小时、小于约8小时、小于约7小时、小于约6小时、小于约5小时、小于约4小时、小于约3小时、小于约2小时或小于约1小时内鉴别、检测或定量样品中的一种或多种靶分析物。
C.捕获分子
在一个方面中，所述方法或试剂盒包括一种或多种捕获分子，其固定或可以固定在支撑表面上的离散结合域中。在一个方面中，捕获分子不是天然存在的序列。在另一方面中，捕获分子是重组产生的。在一个方面中，使用数学算法生成非交叉反应性捕获分子的集合的序列。
在一个方面中，捕获分子是具有与单链寡核苷酸标签的核苷酸序列互补的核苷酸序列的单链捕获寡核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸标签连接到靶分析物。在一个方面中，寡核苷酸标签连接到与靶分析物缔合的探针。在一个方面中，寡核苷酸标签连接到使用靶核苷酸序列作为模板生成的反应产物。在一个方面中，捕获寡核苷酸与寡核苷酸标签的互补核苷酸序列之间的杂交将所关注的靶或反应产物固定到支撑表面以形成检测复合物。随后可以基于所附标记鉴别、检测或定量捕获的靶或反应产物。
在一个方面中，所述方法或试剂盒包括用于待鉴别、检测或测量的每个靶核苷酸序列的不同捕获寡核苷酸。在一个方面中，多种捕获寡核苷酸与其互补寡核苷酸标签之间的杂交跨捕获寡核苷酸的阵列同时并行发生。阵列可以包含本文所描述的两种或更多种捕获寡核苷酸或由其组成。因此，阵列可以包含2-150种或更多种捕获寡核苷酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或至多60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或150种捕获寡核苷酸。阵列中的寡核苷酸可以包含如本文所描述的寡核苷酸的“父集”或“子集”(在本文中也称为“集合”)或由其组成。
在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸包括单链核酸序列，包括例如包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或包括也可以参与杂交反应的非天然存在的化学结构的结构类似物的核酸序列。
在一个方面中，用于特定阵列的捕获寡核苷酸具有相似的结合能或解链温度(Tm)，例如，在彼此的至少约0.5℃、1℃、2℃、3℃、4℃或5℃内，其中寡核苷酸的解链温度(Tm)是指50％的寡核苷酸与其互补序列杂交并且50％在溶液中游离的温度。Tm可以使用已知方法确定，例如通过测量寡核苷酸与其互补序列随温度而变的吸光度变化。在一个方面中，捕获寡核苷酸在50mM NaCl下的解链温度(Tm)在约50℃与约70℃之间、55℃与约65℃之间，或至少约50℃、55℃或60℃并且至多约60℃、65℃或70℃。在一个方面中，捕获寡核苷酸的GC含量在约40％与约60％之间，或约40％与约50％之间。
在一个方面中，捕获寡核苷酸的长度在约20与约100、约30与约50或约35与约40个核苷酸之间，例如长度为至少约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36并且至多约36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、75或100个核苷酸。在一个方面中，捕获寡核苷酸包括至少20、24、30或36个核苷酸。长度为至少约20、24、30或36个核苷酸的捕获寡核苷酸能够结合到加标签的靶或反应产物，并且与较短捕获寡核苷酸相比在较高的高温下保持结合并且具有改进的特异性(即，较少非特异性结合)。在一个方面中，阵列中的一种或多种捕获寡核苷酸在长度上与其互补寡核苷酸标签的核酸序列不相同。事实上，可能需要包括具有比其互补单链寡核苷酸标签长例如至多5、10、15、20或25个碱基的序列的捕获寡核苷酸。在一个方面中，以约1:1的比包括加标签的靶或反应产物和捕获寡核苷酸。在另一方面中，加标签的靶或反应产物过量存在以增加加标签的靶或反应产物与捕获寡核苷酸结合的可能性。在一个方面中，以约2:1、3:1、4:1或5:1的比包括加标签的反应产物和捕获寡核苷酸。
在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸共价或非共价固定到支撑表面。在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸共价或非共价固定到支撑表面上的一个或多个结合域。在一个方面中，捕获寡核苷酸通过例如寡核苷酸上带负电的磷酸基与支撑表面上的正电荷之间的静电相互作用吸附到支撑表面。在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸通过连接(直接或通过接头部分)到捕获寡核苷酸的第一结合伴侣与固定在表面上的第二结合伴侣的结合而固定到支撑表面。在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸共价固定到支撑表面。在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸直接固定到支撑表面。在另一方面中，捕获寡核苷酸通过接头固定到支撑表面。
在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸包括反应性官能团。在一个方面中，官能团包括硫醇(-SH)或胺(-NH2)基团。在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸通过反应性官能团固定到支撑表面。在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸通过反应性官能团固定到支撑表面，所述反应性官能团通过接头连接到捕获寡核苷酸。在一个方面中，捕获寡核苷酸通过硫醇或胺基团固定到支撑表面。在一个方面中，捕获寡核苷酸通过硫醇或胺基团固定到支撑表面，所述硫醇或胺基团通过接头(在本文中也称为“间隔子”)连接到捕获寡核苷酸。在一个方面中，接头包括约3与约20个之间的原子或分子或单元，或至少约3、4、5、6、7、8、9、10并且至多约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个原子或分子或单元。在一个方面中，接头为碳原子接头。在一个方面中，接头为乙二醇接头或聚乙二醇(PEG)接头。在一个方面中，接头包括至多3、4、5或6个连续PEG单元。在另一方面中，接头包括三个连续PEG单元。在另一方面中，接头包括六个连续PEG单元。接头可以具有实例2中所示的结构。
在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸固定到已用如牛血清白蛋白(BSA)的蛋白质预处理的支撑表面。在另一方面中，捕获寡核苷酸通过交联剂固定到支撑表面。用于将蛋白质和核酸彼此连接或连接到其它材料的合适的同型双官能和异质双官能交联剂是所属领域中众所周知的，参见例如《赛默科技交联技术手册(Thermo ScientificCrosslinking Technical Handbook)》，赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)2012年出版)。在一个方面中，交联剂是异质双官能交联剂，其包含胺反应性部分(如N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯)和硫醇反应性部分，如马来酰亚胺、碘代琥珀酰亚胺或活化二硫化物(如吡啶基二硫化物)；此类异质双官能交叉官能交联剂包括例如磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(Sulfo-SMCC)。在一个方面中，胺反应性部分(例如SMCC的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分)与蛋白质反应以将硫醇反应性部分(例如SMCC的马来酰亚胺部分)引入蛋白质中。硫醇反应性部分又与硫醇修饰的捕获寡核苷酸反应以形成通过稳定硫醚键连接的蛋白质-寡核苷酸缀合物。蛋白质-寡核苷酸缀合物的阵列可以通过将试剂的图案印刷在吸附蛋白质或与蛋白质反应的表面上以生成图案化阵列来形成。在一个方面中，通过在石墨碳表面(例如，丝网印刷碳墨电极)上印刷蛋白质-寡核苷酸缀合物形成阵列。参见例如美国专利公开号2016/0069872、美国专利6,977,722和7,842,246，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸固定到尚未用蛋白质预处理的支撑表面上。在一个方面中，如上文所描述，用于固定寡核苷酸的蛋白质-寡核苷酸的蛋白质组分为BSA。
在一个方法中，计算机算法用于生成符合以下要求中的一者或多者的上文所论述的长度(例如24、30或36聚体)的捕获寡核苷酸的集合：(a)约40％与约50％之间的GC含量，(b)约30％与约70％之间的AG含量，(c)约30％与约70％之间的CT含量，(d)不超过三个的序列中的最大碱基重复串，(e)没有不需要的与连续超过7个互补碱基对匹配的串的寡核苷酸-寡核苷酸相互作用，(f)没有不需要的与18个连续碱基或更少的串的寡核苷酸-寡核苷酸相互作用，其中(i)每一端的末端碱基是互补匹配和(ii)互补碱基对匹配之和减错配之和大于7，(g)没有20个碱基对或更长(例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36bp)的串匹配给定基因组(例如人类基因组)中或自然界中序列中的序列(或序列的互补序列或两者)，(h)序列与其互补序列(或从5'端起的前24个寡核苷酸与其互补序列)的杂交自由能差异小于约1kCal/mol、约2kCal/mol、约3kCal/mol或约4kCal/mol，(i)没有在茎中具有4个或更多个连续匹配的预测发夹环，(j)没有在茎中具有4个或更多个连续匹配且环大小大于6个碱基的预测发夹环。在一个方面中，考虑至少标准(a)到(h)。在此上下文中，不需要的寡核苷酸-寡核苷酸相互作用是指寡核苷酸与自身、与集合内的另一序列或与集合内的另一序列的互补序列的相互作用。杂交自由能(ΔG)一般针对指定离子强度、温度和pH计算，例如生理离子强度和pH(约150mM NaCl，约pH 7.2)在室温(约25℃)下，或约200mM一价阳离子，约pH 7.0在约23℃下，或另一相关条件。或者或另外，可以避免以下配置中的一者或多者：当与分析中使用的其它捕获寡核苷酸配对时，形成定位于富G/C序列之间的单核苷酸环或单核苷酸错配。
在一个方面中，捕获分子包括SEQ ID NO:1-774(表1-12)中的任一者中所示的寡核苷酸序列。在一个方面中，捕获寡核苷酸具有与SEQ ID NO:1-774中的任一者中所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。在另一方面中，捕获寡核苷酸具有包括SEQ ID No:1-774中的任一者中所示的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一方面中，捕获寡核苷酸具有包括SEQ ID No:1-774中的任一者中所示的序列的至少20个连续核苷酸的核苷酸序列。
在另一方面中，捕获寡核苷酸具有SEQ ID No:1-64中的任一者中所示的核苷酸序列。在一个方面中，捕获寡核苷酸具有与SEQ ID NO:1-64中的任一者中所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。在另一方面中，捕获寡核苷酸具有包括SEQ ID No:1-64中的任一者中所示的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一方面中，捕获寡核苷酸具有包括SEQ ID No:1-64中的任一者中所示的序列的至少20个连续核苷酸的核苷酸序列。
在另一方面中，捕获寡核苷酸具有SEQ ID No:1到10、11到13、25到26、33到37、42、44到46、54和59到62中的任一者中所示的核苷酸序列。在一个方面中，捕获寡核苷酸具有与SEQ ID NO:1到10、11到13、25到26、33到37、42、44到46、54和59到62中的任一者中所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。在另一方面中，捕获寡核苷酸具有包括SEQ ID No:1到10、11到13、25到26、33到37、42、44到46、54和59到62中的任一者中所示的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一方面中，捕获寡核苷酸具有包括SEQ ID No:1到10、11到13、25到26、33到37、42、44到46、54和59到62中的任一者中所示的序列的至少20个连续核苷酸的核苷酸序列。
在另一方面中，捕获寡核苷酸具有SEQ ID No:1-10中的任一者中所示的核苷酸序列。在一个方面中，捕获寡核苷酸具有与SEQ ID NO:1-10中的任一者中所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。在另一方面中，捕获寡核苷酸具有包括SEQ ID No:1-10中的任一者中所示的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一方面中，捕获寡核苷酸具有包括SEQ ID No:1-10中的任一者中所示的序列的至少20个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一方面中，捕获寡核苷酸具有与包括SEQ ID No:1-10中的任一者中所示的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。在另一方面中，捕获寡核苷酸具有与包括SEQ ID No:1-10中的任一者中所示的序列的至少20个连续核苷酸的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。
在一个方面中，碱基序列用于使用算法生成非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合。在一个方面中，生成至多四个集合的非交叉反应性捕获寡核苷酸：(a)使用碱基序列生成第一集合的非交叉反应性捕获寡核苷酸；(b)可以生成第二集合的非交叉反应性捕获寡核苷酸，其具有与第一集合中的捕获寡核苷酸序列互补的序列；(c)可以生成第三集合的非交叉反应性捕获寡核苷酸，其具有第一集合中的捕获寡核苷酸序列的反向序列；以及(d)可以生成第四集合的非交叉反应性捕获寡核苷酸，其具有作为第一集合中的捕获寡核苷酸序列的反向互补序列的序列。
在一个方面中，使用碱基序列生成的每个非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合称为“父集”。可以选择来自父集的两种或更多种寡核苷酸以形成非交叉反应性捕获寡核苷酸的“子集”(在本文中也称为“集合”)，其中子集中的每个寡核苷酸是同一父集的成员(即，子集不能包括来自多于一个父集的捕获寡核苷酸)。
举例来说，碱基序列可以用于生成：(a)第一父集的非交叉反应性捕获寡核苷酸；(b)可以生成第二父集的非交叉反应性捕获寡核苷酸，其具有与第一集合中的捕获寡核苷酸序列互补的序列；(c)可以生成第三父集的非交叉反应性捕获寡核苷酸，其具有第一集合中的捕获寡核苷酸序列的反向序列；以及(d)可以生成第四父集的非交叉反应性捕获寡核苷酸，其具有作为第一集合中的捕获寡核苷酸序列的反向互补序列的序列。
子集(或集合)可以包括：(a)来自第一父集的两种或更多种非交叉反应性捕获寡核苷酸；(b)来自第二父集的两种或更多种非交叉反应性捕获寡核苷酸；(c)来自第三父集的两种或更多种非交叉反应性捕获寡核苷酸；或(d)来自第四父集的两种或更多种非交叉反应性捕获寡核苷酸。在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合或子集包括约50与约150种之间、约50与约100种之间、约60与约75种之间或约60与约65种之间的选自非交叉反应性寡核苷酸的父集的非交叉反应性捕获寡核苷酸。在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合或子集包括至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25并且至多约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、70、75、80、85、90、95、100、125或150种选自非交叉反应性寡核苷酸的父集的非交叉反应性寡核苷酸。
在一个方面中，第一碱基序列用于生成表1(SEQ ID NO:1-64)中所示的第一集合的非交叉反应性捕获寡核苷酸。此第一集合的非交叉反应性捕获寡核苷酸的互补序列可以用于生成表4(SEQ ID NO:187-250)中所示的另一集合的非交叉反应性序列。此第一集合的非交叉反应性捕获寡核苷酸的反向序列可以用于生成表7(SEQ ID NO:373-436)中所示的另一集合的非交叉反应性序列。此第一集合的非交叉反应性捕获寡核苷酸的反向互补序列可以用于生成表10(SEQ ID NO:559-622)中所示的另一集合的非交叉反应性序列。
在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括来自表1(SEQ ID NO:1-64)中所示的父集的两个或更多个序列。在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括来自表4(SEQ ID NO:187-250)中所示的父集的两个或更多个序列。在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括来自表7(SEQ ID NO:373-436)中所示的父集的两个或更多个序列。在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括来自表10(SEQ IDNO:559-622)中所示的父集的两个或更多个序列。在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合是选自表1(SEQ ID NO:1-64)、表4(SEQ ID NO:187-250)、表7(SEQ ID NO:373-436)或表10(SEQ ID NO:559-622)中所示的父集的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25并且至多64个非交叉反应性序列的子集。
在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括一种或多种具有与表1(SEQ ID NO:1-64)、表4(SEQ ID NO:187-250)、表7(SEQ ID NO:373-436)或表10(SEQ IDNO:559-622)中所示的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列的捕获寡核苷酸。在另一方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括一种或多种具有包括表1(SEQ ID NO:1-64)、表4(SEQ ID NO:187-250)、表7(SEQ ID NO:373-436)或表10(SEQID NO:559-622)中所示的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列的捕获寡核苷酸。在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括一种或多种具有与包括表1(SEQ ID NO:1-64)、表4(SEQ ID NO:187-250)、表7(SEQ ID NO:373-436)或表10(SEQ ID NO:559-622)中所示的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列的捕获寡核苷酸。
在一个方面中，第二碱基序列用于生成表2(SEQ ID NO:65-122)中所示的第二集合的非交叉反应性捕获寡核苷酸。此第二集合的非交叉反应性捕获寡核苷酸的互补序列可以用于生成表5(SEQ ID NO:251-308)中所示的另一集合的非交叉反应性序列。此第二集合的非交叉反应性捕获寡核苷酸的反向序列可以用于生成表8(SEQ ID NO:437-494)中所示的另一集合的非交叉反应性序列。此第二集合的非交叉反应性捕获寡核苷酸的反向互补序列可以用于生成表11(SEQ ID NO:623-680)中所示的另一集合的非交叉反应性序列。
在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括来自表2(SEQ ID NO:65-122)中所示的父集的两个或更多个序列。在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括来自表5(SEQ ID NO:251-308)中所示的父集的两个或更多个序列。在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括来自表8(SEQ ID NO:437-494)中所示的父集的两个或更多个序列。在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括来自表11(SEQ IDNO:623-680)中所示的父集的两个或更多个序列。在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合是选自表2(SEQ ID NO:65-122)、表5(SEQ ID NO:251-308)、表8(SEQ ID NO:437-494)或表11(SEQ ID NO:623-680)中所示的父集的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25并且至多64个非交叉反应性序列的子集。
在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括一种或多种具有与表2(SEQ ID NO:65-122)、表5(SEQ ID NO:251-308)、表8(SEQ ID NO:437-494)或表11(SEQ IDNO:623-680)中所示的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列的捕获寡核苷酸。在另一方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括一种或多种具有包括表2(SEQ ID NO:65-122)、表5(SEQ ID NO:251-308)、表8(SEQ ID NO:437-494)或表11(SEQ ID NO:623-680)中所示的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列的捕获寡核苷酸。在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括一种或多种具有包括与表2(SEQ ID NO:65-122)、表5(SEQ IDNO:251-308)、表8(SEQ ID NO:437-494)或表11(SEQ ID NO:623-680)中所示的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列的捕获寡核苷酸。
在一个方面中，第三碱基序列用于生成表3(SEQ ID NO:123-186)中所示的第三集合的非交叉反应性捕获寡核苷酸。此第三集合的非交叉反应性捕获寡核苷酸的互补序列可以用于生成表6(SEQ ID NO:309-372)中所示的另一集合的非交叉反应性序列。此第三集合的非交叉反应性捕获寡核苷酸的反向序列可以用于生成表9(SEQ ID NO:495-558)中所示的另一集合的非交叉反应性序列。此第三集合的非交叉反应性捕获寡核苷酸的反向互补序列可以用于生成表12(SEQ ID NO:681-744)中所示的另一集合的非交叉反应性序列。
在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括来自表3(SEQ ID NO:123-186)中所示的父集的两个或更多个序列。在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括来自表6(SEQ ID NO:309-372)中所示的父集的两个或更多个序列。在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括来自表9(SEQ ID NO:495-558)中所示的父集的两个或更多个序列。在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括来自表12(SEQ IDNO:681-744)中所示的父集的两个或更多个序列。在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合是选自表3(SEQ ID NO:123-186)、表6(SEQ ID NO:309-372)、表9(SEQ ID NO:495-558)或表12(SEQ ID NO:681-744)中所示的父集的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25并且至多64个非交叉反应性序列的子集。
在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括一种或多种具有与表3(SEQ ID NO:123-186)、表6(SEQ ID NO:309-372)、表9(SEQ ID NO:495-558)或表12(SEQID NO:681-744)中所示的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列的捕获寡核苷酸。在另一方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括一种或多种具有包括表3(SEQ ID NO:123-186)、表6(SEQ ID NO:309-372)、表9(SEQ ID NO:495-558)或表12(SEQ ID NO:681-744)中所示的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列的捕获寡核苷酸。在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括一种或多种具有包括与表3(SEQ ID NO:123-186)、表6(SEQ IDNO:309-372)、表9(SEQ ID NO:495-558)或表12(SEQ ID NO:681-744)中所示的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列的捕获寡核苷酸。
在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括一种或多种选自以下的捕获寡核苷酸：具有选自SEQ ID No:1-64的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；具有与选自SEQ ID No:1-64的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的捕获寡核苷酸；具有与选自SEQID No:1-64的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；具有选自SEQ ID No:1-64的序列的捕获寡核苷酸；以及其组合。
在一个方面中，非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合包括一种或多种选自以下的捕获寡核苷酸：具有选自SEQ ID No:1-10的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；具有与选自SEQ ID No:1-10的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的捕获寡核苷酸；具有与选自SEQID No:1-10的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；具有选自SEQ ID No:1-10的序列的捕获寡核苷酸；以及其组合。
在一个方面中，捕获寡核苷酸共价结合到蛋白质并且通过蛋白质吸附到支撑表面实现在支撑表面上的固定。可以使用的蛋白质的实例包括白蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白或针对其吸附至支撑表面的能力而选择的另一蛋白质。在另一方面中，捕获寡核苷酸连接(直接或通过接头)到来自结合伴侣对的第一结合伴侣，并且通过此第一结合伴侣与来自固定在支撑表面上的结合伴侣对的第二结合伴侣的结合实现固定。适用于固定捕获寡核苷酸的结合伴侣对包括所属领域中已知的结合伴侣对，如生物素-链霉亲和素、生物素-亲和素、抗体-半抗原、抗体-表位标签(例如抗体-FLAG)、镍-NTA以及受体-配体对。在一个方面中，捕获寡核苷酸通过硫醇(-SH)或胺(-NH2)基团共价结合到蛋白质或第一结合伴侣。此结合可以是直接的或通过连接基团(例如，双官能连接基团，如赛默飞世尔科技2012年出版的《赛默科技交联技术手册》中所描述的那些)。在一个方面中，硫醇或胺基团在捕获寡核苷酸的5'或3'端处。在一个方面中，捕获寡核苷酸为5'末端硫醇化寡核苷酸。在一个方面中，捕获寡核苷酸为3'末端硫醇化寡核苷酸。在一个方面中，硫醇基在捕获寡核苷酸的内部位置处并入。在一个方面中，捕获寡核苷酸具有包括SEQ ID NO:1489-1498(表25)中的任一者中所示的序列的核苷酸序列。在一个方面中，捕获寡核苷酸具有与SEQ ID NO:1489-1498中的任一者中所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。在另一方面中，捕获寡核苷酸具有包括SEQ ID No:1489-1498中所示的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一方面中，捕获寡核苷酸具有包括与SEQ ID NO:1489-1498中的任一者中所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列。
在一个方面中，捕获寡核苷酸通过硫醇(-SH)或胺(-NH2)基团共价结合到支撑表面。在一个方面中，硫醇或胺基团在捕获寡核苷酸的5'或3'端处。在一个方面中，捕获寡核苷酸为5'末端硫醇化寡核苷酸。在一个方面中，捕获寡核苷酸为3'末端硫醇化寡核苷酸。在一个方面中，硫醇基在捕获寡核苷酸的内部位置处并入。在一个方面中，捕获寡核苷酸具有包括SEQ ID NO:1489-1498(表25)中的任一者中所示的序列的核苷酸序列。在一个方面中，捕获寡核苷酸具有与SEQ ID NO:1489-1498中的任一者中所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。在另一方面中，捕获寡核苷酸具有包括SEQ ID No:1489-1498中所示的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一方面中，捕获寡核苷酸具有包括与SEQ ID NO:1489-1498中的任一者中所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列。
在一个方面中，捕获寡核苷酸具有作为SEQ ID NO:1489-1498中所示的核苷酸序列的互补序列、反向序列或反向互补序列的核苷酸序列。在一个方面中，捕获寡核苷酸具有作为与SEQ ID NO:1489-1498中的任一者中所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列的互补序列、反向序列或反向互补序列的核苷酸序列。在另一方面中，捕获寡核苷酸具有作为具有SEQ ID No:1489-1498中所示的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的序列的互补序列、反向序列或反向互补序列的序列。在另一方面中，捕获寡核苷酸具有作为包括与SEQ ID No:1489-1498中的任一者中所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的序列的互补序列、反向序列或反向互补序列的核苷酸序列。
在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸仅包括三个碱基(TAG)以减少与天然序列的杂交，类似于Luminex x-TAG技术。
D.锚定试剂
在一个方面中，支撑表面包括锚定试剂以将检测复合物锚定到支撑表面。举例来说，锚定试剂可以帮助稳定具有低结合亲和力相互作用和/或高分子量标记或标记位点的检测复合物。锚定试剂公开于国际申请号PCT/US20/020288；提交：2020年2月28日，标题为用于进行多重分析的改进的方法(IMPROVED METHODS FOR CONDUCTING MULTIPLEXEDASSAYS)，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
在一个方面中，锚定试剂包括寡核苷酸序列、适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位或模拟表位。在一个方面中，锚定试剂包括单链寡核苷酸序列，并且可称为锚定寡核苷酸。在一个方面中，锚定寡核苷酸包括与连接到检测复合物的锚定序列互补序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个方面中，具有锚定区的寡核苷酸连接到检测复合物。在一个方面中，锚定试剂为结合到连接到检测复合物的锚定区的DNA结合蛋白。在一个方面中，锚定试剂为嵌入剂，并且连接到检测复合物的锚定区为双链寡核苷酸序列。在一个方面中，连接到检测复合物的锚定区包括由锚定试剂结合的一种或多种修饰的寡核苷酸碱基。
在一个方面中，锚定试剂包括具有可以与连接到检测复合物的锚定序列互补序列杂交的核苷酸序列的锚定寡核苷酸。在一个方面中，锚定寡核苷酸具有可以与连接到检测复合物的延伸序列(或扩增子)中存在的锚定序列互补序列杂交的核苷酸序列。在一个方面中，锚定寡核苷酸包括与不结合检测试剂的延伸序列(或扩增子)的锚定序列互补序列杂交的序列。锚定寡核苷酸序列可以包括可以与在本文所描述的延伸过程期间连接到检测复合物的延伸序列(或扩增子)杂交的任何序列。在一个方面中，与锚定序列互补序列杂交的锚定寡核苷酸序列的长度为约20个核苷酸起并且长度为至多约30个核苷酸。在一个方面中，锚定试剂包括锚定序列和寡核苷酸标签，其中寡核苷酸标签将锚定试剂固定到支撑表面。在一个方面中，锚定试剂包括锚定序列、寡核苷酸标签和接头，如多(A)寡核苷酸序列。
锚定试剂可以使用所属领域中已知用于固定寡核苷酸的方法直接或间接地共价或非共价结合到支撑表面。在一个方面中，锚定试剂直接固定在固体支撑物上。在一个方面中，锚定试剂间接固定在固体支撑物上。在一个方面中，锚定试剂共价连接到支撑表面。在一个方面中，锚定试剂非共价连接到支撑表面。在一个方面中，支撑表面包括一种或多种，或多种捕获分子。在一个方面中，捕获分子包括具有与单链寡核苷酸标签的核苷酸序列互补的核苷酸序列的单链捕获寡核苷酸。在一个方面中，锚定试剂包括锚定序列。在一个方面中，锚定序列与从检测复合物延伸的扩增子的锚定序列互补序列互补。在一个方面中，锚定试剂包括寡核苷酸标签。在一个方面中，锚定试剂通过锚定试剂的寡核苷酸标签与具有与支撑表面杂交的互补序列的捕获寡核苷酸之间的杂交而固定在支撑表面上。
在一个方面中，锚定试剂包括与锚定序列互补序列或捕获寡核苷酸不互补的寡核苷酸序列。在一个方面中，非互补区包括接头序列，其用以将锚定寡核苷酸的与检测复合物的锚定序列互补序列互补的区延伸远离表面。在一个方面中，接头序列包括多(A)序列。
在一个方面中，锚定试剂的锚定序列包括具有长度为约10至约30或约17至约25个核酸的核酸序列的寡核苷酸。在一个方面中，锚定试剂的锚定序列包括具有长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20并且至多约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个核酸的核酸序列的寡核苷酸。在一个方面中，锚定试剂的锚定序列包括具有长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个核酸的核酸序列的寡核苷酸。在一个方面中，锚定试剂包括长度为约17或约25个寡核苷酸的寡核苷酸。
在一个方面中，锚定试剂的锚定序列具有包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ IDNO:1669)的核苷酸序列。在一个方面中，锚定试剂的锚定序列具有由5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:1669)组成的核苷酸序列。在一个方面中，锚定试剂的锚定序列具有包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(SEQ ID NO:1665)的核苷酸序列。在一个方面中，锚定试剂的锚定序列具有由5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(SEQ IDNO:1665)组成的核苷酸序列。
在一个方面中，提供锚定试剂的集合，其中每一锚定试剂包括寡核苷酸标签、接头和锚定寡核苷酸。在一个方面中，每一锚定试剂包括5'寡核苷酸标签、多A接头和3'锚定寡核苷酸。在一个方面中，提供10种锚定试剂的集合用于10点分析。在一个方面中，提供10种锚定试剂的集合以与10点分析板一起使用，其中互补寡核苷酸捕获分子固定在分析板的孔内的10个离散结合域中。
在一个方面中，集合中的一种或多种锚定试剂包括相同接头序列。在一个方面中，集合中的一种或多种锚定试剂包括与集合中的其它锚定试剂不同的接头序列。在一个方面中，集合中的每一锚定试剂包括相同接头序列。在一个方面中，接头序列包括多A序列。在一个方面中，接头序列包括约1到约10个腺嘌呤碱基。在一个方面中，接头序列包括约1、约2、约3、约4或约5并且至多约6、约7、约8、约9或约10个腺嘌呤碱基。在一个方面中，接头序列包括约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个腺嘌呤碱基。在一个方面中，接头序列包括约5个腺嘌呤碱基。在一个方面中，接头序列包括约6个腺嘌呤碱基。在一个方面中，接头序列包括约7个腺嘌呤碱基。
在一个方面中，一种或多种锚定试剂包括与集合中的其它锚定试剂相同的锚定序列。在一个方面中，一种或多种锚定试剂包括与集合中的其它锚定试剂不同的锚定序列。在一个方面中，集合中的每一锚定试剂包括相同锚定序列。
在一个方面中，提供10种锚定试剂(如表26中所示的那些)的集合，以与10点分析板一起使用。
E.支撑表面
在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸固定在支撑表面上。捕获寡核苷酸可以固定在多种支撑表面上，包括用于常规结合分析的支撑表面。在一个方面中，支撑表面具有平坦表面。在另一方面中，支撑表面具有弯曲表面。在一个方面中，支撑表面包括分析模块，如分析板、载玻片、盒、珠粒或芯片。在一个方面中，支撑表面包括颜色编码微球。参见例如Yang等人(2001)《BADGE，用于检测基因表达的珠粒阵列，一种高通量诊断生物分析(BADGE,BeadsArray for the Detection of Gene Expression,a High-Throughput DiagnosticBioassay)》.《基因组研究(Genome Res.)》11(11):1888-1898。在一个方面中，支撑表面包括一个或多个珠粒，一种或多种捕获寡核苷酸固定在所述珠粒上。
支撑表面可以由多种合适的材料制成，包括聚合物(如聚苯乙烯和聚丙烯)、陶瓷、玻璃、复合材料，包括例如碳-聚合物复合材料，如碳基墨。在一个方面中，支撑表面为碳基支撑表面。
在一个方面中，支撑表面由一个或多个粒子或“珠粒”提供。在一个方面中，珠粒可以具有至多约1cm(或10,000μm)、5,000μm、1,000μm、500μm或100μm的直径。在一个方面中，珠粒具有约10nm与约100μm之间、约100nm与约10μm之间或约0.5μm与约5μm之间的直径。在一个方面中，珠粒为顺磁性的，提供通过使用磁场捕获珠粒的能力。在一个方面中，支撑表面由链霉亲和素或亲和素涂布的磁性珠粒提供，并且生物素标记的捕获寡核苷酸固定在珠粒上。
在一个方面中，支撑表面是具有多个孔的板，即，“多孔板”。多孔板可以包括以任何图案或配置布置的任何数目个任何大小或形状的孔。在一个方面中，多孔板包括约1到约10,000个之间的孔。在一个方面中，多孔分析板针对板和孔的数目、大小、形状和配置使用行业标准格式。标准格式的实例包括96、384、1536和9600孔板，其中孔以二维阵列配置。其它多孔格式包括单孔、二孔、六孔和二十四孔以及6144孔板。在一个方面中，支撑表面包括96孔板。
在一个方面中，支撑表面包括二维图案化阵列，其中捕获分子印刷在称为结合域的已知位置处。在一个方面中，支撑表面包括捕获寡核苷酸所固定到的离散、非重叠、可寻址结合域的图案化阵列，其中每个结合域中的捕获寡核苷酸的序列是已知的并且可以与适当靶分析物或靶反应产物相关联。在一个方面中，特定结合域中的所有捕获寡核苷酸具有相同序列，并且一个结合域中的捕获寡核苷酸具有不同于其它结合域中的捕获寡核苷酸的序列。在一个方面中，多个结合域以有序的行和列排列在支撑表面上，并且每个结合域的精确位置和序列记录在计算机数据库中。在一个方面中，阵列布置成对称栅格图案。在其它方面中，阵列布置成另一图案，包括但不限于径向分布的线、螺旋线或有序簇。在另一方面中，每个结合域定位于一个或多个微粒或珠粒的表面上，其中微粒或珠粒被编码以允许不同结合域之间的区分。
在一个方面中，支撑表面包括二维图案化阵列，其中捕获分子和锚定试剂固定在称为结合域的已知位置处。在一个方面中，捕获分子和锚定试剂位于相同结合域上。在一个方面中，捕获分子和锚定试剂位于两个不同结合域上。在一个方面中，支撑表面包括多个不同结合域，并且捕获分子和锚定试剂位于相同结合域上。在一个方面中，支撑表面包括多个不同结合域，并且捕获分子和锚定试剂位于两个不同结合域上。在一个方面中，支撑表面是板的孔，其中孔包括多个不同结合域，捕获分子和锚定试剂位于所述结合域中。在一个方面中，孔包括多个不同结合域，其中捕获分子和锚定试剂位于孔内的两个不同结合域上。在一个实施例中，孔可以包括多个不同结合域，其中捕获分子和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。在一个方面中，孔包括电极，其包括多个不同结合域，其中捕获分子和锚定试剂位于电极上的相同结合域上。在一个方面中，孔包括电极，其包括多个不同结合域，其中捕获分子和锚定试剂位于电极上的两个不同结合域上。在一个方面中，支撑表面包括电极，并且测量步骤包括将电压波形施加到电极以生成电化学发光(ECL)信号。
在一个方面中，支撑表面是包括对应于一种或多种捕获寡核苷酸的每个孔内的一个或多个离散可寻址结合域的多孔板。在一个方面中，支撑表面包括至少一个用于检测野生型核苷酸序列的结合域和用于检测突变核苷酸序列的独立结合域。在一个方面中，每个孔包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个结合域。在一个方面中，每个孔包括至少7、10、16或25个结合域。
在一个方面中，支撑表面是包括至少24、96或384个孔的多孔板，并且每个孔包括至多10个结合域的阵列，其中不同捕获寡核苷酸固定在离散结合域中。在一个更特定的方面中，支撑表面为96孔板，其中每个孔包括具有至多10个结合域的阵列。在一个方面中，96孔板的每个孔包括至多10个结合域，其上固定有至多10个不同捕获寡核苷酸。在一个方面中，每个孔包括具有相同捕获寡核苷酸的相同图案化阵列。在另一方面中，不同孔可以包括捕获寡核苷酸的不同图案化阵列。
