KR20230080414A

KR20230080414A - 샘플에서 하나 이상의 표적 분석물을 검출하기 위한 키트 및 이의 제조 및 사용 방법

Info

Publication number: KR20230080414A
Application number: KR1020237011128A
Authority: KR
Inventors: 존 켄텐; 갈리나 니콜렌코; 세스 비 하킨스; 티모시 제이 브레이크
Original assignee: 메소 스케일 테크놀러지즈, 엘엘시
Priority date: 2020-09-02
Filing date: 2021-09-02
Publication date: 2023-06-07
Also published as: JP2023539360A; IL300973A; CN116507738A; WO2022051485A2; EP4208566A2; WO2022051485A3; AU2021338303A1; CA3193739A1

Abstract

샘플에서 하나 이상의 표적 분석물을 검출, 확인 또는 정량화하기 위한 올리고뉴클레오티드, 방법 및 키트는 물론 올리고뉴클레오티드를 지지체 표면에 고정시키기 위한 방법이 제공된다.

Description

샘플에서 하나 이상의 표적 분석물을 검출하기 위한 키트 및 이의 제조 및 사용 방법

본 개시내용은 샘플에서 하나 이상의 표적 분석물을 검출하기 위한 키트 및 이의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

단일 뉴클레오티드 다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP)은 인구의 상당 부분(>1%)에 각각 나타나는 2개 이상의 개별 뉴클레오티드 잔기(대립유전자)가 있는 유기체 게놈의 단일 뉴클레오티드 변이를 의미한다. SNP는 개체 사이에서 가장 빈번한 서열 변이 형태이며 많은 유전병의 병인에 관여한다. Wang 등 (1998), Large-Scale Identification, Mapping, and Genotyping of Single-Nucleotide Polymorphisms in the Human Genome, Science, 280:1077-1082. 인간 게놈에는 코딩 및 비코딩 영역에서 발생할 수 있는 약 1천만 개의 SNP가 있다. Kruglyak 등 (2001) Variation is the Spice of Life, Nat. Genet., 27:234-236. 많은 SNP는 세포 기능에 영향을 미치지 않지만 다른 SNP는 유전적 특성, 유전 질환, 연령 관련 질환, 및 약물 및 환경 요인에 대한 반응과 관련이 있다.

유전자형분석(genotyping) 검정은 샘플에서 뉴클레오티드 서열의 존재를 검출하는 데 사용되는 유전자 검사이며, 결실 및 삽입, 복제 및 전좌를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 샘플에서 SNP 또는 다른 서열 변이의 존재를 검출하는 데 사용할 수 있다. 고밀도 올리고뉴클레오티드 어레이는 칩 상에 배열된 수십만 개의 프로브를 사용하여 많은 뉴클레오티드 서열의 동시 조사를 가능케 한다.

서열을 질환 또는 질환에 대한 감수성과 연관시키거나 서열을 약물 반응의 개별 가변성과 연관시키거나 집단 연구를 수행하기 위해 샘플에서 뉴클레오티드 서열의 대규모 분석이 필요하기 때문에, 샘플에서 뉴클레오티드 서열을 확인하기 위한 키트에 대한 필요성이 남아있다.

샘플에서 표적 핵산 서열을 포함하는 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위한 방법이 본원에서 제공된다. 한 측면에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) 표적 보체(target complement)가 표적 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산 서열에 혼성화하여 반응 생성물을 형성하는 조건 하에서 올리고뉴클레오티드 태그, 표적 보체 및 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 검출 프로브(detection probe)와 샘플을 접촉시키는 단계;

(b) 반응 생성물의 올리고뉴클레오티드 태그가 포획 올리고뉴클레오티드(capture oligonucleotide)에 혼성화하여 고정된 검출 복합체(immobilized detection complex)를 형성하는 조건 하에서 반응 생성물을 함유하는 혼합물과 포획 올리고뉴클레오티드가 고정된 지지체 표면을 접촉시키는 단계;

(c) 증폭 주형(amplification template)을 포함하는 검출 혼합물과 고정된 검출 복합체를 접촉시키는 단계;

(d) 검출 표지화 부위(detection labeling site)를 포함하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 앰플리콘(amplicon)을 형성하기 위해 증폭 주형을 증폭시키는 단계;

(e) 검출 시약의 핵산 서열이 앰플리콘의 검출 표지화 부위에 혼성화하는 조건 하에서 표지 및 검출 표지화 부위에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 검출 시약과 앰플리콘을 접촉시키는 단계; 및

(f) 검출 표지화 부위에 결합된 표지를 검출하는 단계. 한 측면에서, 샘플은 (a)에서 고정 시약 및 검출 프로브와 접촉된다. 한 측면에서, 고정 시약은 올리고뉴클레오티드 태그 및 고정 서열(anchoring sequence)을 포함한다. 한 측면에서, 검출 프로브는 단일 가닥(single stranded) DNA 올리고뉴클레오티드 태그, 단일 가닥 RNA 표적 보체 및 단일 가닥 DNA 검출 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 고정 시약은 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 태그 및 단일 가닥 DNA 고정 서열을 포함한다.

한 측면에서, 상기 방법은 고정된 검출 복합체를 RNase와 접촉시켜 (c) 전에 결합되지 않은 프로브의 단일 가닥 RNA를 분해하는 단계를 포함한다.

한 측면에서, 샘플에서 표적 핵산 서열을 포함하는 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위한 방법이 제공된다. 한 측면에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) 샘플을

(ⅰ) 단일 가닥 DNA 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 태그, 단일 가닥 RNA 서열을 포함하는 표적 보체 및 단일 가닥 DNA 서열을 포함하는 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 검출 프로브; 및

(ⅱ) 단일 가닥 DNA 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 태그 및 단일 가닥 DNA 서열을 포함하는 고정 서열을 포함하는 고정 시약과 접촉시키는 단계로서,

검출 프로브의 표적 보체는 표적 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산 서열에 혼성화하여 올리고뉴클레오티드 태그, 표적 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산 서열을 포함하는 이중 가닥 RNA 듀플렉스(double stranded RNA duplex) 및 표적 보체를 포함하는 반응 생성물을 형성하는 단계;

(b) 반응 생성물의 올리고뉴클레오티드 태그가 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화하여 지지체 표면에 검출 복합체를 형성하는 조건 하에서 반응 생성물을 포함하는 혼합물과 개별 결합 도메인에 복수의 포획 올리고뉴클레오티드가 고정된 하나 이상의 전극을 포함하는 지지체 표면을 접촉시키는 단계;

(c) 결합되지 않은 검출 프로브의 단일 가닥 RNA를 분해하기 위해 RNase와 지지체 표면을 접촉시키는 단계;

(d) 회전 환 증폭(rolling circle amplification, RCA) 주형 및 중합효소를 포함하는 검출 혼합물과 고정된 검출 복합체를 접촉시키는 단계;

(e) 검출 복합체에 부착된 연장된 서열을 형성하기 위해 RCA에 의해 주형을 증폭시키는 단계로서, 연장된 서열은 검출 표지화 부위를 포함하는 다중 핵산 서열을 포함하는 단계;

(f) 검출 시약의 핵산 서열이 검출 표지화 부위에 혼성화하는 조건 하에서 전기화학발광(electrochemiluminescent, ECL) 표지 및 연장된 서열의 검출 표지화 부위에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 검출 시약과 연장된 서열을 접촉시키는 단계; 및

(g) ECL 표지를 ECL 공반응물을 포함하는 ECL 판독 버퍼와 접촉시키고 전극에 전위를 인가함으로써 연장된 서열에 결합된 ECL 표지를 검출하는 단계.

한 측면에서, 샘플에서 표적 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 방법이 제공된다. 한 측면에서, 상기 방법은 다음을 포함한다:

(a) 샘플을

(ⅰ) 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그 및 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 제1 영역에 상보적인 제1 핵산 서열을 포함하는 표적화 프로브; 및

(ⅱ) 검출 올리고뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드 서열의 제2 영역에 상보적인 제2 핵산 서열을 포함하는 검출 프로브를 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계로서,

표적화 프로브의 제1 핵산 서열 및 검출 프로브의 제2 핵산 서열은 표적 올리고뉴클레오티드의 인접한 핵산 서열에 상보적인 단계;

(b) 표적화 프로브 및 검출 프로브가 표적 올리고뉴클레오티드의 상응하는 뉴클레오티드 서열에 결합하고 핵산 리가아제(nucleic acid ligase)가 표적화 및 검출 프로브를 결찰시켜 올리고뉴클레오티드 태그 및 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 반응 생성물을 형성하는 조건 하에서 핵산 리가아제의 존재하에 표적 올리고뉴클레오티드, 표적화 프로브 및 검출 프로브를 포함하는 혼합물을 인큐베이션하는 단계;

(c) 반응 생성물의 올리고뉴클레오티드 태그가 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화하여 고정된 검출 복합체를 형성하는 조건 하에서 반응 생성물을 포함하는 혼합물과 포획 올리고뉴클레오티드가 고정된 지지체 표면을 접촉시키는 단계;

(d) 증폭 주형을 포함하는 검출 혼합물과 고정된 검출 복합체를 접촉시키는 단계;

(e) 검출 표지화 부위를 포함하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 앰플리콘을 형성하기 위해 증폭 주형을 증폭시키는 단계;

(f) 검출 시약의 핵산 서열이 검출 표지화 부위에 혼성화하는 조건 하에서 표지 및 검출 표지화 부위에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 검출 시약과 앰플리콘을 접촉시키는 단계; 및

(g) 지지체 표면에 결합된 표지를 검출하는 단계.

한 측면에서, 검출 프로브는 표적화 프로브의 3' 엔드에 인접한 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 5' 엔드를 갖는다.

한 측면에서, 상기 방법은 표적 올리고뉴클레오티드로부터 반응 생성물을 분리시키기 위해 (b)에서 형성된 반응 생성물을 변성 조건에 노출시키는 단계를 포함한다.

한 측면에서, 증폭 주형은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 증폭된다. 한 측면에서, 증폭 주형은 회전 환 증폭(rolling circle amplification, RCA)에 의해 증폭된다. 한 측면에서, 증폭 주형은 원형 증폭 주형(circular amplification template)을 포함한다.

한 측면에서, RCA에 의해 생성된 앰플리콘은 고정된 검출 복합체에 부착된 연장된 서열을 포함한다. 한 측면에서, 앰플리콘은 다중 검출 표지화 부위를 포함한다.

한 측면에서, 증폭 주형은 5' 말단 뉴클레오티드 서열 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 증폭 주형, 및 검출 시약의 핵산 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 내부 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 증폭 주형의 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 내부 서열과 중첩되지 않는다.

한 측면에서, 증폭 주형은 5' 말단 뉴클레오티드 서열 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 증폭 주형, 고정 올리고뉴클레오티드 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제1 내부 서열 및 검출 시약의 핵산 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제2 내부 서열을 포함하고, 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 검출에 혼성화할 수 있고, 증폭 주형의 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 제1 및 제2 내부 서열과 중첩되지 않는다.

한 측면에서, 3' 및 5' 말단 서열 길이의 합은 약 14 내지 약 24개의 뉴클레오티드 길이이다. 한 측면에서, 3' 및 5' 말단 서열 길이의 합은 약 14개 또는 약 15개의 뉴클레오티드 길이이다.

한 측면에서, 증폭 주형은 5'-GTTCTGTC-3'(서열번호 1666)의 5' 말단 서열 및 5'-GTGTCTA-3'(서열번호 1667)의 3' 말단 서열을 포함한다.

한 측면에서, 검출 올리고뉴클레오티드는 증폭 주형의 5' 말단 서열에 상보적인 제1 서열 및 증폭 주형의 3' 말단 서열에 상보적인 인접한 제2 서열을 포함한다.

한 측면에서, 증폭 주형은 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(서열번호 1668)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(서열번호 1669)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'(서열번호 1670)로 이루어진 서열을 포함한다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA-3'(서열번호 1671)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

한 측면에서, 검출 올리고뉴클레오티드는 5'-GACAGAACTAGACAC-3'(서열번호 1664)의 14개 또는 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 증폭 주형은 약 50 내지 약 78개의 뉴클레오티드 길이인 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 증폭 주형의 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드 서열은 약 53 내지 약 76개의 뉴클레오티드 길이, 약 50 내지 약 70개의 뉴클레오티드 길이, 약 53 내지 약 61개의 뉴클레오티드 길이 또는 약 54 내지 약 61개의 뉴클레오티드 길이이다. 한 측면에서, 증폭 주형의 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드 서열은 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75 또는 약 76개의 뉴클레오티드 길이이다. 한 측면에서, 증폭 주형의 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드 서열은 약 61개의 뉴클레오티드 길이이다.

한 측면에서, 검출 시약의 핵산 서열은 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(서열번호 1672)의 14개 또는 15개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 검출 시약의 핵산 서열은 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(서열번호 1672)를 포함한다. 한 측면에서, 검출 시약의 핵산 서열은 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(서열번호 1668)를 포함한다.

한 측면에서, 고정 시약의 고정 서열은 약 10 내지 약 30개의 핵산 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 고정 시약의 고정 서열은 약 17개 또는 약 25개의 올리고뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 고정 시약의 고정 서열은 5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(서열번호 1669)를 포함한다. 한 측면에서, 고정 시약의 고정 서열은 5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(서열번호 1665)로 이루어진다.

한 측면에서, 지지체 표면은 하나 이상의 탄소계 전극을 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 하나 이상의 탄소계 전극을 포함하는 멀티 웰 플레이트(multi-well plate)를 포함한다. 한 측면에서, 전극은 카본 잉크 전극을 포함한다.

한 측면에서, 지지체 표면은 하나 이상의 탄소계 전극을 포함하는 멀티 웰 플레이트를 포함하고, 복수의 포획 올리고뉴클레오티드는 개별 도메인에서 탄소계 전극에 고정된다. 한 측면에서, 복수의 포획 올리고뉴클레오티드는 어레이의 개별 결합 도메인에서 지지체 표면에 고정된다.

한 측면에서, 표지는 전기화학발광(ECL) 표지를 포함한다. 한 측면에서, 상기 방법은 전극을 전기화학발광 공반응물을 포함하는 전기화학발광 판독 버퍼와 접촉시키고 전극에 전위를 인가함으로써 검정 신호를 생성하는 단계를 포함한다.

한 측면에서, 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드는 다음 요건 중 하나 이상을 충족하는 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 세트로부터 선택된다:

(a) 약 40% 내지 약 50%의 GC 함량;

(b) 약 30 내지 약 70%의 AG 함량;

(c) 약 30% 내지 약 70%의 CT 함량;

(d) 3개 이하의 서열의 염기 반복부의 최대 스트링(string);

(e) 일렬로 7개 초과의 상보적 염기쌍 일치(complementary base pair match)의 스트링과의 바람직하지 않은 올리고뉴클레오티드-올리고뉴클레오티드 상호작용이 없음;

(f) 18개 이하의 연속 염기의 스트링과의 바람직하지 않은 올리고뉴클레오티드-올리고뉴클레오티드 상호작용이 없으며:

(i) 각 엔드에 있는 말단 염기는 상보적으로 일치하고;

(ii) 상보적 염기쌍 일치의 합에서 불일치(mismatch)의 합을 뺀 값이 7보다 큼;

(g) 게놈 또는 자연의 서열 또는 서열의 보체 또는 둘 다와 일치하는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개 또는 이보다 긴 염기쌍의 스트링이 없음;

(h) 보체가 있는 서열에 대한 혼성화 자유 에너지의 차이는 약 1kCal/mol, 약 2kCal/mol, 약 3kCal/mol 또는 약 4kCal/mol 미만임;

(i) 스템(stem)에서 4개 이상 연속 일치되는 예측된 헤어핀 루프가 없다; 및

(j) 스템에서 4개 이상 연속 일치되는 예측된 헤어핀 루프가 없고 6개 염기 초과의 루프 크기가 없다.

한 측면에서, 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드는 다음으로부터 선택된다:

(a) 서열번호 1-64로부터 선택된 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 포획 올리고뉴클레오티드;

(b) 서열번호 1-64로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 포획 올리고뉴클레오티드;

(c) 서열번호 1-64로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 포획 올리고뉴클레오티드;

(d) 서열번호 1-64로부터 선택된 서열을 포함하는 포획 올리고뉴클레오티드; 및

(e) (a)-(d) 중 임의의 것으로부터 선택된 포획 올리고뉴클레오티드.

(a) 서열번호 1-10으로부터 선택된 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 서열을 포함하는 포획 올리고뉴클레오티드;

(b) 서열번호 1-10으로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 포획 올리고뉴클레오티드;

(c) 서열번호 1-10으로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 포획 올리고뉴클레오티드;

(d) 서열번호 1-10으로부터 선택된 서열을 포함하는 포획 올리고뉴클레오티드; 및

한 측면에서, 샘플에서 표적 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 키트가 제공된다. 한 측면에서, 상기 키트는 다음을 포함한다:

(a) 하나 이상의 고정된 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하는 지지체 표면;

(b) 올리고뉴클레오티드 태그, 표적 보체 및 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 검출 프로브;

(c) 증폭 주형;

(d) 핵산 리가아제;

(e) 핵산 중합효소; 및

(f) 표지 및 핵산 서열을 포함하는 검출 시약.

한 측면에서, 키트는 올리고뉴클레오티드 태그 및 고정 올리고뉴클레오티드를 포함하는 고정 시약을 포함한다. 한 측면에서, 고정 시약은 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드는 약 10 내지 약 30개의 핵산 길이이다. 한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드는 17개 또는 25개의 올리고뉴클레오티드 길이이다.

한 측면에서, 키트 내 고정 올리고뉴클레오티드는 5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-(서열번호 1669)를 포함한다. 한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드는 5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(서열번호 1665)로 이루어진다.

한 측면에서, 키트 내 증폭 주형은 5' 말단 뉴클레오티드 서열 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 증폭 주형, 및 고정 시약의 고정 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 내부 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 증폭 주형의 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 내부 서열과 중첩되지 않는다.

한 측면에서, 키트 내 증폭 주형은 5' 말단 뉴클레오티드 서열 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 증폭 주형, 고정 시약의 고정 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제1 내부 뉴클레오티드 서열 및 검출 시약의 핵산 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제2 내부 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 증폭 주형의 서열은 제1 및 제2 내부 서열과 중첩되지 않는다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5' 말단 포스페이트 그룹을 포함한다.

한 측면에서, 키트 내 증폭 주형은 약 53 내지 약 61개의 뉴클레오티드 길이이다. 한 측면에서, 5' 및 3' 말단 서열의 길이의 합은 약 14 내지 약 24개의 뉴클레오티드 길이이다. 한 측면에서, 3' 및 5' 말단 서열 길이의 합은 약 14 내지 약 19개의 뉴클레오티드 길이이다. 한 측면에서, 3' 및 5' 말단 서열 길이의 합은 약 14개 또는 약 15개의 뉴클레오티드 길이이다.