在一个方面中，支撑表面包括离散结合域的阵列。在一个方面中，支撑表面包括多孔板，其在每个孔中包括一系列离散结合域。在一个方面中，每个结合域包括单链捕获寡核苷酸和锚定寡核苷酸。在一个方面中，单链捕获寡核苷酸和锚定寡核苷酸固定在每个孔中的一个或多个离散结合域中。在一个方面中，每个结合域包括单链捕获寡核苷酸和锚定寡核苷酸。在一个方面中，支撑表面在每个孔中包括约2到约150个离散结合域，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或至多60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或150个结合域。在一个方面中，支撑表面在每个孔中包括至多10个离散结合域。在一个方面中，特定结合域中的所有捕获寡核苷酸具有相同序列，并且特定结合域中的所有锚定寡核苷酸具有相同序列。在一个方面中，一个结合域中的捕获寡核苷酸具有不同于其它结合域中的捕获寡核苷酸的序列。在一个方面中，一个结合域中的锚定寡核苷酸具有与其它结合域中的锚定寡核苷酸相同的序列。
在一个方面中，捕获寡核苷酸和锚定寡核苷酸固定在每个孔中的离散结合域中。在一个方面中，通过将捕获寡核苷酸和锚定寡核苷酸共同固定在离散结合域中来制备支撑表面。在一个方面中，捕获寡核苷酸和锚定寡核苷酸通过将捕获寡核苷酸和锚定寡核苷酸点样或印刷在多孔板的孔中的阵列中来固定。在一个方面中，捕获寡核苷酸和锚定寡核苷酸通过接触印刷，包括例如接触针印刷或微压印，或通过非接触印刷，包括例如光刻、激光直写、电喷雾沉积和喷墨印刷来点样或印刷。
在一个方面中，锚定寡核苷酸和捕获寡核苷酸都包括反应性官能团。在一个方面中，官能团包括硫醇(-SH)或胺(-NH2)基团。在一个方面中，锚定寡核苷酸和捕获寡核苷酸通过反应性官能团固定在支撑表面上。在一个方面中，捕获寡核苷酸、锚定寡核苷酸或两者通过反应性官能团固定到支撑表面，反应性官能团通过接头连接到捕获或锚定寡核苷酸。
在一个方面中，捕获寡核苷酸包括硫醇修饰并且通过硫醇部分固定在支撑表面上。在一个方面中，硫醇修饰的捕获寡核苷酸包括正巯基丙醇修饰。在一个方面中，硫醇修饰的捕获寡核苷酸包括连接到寡核苷酸的3'端的正巯基丙醇修饰。在一个方面中，捕获寡核苷酸通过硫醇或胺基团固定到支撑表面，所述硫醇或胺基团通过接头(在本文中也称为“间隔子”)连接到捕获寡核苷酸。在一个方面中，接头包括约3与约20个之间的原子或分子或单元，或至少约3、4、5、6、7、8、9、10并且至多约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个原子或分子或单元。在一个方面中，接头为碳原子接头。在一个方面中，接头为乙二醇接头或聚乙二醇(PEG)接头。在一个方面中，接头包括至多3、4、5或6个连续PEG单元。在另一方面中，接头包括三个连续PEG单元。在另一方面中，接头包括六个连续PEG单元。
在一个方面中，锚定寡核苷酸包括硫醇修饰并且通过硫醇部分固定在支撑表面上。在一个方面中，硫醇修饰的锚定寡核苷酸包括正巯基丙醇修饰。在一个方面中，硫醇修饰的锚定寡核苷酸包括连接到寡核苷酸的3'端的正巯基丙醇修饰。在一个方面中，锚定寡核苷酸通过硫醇或胺基团固定到支撑表面，所述硫醇或胺基团通过接头(在本文中也称为“间隔子”)连接到锚定寡核苷酸。在一个方面中，接头包括约3与约20个之间的原子或分子或单元，或至少约3、4、5、6、7、8、9、10并且至多约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个原子或分子或单元。在一个方面中，接头为碳原子接头。在一个方面中，接头为乙二醇接头或聚乙二醇(PEG)接头。在一个方面中，接头包括至多3、4、5或6个连续PEG单元。在另一方面中，接头包括三个连续PEG单元。在另一方面中，接头包括六个连续PEG单元。
在一个方面中，捕获寡核苷酸、锚定寡核苷酸或两者包括硫醇修饰并且通过硫醇部分固定在支撑表面上。在一个方面中，捕获寡核苷酸、锚定寡核苷酸或两者通过硫醇基固定到支撑表面，所述硫醇基通过接头连接。在一个方面中，接头为碳原子接头。在一个方面中，接头为乙二醇接头或聚乙二醇(PEG)接头。在一个方面中，接头包括至多3、4、5或6个连续PEG单元。在另一方面中，接头包括三个连续PEG单元。在另一方面中，接头包括六个连续PEG单元。
在一个方面中，硫醇修饰的捕获寡核苷酸和硫醇修饰的锚定寡核苷酸使用在缓冲溶液中包括硫醇修饰的寡核苷酸的印刷溶液固定。在一个方面中，印刷溶液包括磷酸钠、NaCl、EDTA、海藻糖和Triton X-100。在一个方面中，硫醇修饰的捕获寡核苷酸和硫醇修饰的锚定寡核苷酸包括于同一印刷溶液中。在一个方面中，硫醇修饰的捕获寡核苷酸和硫醇修饰的锚定寡核苷酸同时固定在支撑表面上。
F.电极
在一个方面中，使用电化学发光鉴别、检测或定量靶分析物，包括例如多肽或核酸序列。使用电化学发光的分析物的多重测量描述于美国专利号7,842,246和6,977,722中，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
在一个方面中，支撑表面包括一个或多个电极。在一个方面中，支撑表面包括一个或多个工作电极和一个或多个对电极。在一个方面中，支撑表面包括形成于一个或多个电极上的一个或多个结合域，用于电化学或电化学发光分析。
在一个方面中，结合域通过将涂布有捕获寡核苷酸的珠粒收集到电极表面上来形成。在一个方面中，珠粒为顺磁性的，并且通过使用磁场在电极上收集珠粒。
在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸共价或非共价固定在支撑表面上的一个或多个电极上的一个或多个结合域上。在一个方面中，多个不同结合域存在于一个或多个电极上，用于样品中靶分析物的多重测量。
在一个方面中，电极提供于分析模块内，所述分析模块提供分析容器、分析流动池、分析流控或适用于进行分析的其它组件。用于进行电化学发光分析的分析模块的实例包括例如多阵列壳、分析板壳、盒壳等。在一个方面中，电极提供于分析模块内，所述分析模块提供分析容器、分析流动池、分析流控或适用于进行分析的其它组件。用于进行电化学发光分析的分析模块的实例可见于美国专利号6,673,533、7,842,246、9,731,297和8,298834中。在一个方面中，支撑表面为包括至少一个电极的多孔板。在一个方面中，多孔分析板的每个孔包括至少一个电极。在一个方面中，多孔分析板的至少一个孔包括工作电极。在另一方面中，多孔分析板的至少一个孔包括工作电极和对电极。在另一方面中，多孔分析板的每个孔包括工作电极和对电极。在一个方面中，工作电极与对电极邻近但不电接触。
在一个方面中，电极由导电材料构成，包括例如金属，如金、银、铂、镍、钢、铱、铜、铝、导电合金或其组合。在另一方面中，电极包括半导体材料，如硅和锗，或半导体膜，如氧化铟锡(ITO)和氧化锑锡(ATO)。在另一方面中，电极包括氧化物涂布的金属，如氧化铝涂布的铝。在一个方面中，电极包括碳基材料。在一个方面中，电极包括含有导电复合材料、墨、糊、聚合物共混物和金属/非金属复合材料的材料的混合物，包括例如导电或半导电材料与非导电材料的混合物。在一个方面中，电极包括碳基材料，如碳、玻璃碳、炭黑、石墨碳、碳纳米管、碳原纤维、石墨、碳纤维和其混合物。在一个方面中，电极包括导电碳-聚合物复合材料、导电聚合物或分散于基质中的导电粒子，例如碳墨、碳糊或金属墨。在一个方面中，工作电极由碳-聚合物复合材料制成，所述碳-聚合物复合材料包括例如分散于基质(例如聚合物基质，如乙烯乙酸乙烯酯(EVA)、聚苯乙烯、聚乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯醇、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)，或这些聚合物中的一者或多者的共聚物)中的导电碳粒子(如碳原纤维、炭黑或石墨碳)。
在一个方面中，工作电极由连续导电片或一种或多种导电材料的膜制成，其可以挤出、按压或模制。在另一方面中，工作电极由沉积或图案化于衬底上的导电材料制成，例如通过印刷、涂刷、涂布、旋涂、蒸发、化学气相沉积、电解沉积、无电沉积、光刻或其它电子微制造技术。在一个方面中，工作电极包括印刷在聚合支撑物上的导电碳墨，例如通过喷墨印刷、激光印刷或丝网印刷。碳墨是已知的并且包括由以下生产的材料：Acheson ColloidsCo.(例如，Acheson 440B、423ss、PF407A、PF407C、PM-003A、30D071、435A、Electrodag505SS和AquadagTM)、杜邦公司(E.I.Du Pont de Nemours and Co.)(例如，Dupont 7105、7101、7102、7103、7144、7082、7861D和CB050)、Conductive Compounds Inc(例如，C-100)以及Ercon Inc.(例如，G-451)。
在一个方面中，工作电极为连续膜。在另一方面中，工作电极包括一个或多个离散区或离散区的图案。或者，工作电极可以包括多个连接区。工作电极上暴露的电极表面的一个或多个区可以由覆盖工作电极的图案化绝缘层限定，例如通过在工作电极上方丝网印刷图案化电介质墨水层，或通过粘附模切绝缘膜。暴露区可以限定印刷在工作电极上的试剂阵列的阵列元件，并且可以呈现如上文所描述的阵列形状和图案。在一个方面中，绝缘层限定暴露的工作电极表面的一系列圆形区(或“点”)。
对电极可以具有上文一般针对工作电极描述的特性中的一者或多者。在一个方面中，工作电极和对电极由相同材料构成。在另一方面中，工作电极和对电极不由相同材料构成，例如工作电极可以是碳电极并且对电极可以是金属电极。
在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸通过被动吸附固定在一个或多个电极上。在另一方面中，一种或多种捕获寡核苷酸共价固定在电极上。在一个方面中，电极被衍生化或修饰，例如以将如捕获寡核苷酸的试剂固定在电极的表面上。在一个方面中，电极通过化学或机械处理修饰以改进试剂的固定，例如以引入用于固定试剂的官能团或增强其吸附特性。可以引入的官能团的实例包括但不限于羧酸(COOH)、羟基(OH)、氨基(NH2)、活化羧基(例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-酯)、聚(乙二醇)、硫醇、烷基((CH2)n)或其组合)。在一个方面中，一种或多种试剂(例如捕获寡核苷酸)通过共价或非共价方式固定到含碳电极，例如分散于另一材料中的炭黑、原纤维或碳。已发现具有硫醇基的捕获分子可以共价结合到含碳电极，例如结合到丝网印刷碳墨电极，而不必首先沉积额外的硫醇反应性层，如蛋白质层或化学交联层。在一个方面中，提供用于将具有硫醇基的捕获分子(如硫醇修饰的寡核苷酸)直接连接到电极的方法，这提供了用于在电极上形成捕获表面和阵列的简单、稳健、高效且可再现的工艺。在一个方面中，在不首先将硫醇反应性层添加到电极的情况下，一种或多种具有硫醇基的捕获寡核苷酸通过硫醇与电极的反应直接固定在含碳电极(如丝网印刷碳墨电极)上。
在一个方面中，用等离子体，例如低温等离子体，如辉光放电等离子体处理电极以改变电极的物理特性、化学组成或表面化学特性，例如以帮助固定如捕获寡核苷酸的试剂，或减少污染物、改进与其它材料的粘附性、改变表面的可湿性、促进材料的沉积、创建图案或改进均匀性。适用的等离子体的实例包括氧、氮、氩、氨、氢、碳氟化合物、水和其组合。在一个方面中，氧等离子体用于处理在碳-聚合物复合材料中具有碳粒子的电极。在另一方面中，氧用于将羧酸或其它氧化碳官能团引入碳或有机材料(例如活化酯或酰氯)中以促进试剂偶联。在另一方面中，含氨等离子体可以用于引入氨基以用于偶联分析试剂。在一个方面中，电极未经预处理以帮助固定一种或多种捕获寡核苷酸。
在一个方面中，支撑表面包括分析模块，如在每个孔中具有一个或多个工作电极或对电极的多孔板。在一个方面中，多孔板在每个孔中包括多个工作电极或对电极。在一个方面中，多孔板的工作电极或对电极包括碳，例如丝网印刷的碳墨层。在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸通过捕获寡核苷酸上的硫醇部分固定在丝网印刷的碳墨上。在一个方面中，工作电极用于诱导来自连接到反应产物的标记的电化学发光信号。在一个方面中，电化学发光信号在共反应物(如叔烷基胺，例如三丙胺或丁基二乙醇胺)存在下从钌-三联吡啶发射。
在一个方面中，电极含有如上文所描述的由电介质墨水(即，电绝缘墨水)限定的结合域。电极是具有以限定上文所描述的结合域的图案印刷在其上的电介质的工作电极。在一个方面中，结合域是暴露的工作电极的大致圆形区域(或“点”)。电极在通过将注射成型的96孔板顶部粘附到限定孔的底部的麦拉(mylar)薄片而形成的96孔板中。麦拉薄片的顶部表面上面印刷有丝网印刷碳墨电极，使得每个孔包括大致在孔的中心的碳墨工作电极和大致朝向孔的两个边缘的两个碳墨对电极。印刷在麦拉薄片底部上的电极通过导电通孔连接到薄片顶部，提供用于将电压施加到工作电极和对电极的触点。
G.固定捕获分子的方法
在一个方面中，提供一种将一种或多种捕获分子固定在支撑表面上的方法。在一个方面中，一种或多种捕获分子包括一种或多种如本文所描述的单链捕获寡核苷酸分子。
在一个方面中，所述方法包括将一种或多种捕获分子固定在包括碳基支撑表面的支撑表面上。在一个方面中，所述方法包括将一种或多种捕获分子固定在包括一个或多个电极的支撑表面上。在一个方面中，所述方法包括将一种或多种捕获分子固定在包括一个或多个碳基电极的支撑表面上。
在一个方面中，支撑表面是包括一个或多个电极的多孔板。在一个方面中，支撑表面是在每个孔中包括一个或多个电极的多孔板。在一个方面中，一种或多种捕获分子固定在支撑表面上的阵列中。
在一个方面中，所述方法包括将两种或更多种捕获寡核苷酸点样或印刷在多孔板的第一孔的第一电极上的阵列中，并且随后将一种或多种捕获寡核苷酸印刷在多孔板的一个或多个额外孔中的电极上的阵列中。在一个方面中，每个孔中的至少一些印刷阵列是相同的。在另一方面中，每个孔中的至少一些印刷阵列是不同的。
在一个方面中，一种或多种捕获分子点样或印刷在阵列内的一个或多个已知位置，称为结合域。在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸固定在离散、非重叠、可寻址结合域中，并且每个结合域中的捕获寡核苷酸的序列是已知的并且可以与靶分析物相关联。在一个方面中，特定结合域中的所有捕获寡核苷酸具有相同序列，并且一个结合域中的捕获寡核苷酸具有不同于其它结合域中的捕获寡核苷酸的序列。
在一个方面中，一种或多种捕获分子点样或印刷到支撑表面上的离散结合域上。在一个方面中，捕获寡核苷酸的阵列点样或印刷到支撑表面上的离散结合域上。在一个方面中，捕获分子通过接触印刷，包括例如接触针印刷或微压印，或通过非接触印刷，包括例如光刻、激光直写、电喷雾沉积和喷墨印刷来点样或印刷。一般来说，点样或印刷方法包括将包括一种或多种捕获分子的一个或多个小液滴施加到支撑表面上的离散结合域上并且使小液滴干燥。在一个方面中，使小液滴扩散以覆盖支撑表面的区域。在一个方面中，支撑表面包括一个或多个较高可湿性区和一个或多个较低可湿性区，其中较高可湿性区限定结合域或阵列元件。可湿性是指液体与固体表面之间的相互作用，更特定地，指水溶液不扩散到固体表面上而是收缩以形成小滴的现象。在一个方面中，固体支撑物具有当将少量水溶液分配到一个或多个离散结合域时促进小滴形成的表面特性。印刷在较高可湿性区上的捕获分子的溶液扩散到与较低可湿性区的边界，提供对结合域的形状和位置的精确控制。在一个方面中，结合域是工作电极上的暴露电极表面的区，并且工作电极上的图案化绝缘层(例如丝网印刷碳墨电极上方的丝网印刷电介质墨水)限定暴露电极区的较低可湿性边界。
用于将寡核苷酸固定到支撑表面的方法是已知的(参见例如Balasheb Nimse等人(2014)《用于微阵列的固定技术：挑战和应用(Immobilization Techniques forMicroarray:Challenges and Applications)》.《传感器(Sensors.)》14(2):22208-22229)，并且一般基于以下机制中的一者或多者：(1)物理吸附，例如通过电荷-电荷或疏水相互作用(2)共价固定，例如通过化学键结；以及(3)非共价蛋白质-配体相互作用，如链霉亲和素-生物素固定。在一个方面中，一种或多种寡核苷酸固定到官能化支撑表面。在一个方面中，一种或多种寡核苷酸固定到尚未被修饰以包括一个或多个官能团的支撑表面。在一个方面中，一种或多种寡核苷酸通过物理吸收固定到支撑表面，所述支撑表面包括以下部分中的一者或多者：胺、硝化纤维素、聚(l-赖氨酸)、PAAH和重氮。在一个方面中，一种或多种寡核苷酸通过共价相互作用，例如通过硫醇(-SH)、胺(-NH2)或酰肼基团固定到支撑表面。在一个方面中，支撑表面包括或被修饰以包括反应性官能团，包括例如羧基(-COOH)、醛(-CHO)、环氧基(-CHCH2O)、异硫氰酸酯(-N＝C＝S)、马来酰亚胺(-HC2(CO)2NH)或巯基硅烷(-Si-R-SH)。在一个方面中，寡核苷酸包括或被修饰以包括反应性官能团，包括例如硫醇、胺或酰肼基团。在一个方面中，一种或多种寡核苷酸通过存在于支撑表面上的亲核或亲电官能团固定到支撑表面。
在一个方面中，一种或多种捕获分子包括硫醇基。在一个方面中，一种或多种捕获分子通过存在于捕获分子上的硫醇基固定在支撑表面上。在一个方面中，所述方法包括将一种或多种包括硫醇基的捕获分子点样或印刷到碳基支撑表面上，并且培育印刷的支撑表面以通过硫醇基将一种或多种捕获分子固定在支撑表面上。在一个方面中，一种或多种捕获分子通过硫醇基共价连接到支撑表面。
在一个方面中，通过将含有捕获分子的小液滴(例如50nL)印刷到支撑表面上，使小液滴扩散，使小液滴干燥，并且培育干燥的小滴持续足以将捕获分子固定到支撑表面的时间量(例如过夜)，将一种或多种捕获分子固定到支撑表面上。在一个方面中，通过将含有捕获分子的小液滴印刷到支撑表面上，使小液滴扩散，使小液滴干燥，并且培育干燥的小滴持续足以通过硫醇基将捕获分子固定到支撑表面的时间量，将一种或多种包括硫醇基的捕获分子固定到碳基支撑表面上。在一个方面中，小液滴印刷于阵列中。在一个方面中，小液滴印刷于一个或多个结合域中。在一个方面中，碳基支撑表面包括一个或多个碳基电极。在一个方面中，一种或多种捕获分子通过硫醇基共价连接到碳基电极。在一个方面中，图案化绝缘层包括于碳基支撑表面上以限定印刷于支撑表面上的小液滴的扩散。
在一个方面中，碳基支撑表面经预处理，例如以在支撑表面上引入一个或多个官能团，例如以增加捕获分子上的硫醇基与支撑表面之间的反应性。在一个方面中，碳基支撑表面用如牛血清白蛋白(BSA)的蛋白质预处理。在另一方面中，碳基支撑表面未经预处理以在通过硫醇基将一种或多种捕获寡核苷酸固定到支撑表面之前在支撑表面上引入任何官能团。在一个方面中，支撑表面未用蛋白质修饰以增加捕获分子上的硫醇基与支撑表面的反应性。
在一个方面中，在将一种或多种捕获寡核苷酸点样或印刷到表面上以去除游离捕获寡核苷酸(即，未固定到支撑表面的捕获寡核苷酸)之后，用洗涤(或封闭)溶液洗涤支撑表面(在本文中也称为“封闭”步骤；参见例如实例3)。在一个方面中，在印刷和干燥之后用洗涤溶液洗涤支撑表面。在一个方面中，在将支撑表面包装在干燥包装中之前，洗涤支撑表面。在另一方面中，在将支撑表面包装在干燥包装中之后，洗涤支撑表面。
在一个方面中，洗涤或封闭步骤包含将洗涤或封闭溶液添加到表面(例如，对于96孔分析板，每孔50μL溶液)并且培育30到60分钟。培育温度可以是任何适宜温度，例如室温或37℃。可以在摇动表面的同时进行培育。洗涤或封闭步骤可以包含去除洗涤或封闭溶液并且用如PBS的缓冲液冲洗表面。
在一个方面中，洗涤溶液包括含硫醇化合物。在洗涤步骤期间，来自碳基电极上的一个结合域的过量含硫醇捕获分子可以转移到另一结合域并且变为永久性附着。通过在洗涤溶液中包括含硫醇化合物，可以减少此捕获分子的转移以及所引起的结合域的交叉污染。虽然不希望受理论束缚，但据信洗涤溶液中的含硫醇化合物与游离(未结合)捕获寡核苷酸竞争并且防止由从不同结合域去除的过量捕获寡核苷酸的结合引起的结合域的交叉污染。在一个方面中，洗涤溶液包括水溶性含硫醇化合物。在一个方面中，洗涤溶液包括分子量小于约200g/mol、约175g/mol、约150g/mol或约125g/mol的水溶性含硫醇化合物。在一个方面中，水溶性含硫醇化合物包括两性离子。
在一个方面中，洗涤溶液包括选自半胱氨酸(例如L-半胱氨酸)、半胱胺、二硫苏糖醇、3-巯基丙酸酯、3-巯基-1-丙磺酸的水溶性硫醇。在一个方面中，水溶性含硫醇化合物包括半胱氨酸。
在一个方面中，洗涤溶液包括pH缓冲组分。在一个方面中，pH缓冲组分包括Tris。在一个方面中，洗涤溶液包括表面活性剂。在一个方面中，表面活性剂包括Triton X-100。在一个方面中，洗涤溶液包括金属螯合剂。
在一个方面中，洗涤溶液包括约5mM与约750mM之间、约10mM与约500mM之间、约25mM与约75mM之间或约50mM的含硫醇化合物。在一个方面中，洗涤溶液包括约5mM与约750mM之间、约10mM与约500mM之间、约25mM与约75mM之间或约50mM的半胱氨酸。在一个方面中，洗涤溶液包括约10mM与约30mM之间，或约15mM与约25mM之间，或约20mM的缓冲液，如Tris。在一个方面中，洗涤包括约0.05％与约0.5％之间，或约0.05％与0.2％之间，或约0.1％的表面活性剂，如Triton X-100。在一个方面中，洗涤溶液具有约7与约9之间、约7.5与约8.5之间或约8.0的pH。
在一个方面中，洗涤或封闭溶液包括以下试剂中的一者或多者：(i)已知适用于降低杂交分析中的背景信号的聚合物，包括但不限于PS20、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(约1,000kD或约360kD)、聚蔗糖(Ficoll)和聚乙二醇(约3kD和约10kD)，(ii)核酸或其它聚阴离子，包括但不限于鲑鱼精DNA、鲱鱼DNA、小牛胸腺DNA、剪切的多A、酵母tRNA；和肝素，(iii)单体和聚合蛋白质封闭剂，包括但不限于BSA和聚BSA，(iv)表面活性剂，包括但不限于十二烷基硫酸钠(SDS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、triton-100和吐温-20，以及(v)氢键去稳定剂，包括但不限于甲酰胺和丙二醇。
在一个方面中，所述方法包括将一种或多种捕获寡核苷酸固定在支撑表面上，并且接着用洗涤溶液将过量未固定捕获寡核苷酸从支撑表面洗掉的步骤。在一个方面中，洗涤包括在严格洗涤条件下洗涤固定化捕获寡核苷酸。在一个方面中，严格洗涤条件包括约27℃与约47℃之间的温度、约21％与约41％之间的甲酰胺浓度、约300mM与约500mM之间的盐浓度以及约7.5与约8.5之间的pH。在一个方面中，高严格条件包括约37℃的温度、约31％的甲酰胺浓度、约400mM的盐浓度以及8.0的pH。在一个方面中，使固定化寡核苷酸暴露于高严格条件至少5、10、30或60分钟。在另一方面中，高严格条件包括低盐条件，例如盐浓度小于约40mM、20mM、15mM或10mM的缓冲液。在一个方面中，高严格条件包括低盐条件，如37℃下的0.1×PBS。
在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸固定在支撑表面上的阵列中。在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸固定在支撑表面上的一个或多个结合域中。在一个方面中，印刷在阵列的一个结合域上的捕获寡核苷酸具有与印刷在阵列中的其它结合域上的捕获寡核苷酸不同的序列。
虽然不希望受理论束缚，但据信洗涤溶液将松散结合的捕获寡核苷酸带入溶液中，所述捕获寡核苷酸可以潜在地从溶液中通过SH共价结合或其它机制再沉积到表面。如果捕获寡核苷酸与具有不同核苷酸序列的捕获寡核苷酸一起再沉积于结合域上，则其被视为污染捕获分子。污染捕获分子的存在可能干扰分析结果。在一个方面中，通过本文所描述的方法制备的阵列的结合域包括小于约0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％污染捕获分子。
在一个方面中，捕获分子的集合的结合伴侣(即，寡核苷酸标签)之间的交叉反应性小于约0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％。在一个方面中，确定分析特异性(包括来自非互补序列的结合或来自捕获寡核苷酸交叉污染的交叉反应性)。在一个方面中，通过在QC探针与固定在板表面上的其相应互补捕获分子杂交的条件下，将含有一种或多种标记的QC探针的一种或多种样品添加到一个或多个复制板中来确定特异性。随后洗涤板以去除过量QC探针，并且通过检测一级标记或通过添加二级结合伴侣来检测结合的QC探针的存在。可以针对每一阵列，例如多孔板中的每个孔计算交叉反应性，作为从探针与具有非特异性捕获核苷酸的点结合检测到的信号，呈来自探针与具有其相应互补捕获核苷酸的点结合的信号的百分比。在一个方面中，计算包括对在不存在任何QC探针的情况下检测到的非特异性背景信号的校正。
在一个方面中，使用质量控制(QC)寡核苷酸探针的集合确定分析特异性。在一个方面中，QC探针包括与固定在表面上的非交叉反应性捕获分子的集合中的相应捕获分子的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核酸互补的核苷酸序列。在一个方面中，所述集合包括QC探针，其具有与具有SEQ ID NO:1-774中的任一者中所示的序列的非交叉反应性捕获分子的集合中的相应捕获分子的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核酸互补的核苷酸序列。在一个方面中，所述集合包括QC探针，其具有与SEQ ID NO:1-64中所示的非交叉反应性捕获分子的集合中的相应捕获分子的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核酸互补的核苷酸序列。在一个方面中，所述集合包括QC探针，其具有与SEQ ID NO:1-10中所示的非交叉反应性捕获分子的集合中的相应捕获分子的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核酸互补的核苷酸序列。
在一个方面中，QC探针包括标记。在一个方面中，标记直接连接到QC探针。在另一方面中，标记通过接头连接到QC探针。在一个方面中，标记是作为结合对的成员的化合物，其中结合对的第一成员(其可称为“一级结合试剂”)连接到底物，例如寡核苷酸，并且结合对的另一成员(其可称为“二级结合试剂”)具有可检测物理特性。实例或一级标记包括但不限于电化学发光标记、包括过渡金属(例如钌)的有机金属络合物。在一个方面中，一级标记包括链霉亲和素。在一个方面中，一级标记包括MSD SULFO-TAG标记的链霉亲和素。
在一个方面中，标记包括结合到一级结合试剂的二级结合试剂。在一个方面中，一级结合试剂包括生物素、半抗原、链霉亲和素、亲和素或抗体或抗原。在一个方面中，二级结合试剂包括生物素、半抗原、链霉亲和素、亲和素或抗体或抗原。在一个方面中，二级结合试剂包括电化学发光标记。在一个方面中，二级结合试剂包括有机金属络合物，其包括过渡金属，例如钌。在一个方面中，QC探针包括生物素，并且二级结合试剂包括MSD SULFO-TAG标记的链霉亲和素。在一个方面中，QC探针在3'端用生物素修饰，如以下结构中所示：
在一个方面中，污染捕获分子的百分比通过实例4的方法测量。
在一个方面中，一个板上(板内)或跨两个或更多个板(内插)的一个或多个结合域的均匀性可以使用已知用于确定变异系数(CV)的方法来确定。在一个方面中，板内或板间结合域具有小于约10％、9.5％、9％、8.5％、8％、7.5％、7％、6.5％、6％、5.5％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％或1％的CV。在一个方面中，平均板内或板间CV在约3％与约6％之间，或小于约5％。在一个方面中，通过实例5的方法测量结合域均匀性。
H.适体固定
在一个方面中，提供一种将一种或多种适体固定在支撑表面上的方法。在一个方面中，一种或多种适体通过结合到固定到如本文所描述的支撑表面的一种或多种单链捕获分子而固定到支撑表面上。在一个方面中，适体是能够特异性结合到靶分子的寡核苷酸，并且可以包括例如DNA、RNA或XNA适体，其结合到分子靶，包括例如小分子、蛋白质、核酸、细胞、组织和生物体非共价相互作用，如静电和疏水相互作用。在另一方面中，适体是能够特异性结合到靶分子的肽，所述靶分子包括由蛋白质支架显示的至少一个或多个可变肽域。在一个方面中，固定化适体用作一种或多种靶分析物的探针。在一个方面中，固定化适体用于微阵列。
I.寡核苷酸探针
在一个方面中，所述方法或试剂盒包括一种或多种能够特异性结合到样品中的靶分析物的探针试剂。在一个方面中，寡核苷酸探针包括能够特异性结合到样品中的靶分析物的结合伴侣。
如本文所用，术语“结合伴侣”是指在一组特定条件下彼此特异性结合的一对部分的成员，即，结合对彼此结合以大体上排除环境中存在的其它部分。结合伴侣可以是任何分子，如多肽、脂质、糖脂、核酸分子、碳水化合物或其它分子，另一分子与所述分子特异性相互作用，例如通过共价或非共价相互作用，包括例如抗体与其同源抗原的相互作用、两个互补核苷酸序列之间的相互作用或生物素与链霉亲和素或亲和素之间的相互作用。术语“相应”是指两个特异性结合伴侣之间的关系，使得结合伴侣对的一个成员“对应”于所述对的另一成员。
在一个方面中，结合伴侣包括特异性结合到靶分析物的抗体。在另一方面中，结合伴侣包括与靶分析物的寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列，使得寡核苷酸探针能够与靶核苷酸序列杂交。
在一个方面中，寡核苷酸探针包括寡核苷酸标签和结合伴侣。在一个方面中，结合伴侣包括与靶核苷酸序列的一部分互补或大体上互补的单链序列。在一个方面中，探针包括具有与捕获寡核苷酸的序列互补的序列的寡核苷酸标签。在一个方面中，寡核苷酸标签和结合伴侣是单一寡核苷酸链的不同区。
在一个方面中，探针为单链核酸序列，包括例如核酸序列，包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)。在一个方面中，探针包括一个或多个修饰的含氮碱基类似物或已被修饰以包括标记或适用于连接标记的反应性官能团或接头的碱基。
在一个方面中，探针的长度为约5与约100、约10与约50、约20与约30之间，或至少约5、6、7、8、9、10、15、20或25并且至多约30、35、40、45、50、75或100个核苷酸。探针可以通过所属领域中已知的任何合适方法制备，包括化学或酶促合成，或通过使用非特异性核酸裂解化学品或酶或用位点特异性限制性核酸内切酶裂解较大核酸。在一些应用中，与靶序列中的互补区杂交的探针可以通过聚合酶引发探针延伸，充当靶序列上的相邻单链区复制的起点。
在一个方面中，探针包括标记。在一个方面中，标记直接连接到探针。在另一方面中，标记通过接头连接到探针。在一个方面中，标记是作为结合对的成员的化合物，其中结合对的第一成员(其可称为“一级结合试剂”)连接到底物，例如寡核苷酸，并且结合对的另一成员(其可称为“二级结合试剂”)具有可检测物理特性。实例或一级标记包括但不限于电化学发光标记、包括过渡金属(例如钌)的有机金属络合物。在一个方面中，一级标记为MSDSULFO-TAG标记。
在一个方面中，二级结合试剂结合到一级结合试剂。在一个方面中，一级结合试剂包括生物素、半抗原、链霉亲和素、亲和素或抗体或抗原。在一个方面中，二级结合试剂包括生物素、半抗原、链霉亲和素、亲和素或抗体或抗原。在一个方面中，二级结合试剂包括电化学发光标记。在一个方面中，二级结合试剂包括有机金属络合物，其包括过渡金属，例如钌。在一个方面中，二级结合试剂包括MSD SULFO-TAG标记。
在一个方面中，寡核苷酸探针包括寡核苷酸标签和靶互补序列，例如具有与靶核酸序列的序列互补的序列的寡核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包括寡核苷酸标签、靶互补序列和检测寡核苷酸。在一个方面中，检测寡核苷酸包括具有与扩增模板的核酸序列互补的核酸序列的检测序列。在一个方面中，检测寡核苷酸充当扩增反应的引物，所述扩增反应包括但不限于PCR(聚合酶链反应)、LCR(连接酶链反应)、SDA(链置换扩增)、3SR(自持合成反应)或等温扩增方法，如解旋酶依赖性扩增或滚环扩增(RCA)。在一个方面中，检测寡核苷酸与扩增模板接触，并且检测寡核苷酸用作引物以扩增所述扩增模板，例如通过聚合酶链反应(PCR)。在一个方面中，检测寡核苷酸与扩增模板接触，并且检测寡核苷酸充当扩增所述扩增模板的引物，例如通过滚环扩增(RCA)。
在一个方面中，提供寡核苷酸探针的集合。在一个方面中，提供10个寡核苷酸探针的集合。在一个方面中，每个寡核苷酸探针包括寡核苷酸标签、靶互补序列和检测寡核苷酸。在一个方面中，每个寡核苷酸探针包括5'寡核苷酸标签、靶互补序列和3'检测寡核苷酸。在一个方面中，提供10个寡核苷酸探针的集合用于10点分析。在一个方面中，提供10个寡核苷酸探针的集合以与10点分析板一起使用，其中互补寡核苷酸捕获分子固定在分析板的孔内的10个离散结合域中。
在一个方面中，所述集合中的寡核苷酸探针中的一者或多者包括相同检测寡核苷酸序列。在一个方面中，所述集合中的寡核苷酸探针中的一者或多者包括与所述集合中的其它寡核苷酸探针不同的检测寡核苷酸序列。在一个方面中，所述集合中的寡核苷酸探针中的每一者包括相同检测寡核苷酸序列。
在一个方面中，提供10个寡核苷酸探针(如表27中所示的那些)的集合，以与10点分析板一起使用。
在一个方面中，提供一种试剂盒，其包括一种或多种探针试剂。在一个方面中，最终用户制备一种或多种探针试剂。
J.寡核苷酸标签
在一个方面中，探针包括具有特异性结合到捕获分子的寡核苷酸序列的序列的寡核苷酸标签。在一个方面中，标签包括与单链捕获寡核苷酸的核苷酸序列的至少一部分互补的单链寡核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸标签是重组产生的。在一个方面中，寡核苷酸标签不是天然存在的序列。在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸包括单链核酸序列，包括例如包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或包括也可以参与杂交反应的非天然存在的化学结构的结构类似物的核酸序列。
在一个方面中，标签连接到探针的5'端。在另一方面中，标签连接到探针的3'端。在一个方面中，标签与靶核苷酸序列不互补并且不杂交。
在一个方面中，与靶核苷酸序列互补的序列和寡核苷酸标签序列存在于探针内的一个核酸链上。在另一方面中，与靶核苷酸序列互补的序列和寡核苷酸标签序列存在于不同核酸链上。在一个方面中，探针包括具有与靶序列互补的序列和第一桥接序列的第一链以及具有寡核苷酸标签序列和与第一桥接序列互补的第二桥接序列的第二链，其中第一和第二链通过第一和第二桥接序列杂交或可以杂交。
在一个方面中，寡核苷酸标签包括标记。在一个方面中，标记直接连接到寡核苷酸标签。在另一方面中，标记通过接头连接到寡核苷酸标签。在一个方面中，标记连接到寡核苷酸标签的5'末端核苷酸。在另一方面中，标记连接到寡核苷酸标签的3'末端核苷酸。在一个方面中，标记沿寡核苷酸标签的长度连接。
在一个方面中，标记包括放射性、荧光、化学发光、电化学发光、光吸收、光散射、电化学、磁性或酶标记。在一个方面中，标记包括电化学发光标记。在一个方面中，标记包括半抗原。在一个方面中，标记为生物素、荧光素或地高辛(digoxigenin)。在一个方面中，标记包括有机金属络合物，其包括过渡金属。在一个方面中，过渡金属包括钌。在一个方面中，标记为MSD SULFO-TAGTM标记。
在一个方面中，寡核苷酸标签包括作为标记的一级结合试剂，其中一级结合试剂是二级结合试剂的结合伴侣。在一个方面中，一级结合试剂包括生物素、链霉亲和素、亲和素或抗原。在一个方面中，二级结合试剂包括生物素、链霉亲和素、亲和素或抗体。在一个方面中，一级结合试剂包括寡核苷酸，并且二级结合试剂是具有与一级结合试剂的序列互补的序列的寡核苷酸。
在一个方面中，标签具有长度为至少约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25并且至多约25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸，或约15与约40或约20与约30个核苷酸之间的核苷酸序列。在一个方面中，标签包括比互补捕获寡核苷酸序列短至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10并且至多约11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸，或约1与约20个核苷酸之间或约10与约15个核苷酸之间或约12与约13个核苷酸之间的核苷酸序列。在一个方面中，标签具有长度为至少约24、30或36个核苷酸的核苷酸序列。
在一个方面中，寡核苷酸标签具有与捕获分子杂交的序列，所述捕获分子具有SEQID NO:1-774(表1-12)中的任一者中所示的序列。在一个方面中，寡核苷酸标签具有与互补捕获分子杂交的序列，所述互补捕获分子具有SEQ ID NO:1-744(表1-12)中的任一者中所示的序列。在一个方面中，标签具有与作为SEQ ID NO:1-744中的任一者中所示的序列的至少约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的序列互补的核苷酸序列。在一个方面中，标签具有与作为SEQ ID NO:1-744中的任一者中所示的序列的至少约24、30或36个连续核苷酸的序列互补的核苷酸序列。在一个方面中，寡核苷酸标签具有SEQ ID NO:745-1488(表13-24)中的任一者中所示的核酸序列。
在一个方面中，寡核苷酸标签具有与SEQ ID NO:745-1488(表13-24)中的任一者中所示的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。在另一方面中，寡核苷酸标签具有包括SEQ ID NO:745-1488(表13-24)中的任一者中所示的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一方面中，寡核苷酸标签具有包括SEQ ID NO:745-1488(表13-24)中的任一者中所示的序列的至少20个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一方面中，寡核苷酸标签具有包括与SEQID NO:745-1488(表13-24)中的任一者中的核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一方面中，寡核苷酸标签具有包括与SEQ ID NO:745-1488(表13-24)中的任一者中的核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的至少20个连续核苷酸的核苷酸序列。
在一个方面中，寡核苷酸标签具有与SEQ ID NO:745-754、755-757、769-770、777-781、786、788-790、798和803-806中的任一者中所示的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。在另一方面中，寡核苷酸标签具有包括SEQ ID NO:745-754、755-757、769-770、777-781、786、788-790、798和803-806中的任一者中所示的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一方面中，寡核苷酸标签具有包括SEQ ID NO:745-754、755-757、769-770、777-781、786、788-790、798和803-806中的任一者中所示的序列的至少20个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一方面中，寡核苷酸标签具有包括与SEQ ID NO:745-754、755-757、769-770、777-781、786、788-790、798和803-806中的任一者中的核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列。在一个方面中，寡核苷酸标签具有SEQ ID NO:745-754、755-757、769-770、777-781、786、788-790、798和803-806中的任一者中所示的核苷酸序列。
在一个方面中，寡核苷酸标签具有与SEQ ID NO:745-754中的任一者中所示的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。在另一方面中，寡核苷酸标签具有包括SEQ ID NO:745-754中的任一者中所示的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一方面中，寡核苷酸标签具有包括与SEQ ID NO:745-754中的任一者中的核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的核苷酸序列。在一个方面中，寡核苷酸标签具有SEQ ID NO:745-754中的任一者中所示的核苷酸序列。
在一个方面中，所述方法或试剂盒包括选自非交叉反应性寡核苷酸标签的“父集”的非交叉反应性寡核苷酸标签的集合。在一个方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的集合与非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合互补。在一个方面中，集合中的非交叉反应性寡核苷酸标签被配置成与其捕获寡核苷酸的相应集合中的相应互补序列杂交。在一个方面中，相对于互补序列，集合中的寡核苷酸标签与捕获寡核苷酸的相应集合中的非互补序列杂交小于0.05％。
可以选择来自父集的两种或更多种寡核苷酸以形成非交叉反应性寡核苷酸标签的“子集”，其中子集中的每个寡核苷酸是原始父集的成员。子集不能包括来自多于一个父集的寡核苷酸标签。在一个方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的集合或子集包括选自非交叉反应性序列的父集的至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25并且至多64个非交叉反应性序列。
在一个方面中，生成与表1(SEQ ID NO:1-64)中所示的一个或多个捕获序列互补的非交叉反应性寡核苷酸标签的第一集合。在一个方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的第一集合包括来自表13(SEQ ID NO:745-808)中所示的父集的两个或更多个寡核苷酸标签。
在一个方面中，生成与表2(SEQ ID NO:65-122)中所示的一个或多个捕获序列互补的非交叉反应性寡核苷酸标签的第二集合。在一个方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的第二集合包括来自表14(SEQ ID NO:809-866)中所示的父集的两个或更多个寡核苷酸标签。
在一个方面中，生成与表3(SEQ ID NO:123-186)中所示的一个或多个捕获序列互补的非交叉反应性寡核苷酸标签的第三集合。在一个方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的第三集合包括来自表15(SEQ ID NO:867-930)中所示的父集的两个或更多个寡核苷酸标签。
在一个方面中，生成与表4(SEQ ID NO:187-250)中所示的一个或多个捕获序列互补的非交叉反应性寡核苷酸标签的第四集合。在一个方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的第四集合包括来自表16(SEQ ID NO:931-994)中所示的父集的两个或更多个寡核苷酸标签。
在一个方面中，生成与表5(SEQ ID NO:251-308)中所示的一个或多个捕获序列互补的非交叉反应性寡核苷酸标签的第五集合。在一个方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的第二集合包括来自17(SEQ ID NO:995-1052)中所示的父集的两个或更多个寡核苷酸标签。