한 측면에서, 키트 내 증폭 주형은 5'-GTTCTGTC-3'(서열번호 1666)의 5' 말단 서열 및 5'-GTGTCTA-3'(서열번호 1667)의 3' 말단 서열을 포함한다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(서열번호 1668)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(서열번호 1669)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'(서열번호 1670)로 이루어진 서열을 포함한다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA-3'(서열번호 1671)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

한 측면에서, 키트 내 증폭 주형은 원형 증폭 주형을 포함한다.

한 측면에서, 키트 내 검출 프로브는 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 태그, 단일 가닥 RNA 표적 보체 및 단일 가닥 DNA 검출 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 키트 내 고정 시약은 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 태그 및 단일 가닥 DNA 고정 서열을 포함한다.

한 측면에서, 키트는 RNase를 포함한다.

한 측면에서, 키트 내 검출 프로브의 검출 올리고뉴클레오티드는 증폭 주형의 5' 말단 서열에 상보적인 제1 서열 및 증폭 주형의 3' 말단 서열에 상보적인 인접한 제2 서열을 포함한다.

한 측면에서, 키트 내 검출 시약의 핵산 서열은 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(서열번호 1672)의 14개 또는 15개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 측면에서, 검출 시약의 핵산 서열은 서열 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(서열번호 1672)를 포함한다. 한 측면에서, 검출 시약의 핵산 서열은 서열 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(서열번호 1668)를 포함한다.

한 측면에서, 키트 내 검출 시약의 표지는 전기화학발광(ECL) 표지를 포함한다.

한 측면에서, 키트의 지지체 표면은 탄소계 지지체 표면을 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 탄소계 전극을 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 카본 잉크 전극을 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 멀티 웰 플레이트 검정 소모품을 포함하고, 플레이트의 각 웰은 카본 잉크 전극을 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 비드를 포함한다.

한 측면에서, 복수의 포획 올리고뉴클레오티드는 어레이를 형성하기 위해 개별 결합 도메인에서 키트의 고상 지지체에 고정된다. 한 측면에서, 복수의 포획 올리고뉴클레오티드 및 적어도 하나의 고정 시약은 어레이를 형성하기 위해 개별 결합 도메인에서 고상 지지체에 고정되고, 각각의 결합 도메인은 복수의 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나 및 적어도 하나의 고정 시약을 포함한다.

한 측면에서, 키트의 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드는 다음 요건 중 하나 이상을 충족하는 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 세트로부터 선택된다:

(a) 약 40% 내지 약 50%의 GC 함량;

(b) 약 30 내지 약 70%의 AG 함량;

(c) 약 30% 내지 약 70%의 CT 함량;

(d) 3개 이하의 서열의 염기 반복부의 최대 스트링;

(e) 일렬로 7개 초과의 상보적 염기쌍 일치의 스트링과의 바람직하지 않은 올리고뉴클레오티드-올리고뉴클레오티드 상호작용이 없다;

(i) 각 엔드에 있는 말단 염기는 상보적으로 일치하고;

(ii) 상보적 염기쌍 일치의 합에서 불일치의 합을 뺀 값이 7보다 크다;

(g) 게놈 또는 자연의 서열 또는 서열의 보체 또는 둘 다와 일치하는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개 또는 이보다 긴 염기쌍의 스트링이 없다;

(h) 보체가 있는 서열에 대한 혼성화 자유 에너지의 차이는 약 1kCal/mol, 약 2kCal/mol, 약 3kCal/mol 또는 약 4kCal/mol 미만이다;

(i) 스템에서 4개 이상 연속 일치되는 예측된 헤어핀 루프가 없다; 및

한 측면에서, 키트의 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드는 다음으로부터 선택된다:

한 측면에서, 다음을 포함하는, 샘플에서 표적 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 키트가 제공된다:

(b) 올리고뉴클레오티드 태그 및 고정 올리고뉴클레오티드를 포함하는 고정 시약;

(c) 올리고뉴클레오티드 태그, 표적 보체 및 단일 가닥 DNA 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 검출 프로브;

(d) 전기화학발광(ECL) 표지 및 핵산 서열을 포함하는 검출 시약.

(e) 5' 말단 뉴클레오티드 서열 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 증폭 주형, 고정 시약의 고정 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제1 내부 뉴클레오티드 서열 및 검출 시약의 핵산 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제2 내부 뉴클레오티드 서열로서, 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 증폭 주형의 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 제1 및 제2 내부 서열과 중첩되지 않음;

(f) 핵산 리가아제; 및

(g) 핵산 중합효소.

한 측면에서, 고정 시약은 키트의 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 고정 시약은 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 태그 및 단일 가닥 DNA 고정 올리고뉴클레오티드를 포함하고; 검출 프로브는 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 태그, 단일 가닥 RNA 표적 보체 및 단일 가닥 DNA 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하고; 상기 키트는 RNase를 추가로 포함한다.

(a) 고정된 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하는 지지체 표면;

(b) 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그 및 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 제1 영역에 상보적인 제1 핵산 서열을 포함하는 표적화 프로브;

(c) 검출 올리고뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드 서열의 제2 영역에 상보적인 제2 핵산 서열을 포함하는 검출 프로브로서, 표적화 프로브의 제1 핵산 서열 및 검출 프로브의 제2 핵산 서열은 표적 뉴클레오티드의 인접한 서열에 상보적인 검출 프로브;

(d) 증폭 주형;

(e) 핵산 리가아제;

(f) 핵산 중합효소; 및

(g) 표지 및 핵산 서열을 포함하는 검출 시약.

한 측면에서, 표적화 프로브는 검출 프로브의 5' 말단 뉴클레오티드가 상보적인 영역에 인접한 표적 뉴클레오티드 서열의 영역에 상보적인 말단 3' 뉴클레오티드를 갖는다. 한 측면에서, 표적화 프로브의 말단 3' 뉴클레오티드는 표적 뉴클레오티드 서열의 다형성 뉴클레오티드에 상보적이다.

(c) 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그 및 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 제1 영역에 상보적인 제1 핵산 서열을 포함하는 표적화 프로브;

(d) 검출 올리고뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드 서열의 제2 영역에 상보적인 제2 핵산 서열을 포함하는 검출 프로브로서, 표적화 프로브의 제1 핵산 서열 및 검출 프로브의 제2 핵산 서열은 표적 뉴클레오티드의 인접한 서열에 상보적인 검출 프로브:

(f) 핵산 리가아제;

(g) 핵산 중합효소; 및

(h) 전기화학발광(ECL) 표지 및 핵산 서열을 포함하는 검출 시약.

한 측면에서, 키트는 선형 증폭 주형, 및 결찰 버퍼, 아데노신 트리포스페이트(ATP), 소 혈청 알부민(BSA), Tween 20, T4 DNA 리가아제 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 검출 혼합물을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 검출 혼합물은 BSA, 버퍼, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(deoxynucleoside triphosphate, dNTP), Tween 20, Phi29 DNA 중합효소 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 회전 환 증폭을 위한 하나 이상의 성분을 포함한다.

한 측면에서, 키트는 ECL 판독 버퍼를 포함한다.