在一个方面中，生成与表6(SEQ ID NO:309-372)中所示的一个或多个捕获序列互补的非交叉反应性寡核苷酸标签的第六集合。在一个方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的第二集合包括来自表18(SEQ ID NO:1053-1116)中所示的父集的两个或更多个寡核苷酸标签。
在一个方面中，生成与表7(SEQ ID NO:373-436)中所示的一个或多个捕获序列互补的非交叉反应性寡核苷酸标签的第七集合。在一个方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的第二集合包括来自表19(SEQ ID NO:1117-1180)中所示的父集的两个或更多个寡核苷酸标签。
在一个方面中，生成与表8(SEQ ID NO:437-494)中所示的一个或多个捕获序列互补的非交叉反应性寡核苷酸标签的第八集合。在一个方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的第二集合包括来自表20(SEQ ID NO:1181-1238)中所示的父集的两个或更多个寡核苷酸标签。
在一个方面中，生成与表9(SEQ ID NO:495-558)中所示的一个或多个捕获序列互补的非交叉反应性寡核苷酸标签的第九集合。在一个方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的第二集合包括来自表21(SEQ ID NO:1239-1302)中所示的父集的两个或更多个寡核苷酸标签。
在一个方面中，生成与表10(SEQ ID NO:559-622)中所示的一个或多个捕获序列互补的非交叉反应性寡核苷酸标签的第十集合。在一个方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的第二集合包括来自表22(SEQ ID NO:1303-1366)中所示的父集的两个或更多个寡核苷酸标签。
在一个方面中，生成与表11(SEQ ID NO:623-680)中所示的一个或多个捕获序列互补的非交叉反应性寡核苷酸标签的第十一集合。在一个方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的第二集合包括来自表23(SEQ ID NO:1367-1424)中所示的父集的两个或更多个寡核苷酸标签。
在一个方面中，生成与表12(SEQ ID NO:681-744)中所示的一个或多个捕获序列互补的非交叉反应性寡核苷酸标签的第十二集合。在一个方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的第二集合包括来自表24(SEQ ID NO:1425-1488)中所示的父集的两个或更多个寡核苷酸标签。
在一个方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的集合包括一个或多个标签，其具有与和以下中的捕获寡核苷酸的序列互补的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列：表1(SEQ ID NO:1-64)、表2(SEQ ID NO:65-122)、表3(SEQ ID NO:123-186)、表4(SEQ ID NO:187-250)、表5(SEQ ID NO:251-308)、表6(SEQ ID NO:309-372)、表7(SEQ ID NO:373-436)、表8(SEQ ID NO:437-494)、表9(SEQ ID NO:495-558)、表10(SEQ IDNO:559-622)、表11(SEQ ID NO:623-680)或表12(SEQ ID NO:681-744)。在一个方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的集合包括一个或多个标签，其具有与以下中所示的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列：表13(SEQ ID NO:745-808)、表14(SEQ ID NO:809-866)、表15(SEQ ID NO:867-930)、表16(SEQ ID NO:931-994)、表17(SEQID NO:995-1052)、表18(SEQ ID NO:1053-1116)、表19(SEQ ID NO:1117-1180)、表20(SEQID NO:1181-1238)、表21(SEQ ID NO:1239-1302)、表22(SEQ ID NO:1303-1366)、表23(SEQID NO:1367-1424)或表24(SEQ ID NO:1425-1488)。
在另一方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的集合包括一个或多个标签，其具有包括与以下中的捕获寡核苷酸的序列互补的序列的至少20、21、22、23或24个连续核苷酸的核苷酸序列：表1(SEQ ID NO:1-64)、表2(SEQ ID NO:65-122)、表3(SEQ ID NO:123-186)、表4(SEQ ID NO:187-250)、表5(SEQ ID NO:251-308)、表6(SEQ ID NO:309-372)、表7(SEQID NO:373-436)、表8(SEQ ID NO:437-494)、表9(SEQ ID NO:495-558)、表10(SEQ ID NO:559-622)、表11(SEQ ID NO:623-680)或表12(SEQ ID NO:681-744)。在另一方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的集合包括一个或多个标签，其具有包括以下中所示的序列的至少20、21、22、23或24个连续核苷酸的核苷酸序列：表13(SEQ ID NO:745-808)、表14(SEQ IDNO:809-866)、表15(SEQ ID NO:867-930)、表16(SEQ ID NO:931-994)、表17(SEQ ID NO:995-1052)、表18(SEQ ID NO:1053-1116)、表19(SEQ ID NO:1117-1180)、表20(SEQ ID NO:1181-1238)、表21(SEQ ID NO:1239-1302)、表22(SEQ ID NO:1303-1366)、表23(SEQ IDNO:1367-1424)或表24(SEQ ID NO:1425-1488)。
在另一方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的集合包括一个或多个标签，其具有包括与和以下中的捕获寡核苷酸的序列互补的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的至少20、21、22、23或24个连续核苷酸的核苷酸序列：表1(SEQ ID NO:1-64)、表2(SEQ ID NO:65-122)、表3(SEQ ID NO:123-186)、表4(SEQ ID NO:187-250)、表5(SEQ ID NO:251-308)、表6(SEQ ID NO:309-372)、表7(SEQ ID NO:373-436)、表8(SEQ IDNO:437-494)、表9(SEQ ID NO:495-558)、表10(SEQ ID NO:559-622)、表11(SEQ ID NO:623-680)或表12(SEQ ID NO:681-744)。在另一方面中，非交叉反应性寡核苷酸标签的集合包括一个或多个寡核苷酸标签，其具有包括与以下中所示的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的至少20、21、22、23或24个连续核苷酸的核苷酸序列：表13(SEQ ID NO:745-808)、表14(SEQ ID NO:809-866)、表15(SEQ ID NO:867-930)、表16(SEQID NO:931-994)、表17(SEQ ID NO:995-1052)、表18(SEQ ID NO:1053-1116)、表19(SEQ IDNO:1117-1180)、表20(SEQ ID NO:1181-1238)、表21(SEQ ID NO:1239-1302)、表22(SEQ IDNO:1303-1366)、表23(SEQ ID NO:1367-1424)或表24(SEQ ID NO:1425-1488)。
在一个方面中，所述集合中的非交叉反应性寡核苷酸标签选自：具有带有选自SEQID No:745-808的序列的至少20、21、22、23或24个连续核苷酸的序列的寡核苷酸标签；具有与选自SEQ ID No:745-808的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的寡核苷酸标签；具有带有与选自SEQ ID No:745-808的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的至少20、21、22、23或24个连续核苷酸的序列的寡核苷酸标签；具有选自SEQ ID No:745-808的序列的寡核苷酸标签；以及其组合。
在一个方面中，所述集合中的非交叉反应性寡核苷酸标签选自：具有带有选自SEQID No:745-754的序列的至少20、21、22、23或24个连续核苷酸的序列的寡核苷酸标签；具有与选自SEQ ID No:745-754的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的寡核苷酸标签；具有带有与选自SEQ ID No:745-754的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的至少20、21、22、23或24个连续核苷酸的序列的寡核苷酸标签；具有选自SEQ ID No:745-754的序列的寡核苷酸标签；以及其组合。
K.检测标记的寡核苷酸产物
在一个方面中，提供一种用于标记和检测样品中的一种或多种靶分析物的方法和试剂盒。在一个方面中，通过生成包括寡核苷酸标签的反应产物来确定样品中一种或多种靶分析物的存在。在一个方面中，反应产物包括标记。各种方法可以用于生成反应产物。在一个方面中，反应产物通过本文所描述的方法生成，包括但不限于夹心分析、寡核苷酸连接分析(OLA)、引物延伸分析(PEA)、直接杂交分析、基于聚合酶链反应(PCR)的分析或其它靶向扩增分析以及核酸酶保护分析。
1.夹心分析
在一个方面中，提供一种使用夹心分析检测、鉴别或定量样品中的一种或多种靶分析物的方法和试剂盒。在一个方面中，所述方法或试剂盒包括一个或多个探针集合，其包括靶向探针和检测探针。在一个方面中，靶向探针包括与固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸的至少一部分互补的单链寡核苷酸标签和第一结合伴侣。在一个方面中，第一结合伴侣包括第一核酸序列。在一个方面中，第一结合伴侣的第一核酸序列与样品中的靶核苷酸序列的第一区互补。在一个方面中，第一结合伴侣的第一核酸序列包括治疗性寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸包括RNA寡核苷酸序列。在一个方面中，治疗性寡核苷酸选自miRNA、治疗性RNA、mRNA、RNA病毒、反义寡核苷酸(ASO)或其组合。在一个方面中，第一结合伴侣的第一核酸序列由样品中的抗药物抗体(ADA)特异性结合。在另一方面中，第一结合伴侣包括特异性结合到样品中的靶分析物的抗体。在一个方面中，检测探针包括标记和第二结合伴侣。
在一个方面中，第二结合伴侣包括第二核酸序列。在一个方面中，第二结合伴侣的第二核酸序列与靶核苷酸序列的第二区互补。在一个方面中，第二结合伴侣的第二核酸序列包括治疗性寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸包括RNA寡核苷酸序列。在一个方面中，治疗性寡核苷酸选自miRNA、治疗性RNA、mRNA、RNA病毒、反义寡核苷酸(ASO)或其组合。在一个方面中，第二结合伴侣的第二核酸序列由样品中的抗药物抗体(ADA)特异性结合。在一个方面中，第一结合伴侣的第一ASO和第二结合伴侣的第二ASO由相同抗药物抗体特异性结合。
在一个方面中，第一结合伴侣的第一ASO的核苷酸序列与第二结合伴侣的第二ASO的核苷酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一个方面中，第二结合伴侣包括特异性结合到样品中的靶分析物的抗体。在一个方面中，靶向探针和检测探针可以与样品中的相同靶分析物同时结合以形成反应产物。在一个方面中，反应产物为夹心复合物。
在一个方面中，所述方法或试剂盒包括多个探针集合，其可以用于多重阵列以并行检测、鉴别或定量多种靶分析物。在一个方面中，每个探针集合包括靶向探针，其具有特异性结合到与另一集合中的靶向探针不同的第一靶分析物的第一结合伴侣，以及具有与和其它集合中的靶向探针不同的捕获寡核苷酸序列互补的序列的寡核苷酸标签。在一个方面中，每个探针集合包括检测探针，其包括特异性结合第一靶分析物的第二结合伴侣和标记。在一个方面中，所述方法或试剂盒包括多个寡核苷酸探针集合。在一个方面中，每个探针集合包括靶向探针，其中第一结合伴侣包括与第一靶核苷酸序列互补的核酸序列和具有与捕获寡核苷酸序列互补的序列的寡核苷酸标签，其中一个集合中的靶向探针的靶核苷酸序列不同于另一集合中的靶向探针中的靶核苷酸序列。在一个方面中，一个集合中的靶向探针的寡核苷酸标签的序列和另一集合中的靶向探针的寡核苷酸标签的序列与不同捕获寡核苷酸序列互补。在一个方面中，所述方法或试剂盒包括具有第二结合伴侣的检测探针，所述第二结合伴侣是与一种或多种靶核苷酸中的第二靶核苷酸序列互补的第二靶核苷酸序列。
在一个方面中，所述方法包括以下步骤：提供阵列，其包括具有一个或多个表面的一个或多个碳基电极；和本文所描述的一种或多种非交叉反应性捕获寡核苷酸，其中一种或多种非交叉反应性捕获寡核苷酸固定在一个或多个碳基电极的一个或多个表面上的一个或多个结合域中。在一个方面中，所述方法包括以下步骤：使一种或多种靶分析物与寡核苷酸标签和标记缔合，所述寡核苷酸标签与固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸的至少一部分互补；并且接着使阵列与包括一种或多种加标签且标记的靶分析物或反应产物的组合物接触。如本文所用，“缔合(associating)”或“缔合(associated)”意指寡核苷酸标签或标记共价或非共价结合到靶分析物。在一个方面中，一种或多种靶分析物与夹心复合物中的寡核苷酸标签和标记缔合。在一个方面中，靶分析物用于生成包括寡核苷酸标签和标记的反应产物。在一个方面中，所述方法包括以下步骤：在夹心复合物或反应产物的寡核苷酸标签与其相应互补捕获寡核苷酸杂交的条件下，将夹心复合物或反应产物与支撑表面一起培育，并且基于阵列位置中标记的存在或不存在来鉴别、检测或定量靶分析物。
2.寡核苷酸连接分析(OLA)
在一个方面中，使阵列与靶分析物的组合物接触，其中靶分析物与寡核苷酸标签缔合，所述寡核苷酸标签与固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸互补。在一个方面中，使阵列与包括多种靶分析物的组合物接触，其中每一靶分析物与寡核苷酸标签缔合，所述寡核苷酸标签与不同捕获寡核苷酸互补，并且可以基于阵列位置中寡核苷酸标签的结合来鉴别、检测或定量靶分析物。在一个方面中，使阵列与包括加标签且标记的反应产物的组合物接触。在一个方面中，使阵列与包括多种加标签且标记的反应产物的组合物接触，其中每一靶分析物用于生成包括与不同捕获寡核苷酸互补的寡核苷酸标签的反应产物，并且可以基于阵列位置中反应产物的结合来鉴别、检测或定量样品中的靶分析物。
在一个方面中，加标签且标记的反应产物通过寡核苷酸连接分析(OLA)制备，并且可以被捕获和检测以鉴别、检测或定量一个或多个靶核苷酸序列。在一个方面中，连接分析用于检测、鉴别或定量一个或多个靶核苷酸序列中的单核苷酸多态性(SNP)。在一个方面中，连接分析用于检测、鉴别或定量样品中的反义寡核苷酸(ASO)。在一个方面中，连接分析在样品中的一个或多个靶核苷酸序列扩增之后进行。在另一方面中，对一个或多个靶核苷酸序列未扩增的样品进行连接分析。在一个方面中，来自连接分析的反应产物在捕获和检测之前扩增。在另一方面中，来自连接分析的反应产物在捕获和检测之前未扩增。连接分析的反应产物可以使用已知方法扩增。
用于进行寡核苷酸连接反应的方法是已知的，并且一般包括以下步骤：使含有或可能含有一个或多个所关注核苷酸序列的样品与单链寡核苷酸探针对接触，所述探针与一个或多个靶核苷酸序列互补并且允许与靶核苷酸序列杂交。连接与靶核苷酸序列的相邻区杂交的探针以形成反应产物。在一个方面中，可以重复这些步骤以获得反应产物的多个拷贝。在一个方面中，连接反应混合物中的核苷酸序列在退火步骤之前变性。可以基于样品中反应产物的存在、不存在或数量来检测、鉴别或定量靶核苷酸序列。
通过DNA连接酶接合探针取决于三个事件：(1)寡核苷酸探针必须与靶核苷酸序列内的互补序列杂交；(2)寡核苷酸探针必须在5'到3'方向上彼此相邻，没有中间核苷酸；以及(3)寡核苷酸探针必须在其接合的位点处与靶核苷酸序列具有完全碱基对互补性。引物与靶之间的单核苷酸错配可能抑制连接。
在一个方面中，通过鉴别在靶核苷酸序列中SNP位点的两侧上包括约40个碱基对(总共约80个碱基对)的核酸序列并且产生在SNP上游和下游具有跨越约18到约28个核苷酸的互补序列的探针来生成探针。在一个方面中，生成在SNP位置不同的两个靶向探针。典型地，仅需要一个检测探针来检测野生型和变异等位基因。
在另一方面中，靶核苷酸序列为小核酸，例如长度为至少约15个碱基对、至少约16个碱基对、至少约17个碱基对、至少约18个碱基对、至少约19个碱基对或至少约20个碱基对并且至多约20个碱基对，长度为至多约25个碱基对，长度为至多约30个碱基对，长度为至多约40个碱基对或长度为至多约50个碱基对。在一个方面中，用于检测此类小核酸靶的探针包括长度为至少约8个碱基对、至少约9个碱基对、至少约10个碱基对、至少约11个碱基对或至少约12个碱基对并且至多约20个碱基对，长度为至多约25个碱基对，长度为至多约30个碱基对，长度为至多约40个碱基对或长度为至多约50个碱基对，并且探针和小核酸靶在如本文所描述与另一者杂交后连接。
寡核苷酸探针序列的长度可以基于OLA反应的连接温度要求(例如，62℃约与约64℃之间)而变化。可以向靶向或检测探针添加碱基或从中去除碱基，直到探针长度适合于给定反应温度。
在确定靶向和检测探针的序列和长度之后，可以将寡核苷酸标签添加到靶向探针。在一个方面中，将寡核苷酸标签添加到上游靶向探针的5′端。在一个方面中，每个寡核苷酸标签与固定在支撑表面上的不同捕获寡核苷酸互补。在一个方面中，检测探针包括标记。在一个方面中，检测探针包括5'磷酸基和3'标记。在一个方面中，检测探针包括5'磷酸基和3'生物素标记。
在一个方面中，所述方法包括使用多于一对探针。在一个方面中，为样品中的每个靶序列提供一对探针。在一个方面中，制备三个探针用于检测SNP对，即在单核苷酸多态性处不同的两个靶向探针以及一个检测探针。在一个方面中，两个靶向探针包括5'寡核苷酸标签和与所关注靶核酸中的野生型或变异单核苷酸多态性互补的3'核酸，并且检测探针包括3'标记。在一个方面中，3'标记是结合到可检测二级结合试剂的一级结合试剂。在一个方面中，3'标记包括生物素，并且二级结合试剂包括MSD SULFO-TAG链霉亲和素。在一个方面中，为多态性位点处的每个等位基因制备一对探针，例如可以制备两个探针，一个用于野生型等位基因并且一个用于突变等位基因。在一个方面中，对每个靶核苷酸序列进行连接反应。在另一方面中，对多于一个靶核苷酸序列进行多重连接反应。在一个方面中，对约1与约100个之间，或至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50、75或100个靶核苷酸序列进行多重连接反应。在一个方面中，进行多重连接反应以检测、鉴别或定量每个孔中的至多10个靶核苷酸序列。在一个方面中，检测、鉴别或定量多个等位基因对。在一个方面中，在每个孔中检测、鉴别或定量至多五个等位基因对(即，野生型和突变SNP对)。在一个方面中，检测、鉴别或定量包括确定样品对于变异等位基因是纯合、杂合还是无效的。
在一个方面中，探针使用模板依赖性连接酶接合，例如DNA连接酶，如大肠杆菌DNA连接酶、T4 DNA连接酶、栖热水生菌(Taq)连接酶、极端嗜热菌DNA连接酶或火球菌属DNA连接酶。在一个方面中，连接酶为热稳定连接酶。在另一方面中，探针通过化学连接接合。在一个方面中，例如使用多个热循环和热稳定连接酶在组合步骤中进行杂交和连接。在一个方面中，反应混合物包括至少约100U/mL、500U/mL或1000U/mL并且至多约1500U/mL或2000U/mL连接酶。
在一个方面中，通过在连接缓冲液中将样品与一对或多对探针和连接酶组合来进行连接分析。在一个方面中，将样品、探针和连接酶与连接缓冲液组合以形成体积为至少约10μL、15μL或20μL并且至多约20μL、25μL或50μL的连接反应混合物。
在一个方面中，每对探针包括靶向探针和检测探针。在一个方面中，靶向探针包括与靶核苷酸序列的第一区互补的核苷酸序列和与固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸的至少一部分互补的单链寡核苷酸标签。在一个方面中，检测探针包括标记和与靶核苷酸序列的第二区互补的核苷酸序列，所述第二区与靶向探针序列的第一核酸序列所互补的第一区相邻。在一个方面中，当探针对与靶核苷酸序列退火时，靶向探针的5'端被磷酸化并且与检测探针的3'-羟基相邻，使得两个探针的端可以通过形成磷酸二酯键而连接。在一个方面中，当探针对与靶核苷酸序列退火时，检测探针的5'端被磷酸化并且与靶向探针的3'-羟基相邻，使得两个探针的端可以通过形成磷酸二酯键而连接。
在一个方面中，靶向探针包括约5与约100、约10与约50、约20与约30之间，或至少约5、6、7、8、9、10、15、20或25并且至多约30、35、40、45、50、75或100个核苷酸。在一个方面中，至少约1nM、2nM、3nM、4nM或5nM并且至多约5nM、10nM、25nM或50nM的靶向探针包括于反应混合物中。
在一个方面中，靶向探针的整个长度与靶核苷酸序列互补。在另一方面中，靶向探针的一部分与靶核苷酸序列互补。在一个方面中，靶向探针与多态性位点下游的靶核苷酸序列互补。在一个方面中，靶向探针是等位基因特异性探针，其包括与包括单核苷酸变异体的靶核苷酸序列的区互补的核酸序列。在一个方面中，靶向探针是等位基因特异性探针，其包括与包括单核苷酸多态性的靶核苷酸序列的区互补的核酸序列。在一个方面中，靶向探针的3'末端核酸与靶核苷酸序列的多态性核酸互补。在另一方面中，靶向探针的3'末端核酸与靶核苷酸序列的多态性核酸3'端的核苷酸互补。
在一个方面中，靶向探针包括特异性结合到捕获分子的标签。在一个方面中，标签包括与单链捕获寡核苷酸的核苷酸序列的至少一部分互补的单链寡核苷酸序列。在一个方面中，标签连接到靶向探针的5'端。在另一方面中，标签连接到靶向探针的3'端。在一个方面中，标签与靶核苷酸序列不互补并且不杂交。
在一个方面中，标签包括比互补捕获寡核苷酸序列短至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10并且至多约11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸，或约1与约20个核苷酸之间或约10与约15个核苷酸之间或约12与约13个核苷酸之间的核苷酸序列。在一个方面中，标签具有长度为至少约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25并且至多约25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸，或约15与约40或约20与约30个核苷酸之间的核苷酸序列。
在一个方面中，标签包括与SEQ ID No:1-10中所示的捕获寡核苷酸的核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。在一个方面中，标签包括与SEQ ID No:1-10中所示的捕获寡核苷酸的序列的约20与约25之间或约24个连续核苷酸互补的核苷酸序列。在一个方面中，基于捕获寡核苷酸的序列使用已知方法制备单链寡核苷酸标签。
在一个方面中，每对寡核苷酸探针包括检测探针，其具有约5与约100、约10与约50、约20与约30之间，或至少约5、6、7、8、9、10、15、20或25并且至多约30、35、40、45、50、75或100个核苷酸。
在一个方面中，靶向探针和检测探针具有约60℃与约65℃之间或约62℃与约64℃之间的解链温度。在一个方面中，靶向探针和检测探针具有相似的解链温度(即，在约1℃、2℃、3℃、4℃或5℃内)。
在一个方面中，靶核苷酸序列的靶向探针和检测探针以1:1的比包括于连接反应混合物中。在另一方面中，包括过量的检测探针，例如，与靶向探针相比，连接反应混合物可以包括多至少约5×、10×或20×的检测探针。在一个方面中，至少约10nM、25nM、50nM、75nM、100nM、150nM或200nM的检测探针包括于反应混合物中。
在一个方面中，检测探针的整个长度与靶核苷酸序列互补。在另一方面中，检测探针的一部分与靶核苷酸序列互补。在一个方面中，检测探针与多态性位点上游的靶核苷酸序列互补。在一个方面中，检测探针包括与包括单核苷酸变异体的靶核苷酸序列的区互补的核酸序列。在一个方面中，检测探针包括与包括单核苷酸多态性的靶核苷酸序列的区互补的核酸序列。在一个方面中，检测探针的5'末端核酸与靶核苷酸序列的多态性核酸互补。在另一方面中，检测探针的5'末端核酸与靶核苷酸序列的多态性核酸5'端的核酸杂交。
在一个方面中，检测探针包括标记。在一个方面中，标记连接到检测探针的3'端。在一个方面中，标记连接到检测探针的3'端，并且5'端具有与靶核苷酸的序列互补的核酸序列，所述靶核苷酸的序列紧邻与靶向探针的3'端杂交的靶核苷酸的序列。在一个方面中，标记连接到检测探针的5'端，并且3'端具有与靶核苷酸的序列互补的核酸序列，所述靶核苷酸的序列紧邻与靶向探针的5'端杂交的靶核苷酸的序列。
在一个方面中，靶向探针与靶核苷酸序列杂交，使得靶向探针的3'端定位于靶核苷酸序列的多态性核苷酸正上方，并且检测探针与和多态性位点相邻的靶核苷酸序列杂交，提供5'端用于连接反应。如果靶向探针与靶核苷酸序列中的多态性核苷酸互补，则第一寡核苷酸将在多态性位点处与靶核苷酸序列杂交并且可以发生连接。如果靶向探针与核苷酸序列中的多态性核苷酸不互补，则第一寡核苷酸将不在多态性位点处与靶核苷酸序列杂交并且将不发生连接。
在另一方面中，靶向探针与靶核苷酸序列杂交，使得靶向探针的末端5'-碱基定位于靶核苷酸序列的多态性核苷酸正上方，并且检测探针与和多态性位点相邻的靶核苷酸序列杂交，提供3'端用于连接反应。
在另一方面中，检测探针与靶核苷酸序列杂交，使得检测探针的末端5'-碱基定位于靶核苷酸序列的多态性核苷酸正上方，并且靶向探针与和多态性位点相邻的靶核苷酸序列杂交，提供3'端用于连接反应。
在另一方面中，检测探针与靶核苷酸序列杂交，使得检测探针的末端3'碱基定位于靶核苷酸序列的多态性核苷酸正上方，并且靶向探针与和多态性位点相邻的靶核苷酸序列杂交，提供5'端用于连接反应。
在一个方面中，所述方法包括(i)使含有一种或多种靶核苷酸的样品与一对寡核苷酸探针和DNA连接酶接触以形成连接反应混合物；(ii)使探针对与靶核苷酸序列杂交，其中所述对包括具有定位于靶核苷酸序列的多态性核苷酸正上方的末端3'或5'碱基的捕获探针或检测探针；(iii)将靶向探针与检测探针连接在一起以形成标记且加标签的反应产物；(iv)使上面固定有一种或多种捕获寡核苷酸的支撑表面与标记且加标签的反应产物接触；(v)允许标签与捕获寡核苷酸杂交；以及(vi)检测加标签且标记的反应产物的存在。
在一个方面中，用于连接分析的探针以超过靶核苷酸序列的过量包括(即，在nM水平下)，并且因此，在一些情况下，可以在板上检测寡核苷酸与靶的非特异性结合作为阳性信号。虽然不希望受理论束缚，但据信非特异性杂交可能是探针与靶核苷酸序列杂交并且在不连接的情况下保持杂交的结果，这导致并非归因于连接反应产物的信号，而是称为桥接背景的非特异性信号。
在一个方面中，所述方法包括在连接反应混合物中提供一种或多种封闭探针。在一个方面中，在连接反应混合物中包括一种或多种封闭探针降低非特异性桥接背景。如本文所用，术语“封闭探针”是指与靶核苷酸序列互补并且跨越探针连接位点但不包括标签或标记的单链核苷酸序列，或与被设计成与靶核苷酸序列杂交的探针互补的单链核苷酸序列。在一个方面中，封闭探针在很大程度上与探针序列共线性。在一个方面中，封闭探针包括至少约20、25、30、35、40、45或50并且至多约50、75、100、150或200，或约20与约200之间，或约50与约100之间的与靶核苷酸序列或针对靶核苷酸序列的探针互补的核苷酸。在一个方面中，一对封闭探针包括于连接反应混合物中，其中第一封闭探针具有与连接探针相同的序列，但不具有互补寡核苷酸标签；并且第二封闭探针具有与检测探针相同的序列，但不具有生物素标记。在一个方面中，可以将至多2、3、4或5个额外核苷酸添加到与和探针序列相邻的靶核苷酸序列互补的封闭探针的5'和3'端。
虽然不希望受理论束缚，但据信封闭探针的存在可以减少复合物形成，其中靶核苷酸序列充当与靶序列退火但不连接的探针的桥接，使得复合物可能生成假信号。在一个方面中，一对封闭探针包括于连接反应混合物中。在另一方面中，一种或多种封闭探针以超过相应OLA探针的过量包括于连接反应混合物中。在一个方面中，一种或多种封闭探针以超过相应OLA探针至少约10×、20×、30×、40×、50×、60×、70×、80×、90×或100×的摩尔过量包括。
寡核苷酸连接分析的一个实施例示意性地表示于图1中。简单来说，包括多态性位点2的靶核苷酸序列1与一对寡核苷酸探针接触，所述探针包括具有寡核苷酸标签4和与多态性位点互补的核苷酸的靶向探针3以及具有标记6的检测探针5。允许寡核苷酸探针3、5与靶核苷酸序列杂交。(图1A)在多态性位点处以完全互补性杂交的寡核苷酸探针3、5连接以形成加标签4且标记6的反应产物11。(图1B)含有加标签4且标记6的连接产物11的反应混合物引入到具有固定在一个或多个结合域9中的一种或多种捕获寡核苷酸7的支撑表面上。如果加标签4且标记6的连接产物11通过加标签的寡核苷酸4中所含的互补核苷酸序列与捕获寡核苷酸7之间的杂交而固定在支撑表面上，则检测到信号10。(图1C)。
在一个方面中，提供多重连接酶检测反应。在一个方面中，使样品与一种或多种等位基因特异性探针和一种或多种常见探针接触。在一个方面中，一种或多种等位基因特异性探针包括上游探针，其包括具有与捕获寡核苷酸序列互补的序列的5′寡核苷酸标签和对应于所关注多态性的3′序列。在一个方面中，一种或多种常见探针是5′磷酸化和3′生物素化的下游探针。在一个方面中，使多重连接探针与含有一种或多种靶分析物的样品接触，允许其杂交并且相邻探针用DNA连接酶连接以形成连接产物。在一个方面中，使一种或多种固定化捕获寡核苷酸与连接产物接触，并且允许寡核苷酸标签与其相应捕获寡核苷酸杂交。可以例如使用标记的链霉亲和素，例如SULFO-TAG标记的链霉亲和素检测固定化连接产物。
在一个方面中，寡核苷酸连接分析(OLA)用于检测、鉴别和/或定量样品中所含的靶核苷酸序列，所述样品可能含有靶核苷酸序列的降解产物，也称为寡核苷酸代谢物。在一个方面中，含有靶核苷酸序列的样品进一步包括一种或多种寡核苷酸代谢物。在一个方面中，OLA用于测量样品中靶核苷酸序列相对于寡核苷酸代谢物的量。在一个方面中，OLA用于确定靶核苷酸序列的药代动力学参数。在一个方面中，测量的药代动力学参数为清除率、体积分布、血浆浓度、半衰期、峰时间、峰浓度、可用率或其组合。本文中描述药代动力学参数的测量和解释。在一个方面中，靶核苷酸序列为治疗性寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸为反义寡核苷酸(ASO)。在一个方面中，寡核苷酸代谢物为治疗性寡核苷酸代谢物。本文中描述治疗性寡核苷酸、ASO及其代谢和药理学。
在一个方面中，寡核苷酸代谢物比靶核苷酸序列短1个或更多个核苷酸、2个或更多个核苷酸、3个或更多个核苷酸、4个或更多个核苷酸、5个或更多个核苷酸、6个或更多个核苷酸、7个或更多个核苷酸、8个或更多个核苷酸、9个或更多个核苷酸、10个或更多个核苷酸、15个或更多个核苷酸或20个或更多个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸代谢物比靶核苷酸序列短约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。在一个方面中，靶核苷酸序列为治疗性寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸为反义寡核苷酸(ASO)。在一个方面中，寡核苷酸代谢物为治疗性寡核苷酸代谢物。
图15中绘示一个示范性实施例。在图15中，使含有靶核苷酸序列的样品与模板寡核苷酸接触。模板寡核苷酸包含与靶核苷酸序列互补的第一序列，以及与第一序列相邻并且与靶核苷酸序列的连接伴侣互补的第二序列。在一个方面中，靶核苷酸序列与模板寡核苷酸的第一序列杂交，并且靶核苷酸序列的连接伴侣与模板寡核苷酸的第二序列杂交。在一个方面中，靶核苷酸序列和连接伴侣在模板寡核苷酸的整个长度上杂交。在一个方面中，靶核苷酸序列和连接伴侣与模板寡核苷酸杂交以形成双链复合物。使用本文所描述的方法将靶核苷酸序列和连接伴侣连接在一起以形成靶核苷酸序列连接产物。随后使靶核苷酸序列连接产物与单链寡核苷酸探针对接触，所述探针对与靶核苷酸序列连接产物互补并且允许与靶核苷酸序列连接产物杂交。在一个方面中，将能够与靶核苷酸序列连接产物的相邻区杂交的探针添加到靶核苷酸序列连接产物中。在一个方面中，连接两个相邻探针(各自与靶核苷酸序列连接产物的相邻区杂交)以形成反应产物。在一个方面中，探针包含如本文所描述的靶向探针和检测探针。在一个方面中，靶向探针和检测探针在靶核苷酸序列连接产物的整个长度上杂交。在一个方面中，靶向探针包含寡核苷酸标签。本文中进一步描述靶向探针和寡核苷酸标签。在一个方面中，寡核苷酸标签与固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸的至少一部分互补。在一个方面中，检测探针包含标记。本文中进一步描述检测探针和标记。在一个方面中，标记包含生物素，并且检测试剂连接到链霉亲和素。在另一方面中，标记包含半抗原，并且检测试剂连接到半抗原结合伴侣，如抗体。本文中进一步描述标记、检测试剂和标记与检测试剂之间的结合模式。在一个方面中，使表面与用于结合到标记的检测试剂接触。在一个方面中，检测试剂为电化学发光试剂。在一个方面中，检测试剂包含MSDSULFO-TAG。在一个方面中，如本文所描述测量电化学发光以检测、鉴别和/或定量靶核苷酸序列。在一个方面中，测量样品中靶核苷酸序列的量以确定靶核苷酸序列的药代动力学参数。在一个方面中，靶核苷酸序列为治疗性寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸为反义寡核苷酸。在一个方面中，在不扩增治疗性寡核苷酸的情况下检测治疗性寡核苷酸。在一个方面中，在无核酸提取步骤的情况下检测样品中的治疗性寡核苷酸。
在一个方面中，含有靶核苷酸序列的样品还包括一种或多种寡核苷酸代谢物。在一个方面中，寡核苷酸代谢物干扰靶核苷酸序列的检测、鉴别和/或定量。因此，可能需要从样品中去除寡核苷酸代谢物。因此，在一个方面中，将对单链寡核苷酸具有特异性的核酸酶(即，“单链特异性核酸酶”)添加到样品中，同时使靶核苷酸序列连接产物与模板寡核苷酸杂交，并且之后添加探针，如图15中所概述。单链特异性核酸酶特异性去除单链寡核苷酸代谢物，同时大体上对杂交的靶核苷酸序列连接产物和模板寡核苷酸不具有反应性。在一个方面中，单链特异性核酸酶另外去除过量未杂交的模板寡核苷酸。单链特异性核酸酶的非限制性实例包括核酸酶S1(例如从米曲霉(Aspergillus oryzae)中分离)、核酸酶P1(例如从桔青霉(Penicillium citrinum)中分离)、核酸酶MB(例如从绿豆(mung bean；Vignaradiata)中分离)以及从埃氏交替单胞菌(Alteromonas espejiana)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)和玉米黑粉菌(Ustilago maydis)中分离的核酸酶。单链特异性核酸酶还可以包括例如RNA酶，如RNA酶A、RNA酶H、RNA酶I、RNA酶III、RNA酶L、RNA酶P、RNA酶PhyM、RNA酶T1、RNA酶T2、RNA酶U2、RNA酶V、PNP酶、RNA酶PH、RNA酶R、RNA酶D、RNA酶T、RNA酶ONE、寡核糖核酸酶、核糖核酸外切酶I以及核糖核酸外切酶II。可能适合于本发明方法的额外核酸酶包括某些DNA酶。包括单链特异性核酸酶的额外核酸酶提供于例如Yang,《生物物理学季评(Q Rev Biophys)》44(1):1-93(2011)和Desai等人,《欧洲微生物学会联合会微生物学评论(FEMS Microbiol Rev)》26:457-491(2003)中。在一个方面中，靶核苷酸序列为治疗性寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸为反义寡核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸代谢物为治疗性寡核苷酸代谢物。在一个方面中，靶核苷酸序列包括RNA。在一个方面中，靶核苷酸序列包括miRNA、治疗性RNA、mRNA、RNA病毒或其组合。
3.引物延伸分析(PEA)
在另一方面中，使用引物延伸分析(PEA)检测、鉴别或定量样品中的一个或多个靶核苷酸序列。在一个方面中，靶核苷酸序列包括一种或多种单核苷酸变异体(SNV)。在另一方面中，核苷酸序列包括一种或多种单核苷酸多态性(SNP)。在一个方面中，引物延伸在样品中的靶核苷酸序列扩增之后进行。在另一方面中，对未扩增的样品进行引物延伸。
用于进行引物延伸分析的方法是已知的并且一般包括以下步骤：使样品与具有与靶核苷酸序列互补的核苷酸序列的探针接触。在一个方面中，探针的整个长度与靶核苷酸序列互补。在另一方面中，探针的一部分与靶核苷酸序列互补。在一个方面中，探针包括与紧接多态性的3'端的靶核苷酸序列的核酸序列互补的核酸序列，使得探针与多态性核苷酸下游的靶核苷酸序列杂交。在一个方面中，探针包括约5与约100、约10与约50、约20与约30之间，或至少约5、6、7、8、9、10、15、20或25并且至多约30、35、40、45、50、75或100个核苷酸。
在一个方面中，探针是包括特异性结合到捕获分子的标签的靶向探针。在一个方面中，标签包括与单链捕获寡核苷酸的核苷酸序列互补的单链寡核苷酸序列。在一个方面中，标签连接到靶向探针的5'端。在一个方面中，标签连接的靶向探针的5'端，并且靶向探针的3'末端核酸与紧接在靶核苷酸序列的多态性位点下游的核酸互补。在一个方面中，基于捕获寡核苷酸的序列，由最终用户使用已知方法制备单链寡核苷酸标签。
在一个方面中，标签包括比捕获寡核苷酸序列短至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10并且至多约11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸，或约1与约20个核苷酸之间或约10与约15个核苷酸之间的核苷酸序列。在一个方面中，标签具有长度为至少约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25并且至多约25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸，或约15与约40或约20与约30个核苷酸之间的核苷酸序列。在一个方面中，标签包括与SEQ ID NO:1-64中所示的捕获寡核苷酸的核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。在一个方面中，标签包括与SEQ ID NO:1-10中所示的捕获寡核苷酸的核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。
在一个方面中，一种或多种标签寡核苷酸含有与其相应捕获寡核苷酸的全序列互补的序列。在一个方面中，一种或多种标签寡核苷酸含有仅与其相应捕获寡核苷酸的序列的一部分互补的序列。举例来说，但不作为限制，捕获寡核苷酸可以含有如本文所描述的接头，其可以由以下组成或包含以下：与标签寡核苷酸序列不互补的寡核苷酸序列，邻近其所连接的表面(例如，从硫醇修饰的末端核苷酸开始)。标签与捕获寡核苷酸之间的互补区的长度也可以变化。在本发明的一些方面中，寡核苷酸之间的互补区的长度为至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸。
在一个方面中，所述方法包括使含有一个或多个靶核苷酸序列的样品与靶向探针接触，并且使靶向探针与靶寡核苷酸在引物延伸反应混合物的存在下杂交，所述引物延伸反应混合物包括聚合酶和一种或多种2'3'-双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)，包括例如ddA、ddT、ddC、ddG。在一个方面中，ddNTP与多态性位点互补被标记。在一个方面中，与多态性位点不互补的ddNTP未被标记。在一个方面中，与野生型多态性核苷酸互补的ddNTP被标记。在另一方面中，ddNTP与突变多态性核苷酸互补被标记。在一个方面中，靶向探针的3'端由单个ddNTP延伸。在一个方面中，当标记的ddNTP与多态性核苷酸互补时，引物由一个标记的ddNTP延伸以形成加标签且标记的反应产物。当标记的ddNTP与多态性核苷酸不互补时，使得引物由未标记的ddNTP延伸并且未检测到。
合适的聚合酶包括但不限于DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA依赖性RNA聚合酶(逆转录酶)及其活性亚基，包括例如DNA聚合酶的克列诺片段(Klenow fragment)。在一个方面中，聚合酶为DNA聚合酶。在一个方面中，聚合酶为热稳定聚合酶，如Taq聚合酶。
引物延伸分析的一个实施例示意性地表示于图2中。简单来说，使包括多态性位点22的靶核苷酸序列21与具有寡核苷酸标签25的靶向探针23在引物延伸反应混合物存在下接触，所述引物延伸反应混合物包括DNA聚合酶和2'3'-双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)，即，ddA、ddT、ddC、ddG，其中与多态性位点互补的ddNTP 25被标记26。靶向探针的3'端由单个ddNTP延伸。如图2A中所示，当标记的ddNTP与多态性核苷酸互补时，引物由一个标记的ddNTP延伸以形成加标签且标记的反应产物。如图2B中所示，当多态性核苷酸与标记的ddNTP不互补时，引物由未标记的ddNTP延伸，产生不会被检测到的未标记的反应产物。
4.直接杂交
在一个方面中，提供一种使用直接杂交方法检测、鉴别或定量样品中的一种或多种靶分析物的方法或试剂盒。在一个方面中，所述方法或试剂盒包括一种或多种捕获寡核苷酸，其包括与样品中的一种或多种靶核酸的序列互补的一个或多个核酸序列(在本文中称为“靶特异性捕获寡核苷酸”)。在一个方面中，所述方法或试剂盒包括多种靶特异性捕获寡核苷酸，其可以用于多重阵列以并行检测、鉴别或定量多种靶分析物。
在一个方面中，所述方法包括提供支撑表面的步骤，一种或多种靶特异性捕获分子固定到所述支撑表面上。在一个方面中，支撑表面具有平坦表面。在一个方面中，支撑表面是具有多个孔的板，即，“多孔板”。多孔板可以包括以任何图案或配置布置的任何数目个任何大小或形状的孔。在另一方面中，支撑表面具有弯曲表面。在一个方面中，支撑表面包括分析模块，如分析板、载玻片、盒、珠粒或芯片。在一个方面中，支撑表面由一个或多个粒子或“珠粒”提供。在一个方面中，支撑表面包括颜色编码微球。参见例如Yang等人(2001)《BADGE，用于检测基因表达的珠粒阵列，一种高通量诊断生物分析》.《基因组研究》11(11):1888-1898。在一个方面中，支撑表面包括一个或多个珠粒，一种或多种靶特异性捕获寡核苷酸固定在所述珠粒上。