도 1a는 올리고뉴클레오티드 결찰 검정(oligonucleotide ligation assay, OLA) 혼성화 단계의 개략도이다; 도 1b는 OLA 결찰 단계의 개략도이다; 도 1c는 OLA 검출 단계의 개략도이다; 도 1d는 혼성화가 일어나지 않는 OLA 프로브 불일치의 개략도이다.
도 2a는 표지된 ddNTP가 프로브의 3' 엔드에 부가된 프라이머 연장 검정(primer extension assay, PEA)의 개략도이다; 도 2b는 표지되지 않은 ddNTP가 프로브의 3' 엔드에 부가된 PEA의 개략도이다.
도 3은 포획 올리고뉴클레오티드와 전극 사이의 링커(또는 스페이서)의 길이 변화가 프로브의 포획 올리고뉴클레오티드에 대한 혼성화 및 전기화학발광을 이용한 검출에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 4는 상이한 포획 올리고뉴클레오티드 어레이 세척 조건이 어레이의 한 요소에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브의 측정된 교차 반응성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5는 표적 BRAF 유전자 영역을 함유하는 핵산 주형의 농도의 함수로서 BRAF 돌연변이에 대한 전기화학발광 OLA에 대한 검정 신호를 비교하는 그래프이며 돌연변이체 서열 대 야생형 서열로 생성된 신호를 비교한다.
도 6은 특정 표적 서열의 농도의 함수로서 전기화학발광 OLA의 패널에 의해 생성된 검정 신호를 나타내는 그래프이다.
도 7은 전기화학발광 OLA의 패널에 대한 브릿징 배경 신호(bridging background signal)가 차단 올리고뉴클레오티드가 포함됨으로써 감소될 수 있음을 보여주는 그래프이다.
도 8은 프로브와 포획 올리고뉴클레오티드의 비특이적 결합으로 인한 전기화학발광 OLA의 상승된 배경이 차단 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 고도의 엄격한 고온 침지 단계를 추가함으로써 감소될 수 있음을 보여주는 그래프이다.
도 9는 돌연변이체 세포와 야생형 세포의 혼합물로부터 추출된 PCR 증폭된 게놈 DNA로부터의 전기화학발광 OLA 결과에 대한 돌연변이체 BRAF 및 NRAS 서열의 예측된 백분율 대 돌연변이체 서열의 실제 백분율을 나타낸다.
도 10은 돌연변이체 서열 및 야생형 서열을 나타내는 주형 핵산의 농도의 함수로서 BRAF 1799T>A 돌연변이에 대한 전기화학발광 PEA에 대한 검정 신호를 나타내며, 상기 검정은 돌연변이체 서열에 대해 특이적임을 보여준다.
도 11은 BRAF 및 NRAS SNP에 대한 전기화학발광 PEA의 패널이 투입 DNA 농도에 대해 선형 반응됨을 나타내는 그래프이다.
도 12는 돌연변이체 세포와 야생형 세포의 혼합물로부터 추출된 PCR 증폭된 게놈 DNA를 측정하기 위해 전기화학발광 BRAF 1799T>A OLA 검정을 사용한 돌연변이체 BRAF 1799T>A 서열의 예측된 백분율 대 돌연변이체 서열의 실제 백분율을 나타낸다.
도 13은 돌연변이체 세포와 야생형 세포의 혼합물로부터 추출된 PCR 증폭된 게놈 DNA를 측정하기 위해 전기화학발광 NRAS 181C>A OLA 검정을 사용한 돌연변이체 NRAS 181C>A 서열의 예측된 백분율 대 돌연변이체 서열의 실제 백분율을 나타낸다.
도 14는 돌연변이체 세포와 야생형 세포의 혼합물로부터 추출된 PCR 증폭된 게놈 DNA를 측정하기 위해 전기화학발광 182A>T OLA 검정을 사용한 돌연변이체 182A>T 서열의 예측된 백분율 대 돌연변이체 서열의 실제 백분율을 나타낸다.
도 15는 본원의 실시양태에 기술된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 대사산물을 함유할 수 있는 샘플체서 표적 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 치료용 올리고뉴클레오티드의 검출, 확인 및/또는 정량화를 위한 올리고뉴클레오티드 결찰 증폭(OLA) 검정을 나타낸다.
도 16은 본원의 실시양태에 기술된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 대사산물을 함유할 수 있는 샘플에서 표적 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 치료용 올리고뉴클레오티드의 검출, 확인 및/또는 정량화를 위한 직접 혼성화 방법을 나타낸다.
도 17은 본원의 실시양태에 기술된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 대사산물을 함유할 수 있는 샘플에서 표적 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 치료용 올리고뉴클레오티드의 검출, 확인 및/또는 정량화를 위한 직접 표면 코팅을 사용한 뉴클레아제 보호 검정(nuclease protection assay, NPA)을 나타낸다.
도 18은 본원의 실시양태에 기술된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 대사산물을 함유할 수 있는 샘플에서 표적 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 치료용 올리고뉴클레오티드의 검출, 확인 및/또는 정량화를 위한 혼성화/보호 검정을 나타낸다.
도 19는 샘플에서 항체, 예를 들어, 항-약물 항체(anti-drug antibody, ADA)의 검출, 확인 및/또는 정량화를 위한 샌드위치 검정을 나타낸다.
도 20은 ASO 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 양성 대조군 올리고뉴클레오티드에 의해 브릿징된 표적화 프로브 및 검출 프로브의 개략도를 나타낸다.
도 21은 샘플에서 항체, 예를 들어, 항-약물 항체의 검출, 확인 및/또는 정량화를 위한 도 19에 나타낸 샌드위치 검정의 변형을 도시한다.
도 22는 본원에 기술된 바와 같이 신호 증폭을 위한 검출 올리고뉴클레오티드로 표적 올리고뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 방법의 개략도이다.
도 23a는 본원에 기술된 바와 같이 지지체 표면에 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 반응 생성물을 고정시키는 방법의 개략도이다.
도 23b는 회전 환 증폭(RCA)에 의해 검출 복합체를 검출하는 방법의 개략도이며, 검출 복합체는 고정 올리고뉴클레오티드를 통해 지지체 표면에 고정된다.
도 24는 도 23a 및 23b에 나타낸 방법에 사용하기 위한 프로브 및 고정 시약에 대한 올리고뉴클레오티드 서열의 예를 제공한다.

A. 정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미가 있다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함하고 복수형 용어는 단수형을 포함하는데, 예를 들어, "a" 또는 "an"은 복수형, 예를 들어, "하나 이상" 또는 "적어도 하나"를 포함하며 용어 "또는"은 대안만을 언급하도록 명시적으로 지시되거나 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미할 수 있다. "포함하는", "포함하다" 및 "포함되는"이라는 용어는 제한적이지 않다. 임의 유형의 본원에 제공된 범위는 기술된 특정 범위 내의 모든 값 및 특정 범위에 대한 엔드포인트에 대한 값을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "약"은, 예를 들어, 본 발명을 기술하는 데 사용된 조성물 중 성분의 양, 농도, 부피, 공정 온도, 공정 시간, 수율, 유량, 압력 및 이들의 범위를 수식하는 데 사용된다. 용어 "약"은, 예를 들어, 화합물, 조성물, 농축물 또는 제형을 제조하는데 사용되는 전형적인 측정 및 취급 절차를 통해; 이러한 절차의 부주의한 오류를 통해; 방법을 수행하는 데 사용되는 출발 물질 또는 성분의 제조, 공급처 또는 순도의 차이 및 기타 유사한 고려사항을 통해 발생할 수 있는 수치적 양의 변화를 의미한다. 또한, 용어 "약"은 특정 초기 농도 또는 혼합물로 된 제형의 에이징으로 인해 차이나는 양 및 특정 초기 농도 또는 혼합물로 된 제형의 혼합 또는 가공으로 인해 차이나는 양을 포함한다. 용어 "약"에 의해 수식되는 경우, 본원에 첨부된 청구범위는 그러한 등가물을 포함한다.

본원에서 사용되는, 단어 "사이"를 사용하여 표현되는 범위는 범위 엔드포인트를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 50℃와 70℃ 사이의 범위는 50℃에서 70℃를 포함하며, 즉 50℃ 및 70℃인 엔드포인트를 포함한다.

일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법은 당업계에서 잘 공지되어 있고 통상 사용되는 것이다. 아미노산은 본원에서 통상 공지된 3문자 기호 또는 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에서 권장하는 1문자 기호로 언급될 수 있다. 마찬가지로 뉴클레오티드는 일반적으로 허용되는 단일 문자 코드로 지칭될 수 있다.

"표적 분석물"은 본원에 기술된 방법 및 키트에 의해 검출되고 분석될 수 있는 임의의 관심 분자를 포함할 수 있고 핵산, 단백질, 탄수화물, 당 및 지질과 같은 생물학적 분자를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 표적 분석물은 표적 뉴클레오티드 서열이다. 또 다른 측면에서, 표적 분석물은 단백질이다. 한 측면에서, 표적 분석물은 DNA 결합 단백질이다. 용어 "표적 분석물"은 전체 관심 분자나 관심 분자의 분절(segment) 또는 일부를 의미할 수 있다. 한 측면에서, 표적 분석물은 변형된 분자, 예를 들어, 관심 분자의 표지된, 절단된, 또는 화학적으로 또는 효소적으로 처리된 버전을 포함한다.

"표적 뉴클레오티드 서열"은 원핵 또는 진핵 DNA 유기체의 DNA 또는 RNA에서 발견되는 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 관심 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 여기에는 단일 또는 이중 가닥 DNA, 단일 또는 이중 가닥 RNA, DNA/RNA 혼성물 또는 DNA/RNA 모자이크가 포함될 수 있다. 표적 뉴클레오티드 서열은 miRNA, 치료용 RNA, mRNA, RNA 바이러스 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 이중 가닥 뉴클레오티드 서열의 경우, 표적 뉴클레오티드 서열은 어느 가닥에서나 확인될 수 있다. 표적 뉴클레오티드 서열은 추출, 예를 들어, 핵 DNA 또는 바이러스 게놈 DNA 또는 RNA를 필요로 할 수 있거나, 샘플, 예를 들어, 혈청 또는 혈장 내 무세포 태아 DNA 또는 무세포 종양 DNA, 또는 순환 중인 치료용 올리고뉴클레오티드에서 직접 조작될 수 있다. 표적 뉴클레오티드 서열은 생물학적 샘플로부터 직접 단리될 수 있거나 생물학적 샘플로부터의 증폭된 서열을 포함할 수 있다. 증폭 방법은 공지되어 있고 중합효소 연쇄 반응(PCR), 전체 게놈 증폭(whole genome amplification, WGA), 역전사 후 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription followed by the polymerase chain reaction, RT-PCR), 염기서열 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA) 또는 회전 환 증폭(RCA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원의 증폭 방법에 적합한 중합효소는, 예를 들어, DNA 증폭을 위한 Taq, Phi, Bst 및 Vent-exo, 및 예를 들어, RNA 증폭을 위한 T7 RNA 중합효소를 포함한다.

표적 뉴클레오티드 서열은 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 치료용 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본원에서 사용되는 "치료용 올리고뉴클레오티드"는 생체분자와 상호작용하여 치료 효과를 제공할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide, ASO)이다. ASO는 RNA 처리에 영향을 미치고/거나 단백질 발현을 조절할 수 있다. ASO는 단일 가닥 RNA에 결합하여 RNA를 비활성화시키는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. ASO는 전형적으로 약 5, 10, 15, 20 또는 25개의 뉴클레오티드 길이 내지 약 30, 35, 40, 45 또는 50개의 뉴클레오티드 길이인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, ASO는 유전자에 대한 메신저 RNA(mRNA)에 결합하여 유전자를 불활성화시킨다. 한 측면에서, 유전자는 질환 유전자이다. 따라서, ASO는 질환 유전자의 mRNA를 불활성화시켜 특정 질환 유발 단백질의 생성을 예방하거나 개선할 수 있다. 한 측면에서, ASO는 DNA, RNA 또는 이들의 조합을 포함한다. 치료용 올리고뉴클레오티드 및 ASO는, 예를 들어, Goodchild, Methods Mol Biol 764:1-15 (2011); Smith 등, Ann Rev Pharmacol Toxicol 59:605-630 (2019); 및 Stein 등, Mol Ther 25(5):1069-1075 (2017)에 추가로 기술되어 있다.

한 측면에서, 표적 분석물은 항-약물 항체(ADA)이다. 본원에서 사용되는 "항-약물 항체" 또는 "ADA"는 바이오의약품에 대해 유기체에서 생체 내 유도되는 항체이다. ADA는 단백질 및 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 치료용 폴리펩티드, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 짧은 간섭 RNA, 미세RNA(microRNA) 및 CRISPR/Cas에 대한 합성 가이드 가닥을 포함하지만 이에 제한되지 않는 치료용 올리고뉴클레오티드와 같은 바이오의약품에 대해 유도될 수 있다. ADA는 결합 항체로 지칭되는, 바이오의약품에 결합할 수 있는 임의의 항체 아이소타입(isotype)을 포함할 수 있고, 또한 중화 항체로 지칭되는, 치료제의 기능적 활성을 억제할 수 있는 결합 항체의 하위집단을 포함할 수 있다. ADA 검출은 면역원성의 중요한 척도가 될 수 있으며, 이는 바이오의약품의 안전성과 효능 모두에 영향을 미칠 수 있다.

샘플에서 치료용 올리고뉴클레오티드와 같은 표적 뉴클레오티드 서열은 뉴클레아제의 존재, 온도, pH, 염 농도 등과 같은 다양한 요인으로 인해 시간이 지남에 따라 붕해될 수 있는데, 즉 짧아질 수 있다. 표적 뉴클레오티드 서열의 붕해 생성물은 올리고뉴클레오티드 대사산물이라고도 지칭된다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물은 표적 뉴클레오티드 서열보다 1개 이상의 뉴클레오티드, 2개 이상의 뉴클레오티드, 3개 이상의 뉴클레오티드, 4개 이상의 뉴클레오티드, 5개 이상의 뉴클레오티드, 6개 이상의 뉴클레오티드, 7개 이상의 뉴클레오티드, 8개 이상의 뉴클레오티드, 9개 이상의 뉴클레오티드, 10개 이상의 뉴클레오티드, 15개 이상의 뉴클레오티드 또는 20개 이상의 뉴클레오티드가 더 짧다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물은 표적 뉴클레오티드 서열보다 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10% 더 짧다. 한 측면에서, 본 개시내용의 샘플은 표적 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 치료용 올리고뉴클레오티드, 및 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 대사산물, 예를 들어, 치료용 올리고뉴클레오티드 대사산물을 포함한다.

한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 치료용 올리고뉴클레오티드이다. 특정 측면에서, 샘플에서 치료용 올리고뉴클레오티드의 붕해는 치료용 올리고뉴클레오티드에 대한 약력학적 반응을 나타낸다. 본원에서 치료용 올리고뉴클레오티드 대사산물이라고도 지칭되는 붕해되거나 짧아진 치료용 올리고뉴클레오티드는 치료 효과를 잃을 수 있다. 본 개시내용의 방법은 올리고뉴클레오티드 대사산물, 예를 들어, 치료용 올리고뉴클레오티드 대사산물 대비 표적 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 치료용 올리고뉴클레오티드의 양을 측정하는 데 사용될 수 있다. 한 측면에서, 본 개시내용의 방법은 표적 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 치료용 올리고뉴클레오티드의 약동학적 매개변수를 결정하는 데 사용된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 치료용 올리고뉴클레오티드의 약동학적 매개변수는 생물학적 환경, 예를 들어, 환자에서 표적 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 치료용 올리고뉴클레오티드의 붕해 속도 및/또는 양을 측정함으로써 결정된다. 한 측면에서, 측정된 약동학적 매개변수는 클리어런스, 부피 분포, 혈장 농도, 반감기, 피크 시간, 피크 농도, 이용률 또는 이들의 조합이다. 약동학적 매개변수의 측정 및 해석에 대한 추가 논의는, 예를 들어, Benet, Eur J Respir Dis Suppl 134:45-61 (1984) 및 Le 등, "Overview of Pharmacokinetics," Merck Manual Professional Version, 2019년 5월 개정판에서 찾을 수 있다. 또한, 샘플에 존재하는 올리고뉴클레오티드 대사산물은 샘플에서 표적 뉴클레오티드 서열의 검출, 확인 및/또는 정량화를 방해할 수 있다. 따라서, 샘플로부터 올리고뉴클레오티드 대사산물을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 방법은 또한, 예를 들어, 표적 뉴클레오티드 서열의 양을 더 정확히 측정하기 위해 샘플로부터 올리고뉴클레오티드 대사산물을 감소시키고/거나 제거하는 데 사용될 수 있다.

한 측면에서, 표적 분석물은 올리고뉴클레오티드 태그 및 표지를 포함하는 "반응 생성물"을 생성하는 데 사용될 수 있는 표적 올리고뉴클레오티드이다. 다양한 방법을 사용하여 반응 생성물을 생성할 수 있다. 한 측면에서, 반응 생성물은 샌드위치 검정, 올리고뉴클레오티드 결찰 검정(OLA), 프라이머 연장 검정(PEA), 직접 혼성화 검정, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기반 검정 또는 기타 표적화 증폭 검정 및 뉴클레아제 보호 검정을 포함하지만 이에 제한되지 않는 방법에 의해 생성된다. 한 측면에서, 반응 생성물은 검출 프로브 및/또는 표적화 프로브가 혼성화되는 표적 올리고뉴클레오티드를 포함하는 "혼성화 복합체"이다. 한 측면에서, 혼성화 복합체는 핵산 리가아제가 표적화 및 검출 프로브를 결찰시키는 조건 하에서 핵산 리가아제의 존재하에 인큐베이션될 수 있다. 한 측면에서, 반응 생성물은 올리고뉴클레오티드 태그 및 표지를 포함한다. 한 측면에서, 반응 생성물은 올리고뉴클레오티드 및 검출 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 반응 생성물은 표적 올리고뉴클레오티드, 및 올리고뉴클레오티드 태그, 표적 보체 및 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 검출 프로브를 포함한다. 한 측면에서, 표적 보체는 표적 올리고뉴클레오티드의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 검출 프로브는 표적 보체와 표적 올리고뉴클레오티드 사이의 혼성화에 의해 표적 올리고뉴클레오티드에 혼성화한다. 또 다른 측면에서, 반응 생성물은 본원에 기술된 바와 같은 "샌드위치 복합체"이다.

한 측면에서, "검출 복합체"는 반응 생성물을 지지체 표면에 고정함으로써 형성된다. 한 측면에서, 반응 생성물은 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드와 반응 생성물 상에 존재하는 올리고뉴클레오티드 태그의 상보적인 뉴클레오티드 서열 사이의 혼성화에 의해 지지체 표면에 고정된다.

"중합 효소 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 다음 3단계의 반복 사이클을 수반하는 표적 뉴클레오티드 서열 증폭에 사용되는 기술을 지칭한다: (1) 이중 가닥 DNA 주형을 가열하여 가닥을 분리하는 변성; (2) 프라이머가 표적 DNA 서열의 측면에 있는 영역에 결합하는 어닐링; 및 (3) DNA 중합효소가 주형 가닥을 따라 각 프라이머의 3' 엔드를 연장하는 연장. PCR은 Taq 중합효소와 같은 열 안정성 DNA 중합효소를 사용할 수 있다.

"뉴클레오티드"는 질소 염기, 5탄당(리보스 또는 데옥시리보스) 및 적어도 하나의 포스페이트 그룹을 포함하는 단량체 단위를 지칭한다. 뉴클레오티드는 RNA에서 발견되는 ATP, UTP, CTG 및 GTP와 같은 리보뉴클레오시드 트리포스페이트; DNA에서 발견되는 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트, 가장 일반적으로 dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 및 예를 들어, ddATP, ddCTP, ddGTP 및 ddTTP를 포함하는, 중합효소 매개된 연장에 필요한 3'-OH가 결여된 디데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(ddNTP)를 포함한다.