在一个方面中，一种或多种靶特异性捕获分子固定在阵列中的结合域中。在一个方面中，支撑表面包括具有一个或多个表面的一个或多个碳基电极，以及固定在一个或多个碳基电极的一个或多个表面上的一个或多个结合域中的一种或多种靶特异性捕获寡核苷酸。
在一个方面中，使含有或疑似含有一种或多种靶分析物的样品与一种或多种寡核苷酸探针接触，所述探针包括与一种或多种靶核酸上的序列互补的一个或多个序列以及包括与一种或多种靶分析物互补的序列的标记的引物，所述接触在标记的引物与靶分析物杂交的条件下进行。随后可以使用已知技术，如PCR扩增来扩增靶分析物，以形成标记的反应产物。
在一个方面中，使上面固定有一个或多个靶特异性捕获寡核苷酸序列的支撑表面与标记的反应产物在如下条件下接触：一种或多种标记的反应产物的寡核苷酸标签能够与其在支撑表面上的相应互补捕获寡核苷酸序列杂交，以形成固定化检测复合物，并且基于阵列位置中标记的存在或不存在来鉴别、检测或定量靶分析物。
在一个方面中，直接杂交用于检测、鉴别或定量样品中病毒的存在。在一个方面中，直接杂交可以用于人乳头瘤病毒(HPV)基因分型。人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的主要原因。已鉴别出超过200种HPV基因型，并且大约40种造成生殖器感染。HPV 16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82型视为致癌的。Munoz等人(2003)《与宫颈癌相关的人乳头瘤病毒类型的流行病学分类(Epidemiologic classification ofhuman papillomavirus types associated with cervical cancer)》.《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》3(48):518。
在一个方面中，直接杂交用于检测、鉴别或定量样品中细菌的存在。在一个方面中，直接杂交用于检测、鉴别或定量样品中的沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis；C.trachomatis)。在一个方面中，直接杂交用于检测、鉴别或定量沙眼衣原体的三种主要血清型(血清型A-C)中的一者或多者。
在一个方面中，直接杂交用于检测、鉴别或定量样品中肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)的存在。已鉴别出超过2600种不同血清型，并且其可以分成伤寒和非伤寒血清变异型。Gal-mor等人(2014)《相同物种，不同疾病：伤寒和非伤寒肠道沙门氏菌血清变异型如何以及为何不同(Same species,different diseases:how and why typhoidal and non-typhoidal Salmonella enterica sevovars differ)》.《微生物学前沿(Front.Microbiol.)》5(391)doi:10.3389/fmicb.2014.00391。
在一个方面中，直接杂交用于检测、鉴别和/或定量可能含有寡核苷酸代谢物的样品中的靶核苷酸序列，例如治疗性寡核苷酸。在一个方面中，含有靶核苷酸序列的样品进一步包括一种或多种寡核苷酸代谢物。在一个方面中，直接杂交用于测量样品中靶核苷酸序列相对于寡核苷酸代谢物的量。在一个方面中，直接杂交用于确定靶核苷酸序列的药代动力学参数。在一个方面中，测量的药代动力学参数为清除率、体积分布、血浆浓度、半衰期、峰时间、峰浓度、可用率或其组合。本文中描述药代动力学参数的测量和解释。在一个方面中，靶核苷酸序列为治疗性寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸为反义寡核苷酸(ASO)。本文中描述治疗性寡核苷酸、ASO及其代谢和药理学。
在一个方面中，寡核苷酸代谢物比靶核苷酸序列短1个或更多个核苷酸、2个或更多个核苷酸、3个或更多个核苷酸、4个或更多个核苷酸、5个或更多个核苷酸、6个或更多个核苷酸、7个或更多个核苷酸、8个或更多个核苷酸、9个或更多个核苷酸、10个或更多个核苷酸、15个或更多个核苷酸或20个或更多个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸代谢物比靶核苷酸序列短约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。在一个方面中，靶核苷酸序列为治疗性寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸为反义寡核苷酸(ASO)。在一个方面中，寡核苷酸代谢物为治疗性寡核苷酸代谢物。
图16中绘示一个示范性实施例。在图16中，在靶核苷酸序列与靶核苷酸序列互补序列杂交的条件下，使含有靶核苷酸序列的样品与包含靶核苷酸序列的互补序列的靶核苷酸序列互补序列接触。在一个方面中，靶核苷酸序列和靶核苷酸序列互补序列在其整个长度上杂交。在一个方面中，靶核苷酸序列分析物和靶核苷酸序列互补序列杂交以形成双链杂交复合物。在一个方面中，含有靶核苷酸序列的样品进一步包括一种或多种寡核苷酸代谢物。本文中描述靶核苷酸序列(例如治疗性寡核苷酸，如ASO)的代谢物。在一个方面中，所述方法包括去除寡核苷酸代谢物。在一个方面中，将单链特异性核酸酶添加到样品中，同时使靶核苷酸序列与靶核苷酸序列互补序列杂交。在一个方面中，单链特异性核酸酶特异性去除单链寡核苷酸代谢物，同时大体上对杂交的靶核苷酸序列和靶核苷酸序列互补序列不具有反应性。在一个方面中，单链特异性核酸酶另外去除过量未杂交的靶核苷酸序列互补序列。本文中提供合适的核酸酶，包括单链特异性核酸酶的实例。在一个方面中，靶核苷酸序列为治疗性寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸为反义寡核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸代谢物为治疗性寡核苷酸代谢物。
在一个方面中，在通过单链特异性核酸酶去除寡核苷酸代谢物和/或未杂交的靶核苷酸序列互补序列之后，添加能够与靶核苷酸序列的相邻区杂交的探针。在一个方面中，连接两个相邻探针(各自与靶核苷酸序列的相邻区杂交)以形成反应产物。在一个方面中，探针包含如本文所描述的靶向探针和检测探针。在一个方面中，靶向探针和检测探针在靶核苷酸序列的整个长度上杂交。在一个方面中，靶向探针包含寡核苷酸标签。本文中进一步描述靶向探针和寡核苷酸标签。在一个方面中，寡核苷酸标签与固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸的至少一部分互补。在一个方面中，检测探针包含标记。本文中进一步描述检测探针和标记。在一个方面中，检测探针能够结合到检测试剂。在一个方面中，检测探针包含生物素标记。在一个方面中，标记包含生物素，并且检测试剂连接到链霉亲和素。在另一方面中，标记包含半抗原，并且检测试剂连接到半抗原结合伴侣，如抗体。本文中进一步描述标记、检测试剂和标记与检测试剂之间的结合模式。在一个方面中，使表面与用于结合到标记的检测试剂接触。在一个方面中，检测试剂为电化学发光试剂。在一个方面中，检测试剂包含MSD SULFO-TAG。在一个方面中，如本文所描述测量电化学发光以检测、鉴别和/或定量靶核苷酸序列。在一个方面中，测量样品中靶核苷酸序列的量以确定靶核苷酸序列的药代动力学参数。在一个方面中，靶核苷酸序列为治疗性寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸为反义寡核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸代谢物为治疗性寡核苷酸代谢物。在一个方面中，靶核苷酸序列包括RNA。在一个方面中，靶核苷酸序列包括miRNA、治疗性RNA、mRNA、RNA病毒或其组合。
5.聚合酶链反应(PCR)
在一个方面中，提供一种使用聚合酶链反应(PCR)检测、鉴别或定量样品中的一种或多种靶分析物的方法或试剂盒。在一个方面中，使用PCR扩增靶核酸。在一个方面中，提供一种方法或试剂盒，其包括一个或多个PCR引物集合，其中每个引物集合包括上游引物和下游引物。在一个方面中，使用一种或多种上游和下游PCR引物扩增样品中的靶核苷酸序列。
在一个方面中，使用一种或多种修饰的上游或下游引物扩增样品中的一种或多种靶核苷酸分析物。在一个方面中，使用一种或多种上游引物扩增一种或多种靶核苷酸分析物，所述引物包括被配置成与具有互补序列的捕获寡核苷酸杂交的寡核苷酸标签序列。在一个方面中，使用一种或多种包括标记的下游引物扩增一种或多种靶核苷酸分析物。在一个方面中，使用一种或多种下游引物扩增一种或多种靶核苷酸分析物，所述引物包括被配置成与具有互补序列的捕获寡核苷酸杂交的寡核苷酸标签序列。在一个方面中，使用一种或多种包括标记的上游引物扩增一种或多种靶核苷酸分析物。
在一个方面中，使用一个或多个修饰的PCR引物扩增靶核苷酸序列以形成PCR反应产物，其包括被配置成与固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸杂交的寡核苷酸标签。在一个方面中，使用一种或多种修饰的PCR引物扩增靶核苷酸序列以形成包括标记的PCR反应产物。在一个方面中，使用一个或多个修饰的PCR引物扩增靶核苷酸序列以形成PCR反应产物，其包括被配置成与固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸杂交的寡核苷酸标签以及标记。用于标记PCR反应产物的方法是已知的，并且包括例如标记的脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)或包括标记的修饰的上游或下游引物。
在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸固定在支撑表面上的阵列中的结合域中。在一个方面中，通过使寡核苷酸标签与其相应捕获寡核苷酸杂交，在支撑表面上捕获PCR反应产物，从而形成固定在支撑表面上的检测复合物。
在一个方面中，使用连接介导的扩增(LM PCR)检测、鉴别或定量一种或多种靶分析物。在一个方面中，使用多重“连接介导的扩增”结合本文所描述的方法检测、鉴别或定量一种或多种靶分析物。在一个方面中，使用上游和下游探针逆转录一种或多种靶核苷酸分析物。在一个方面中，上游探针包括与通用引物位点(如T7)互补的核苷酸序列、寡核苷酸标签序列和基因特异性序列，并且下游探针包括与上游探针的基因特异性片段邻接的基因特异性片段和通用引物位点(如T3)。在一个方面中，下游探针是5'磷酸化的。在一个方面中，探针与其靶退火，去除游离探针并且使用连接酶连接退火的探针以产生扩增模板。在一个方面中，用T3和5'生物素化T7引物进行PCR。在一个方面中，在寡核苷酸标签与其相应捕获寡核苷酸杂交的条件下，使固定到支撑表面的捕获寡核苷酸与生物素化扩增子接触。在一个方面中，将所捕获的标记的扩增子与标记的链霉亲和素(例如，SULFO-TAG标记的链霉亲和素)一起培育，使得可以检测、鉴别或定量所捕获的标记的扩增子。参见例如Peck等人(2006)《一种用于高通量基因表达特征分析的方法(A method for high-throughput geneexpression signature analysis)》.《基因组生物学(Genome Biol.)》7(7):R61。
在一个方面中，靶分析物为cDNA。在一个方面中，靶分析物为mRNA。在一个方面中，使用寡脱氧胸苷酸(oligo-dT)引物从加多A尾的mRNA合成cDNA。在一个方面中，可以使用随机引发cDNA合成从mRNA生成cDNA。
6.核酸酶保护分析(NPA)
在一个方面中，提供一种使用核酸酶保护分析检测、鉴别或定量样品中的一种或多种靶分析物的方法或试剂盒。在一个方面中，核酸酶保护分析用于检测、鉴别或定量含有或疑似含有靶分析物的样品中的靶分析物。在一个方面中，靶分析物包括单链核酸，包括例如单链RNA。在一个方面中，靶分析物包括微RNA(miRNA)。在一个方面中，使样品与一种或多种包括与靶分析物的序列互补的序列以及寡核苷酸标签序列的单链探针在如下条件下接触：靶分析物与探针杂交，以形成加标签的反应产物。在一个方面中，探针为DNA/RNA杂交探针，其包括单链DNA标签序列和与靶分析物的核酸序列互补的单链RNA序列。在一个方面中，杂交探针包括生物素标记。
在一个方面中，使上面固定有一种或多种捕获寡核苷酸的支撑表面与包括加标签的反应产物的混合物在如下条件下接触：一个或多个寡核苷酸标签序列与其固定在支撑表面上的相应捕获寡核苷酸序列杂交。在允许寡核苷酸标签与其在支撑表面上的相应捕获寡核苷酸杂交之后，洗涤支撑表面并且使支撑表面与对单链RNA具有特异性的RNA酶(例如RNA酶A或RNA酶I)在如下条件下接触：RNA酶可以消化单链RNA分子并且去除结合到不具有杂交的靶RNA的点的过量探针并且裂解探针与靶RNA之间的任何错配位点。
在一个方面中，miRNA分析包括递减探针杂交步骤，其中DNA/RNA嵌合探针在退火温度增量降低期间与靶miRNA杂交。
在一个方面中，具有直接表面涂层的核酸酶保护分析(NPA)用于检测、鉴别和/或定量样品中的靶核苷酸序列，所述样品可能含有靶核苷酸序列的降解产物，也称为寡核苷酸代谢物。在一个方面中，含有靶核苷酸序列的样品进一步包括一种或多种寡核苷酸代谢物。在一个方面中，具有直接表面涂层的NPA用于测量样品中靶核苷酸序列相对于寡核苷酸代谢物的量。在一个方面中，具有直接表面涂层的NPA用于确定治疗性寡核苷酸的药代动力学参数。在一个方面中，测量的药代动力学参数为清除率、体积分布、血浆浓度、半衰期、峰时间、峰浓度、可用率或其组合。本文中描述药代动力学参数的测量和解释。在一个方面中，靶核苷酸序列为治疗性寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸为反义寡核苷酸(ASO)。在一个方面中，寡核苷酸代谢物为治疗性寡核苷酸代谢物。本文中描述治疗性寡核苷酸、反义寡核苷酸及其代谢和药理学。
在一个方面中，寡核苷酸代谢物比靶核苷酸序列短1个或更多个核苷酸、2个或更多个核苷酸、3个或更多个核苷酸、4个或更多个核苷酸、5个或更多个核苷酸、6个或更多个核苷酸、7个或更多个核苷酸、8个或更多个核苷酸、9个或更多个核苷酸、10个或更多个核苷酸、15个或更多个核苷酸或20个或更多个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸代谢物比靶核苷酸序列短约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。在一个方面中，靶核苷酸序列为治疗性寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸为反义寡核苷酸(ASO)。在一个方面中，寡核苷酸代谢物为治疗性寡核苷酸代谢物。在一个方面中，在不扩增治疗性寡核苷酸的情况下检测治疗性寡核苷酸。在一个方面中，在无核酸提取步骤的情况下检测样品中的治疗性寡核苷酸。
图17中绘示一个示范性实施例。在图17中，包含与靶核苷酸序列的互补序列的靶核苷酸序列互补序列用作捕获寡核苷酸。靶核苷酸序列互补序列在一端包含标记并且在另一端包含表面连接部分。将捕获寡核苷酸固定到表面的方法描述于本文中并且包括例如静电相互作用、互补结合伴侣、互补反应性官能团、接头(例如包括反应性官能团的交联剂)等。在一个方面中，表面通过靶核苷酸序列互补序列的表面连接部分涂布有靶核苷酸序列互补序列。在一个方面中，表面连接部分包含硫醇。在一个方面中，表面连接部分包含生物素。
在一个方面中，在靶核苷酸序列互补序列与靶核苷酸序列杂交的条件下，使靶核苷酸序列互补序列涂布的表面与含有靶核苷酸序列的样品接触。在一个方面中，靶核苷酸序列与靶核苷酸序列互补序列在其整个长度上杂交。在一个方面中，靶核苷酸序列和靶核苷酸序列互补序列杂交以形成双链杂交复合物。在一个方面中，含有靶核苷酸序列的样品进一步包括一种或多种寡核苷酸代谢物。本文中描述靶核苷酸序列(例如治疗性寡核苷酸，如ASO)的代谢物。在一个方面中，所述方法包括去除寡核苷酸代谢物。在一个方面中，将单链特异性核酸酶添加到样品中，同时使靶核苷酸序列与靶核苷酸序列互补序列杂交。在一个方面中，单链特异性核酸酶特异性去除单链寡核苷酸代谢物，同时大体上对杂交的靶核苷酸序列-靶核苷酸序列互补序列不具有反应性。本文中提供合适的核酸酶，包括单链特异性核酸酶的实例。
在一个方面中，在通过单链特异性核酸酶去除寡核苷酸代谢物之后，使表面与能够结合到靶核苷酸序列互补序列上的标记的检测试剂接触。在一个方面中，标记包含生物素，并且检测试剂连接到链霉亲和素。在另一方面中，标记包含半抗原，并且检测试剂连接到半抗原结合伴侣，如抗体。本文中进一步描述标记、检测试剂和标记与检测试剂之间的结合模式。在一个方面中，检测试剂为电化学发光试剂。在一个方面中，检测试剂包含MSDSULFO-TAG。在一个方面中，如本文所描述测量电化学发光以检测、鉴别和/或定量靶核苷酸序列。在一个方面中，测量样品中靶核苷酸序列的量以确定靶核苷酸序列的药代动力学参数。在一个方面中，靶核苷酸序列为治疗性寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸为反义寡核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸代谢物为治疗性寡核苷酸代谢物。在一个方面中，靶核苷酸序列包括RNA。在一个方面中，靶核苷酸序列包括miRNA、治疗性RNA、mRNA、RNA病毒或其组合。
在另一方面中，靶核苷酸序列为小核酸，例如长度为至少约15个碱基对、至少约16个碱基对、至少约17个碱基对、至少约18个碱基对、至少约19个碱基对或至少约20个碱基对并且至多约20个碱基对，长度为至多约25个碱基对，长度为至多约30个碱基对，长度为至多约40个碱基对或长度为至多约50个碱基对。在一个方面中，用于检测此类小核酸靶的探针包括长度为至少约8个碱基对、至少约9个碱基对、至少约10个碱基对、至少约11个碱基对或至少约12个碱基对并且至多约20个碱基对，长度为至多约25个碱基对，长度为至多约30个碱基对，长度为至多约40个碱基对或长度为至多约50个碱基对，并且探针和小核酸靶在如本文所描述与另一者杂交后连接。
7.杂交/保护分析
在一个方面中，杂交/保护分析用于检测、鉴别和/或定量可能含有寡核苷酸代谢物的样品中的靶核苷酸序列，例如治疗性寡核苷酸。在一个方面中，含有靶核苷酸序列的样品进一步包括一种或多种寡核苷酸代谢物。在一个方面中，杂交/保护分析用于测量样品中的靶核苷酸序列相对于寡核苷酸代谢物的量。在一个方面中，杂交/保护分析用于确定治疗性寡核苷酸的药代动力学参数。在一个方面中，测量的药代动力学参数为清除率、体积分布、血浆浓度、半衰期、峰时间、峰浓度、可用率或其组合。本文中描述药代动力学参数的测量和解释。在一个方面中，靶核苷酸序列为治疗性寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸为反义寡核苷酸(ASO)。本文中描述治疗性寡核苷酸、ASO及其代谢和药理学。
在一个方面中，寡核苷酸代谢物比靶核苷酸序列短1个或更多个核苷酸、2个或更多个核苷酸、3个或更多个核苷酸、4个或更多个核苷酸、5个或更多个核苷酸、6个或更多个核苷酸、7个或更多个核苷酸、8个或更多个核苷酸、9个或更多个核苷酸、10个或更多个核苷酸、15个或更多个核苷酸或20个或更多个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸代谢物比靶核苷酸序列短约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。在一个方面中，靶核苷酸序列为治疗性寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸为反义寡核苷酸(ASO)。在一个方面中，寡核苷酸代谢物为治疗性寡核苷酸代谢物。在一个方面中，在不扩增治疗性寡核苷酸的情况下检测治疗性寡核苷酸。在一个方面中，在无核酸提取步骤的情况下检测样品中的治疗性寡核苷酸。
图18中绘示一个示范性实施例。在图18中，使含有靶核苷酸序列的样品与靶核苷酸序列互补序列探针接触，所述探针包含(i)与靶核苷酸序列互补的靶核苷酸序列互补序列；(ii)寡核苷酸标签以及(iii)标记。在一个方面中，靶核苷酸序列互补序列探针的寡核苷酸标签与固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸的至少一部分互补。在一个方面中，靶核苷酸序列的寡核苷酸标签是双链的，并且寡核苷酸标签的一条链与固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸的至少一部分互补。本文中进一步描述寡核苷酸标签和捕获寡核苷酸。在一个方面中，靶核苷酸序列互补序列探针的标记能够结合到检测试剂。在一个方面中，标记包含生物素，并且检测试剂连接到链霉亲和素。在另一方面中，标记包含半抗原，并且检测试剂连接到半抗原结合伴侣，如抗体。本文中进一步描述标记、检测试剂和标记与检测试剂之间的结合模式。
在一个方面中，靶核苷酸序列与靶核苷酸序列互补序列探针杂交。在一个方面中，靶核苷酸序列和靶核苷酸序列互补序列探针在靶核苷酸序列和靶核苷酸序列互补序列的整个长度上杂交。在一个方面中，寡核苷酸标签是双链的，并且靶核苷酸序列和靶核苷酸序列互补序列杂交以形成双链杂交复合物。在一个方面中，含有靶核苷酸序列的样品进一步包括一种或多种寡核苷酸代谢物。本文中描述靶核苷酸序列(例如治疗性寡核苷酸，如ASO)的代谢物。在一个方面中，所述方法包括去除寡核苷酸代谢物。在一个方面中，将单链特异性核酸酶添加到样品中，同时使靶核苷酸序列与靶核苷酸序列互补序列杂交。在一个方面中，单链特异性核酸酶特异性去除单链寡核苷酸代谢物，同时大体上对杂交的靶核苷酸序列-靶核苷酸序列互补序列不具有反应性。在一个方面中，单链特异性核酸酶另外去除过量未杂交的靶核苷酸序列互补序列探针。本文中提供合适的核酸酶，包括单链特异性核酸酶的实例。
在一个方面中，在去除寡核苷酸代谢物和/或未杂交的靶核苷酸序列互补序列探针之后，杂交的靶核苷酸序列-靶核苷酸序列互补序列探针通过靶核苷酸序列互补序列探针上的寡核苷酸标签与表面上的捕获寡核苷酸的结合固定到支撑表面上。在一个方面中，在固定杂交的靶核苷酸序列-靶核苷酸序列互补序列探针之前去除寡核苷酸代谢物和/或未杂交的靶核苷酸序列互补序列探针，以提供与同时去除/固定或固定后接去除形式相比改进的灵敏度。在一个方面中，将检测试剂添加到表面，并且检测试剂结合到靶核苷酸序列互补序列探针上的标记。在一个方面中，检测试剂为电化学发光试剂。在一个方面中，检测试剂包含MSD SULFO-TAG。在一个方面中，如本文所描述测量电化学发光以检测、鉴别和/或定量靶核苷酸序列。在一个方面中，测量样品中靶核苷酸序列的量以确定靶核苷酸序列的药代动力学参数。在一个方面中，靶核苷酸序列为治疗性寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸为反义寡核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸代谢物为治疗性寡核苷酸代谢物。在一个方面中，靶核苷酸序列包括RNA。在一个方面中，靶核苷酸序列包括miRNA、治疗性RNA、mRNA、RNA病毒或其组合。
8.信号放大
在一个方面中，放大来自标记的反应产物的信号，例如以改进对少量结合事件的检测，例如个别检测复合物的检测。在一个方面中，通过生成包括多个标记或检测标记位点的扩增子来放大来自标记的反应产物的可检测信号，从而放大反应产物的可检测信号。在一个方面中，通过将含有多个标记或检测标记位点的延伸探针连接到反应产物来放大来自标记的反应产物的可检测信号，从而放大反应产物的可检测信号。在一个方面中，将反应产物固定在支撑表面上以形成检测复合物。在一个方面中，通过将含有多个标记或检测标记位点的延伸探针连接到检测复合物来放大来自标记的检测复合物的可检测信号，从而放大可检测信号。在一个方面中，锚定试剂固定在支撑表面上以稳定检测复合物。在一个方面中，通过将含有多个标记或检测标记位点的延伸探针连接到反应产物来放大来自标记的反应产物的可检测信号，并且锚定试剂固定在支撑表面上以稳定检测复合物，例如，如2014年3月12日提交的标题为“改进的分析方法(IMPROVED ASSAY METHODS)”的国际申请号WO2014/165061以及2020年2月28日提交的标题为“用于进行多重分析的改进方法(IMPROVEDMETHODS FOR CONDUCTING MULTIPLEXED ASSAYS)”的国际申请号PCT/US2020/020288中所描述，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
在一个方面中，检测复合物通过将如本文所描述生成的反应产物固定到支撑表面上而形成。在一个方面中，反应产物通过固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸与连接到反应产物的寡核苷酸标签的互补核苷酸序列之间的杂交而固定在支撑表面上。在一个方面中，检测复合物通过锚定试剂锚定到支撑表面。在一个方面中，锚定试剂包括锚定寡核苷酸。在一个方面中，锚定寡核苷酸包括单链寡核苷酸序列。在一个方面中，锚定寡核苷酸包括与连接到检测复合物的锚定序列互补序列的寡核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在一个方面中，来自标记检测复合物的信号被放大。在一个方面中，来自标记的检测复合物的信号通过生成一个或多个含有多个标记或检测标记位点的扩增子而被放大。在一个方面中，来自标记的检测复合物的信号通过将含有多个标记或检测标记位点的延伸核苷酸序列连接到检测复合物而被放大。在一个方面中，包括多个标记或检测标记位点的延伸核苷酸序列连接到检测复合物，并且检测复合物通过锚定试剂锚定到支撑表面。
在一个方面中，通过形成如本文所描述的反应产物，将反应产物固定到捕获分子以形成检测复合物来检测样品中的分析物。在一个方面中，捕获分子包括捕获寡核苷酸。在一个方面中，反应产物包括具有与捕获寡核苷酸的核酸序列互补的核酸序列的寡核苷酸标签。在一个方面中，反应产物包括检测序列。在一个方面中，延伸检测序列以形成包括一个或多个，或多个可检测标记或检测标记位点的延伸序列或扩增子。
在一个方面中，检测序列用作扩增技术的引物，所述扩增技术包括但不限于PCR(聚合酶链反应)、LCR(连接酶链反应)、SDA(链置换扩增)、3SR(自持合成反应)或等温扩增方法，如解旋酶依赖性扩增或滚环扩增(RCA)。在一个方面中，检测序列与扩增模板接触，并且检测序列用作引物以扩增所述扩增模板，例如通过聚合酶链反应(PCR)。在一个方面中，检测序列与扩增模板接触，并且检测序列充当扩增所述扩增模板的引物，例如通过滚环扩增(RCA)。
在一个方面中，扩增模板为线性扩增模板。在一个方面中，扩增模板为环状扩增模板。在一个方面中，延伸检测序列包括使检测序列与环状扩增模板接触并且通过滚环扩增(RCA)延伸检测序列。在一个方面中，延伸检测序列包括使检测序列与线性扩增模板接触，形成环状扩增模板(例如，通过连接线性模板的5'和3'端以形成环)，并且通过RCA延伸环状模板。在一个方面中，扩增子包括多个检测标记位点。在一个方面中，延伸序列包括多个检测标记位点。在一个方面中，延伸序列在延伸之后保持定位于表面上。
RCA的技术是所属领域中已知的(参见例如Baner等人,《核酸研究(Nucleic AcidsResearch)》,26:5073 5078,1998；Lizardi等人,《自然·遗传学(Nature Genetics)》19:226,1998；Schweitzer等人《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》97:10113119,2000；Faruqi等人,《BMC基因组学(BMC Genomics)》2:4,2000；Nallur等人,《核酸研究》29:e118,2001；Dean等人《基因组研究》11:1095 1099,2001；Schweitzer等人,《自然·生物技术(Nature Biotech.)》20:359 365,2002；美国专利号6,054,274、6,291,187、6,323,009、6,344,329和6,368,801)，并且包括变化形式，如线性RCA(LRCA)和指数RCA(ERCA)。RCA生成数以千计的环状模板的拷贝，其中拷贝链连接到原始靶DNA(在此情况下，检测序列)，允许快速信号放大。
在一个方面中，扩增模板为线性模板，其5'和3'端能够连接以生成环状模板。在一个方面中，检测序列包括与扩增模板的核酸序列互补的核酸序列。在一个方面中，检测寡核苷酸充当扩增反应的引物。在一个方面中，检测寡核苷酸充当RCA的引物。在一个方面中，RCA延伸检测寡核苷酸以形成延伸序列或扩增子。
在一个方面中，扩增模板是具有5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列的线性扩增模板。在一个方面中，扩增模板的5'和3'末端核苷酸序列能够与检测序列杂交。在一个方面中，扩增模板包括能够与锚定试剂的锚定序列的互补序列杂交的内部核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板的5'和3'末端核苷酸序列不与内部序列重叠。在一个方面中，扩增模板包括能够与锚定试剂的锚定序列的互补序列杂交的第一内部核苷酸序列和能够与检测试剂的核酸序列的互补序列杂交的第二内部核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板的5'和3'末端核苷酸序列不与第一或第二内部序列重叠。在一个方面中，扩增模板具有5'末端磷酸基。
在一个方面中，扩增模板是长度为约40到约100个核苷酸的非天然存在的寡核苷酸。在一个方面中，扩增模板是长度为约50到约78个核苷酸的非天然存在的寡核苷酸。在一个方面中，扩增模板是非天然存在的寡核苷酸，长度为约53到约76个核苷酸。在一个方面中，扩增模板是非天然存在的寡核苷酸，长度为约50到约70个核苷酸。在一个方面中，扩增模板是非天然存在的寡核苷酸，长度为约53到约61个核苷酸。在一个方面中，扩增模板是非天然存在的寡核苷酸，长度为约54到约61个核苷酸。在一个方面中，扩增模板是非天然存在的寡核苷酸，长度为约61个核苷酸。在一个方面中，扩增模板是长度为约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54或约55并且至多约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75或约76个核苷酸的非天然存在的寡核苷酸。在一个方面中，扩增模板是非天然存在的寡核苷酸，长度为约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75或约76个核苷酸。
在一个方面中，扩增模板的5'和3'末端序列的长度的总和为约14到约24个核苷酸的长度。在一个方面中，扩增模板的3'和5'末端序列的长度的总和为约14到约19个核苷酸的长度。在一个方面中，扩增模板的3'和5'末端序列的长度的总和为约14、约15、约16或约17并且至多约18、约19、约20、约21、约22、约23或约24个核苷酸的长度。在一个方面中，扩增模板的3'和5'末端序列的长度的总和为约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23或约24个核苷酸的长度。在一个方面中，扩增模板的3'和5'末端序列的长度的总和为约14或约15个核苷酸的长度。
在一个方面中，扩增模板具有5'-GTTCTGTC-3'(SEQ ID NO:1666)的5'末端序列和5'-GTGTCTA-3'(SEQ ID NO:1667)的3'末端序列。在一个方面中，扩增模板具有包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:1668)的核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板具有由5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:1668)组成的核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板具有包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:1669)的核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板具有由5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:1669)组成的核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板具有包括5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTA GTACAGCAAGAGTGTCTA-3'(SEQ ID NO:1670)的核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板具有由5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACA GCAAGAGTGTCTA-3'(SEQID NO:1670)组成的核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板具有包括5'-GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACA GCAAGAGCGTCGA-3'(SEQ ID NO:1671)的核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板具有由5'-GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAA GAGCGTCGA-3'(SEQ ID NO:1671)组成的核苷酸序列。
在一个方面中，支撑表面包括捕获分子和锚定寡核苷酸，并且在一个或多个步骤中，反应产物结合到捕获分子和检测试剂。在一个方面中，反应产物同时或大体上同时结合到捕获分子和检测试剂。在一个方面中，反应产物依序(以任一顺序)结合到捕获分子和检测试剂。在一个方面中，检测复合物形成于包括捕获分子、反应产物和检测试剂的支撑表面上。在一个方面中，检测试剂包括寡核苷酸序列，在本文中称为检测寡核苷酸。在一个方面中，检测寡核苷酸被延伸以形成延伸序列(或扩增子)，其包括与锚定试剂的锚定序列互补并且可以与之杂交的锚定序列互补序列。在一个方面中，锚定序列与锚定序列互补序列杂交，并且检测到与支撑表面结合的延伸序列。
在一个方面中，延伸序列(或扩增子)包括一个或多个，或多个检测标记位点，其具有与标记的检测试剂的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个方面中，标记的检测试剂包括与检测标记位点的核苷酸序列互补的核苷酸序列，以及可检测标记。在一个方面中，可检测标记包括电化学发光标记。在一个方面中，一种或多种，或多种标记的检测试剂与扩增子杂交并且用于检测所述检测复合物。在一个方面中，延伸过程将标记的核苷酸碱基并入扩增子中，所述标记的核苷酸碱基用于直接检测表面上的扩增子，而无需添加一种或多种与扩增子互补的标记的探针。
在一个方面中，检测序列具有长度为约10到约30个核苷酸的核酸序列。在一个方面中，检测序列具有长度为约12到约28个核苷酸的核苷酸序列。在一个方面中，检测序列具有长度为约13到约26个核苷酸的核苷酸序列。在一个方面中，检测序列具有长度为约14到约24个核苷酸的核苷酸序列。在一个方面中，检测序列具有长度为约11到约22个核苷酸的核苷酸序列。在一个方面中，检测序列具有长度为约12到约21个核苷酸的核苷酸序列。在一个方面中，检测序列具有长度为约13到约20个核苷酸的核苷酸序列。在一个方面中，检测序列具有长度为约13到约18个核苷酸的核苷酸序列。在一个方面中，检测序列具有长度为约14到约19个核苷酸的核苷酸序列。在一个方面中，检测序列具有长度为约10、约11、约12、约13、约14或约15并且至多约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个核苷酸的核苷酸序列。在一个方面中，检测序列具有长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个核苷酸的核苷酸序列。在一个方面中，检测序列具有约14个核苷酸的核苷酸序列。在一个方面中，检测序列具有约15个核苷酸的核苷酸序列。
在一个方面中，检测探针的检测寡核苷酸具有与扩增模板的5'末端序列互补的第一序列和与扩增模板的3'末端序列互补的相邻第二序列。在一个方面中，检测试剂的核酸序列具有与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:1672)具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一个方面中，检测试剂的核酸序列具有包括以下的至少约14、约15、约16、约17、约18或约19个连续核苷酸的序列：5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:1672)。在一个方面中，检测试剂的核酸序列具有与以下的至少约14、约15、约16、约17、约18或约19个连续核苷酸具有至少90％序列同一性的序列：5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:1672)。在一个方面中，检测试剂的核酸序列具有与以下的14或15个连续核苷酸具有至少90％序列同一性的序列：5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:1672)。在一个方面中，检测试剂的核酸序列包括序列5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:1672)。在一个方面中，检测试剂的核酸序列由序列5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:1672)组成。在一个方面中，检测试剂的核酸序列包括序列5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:1668)。在一个方面中，检测试剂的核酸序列由序列5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:1668)组成。
在一个方面中，使用锚定试剂和信号放大过程两者，例如，如图22和23中所示。举例来说，在靶互补序列与靶寡核苷酸杂交的条件下，使包括包含靶核苷酸序列(例如反义寡核苷酸(ASO))的靶分析物的样品与包括以下的检测探针接触：靶互补序列、寡核苷酸标签和检测寡核苷酸，以形成反应产物。在一个方面中，靶互补序列包括RNA，并且寡核苷酸标签和检测寡核苷酸包括DNA序列。在一个方面中，靶互补序列为RNA，并且寡核苷酸标签和检测寡核苷酸为DNA。
在一个方面中，样品还与包括锚定序列和寡核苷酸标签的锚定试剂接触。在一个方面中，锚定序列和寡核苷酸标签都包括DNA序列。
在一个方面中，在反应产物、未结合探针和锚定试剂的寡核苷酸标签与固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸杂交的条件下，使支撑表面与包括反应产物、未结合探针和未结合锚定试剂的混合物接触。如本文所用，“未结合探针”是指未与靶寡核苷酸杂交的检测探针。在一个方面中，使支撑表面与RNA酶接触以降解固定化“未结合探针”中的单链RNA。
在一个方面中，将检测混合物添加到支撑表面。在一个方面中，检测混合物包括用于滚环扩增的线性模板和连接酶。在一个方面中，检测混合物还包括一种或多种额外组分，包括例如连接缓冲液、腺苷三磷酸(ATP)、牛血清白蛋白(BSA)、吐温20、T4 DNA连接酶和其组合。在一个方面中，检测混合物包括一种或多种用于滚环扩增的组分，包括例如BSA、缓冲液、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、吐温20、Phi29 DNA聚合酶或其组合。在一个方面中，检测混合物包括乙酰BSA。
在一个方面中，将线性DNA模板环化，并且通过滚环扩增扩增环状DNA模板以延伸检测寡核苷酸并且生成包括一个或多个检测标记位点和锚定寡核苷酸序列互补序列的扩增子。在一个方面中，锚定寡核苷酸序列互补序列与固定在支撑表面上的锚定寡核苷酸序列杂交。在一个方面中，一种或多种，或多种标记的检测试剂与扩增子的检测标记位点杂交以放大信号。
在一个方面中，通过检测结合到延伸序列的可检测标记来检测样品中的靶分析物。在一个方面中，延伸序列从支撑表面释放到洗脱液中，并且检测洗脱液中的延伸序列。
在一个方面中，提供一种用于检测样品中的靶寡核苷酸的方法，其中所述靶寡核苷酸包括靶核酸序列。在一个方面中，所述方法包括：
(a)使所述样品与包括寡核苷酸标签、靶互补序列和检测寡核苷酸的检测探针在如下条件下接触：所述靶互补序列与所述靶寡核苷酸的所述靶核酸序列杂交，以形成反应产物；
(b)使上面固定有捕获寡核苷酸的支撑表面与含有所述反应产物的混合物在如下条件下接触：所述反应产物的所述寡核苷酸标签与所述捕获寡核苷酸杂交，以形成固定化检测复合物；
(c)使所述固定化检测复合物与包括扩增模板的检测混合物接触；
(d)扩增所述扩增模板以形成包括一个或多个包括检测标记位点的核酸序列的扩增子；
(e)使所述扩增子与包括标记和与所述检测标记位点互补的核酸序列的检测试剂在如下条件下接触：所述检测试剂的所述核酸序列与所述扩增子的所述检测标记位点杂交；以及
(f)检测结合到所述检测标记位点的所述标记。
在一个方面中，在(a)中使样品与锚定试剂和检测探针接触，其中锚定试剂包括寡核苷酸标签和锚定序列。
在一个方面中，检测探针包括单链DNA寡核苷酸标签、单链RNA靶互补序列和单链DNA检测寡核苷酸。在一个方面中，锚定试剂包括单链DNA寡核苷酸标签和单链DNA锚定序列。在一个方面中，所述方法包括在(c)之前使固定化检测复合物与RNA酶接触以消化未结合探针的单链RNA。
在一个方面中，提供一种用于检测样品中的靶寡核苷酸的方法，其中所述靶寡核苷酸包括靶核酸序列。在一个方面中，所述方法包括：
(a)使所述样品与以下接触：
(i)检测探针，其包括包含单链DNA序列的寡核苷酸标签、包含单链RNA序列的靶互补序列和包含单链DNA序列的检测寡核苷酸；和
(ii)锚定试剂，其包括包含单链DNA序列的寡核苷酸标签和包含单链DNA序列的锚定序列，
其中所述检测探针的所述靶互补序列与所述靶寡核苷酸的所述靶核酸序列杂交以形成反应产物，其包括所述寡核苷酸标签、包括所述靶寡核苷酸的所述靶核酸序列和所述靶互补序列的双链RNA双链体；
(b)使包括上面在离散结合域中固定有多种捕获寡核苷酸的一个或多个电极的支撑表面与包括所述反应产物的混合物在如下条件下接触：所述反应产物的所述寡核苷酸标签与所述捕获寡核苷酸杂交，以在所述支撑表面上形成检测复合物；
(c)使所述支撑表面与RNA酶接触以消化未结合检测探针的单链RNA；
(d)使固定化检测复合物与包括滚环扩增(RCA)模板和聚合酶的检测混合物接触；
(e)通过RCA扩增所述模板以形成连接到所述检测复合物的延伸序列，其中所述延伸序列包括多个包括检测标记位点的核酸序列；
(f)使所述延伸序列与包括电化学发光(ECL)标记和与所述延伸序列的所述检测标记位点互补的核酸序列的检测试剂在如下条件下接触：所述检测试剂的所述核酸序列与所述检测标记位点杂交；以及
(g)通过使所述ECL标记与包括ECL共反应物的ECL读取缓冲液接触并且向所述电极施加电势来检测结合到所述延伸序列的所述ECL标记。
在一个方面中，提供一种用于检测样品中的靶核苷酸序列的方法。在一个方面中，所述方法包括：
(a)使所述样品与包括以下的混合物接触：
(i)靶向探针，其包括单链寡核苷酸标签和与所述样品中的所述靶核苷酸序列的第一区互补的第一核酸序列；和
(ii)检测探针，其包括检测寡核苷酸和与所述靶核苷酸序列的第二区互补的第二核酸序列，
其中所述靶向探针的所述第一核酸序列和所述检测探针的所述第二核酸序列与所述靶寡核苷酸的相邻核酸序列互补；
(b)在核酸连接酶存在下，在如下条件下培育包括所述靶寡核苷酸、靶向探针和检测探针的所述混合物：所述靶向探针和所述检测探针结合到其相应的所述靶寡核苷酸的核苷酸序列，并且所述核酸连接酶连接所述靶向探针和所述检测探针，以形成包括所述寡核苷酸标签和所述检测寡核苷酸的反应产物；