"올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고"는 약 5 내지 약 100개, 약 10 내지 약 50개, 또는 약 10 내지 약 25개의 뉴클레오티드 길이 또는 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 및 최대 약 50, 75 또는 100개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 지칭한다. 본원에 기술된 프로브, 프라이머, 태그 또는 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, Beaucage 및 Carruthers (1981) Deoxynucleoside phosphoramidites - a new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. Tetrahedron Lett., 22(2):1859-1862에 의해 기술된 포스포르아미다이트 방법(phosphoramidite method), 또는 Matteucci 및 Caruthers (1981) Synthesis of deoxynucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc., 103(11):3185-3191에 따른 트리에스테르 방법을 포함하는 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

예를 들어, 본 개시내용의 표적 서열 또는 올리고뉴클레오티드 시약에 있는 것을 포함하는 본 개시내용의 뉴클레오티드 및 핵산은 혼성화 반응에도 참여할 수 있는 비-자연 발생 화학 구조를 포함하는 구조적 유사체를 포함할 수 있다. 한 예에서, 뉴클레오티드 또는 핵산은 이를 표지에 연결하거나, 예를 들어, 아민 또는 티올 변형된 뉴클레오티드 염기, 포스페이트 또는 당의 사용을 통해 표지에 연결될 수 있는 반응성 작용기를 제공하는 화학적 변형을 포함할 수 있다. 용어 "반응성 작용기"는, 예를 들어, 다른 작용기와 공유 결합을 형성하기 위해 추가 화학 반응을 겪을 수 있는 원자 또는 회합된 원자단을 지칭한다. 반응성 작용기의 예는 아미노, 티올, 하이드록시 및 카보닐 그룹을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 측면에서, 반응성 작용기는 티올 그룹을 포함한다. 이러한 화학적 변형을 통해 뉴클레오티드 또는 핵산에 연결될 수 있는 표지는 비오틴, 합텐(hapten), 형광단 및 전기화학발광(ECL) 표지와 같은 검출 가능한 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

또 다른 측면에서, 뉴클레오티드는, 예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 그룹을 디데옥시리보스로 교체함으로써 그것이 혼입되는 핵산 사슬의 효소적 또는 화학적 연장을 방지하도록 변형될 수 있다. 또 다른 예에서, 뉴클레오티드 염기(예를 들어, 당 또는 포스페이트 그룹)를 함께 연결하는 백본 구성요소는, 예를 들어, 펩티드 핵산(PNA)의 사용을 통해 또는 2'-O-메틸 치환된 RNA, 로킹된 핵산(locked nucleic acids), 브릿징된 핵산 및 모르폴리노 핵산에서 발견되는 것과 같은 리보스 유사체의 혼입에 의해 변형되거나 대체될 수 있다. 이들 "백본" 유사체는 핵산 또는 올리고뉴클레오티드의 백본 결합 중 하나, 일부 또는 모두에 존재할 수 있으며 결합 안정성 또는 뉴클레아제에 대한 연결 안정성이 개선된 혼성화 생성물과 같은 특정 이점을 제공할 수 있다. 뉴클레오티드 및 핵산 구조 유사체의 또 다른 예로 비천연 뉴클레오티드 염기가 포함될 수 있다. 비천연("비-정규" 염기라고도 지칭됨)은 천연(정규) 염기와 혼성화하거나 다른 비천연 염기와 혼성화할 수 있다.

"단리된"은 표적 분석물, 예를 들어, 보통 자연 발생 환경에서 수반되거나 상호작용하는 다른 서열 또는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 서열을 지칭한다. 한 측면에서, 단리된 뉴클레오티드 서열은 자연 환경의 핵산 서열에서 발견되지 않는 성분 또는 서열을 포함한다. 또한, 용어 "단리된"은 비-자연 발생 또는 재조합 생성된 올리고뉴클레오티드 또는 단백질 서열을 포함하는데, 이러한 비-자연 발생 또는 재조합 생성된 서열은 자연에서 발견되지 않기 때문이다. 특히, 비-자연 발생 또는 재조합 생성된 올리고뉴클레오티드는 자연 발생하지 않는 바로 인접한 서열을 가질 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "변이체"는 기준 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나 기준 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 아미노산 또는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드 서열을 지칭한다.

용어 "동일한"은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 서열이 비교 범위에 걸쳐 동일한 위치에서 각각 동일한 핵산 염기 또는 동일한 아미노산 잔기를 포함한다는 것을 의미한다. 용어 "서열 동일성 %"는 2개의 정렬된 서열을 비교 범위에 걸쳐 비교하고, 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에서 존재하는 위치의 수를 결정하여 일치하는 위치의 수를 산출하고, 일치하는 위치의 수를 비교 범위의 총 위치 수로 나누고 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출하여 결정할 수 있다. 비교 범위는 전장 서열을 포함할 수 있거나 더 큰 서열의 하위부분일 수 있다. MEGALIGN (DNASTAR, Inc. Madison, Wis.), FASTA, BLAST 또는 ENTREZ를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 2개 또는 서열 간의 동일성 %를 결정하기 위한 다양한 방법 및 알고리즘이 공지되어 있다.

"포획 올리고뉴클레오티드"는 지지체 표면에 고정될 수 있고 상보적 올리고뉴클레오티드에 혼성화하도록(따라서 표면에 포획되도록) 설계된 올리고뉴클레오티드 시약을 지칭한다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 반응 생성물 상에 존재하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그와 선택적으로 혼성화할 수 있는 단일 가닥 서열이다. 포획 올리고뉴클레오티드는 고체 형태, 예를 들어, 동결건조된 형태, 용액, 또는 지지체 표면, 예를 들어, 입자(예를 들어, 마이크로입자, 비드)에 고정된 형태, 또는 어레이로 제공될 수 있다. 2개 이상의 포획 올리고뉴클레오티드가 함께 제공될 수 있다. 함께 제공되는 2개 이상의 포획 올리고뉴클레오티드의 예는 본원에 기술된 바와 같은 포획 올리고뉴클레오티드의 모 세트(parent set) 또는 하위세트(본원에서 세트로도 지칭됨)를 포함한다.

"고정 시약"은 검출 복합체를 지지체 표면에 고정시키는 것을 돕기 위해 지지체 표면에 고정될 수 있는 화합물을 지칭한다. 고정 시약은 올리고뉴클레오티드 서열, 압타머(aptamer), 압타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 합텐, 에피토프(epitope) 또는 미모토프(mimotope)를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 고정 시약은 고정 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드는 검출 복합체에 부착된 연장된 서열 또는 앰플리콘의 고정 서열 보체의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 갖는 고정 서열을 포함한다. 한 측면에서, 고정 시약은 고정 서열 및 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다. 한 측면에서, 고정 서열은 지지체 표면에 직접 부착된다. 한 측면에서, 고정 서열은 올리고뉴클레오티드 태그와 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드 사이의 혼성화에 의해 지지체 표면에 간접적으로 부착된다. 한 측면에서, 고정 서열은 DNA 서열이다. 한 측면에서, 고정 서열은 RNA 서열이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 DNA 서열이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 DNA 서열이다. 한 측면에서, 고정 서열은 DNA 서열이고 올리고뉴클레오티드 태그 서열은 DNA 서열이다.

"프로브" 또는 "프라이머"는 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 시약을 지칭한다. 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열의 일부에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 단일 가닥 서열을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 프로브는 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드 태그 서열(본원에서 지시 서열(directing sequence)이라고도 지칭됨)을 포함한다. 한 측면에서, 프로브는 표지를 포함한다. 한 측면에서, 프로브는 올리고뉴클레오티드 태그 및 표지를 포함한다. 한 측면에서, 프로브는 올리고뉴클레오티드 태그 및 검출 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열 및 올리고뉴클레오티드 태그 서열은 프로브 내의 동일한 핵산 가닥 상에 존재한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열 및 올리고뉴클레오티드 태그 서열은 프로브 내의 상이한 가닥 상에 존재하며, 예를 들어, 프로브는 표적 서열에 상보적인 서열 및 브릿징 서열을 갖는 제1 가닥과 태그 서열 및 제1 가닥 상의 브릿징 서열에 상보적인 서열을 갖는 제2 가닥을 포함할 수 있고, 상기 제1 및 제2 가닥은 혼성화되거나 브릿징 서열을 통해 혼성화될 수 있다. 프로브는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 조합일 수 있으며 변형된 질소 염기 유사체를 함유하거나 표지 또는 표지 부착에 적합한 링커에 의해 변형된 것일 수 있다. 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 프로브의 혼성화를 허용하기에 충분히 길어야 하며, 전형적으로 약 5 내지 약 100개, 약 10 내지 약 50개, 약 20 내지 약 30개, 또는 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25개 및 최대 약 30, 35, 40, 45, 50, 75 또는 100개의 뉴클레오티드 길이이다. 프로브는 화학적 또는 효소적 합성을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해, 또는 비특이적 핵산 절단 화학물질 또는 효소를 사용하는 더 큰 핵산의 절단에 의해, 또는 부위 특이적 제한 엔도뉴클레아제에 의해 제조될 수 있다. 일부 적용에서, 표적 서열의 상보적인 영역에 혼성화되는 프로브는 중합효소에 의해 프로브의 연장을 프라이밍할 수 있으며, 이는 표적 서열에서 인접한 단일 가닥 영역의 복제를 위한 시작점으로 작용할 수 있다.

"표적화 프로브"는 표적 보체 및 올리고뉴클레오티드 태그를 포함하는 프로브를 지칭한다. 한 측면에서, 표적 보체는 샘플에서 표적 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 표적 보체는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 표적 보체는 DNA 서열이다. 한 측면에서, 표적 보체는 RNA 서열이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 DNA 서열이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 RNA 서열이다.