(b)使上面固定有捕获寡核苷酸的支撑表面与包括所述反应产物的所述混合物在如下条件下接触：所述反应产物的所述寡核苷酸标签与所述捕获寡核苷酸杂交，以形成固定化检测复合物；
(c)使所述固定化检测复合物与包括扩增模板的检测混合物接触；
(d)扩增所述扩增模板以形成包括一个或多个包括检测标记位点的核酸序列的扩增子；
(e)使所述扩增子与包括标记和与所述检测标记位点互补的核酸序列的检测试剂在如下条件下接触：所述检测试剂的所述核酸序列与所述检测标记位点杂交；以及
(f)检测结合到所述支撑表面的所述标记。在一个方面中，检测探针具有与和靶向探针的3'端相邻的靶核苷酸序列杂交的5'端。
在一个方面中，所述方法包括使(b)中形成的反应产物暴露于变性条件以使反应产物与靶寡核苷酸解离。
L.样品
本文所描述的方法或试剂盒适用于检测含有或疑似含有一种或多种靶分析物的样品中的一种或多种靶分析物。在一个方面中，靶分析物包括靶核苷酸序列。在另一方面中，靶分析物包括靶蛋白。在一个方面中，样品包括或疑似包括一种或多种所关注原核或真核DNA或RNA序列。在一个方面中，样品是获自以下的生物样品：生物体，如人或其它哺乳动物，包括但不限于非人灵长类动物、狗、猫、牛、绵羊、家禽、马；或其它生物体，如植物、细菌、真菌、原生生物或病毒。在一个方面中，生物样品包括固体材料，如组织、细胞、细胞提取物或活检体；或生物流体，如尿液、血液、唾液、羊膜液、来自感染或炎症区域的渗出物、含有口腔细胞的漱口水、脑脊液或滑液。在一个方面中，样品从一个个体中分离。在另一方面中，样品来源于一组个体。在一个方面中，样品包括一个或多个，或多个个别样品或合并的样品。
在一个方面中，样品包括一个或多个靶DNA序列，包括但不限于单链或双链DNA，包括但不限于基因组DNA、线粒体DNA、cDNA、全基因组扩增DNA或其组合。在另一方面中，样品包括一个或多个靶RNA序列，包括但不限于单链或双链RNA，包括但不限于核糖体RNA、mRNA、miRNA、siRNA、RNAi或其组合。在另一方面中，样品包括或疑似包括一个或多个靶核苷酸序列，其为扩增子，如PCR产物、质粒、粘粒、DNA文库、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、合成寡核苷酸、限制片段、DNA/RNA杂交体、PNA(肽核酸)或DNA/RNA嵌合核酸。对于双链核酸，靶核苷酸序列可以存在于任一链中。在一个方面中，样品不包括乙二胺四乙酸(EDTA)。
在一个方面中，样品包括一个或多个靶核苷酸序列，例如治疗性寡核苷酸，其中样品还可以含有寡核苷酸代谢物。如本文所用，“治疗性寡核苷酸”是指能够与生物分子相互作用以提供治疗效果的寡核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸为反义寡核苷酸(ASO)。ASO是长度典型地为约5、10、15、20或25个核苷酸到约30、35、40、45或50个核苷酸的单链寡核苷酸。ASO能够影响RNA加工和/或调节蛋白质表达。ASO是结合到单链RNA以使RNA失活的单链寡核苷酸。在一个方面中，ASO结合到基因的信使RNA(mRNA)，从而使所述基因失活。在一个方面中，所述基因为疾病基因。因此，ASO可以使疾病基因的mRNA失活，以防止或改善特定致病蛋白质的产生。在一个方面中，ASO包含DNA、RNA或其组合。
归因于如核酸酶的存在、温度、pH、盐浓度等各种因素，样品中的寡核苷酸(例如治疗性寡核苷酸，如ASO)可能随时间推移降解，例如缩短。在某些方面中，样品中治疗性寡核苷酸的降解指示对治疗性寡核苷酸的药效学反应。降解或缩短的治疗性寡核苷酸，在本文中也称为治疗性寡核苷酸代谢物，可能失去治疗有效性。在一个方面中，样品包括治疗性寡核苷酸和一种或多种治疗性寡核苷酸代谢物。在一个方面中，治疗性寡核苷酸代谢物比治疗性寡核苷酸短1个或更多个核苷酸、2个或更多个核苷酸、3个或更多个核苷酸、4个或更多个核苷酸、5个或更多个核苷酸、6个或更多个核苷酸、7个或更多个核苷酸、8个或更多个核苷酸、9个或更多个核苷酸、10个或更多个核苷酸、15个或更多个核苷酸或20个或更多个核苷酸。在一个方面中，治疗性寡核苷酸代谢物比治疗性寡核苷酸短约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。
在一个方面中，本文所提供的方法用于测量样品中治疗性寡核苷酸相对于治疗性寡核苷酸代谢物的量。在一个方面中，治疗性寡核苷酸的药代动力学参数通过测量治疗性寡核苷酸在生物环境(例如患者)中的降解速率和/或量来确定。因此，在一个方面中，本文所提供的方法用于确定治疗性寡核苷酸的药代动力学参数。在一个方面中，测量的药代动力学参数为清除率、体积分布、血浆浓度、半衰期、峰时间、峰浓度、可用率或其组合。本文中进一步描述药代动力学参数的测量和解释。
在一个方面中，样品包括一种或多种抗药物抗体(ADA)。在一个方面中，ADA结合治疗性多肽，包括但不限于治疗性蛋白质或治疗性抗体。在一个方面中，ADA结合治疗性寡核苷酸，包括但不限于反义寡核苷酸(ASO)、短干扰RNA、微RNA和CRISPR/Cas的合成引导链。在一个方面中，ADA能够结合到生物药物产品。在一个方面中，ADA能够抑制治疗产品的功能活性。
在一个方面中，样品包括一个或多个未扩增的靶核苷酸序列。在另一方面中，样品包括通过扩增或克隆来自生物样品的序列获得的一个或多个靶核苷酸序列。扩增可以通过包括但不限于以下的方法来实现：聚合酶链反应(PCR)、全基因组扩增(WGA)、逆转录后接聚合酶链反应(RT-PCR)、链置换扩增(SDA)或滚环扩增(RCA)。
在一个方面中，样品包括或疑似包括一种或多种靶蛋白。在一个方面中，靶蛋白包括DNA结合蛋白，包括例如具有可以结合到单链或双链DNA的DNA结合结构域的蛋白质。DNA结合蛋白的实例包括但不限于转录因子、聚合酶、核酸酶和组蛋白。在一个方面中，DNA结合蛋白结合到特定DNA序列，例如转录因子。
在一个方面中，从生物样品中纯化一种或多种靶分析物。用于从样品中纯化靶分析物的方法是已知的。用于从生物样品中纯化核苷酸序列的方法是已知的并且包括例如高效液相色谱(HPLC)，例如反相高效液相色谱(RP-HPLC)或阴离子交换高压液相色谱(AEXHPLC)或聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。用于从生物样品中纯化蛋白质的方法是已知的并且包括例如色谱，如尺寸排阻色谱、高效液相色谱(HPLC)、疏水相互作用色谱(HIC)、离子交换色谱、亲和色谱以及电泳。
在一个方面中，样品包括至少约1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg或10μg并且至多约20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg或50μg，或约1μg与约50μg之间，或约5μg与约20μg之间的一种或多种靶分析物，例如从细胞系中纯化的基因组DNA或全基因组扩增DNA。在一个方面中，样品包括至少约0.1μL、0.5μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL并且至多约6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、15μL、20μL或25μL或约1μL到约25μL之间，或约0.1μL到约5μL之间的含有一种或多种靶分析物的样品，例如含有一种或多种扩增产物的样品，扩增产物例如由细胞系DNA生成的PCR扩增子。在一个方面中，样品具有至少约1ng/μL、5ng/μL或10ng/μL并且至多约25ng/μL、50ng/μL或100ng/μL的分析物浓度。
在一个方面中，样品包括靶分析物的至少一个拷贝。在一个方面中，样品包括拷贝数小于107、106、105、104、103、102或101的靶核酸。在一个方面中，这些拷贝存在于约0.001mL与约1mL之间的样品中，或小于约1mL、0.1mL、0.01mL或0.001mL的样品中。
M.样品扩增
虽然本文所描述的方法或试剂盒可以与一个或多个靶核苷酸序列未扩增的样品结合使用，但可能需要包括扩增步骤以增加样品中靶核苷酸的数量。举例来说，当靶核苷酸序列包括一种或多种罕见突变，例如一种或多种与癌症相关的罕见或低等位基因分数突变时，可能需要扩增靶核苷酸序列。
在一个方面中，使固定化检测复合物扩增试剂接触，其中检测复合物和扩增试剂各自包含结合对的成员。在一些方面中，结合对包含受体-配体对、抗原-抗体对、半抗原-抗体对、表位-抗体对、模拟表位-抗体对、适体-靶分子对或嵌入剂-靶分子对。在一些方面中，结合对为生物素/链霉亲和素或生物素/亲和素。
在一个方面中，扩增试剂包含检测序列。在一个方面中，检测序列包含与扩增模板的核酸序列互补的核酸序列。在一个方面中，检测序列包含与包括锚定序列和寡核苷酸标签的锚定试剂互补的核酸序列。
在一个方面中，延伸检测序列以形成包括一个或多个可检测标记或检测标记位点的延伸序列或扩增子。在一个方面中，标记包括适用于连接可检测标记的结合伴侣。在一个方面中，标记包括生物素并且可以结合到包括链霉亲和素的可检测标记。
在一个方面中，靶核苷酸序列通过聚合酶链反应(PCR)扩增。用于PCR扩增的方法是已知的。参见例如Saiki等人《利用热稳定DNA聚合酶进行DNA的引物引导酶促扩增(Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNAPolymerase)》,《科学》,239:487-491。简单来说，在PCR扩增中，靶核苷酸序列与侧接待扩增的特定核苷酸序列的两个寡核苷酸引物接触。热变性、引物与其互补序列退火以及用DNA聚合酶延伸退火引物的重复循环引起大约2n的靶片段的指数累积，其中n为循环数。
在另一方面中，靶核苷酸序列使用滚环扩增(RCA)，一种等温核酸(例如DNA或RNA)扩增技术扩增，其中聚合酶将单核苷酸连续添加到与环状模板退火的引物，产生含有多个(例如数十到数百个)与环状模板互补的串联重复序列的长单链DNA或RNA序列。
在另一方面中，全基因组扩增(WGA)用于扩增基因组DNA样品。用于全基因组扩增的方法是已知的并且包括例如多重置换扩增(MDA)、简并寡核苷酸PCR(DOP-PCR)和引物延伸预扩增(PEP)。DOP-PCR和PEP基于标准PCR技术，而MDA使用等温反应设置。
在一些方面中，扩增包括使用一种或多种寡核苷酸引物，其由聚合酶用于引发DNA或RNA合成。引物可以是去氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、含硫代磷酸酯键的DNA或其组合，并且包括核苷酸类似物或修饰的核苷酸。一般来说，引物是长度为约10与约100之间，或约15与约30之间，或至少约10、15或20并且至多约25、30、35、40、45或50个核苷酸的单链寡核苷酸。在一些方面中，寡核苷酸引物为特异性引物，其与靶核苷酸序列的某些区互补，使得模板被扩增的区由引物限定。用于制备寡核苷酸引物的方法是已知的。在一个方面中，可以使用市售扩增引物。在一个方面中，引物是至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯。
在一个方面中，样品包括PCR产物。在一个方面中，PCR产物的长度在约25bp与约500bp之间，或约50bp与约300bp之间或约75bp与约200bp之间。在一个方面中，PCR引物具有与多重PCR分析中使用的其它引物类似(即，在约5℃或1℃内)的解链温度。
N.检测
在一个方面中，在阵列中检测、鉴别或定量靶分析物。在一个方面中，可以在阵列中检测、鉴别或定量如本文所描述的反应产物，包括例如PCR反应产物、OLA反应产物、PEA反应产物、夹心复合物或NPA反应产物。在一个方面中，阵列为多重阵列，并且通过检测连接到阵列上的固定化靶分子的标记来检测、鉴别或定量靶分析物。在一个方面中，使支撑表面与含有加标签的反应产物的杂交混合物接触，并且通过单链寡核苷酸标签与其相应互补捕获寡核苷酸的杂交将反应产物固定到支撑表面上，形成检测复合物。在一个方面中，在固体支撑物与反应产物接触之前扩增反应产物。在一个方面中，反应产物扩增至少约10×、20×、30×、40×或50×。
在一个方面中，杂交混合物包括杂交缓冲液。在一个方面中，可以基于连接到反应产物的标记检测、鉴别或定量反应产物的存在或量。在一个方面中，在反应产物固定在支撑表面上之后，用洗涤缓冲液洗涤支撑表面。
在一个方面中，基于检测固定在支撑表面上的反应产物，检测、鉴别或定量一个或多个靶核苷酸序列的存在。在一个方面中，通过监测来自反应产物上的标记的发光检测固定化反应产物的存在，所述发光包括但不限于荧光、时间分辨荧光、荧光共振能量转移(FRET)、荧光偏振(FP)、发光、化学发光、生物发光、磷光、光散射或电极诱导的发光。在另一方面中，标记包括酶或具有产生可测量信号(如光散射、吸光度、荧光等)的化学活性的其它化学反应性物种。酶标记的实例包括但不限于辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。在一个方面中，标记为可检测半抗原，包括但不限于生物素、荧光素或地高辛。在一个方面中，反应产物包括生物素标记。
在一个方面中，反应产物固定在位于支撑表面上的一个或多个结合域上。在一个方面中，一个或多个结合域位于一个或多个电极上，并且检测、鉴别或定量包括将电压波形施加到一个或多个电极以刺激所捕获的反应产物上的标记产生电化学或发光信号。在一个方面中，检测、鉴别或定量包括测量电化学发光信号并且使信号与样品中靶核苷酸序列的存在或量相关联。在一个方面中，发射光的强度与样品中的靶量成比例，使得发射光可以提供样品中靶核苷酸的量的定量测定。
在一个方面中，在反应产物固定在支撑表面上之后，使支撑表面与检测混合物接触。在一个方面中，检测混合物包括电化学发光标记。电化学发光标记的实例包括：i)有机金属化合物，其中金属来自例如第VIII族的贵金属，包括含Ru和含Os有机金属化合物，如三联吡啶-钌(RuBpy)部分，以及ii)鲁米诺(luminol)和相关化合物。在一个方面中，检测混合物还包括一种或多种电化学发光共反应物和一种或多种额外组分，如pH缓冲剂、清洁剂、防腐剂、消泡剂、盐、金属离子或金属螯合剂。术语“电化学发光共反应物”是指与电化学发光标记一起参与的物种，并且包括但不限于用于RuBpy的叔胺(如三丙胺(TPA))、草酸根离子、抗坏血酸和过硫酸盐以及用于鲁米诺的过氧化氢。用于测量电化学发光的方法是已知的，并且用于进行测量的仪器可商购。举例来说，使用电化学发光对分析物进行多重测量用于Meso Scale Diagnostics,LLC,和/>Imager系列或产品(参见例如美国专利号7,842,246和6,977,722，其公开内容以全文引用的方式并入本文中)。
在一个方面中，生物素共价连接到反应产物并且检测混合物包括链霉亲和素缀合标记，其通过亲和素部分结合到固定化反应产物。在一个方面中，链霉亲和素缀合标记为电化学发光(ECL)标记。在一个方面中，电化学发光标记为正羟基琥珀酰亚胺酯，如Sulfo-TAGNHS-Ester(Meso Scale Diagnostics)。
在一个方面中，所述试剂盒或方法用于检测、鉴别或定量一个或多个靶核苷酸序列中的一种或多种单核苷酸多态性(SNP)。在一个方面中，通过确定样品中野生型与变异等位基因之间的比率来检测所关注SNP的存在。在一个方面中，通过确定样品中存在的野生型和变异等位基因的可检测标记的比率来确定所述比率。在一个方面中，确定野生型和变异等位基因的电化学发光标记的比率。下式可以用于确定样品中存在的野生型或变异等位基因的比率：
ECL比率WT＝(信号WT-)/(信号WT-Bkg+信号MUT-Bkg)
ECL比率MUT＝(信号MUT-Bkg)/(信号WT-Bkg+信号MUT-Bkg)
其中信号WT为野生型等位基因检测到的ECL信号，信号MUT为变异等位基因检测到的信号并且Bkg为背景信号。在一个方面中，背景信号对于对应于野生型或变异等位基因的结合域具有特异性，因为背景信号可以在结合域之间变化。在一个方面中，背景值是“无连接酶对照”样品的两个孔中重复点的平均值。
所述比率估计样品中存在的野生型和变异序列的百分比。在一个方面中，样品的可能性为：纯合野生型、杂合或纯合变异体。在一个方面中，纯合野生型或变异体的比率应大于约0.8，杂合的比率应在约0.3与约0.7之间，并且不存在变异体(或野生型)的比率应小于约0.2。归因于信号变异性，纯合等位基因的比率可能大于1.0。类似地，归因于背景减除，不存在等位基因可能产生小于零的比率。
在一个方面中，所述试剂盒或方法用于检测一种或多种罕见或低等位基因分数的癌症突变。在一个方面中，通过使用下式从ECL信号生成校准曲线来确定样品中存在的罕见或低等位基因分数突变的频率：
ECL比率MUT＝(信号MUT)/(信号WT+信号MUT)。
制备校准曲线时不需要背景减除，因为所有信号都与校准曲线进行比较，并且在拟合中考虑背景。校准曲线建立给定等位基因可检测的最低变异等位基因百分比，并且将样品数据拟合回到曲线允许确定每一样品中存在的变异体百分比。
在一个方面中，分析具有约1×105与10×105之间，或小于约10×105、9×105、8×105、7×105、6×105、5×105、4×105、3×105、2×105或1×105个分子/孔的检测限(LOD)。在一个方面中，基于OLA的分析的LOD为约1×105与5×105之间或约2×105个分子/孔。在一个方面中，基于PEA的分析的LOD为约4×105与约6×105之间或约5×105个分子/孔。
O.使用方法
本文描述用于鉴别、检测或定量样品中一种或多种靶分析物的方法和试剂盒。在一个方面中，靶分析物为核苷酸序列。在另一方面中，靶分析物为蛋白质。在一个方面中，靶分析物含有或疑似含有野生型核苷酸或肽序列。在一个方面中，靶核苷酸序列含有或疑似含有突变，如缺失、添加、取代、转换、颠换、重排或易位。在一个方面中，突变包括错义、无义、沉默或剪接位点突变。
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于检测、鉴别或定量样品中的一个或多个核苷酸序列。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于检测、鉴别或定量样品中的一种或多种单核苷酸多态性(SNP)、拷贝数变异(CNV)或其它序列变异体或突变。
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量含有核酸混合物的样品中的一个或多个靶核苷酸序列，例如来自多个基因组或物种、多个个体或生物样品，如来源于组织或细胞混合物的肿瘤样品。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于检测可能存在于样品中的一个或多个核苷酸序列。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于检测以至少约50％或至多约100％的频率存在的单核苷酸变异体。在一个方面中，所述变异体不存在。在另一方面中，所述方法或试剂盒用于检测存在于样品中存在的超过约1％的核苷酸序列中的一种或多种单核苷酸多态性。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于检测存在于样品中存在的小于约5％或10％的核苷酸序列中的单核苷酸多态性。在一个方面中，所述方法或试剂盒可以用于鉴别、检测或定量生物样品中的核酸突变，所述生物样品含有在靶区中具有突变的核苷酸序列以及野生型核酸序列的异质混合物，其中突变可以存在于约1％与约5％之间的靶核苷酸序列中。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于分析指示生物样品或组织活检体中癌组织或癌前组织的存在的靶核苷酸中的一个或多个突变，包括例如指示癌症，如前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌或宫颈癌的单核苷酸癌症相关突变。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于检测样品中小于约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％或0.05％的核苷酸序列中存在的突变。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于检测血液样品、细胞外液、细胞外囊泡或液体活检体中存在的一个或多个靶核苷酸序列。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于检测肿瘤学中所关注的一种或多种突变，包括但不限于在正常细胞背景下循环肿瘤细胞中的突变，或检测血液中肿瘤衍生的游离DNA。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量对于药物开发重要的一种或多种突变。
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于检测、鉴别或定量样品中的RNA。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于检测、鉴别或定量样品中的非编码RNA，包括例如微RNA(miRNA)、小核仁RNA(snoRNA)和球形核酸(SNA)。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于基因分型分析。基因分型方法是已知的并且一般包括探针杂交、探针连接和信号放大的步骤，例如使用聚合酶链反应(PCR)、将扩增产物固定到支撑表面以及检测靶分析物。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于人基因分型分析。在另一方面中，所述方法或试剂盒用于植物基因分型分析，例如用于农业基因组分析。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于例如在基因表达分析或转录组分析中表征转录活性(编码和非编码)。
在一个方面中，所述方法或试剂盒可以用于微RNA(miRNA)表达的多重分析。miRNA是调控基本细胞过程的小的非编码RNA(长度为大约20-22个核苷酸)，所述细胞过程包括例如细胞分化和增殖、发育时间、造血、免疫反应、细胞凋亡和神经系统模式化。人类基因组包括大约2000个编码微RNA(miRNA)的基因。(Kawahara(2014)《由微RNA和微RNA相关基因的种系和体细胞异常引起的人类疾病(Human diseases caused by germline and somaticabnormalities in microRNA and mciro-RNA related genes)》.《先天性异常(Congenital Anomalies)》.54:12-21)。miRNA水平、表达时间、位置或靶识别的改变可能具有破坏性后果，并且miRNA的表达谱可以提供关于各种生物过程的有价值的信息。对初级、前体和成熟miRNA水平的分析以及miRNA靶的鉴别和表征对于确定miRNA生物发生的步骤或特定突变体或疾病中的功能可能是重要的。(参见Van Wynsberghe等人(2011)《微RNA表达和功能的分析(Analysis of microRNA Expression and Function)》.《细胞生物学方法(Methods Cell Biol.)》106:219-252)。miRNA(isomiR)的序列长度变异性可能引起靶向能力或特异性改变。(Cammaerts等人(2015)《微RNA基因中的遗传变异体：对微RNA表达、功能和疾病的影响(Genetic variants in microRNA genes:impact on microRNAexpression,function,and disease)》.《遗传学前沿(Front.Genet.)》6:186)。
各种人类疾病(包括发育异常和癌症)由miRNA基因或编码miRNA加工机构的miRNA相关基因或靶mRNA的3'UTR中的miRNA结合位点的种系或体细胞突变引起。与人类疾病相关的miRNA和miRNA相关基因包括但不限于DGCR8(迪乔治综合症(DiGeorge syndrome))；DICER1(胸膜肺胚细胞瘤、囊性肾瘤、卵巢塞特利-雷迪格(Sertoli-Leydig)型肿瘤、成松果体细胞瘤、非上皮卵巢瘤)；TARBP2(结肠肿瘤、胃肿瘤)；XPO5(结肠肿瘤、胃肿瘤、子宫内膜肿瘤)；mR-14和miR-146(5q综合征)；mi-R-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a(2型费恩高德综合征(Feingold syndrome2))；miR15a和miR-16-1(慢性淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、前列腺肿瘤)；miR-16-1(慢性淋巴细胞性白血病)；miR-96(严重耳聋)；miR-84(EDICT综合征)；SLITRK1(图雷特综合症(Tourette'ssyndrome))；IRGM(克罗恩病(Crohn's disease))以及HDAC6(X连锁显性软骨发育不良)。(Kawahara,Y.(2014)《由微RNA和微RNA相关基因的种系和体细胞异常引起的人类疾病》.《先天性异常》.54:12-21)。
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量样品中的一个或多个靶miRNA序列。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或数量具有单碱基核苷酸差异的微RNA。在一个方面中，所述方法包括使用一种或多种标记的探针，其包括与固定化捕获寡核苷酸序列互补的标签序列和与miRNA序列互补的序列。在一个方面中，标记包括生物素标记。在另一方面中，标记包括化学发光标记。在一个方面中，所述方法包括使具有一种或多种固定化捕获寡核苷酸的支撑表面与一种或多种包括与固定化捕获寡核苷酸序列互补的标签序列和与靶miRNA序列互补的序列的探针在适合于标签序列与捕获寡核苷酸序列结合的条件下接触。随后洗涤支撑表面以去除过量探针，并且随后使其与包括或疑似包括一个或多个靶miRNA序列的样品在miRNA序列能够与固定化探针序列杂交的条件下接触。
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量与病症或疾病相关的一个或多个核苷酸序列或变异体，所述病症或疾病包括但不限于癌症、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)、囊性纤维化、镰状细胞贫血、杜氏肌营养不良(Duchennemuscular dystrophy)、地中海贫血或亨廷顿病(Huntington's disease)。在一个方面中，所述方法或试剂盒可以用于检测多态性基因(如细胞色素p450)的一种或多种多态性。
已知许多疾病与遗传变异相关，包括但不限于肝豆状核变性(APP7B)、肥胖症(MC4R)、2型糖尿病(IRS1)、囊性纤维化(CTFR)、雷特综合症(Rett syndrome)(MECP2)、阿尔茨海默病(APP)、克雅二氏综合症(Creutzfeldt-Jakob syndrome)(PRNP)、家族性地中海热(MEFV)、胃肠道间质瘤(KIT)、嗜铬细胞瘤(RET)、杜氏肌营养不良(DMD)、神经性尿崩症(AVP)、脆性X综合征(FMR1)、鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症(OTC)、布鲁格达综合症(Brugadasyndrome)(SCN5A)、马方综合症(Marfan syndrome)(FBN1)、真性红细胞增多症(JAK2)、常染色体隐性多囊肾(PKHD1)、恶性高热(RYR1)以及卡纳万病(Canavan disease)(ASPA)。Pinero等人(2015)《DisGeNET：一种用于动态探索人类疾病及其基因的发现平台(DisGeNET:a discovery platform for the dynamical exploration of humandiseases and their genes)》.数据库：doi:10.1093/database/bav028。
在一个方面中，提供一种检测、鉴别或定量与传染病表型相关的一种或多种SNP的方法或试剂盒，所述传染病表型包括例如克雅二氏病(PRNP)、登革休克综合征(MICB)、乙型肝炎(HLA-DPA1和HLA-DPB1)；丙型肝炎(IL28B)；HIV-1和艾滋病(HLA-C、HLA-B、HCP5、MICA、PSORS1C3、ZNRD1、RNF39、PARD3B和CXCR6)；麻风(LACC1、NOD2、RIPK2、CCDC122和TNFSF15)；脑膜炎球菌病(CFH)、疟疾(HBB)；以及肺结核(GATA6、TAGE1、RBBP8和CABLES1)。Fareed和Afzal(2012)《人群中全基因组关联的单核苷酸多态性：一种用于广谱科学的工具(Singlenucleotide polymorphism in genome-wide association of human population:A toolfor broad spectrum science)》.《埃及医学人类遗传学杂志(Egypt.J.Med.HumanGenet.)》14:123-134。
在一个方面中，提供一种检测、鉴别或定量与疾病相关的一种或多种SNP的方法或试剂盒，所述疾病包括例如自身免疫疾病、心血管病状、糖尿病、胃肠道病症、脂质代谢病症和神经精神病状。与自身免疫疾病相关的SNP是已知的，并且包括例如与以下相关的SNP：类风湿性关节炎(SPRED2、ANKRD55、IL6ST、PXK、RBPJ、CCR6、IRF5、TRAF1-C5、NTAFIP3附近的染色体6q23.3和OLIG3)以及系统性红斑性狼疮(BANK1)。与心血管病状相关的SNP是已知的，并且包括例如与以下相关的SNP：心房颤动/心房扑动(PITX2附近的染色体4q25)；冠状动脉疾病(CDKN2A/B和MTHFD1L)、冠心病(DAB2IP)；以及心肌疾病(CDKN2A/B)。与糖尿病相关的SNP是已知的，并且包括例如与以下相关的SNP：1型糖尿病(FUT2、C12orf30、ERBB3、KIAA0350、PTPN2、CD226、TRAFD1和PTPN11)；以及2型糖尿病(KCNQ1、SLC30A8、FTO、HHEX、CDKAL1、CDKN2B、IGFBP2、CDKN2A/B和IGF2BP2)。与胃肠道病症相关的SNP是已知的，并且包括例如与以下相关的SNP：乳糜泻(KIA1109、TENR、IL2和IL21)；克罗恩病(PTPN2、IRGM、NKX2-3、ATG16L1、BSN、MST1和IRGM)；胆石(ABCG8和SH2B3/LNK)；以及炎性肠病(IL23R)。与脂质代谢病症相关的SNP包括例如与以下相关的SNP：HDL-胆固醇(GALNT2和MVK/MMAB)；LDLl-胆固醇(CELSR2、PSRC1、SORT1、CILP2和PBX4)；甘油三酯(BCL7B、TBL2、MLXIPL、CILP2、PBX4、TRIB1、GALNT2、ANGPTL3、DOCK7、ATG4C、GCKR、TRIB1、NCAN/CILP2和MLXIPL)。与神经精神病状相关的SNP是已知的，并且包括例如与以下相关的SNP：肌萎缩侧索硬化症(DPP6)；APOE e4与迟发性阿尔茨海默病(GAB2)；双相型障碍(DGKH、PALB2、NDUFAB1和DCTN5)；多发性硬化症(KIAA 0350、IL2RA和IL7RA)；不宁腿综合征(BTBD9、MEIS1、BTBD9、MAP2K5和LBXCOR1)；以及精神分裂症(CSF2RA)。Fareed和Afzal(2012)《人群中全基因组关联的单核苷酸多态性：一种用于广谱科学的工具》.《埃及医学人类遗传学杂志》14:123-134。
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量与癌症相关的一个或多个核苷酸序列或变异体。在一个方面中，核酸序列为野生型序列。在一个方面中，核酸序列为突变或变异序列。在一个方面中，核苷酸序列中的突变与癌症相关。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量一种或多种致癌基因或原癌基因(如BRAF或KRAS)或一种或多种肿瘤抑制基因(如BRCA1、BRCA2、PTEN、CTFR和TP53)和其组合的野生型、突变或变异核酸序列的存在或不存在。(参见例如Concert Genetics(2017)《基因测试的现状(TheCurrent Landscape of Genetic Testing)》)。
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于检测癌症的医学相关的基于DNA或RNA的标志。在另一方面中，所述方法或试剂盒用于个性化医药以帮助选择有效癌症疗法。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别具有遗传性癌症的风险的个人。遗传性癌症是指一组显著提高个人罹患癌症的风险的遗传缺陷，其可以通过鉴别特定基因中的种系突变来诊断，包括例如李-佛美尼综合症(Li-Fraumeni syndrome)(p53)、家族性腺瘤性息肉病(APC)、乳腺癌(BRCA1；BRCA2；PALB2；TP53；CHEK2；ATM；NBS/NBN；BLM；PTEN；MRE11；BRIP1；BARD1；RAD50；RAD51C；RAD51D；RECQL；FANCC；和FANCM)以及遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)综合征(MLH1；MSH2；MSH3；MSH6；PMS2；EPCAM；APC；MUTYH；NTHL1；POLE；POLD1；SMAD4；BMPR1A；和STK11)。Sokolenko和Imyanitov(2018)《临床肿瘤学中的分子诊断(MolecularDiagnostics in Clinical Oncology)》.《分子生物学前沿(Front.Molec.Bio.)》5(76):1-15。
癌症的其它SNP标志是已知的，并且包括例如以下的标志：乳腺癌(FGFR2、TNCR9/LOC643714、MAP3K1、LSP1和ERBB4)；基底细胞癌(RHOU、PADI4、PADI6、RCC2、ARHGEF10L、KRT5、CDKN2A/B、TCF2、IGF2、IGF2A、INS和TH)；结直肠癌(ORF、DQ515897和SMAD7)；肺癌(CHRNA3、CHRNA5、CHRNB4、PSMA4、LOCI23688和TRNAA-UGC)；黑色素瘤(CDC91L1)、成神经细胞瘤(FLJ22536、FLJ44180和BARD1)；以及甲状腺癌(FOXE1和NKX2-1)。Fareed和Afzal(2012)《人群中全基因组关联的单核苷酸多态性：一种用于广谱科学的工具》.《埃及医学人类遗传学杂志》14:123-134。
在一个方面中，提供一种方法或试剂盒以检测、鉴别或定量与人类疾病相关的一种或多种拷贝数变异(CNV)或非整倍体，所述人类疾病包括例如神经发育障碍，如自闭症、智力障碍和癫痫，先天性心脏缺陷以及其它先天性异常。在一个方面中，CNV包括缺失。在另一方面中，CNV包括重复。与缺失CNV相关的病症的实例包括但不限于影响头部大小的病症、精神病症和代谢(KCTD13和PRRT2)；睡眠调节和代谢(RAI1)；面部外观(ELN)；心脏异常、婴儿高钙血症、生长或发育迟缓(LIMK-1)；畸形特征、发育迟缓、心脏缺陷(GATA4)；智力障碍、癫痫、癫痫发作、面部和手指畸形(CHRNA7)；智力障碍、独特的面部特征、癫痫、心脏缺陷、泌尿生殖系统异常(KANSL1)以及畸形面部特征、腭心面综合征、先天性心脏病、学习障碍、听力损失(TBX1)。与重复CNV相关的病症的实例包括但不限于影响头部大小的病症、精神病症和新陈代谢(KCTD13和PRRT2)；睡眠调节和新陈代谢(RAI1)；面部外观(ELN)；畸形特征、发育迟缓、心脏缺陷(GATA4)；语言和言语迟缓、自闭症、癫痫(LIMK-1)；智力障碍、自闭症、复发性耳部感染、低耳位、肥胖症(CHRNA7)；发育迟缓、小头畸形、面部畸形、异常手指和多毛症、发育迟缓(KANSL1)以及畸形面部特征、腭咽闭合不全、先天性心脏病、智力障碍、言语迟缓、听力损失和发育迟缓(TBX1)。Golzio和Katsanis(2013)《相互CNV的遗传结构(GeneticArchitecture of Reciprocal CNVs)》.《遗传学和发育当前观点(Curr.Opin.Genet.Dev.)》23(3):240-248。与CNV相关的经常观察到的病症包括但不限于威廉姆斯(Willaims)(ELN，缺失表型)、普拉德-威利(Prader-Willi)或安格尔曼(Angelman)(UBE3A，缺失表型)、史密斯-马吉利(Smith-Magenis)(RAI1，缺失表型)、波托茨基-鲁普斯基(Potocki-Lupski)(RAI1，重复表型)、库伦-德弗里斯(Koolen-de Vries)(MAPT、KANSL1，缺失表型)、迪乔治/腭心面(TBX1、HIRA，缺失表型)以及肾囊肿和糖尿病(HNFIB，缺失表型)。Martin等人(2015)《CNV、非整倍体和人类疾病(CNVs,Aneuploidiesand Human Disease)》.《临床和围产期医学(Clinics and Perinatology)》.42(2):227-242，还参见Aouiche等人(2018)《拷贝数变异相关疾病基因(Copy number variationrelated disease genes)》.《定量生物学(Quant.Biol.)》6(2):99-112。
在一个方面中，本文所描述的方法或试剂盒可以用作伴随诊断装置以提供与相应治疗产品的使用相关的信息。举例来说，所述方法或试剂盒可以用于检测、鉴别或定量一种或多种基因，如BRCA1或BRCA2，用于涉及用于乳腺癌或卵巢癌的治疗剂，如(奥拉帕尼(olaparib))、/>(他拉唑帕尼(talazoparib))或/>(卢卡帕尼rucaparib))的患者管理；EGFR，用于涉及用于非小细胞肺癌的治疗剂，如/>(吉非替尼(gefitinib))、/>(阿法替尼(afatinib))或/>(达可替尼(dacomitinib))、/>(厄洛替尼(eroltinib))或/>(奥希替尼(osimertinib))的患者管理；PD-L1，用于涉及用于非小细胞肺癌的治疗剂，如/>(帕博利珠单抗(pembrolizimab))或/>(阿特珠单抗(atezolizumab))的患者管理；IDH1，用于涉及用于急性骨髓性白血病的治疗剂，如/>(艾伏尼布(ivosidenib))的患者管理；BCR-ABL，用于涉及用于慢性骨髓性白血病的治疗剂，如(尼洛替尼(nilotinib))的患者管理；ALK，用于涉及用于非小细胞肺癌的治疗剂，如/>(色瑞替尼(ceritinib))、/>(克唑替尼(crizotinib))和/>(阿来替尼(alectinib))的患者管理；IDH2，用于涉及用于急性骨髓性白血病的治疗剂，如(恩西地平(enasidenib))的患者管理；RAS，用于涉及用于结直肠癌的治疗剂，如(帕尼单抗(panitumumab))的患者管理；FLT3，用于涉及用于急性骨髓性白血病的治疗剂，如/>(米哚妥林(midostaurin))和/>(吉瑞替尼(gilterinib))的患者管理；KIT(D816V)，用于涉及用于侵袭性系统性肥大细胞增多症的治疗剂，如(甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate))的患者管理；PDGFRB，用于涉及用于骨髓增生异常综合征/骨髓增生性疾病的治疗剂，如/>(甲磺酸伊马替尼)的患者管理；KRAS或EGFR，用于涉及用于结直肠癌的治疗剂，如/>(西妥昔单抗(cetuximab))或/>(帕尼单抗)的患者管理；c-KIT，用于涉及用于胃肠道间质瘤的治疗剂，如(甲磺酸伊马替尼)/>(甲磺酸伊马替尼)的患者管理；HER-2，用于涉及用于乳腺癌的治疗剂，如/>(曲妥珠单抗(trastuzumab))、/>(帕妥株单抗(pertuzumab))或/>(ado-曲妥珠单抗)的患者管理；HER-2，用于涉及用于胃癌和胃食管癌的治疗剂，如/>(曲妥珠单抗)的患者管理；BRAF，用于涉及用于黑色素瘤的治疗剂，如/>(康奈非尼(encorafenib))、/>(贝美替尼(binimetinib))、(曲美替尼(tramatenib))、/>(达拉非尼(dabrafenib))、/>(维罗非尼(vemurafenib))或/>(考比替尼(cobimetinib))的患者管理；或其组合。参见例如可在fda.gov获得的FDA明确或批准的伴随诊断装置(体外和成像工具)列表(FDAList of Cleared or Approved Companion Diagnostic Devices(In Vitro and ImagingTools))。
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量一个或多个核苷酸序列或变异体以检测临床或环境样品中的病原性生物体，例如用于临床诊断、食品安全测试、环境监测或生物防御。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量一种或多种病原体，包括病毒、细菌、寄生虫和真菌病原体。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量一种或多种抗生素或抗病毒抗性病原性生物体。
在一个方面中，所述方法或试剂盒包括一个或多个探针集合，其被配置成检测一种或多种病原性基因组的存在。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于针对病原体检测、基因分型、病毒检测、毒力标志检测、抗生素抗性检测或爆发调查的高通量筛选，参见例如Fourier等人(2014)《基因组学时代细菌病原体的临床检测和表征(Clinical Detectionand Characterization of bacterial pathogens in the genomics era)》.《基因组医学(Genome Medicine)》.6:114。在一个方面中，提供一种用于病毒病原体检测和基因分型的方法或试剂盒，参见例如Wang等人(2002)《基于微阵列的病毒病原体检测和基因分型(Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens)》.《美国国家科学院院刊(PNAS)》.99(24):15687-15692。
病毒基因组序列是已知的并且可以例如使用NCBI病毒基因组资源(NCBI ViralGenomes Resource)发现，其将所有可公开获得的病毒基因组序列按目录分类并且可以在ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses处访问。类似地，微生物基因组序列是已知的并且可以例如使用NCBI微生物基因组资源发现，其将所有可公开获得的微生物基因组序列按目录分类并且可以在ncbi.nlm.nih.gov/genome/microbes处访问。
在另一方面中，所述方法或试剂盒可以用于检测、鉴别或定量一种或多种病毒，例如一种或多种呼吸道病毒，包括但不限于甲型流感和乙型流感病毒，包括例如甲型流感病毒H1、H3和H5亚型；1、2、3和4型副流感病毒；呼吸道合胞病毒A型和B型；腺病毒；偏肺病毒(MPV)；鼻病毒；肠病毒；和冠状病毒(CoV)，如OC43和229E或严重急性呼吸综合征冠状病毒、NL63和HKU1；禽流感病毒H5N1；以及人类博卡病毒(bocavirus)。在一个方面中，提供一种用于检测病毒衣壳(CA)蛋白的方法或试剂盒。
在一个方面中，所述方法或试剂盒包括匹配对于分类科或亚科唯一但由所述科内的物种共享的基因组区的一个或多个“发现”探针。“发现”探针靶向在科内进化较慢的序列，并且适用于检测已知科内的物种。在另一方面中，所述方法或试剂盒包括靶向对于个别物种或株系唯一的高度可变区的一个或多个“普查”探针。“普查”探针适用于鉴别样品中的生物体的特定株系。McLoughlin,K.S.(2011)《用于病原体检测和分析的微阵列(Microarrays for Pathogen Detection and Analysis)》.《功能基因组学简报(Brief.Funct.Genomics.)》10(6):342-353.
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于检测、鉴别或定量与病原性细菌相关的核酸序列。用于鉴别广泛多种好氧细菌和厌氧细菌的共同基因靶为16S rRNA或rDNA。编码细菌RNA聚合酶的β-亚基的rpoB基因也可以用于细菌鉴别，例如用于鉴别快速生长的分枝杆菌。其它细菌基因靶包括tuf(延伸因子Tu)、gyrA或gyrB(旋转酶A或B)、soda(锰依赖性超氧化物歧化酶)和热休克蛋白。Petti,C.A.(2007)《通过基因扩增和测序检测和鉴别微生物(Detection and Identification of Microorganisms by Gene Amplification andSequencing)》.《临床传染病(Clin.Infect.Dis.)》44:1108-1114。
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量粪便样本中的一种或多种病原性生物体。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量人粪便样本中的一种或多种病毒、寄生虫或细菌核酸序列。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量一种或多种细菌或细菌毒素，包括但不限于弯曲杆菌属(Campylobacter)、艰难梭菌(Clostridium dificile)毒素A/B、大肠杆菌O157、肠毒素大肠杆菌(ETEC)LT/ST、产生志贺样毒素的大肠杆菌(STEC)stx1/stx2、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)以及小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量一种或多种病毒，包括但不限于腺病毒、诺如病毒(norovirus)和轮状病毒。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量一种或多种寄生虫，包括但不限于隐孢子虫(Cryptosporidium)、溶组织内阿米巴(Entamoeba hisolytica)或贾第虫属(Giardia)。
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量与器官移植结果相关的一个或多个核苷酸序列或变异体。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量人白细胞抗原(HLA)以提供对器官移植程序有帮助的信息。人白细胞抗原(HLA)分子在几乎所有的有核细胞上表达并且在移植物排斥方面是重要的。系统是高度多态的。HLA I类存在三个经典基因座：HLA-A、HLA-B和HLA-Cw，并且II类存在五个基因座：HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、HLA-DM和HLA-DO。Mahdi,B.M.(2013)《HLA分型在器官移植中的应用(A glow of HLAtyping in organ transplantation)》.《临床与转化医学(Clin.Transl.Med.)》2:6。目前已知超过7,500种不同的等位基因和超过5,458种表达的抗原。(Laperrousaz等人(2012)《肾移植中的HLA和非HLA多态性(HLA and non-HLA polymorphisms in renaltransplantation)》.《瑞士医学周报(Swiss Med.Wkly.)》142:w13668。
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量患者循环中的核酸，例如核酸治疗剂。多种核酸治疗剂是已知的并且包括DNA治疗剂，如反义寡核苷酸、DNA适体和基因疗法；以及RNA治疗剂，如微RNA、短干扰RNA、核酶、RNA诱饵和环状RNA。反义寡核苷酸的实例包括用于管理巨细胞病毒(CMV)视网膜炎的福米韦生(Fomivirsen)和载脂蛋白B-100合成的抑制剂米泊美生(Mipomersen)。用于基因疗法的寡核苷酸的实例包括用于表达肿瘤抑制基因p53的今又生(Gendicine)和用于具有脂蛋白脂肪酶缺乏的患者的阿利泼金(Alipgene)。米拉维森(Miravirsen)是靶向肝脏特异性微RNA-122的反义寡核苷酸。临床试验中的其它治疗性核酸在Sridharan和Gogtay(2016)《治疗性核酸：当前临床状态(Therapeutic Nucleic Acids:Current Clinical Status)》.《英国临床药理学杂志(Br.J.Clin.Pharmacol.)》82(3):659-672中列出，其公开内容全文并入本文中。
在一个方面中，提供一种用于基因表达研究的方法或试剂盒。在一个方面中，提供一种检测、鉴别或定量样品中的mRNA表达的方法或试剂盒。在一个方面中，提供一种方法或试剂盒以检测、鉴别或定量一种或多种调控多态性(rSNP)。术语“调控多态性”是指可能影响基因表达的外显子区外发生的多态性。顺式作用调控多态性作用于存在于同一等位基因上的基因拷贝，并且典型地存在于其调控的基因的基因座中或附近。反式作用调控多态性是一个基因中影响另一基因表达的多态性。Knight,J.C.(2005)《复杂疾病性状下的调控多态性(Regulatory Polymorphisms underlying complex disease traits)》.《分子医学杂志(柏林)(J.Mol.Med.(Berl.).)》83(2):97-109。人类基因的顺式和反式作用多态性调控子是已知的，并且包括Cheung等人(2010)《人类基因表达的多态性顺式和反式调控(Polymorphic Cis-and Trans-Regulation of Human Gene Expression)》.《公共科学图书馆·生物学(PLOS Biol.)》8(9):e1000480描述的那些，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量一个或多个核苷酸序列或变异体，如DNA甲基化多态性或其它表观遗传变异。
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量微卫星不稳定性(MSI)。MSI指示由DNA错配修复受损引起的突变倾向性。MSI进一步描述于例如等人,“微卫星不稳定性(Microsatellite Instability)”,eLS 2004；doi:10.1038/npg.els.0000840中。
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量归因于基因编辑技术的一个或多个核苷酸序列或变异体，所述基因编辑技术包括例如成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)。
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量样品中的一种或多种蛋白质。在一个方面中，蛋白质为DNA结合蛋白。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于从样品中分离一种或多种靶DNA结合蛋白。在另一方面中，所述方法或试剂盒用于确认样品中的一种或多种DNA结合蛋白的身份或确定样品中DNA结合蛋白的相对量。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于测量转录因子-DNA结合相互作用。在一个方面中，DNA结合蛋白所结合的单链或双链DNA序列固定到如本文所描述的支撑表面，并且与含有或疑似含有DNA结合蛋白的样品接触。在一个方面中，使固定化DNA序列与含有或疑似含有DNA结合蛋白的样品在DNA结合蛋白结合到支撑表面上的固定化DNA序列的条件下接触。随后洗涤表面以去除碎片，包括例如非特异性结合的蛋白质。在一个方面中，靶DNA结合蛋白从固定化DNA洗脱并且例如通过蛋白质印迹或质谱检测。在另一方面中，例如使用特异性结合到蛋白质的标记的抗体或电化学发光标记来标记和检测固定化靶DNA结合蛋白。在一个方面中，样品是包括一种或多种DNA结合蛋白的细胞裂解物。在一个方面中，支撑表面为微孔板。在一个方面中，微板格式与高通量分析结合使用，例如用于突变或激活分析。
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量一个或多个核苷酸序列或变异体，如与致病性或耐药性相关的单核苷酸变异体或单核苷酸多态性。在另一方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量一个或多个核苷酸序列或变异体，如与特定工业或农业应用相关的单核苷酸变异体或单核苷酸多态性，例如与遗传修饰生物体(GMO)相关的突变。在一个方面中，所述方法或试剂盒可以用于全基因组关联研究(GWAS)以确定一种或多种变异体(例如单核苷酸变异体)是否与疾病相关。
在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量一种或多种单核苷酸变异体。在一个方面中，所述方法或试剂盒用于鉴别、检测或定量约1与约100个或约5与约100个之间的确定的单核苷酸变异体，其可以包括一种或多种单核苷酸多态性。
在一个方面中，提供用于同时、并行鉴别、检测或定量样品中的多个靶核苷酸序列的方法和试剂盒。在一个方面中，提供一种用于鉴别、检测或定量样品中的至多100个靶核苷酸序列，例如样品中的约1与约100个或约5与约100个之间的靶核苷酸序列的方法。在一个方面中，提供一种方法或试剂盒，其中用户或制造商可以基于特定用户要求配置多重结合分析以用于检测一个或多个靶核苷酸序列。
在一个方面中，所述方法包括使用靶核苷酸序列作为模板生成加标签且标记的反应产物，并且使支撑表面与加标签且标记的反应产物接触，其中所述支撑表面包括多个捕获分子所固定到的一个或多个结合域的图案化阵列。在一个方面中，捕获分子包括固定在离散结合域上的单链捕获寡核苷酸，其中每个结合域包括捕获具有特定核苷酸序列的寡核苷酸。在一个方面中，加标签且标记的反应产物包括具有与捕获寡核苷酸的序列互补的序列的单链寡核苷酸标签。在一个方面中，加标签且标记的反应产物由寡核苷酸连接分析(OLA)生成。在另一方面中，加标签且标记的反应产物由引物延伸分析(PEA)生成。在一个方面中，标记为电化学发光(ECL)标记，并且支撑表面包括一个或多个工作电极和一个或多个对电极，其适用于触发来自固定化反应产物的标记的电化学发光发射。
在一个方面中，靶核苷酸序列包括或疑似含有野生型序列。在一个方面中，靶核苷酸序列包括或疑似含有突变，如缺失、添加、取代、转换、颠换、重排或易位。在一个方面中，突变包括错义、无义、沉默或剪接位点突变。在一个方面中，提供用于鉴别、检测或定量一个或多个靶核苷酸序列中的一种或多种单核苷酸多态性(SNP)的方法和试剂盒。在一个方面中，提供用于鉴别、检测或定量存在于至少约1％的群体中的一种或多种常见单核苷酸SNP的方法和试剂盒。在另一方面中，提供用于鉴别、检测或定量以低频率存在于样品中的突变(例如以小于0.05％或0.01％存在于样品中的突变)的方法和试剂盒。
在一个方面中，提供一种对多种靶分析物进行多重结合分析的方法。多重结合分析是已知的，并且包括2015年9月8日提交的标题为用于进行多重分析的方法(METHODS FORCONDUCTING MULTIPLEXED ASSAYS)的美国专利公开号2016/0069872中所描述的那些，其公开内容全文并入本文中。
在一个方面中，进行多重结合分析的方法包括提供支撑表面，在所述撑表面上至少具有第一核苷酸序列的第一捕获寡核苷酸固定在第一结合域上并且具有第二核苷酸序列的第二捕获寡核苷酸固定在第二结合域上。在一个方面中，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列不同。在一个方面中，在一个或多个步骤中，使支撑表面与至少第一靶向剂、第一结合试剂、第二靶向剂和第二结合试剂接触。在一个方面中，第一靶向剂包括可操作地连接到第一连接剂的第一标签序列。在一个方面中，第一标签序列包括与第一捕获寡核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个方面中，第二靶向剂包括可操作地连接到第二连接剂的第二标签序列。在一个方面中，第二标签序列包括与第二捕获寡核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个方面中，第一结合试剂包括与可操作地连接到第一补充连接剂的第一分析物特异性结合的第一分析物结合域。在一个方面中，第二结合试剂包括与可操作地连接到第二补充连接剂的第二分析物特异性结合的第二分析物结合域。在一个方面中，第一连接剂为第一补充连接剂的结合伴侣并且第二连接剂为第二连接剂的结合伴侣。在一个方面中，支撑表面与至少第一和第二桥接剂接触。在一个方面中，第一桥接剂包括结合到第一连接剂的第一连接剂结合位点和结合到第一补充连接剂的第一补充连接剂结合位点，并且第二桥接剂包括结合到第二连接剂的第二连接剂结合位点和结合到第二补充连接剂的第二补充连接剂结合位点。
在一个方面中，使支撑表面与含有或疑似含有至少所关注的第一分析物和所关注的第二分析物的样品接触。在一个方面中，形成至少第一检测复合物和第二检测复合物。在一个方面中，第一检测复合物形成于第一结合域上并且包括第一靶向剂、第一捕获寡核苷酸、第一结合试剂和第一分析物。在一个方面中，第一检测复合物形成于第一结合域上并且包括第一靶向剂、第一捕获寡核苷酸、第一桥接剂、第一结合试剂和第一分析物。在一个方面中，第二检测复合物形成于第二结合域上并且包括第二靶向剂、第二捕获寡核苷酸、第二结合试剂和第二分析物。在一个方面中，第二检测复合物形成于第二结合域上并且包括第二靶向剂、第二捕获寡核苷酸、第二桥接剂、第二结合试剂和第二分析物。在一个方面中，所述方法包括通过第一和第二检测复合物分别测量固定在第一和第二结合域上的第一和第二分析物的量。
P.手动和自动化实施例
本文所公开的方法可以手动进行、使用自动化技术进行，或两者。自动化技术可以是部分自动化的，例如一个或多个模块化仪器，或完全集成的自动化仪器。
示例自动化系统论述且描述于共同拥有的国际专利申请公开号WO 2018/017156和WO 2017/015636以及国际专利申请公开号WO 2016/164477中，其中的每一者以全文引用的方式并入。
可以在上面进行本文的方法的自动化系统(模块和完全集成)可以包括以下自动化子系统：计算机子系统，其可以包括硬件(例如个人计算机、膝上型计算机、硬件处理器、磁盘、键盘、显示器、打印机)、软件(例如进程，如驱动程序、驱动程序控制器和数据分析器)以及数据库；液体处置子系统，例如样品处置和试剂处置，例如机器人移液头、注射器、搅拌设备、超声混合设备、磁力混合设备；样品、试剂和消耗品存储和处置子系统，例如机器人操纵器、管或盖或箔穿孔设备、盖去除设备、传送设备(如线性和环形传送带和机器人操纵器)、管架、板载架、槽载架、移液器吸头载架、平板振荡器；离心机、分析反应子系统，例如基于流体的和基于消耗品的子系统(如管和多孔板)；容器和消耗品洗涤子系统，例如板洗涤设备；磁性分离器或磁性粒子集中器子系统，例如流动池、管和板类型；细胞和粒子检测、分类和分离子系统，例如流式细胞仪和库尔特计数器(Coulter counter)；检测子系统，如比色、浊度、荧光和ECL检测器；温度控制子系统，例如空气处置、空气冷却、空气加热、风扇、鼓风机、水浴；废物子系统，例如液体和固体废物容器；全球唯一标识符(GUI)检测子系统，例如1D和2D条形码扫描仪，如平板和棒型；样品标识符检测子系统，例如1D和2D条形码扫描仪，如平板和棒型。分析子系统，例如色谱系统，如高效液相色谱(HPLC)、快速蛋白液相色谱(FPLC)和质谱仪也可以是模块或完全集成的。
执行样品鉴别和制备的系统或模块可与执行分析且执行检测或执行两者的系统或模块组合(或邻接到或邻近或以机器人方式连结或联接到所述系统或模块)。相同种类的多个模块化系统可组合以增加吞吐量。模块化系统可与实行例如化学、生化和核酸分析的其它类型的分析的模块组合。
自动化系统可允许分批、连续、随机接入和护理点工作流程和单个、中等及高样品吞吐量。
所述系统可包括例如以下装置中的一个或多个：板密封器(例如，Zymark)、板洗涤器(例如，伯腾(BioTek)、帝肯(TECAN))、试剂分配器和/或自动化移液站和/或液体处置站(例如，帝肯、Zymark、雷勃(Labsystems)、贝克曼(Beckman)、汉密尔顿(Hamilton))、培养箱(例如，Zymark)、板振荡器(例如，Q.Instruments、Inheco、赛默飞世尔科技)、化合物库或样品存储器和/或化合物和/或样品检索模块。这些装置中的一个或多个提供机器人组合件联接到本发明的设备，使得可自动执行整个分析程序。根据替代实施例，容器(例如，板)在所述设备与各种装置(例如，板的堆叠)之间手动地移动。
所述自动化系统可被配置成执行以下功能中的一个或多个：(a)将例如板的消耗品移动到检测子系统中、内及之外，(b)在其它子系统之间移动消耗品，(c)存储所述消耗品，(d)样品和试剂处置(例如，适于混合试剂和/或将试剂引入到消耗品中)，(e)消耗品振荡(例如，用于混合试剂和/或用于增加反应速率)，(f)消耗品洗涤(例如，洗涤板和/或执行分析洗涤步骤(例如，孔抽吸))，(g)测量流动池或例如管或板的消耗品中的ECL。自动化系统可以被配置成处置放置于架中的个别管、如96或384孔板等多孔板。
如本文所描述的用于在自动化系统中集成组件和模块的方法在所属领域中是众所周知的，参见例如Sargeant等人,平台完善(Platform Perfection),医疗产品外包(Medical Product Outsourcing),2010年5月17日。
在实施例中，自动化系统是全自动化、模块化、计算机化的，对广泛范围的分析物执行体外定量和定性测试，并且执行光度分析、离子选择性电极测量和/或电化学发光(ECL)分析。在实施例中，所述系统包括以下硬件单元：控制单元、核心单元和至少一个分析模块。
在实施例中，控制单元使用图形用户接口来控制所有仪器功能，并且包括读出装置(如监视器)、输入装置(如键盘和鼠标)和使用例如Windows操作系统的个人计算机。在实施例中，核心单元包括管理样品到每一分配的分析模块的传送的若干组件。核心单元的实际组成取决于分析模块的配置，其可以由所属领域的技术人员使用所属领域中已知的方法配置。在实施例中，核心单元包括至少取样单元和一个机架转子作为主要组件。传送线和第二机架转子是可能的扩展。若干其它核心单元组件可以包括样品架装载器/卸载器、端口、条形码读取器(用于架和样品)、供水和系统接口端口。在实施例中，分析模块进行ECL分析并且包括试剂区、测量区、消耗品区和预清洁区。
Q.试剂盒
在一个方面中，提供一种用于进行分析以鉴别、检测或定量样品中的一种或多种靶分析物的试剂盒。在一个方面中，所述试剂盒可以由制造商或最终用户定制以鉴别、检测或定量所关注的一种或多种靶蛋白质或核苷酸序列。在一个方面中，最终用户可以基于与靶分析物或反应产物缔合的寡核苷酸标签与固定在每个结合域中的捕获寡核苷酸之间的互补性，指定哪一种靶分析物将被引导到阵列中的每个结合域。在一个方面中，所述试剂盒提供可以基于用户规格配置的多孔分析板，例如最终用户可以选择分析物集合并且针对所述分析物集合配置用户定制的多重分析。
在一个方面中，提供一种试剂盒。在一个方面中，所述试剂盒包括如本文所描述的非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合。在一个方面中，所述试剂盒包括选自以下的两种或更多种非交叉反应性捕获寡核苷酸：表1(SEQ ID NO:1-64)、表2(SEQ ID NO:65-122)、表3(SEQ ID NO:123-186)、表4(SEQ ID NO:187-250)、表5(SEQ ID NO:251-308)、表6(SEQ IDNO:309-372)、表7(SEQ ID NO:373-436)、表8(SEQ ID NO:437-494)、表9(SEQ ID NO:495-558)、表10(SEQ ID NO:559-622)、表11(SEQ ID NO:623-680)或表12(SEQ ID NO:681-744)，或其变异体。在一个方面中，所述试剂盒包括选自SEQ ID No:1-64或其变异体的两种或更多种非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合。在一个方面中，所述试剂盒包括选自SEQ IDNo:1-10或其变异体的两种或更多种非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合。在一个方面中，捕获寡核苷酸包括至少24、30或36个核苷酸。
在一个方面中，所述试剂盒包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25并且至多64种非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合。在一个方面中，所述试剂盒包括至多10种非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合。
在一个方面中，所述试剂盒包括提供于容器中的一种或多种捕获寡核苷酸，其中一个容器中的捕获寡核苷酸具有相同序列并且每个容器含有具有与其它容器中的捕获寡核苷酸的序列不同(并且不互补)的序列的捕获寡核苷酸。在一个方面中，所述试剂盒在独立容器中包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25并且至多64种非交叉反应性捕获寡核苷酸。在一个方面中，所述试剂盒在独立容器中包括至多10种不同捕获寡核苷酸，其可以用于鉴别、检测或定量至多10种靶核苷酸序列。
在一个方面中，所述试剂盒包括支撑表面和如本文所描述的非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合。在一个方面中，所述试剂盒包括固定在支撑表面上的非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合。在一个方面中，所述试剂盒包括固定在支撑表面上阵列中的非交叉反应性捕获寡核苷酸的集合。在一个方面中，所述试剂盒包括固定到一个或多个离散结合域的一种或多种捕获寡核苷酸，所述离散结合域具有阵列内的已知位置。在一个方面中，所述试剂盒包括固定在珠粒阵列上的两种或更多种非交叉反应性捕获寡核苷酸。
在一个方面中，所述试剂盒包括固定在支撑表面上的一个或多个结合域中的一种或多种非交叉反应性捕获寡核苷酸。在一个方面中，所述试剂盒包括固定在两个或更多个独特结合域中的两种或更多种非交叉反应性捕获寡核苷酸，其中固定在每个独特结合域上的捕获寡核苷酸的序列相同。在一个方面中，所述试剂盒包括一个或多个结合域，其中至少一些捕获寡核苷酸不共价结合到支撑表面。在一个方面中，所述试剂盒包括一个或多个结合域，其中至少一些捕获寡核苷酸不通过硫醇基共价结合到碳基表面，例如碳基电极。在一个方面中，一个或多个结合域包括不通过硫醇基共价结合到支撑表面的大于10％、15％、20％、25％、50％或75％的捕获寡核苷酸。在一个方面中，所述试剂盒包括一个或多个具有小于约0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％污染捕获寡核苷酸的结合域。
在一个方面中，所述试剂盒包括一种或多种包括官能团的捕获寡核苷酸。在一个方面中，所述试剂盒包括一种或多种包括硫醇基的捕获寡核苷酸。在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸通过硫醇基共价连接到碳基支撑表面。在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸通过接头连接到硫醇基。在一个方面中，一种或多种捕获寡核苷酸通过硫醇基连接到一个或多个电极。
在另一方面中，所述试剂盒包括如本文所描述的非交叉反应性寡核苷酸标签的集合。在一个方面中，所述试剂盒包括非交叉反应性寡核苷酸标签的集合，其相对于互补捕获寡核苷酸与非互补捕获寡核苷酸的结合小于0.05％。
在一个方面中，所述试剂盒包括选自以下的非交叉反应性寡核苷酸的集合：表13(SEQ ID NO:745-808)、表14(SEQ ID NO:809-866)、表15(SEQ ID NO:867-930)、表16(SEQID NO:931-994)、表17(SEQ ID NO:995-1052)、表18(SEQ ID NO:1053-1116)、表19(SEQ IDNO:1117-1180)、表20(SEQ ID NO:1181-1238)、表21(SEQ ID NO:1239-1302)、表22(SEQ IDNO:1303-1366)、表23(SEQ ID NO:1367-1424)或表24(SEQ ID NO:1425-1488)，或其变异体。在一个方面中，寡核苷酸标签包括至少20、24、30或36个核苷酸。
在一个方面中，所述试剂盒包括提供于容器中的一种或多种寡核苷酸寡核苷酸标签，其中一个容器中的寡核苷酸标签具有相同序列并且每个容器含有具有与其它容器中的寡核苷酸标签的序列不同(并且不互补)的序列的寡核苷酸标签。在一个方面中，所述试剂盒在独立容器中包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25并且至多64种非交叉反应性寡核苷酸标签。在一个方面中，所述试剂盒包括至多10种非交叉反应性寡核苷酸标签的集合。
在一个方面中，所述试剂盒包括支撑表面。在一个方面中，所述试剂盒包括碳基支撑表面。在一个方面中，支撑表面包括至少一个电极。在一个方面中，电极为碳基电极。在一个方面中，支撑表面包括一个或多个碳墨电极。在一个方面中，支撑表面包括至少一个工作电极和至少一个对电极。
在一个方面中，所述试剂盒包括支撑表面，其包括多孔分析板。在一个方面中，多孔板的一个或多个孔包括一个或多个电极。在一个方面中，支撑表面包括多孔板，其中一个或多个孔包括一个或多个工作电极和一个或多个对电极。在一个方面中，支撑表面包括一个或多个参比电极。
在一个方面中，所述试剂盒包括具有一个或多个电极的支撑表面，一个或多个捕获寡核苷酸阵列印刷在所述电极上。在一个方面中，所述试剂盒包括一个或多个多孔板，一个或多个捕获寡核苷酸阵列已印刷在所述多孔板上。在另一方面中，所述试剂盒包括一个或多个多孔板和包括一种或多种捕获寡核苷酸的一个或多个小瓶，其中所述捕获寡核苷酸可以印刷到所述多孔板上。在一个方面中，最终用户或制造商可以通过使寡核苷酸标签与靶分析物缔合或生成具有与试剂盒提供的捕获寡核苷酸互补的寡核苷酸标签的反应产物来定制鉴别、检测或定量哪些靶核苷酸序列。
在一个方面中，所述试剂盒包括固定到支撑表面上的一个或多个结合域的一种或多种捕获寡核苷酸。在一个方面中，所述试剂盒包括固定在多孔板的孔内的一个或多个结合域上的一种或多种捕获寡核苷酸。在一个方面中，所述试剂盒包括固定在电极上的一个或多个结合域上的一种或多种捕获寡核苷酸。在一个方面中，所述试剂盒包括固定在多孔板的一个或多个孔内的电极上的一个或多个结合域上的一种或多种捕获寡核苷酸。
在一个方面中，所述试剂盒包括一个或多个多孔板，其中至多10种捕获寡核苷酸固定在多孔板的孔内的一个或多个结合域中，其中每个结合域包括捕获寡核苷酸，其具有不同于孔内的其它结合域中的捕获寡核苷酸的序列的序列。在一个方面中，所述试剂盒包括具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25种不同捕获寡核苷酸的支撑表面，所述捕获寡核苷酸固定在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个独特结合域中。在一个方面中，所述试剂盒包括具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25种不同捕获寡核苷酸的多孔板，所述捕获寡核苷酸固定在一个或多个孔中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个独特结合域中。在一个方面中，所述试剂盒包括一个或多个多孔板，其中每个孔包括至多10种固定在阵列中的捕获寡核苷酸。在一个方面中，多孔板可以被配置成在多孔板的每个孔内产生1与10之间的检测分析。
在一个方面中，所述试剂盒包括标准格式多孔板，其在所属领域中已知并且可以包括但不限于24、96和384孔板。在一个方面中，所述试剂盒包括一个或多个96孔板。在一个方面中，所述试剂盒包括一个多孔板。在另一方面中，所述试剂盒包括10个多孔板。在另一方面中，所述试剂盒包括10与100个之间的多孔板。
在一个方面中，提供一种用于进行发光分析的试剂盒，所述发光分析例如用于鉴别、检测或定量样品中的一个或多个靶核苷酸序列的电化学发光分析。在一个方面中，所述试剂盒包括适用于进行电化学发光分析的一种或多种分析组分。
在一个方面中，所述试剂盒包括杂交缓冲液，其可以用于为寡核苷酸标签与其相应互补捕获寡核苷酸序列杂交提供适当条件(例如严格条件)。在一个方面中，杂交缓冲液包括核酸变性剂，如甲酰胺。在一个方面中，杂交缓冲液提供为可以组合以形成杂交缓冲液的两种独立组分。
在一个方面中，所述试剂盒包括用于在印刷之后从支撑表面去除游离(即，未固定)捕获分子的洗涤溶液的容器。在一个方面中，洗涤溶液为水溶液。在一个方面中，洗涤溶液包括含硫醇化合物。在一个方面中，含硫醇化合物为水溶性的并且具有小于约200g/mol、175g/mol、150g/mol或125g/mol的分子量。在一个方面中，含硫醇化合物选自半胱氨酸、半胱胺、二硫苏糖醇、3-巯基丙酸酯、3-巯基-1-丙磺酸和其组合。在一个方面中，含硫醇化合物包括半胱氨酸。在一个方面中，含硫醇化合物包括两性离子。
在一个方面中，洗涤溶液中的水溶性含硫醇化合物与游离捕获寡核苷酸竞争以防止冲走。冲走是指捕获分子再沉积到相邻结合域，例如当松散地结合的捕获分子从表面释放到溶液(例如洗涤缓冲液、分析稀释剂或样品)中并且迁移到一个或多个相邻结合域时。为了减少冲走，应去除松散地结合的捕获分子并且应防止再沉积。即使不存在真正的交叉反应性，冲走也可能增加不同分析物之间的表观交叉反应性。
虽然不希望受理论束缚，但据信洗涤溶液的作用机制如下：洗涤溶液将松散地结合的捕获寡核苷酸带入溶液中，其可能潜在地通过SH共价结合或其它机制从所述溶液中再沉积到表面。如果捕获寡核苷酸与具有不同核苷酸序列的捕获寡核苷酸一起再沉积于结合域上，则其被视为污染捕获分子。污染捕获分子的存在可能干扰分析结果。在一个方面中，洗涤溶液相对于捕获寡核苷酸以极大摩尔过量(至少10,000×)包括水溶性含硫醇化合物(例如半胱氨酸)，其允许含硫醇化合物的硫醇基结合并且胜过松散捕获寡核苷酸以结合到表面上的可用位点。Triton X-100(0.1％)使表面与SH基团的反应性失活；并且Tris分子减少溶液中结合，可能是由于存在具有结合到表面的潜能的胺基团。在一个方面中，通过本文所描述的方法制备的阵列的结合域包括小于约0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％污染捕获分子。
在一个方面中，洗涤溶液包括含硫醇化合物、pH缓冲组分、表面活性剂或其组合，并且具有约7与约9之间的pH。
在一个方面中，洗涤溶液包括约5mM与约750mM之间、约10mM与约500mM之间、约25mM与约75mM之间或约50mM半胱氨酸。在一个方面中，表面活性剂是非离子表面活性剂，例如Triton X-100。在一个方面中，洗涤包括约10mM与约30mM之间，或约15mM与约25mM之间，或约20mM缓冲液，如Tris。在一个方面中，洗涤包括约0.05％与约0.5％之间，或约0.05％与0.2％之间，或约0.1％的表面活性剂，如Triton X-100。在一个方面中，洗涤溶液具有约7.5与约8.5之间或约8.0的pH。在一个方面中，洗涤缓冲液包括约15mM与约25mM之间的Tris、约pH 8.0、约0.05％与约0.15％之间的triton X-100以及约25mM与75mM之间的半胱氨酸。在一个更特定的方面中，洗涤包括约20mM Tris、约pH 8.0、约0.1％triton X-100和约50mM半胱氨酸。
在一个方面中，洗涤溶液的一种或多种组分以干燥形式提供于试剂盒中。在一个方面中，在试剂盒中提供液体稀释剂以用于重构洗涤溶液的一种或多种组分。
在一个方面中，所述试剂盒包括一个或多个包括标记的容器。在一个方面中，标记选自放射性、荧光、化学发光、电化学发光、光吸收、光散射、电化学、磁性和酶标记。在一个方面中，标记包括电化学发光标记。在一个方面中，标记包括有机金属络合物，其包括过渡金属。在一个方面中，过渡金属包括钌。在一个方面中，标记为MSD SULFO-TAGTM标记。
在一个方面中，标记包括一级结合试剂，其为二级结合试剂的结合伴侣。在一个方面中，二级结合试剂包括生物素、链霉亲和素、亲和素或抗体。在一个方面中，二级结合试剂包括亲和素、链霉亲和素或抗体。在一个方面中，标记包括选自生物素、荧光素和地高辛的半抗原。在一个方面中，标记为包括第一寡核苷酸序列的一级结合剂，并且二级结合试剂包括与一级结合剂的第一寡核苷酸序列互补的第二寡核苷酸序列。
在一个方面中，所述试剂盒包括一个或多个包括电化学发光标记的容器。在一个更特定的方面中，所述试剂盒包括一个或多个容器，其含有含Ru或含Os的有机金属化合物，如三联吡啶-钌(RuBpy)。在一个方面中，标记包括有机金属络合物，其包括过渡金属。在一个方面中，过渡金属包括钌。在一个方面中，标记包括MSD SULFO-TAGTM标记(马里兰州罗克维尔(Rockville,MD)MesoScale)。在另一方面中，所述试剂盒包括一个或多个含有鲁米诺或其它相关化合物的容器。
在一个方面中，所述试剂盒包括一个或多个具有一种或多种电化学发光共反应物的容器。在一个方面中，一种或多种电化学发光共反应物共价或非共价固定在支撑表面上。在一个方面中，一种或多种电化学发光共反应物固定在支撑表面的一个或多个工作电极上。
在一个方面中，所述试剂盒中包括的标记包括一级结合试剂和二级结合试剂。在一个方面中，二级结合试剂包括生物素、链霉亲和素、亲和素或抗体。
在一个方面中，所述试剂盒适用于多种分析。在一个方面中，所述试剂盒含于可再密封包或容器中。在一个方面中，包或容器大体上不透水。在一个方面中，包为箔，例如镀铝箔。在一个方面中，所述试剂盒和试剂以干燥状态储存，并且所述试剂盒可以包括干燥剂材料以将分析试剂维持在干燥状态。
在一个方面中，所述试剂盒包括支撑表面，其包括包装于干燥包装中的一种或多种固定化捕获寡核苷酸。在一个方面中，所述试剂盒包括在包装于干燥包装中之前用含硫醇洗涤溶液洗涤的支撑表面。在一个方面中，所述试剂盒包括支撑表面，其包括一种或多种固定化捕获寡核苷酸，其中支撑表面在其包装于干燥包装中之前不用含硫醇洗涤溶液洗涤。
在一个方面中，所述试剂盒包括以下分析组分中的一者或多者：一种或多种非交叉反应性捕获寡核苷酸；和一种或多种缓冲液，例如洗涤缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液或读取缓冲液。在一个方面中，杂交缓冲液包括核酸变性剂。在一个方面中，核酸变性剂包括甲酰胺。在一个方面中，杂交缓冲液提供为可以组合以形成杂交缓冲液的两种独立组分。在一个方面中，结合缓冲液包括表面活性剂。在一个方面中，读取缓冲液包括电化学发光(ECL)读取缓冲液。
在一个方面中，ECL读取缓冲液包括与ECL标记相互作用的化合物，其可称为ECL共反应物。常用共反应物包括用于来自Ru(Bpy)3 +2的ECL的叔胺(参见例如US 5,846,485)、草酸盐和过硫酸盐以及用于来自鲁米诺的ECL的过氧化氢(参见例如US 5,240,863)。在一个方面中，ECL共反应物包括叔胺。在一个方面中，ECL共反应物包括叔烷基胺。在一个方面中，ECL共反应物包括叔羟基烷基胺。在一个方面中，ECL共反应物包括两性离子叔胺。在一个方面中，ECL共反应物包括仲胺。在一个方面中，ECL共反应物选自：三丁胺(TBA)、(二丁基)氨基乙醇(DBAE)、(二乙基)氨基乙醇(DEAE)、三乙醇胺(TEA)、丁基二乙醇胺(BDEA)、丙基二乙醇胺(PDEA)、乙基二乙醇胺(EDEA)、甲基二乙醇胺(MDEA)、叔丁基二乙醇胺(tBDEA)、二丁胺(DBA)、丁基乙醇胺(BEA)、二乙醇胺(DEA)、二丁胺丙磺酸(DBA-PS)、二丁胺丁磺酸(DBA-BS)、丁基乙醇胺丙磺酸(BEA-PS)、丁基乙醇胺丁磺酸(BEA-BS)、二乙醇胺丙磺酸(也称为3-[双-(2-羟基-乙基)-氨基]-丙烷-1-磺酸；DEA-PS)或二乙醇胺丁磺酸(DEA-BS)。ECL共反应物描述于2020年7月1日提交并且标题为“用于分析测量的组合物和方法(COMPOSITIONSAND METHODS FOR ASSAY MEASUREMENTS)”的美国申请号63/047,167中，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。在一个方面中，所述试剂盒包括一种或多种分析组分，如标记。在一个方面中，标记为发光标记，如电化学发光标记。在一个方面中，所述试剂盒包括至少一种电化学发光共反应物。在一个方面中，电化学发光共反应物包括叔胺、三丙胺或正丁基二乙醇胺。
在一个方面中，标记包括一级结合试剂，其为二级结合试剂的结合对。在一个方面中，所述试剂盒包括二级结合试剂。在一个方面中，所述试剂盒包括一个或多个板孔中呈干燥形式的一种或多种分析组分。在一个方面中，所述试剂盒包括独特的试剂盒标识符。
在一个方面中，所述试剂盒包括一种或多种其它分析组分。在一个方面中，所述试剂盒包括一种或多种分析，包括但不限于稀释剂、封闭剂、稳定剂、清洁剂、盐、pH缓冲剂和防腐剂。在一个方面中，所述试剂盒包括一种或多种此类组分的容器。在另一方面中，一种或多种试剂包括于所述试剂盒的提供的分析支撑表面上。
在一个方面中，所述试剂盒包括结合缓冲液，其可以用于为将一种或多种探针结合到一个或多个靶核苷酸序列提供适当条件。在一个方面中，结合缓冲液包括表面活性剂。
在一个方面中，所述试剂盒包括可以用于为检测标记的存在提供适当条件的读取缓冲液。在一个方面中，所述试剂盒包括电化学发光读取缓冲液，其包括一种或多种电化学发光共反应物，包括例如叔胺、三丙胺和正丁基二乙醇胺。在一个方面中，所述试剂盒包括使用说明书或唯一试剂盒标识符。
在一个方面中，所述试剂盒包括一种或多种用于检测靶核苷酸序列中的单核苷酸多态性的分析组分。在一个方面中，所述试剂盒包括以下组分中的一者或多者：标记的寡核苷酸探针，其包括与所关注核酸中的靶序列互补的序列；一种或多种封闭探针；一种或多种核苷三磷酸；一种或多种标记的核苷三磷酸；标记的双脱氧核苷三磷酸；连接酶或聚合酶。
在一个方面中，所述试剂盒包括一种或多种，或多种标记的寡核苷酸探针，其具有与所关注核酸中的靶序列互补的第一序列和与捕获寡核苷酸互补的寡核苷酸标签。
在一个方面中，所述试剂盒包括一种或多种用于使用寡核苷酸连接分析鉴别、检测或定量靶核苷酸序列的分析组分，包括例如连接酶缓冲液或DNA连接酶。
在一个方面中，所述试剂盒包括一种或多种用于检测、鉴别或定量样品中的一个或多个靶核苷酸序列的分析组分，其中一个或多个靶核苷酸序列包括多态性核苷酸。在一个方面中，所述试剂盒包括至少一对寡核苷酸探针。在一个方面中，所述试剂盒包括用于多个靶核苷酸序列的多对寡核苷酸探针。在一个方面中，寡核苷酸探针对包括靶向探针和检测探针。在一个方面中，靶向探针包括与固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸的至少一部分互补的单链寡核苷酸标签和与样品中靶核苷酸序列的第一区互补的第一核酸序列。在一个方面中，检测探针包括标记和与靶核苷酸序列的第二区互补的第二核酸序列，所述第二区与靶向探针序列的第一核酸序列所互补的第一区相邻，其中靶向或检测探针包括位于靶核苷酸序列的多态性核苷酸上方的末端3'或5'核苷酸。在一个方面中，标记连接到检测探针的3'端。
在一个方面中，靶向探针具有与靶核苷酸序列的区互补的末端3'核苷酸，所述区与检测探针的5'末端核苷酸所互补的区相邻。在一个方面中，检测探针的末端5'核苷酸与靶核苷酸序列的多态性核苷酸互补。
在一个方面中，所述试剂盒包括结合靶核苷酸序列的第一和第二检测探针，其中所述第一和第二检测探针仅在末端5'核苷酸中不同。在一个方面中，第一检测探针与野生型序列互补并且第二检测探针与突变序列互补。
在一个方面中，所述试剂盒包括连接酶。在一个方面中，所述试剂盒包括一种或多种核苷三磷酸。
在一个方面中，所述试剂盒或方法包括一种或多种封闭探针。在一个方面中，一种或多种封闭探针用于增加分析灵敏度，例如用于检测罕见或低等位基因分数的癌症突变。在一个方面中，封闭探针用于通过防止模板分子将非连接探针桥接到可以与捕获寡核苷酸杂交并且从未连接的探针生成假信号的复合物中，减少OLA分析中的背景信号。在一个方面中，封闭探针包括单链核苷酸序列，其与靶核苷酸序列互补并且跨越探针连接位点，但不包括标签或标记。在一个方面中，封闭探针在很大程度上与探针序列共线性。在一个方面中，使用一对封闭探针，其包括具有与用于OLA分析的野生型或变异靶向探针相同的序列的第一封闭探针和具有与检测探针相同的序列的第二封闭探针，但不包括5'磷酸或3'标记。
在一个方面中，封闭探针包括至少约20、25、30、35、40、45或50并且至多约50、75、100、150或200，或约20与约200之间，或约50与约100之间的核苷酸。在一个方面中，一对封闭探针包括于连接反应混合物中，其中第一封闭探针具有与连接探针相同的序列，但不具有寡核苷酸标签；并且第二封闭探针具有与检测探针相同的序列，但不具有标记。在一个方面中，可以将至多2、3、4或5个额外核苷酸添加到与和探针序列相邻的靶核苷酸序列互补的封闭探针的5'和3'端。在一个方面中，所述试剂盒包括用于每对寡核苷酸探针的至少一对封闭探针。
在一个方面中，所述试剂盒包括一种或多种用于引物延伸分析的组分。在一个方面中，所述试剂盒包括一种或多种用于引物延伸分析的靶向探针。在一个方面中，所述试剂盒包括多个探针，其包括与样品中的多个靶核苷酸序列互补的靶向核酸序列。在一个方面中，所述试剂盒包括用于引物延伸分析的其它分析组分，包括例如聚合酶、一种或多种核苷三磷酸或一种或多种双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)。在一个方面中，所述试剂盒包括一种或多种标记或未标记的核苷三磷酸。在一个方面中，所述试剂盒包括标记或未标记的双脱氧核苷三磷酸。
在一个方面中，靶向探针包括与固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸的至少一部分互补的单链寡核苷酸标签；与样品中的靶核苷酸序列互补的靶向核酸序列；以及标记。在一个方面中，寡核苷酸标签连接到靶向探针的5'端，并且靶向核酸序列具有与相邻于样品中一个或多个靶核苷酸序列中的多态性核苷酸的核苷酸互补的3'端。在一个方面中，寡核苷酸标签连接到靶向探针的5'端，并且靶向核酸序列包括与样品中一个或多个靶核苷酸序列中的多态性核苷酸互补的末端3'核苷酸。
在一个方面中，所述试剂盒包括一种或多种靶特异性探针，其包括结合到所述试剂盒提供的支撑表面上的捕获寡核苷酸的寡核苷酸标签，以及对靶分析物具有特异性的结合伴侣。在一个方面中，所述试剂盒包括一种或多种靶特异性探针，其具有寡核苷酸标签和与一种或多种靶分析物中的核酸序列杂交的核酸序列。在一个方面中，最终用户生成用于所关注的一种或多种靶分析物的一种或多种靶特异性探针。
在一个方面中，所述试剂盒包括标记的核苷三磷酸。在一个方面中，所述试剂盒包括标记的核苷三磷酸和二级结合试剂。在一个方面中，标记的核苷三磷酸包括一级结合试剂，其为二级结合试剂的结合伴侣。在一个方面中，二级结合试剂包括亲和素、链霉亲和素或抗体，并且标记的核苷三磷酸包括生物素或半抗原标记。在一个方面中，标记的核苷三磷酸包括放射性、荧光、化学发光、电化学发光、光吸收、光散射、电化学、磁性或酶标记。在一个方面中，所述试剂盒包括标记有电化学发光标记的核苷三磷酸。在一个方面中，所述试剂盒包括与靶核苷酸序列的多态性核苷酸互补的标记的双脱氧核苷酸三磷酸。
在一个方面中，所述试剂盒包括支撑表面，如多孔板，例如96孔板，其中多孔板的每个孔包括固定在一个或多个结合域中的一种或多种捕获寡核苷酸。在一个方面中，多孔板的每个孔包括1与10个之间的结合域，其中独特捕获寡核苷酸固定在孔中的每个结合域中。在一个方面中，所述试剂盒还包括以下反应组分中的一者或多者：洗涤缓冲液、杂交缓冲液、标记、稀释剂和读取缓冲液。在一个方面中，洗涤缓冲液包括含硫醇化合物。在一个方面中，洗涤缓冲液为水溶液。在一个方面中，含硫醇化合物为水溶性的并且具有小于约200g/mol、175g/mol、150g/mol或125g/mol的分子量。在一个方面中，含硫醇化合物选自半胱氨酸、半胱胺、二硫苏糖醇、3-巯基丙酸酯、3-巯基-1-丙磺酸和其组合。在一个方面中，含硫醇化合物包括半胱氨酸。在一个方面中，标记包括电化学发光标记。在一个方面中，标记包括二级结合伴侣。在一个方面中，标记包括MSD Sulfo-Tag标记的链霉亲和素。
在一个方面中，提供一种用于检测样品中的靶核苷酸序列的试剂盒。在一个方面中，所述试剂盒包括：
(a)支撑表面，其包含一种或多种固定化捕获寡核苷酸；
(b)检测探针，其包含寡核苷酸标签、靶互补序列和检测寡核苷酸；
(c)扩增模板；
(d)核酸连接酶；
(e)核酸聚合酶；以及
(f)检测试剂，其包含标记和核酸序列。
在一个方面中，所述试剂盒还包括锚定试剂，其包括寡核苷酸标签和锚定寡核苷酸。在一个方面中，锚定试剂固定在支撑表面上。在一个方面中，锚定寡核苷酸的长度为约10到约30个核酸。在一个方面中，锚定寡核苷酸的长度为17或25个寡核苷酸。在一个方面中，锚定寡核苷酸具有包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:1669)的核苷酸序列。在一个方面中，锚定寡核苷酸具有由5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(SEQ ID NO:1665)组成的核苷酸序列。
在一个方面中，所述试剂盒包括具有5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列的线性扩增模板。在一个方面中，5'和3'末端核苷酸序列能够与检测序列杂交。在一个方面中，扩增模板具有能够与锚定试剂的锚定序列的互补序列杂交的内部核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板的5'和3'末端核苷酸序列不与内部序列重叠。在一个方面中，扩增模板具有能够与锚定试剂的锚定序列的互补序列杂交的第一内部核苷酸序列和能够与检测试剂的核酸序列的互补序列杂交的第二内部核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板的5'和3'末端核苷酸序列不与第一和第二内部序列重叠。在一个方面中，扩增模板包括5'末端磷酸基。
在一个方面中，扩增模板的长度为约53到约61个核苷酸。在一个方面中，扩增模板具有5'-GTTCTGTC-3'(SEQ ID NO:1666)的5'末端序列和5'-GTGTCTA-3'(SEQ ID NO:1667)的3'末端序列。在一个方面中，扩增模板具有包括5'-CAGTGAATGCGA GTCCGTCTAAG-3'(SEQID NO:1668)的核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板包含包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:1669)的核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板具有由5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAG TACAGCAAGAGTGTCTA-3'(SEQ ID NO:1670)组成的核苷酸序列。在一个方面中，扩增模板具有包括5'-GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTA GTACAGCAAGAGCGTCGA-3'(SEQ ID NO:1671)的核苷酸序列。