"검출 프로브"는 표적 보체 및 표지를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 지칭한다. 한 측면에서, 표적 보체는 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 올리고뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 표지는 검출 가능한 표지, 예를 들어, 전기화학발광(ECL) 표지를 포함한다. 한 측면에서, 표지는 검출 가능한 표지를 부착하기에 적합한 결합 파트너를 포함한다. 한 측면에서, 표지는 비오틴을 포함하고 스트렙트아비딘(streptavidin) 또는 아비딘(avidin)을 포함하는 검출 가능한 표지에 결합할 수 있다. 한 측면에서, 표지는 당업계에 공지된 올리고뉴클레오티드 증폭 기술을 사용하여 연장되거나 증폭될 수 있는 검출 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 검출 올리고뉴클레오티드는 표지된 검출 시약이 혼성화할 수 있는 하나 이상 또는 다수의 검출 표지화 부위를 포함하는 연장된 서열(또는 앰플리콘)을 형성하도록 연장된다. 한 측면에서, 연장된 서열(또는 앰플리콘)은 고정 올리고뉴클레오티드의 핵산 서열에 상보적이고 그와 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 고정 서열 보체를 포함한다. 한 측면에서, 고정 서열 보체는 검출 복합체를 지지체 표면에 고정시키기 위해 지지체 표면에 고정된 고정 올리고뉴클레오티드에 혼성화한다. 한 측면에서, 지지체 표면에 고정된 검출 복합체에 부착된 연장된 서열이 검출된다. 한 측면에서, 검출 프로브는 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다. 한 측면에서, 검출 프로브는 올리고뉴클레오티드 태그, 표적 보체 및 표지를 포함한다. 한 측면에서, 검출 프로브는 올리고뉴클레오티드 태그, 표적 보체 및 검출 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 DNA 서열이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 RNA 서열이다. 한 측면에서, 표적 보체는 DNA 서열이다. 한 측면에서, 표적 보체는 RNA 서열이다. 한 측면에서, 검출 올리고뉴클레오티드는 DNA 서열이다. 한 측면에서, 검출 올리고뉴클레오티드는 RNA 서열이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 DNA 서열이고, 표적 보체는 RNA 서열이고 검출 올리고뉴클레오티드는 DNA 서열이다.

"링커"(본원에서 "스페이서"라고도 지칭됨)는 하나의 화학적 모이어티를 다른 화학적 모이어티에 연결하는 하나 이상의 원자, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드에 반응성 작용기 또는 표지를 연결하는 하나 이상의 원자를 지칭한다. 링커는 하나 이상의 원자, 예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 원자 내지 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 원자를 포함하는 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 화합물일 수 있고 탄소, 산소, 황, 질소 및 인과 같은 원자 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 링커의 예는 아미드, 에스테르, 카보네이트 및 에테르 그룹과 같은 저분자량 그룹은 물론 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 알킬 사슬과 같은 고분자량 연결 그룹을 포함한다. 따라서, 링커는 하나 이상의 원자, 단위 또는 분자를 포함할 수 있다.

"표지"는 검출 가능한 물리적 특성이 있거나 화학적 그룹 또는 모이어티가 검출 가능한 물리적 특성을 나타내도록 할 수 있는 화학적 그룹 또는 모이어티를 지칭하며, 예를 들어, 기질을 검출 가능한 생성물로 전환하는 것을 촉매하는 효소를 포함한다. 표지는 분광, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광학, 화학 또는 기타 방법으로 검출할 수 있다. 표지의 예는 방사성동위원소, 효소, 기질, 형광 분자, 화학발광 모이어티, 전기화학발광 모이어티, 자성 입자 및 생물발광 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또 다른 측면에서, 표지는 결합 쌍의 구성원인 화합물이며, 결합 쌍의 제1 구성원("1차 결합 시약"으로 지칭될 수 있음)은 기질, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드에 부착되고 결합 쌍의 다른 구성원("2차 결합 시약"으로 지칭될 수 있음)은 검출 가능한 물리적 특성이 있다. 결합 쌍의 비제한적인 예는 비오틴 및 스트렙트아비딘, 또는 아비딘; 상보적 올리고뉴클레오티드; 합텐 및 합텐 결합 파트너; 및 항체/항원 결합 쌍을 포함한다. 한 측면에서, 표지는 검출 올리고뉴클레오티드를 포함한다. "검출"은 표지의 존재 또는 부재에 기초하여 올리고뉴클레오티드와 같은 물질의 존재를 검출, 관찰 또는 정량화하는 것을 지칭한다.

"검출 시약"은 표적 분석물, 프로브, 반응 생성물 또는 검출 복합체의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있는 화합물을 지칭한다. 한 측면에서, 검출 시약은 검출 가능한 표지를 포함한다. 한 측면에서, 검출 가능한 표지는 전기화학발광(ECL) 표지를 포함한다. 한 측면에서, 검출 시약은 검출 가능한 표지 및 부착 요소를 포함하고, 부착 요소는 검출 가능한 표지를 표적 분석물, 프로브, 반응 생성물 또는 검출 복합체에 부착시킨다. 한 측면에서, 부착 요소는 결합 쌍의 구성원이다. 한 측면에서, 부착 요소는 스트렙트아비딘을 포함하고 프로브, 반응 생성물 또는 검출 복합체는 비오틴을 포함하여 검출 시약이 비오틴에 대한 스트렙트아비딘의 결합을 통해 프로브, 반응 생성물 또는 검출 복합체에 결합된다. 한 측면에서, 부착 요소는 검출 복합체에 부착된 연장된 서열(또는 앰플리콘) 상의 검출 표지화 부위의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 연장된 서열(또는 앰플리콘)은 RCA에 의해 생성된다. 한 측면에서, 검출 시약은 검출 가능한 표지, 및 검출 복합체에 부착된 연장된 서열(또는 앰플리콘) 상의 검출 표지화 부위의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 검출 시약은 전기화학발광 표지, 및 검출 복합체에 부착된 연장된 서열(또는 앰플리콘) 상의 검출 표지화 부위의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. "상보적"은, 예를 들어, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 모델에 따라 수소결합의 형성에 의해 상호작용하는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 서열을 의미한다. 예를 들어, 혼성화는 2개의 상보적 DNA 분자 사이(DNA-DNA 혼성화), 2개의 RNA 분자(RNA-RNA 혼성화) 또는 상보적 DNA와 RNA 분자 사이(DNA-RNA 혼성화)에서 발생할 수 있다. 혼성화는 더 긴 뉴클레오티드 서열의 일부에 상보적인 짧은 뉴클레오티드 서열 사이에서 발생할 수 있다. 혼성화는 "서열 상보성"이 100%가 아닌 서열(즉, 왓슨-크릭 염기쌍 모델과 같은 염기쌍 모델을 기반으로 100% 미만의 뉴클레오티드가 정렬되는 서열) 사이에 발생할 수 있지만, 서열 상보성이 더 작은 서열이 서열 상보성이 더 큰 서열보다 덜 안정하고 덜 혼성화할 가능성이 있다. 한 측면에서, 상보적 서열의 뉴클레오티드는 왓슨-크릭 모델을 기반으로 100% 서열 상보성을 갖는다. 또 다른 측면에서, 상보적 서열의 뉴클레오티드는 왓슨-크릭 모델을 기반으로 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상보성을 갖는다.

2개의 상보적 서열이 혼성화하는지 여부는 혼성화 조건의 엄격성에 따라 달라질 수 있으며, 이는 온도, 용매, 이온 강도 및 기타 매개변수와 같은 조건에 따라 달라질 수 있다. 혼성화 조건의 엄격성은 잠재적으로 교차 반응 또는 간섭 서열의 존재하에 2개의 상보적 핵산 서열의 원하는 혼성화 생성물의 선택적 형성 또는 유지를 제공하도록 선택될 수 있다. 엄격한 조건은 서열 의존적이다 - 전형적으로 더 긴 상보적 서열은 더 짧은 상보적 서열보다 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 일반적으로, 엄격한 혼성화 조건은 정의된 이온 강도, 화학적 변성제의 농도, pH 및 혼성화 파트너의 농도에서 특정 뉴클레오티드 서열에 대한 열 융점(T_m)(즉, 서열의 50%가 실질적으로 상보적 서열에 혼성화되는 온도)보다 약 5℃ 내지 약 10℃ 더 낮다. 일반적으로, 더 높은 백분율의 G 및 C 염기를 갖는 뉴클레오티드 서열은 더 낮은 백분율의 G 및 C 염기를 갖는 뉴클레오티드 서열보다 더 엄격한 조건 하에서 혼성화한다. 일반적으로, 온도를 높이거나, pH를 높이거나, 이온 강도를 낮추거나, 화학적 핵산 변성제(예컨대 포름아미드, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 카보네이트)의 농도를 높이면 엄격도를 높일 수 있다. 엄격한 혼성화 조건은 전형적으로 약 1M, 500mM 또는 200mM 미만의 염 농도; 약 20℃, 30℃, 40℃, 60℃ 또는 80℃ 초과의 혼성화 온도; 및 약 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 초과의 화학적 변성제 농도를 포함한다. 많은 인자가 혼성화의 엄격성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 매개변수의 조합이 임의의 매개변수 단독의 절대값보다 더 중요할 수 있다.

용어 "보체" 또는 "상보적"은 염기가 염기별로 상보적 염기쌍을 형성하는 2개의 올리고뉴클레오티드를 지칭하며, 예를 들어, A는 T 또는 U와 쌍을 이루고 C는 G와 쌍을 이룬다. 완벽한 상보성 또는 100% 상보성은 하나의 올리고뉴클레오티드 서열 또는 영역의 각 뉴클레오티드가 제2 올리고뉴클레오티드 가닥 또는 영역의 각 뉴클레오티드와 수소결합할 수 있는 상황을 지칭한다. "실질적 상보성"은 부분적으로 상보적이고 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화할 수 있는 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보적 서열은 전체 길이를 따라 혼성화할 필요가 없다.