在一个方面中，扩增模板为环状扩增模板。
在一个方面中，检测探针包括单链DNA寡核苷酸标签、单链RNA靶互补序列和单链DNA检测寡核苷酸。在一个方面中，锚定试剂包括单链DNA寡核苷酸标签和单链DNA锚定序列。在一个方面中，试剂盒包括RNA酶。
在一个方面中，检测探针的检测寡核苷酸包括与扩增模板的5'末端序列互补的第一序列和与扩增模板的3'末端序列互补的相邻第二序列。在一个方面中，检测试剂的核酸序列具有与以下的14或15个连续核苷酸具有至少90％序列同一性的序列：5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:1672)。在一个方面中，检测试剂的核酸序列包括序列5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:1672)。在一个方面中，检测试剂的核酸序列包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:1668)。
在一个方面中，检测试剂的标记包含电化学发光(ECL)标记。
在一个方面中，支撑表面包括碳基支撑表面。在一个方面中，支撑表面包括碳基电极。在一个方面中，支撑表面包括碳墨电极。在一个方面中，支撑表面包括多孔板分析消耗品，并且板的每个孔包括碳墨电极。
在一个方面中，支撑表面包括珠粒。
在一个方面中，多种捕获寡核苷酸固定在固相支撑物上的离散结合域中以形成阵列。在一个方面中，多种捕获寡核苷酸和至少一种锚定试剂固定在固相支撑物上的离散结合域中以形成阵列，其中每个结合域包含多种捕获寡核苷酸中的一者和至少一种锚定试剂。
在一个方面中，固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸选自符合以下要求中的一者或多者的非交叉反应性寡核苷酸的集合：
(a)约40％与约50％之间的GC含量；
(b)约30％与约70％之间的AG含量；
(c)约30％与约70％之间的CT含量；
(d)不超过三个的序列中的最大碱基重复串；
(e)没有不需要的与连续超过7个互补碱基对匹配的串的寡核苷酸-寡核苷酸相互作用；
(f)没有不需要的与18个连续碱基或更少的串的寡核苷酸-寡核苷酸相互作用，其中：
(i)每一端的末端碱基是互补匹配；和
(ii)互补碱基对匹配之和减错配之和大于7；
(g)没有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个碱基对或更长的串匹配基因组中或自然界中的序列或序列的互补序列或两者；
(h)序列与其互补序列的杂交自由能差异小于约1kCal/mol、约2kCal/mol、约3kCal/mol或约4kCal/mol；
(i)没有在茎中具有4个或更多个连续匹配的预测发夹环；以及
(j)没有在茎中具有4个或更多个连续匹配且环大小大于6个碱基的预测发夹环。
在一个方面中，固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸选自：
(a)具有选自SEQ ID No:1-64的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；
(b)包含与选自SEQ ID No:1-64的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的捕获寡核苷酸；
(c)具有与选自SEQ ID No:1-64的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；
(d)包含选自SEQ ID No:1-64的序列的捕获寡核苷酸；以及
(e)选自(a)-(d)中的任一者的捕获寡核苷酸。
在一个方面中，固定在支撑表面上的捕获寡核苷酸选自：
(a)包含具有选自SEQ ID No:1-10的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的序列的捕获寡核苷酸；
(b)包含与选自SEQ ID No:1-10的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的捕获寡核苷酸；
(c)具有与选自SEQ ID No:1-10的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；
(d)包含选自SEQ ID No:1-10的序列的捕获寡核苷酸；以及
(e)选自(a)-(d)中的任一者的捕获寡核苷酸。
在一个方面中，提供一种用于检测样品中的靶核苷酸序列的试剂盒，其包括：
(a)支撑表面，其包括一种或多种固定化捕获寡核苷酸；
(b)锚定试剂，其包括寡核苷酸标签和锚定寡核苷酸；
(c)检测探针，其包括寡核苷酸标签、靶互补序列和单链DNA检测寡核苷酸；
(d)检测试剂，其包括电化学发光(ECL)标记和核酸序列；
(e)线性扩增模板，其包括5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中所述5'和3'末端核苷酸序列能够与检测序列杂交，能够与所述锚定试剂的锚定序列的互补序列杂交的第一内部核苷酸序列以及能够与所述检测试剂的核酸序列的互补序列杂交的第二内部核苷酸序列，其中所述扩增模板的所述5'和3'末端核苷酸序列不与所述第一和第二内部序列重叠；
(f)核酸连接酶；以及
(g)核酸聚合酶。
在一个方面中，锚定试剂固定在支撑表面上。在一个方面中，锚定试剂包括单链DNA寡核苷酸标签和单链DNA锚定寡核苷酸；并且检测探针包括单链DNA寡核苷酸标签、单链RNA靶互补序列和单链DNA检测寡核苷酸；并且其中试剂盒进一步包含RNA酶。
在一个方面中，提供一种用于检测样品中的靶核苷酸序列的试剂盒，其包括：
(a)支撑表面，其包括固定化捕获寡核苷酸；
(b)靶向探针，其包括单链寡核苷酸标签和与所述样品中的所述靶核苷酸序列的第一区互补的第一核酸序列；
(c)检测探针，其包括检测寡核苷酸和与所述靶核苷酸序列的第二区互补的第二核酸序列，其中所述靶向探针的所述第一核酸序列和所述检测探针的所述第二核酸序列与靶核苷酸的相邻序列互补；
(d)扩增模板；
(e)核酸连接酶；
(f)核酸聚合酶；以及
(g)检测试剂，其包括标记和核酸序列。
在一个方面中，靶向探针具有与靶核苷酸序列的区互补的末端3'核苷酸，所述区与检测探针的5'末端核苷酸所互补的区相邻。在一个方面中，靶向探针的末端3'核苷酸与靶核苷酸序列的多态性核苷酸互补。
在一个方面中，提供一种用于检测样品中的靶核苷酸序列的试剂盒，其包括：
(a)支撑表面，其包括固定化捕获寡核苷酸；
(b)锚定试剂，其包括寡核苷酸标签和锚定寡核苷酸；
(c)靶向探针，其包括单链寡核苷酸标签和与所述样品中的所述靶核苷酸序列的第一区互补的第一核酸序列；
(d)检测探针，其包括检测寡核苷酸和与所述靶核苷酸序列的第二区互补的第二核酸序列，其中所述靶向探针的所述第一核酸序列和所述检测探针的所述第二核酸序列与靶核苷酸的相邻序列互补；
(e)线性扩增模板，其包括5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中所述5'和3'末端核苷酸序列能够与检测序列杂交，能够与所述锚定试剂的锚定序列的互补序列杂交的第一内部核苷酸序列以及能够与所述检测试剂的核酸序列的互补序列杂交的第二内部核苷酸序列，其中所述扩增模板的所述5'和3'末端核苷酸序列不与所述第一和第二内部序列重叠；
(f)核酸连接酶；
(g)核酸聚合酶；以及
(h)检测试剂，其包括电化学发光(ECL)标记和核酸序列。
在一个方面中，试剂盒包括检测混合物，其包括线性扩增模板和一种或多种额外组分，所述额外组分选自：连接缓冲液、腺苷三磷酸(ATP)、牛血清白蛋白(BSA)、吐温20、T4DNA连接酶以及其组合。在一个方面中，检测混合物包括一种或多种用于滚环扩增的组分，其选自BSA、缓冲液、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、吐温20、Phi29 DNA聚合酶或其组合。在一个方面中，检测混合物包括乙酰BSA。
在一个方面中，试剂盒包括ECL读取缓冲液。
R.数据库
各种数据库是可获得的，其提供关于疾病和病症的遗传关联的信息并且提供可以与本文所描述的方法和试剂盒结合使用的信息和序列，包括但不限于以下：
遗传关联数据库(Genetic
Association
Database)
来自复杂疾病和病症的遗传关联数据的数据库。截至2014年9月1日，数据库被“冻结”。然而，截至2014年8月18日的所有数据可以文本或SQL格式下载。
geneticassociationdb.nih.gov
ClinVar
NCBI数据库，包括按致病性、突变类型等显示结果的过滤器。
ncbi.nlm.nih.gov/clinvar？term＝human％5Borgn％5D
新英格兰生物实验室(New England Biolabs)
提供所关注的常见基因的列表。
neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/genetic-markers
瓶中基因组(Genome in a bottle；GIAB)(生物计量学联合计划)
由NIST主办的公私学术联盟，用以开发技术基础设施，使得全人类基因组测序能够转化为临床实践。提供高度表征的参考材料的基因组。
jimb.stanford.edu/giab-resources/
ENSEMBL基因组浏览器
Ensembl是脊椎动物基因组的基因组浏览器，其为基因组学研究创建、集成和分发参考数据集和分析工具。
ensembl.org/index.html
COSMIC基因组浏览器
提供癌症中发现的体细胞突变的目录。
cancer.sanger.ac.uk/cosmic/browse/genome
NCI基因组数据共享(NCI Genomic Data Commons)
为癌症研究团体提供统一的数据存储库，其实现跨癌症基因组研究的数据共享以支持精准医学。
portal.gdc.cancer.gov
NCBI资源
涵盖SNP和其它变异体(插入、缺失、易位等)的dbSNP和dbVAR。
ncbi.nlm.nih.gov/snp
ncbi.nlm.nih.gov/dbvar
基因组变异体存档数据库(Database of Genomic Variants archive)
提供所有物种中可公开获得的基因组结构变异体的存档、增加和分发的存储库。
ebi.ac.uk/dgva
IGSR：国际基因组样本资源(TheInternational Genome Sample Resource)
千人基因组计划(1000genome project)的存储库。
internationalgenome.org/data
InSiGHT变异体数据库
InSiGHT容纳并且管理在促成胃肠癌的基因中重新排序的DNA变异体的最全面的数据库。
insight-group.org/variants/databases
UCSC基因组浏览器
genome.ucsc.edu
S.引用并入
本文所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等，以及其中引用的参考文献，就其尚未被引用的程度而言，出于所有目的在此以全文引用的方式并入本文中。
T.捕获寡核苷酸
表1：捕获寡核苷酸集合1：使用碱基寡核苷酸1号生成的36聚体非交叉反应性捕获寡核苷酸
/>
表2：捕获寡核苷酸集合2：使用碱基寡核苷酸2号生成的36聚体非交叉反应性捕获寡核苷酸
/>
/>
表3：捕获寡核苷酸集合3：使用碱基寡核苷酸3号生成的36聚体非交叉反应性捕获寡核苷酸
/>
表4：捕获寡核苷酸集合4：与使用碱基寡核苷酸1号生成的序列互补的36聚体非交叉反应性捕获寡核苷酸
/>
/>
/>
表5：捕获寡核苷酸集合5：与使用碱基寡核苷酸2号生成的序列互补的36聚体非交叉反应性捕获寡核苷酸
/>
/>
表6：捕获寡核苷酸集合6：与使用碱基寡核苷酸3号生成的序列互补的36聚体非交叉反应性捕获寡核苷酸
/>
/>
表7：捕获寡核苷酸集合7：具有与使用碱基寡核苷酸1号生成的序列反向的序列的36聚体非交叉反应性捕获寡核苷酸
/>
/>
/>
表8：捕获寡核苷酸集合8：具有与使用碱基寡核苷酸2号生成的序列反向的序列的36聚体非交叉反应性捕获寡核苷酸
/>
/>
表9：捕获寡核苷酸集合9：具有与作为使用碱基寡核苷酸3号生成的序列反向的序列的36聚体非交叉反应性捕获寡核苷酸
/>
/>
表10：捕获寡核苷酸集合10：具有与使用碱基寡核苷酸1号生成的序列反向互补的序列的36聚体非交叉反应性捕获寡核苷酸
/>
/>
/>
表11：捕获寡核苷酸集合11：具有与使用碱基寡核苷酸2号生成的序列反向互补的序列的36聚体非交叉反应性捕获寡核苷酸
/>
/>
表12：捕获寡核苷酸集合12：具有与使用碱基寡核苷酸3号生成的序列反向互补的序列的36聚体非交叉反应性捕获寡核苷酸
/>
/>
/>
U.寡核苷酸标签
表13：标签集合1：与使用碱基寡核苷酸1号生成的捕获序列杂交的24聚体非交叉反应性寡核苷酸标签
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表14：标签集合2：与使用碱基寡核苷酸2号生成的捕获寡核苷酸杂交的24聚体非交叉反应性寡核苷酸标签
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表15：标签集合3：与使用碱基寡核苷酸3号生成的捕获寡核苷酸杂交的24聚体非交叉反应性寡核苷酸标签
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表16：标签集合4：与使用碱基寡核苷酸1号生成的序列的互补序列杂交的24聚体非交叉反应性寡核苷酸标签
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表17：标签集合5：与使用碱基寡核苷酸1号生成的序列的互补序列杂交的24聚体非交叉反应性寡核苷酸标签
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表18：标签集合6：与使用碱基寡核苷酸3号生成的序列的互补序列杂交的24聚体非交叉反应性寡核苷酸标签
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表19：标签集合7：与使用碱基寡核苷酸1号生成的序列的反向序列杂交的24聚体非交叉反应性寡核苷酸标签
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表20：标签集合8：具有与使用碱基寡核苷酸2号生成的序列的反向序列杂交的序列的24聚体非交叉反应性寡核苷酸标签
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表21：标签集合9：具有与使用碱基寡核苷酸3号生成的序列的反向序列杂交的序列的24聚体非交叉反应性寡核苷酸标签
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表22：标签集合10：与使用碱基寡核苷酸1号生成的序列的反向互补序列杂交的24聚体非交叉反应性寡核苷酸标签
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表23：标签集合11：与使用碱基寡核苷酸2号生成的序列的反向互补序列杂交的24聚体非交叉反应性寡核苷酸标签
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表24：标签集合12：与使用碱基寡核苷酸3号生成的序列的反向互补序列杂交的24聚体非交叉反应性寡核苷酸标签
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表25.硫醇修饰的捕获寡核苷酸(36聚体)
V.样品信号放大试剂
表26提供可以用于放大来自10点分析的信号的10种锚定试剂的样本集合，其中每一锚定试剂包括5'寡核苷酸标签和3'锚定寡核苷酸。在下文提供的集合中，10种锚定试剂中的每一者包括相同锚定序列。
表27提供可以用于放大来自10点分析的信号的10种寡核苷酸探针的样本集合，其可以与表26中所示的10种锚定试剂的样本集合结合使用。在一个方面中，集合中的每个探针包括5'寡核苷酸标签、靶互补序列、多A接头和3'检测序列。在一个方面中，检测序列和多A接头对于集合中的每个寡核苷酸探针是相同的。
工作实例
本发明的范围不受本文描述的具体实施例的限制。实际上，根据前述描述和附图，除了本文中所述的修改之外，所述方法的各种修改对所属领域的技术人员来说也将变得显而易见。此类修改旨在落入权利要求书的范围内。
实例1.非相互作用捕获寡核苷酸的选择
使用软件来随机生成100,000到1,000,000个核苷酸序列的组。创建36聚体的多个组。在每一组内，消除不符合GC含量标准(40％≤GC含量≤50％)、AG含量标准(30％≤AG含量≤70％)和CT含量标准(30％≤CT含量≤70％)的序列，其中GC(或AG或CT)含量是指作为G或C(或者分别为A或G，或者C或T)的核苷酸的百分比。如果序列具有长于3个碱基的碱基重复序列片段，则也消除序列。在一组内，以从组中第一个随机选择的序列开始，在迭代过程中选择非相互作用序列的集合。额外序列基于其缺乏与已在集合中的序列的预测相互作用，一次一个地添加到集合中。如果序列符合以下标准，则将其添加到集合中：无法找到序列与自身、与集合的前一成员或与集合的前一成员的互补序列的比对，(a)其中存在连续超过7个互补碱基对匹配的连续系列，或(b)其中存在18个碱基或更少的序列，其中(i)每一端的末端碱基是互补匹配且(ii)互补碱基对匹配之和减错配之和大于7。使用此方法，可以鉴别大致50到150个序列的集合(例如，SEQ ID NO 1到64、65到122和123到186)。可以通过将原始集合之一中的所有序列反转或找到其互补序列来创建额外集合(例如，SEQ ID NO 187到250、251到308、309到372、373到436、437到494、495到558、559到622、623到680和681到744)。所述序列足够长，使得在自然界中找到匹配序列的概率极低。针对人类基因组对所选择的集合进行BLAST搜索未发现长于20个碱基对的任何匹配或互补序列。来自集合之一的10个序列和30个序列的子集(分别为SEQ ID NO 1到10、11到13、25到26、33到37、42、44到46、54和59到62)选择为具有杂交自由能(针对与24聚体探针杂交，所述探针与在35聚体5'端开始的36聚体序列的前24个核苷酸互补)，所述杂交自由能大致位于36聚体的全集的自由能分布的中心(自由能计算值范围为大致-24到大致-22kcal/mol)。10个寡核苷酸的集合用于展现这些序列在以下实例中作为捕获试剂的用途。
实例2.捕获寡核苷酸阵列的形成
在10点96孔板(Meso Scale Diagnostics,LLC.)上形成阵列。这些96孔板通过将注射成型的96孔板顶部粘附到限定孔的底部的麦拉薄片而形成。麦拉薄片的顶部表面上面印刷有丝网印刷碳墨电极，使得每个孔包括大致在孔的中心的碳墨工作电极和大致朝向孔的两个边缘的两个碳墨对电极。工作电极具有以图案印刷在其上的电介质(即，电绝缘墨水)，所述图案限定10个大致圆形的暴露工作电极区域(或“点”)，其限定阵列元件的位置。印刷在麦拉薄片底部上的电极通过导电通孔连接到薄片顶部，提供用于将电压施加到工作电极和对电极的触点。关于具有集成碳基电极的板的描述，参见例如美国专利号6,977,722和7,842,246。
通过将含有硫醇修饰的捕获寡核苷酸(使用通过6聚体聚乙二醇(PEG6)间隔子连接到寡核苷酸3'端的正巯基丙醇修饰，如以下结构中所示)的50nL小滴沉积在电极上的个别点上，在这些板上印刷SEQ ID 1到10的捕获寡核苷酸阵列。印刷溶液包括在含有磷酸钠、NaCl、EDTA、海藻糖和Triton X-100的缓冲溶液中的硫醇寡核苷酸，具有相对于使碳墨表面饱和所需的量过量的寡核苷酸，以及足够的Triton X-100，使得小滴扩散到由印刷的电介质墨水层限定的点的边缘。使小滴干燥过夜，在此期间寡核苷酸结合到碳墨表面。将板包装于具有干燥剂的密封袋中。
实例3.用于测量具有与阵列中的捕获寡核苷酸互补的序列的生物素标记的寡核苷酸的程序
在此程序中，如实例2中所描述制备具有捕获寡核苷酸阵列的板，并且使用其测量例如夹心杂交分析、寡核苷酸连接分析(OLA)和聚合酶延伸分析(PEA)的生物素标记的产物。程序包括初始封闭步骤，其中首先用封闭溶液处理阵列以溶解过量非固定化捕获寡核苷酸，同时防止非特异性点的交叉污染。总体程序包括以下步骤：
1.封闭
将50μL含有50mM L-半胱氨酸和0.1％(w/v)Triton X-100于20mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.0中的溶液(其中Tris是指三(羟甲基)氨基甲烷)添加到每个孔中。将板在室温(或37℃)下振荡培育30到60分钟。通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤孔三次来完成封闭步骤。
2.添加样品
将50μL含有生物素标记的产物于缓冲液中的测试样品添加到每个孔中，所述缓冲液为含有31％甲酰胺、400mM NaCl、1mM EDTA、0.01％ Triton X-100的20mM Tris-HCl，pH8.0。在添加样品之后，将板在37℃下振荡培育一小时以提供严格结合条件，在室温下冷却5分钟并且用PBS洗涤三次。
3.在严格条件下热浸(任选的)
将50μL 0.1×PBS(盐浓度为约15mM)添加到每个孔中，并且将板在37℃下振荡培育30分钟，之后将板在室温下冷却5分钟并且用PBS洗涤三次。此任选的步骤在如OLA分析等分析中提供改进的特异性，例如通过最小化生物素标记的OLA产物与错误捕获寡核苷酸的非特异性结合，或通过防止引导序列通过非共价杂交相互作用连接到生物素。
4.添加二级结合试剂
为了检测生物素标记的探针，将50μL含有1μg/mL标记有SULFO-TAG ECL标记(MesoScale Diagnostics,LLC.)的链霉亲和素于500mM NaCl、1mM EDTA、0.01％ Triton X-100、20mM Tris-HCl，pH 8.0中的溶液添加到每个孔中，并且将板振荡培育30分钟，之后将其用PBS洗涤三次。
5.ECL检测
为了测量来自ECL标记的ECL，将150μL含有丁基二乙醇胺(BDEA)作为ECL共反应物的ECL读取缓冲液(参见共同未决的专利申请62/787,892，标题为用于进行分析测量的组合物和的方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR CARRYING OUT ASSAY MEASUREMENTS)，2019年1月3日提交)添加到每个孔中，并且在SECTOR Imager 600或QuickPlex SQ120 ECL读板器上分析板。读板器接触板底部上的电触点，在每个孔内的工作电极和对电极两端施加电压波形，使ECL成像，并且报告与来自每一阵列元件的总ECL发射成比例的ECL信号。
实例4.捕获寡核苷酸阵列的均匀性和交叉反应性
使用与捕获寡核苷酸的前24个核苷酸(从5'端开始)互补的含生物素QC探针的集合(SEQ ID NO 745到754)，测试如实例2中所描述制备的许多板的涂布均匀性和阵列元件之间的交叉反应性。根据实例3中所描述的程序测试板，无任选的热浸步骤。使用的QC探针包括在3'端用生物素修饰进行修饰的探针，如以下结构中所示：
为了测量涂层的均匀性，用含有2pM的10种生物素标记的QC探针以及2nM的相同探针的非生物素修饰形式的混合物的样品测试六个板的所有孔。针对来自每一捕获寡核苷酸的ECL信号确定平均值和板内变异系数(CV)(即，来自给定板中给定点的信号的平均值和CV)。对于所有捕获寡核苷酸，跨六个版的平均板内CV小于5％，并且范围为3.6％到4.6％。对于所有捕获寡核苷酸，板内信号平均值的CV小于6％，并且范围为3.5％到5.5％。
为了测量阵列特异性(包括来自非互补序列的结合或来自捕获寡核苷酸交叉污染的交叉反应性)，将含有200pM的个别生物素标记的QC探针的样品添加到一个板中(每个QC探针8次重复，以及16个空白样品)。针对每个特异性样品的八次重复，确定每一个别QC探针对每一非特异性捕获核苷酸的中值交叉反应性，其中每个孔的交叉反应性计算为来自探针与具有非特异性捕获核苷酸的点结合的信号占来自探针与具有其特异性互补捕获核苷酸的点结合的信号的百分比(在不存在任何QC探针的情况下的非特异性背景信号校正之后)。对于90种可能的非特异性探针/捕获相互作用，81种(90％)具有0.01％或更小的交叉反应性并且最大交叉反应性为0.03％。
实例5.捕获寡核苷酸的接头的比较
使用模型12聚体捕获寡核苷酸和模型24聚体捕获寡核苷酸来比较寡核苷酸与用于将寡核苷酸连接到碳基电极的硫醇之间不同长度的接头的使用。接头包括如实例2中所描述的具有PEG6间隔子的接头、除3聚体聚乙二醇(PEG3)间隔子以外的类似接头和不具有聚乙二醇间隔子的接头，如下所示。
如实例2中所描述，将捕获寡核苷酸固定在96孔板中的碳电极上，并且在类似于实例4中所述条件的条件下用不同浓度的与捕获序列互补的生物素修饰的QC探针进行测试，不同之处在于在室温下在不存在甲酰胺的情况下进行杂交。图3展示对于不同接头随孔中探针分子数目而变的测量的ECL信号，并且证明对于12聚体和24聚体捕获寡核苷酸两者，来自QC探针与捕获寡核苷酸结合的ECL信号随接头长度增加而增加。
实例6.用于制备阵列的封闭条件的比较
比较用于从阵列中去除过量捕获寡核苷酸的封闭条件。如实例2中所描述制备具有印刷阵列的板并且如实例4中所描述对其进行封闭和洗涤，不同之处在于改变封闭溶液的组成。随后如实例4中所描述表征阵列的特异性。图4展示与具有SEQ ID NO:5的捕获寡核苷酸的点的交叉反应性，其由暴露于与其它捕获寡核苷酸互补的QC探针引起。所述图展示省略封闭步骤导致观察到显著交叉反应性，这是由于不同点上的捕获寡核苷酸的交叉污染。具有含BSA的PBS的常规封闭溶液仅提供边际改进。当使用Tris+Triton X-100作为封闭溶液时，观察到的交叉反应性显著改进。向Tris/Triton配制物中添加半胱氨酸进一步将交叉反应性降低到不可检测水平(≤0.01％)。然而，向配制物中添加BSA未引起相同改进。在独立实验中，确定5到50到500mM范围内的半胱氨酸浓度可有效封闭，并且还确定用BSA而非半胱氨酸进行封闭可能导致来自QC探针与其互补捕获寡核苷酸的所需相互作用的信号降低(数据未图示)。
适用于减少交叉污染的其它封闭剂(数据未图示)，尽管不如硫醇封闭剂(如半胱氨酸)有效，包括(i)用于降低杂交分析中的背景信号的聚合物，包括PS20、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(约1,000kD和约360kD)、聚蔗糖和聚乙二醇(约3kD和约10kD)，(ii)核酸和其它聚阴离子，包括鲑鱼精DNA、鲱鱼DNA、小牛胸腺DNA、剪切的多A、酵母tRNA；和肝素，(iii)单体和聚合蛋白质封闭剂，包括BSA和聚BSA，(iv)表面活性剂，包括十二烷基硫酸钠(SDS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、triton-100和吐温-20，以及(v)氢键去稳定剂，如甲酰胺和丙二醇。
应注意，可以在阵列制造期间和阵列包装之前进行封闭和洗涤步骤。然而，如果此步骤恰好在阵列使用之前进行，则实现最佳性能。在封闭之后，仍可能存在一些松散地结合的交叉污染寡核苷酸，其通过弱碱基-碱基相互作用与固定化寡核苷酸结合。这些通常将在分析中使用的严格杂交条件期间解离，但如果干燥并且长时间储存在阵列上，则可能变为不可逆地固定。
实例7.用于检测单核苷酸多态性(SNP)的寡核苷酸连接分析(OLA)的程序。
SNP的检测使用一对寡核苷酸探针进行，如图1中所示：(i)定向探针，其包括朝向5'端的包括选自SEQ ID NO:745到754的序列(即，与如实例2中所描述制备的阵列中的捕获寡核苷酸之一杂交的序列)的序列和3'端处与SNP位点处和下游的分析物核酸序列互补的第一探针序列(使得3'端与分析物中的SNP核苷酸互补)，以及(ii)检测探针，其具有与紧接在SNP上游的分析物核苷酸序列互补的第二探针序列，并且在3'末端包括生物素部分。在分析物和连接酶存在下，仅当定向探针匹配SNP核苷酸时探针对才连接。当比较SNP位置处的不同核苷酸水平(例如野生型核苷酸相对于突变核苷酸的水平)时，为每个替代方案提供定向探针。对于一些分析，用于SNP的OLA定向和检测探针的序列包括编码区的有义DNA链序列(对于BRAF1799、NRAS181和NRAS182)，而对于其它分析，OLA定向和检测探针的序列包括编码区的反义DNA链序列(对于TP53、PIK3CA、KRAS和APC)。
针对OLA探针中的每一者开发封闭寡核苷酸探针。封闭探针使用分析物结合部分(即，第一或第二探针序列)的匹配序列。在一些情况下，其还可以在3'或5'端具有与相邻于分析物上靶序列的相应核苷酸互补的几个(例如3个)额外核苷酸，但一般不需要这些额外核苷酸来提供封闭活性。
还针对可以用于测试探针的性能的每个野生型和突变靶创建合成DNA模板。
用于在寡核苷酸阵列上测试的七个SNP的OLA探针的序列列于下表26中，其中与捕获寡核苷酸互补的区以粗体展示。
表26：OLA探针序列
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OLA分析程序包括以下步骤：
1.制备OLA反应混合物
将待测试的核酸(例如基因组DNA、PCR扩增DNA、全基因组扩增DNA或合成DNA分析物)与每个定向探针、每个检测探针和500U/mL Taq DNA连接酶在Taq DNA连接酶反应缓冲液(新英格兰生物实验室)中组合。或者，可以使用HiFi Taq DNA连接酶缓冲液(新英格兰生物实验室)来改进连接特异性。对于高靶DNA水平(如在PCR产物中)，定向和检测探针分别处于5nM和100nM。对于低靶DNA水平，探针处于10nM和200nM浓度。
2.运行OLA反应
在热循环仪中，通过以下操作处理反应混合物：(i)加热到95℃持续2分钟，(ii)运行加热到95℃持续30秒随后冷却到62℃持续5分钟(对于具有低靶水平DNA的样品)或2分钟(对于具有高水平靶DNA的样品)的30个循环，以及(iii)加热到95℃持续5分钟。任选地，在最终加热条件之前，与第一和第二探针序列互补(或包括第一和第二探针序列)的封闭探针相对于OLA探针过量50倍，以防止定向和检测探针的非共价复合物再形成。
3.通过ECL分析测量OLA反应产物
稀释OLA反应产物以提供具有大致以下水平缓冲剂和盐的溶液：31％甲酰胺、400mM NaCl、1mM EDTA、0.01％ Triton X-100于20mM Tris-HCl，pH 8.0中。如实例3中所描述，分析此样品以检测反应产物。
任选地，可以在不添加连接酶的情况下重复所述过程以确定在不存在任何连接产物情况下的分析背景信号。当在SNP位置处测量多个替代核苷酸时，可以通过比较来自每一者的特异性信号来确定每一者的百分比。举例来说，当测量SNP位置处野生型和突变核苷酸的水平时，野生型(WT)的特异性信号可以由捕获野生型定向探针的阵列元件上测量的信号确定为SSWT＝SWT-BWT，其中SS为特异性信号，S为在连接酶存在下的信号并且B为在不存在连接酶的情况下的背景。类似地，突变体(M)的特异性信号由捕获突变体定向探针的阵列元件确定为SSM＝SM-BM。SNP位置处作为野生型或突变体的核苷酸的百分比分别计算为％WT＝SSWT/(SSWT+SSM)和％M＝SSM/(SSWT+SSM)。这些比率可以用于例如分析基因组DNA以鉴别杂合性。确定杂合性的可能％M阈值为％M<0.2(纯合野生型)、0.3<％M<0.7(杂合突变体)和0.8<％M(纯合突变体)。对于许多应用，也可以使用信号(S)而非背景校正的特异性信号(SS)来计算百分比。
实例8.使用OLA检测合成DNA靶中的SNP
运行OLA分析以检测包括黑色素瘤和结肠癌的癌症中常见的五种突变，BRAFc.1799T>A(p.V600E)；NRAS c.181C>A(p.Q61K)；PIK3CA c.1633G>A(p.E545K)、KRAS c.35G>A(p.G12D)和APC c.4348C>T(p.R1450*)，其中c.1799T>A表示核苷酸1799从T到A的基因突变，并且p.V600E表示编码的蛋白质的氨基酸600从V到E的所得变化。如实例7中所描述，使用模板序列作为分析物和对应的定向、检测和封闭探针(第1489-1523行)，使用热浸和封闭探针运行OLA分析。图5展示随每孔添加的模板分子(突变体或野生型)数目而变的来自BRAF突变(1799A)的分析的信号，并且证明所述分析相对于野生型对突变具有高特异性。图6展示随模板分子数目而变的所有十个分析的信号，并且证明分析信号随模板浓度线性增加。不同分析的检测限为每孔约2×105个分子。对于每一分析，表27比较正确模板的108个拷贝与在SNP位点处具有单一错配的模板的108个拷贝的测量信号。对于大部分分析，以108个模板分子的匹配与错配序列的信号比率提供的特异性大于100(对于WT>Mut取代，在87到629范围内)，表明分析应该能够检测在<1％野生型水平下的罕见突变。
表27：OLA分析的特异性
实例9.使用封闭寡核苷酸以降低非特异性分析背景。
OLA分析需要探针与分析物DNA(模板)杂交以进行连接。即使没有连接事件，探针和模板也可能保持杂交。此复合物可以结合到固定在板上的捕获寡核苷酸(通过定向探针)并且生成信号(通过检测探针)，此处称为桥接背景。在一个等位基因比其它等位基因丰度低(例如罕见癌症突变)的情况下，桥接背景可能与源自罕见等位基因分析物上的连接事件的信号相当，使得桥接背景可能被误解为实际的特异性信号，导致缺乏突变的样品的假阳性结果。
用于减低桥接背景的方法之一为将DNA杂交体在高温(95℃)下解链，并且快速冷却到4℃(或在冰上)。此程序有助于减低桥接背景，但达不到检测样品中低丰度突变所需的程度。另外，此方法难以控制，因此样品处置中的小变化(其在加热后多快冷却和加载到板期间的处置)可能潜在地为影响背景的非所需DNA复合物的形成创建条件。
为了评估桥接背景形成，如实例8中所描述制备OLA样品用于10重OLA分析(BRAF、NRAS181、PIK3CA、KRAS和APC)，不同之处在于不将连接酶添加到反应混合物中。在反应混合物中使用每反应109个拷贝的合成模板，并且在存在和不存在封闭寡核苷酸的情况下，如实例7中所描述在板上测试每分析孔1/10反应(108个拷贝/孔)。
如图7所示，对于在不存在封闭寡核苷酸的情况下测试的样品，背景范围在7,000与30,000个计数之间，推测起来是由于定向探针与检测探针通过与残余模板再杂交(“桥接”)的某一水平的非共价连接。在存在封闭寡核苷酸的情况下，相同样品的背景信号显著下降到180到550个计数。在不存在封闭寡核苷酸的情况下，桥接背景随模板浓度增加而增加(数据未图示)，在高模板浓度(例如，每孔108个拷贝和更高)下变得最显著。因此，封闭探针最适用于具有高模板浓度的实验条件(例如，在野生型序列的高背景下检测罕见癌症突变)。
实例10.封闭寡核苷酸对OLA灵敏度和特异性的影响。
为了评估封闭寡核苷酸对分析灵敏度和特异性的影响，在存在和不存在封闭寡核苷酸的情况下测试三个OLA分析：BRAF c.1799T>A(p.V600E)；NRAS c.181C>A(p.Q61K)；和NRAS c.182A>T(p.Q61L)。使用实例8中所描述的用于BRAF和NRAS181分析的合成模板和OLA探针并且针对NRAS182分析使用实例7中所列的序列(第1524-27行)制备OLA样品。如实例7中所描述测试OLA样品；在最终加热步骤之前添加和不添加封闭寡核苷酸的情况下测试每一样品。对于每一分析，表28比较在具有和不具有在加热和加载到板之前添加到样品中的封闭寡核苷酸的情况下，正确模板的2×108个拷贝与在SNP位点处具有单一错配的模板的2×108个拷贝的测量信号。表展示，添加封闭寡核苷酸对特异性信号(即，正确点上的靶的信号)仅具有边际效应，展示封闭寡核苷酸不降低分析敏感度。表还展示不正确点上的非特异性信号显著降低，引起特异性的改进。当将封闭寡核苷酸添加到样品中时，以108个模板分子的匹配序列与错配序列的信号比率提供的特异性改进至多15倍。通过将在存在封闭寡核苷酸的情况下的特异性除以在不存在封闭寡核苷酸的情况下的特异性来计算特异性改进。
表28：在存在和不存在封闭寡核苷酸的情况下测试的OLA分析的特异性。
实例11.使用热浸或封闭探针以降低OLA格式中的非特异性背景
实例3中用于捕获和测量生物素标记的寡核苷酸的程序在严格条件(包括高温)下进行杂交以最小化非特异性杂交反应。然而，在杂交之后和板洗涤之前冷却板在不太严格的条件下提供一些时间，其中有可能发生一些非特异性杂交反应，这可能持续通过洗涤步骤。减轻此影响的一种方法为快速冷却到4℃(或在冰上)以减缓非特异性杂交的动力学，但冷却板的时间可能难以控制。因此，开发了两种其它方法，发现其分别地或串联地极大降低观察到的非特异性杂交：使用封闭探针和使用热浸步骤。
使用实例2中所描述的板开发用于测量五种不同SNP的野生型和突变形式的10重OLA分析：NRAS c.182A>T、TP53 c.524G>A、PIK3CA c.1633G>A、KRAS c.35G>A和APCc.4348C>T。使用如实例8中所描述的用于PIK3C、KRAS和APC的合成模板和OLA探针，以及来自实例7中序列表(第1526-36行)的NRAS 182和TP53的额外序列制备OLA样品。在此分析中，发现用于KRAS SNP分析的生物素标记的检测探针捕获寡核苷酸阵列的点6上的捕获寡核苷酸具有弱相互作用，这导致在不存在连接的情况下所述点上的背景信号升高。图8展示如实例7中所描述但不存在分析物或连接酶并且不使用封闭寡核苷酸或热浸步骤的情况下运行分析时，观察到点6的背景信号升高。
在OLA方案期间的连接步骤完成后，但在最终95℃变性步骤之前，添加封闭寡核苷酸(相对于OLA探针过量50倍)。图8展示添加封闭探针显著降低非特异性结合的水平。
在将OLA产物培育到捕获寡核苷酸阵列并且洗涤阵列以去除过量未结合试剂之后进行热浸步骤。采用的热浸是在严格条件，即低盐(0.1×PBS)和高温(37℃)下再培育30分钟，这使弱结合的核苷酸解离并且随后被洗掉。图8展示热浸步骤(如同封闭探针)显著降低非特异性结合的水平。通过采用封闭探针和热浸步骤两者，可以实现甚至进一步的降低。封闭探针和热浸步骤对来自OLA产物的真实信号没有显著影响(数据未图示)。
实例12.使用OLA检测在全基因组扩增(WGA)产物和没有扩增的基因组DNA中的突变
就BRAF或NRAS基因中的突变来说杂合的细胞系选自ATCC收藏，如表29中所示。
表29：ATCC细胞系基因组DNA
使用REPLI-g扩增试剂盒(凯杰(QIAGEN))，10ng/反应对来自细胞系A2058和NCI-H1299的DNA进行全基因组扩增(WGA)；来自细胞系HL-60的DNA在不扩增的情况下用于OLA反应。如上文实例8中所描述进行OLA分析。两种WGA DNA样品用BRAF、NRAS181、PIK3CA、KRAS和APC分析进行测试，HL60 gDNA用BRAF、TP53、PIK3CA KRAS和NRAS182分析进行测试。5-15μgDNA样品用于OLA反应，并且2-6μg进入ECL分析孔。
对于对每一样品进行的每一分析，表30-32呈现具有靶突变的测量序列的百分比(如实例7中所描述计算)。<20％的测量突变百分比分类为纯合野生型样品，30％与70％之间的突变百分比分类为杂合(50％突变)并且高于80％的突变百分比分类为纯合突变体。表展示每一细胞系基于其预期基因型正确地分类。
表30.来自细胞系A2058(BRAF 1799T>A杂合)的WGA DNA的OLA结果。
表31.来自细胞系NCI-H1299(NRAS 181C>A杂合)的WGA DNA的OLA结果。
表32.来自细胞系HL-60(NRAS 182A>T杂合)的gDNA的OLA结果。
实例13.使用OLA检测PCR产物
为了产生模拟野生型背景下低水平突变的BRAF c.1799T>A和NRAS c.181C>A突变的模拟癌症样品，将来自不同ATCC细胞系的基因组DNA(表29)以预定水平混合以产生0到50％范围内的突变体水平。如表中所示，每一细胞系对于黑色素瘤中常见的三种突变之一为杂合的：BRAF c.1799T>A(p.V600E)；NRAS c.181C>A(p.Q61K)。为了产生BRAF c.1799T>A样品，将来自细胞系A2058和NCI-H1299的基因组DNA混合。为了产生NRAS c.181C>A样品，将来自细胞系A2058和NCI-H1299的基因组DNA混合。NRAS和BRAF扩增子通过聚合酶链反应(PCR)(35个循环，10ng基因组DNA输入)针对每一模拟癌症样品生成。
如实例8中所描述，对PCR扩增样品进行突变和野生型SNP的寡核苷酸连接分析。将PCR产物稀释，并且每20μl OLA混合物使用0.01μl；在板上测试每分析孔1/10OLA产物(0.001μl PCR产物/分析孔)。结果用于计算具有突变核苷酸的每一SNP的百分比。随突变核苷酸的预测百分比而变的计算百分比(基于细胞系DNA的混合物)提供在表33和34以及图9中。图和表展示计算比率紧密接近预测比率，并且还展示在几乎所有分析中，低至0.2％的突变率可以与纯野生型样品区分。
表33：BRAF 1799T>A突变：PCR扩增的基因组DNA的OLA结果
表34：NRAS 181C>A突变；PCR扩增的基因组DNA的OLA结果
实例14.用于检测单核苷酸多态性(SNP)的聚合酶延伸分析(PEA)的程序
SNP的检测使用图2所示寡核苷酸探针进行：定向探针，其包括朝向5'端的包括选自SEQ ID NO:745到754的序列(即，与如实例2中所描述制备的阵列中的捕获寡核苷酸之一杂交的序列)的序列和3'端处与SNP位点下游的分析物核酸序列互补的第一探针序列(使得3'端与分析物中SNP核苷酸下游一位的核苷酸互补)。在分析物、聚合酶和与SNP位点互补的生物素修饰的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)存在下，延伸定向探针以包括生物素修饰的核苷酸。当比较SNP位置处的不同核苷酸水平(例如，野生型核苷酸与突变核苷酸的水平)时，利用适合于SNP位置处的核苷酸的ddNTP在不同孔中重复反应。
PEA分析程序包括以下步骤：
1.制备PEA反应混合物
将待测试的核酸(例如基因组DNA、PCR扩增DNA、全基因组扩增DNA或合成DNA分析物)与50nM定向探针、2μM与所关注SNP核苷酸互补的每一生物素-ddNTP和未标记的ddNTP以及120U/mL TherminatorTM DNA聚合酶在反应缓冲液中组合。
2.运行PEA反应
在热循环仪中，通过以下操作处理反应混合物：(i)加热到96℃持续2分钟，(ii)运行加热到95℃持续30秒随后冷却到55℃持续30秒并且加热到72℃持续30秒的30个循环。
3.通过ECL分析测量PEA反应产物
稀释PEA反应产物以提供具有大致以下水平缓冲剂和盐的溶液：31％甲酰胺、400mM NaCl、1mM EDTA、0.01％ Triton X-100于20mM Tris-HCl，pH 8.0中。如实例3中所描述，分析此样品以检测反应产物。
可以任选地在不存在聚合酶的情况下重复测量以确定在不存在延伸探针的情况下的背景信号。如实例7中关于OLA格式所描述，检测给定SNP位置处不同核苷酸的分析的信号或背景校正特异性信号的比较可以用于估计样品中具有每一核苷酸的核酸的百分比。
实例15.使用PEA检测合成DNA靶中的SNP
引物延伸分析(PEA)的寡核苷酸探针被设计成用于检测黑色素瘤中常见的三种突变：BRAF c.1799T>A(p.V600E)；NRAS c.181C>A(p.Q61K)；和NRAS c.182A>T(p.Q61L)。针对所关注的每一SNP位置创建定向探针。相对于先前实例中的阵列，使用早期原型捕获阵列。定向探针列于下表35中，其中与捕获寡核苷酸互补的区以大写字母展示：
表35：定向探针
如实例14和3中所描述使用模板序列作为分析物运行分析，不同之处在于使用不同捕获序列。在此实验中，不使用热浸步骤。图10展示随每孔添加的模板分子(突变体或野生型)数目而变的来自BRAF突变(1799A)的分析的信号，并且证明所述分析相对于野生型对突变具有高特异性。图11展示随模板分子数目而变的所有六个分析的信号(对于每一分析使用正确模板)，并且证明分析信号随模板浓度线性增加。不同分析的检测限为每孔约5×105个分子。对于每一分析，表36比较正确模板的108个拷贝与在SNP位点处具有单一错配的模板的108个拷贝的测量信号。以108个模板分子的匹配与错配序列的信号比率提供的特异性在大致102到103范围内，表明分析应该能够检测在<1％野生型水平下的罕见突变。
表36.PEA分析的特异性
实例16.使用PEA检测PCR产物
NRAS和BRAF扩增子使用从表29中所示的ATCC细胞系提取的基因组DNA通过聚合酶链反应(PCR)(35个循环，60ng基因组DNA输入)生成。如表中所示，每一细胞系对于黑色素瘤中常见的三种突变之一为杂合的：BRAF c.1799T>A(p.V600E)；NRAS c.181C>A(p.Q61K)；或NRAS c.182A>T(p.Q61L)。为了产生模拟野生型背景下低突变水平的模拟癌症样品，将细胞系DNA以预定水平混合以产生0到50％范围内的突变体水平。为了产生BRAF c.1799T>A样品，将来自细胞系A2058和NCI-H1299的基因组DNA混合。为了产生NRAS c.181C>A样品，将来自细胞系A2058和NCI-H1299的基因组DNA混合。为了产生NRAS c.182A>T样品，将来自细胞系A2058和HL-60的基因组DNA混合。
如实例15中所描述，对样品进行突变和野生型SNP的引物延伸分析。对于每一样品，测试PCR产物的两种不同稀释液。结果用于计算具有突变核苷酸的每一SNP的百分比。随突变核苷酸的预测百分比而变的计算百分比(基于细胞系DNA的混合物)以表和图形格式提供：BRAF 1799T>A结果(表37和图12)；NRAS 181C>8结果(表38和图13)；NRAS 182A>T结果(表39，图14)。图和表展示计算比率紧密接近预测比率，并且还展示在几乎所有分析中，低至0.2％的突变率可以与纯野生型样品区分。
表37：BRAF 1799T>A突变：基因组DNA的PEA结果
表38：NRAS 181C>A突变；基因组DNA的PEA结果
表39：NRAS 182A>T突变；基因组DNA的PEA结果
实例17.用于检测囊性纤维化(CF)突变的寡核苷酸连接分析(OLA)
囊性纤维化(CF)由囊性纤维化跨膜传导调控因子(CFTR)基因中的突变引起。最常见的突变ΔF508为三个核苷酸的缺失(Δ表示缺失)，其导致蛋白质上第508位处的氨基酸苯丙氨酸(F)损失。ΔF508突变占全世界CF病例的三分之二(66％-70％)和美国病例的90％。ΔF508突变在北欧血统的人中比率最高。其次常见的突变为G542X突变，其占美国CF病例的约5％。
可以使用实例7中所描述的方法检测CF突变。用于检测CF突变的OLA探针在表40中列出。与捕获寡核苷酸互补的区以粗体展示。
表40：用于CF测试的OLA探针序列
实例18.用于检测BRCA突变的寡核苷酸连接分析(OLA)
BRCA突变为BRCA1或BRCA2基因中的种系突变，所述基因为肿瘤抑制基因。这些基因中的突变可能在受影响的人中产生遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征。这些基因中的常见突变包括BRCA1*185delAG(外显子2)BRCA1*5382insC(外显子20)和BRCA2*6174delT(外显子11)。
可以使用实例7中所描述的方法检测BRCA突变。用于检测BRCA突变的OLA探针在表41中列出。与捕获寡核苷酸互补的区以粗体展示。
表41：用于BRCA测试的OLA探针序列
实例19.肺癌SNP组
开发一组与肺癌发展风险增加相关的9个SNP。这些突变为：
-rs1801133(MTHFR C677T)
-rs1801270(CDKN1A c.93C>A)
-rs3842(ABCB1 c.*193A>G)
-rs1051730(CHRNA3 D398N)
-rs8034191(LOC123688或HYKK c.337+256T>C)
-rs212090(ABCC1 c.*866T>A)
-rs2273535(AURKA F31I)
-rs17879961(CHEK2 c.599T>C)
-rs2243828(MPO c.-764T>C)
用于每一突变的探针序列提供于以下表42(上游)和43(下游)中。
表42：上游探针
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表43：下游探针
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为了测试每一突变的探针，选择来自第1或第2链的探针并且针对从HL-60细胞系提取的DNA进行测试。DNA使用Gentra Puregene细胞试剂盒(凯杰目录号158388)提取，并且10ng DNA使用MyTaq HS主混合物(Bioline目录号BIO-25045)以及表44和45中分别展示的分析特异性PCR正向和反向引物进行扩增。
表44：PCR正向引物
表45：PCR反向引物
在扩增之后，如实例7中所描述进行OLA并且确定WT和突变等位基因的频率。每一SNP的结果展示于表46中。
表46：WT和突变等位基因的频率
| 分析 | 野生型％ | 突变体％ | 基因型 |
| MTHFR rs180113 | 57.2 | 42.8 | 杂合 |
| CDKN1A rs1801270 | 99.9 | 0.1 | 纯合(WT) |
| ABCB1 rs3842 | 47.6 | 52.4 | 杂合 |
| CHRNA3 rs1051730 | 99.9 | 0.1 | 纯合(WT) |
| LOC123688rs8034191 | 99.0 | 1.0 | 纯合(WT) |
| ABCC1 rs212090 | 51.4 | 48.6 | 杂合 |
| AURKA rs2273535 | 99.5 | 0.5 | 纯合(WT) |
| CHEK2 rs17879961 | 99.2 | 0.8 | 纯合(WT) |
| MPO rs2243828 | 46.4 | 53.6 | 杂合 |
实例20.使用RNA酶保护分析进行miRNA检测
RNA酶保护分析可以用于miRNA定量。在分析中，使用DNA/RNA嵌合探针，其含有与捕获寡核苷酸序列互补的寡核苷酸标签序列和miRNA互补序列。寡核苷酸标签序列可以是包括于嵌合探针的5'端上的单链DNA(ssDNA)序列，并且miRNA互补序列可以是嵌合探针的3'端处的单链RNA(ssRNA)序列，伴随末端3'生物素。miR-122的序列展示于表47中并且嵌合探针展示于表48中。
简单来说，可以如下检测miRNA：
1).在热循环仪中使miRNA与嵌合探针杂交以形成杂交产物；
2).使用一种或多种已知封闭剂封闭分析板；
3).在杂交产物的寡核苷酸标签序列可以与分析板上的捕获寡核苷酸杂交的条件下，将具有甲酰胺的杂交产物添加到封闭的分析板中。在37℃下培育；
4).用RNA酶A或RNA酶I对ssRNA进行板上消化(30℃-37℃)以消化以下：
a).未与探针杂交的ssRNA；
b).在不具有互补miRNA的情况下与板杂交的探针；和
c).与嵌合探针具有少到单碱基错配的RNA；
5).添加SULFO-TAG标记的链霉亲和素(SA-SULFO-TAGTM)(马里兰州罗克维尔MesoScale Diagnostics,LLC)并且在室温下培育；
6).将读取缓冲液B添加到分析板中并且用MSD成像器测量ECL信号生成；以及
7).将结果相对于校准曲线进行比较用于定量。
以上方案用于检测合成miR-122miRNA。结果展示，在160fM浓度下检测到miR-122，表示对实现500fM的相同miRNA的检测的Rissin等人,《公共科学图书馆·综合(PLOS One)》(2017)报道的结果的改进。
表47：miR-122靶序列
| 靶 | 靶序列 | SEQ ID NO: |
| miR-122 | UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG | 1644 |
表48：miR-122嵌合探针
实例21.使用三种方案(RNA酶保护、使用Taq DNA连接酶的OLA和使用T4 DNA连接酶的OLA)进行ASO检测
使用三种不同方案检测模型DNA ASO(GGC TAA ATC GCT CCA CCA AG；SEQ ID NO:1646)：RNA酶保护分析、利用Taq DNA连接酶的OLA和利用T4 DNA连接酶的OLA。所有三种方案中使用的缓冲液如下：封闭缓冲液含有Tris-HCl、清洁剂和半胱氨酸；杂交缓冲液1(“HB1”)含有Tris-HCl、清洁剂、EDTA、盐和甲酰胺；在所有三种方案中使用的杂交缓冲液2(“HB2”)含有Tris-HCl、清洁剂和EDTA；稀释缓冲液含有Tris-HCl、清洁剂、EDTA和盐。
A.RNA酶保护分析
在校准品与两个空白之间用4倍稀释来建立10点校准曲线。最高校准品(Cal-1)浓度为166pM(约1×108个拷贝/μL)。分析物或校准品最初在水中或在血浆中稀释以展现用例情境，其中血浆为最有可能的样品类型。起始样品大小为20μL。
向血浆样品中添加2×RNAsecure(20μL)，并且将混合物加热到60℃持续10分钟。随后将具有嵌合探针的5×主混合物添加(10μL)到样品中。使用以下方案使样品与探针杂交：80℃-2分钟；65℃-5分钟(随后降低1℃到50℃，各自持续5分钟)；37℃-保持。
在杂交期间，将板在37℃下用封闭缓冲液封闭30分钟。将杂交产物在杂交缓冲液2中稀释到75μL，并且将30μL添加到含有20μL杂交缓冲液1的2个孔中(2:3之比的HB1:HB2/样品)。在37℃下进行与板的杂交1小时。
将RNA酶I添加到板中并且在37℃下完成消化30分钟。将链霉亲和素A-SULFO-TAG(在稀释缓冲液中)添加到孔中并且在RT下培育30分钟。添加分析读取缓冲液并且读取板。
B.利用Taq DNA连接酶的OLA
建立10点校准曲线，在校准品与两个空白之间4倍稀释。最高校准品(Cal-1)浓度为166pM(约1×108个拷贝/μL)。分析物或校准品最初在水中或在血浆中稀释以展现用例情境，其中血浆为最有可能的样品类型。起始样品大小为10μL。
制备含有探针、Taq DNA连接酶和Taq连接酶缓冲液的2×主混合物。将25μL添加到每一样品(10μL)和水(15μL)中，随后进行OLA。OLA循环如下进行：95℃-2分钟；95℃-30秒；37℃-5分钟；4℃-保持。
在循环期间，将板在37℃下用封闭缓冲液封闭30分钟。将OLA产物在杂交缓冲液2中稀释到75μL，并且将30μL添加到含有20μL杂交缓冲液1的2个孔中(2:3之比的HB1:HB2/样品)。在37℃下进行与板的杂交1小时。在杂交之后，将链霉亲和素-SULFO-TAG(在稀释缓冲液中)添加到孔中并且在RT下培育30分钟。添加分析读取缓冲液并且读取板。
C.利用T4 DNA连接酶的OLA
建立10点校准曲线，在校准品与两个空白之间4倍稀释。最高校准品(Cal-1)浓度为166pM(约1×108个拷贝/μL)。分析物或校准品最初在水中或在血浆中稀释以展现用例情境，其中血浆为最有可能的样品类型。起始样品大小为20μL。
用探针和T4 DNA连接酶缓冲液制备2×主混合物，并且将其添加(20μL)到样品中。通过斜升到95℃持续2分钟并且以50％斜变速率冷却到65℃且接着以3％斜变速率冷却到4℃，使样品与探针杂交。添加T4 DNA连接酶并且在RT下完成连接30分钟。通过在65℃下培育10分钟使酶失活。
在连接/失活期间，将板在37℃下用封闭缓冲液封闭30分钟。将连接产物在杂交缓冲液2中稀释到75μL，并且将30μL添加到含有20μL杂交缓冲液1的2个孔中(2:3之比的HB1:HB2/样品)。在37℃下进行与板的杂交1小时。在杂交之后，将链霉亲和素-SULFO-TAG(在稀释缓冲液中)添加到孔中并且在RT下培育30分钟。添加分析读取缓冲液并且读取板。
实例22.使用两种方案(一步和两步)进行ADA检测
开发了两种用于检测针对反义寡核苷酸的抗药物抗体(ADA)的方法。相同的靶向探针和检测探针可以用于任一方法中。靶向探针可以包括12聚体寡核苷酸标签序列GACATGATCGGT(SEQ ID NO:1647)或24聚体寡核苷酸序列ACTGGTAACCCAGAC ATGATCGGT(SEQID NO:745)和反义寡核苷酸序列(ASO)。如果需要，可以在寡核苷酸标签序列与ASO之间包括间隔序列。检测探针包括生物素标记和与靶向探针一起使用的相同反义寡核苷酸序列。
A.“一步”
“一步”ADA检测方法的示意图展示于图19中。
简单来说，将至少约250nM靶向探针和至少约250nM检测探针与可能包括针对靶向探针和检测探针上的ASO的抗药物抗体(ADA)的样品在聚丙烯板中组合以形成混合物。将混合物在室温下振荡(700rpm)培育1小时，以允许ADA(如果存在于样品中)结合到靶向探针和检测探针上的ASO。
将上面有具有与寡核苷酸标签序列互补的核苷酸序列的捕获寡核苷酸的96孔N-PLEX板(MSD)用每孔50μL N-PLEX封闭剂封闭，并且在37℃下振荡(700rpm)培育30分钟。随后洗涤板，并且将50μL来自聚丙烯板的混合物转移到N-PLEX板的每个孔中，并且在室温下振荡(700rpm)培育1小时，以允许混合物中的靶向探针的寡核苷酸标签与固定在板上的捕获寡核苷酸杂交。洗涤板以从混合物中去除未结合物种，并且将50μL含链霉亲和素-SULFO-TAG的稀释剂添加到N-PLEX板的每个孔中且在RT下振荡(700rpm)培育30分钟，以允许链霉亲和素-SULFO-TAG结合到固定在板上的任何检测探针上的生物素部分。洗涤板，将150μLMSD读取缓冲液添加到板的每个孔中，并且确定ADA的存在。
如果针对ADA进行测试的样品还含有显著水平的ASO药物(例如，如果样品来自接受且尚未清除药物的患者)，则样品中的ASO可能以与ADA的复合物形式存在。如果发生这种情况，则循环ASO可能阻断ADA与靶向和检测探针的结合并且干扰分析对ADA的检测。在一个方面中，测试所述分析以确定所述分析对样品中ASO存在的敏感度，以确定样品中存在何种水平ASO会干扰ADA的测量。在一个方面中，如果所述分析对来自样品中的ASO的干扰敏感，则所述方法包括在进行所述分析之前使样品中的ASO与ADA解离的一个或多个步骤。在一个方面中，通过使样品暴露于变性或以其它方式不稳定ASO与ADA之间的结合相互作用但维持ADA完整性的条件来实现解离。在一个方面中，通过酸化样品来实现解离。在一个方面中，通过使样品呈碱性来实现解离。在一个方面中，通过加热样品来实现解离。在一个方面中，通过将变性剂添加到样品中来实现解离。在一个方面中，将样品与靶向和检测探针在稳定形成ADA-ASO复合物的条件下组合，例如通过中和已被酸化或制成碱性的样品，通过冷却已加热的样品，或通过稀释已用变性剂处理的样品。在一个方面中，在测试之前，在样品中选择性地降解ASO。在一个方面中，基于核酸和蛋白质的不同性质，选择性地降解ASO。在一个方面中，酶促选择性降解ASO，例如使用能够水解磷酸二酯键的酶，如核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶或其它非特异性核酸酶、磷酸化酶或磷酸单酯酶。在一个方面中，酶促降解ASO，但通过在进行分析之前抑制核酸酶来防止探针降解。
在一个方面中，使用特异性结合到靶向和检测探针上的ASO的阳性对照ADA以评估来自循环ASO的干扰，例如通过在含有阳性对照抗体的样品加入不同浓度的ASO。在另一方面中，与靶向探针和检测探针的ASO核苷酸序列杂交的阳性对照寡核苷酸用于优化分析条件(图20)。
B.“两步”
“两步”ADA检测方法的示意图展示于图21中。
将上面有具有与寡核苷酸标签序列互补的核苷酸序列的捕获寡核苷酸的96孔N-PLEX板(MSD)用50μL/孔的N-PLEX封闭剂封闭，并且在37℃下振荡(700rpm)培育30分钟。随后洗涤板，并且将50μL含有至少约250nM靶向探针的杂交缓冲液的混合物添加到N-PLEX板的每个孔中，并且在37℃下振荡(700rpm)培育1小时，以允许靶向探针的寡核苷酸标签与板上杂交的捕获寡核苷酸杂交。随后洗涤板，并且将50μL可能包括针对靶向探针上的ASO的抗药物抗体(ADA)的样品和至少约250nM检测探针与稀释剂的组合添加到N-PLEX板的每个孔中，并且在室温下振荡(700rpm)培育1小时，以允许ADA(如果存在)特异性结合到固定在板上的靶向探针的ASO。随后洗涤板，并且将50μL含检测探针的稀释剂添加到N-PLEX板每孔中，并且在室温下振荡(700rpm)培育1小时，以允许检测探针的ASO结合到固定在板上的ADA。洗涤板，并且将50μL含链霉亲和素-SULFO-TAG的稀释剂添加到N-PLEX板的每个孔中，并且在室温下振荡(700rpm)培育30分钟，以允许链霉亲和素结合到固定在板上的检测探针的生物素部分。洗涤板并且每孔添加150μL MSD读取缓冲液，并且确定ADA的存在。
如果针对ADA进行测试的样品还含有显著水平的ASO药物(例如，如果样品来自接受且尚未清除药物的患者)，则样品中的ASO可能以与ADA的复合物形式存在。如果发生这种情况，则循环ASO可能阻断ADA与靶向和检测探针的结合并且干扰分析对ADA的检测。在一个方面中，测试所述分析以确定所述分析对样品中ASO存在的敏感度，以确定样品中存在何种水平ASO会干扰ADA的测量。在一个方面中，如果所述分析对来自样品中的ASO的干扰敏感，则所述方法包括在进行所述分析之前使样品中的ASO与ADA解离的一个或多个步骤。在一个方面中，通过使样品暴露于变性或以其它方式不稳定ASO与ADA之间的结合相互作用的条件来实现解离。在一个方面中，通过酸化样品来实现解离。在一个方面中，通过使样品呈碱性来实现解离。在一个方面中，通过加热样品来实现解离。在一个方面中，通过将变性剂添加到样品中来实现解离。在一个方面中，将样品与靶向和检测探针在稳定形成ADA-ASO复合物的条件下组合，例如通过中和已被酸化或制成碱性的样品，通过冷却已加热的样品，或通过稀释已用变性剂处理的样品。
在一个方面中，在测试之前，在样品中选择性地降解ASO。在一个方面中，基于核酸和蛋白质的不同性质，选择性地降解ASO。在一个方面中，酶促选择性降解ASO，例如使用能够水解磷酸二酯键的酶，如核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶或其它非特异性核酸酶、磷酸化酶或磷酸单酯酶。在一个方面中，酶促降解ASO，但通过在进行分析之前抑制核酸酶来防止探针降解。
在一个方面中，使用特异性结合到靶向和检测探针上的ASO的阳性对照ADA以评估来自循环ASO的干扰，例如通过在含有阳性对照抗体的样品加入不同浓度的ASO。在另一方面中，与靶向探针和检测探针的ASO核苷酸序列杂交的阳性对照寡核苷酸用于优化分析条件(图20)。
实例23.用延伸检测序列检测反义寡核苷酸(ASO)
使用MSD的N-PLEX平台检测寡核苷酸传统上使用并入探针或引物中的生物素化寡核苷酸进行，其使用链霉亲和素标记的SULFO-TAGTM检测。在此实例中，通过使用模型20聚体反义寡核苷酸(ASO)的新颖嵌合探针，用检测寡核苷酸替换探针上的生物素来放大RNA酶保护分析中的信号。生成嵌合探针(图24中所示)，其包括5′端DNA寡核苷酸标签(5'ACTGGTAACCCAGACATGATCGGT 3')(SEQ ID NO:745)，接着是RNA靶互补序列(5'CUUGGUGGAGCGAUUUAGCC 3')(SEQ ID NO:1663)，以及3'端DNA检测序列(5'GACAGAACTAGACAC 3')(SEQ ID NO:1664)。生成锚定试剂(图24中所示)，其包括5'端DNA寡核苷酸标签(5'ACTGGTAACCCAGACATGATCGGT 3')(SEQ ID NO:745)和DNA锚定序列(5'AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA 3')(SEQ ID NO:1665)。
方法在图22中示意性地展示并且描述如下。
使用模型ASO生成校准曲线，例如，如实例21中所描述。
将上文所描述的嵌合探针和锚定试剂添加到包括模型ASO分析物的样品中，并且使其杂交以形成反应产物(ASO/探针复合物)。
将上面固定有捕获寡核苷酸的MSD N-PLEX板在37℃下用封闭缓冲液封闭30分钟，并且用含有杜氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco's phosphate-buffered saline)(1×DPBS)的洗涤缓冲液洗涤。将包括反应产物(ASO/探针复合物)的样品添加到MSD N-PLEX板中并且在37℃下培育1小时，以使ASO/探针复合物与MSD N-PLEX板杂交。随后将板用1×DPBS洗涤，之后进行严格洗涤步骤(0.1×DPBS在37℃下持续30分钟，以约700rpm振荡)。随后洗涤板(1×DPBS)并且添加RNA酶I且在37℃下培育30分钟以降解未结合探针(即，固定在板上但不与ASO杂交的探针)中的RNA。随后洗涤板(1×DPBS)并且添加增强试剂(E1：线性模板；E2：乙酰BSA；以及E3：T4连接酶)，并且在RT下培育30分钟。随后用MSD洗涤缓冲液(PBS-T)洗涤板，并且添加检测试剂(D1)和Phi29聚合酶(D2)且在27℃下培育1小时。随后用MSD洗涤缓冲液(PBS-T)洗涤板，添加MSD GOLD读取缓冲液并且检测ASO的存在。
在N-PLEX上使用S-PLEX以及RNA酶保护分析使ASO的检测限增加10倍或更多，但观察到背景信号的增加和阳性信号的增加。
实例24：用延伸检测序列检测反义寡核苷酸(ASO)
在此实例中，使用省略严格洗涤步骤的修改的分析检测来自实例23的ASO。结果类似于来自实例23中使用的分析的结果。
实例25.使用寡核苷酸连接分析(OLA)和延伸检测序列检测反义寡核苷酸(OLA)
在此实例中，使用寡核苷酸连接分析(OLA)以及延伸检测序列检测来自实例23的模型反义寡核苷酸(ASO)。
简单来说，通过将模型ASO与定向探针(在本文中也称为靶向探针)和检测探针在Taq DNA连接酶反应缓冲液中组合来制备OLA反应混合物。OLA反应在热循环仪中运行以生成反应产物。
我们还能够确定这对于寡核苷酸连接分析(OLA)介导的ASO检测来说是可行的选项。
Claims (95)
1.一种检测样品中包含靶核酸序列的靶寡核苷酸的方法，所述方法包含：
(a)使所述样品与包含寡核苷酸标签、靶互补序列和检测寡核苷酸的检测探针在如下条件下接触：所述靶互补序列与所述靶寡核苷酸的所述靶核酸序列杂交，以形成反应产物；
(b)使上面固定有捕获寡核苷酸的支撑表面与含有所述反应产物的混合物在如下条件下接触：所述反应产物的所述寡核苷酸标签与所述捕获寡核苷酸杂交，以形成固定化检测复合物；
(c)使所述固定化检测复合物与包含扩增模板的检测混合物接触；
(d)扩增所述扩增模板以形成包含一个或多个包含检测标记位点的核酸序列的扩增子；
(e)使所述扩增子与包含标记和与所述检测标记位点互补的核酸序列的检测试剂在如下条件下接触：所述检测试剂的所述核酸序列与所述扩增子的所述检测标记位点杂交；以及
(f)检测结合到所述检测标记位点的所述标记。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在(a)中使所述样品与锚定试剂和所述检测探针接触，其中所述锚定试剂包含寡核苷酸标签和锚定序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述检测探针包含单链DNA寡核苷酸标签、单链RNA靶互补序列和单链DNA检测寡核苷酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述锚定试剂包含单链DNA寡核苷酸标签和单链DNA锚定序列。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其包含在(c)之前使所述固定化检测复合物与RNA酶接触以消化未结合探针的单链RNA。
6.一种检测样品中包含靶核酸序列的靶寡核苷酸的方法，所述方法包含：
(a)使所述样品与以下接触：
(i)检测探针，其包括包含单链DNA序列的寡核苷酸标签、包含单链RNA序列的靶互补序列和包含单链DNA序列的检测寡核苷酸；和
(ii)锚定试剂，其包括包含单链DNA序列的寡核苷酸标签和包含单链DNA序列的锚定序列，
其中所述检测探针的所述靶互补序列与所述靶寡核苷酸的所述靶核酸序列杂交以形成反应产物，其包含所述寡核苷酸标签、包含所述靶寡核苷酸的所述靶核酸序列和所述靶互补序列的双链RNA双链体；
(b)使包含上面在离散结合域中固定有多种捕获寡核苷酸的一个或多个电极的支撑表面与包含所述反应产物的混合物在如下条件下接触：所述反应产物的所述寡核苷酸标签与所述捕获寡核苷酸杂交，以在所述支撑表面上形成检测复合物；
(c)使所述支撑表面与RNA酶接触以消化未结合检测探针的单链RNA；
(d)使固定化检测复合物与包含滚环扩增(RCA)模板和聚合酶的检测混合物接触；
(e)通过RCA扩增所述模板以形成连接到所述检测复合物的延伸序列，其中所述延伸序列包含多个包含检测标记位点的核酸序列；
(f)使所述延伸序列与包含电化学发光(ECL)标记和与所述延伸序列的所述检测标记位点互补的核酸序列的检测试剂在如下条件下接触：所述检测试剂的所述核酸序列与所述检测标记位点杂交；以及
(g)通过使所述ECL标记与包含ECL共反应物的ECL读取缓冲液接触并且向所述电极施加电势来检测结合到所述延伸序列的所述ECL标记。
7.一种检测样品中的靶核苷酸序列的方法，所述方法包含：
(a)使所述样品与包含以下的混合物接触：
(i)靶向探针，其包含单链寡核苷酸标签和与所述样品中的所述靶核苷酸序列的第一区互补的第一核酸序列；和
(ii)检测探针，其包含检测寡核苷酸和与所述靶核苷酸序列的第二区互补的第二核酸序列，
其中所述靶向探针的所述第一核酸序列和所述检测探针的所述第二核酸序列与所述靶寡核苷酸的相邻核酸序列互补；
(b)在核酸连接酶存在下，在如下条件下培育包含所述靶寡核苷酸、所述靶向探针和所述检测探针的所述混合物：所述靶向探针和所述检测探针结合到其相应的所述靶寡核苷酸的核苷酸序列，并且所述核酸连接酶连接所述靶向探针和所述检测探针，以形成包含所述寡核苷酸标签和所述检测寡核苷酸的反应产物；
(c)使上面固定有捕获寡核苷酸的支撑表面与包含所述反应产物的所述混合物在如下条件下接触：所述反应产物的所述寡核苷酸标签与所述捕获寡核苷酸杂交，以形成固定化检测复合物；
(d)使所述固定化检测复合物与包含扩增模板的检测混合物接触；
(e)扩增所述扩增模板以形成包含一个或多个包含检测标记位点的核酸序列的扩增子；
(f)使所述扩增子与包含标记和与所述检测标记位点互补的核酸序列的检测试剂在如下条件下接触：所述检测试剂的所述核酸序列与所述检测标记位点杂交；以及
(g)检测结合到所述支撑表面的所述标记。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述检测探针具有与和所述靶向探针的3'端相邻的靶核苷酸序列杂交的5'端。
9.根据权利要求7所述的方法，其包含使(b)中形成的所述反应产物暴露于变性条件以使所述反应产物与所述靶寡核苷酸解离。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述扩增模板通过聚合酶链反应(PCR)扩增。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述扩增模板通过滚环扩增(RCA)扩增。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述扩增模板包含环状扩增模板。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中由RCA生成的所述扩增子包含连接到所述固定化检测复合物的延伸序列。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述扩增子包含多个检测标记位点。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述扩增模板包含线性扩增模板，其包含5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中所述5'末端核苷酸序列和所述3'末端核苷酸序列能够与所述检测序列杂交；以及能够与所述检测试剂的所述核酸序列的互补序列杂交的内部核苷酸序列，其中所述扩增模板的所述5'末端核苷酸序列和所述3'末端核苷酸序列不与所述内部序列重叠。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述扩增模板包含线性扩增模板，其包含5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中所述5'末端核苷酸序列和所述3'末端核苷酸序列能够与所述检测序列杂交；能够与锚定寡核苷酸序列的互补序列杂交的第一内部序列以及能够与所述检测试剂的所述核酸序列的互补序列杂交的第二内部序列，其中所述扩增模板的所述5'末端核苷酸序列和所述3'末端核苷酸序列不与所述第一内部序列和所述第二内部序列重叠。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述3'末端序列和所述5'末端序列的长度的总和为约14到约24个核苷酸的长度。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述3'末端序列和所述5'末端序列的长度的总和为约14或约15个核苷酸的长度。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述扩增模板包含5'-GTTCTGTC-3'(SEQ ID NO:1666)的5'末端序列和5'-GTGTCTA-3'(SEQ ID NO:1667)的3'末端序列。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测寡核苷酸包含与所述扩增模板的所述5'末端序列互补的第一序列和与所述扩增模板的所述3'末端序列互补的相邻第二序列。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述扩增模板包含5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:1668)的核苷酸序列。
22.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述扩增模板包含5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:1669)的核苷酸序列。
23.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述扩增模板包含由5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAG TGTCTA-3'(SEQ ID NO:1670)组成的序列。
24.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述扩增模板包含5'-GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAG CGTCGA-3'(SEQ ID NO:1671)的核苷酸序列。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述检测寡核苷酸包含5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:1664)的14或15个连续核苷酸。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述扩增模板包含长度为约50到约78个核苷酸的非天然存在的寡核苷酸序列。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述扩增模板的所述非天然存在的寡核苷酸序列的长度为约53到约76个核苷酸、约50到约70个核苷酸、约53到约61个核苷酸或约54到约61个核苷酸。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述扩增模板的所述非天然存在的寡核苷酸序列的长度为约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75或约76个核苷酸。
29.根据权利要求26到28中任一项所述的方法，其中所述扩增模板的所述非天然存在的寡核苷酸序列的长度为约61个核苷酸。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测试剂的所述核酸序列包含与以下的14或15个连续核苷酸具有至少90％序列同一性的核酸序列：5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:1672)。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测试剂的所述核酸序列包含5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:1672)。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测试剂的所述核酸序列包含5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:1668)。
33.根据权利要求2到32中任一项所述的方法，其中所述锚定试剂的所述锚定序列包含长度为约10到约30个核酸的寡核苷酸。
34.根据权利要求2到33中任一项所述的方法，其中所述锚定试剂的所述锚定序列包含长度为约17或约25个寡核苷酸的寡核苷酸。
35.根据权利要求2到33中任一项所述的方法，其中所述锚定试剂的所述锚定序列包含5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:1669)。
36.根据权利要求2到33中任一项所述的方法，其中所述锚定试剂的所述锚定序列由5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(SEQ ID NO:1665)组成。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述支撑表面包含一个或多个碳基电极。
38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述支撑表面包含多孔板，所述多孔板包含一个或多个碳基电极。
39.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述电极包含碳墨电极。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述支撑表面包含多孔板，所述多孔板包含一个或多个碳基电极，并且其中多种捕获寡核苷酸固定在所述碳基电极上的离散域中。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述多种捕获寡核苷酸固定所述支撑表面上阵列中的离散结合域中。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标记包含电化学发光(ECL)标记。
43.根据权利要求42所述的方法，其包含通过使所述电极与包含电化学发光共反应物的电化学发光读取缓冲液接触并且向所述电极施加电势来生成分析信号的步骤。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中固定在所述支撑表面上的所述捕获寡核苷酸选自符合以下要求中的一者或多者的非交叉反应性寡核苷酸的集合：
(a)约40％与约50％之间的GC含量；
(b)约30％与约70％之间的AG含量；
(c)约30％与约70％之间的CT含量；
(d)不超过三个的序列中的最大碱基重复串；
(e)没有不需要的与连续超过7个互补碱基对匹配的串的寡核苷酸-寡核苷酸相互作用；
(f)没有不需要的与18个连续碱基或更少的串的寡核苷酸-寡核苷酸相互作用，
其中：
(i)每一端的末端碱基是互补匹配；和
(ii)互补碱基对匹配之和减错配之和大于7；
(g)没有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个碱基对或更长的串匹配基因组中或自然界中的序列或序列的互补序列或两者；
(h)序列与其互补序列的杂交自由能差异小于约1kCal/mol、约2kCal/mol、约3kCal/mol或约4kCal/mol；
(i)没有在茎中具有4个或更多个连续匹配的预测发夹环；以及
(j)没有在茎中具有4个或更多个连续匹配且环大小大于6个碱基的预测发夹环。
45.根据权利要求44所述的方法，其中固定在所述支撑表面上的所述捕获寡核苷酸选自：
(a)具有选自SEQ ID No:1-64的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；
(b)包含与选自SEQ ID No:1-64的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的捕获寡核苷酸；
(c)具有与选自SEQ ID No:1-64的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；
(d)包含选自SEQ ID No:1-64的序列的捕获寡核苷酸；以及
(e)选自(a)-(d)中的任一者的捕获寡核苷酸。
46.根据权利要求44所述的方法，其中固定在所述支撑表面上的所述捕获寡核苷酸选自：
(a)包含具有选自SEQ ID No:1-10的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的序列的捕获寡核苷酸；
(b)包含与选自SEQ ID No:1-10的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的捕获寡核苷酸；
(c)具有与选自SEQ ID No:1-10的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；
(d)包含选自SEQ ID No:1-10的序列的捕获寡核苷酸；以及
(e)选自(a)-(d)中的任一者的捕获寡核苷酸。
47.一种用于检测样品中的靶核苷酸序列的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)支撑表面，其包含一种或多种固定化捕获寡核苷酸；
(b)检测探针，其包含寡核苷酸标签、靶互补序列和检测寡核苷酸；
(c)扩增模板；
(d)核酸连接酶；
(e)核酸聚合酶；以及
(f)检测试剂，其包含标记和核酸序列。
48.根据权利要求47所述的试剂盒，其进一步包含锚定试剂，所述锚定试剂包含寡核苷酸标签和锚定寡核苷酸。
49.根据权利要求48所述的试剂盒，其中所述锚定试剂固定在所述支撑表面上。
50.根据权利要求48或49所述的试剂盒，其中所述锚定寡核苷酸的长度为约10到约30个核酸。
51.根据权利要求50所述的试剂盒，其中所述锚定寡核苷酸的长度为17或25个寡核苷酸。
52.根据权利要求48到50中任一项所述的试剂盒，其中所述锚定寡核苷酸包含5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:1669)。
53.根据权利要求48到50中任一项所述的试剂盒，其中所述锚定寡核苷酸由5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(SEQ ID NO:1665)组成。
54.根据权利要求47到53中任一项所述的试剂盒，其中所述扩增模板包含线性扩增模板，其包含5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中所述5'末端核苷酸序列和所述3'末端核苷酸序列能够与检测序列杂交；以及能够与所述锚定试剂的锚定序列的互补序列杂交的内部核苷酸序列，其中所述扩增模板的所述5'末端核苷酸序列和所述3'末端核苷酸序列不与所述内部序列重叠。
55.根据权利要求47到53中任一项所述的试剂盒，其中所述扩增模板包含线性扩增模板，其包含5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中所述5'末端核苷酸序列和所述3'末端核苷酸序列能够与检测序列杂交；能够与所述锚定试剂的锚定序列的互补序列杂交的第一内部核苷酸序列以及能够与所述检测试剂的所述核酸序列的互补序列杂交的第二内部核苷酸序列，其中所述扩增模板的所述5'末端核苷酸序列和所述3'末端核苷酸序列不与所述第一内部序列和所述第二内部序列重叠。
56.根据权利要求54或55所述的试剂盒，其中所述扩增模板包含5'末端磷酸基。
57.根据权利要求47到57中任一项所述的试剂盒，其中所述扩增模板的长度为约53到约61个核苷酸。
58.根据权利要求54到57中任一项所述的试剂盒，其中所述5'末端序列和所述3'末端序列的长度的总和为约14到约24个核苷酸的长度。
59.根据权利要求58所述的试剂盒，其中所述3'末端序列和所述5'末端序列的长度的总和为约14到约19个核苷酸的长度。
60.根据权利要求58所述的试剂盒，其中所述3'末端序列和所述5'末端序列的长度的总和为约14或约15个核苷酸的长度。
61.根据权利要求47到60中任一项所述的试剂盒，其中所述扩增模板包含5'-GTTCTGTC-3'(SEQ ID NO:1666)的5'末端序列和5'-GTGTCTA-3'(SEQ ID NO:1667)的3'末端序列。
62.根据权利要求47到60中任一项所述的试剂盒，其中所述扩增模板包含5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:1668)的核苷酸序列。
63.根据权利要求47到60中任一项所述的试剂盒，其中所述扩增模板包含5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:1669)的核苷酸序列。
64.根据权利要求47到60中任一项所述的试剂盒，其中所述扩增模板包含由5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAG TGTCTA-3'(SEQ ID NO:1670)组成的序列。
65.根据权利要求47到60中任一项所述的试剂盒，其中所述扩增模板包含5'-GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAG CGTCGA-3'(SEQ ID NO:1671)的核苷酸序列。
66.根据权利要求47所述的试剂盒，其中所述扩增模板包含环状扩增模板。
67.根据权利要求47到66中任一项所述的试剂盒，其中所述检测探针包含单链DNA寡核苷酸标签、单链RNA靶互补序列和单链DNA检测寡核苷酸。
68.根据权利要求67所述的试剂盒，其中所述锚定试剂包含单链DNA寡核苷酸标签和单链DNA锚定序列。
69.根据权利要求67或68所述的试剂盒，其包含RNA酶。
70.根据权利要求54或55所述的试剂盒，其中所述检测探针的所述检测寡核苷酸包含与所述扩增模板的所述5'末端序列互补的第一序列和与所述扩增模板的所述3'末端序列互补的相邻第二序列。
71.根据权利要求47到70中任一项所述的试剂盒，其中所述检测试剂的所述核酸序列包含与以下的14或15个连续核苷酸具有至少90％序列同一性的序列：5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:1672)。
72.根据权利要求47到70中任一项所述的试剂盒，其中所述检测试剂的所述核酸序列包含序列5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:1672)。
73.根据权利要求47到70中任一项所述的试剂盒，其中所述检测试剂的所述核酸序列包含序列5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:1668)。
74.根据权利要求47到73中任一项所述的试剂盒，其中所述检测试剂的所述标记包含电化学发光(ECL)标记。
75.根据权利要求47到74中任一项所述的试剂盒，其中所述支撑表面包含碳基支撑表面。
76.根据权利要求47到75中任一项所述的试剂盒，其中所述支撑表面包含碳基电极。
77.根据权利要求47到76中任一项所述的试剂盒，其中所述支撑表面包含碳墨电极。
78.根据权利要求47到77中任一项所述的试剂盒，其中所述支撑表面包含多孔板分析消耗品，并且所述板的每个孔包含碳墨电极。
79.根据权利要求47所述的试剂盒，其中所述支撑表面包含珠粒。
80.根据权利要求47到78中任一项所述的试剂盒，其中多种捕获寡核苷酸固定在固相支撑物上的离散结合域中以形成阵列。
81.根据权利要求80所述的试剂盒，其中多种捕获寡核苷酸和至少一种锚定试剂固定在所述固相支撑物上的离散结合域中以形成阵列，其中每个结合域包含所述多种捕获寡核苷酸中的一者和至少一种锚定试剂。
82.根据权利要求47到81中任一项所述的试剂盒，其中固定在所述支撑表面上的所述捕获寡核苷酸选自符合以下要求中的一者或多者的非交叉反应性寡核苷酸的集合：
(a)约40％与约50％之间的GC含量；
(b)约30％与约70％之间的AG含量；
(c)约30％与约70％之间的CT含量；
(d)不超过三个的序列中的最大碱基重复串；
(e)没有不需要的与连续超过7个互补碱基对匹配的串的寡核苷酸-寡核苷酸相互作用；
(f)没有不需要的与18个连续碱基或更少的串的寡核苷酸-寡核苷酸相互作用，其中：
(i)每一端的末端碱基是互补匹配；和
(ii)互补碱基对匹配之和减错配之和大于7；
(g)没有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个碱基对或更长的串匹配基因组中或自然界中的序列或序列的互补序列或两者；
(h)序列与其互补序列的杂交自由能差异小于约1kCal/mol、约2kCal/mol、约3kCal/mol或约4kCal/mol；
(i)没有在茎中具有4个或更多个连续匹配的预测发夹环；以及
(j)没有在茎中具有4个或更多个连续匹配且环大小大于6个碱基的预测发夹环。
83.根据权利要求82所述的试剂盒，其中固定在所述支撑表面上的所述捕获寡核苷酸选自：
(a)具有选自SEQ ID No:1-64的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；
(b)包含与选自SEQ ID No:1-64的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的捕获寡核苷酸；
(c)具有与选自SEQ ID No:1-64的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；
(d)包含选自SEQ ID No:1-64的序列的捕获寡核苷酸；以及
(e)选自(a)-(d)中的任一者的捕获寡核苷酸。
84.根据权利要求82所述的试剂盒，其中固定在所述支撑表面上的所述捕获寡核苷酸选自：
(a)包含具有选自SEQ ID No:1-10的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的序列的捕获寡核苷酸；
(b)包含与选自SEQ ID No:1-10的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的捕获寡核苷酸；
(c)具有与选自SEQ ID No:1-10的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；
(d)包含选自SEQ ID No:1-10的序列的捕获寡核苷酸；以及
(e)选自(a)-(d)中的任一者的捕获寡核苷酸。
85.一种用于检测样品中的靶核苷酸序列的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)支撑表面，其包含一种或多种固定化捕获寡核苷酸；
(b)锚定试剂，其包含寡核苷酸标签和锚定寡核苷酸；
(c)检测探针，其包含寡核苷酸标签、靶互补序列和单链DNA检测寡核苷酸；
(d)检测试剂，其包含电化学发光(ECL)标记和核酸序列；
(e)线性扩增模板，其包含5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中所述5'末端核苷酸序列和所述3'末端核苷酸序列能够与检测序列杂交，能够与所述锚定试剂的锚定序列的互补序列杂交的第一内部核苷酸序列以及能够与所述检测试剂的所述核酸序列的互补序列杂交的第二内部核苷酸序列，其中所述扩增模板的所述5'末端核苷酸序列和所述3'末端核苷酸序列不与所述第一内部序列和所述第二内部序列重叠；
(f)核酸连接酶；以及
(g)核酸聚合酶。
86.根据权利要求85所述的试剂盒，其中所述锚定试剂固定在所述支撑表面上。
87.根据权利要求85或86所述的试剂盒，其中所述锚定试剂包含单链DNA寡核苷酸标签和单链DNA锚定寡核苷酸；并且所述检测探针包含单链DNA寡核苷酸标签、单链RNA靶互补序列和单链DNA检测寡核苷酸；并且其中所述试剂盒进一步包含RNA酶。
88.一种用于检测样品中的靶核苷酸序列的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)支撑表面，其包含固定化捕获寡核苷酸；
(b)靶向探针，其包含单链寡核苷酸标签和与所述样品中的所述靶核苷酸序列的第一区互补的第一核酸序列；
(c)检测探针，其包含检测寡核苷酸和与所述靶核苷酸序列的第二区互补的第二核酸序列，其中所述靶向探针的所述第一核酸序列和所述检测探针的所述第二核酸序列与所述靶核苷酸的相邻序列互补；
(d)扩增模板；
(e)核酸连接酶；
(f)核酸聚合酶；以及
(g)检测试剂，其包含标记和核酸序列。
89.根据权利要求88所述的试剂盒，其中所述靶向探针具有与所述靶核苷酸序列的区互补的末端3'核苷酸，所述区与所述检测探针的5'末端核苷酸所互补的区相邻。
90.根据权利要求89所述的试剂盒，其中所述靶向探针的所述末端3'核苷酸与所述靶核苷酸序列的多态性核苷酸互补。
91.一种用于检测样品中的靶核苷酸序列的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)支撑表面，其包含固定化捕获寡核苷酸；
(b)锚定试剂，其包含寡核苷酸标签和锚定寡核苷酸；
(c)靶向探针，其包含单链寡核苷酸标签和与所述样品中的所述靶核苷酸序列的第一区互补的第一核酸序列；
(d)检测探针，其包含检测寡核苷酸和与所述靶核苷酸序列的第二区互补的第二核酸序列，其中所述靶向探针的所述第一核酸序列和所述检测探针的所述第二核酸序列与所述靶核苷酸的相邻序列互补；
(e)线性扩增模板，其包含5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中所述5'末端核苷酸序列和所述3'末端核苷酸序列能够与检测序列杂交，能够与所述锚定试剂的锚定序列的互补序列杂交的第一内部核苷酸序列以及能够与所述检测试剂的所述核酸序列的互补序列杂交的第二内部核苷酸序列，其中所述扩增模板的所述5'末端核苷酸序列和所述3'末端核苷酸序列不与所述第一内部序列和所述第二内部序列重叠；
(f)核酸连接酶；
(g)核酸聚合酶；以及
(h)检测试剂，其包含电化学发光(ECL)标记和核酸序列。
92.根据权利要求47到91中任一项所述的试剂盒，其进一步包含检测混合物，所述检测混合物包含线性扩增模板和一种或多种额外组分，所述额外组分选自：连接缓冲液、腺苷三磷酸(ATP)、牛血清白蛋白(BSA)、吐温(Tween)20、T4 DNA连接酶以及其组合。
93.根据权利要求92所述的试剂盒，其中所述检测混合物包含一种或多种用于滚环扩增的组分，所述组分选自BSA、缓冲液、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、吐温20、Phi29 DNA聚合酶或其组合。
94.根据权利要求92或93所述的试剂盒，其中所述检测混合物包含乙酰BSA。
95.根据权利要求47到91中任一项所述的试剂盒，其进一步包含ECL读取缓冲液。
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