"상응하는"은 포획 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드 태그 사이의 관계를 지칭하기 위해 사용될 수 있으며, 올리고뉴클레오티드 태그는 엄격한 혼성화 조건 하에서 특정 포획 올리고뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하도록 설계된다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 이의 상응하는 포획 분자에 특이적으로 결합하고 엄격한 조건 하에서 다른 포획 분자와 결합하거나 교차 반응하지 않는다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 이의 상응하는 포획 분자에 특이적으로 결합하고 엄격한 조건 하에서 어레이 내 다른 포획 분자와 결합하거나 교차 반응하지 않는다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 이의 "상응하는" 포획 올리고뉴클레오티드의 서열의 적어도 일부에 상보적인 서열을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, "상응하는" 올리고뉴클레오티드 태그 및 포획 올리고뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드는 왓슨-크릭 모델을 기반으로 100% 서열 상보성을 갖는다. 또 다른 측면에서, 상응하는 서열의 뉴클레오티드는 왓슨-크릭 모델에 기초하여 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상보성을 갖는다.

단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 인접한 뉴클레오티드가 이의 3' 탄소원자와 5' 탄소원자 사이의 포스포디에스테르 결합에 의해 결합되어 - 이는 분자의 5'-(포스포릴) 및 3'-(하이드록실) 엔드라고 지칭될 수 있다 - 말단 5' 및 3' 탄소가 폴리뉴클레오티드의 어느 한 말단에서 노출되기 때문에 "방향" 또는 "방향성"을 갖는다. "역(inverse)" 올리고뉴클레오티드는 5'- 에서 3'- 방향으로 읽을 때 기준 올리고뉴클레오티드의 역 서열이다. 예를 들어, 기준 올리고뉴클레오티드 서열 5'-ACCGATCATG-3'(서열번호 1649)의 경우, "역" 올리고뉴클레오티드 서열은 5'-GTACTAGCCA-3'(서열번호 1650)일 것이다.

왓슨-크릭 염기쌍과 DNA-DNA, RNA-RNA 및 RNA-DNA 이중 나선의 역평행 특성에 의해 정의된 규칙에 따르면 서열의 보체는 원래 서열에서는 염기의 왓슨-크릭 파트너(또는 실질적으로 왓슨-크릭 파트너)이지만 3'에서 5'의 순서인 염기 스트링을 포함한다. 서열 5'-ACCGATCATG-3'(서열번호 1649)의 보체의 예는 5'-CATGATCGGT-3'(서열번호 1651)일 것이다. 역보체라는 용어가 서열과 관련하여 본원에서 사용되는 경우, 이는 원래 서열의 역의 보체를 지칭하는 데 사용된다. 서열 5'-ACCGATCATG-3'(서열번호 1649)의 역보체의 예는 5'-TGGCTAGTAC-3'(서열번호 1652)일 것이다.

"교차 반응" 또는 "교차 반응성"은 샘플에서 하나 초과의 다른 올리고뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 서열의 능력을 지칭한다. 한 측면에서, 용어 "교차 반응"은 샘플에서 제2 올리고뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 제1 올리고뉴클레오티드 서열의 능력을 말하며, 제2 올리고뉴클레오티드 서열은 제1 올리고뉴클레오티드 서열에 상보적이지 않거나 실질적으로 상보적이지 않다. 한 측면에서, 용어 "교차 반응" 또는 "교차 반응성"은 포획 올리고뉴클레오티드가 샘플에서 하나 초과의 올리고뉴클레오티드 태그 또는 하나 초과의 태그된 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 능력을 지칭한다. 한 측면에서, 교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드는 엄격한 포획 혼성화 조건하에 샘플에서 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 태그에 혼성화한다. 한 측면에서, 엄격한 포획 혼성화 조건은 27℃ 내지 47℃의 온도, 21% 내지 41%의 포름아미드 농도, 300mM 내지 500mM의 염 농도 및 7.5 내지 8.5의 pH를 포함한다. 한 측면에서, 엄격한 포획 혼성화 조건은 약 37℃의 온도, 약 31%의 포름아미드 농도, 약 400mM의 염 농도 및 8.0의 pH를 포함한다.

"비-교차 반응성" 또는 "비-교차 반응"은 샘플에서 특정 올리고뉴클레오티드 서열에만 혼성화하는 제1 올리고뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 제1 올리고뉴클레오티드 서열이 샘플에서 이의 상응하는 상보적 서열에만 혼성화하는 능력을 지칭한다. 한 측면에서, 용어 "비-교차 반응성"은 하나 초과의 올리고뉴클레오티드 태그 또는 하나 초과의 태그된 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 샘플에서 하나의 올리고뉴클레오티드 태그에만 혼성화하는 포획 올리고뉴클레오티드의 능력을 지칭한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 프로브는 엄격한 혼성화 조건하에 샘플에서 하나의 올리고뉴클레오티드 태그에만 혼성화한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성은 제1 올리고뉴클레오티드가 샘플에서 이의 상보적 서열 이외의 서열에 결합하는 비율이 엄격한 포획 혼성화 조건 하에서 0.05% 미만임을 의미한다.

"리가아제"는 제2 뉴클레오티드 서열의 5' 포스페이트를 갖는 하나의 뉴클레오티드 서열의 3' 하이드록실 사이에 포스포디에스테르 결합의 형성을 촉매함으로써 뉴클레오티드 서열을 함께 결합할 수 있는 효소 부류를 지칭한다. 리가아제는 대장균(E. coli) DNA 리가아제, T4 DNA 리가아제, T4 RNA 리가아제, T. 아쿠아티쿠스(T. aquaticus)(Taq) 리가아제, T. 써모필러스(T. Thermophilus) DNA 리가아제(예를 들어, HiFi 리가아제) 또는 피로코쿠스(Pyrococcus) DNA 리가아제를 포함한다. 한 측면에서, 리가아제는 열안정성 리가아제이다. "결찰"은 하나의 뉴클레오티드 서열의 3' 하이드록실과 제2 뉴클레오티드 서열의 5' 포스페이트 사이에 포스포디에스테르 결합의 형성에 의해 2개의 뉴클레오티드 서열을 함께 연결하는 과정을 지칭한다.

"어레이"는 본원에서 결합 도메인 또는 어레이 요소로 지칭되는, 하나 초과의 공간적으로 구별되는(즉, 겹치지 않는) 어드레싱 가능한(addressable) 위치가 있는 하나 이상의 지지체 표면을 지칭한다. 한 측면에서, 각각의 어드레싱 가능한한 위치는, 예를 들어, 포획 분자를 포함하는 검정 시약을 포함한다.

"지지체 표면"은 다양한 물질, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 고정될 수 있는 표면 물질을 의미한다. "지지체 표면"은 평면 또는 비평면일 수 있다. 한 측면에서, 지지체 표면은 편평한 표면을 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 복수의 웰이 있는 플레이트, 즉 "멀티 웰 플레이트"이다. 멀티 웰 플레이트는 임의의 패턴 또는 구성으로 배열된 임의의 크기 또는 모양의 임의의 개수의 웰을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 지지체 표면은 곡면을 갖는다. 한 측면에서, 지지체 표면은 하나 이상의 입자, 비드 또는 미소구에 의해 제공된다. 입자, 비드 또는 미소구라는 용어는 달리 표시되지 않는 한 상호교환적으로 사용될 수 있다. 한 측면에서, 지지체 표면은 색상 코딩된 입자, 비드 또는 미소구를 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 검정 플레이트, 슬라이드, 카트리지, 비드 또는 칩과 같은 검정 모듈을 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 검정 흐름 세포(assay flow cell) 또는 검정 유체(assay fluidics)를 포함한다.

한 측면에서, 지지체 표면은, 예를 들어, "유전자 칩" 장치에서 전형적인 바와 같이 복수의 어드레싱 가능한 위치("스폿"으로 지칭될 수 있음)를 포함한다. 또 다른 측면에서, 어레이는 비드 현탁액 중 각각의 비드가 어드레싱 가능한 위치(예를 들어, 유세포분석 또는 현미경 검출 기술을 사용하여 어드레싱될 수 있음)를 나타내는 "비드 어레이" 접근법에서와 같이 표면 각각이 하나의 어드레싱 가능한 위치를 갖는 복수의 지지체 표면을 포함한다. 또 다른 측면에서, 어레이는 표면 각각이 표면당 하나 이상 또는 둘 이상의 어드레싱 가능한 위치를 갖는 복수의 지지체 표면을 포함한다. 지지체 표면 상의 어드레싱 가능한 위치는 균일한 행과 열로 배열되거나 다른 패턴을 형성할 수 있다. 어레이의 어드레싱 가능한 위치의 수는, 예를 들어, 10개 미만에서 50, 100, 200, 500 또는 1000개 초과까지 다양할 수 있다. "멀티플렉싱"은 단일 검정에서 하나 초과의 검정 표적을 동시에 분석하는 것을 지칭한다.

"탄소계"는 원소 탄소(C)를 주성분으로 함유하는 물질을 지칭한다. 탄소 함유 또는 탄소계 물질의 예는 탄소, 카본 블랙, 흑연 탄소, 유리질 탄소, 탄소 나노튜브, 탄소 피브릴, 흑연, 탄소 섬유 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않다. 탄소계 물질은, 예를 들어, 흑연, 카본 블랙 또는 탄소 나노튜브를 포함한 원소 탄소를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 탄소계 물질은 전도성 탄소-중합체 복합물, 전도성 중합체, 또는 매트릭스에 분산된 전도성 입자, 예를 들어, 카본 잉크, 탄소 페이스트 또는 금속 잉크를 포함한다. 전도성 탄소 입자는, 예를 들어, 매트릭스, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트(EVA), 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 클로라이드 또는 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(ABS)과 같은 중합체 매트릭스에 분산된 탄소 피브릴, 카본 블랙 또는 흑연 탄소를 포함한다. 이러한 중합체 매트릭스는 또한 비닐 아세테이트, 에틸렌, 비닐 알코올, 비닐 클로라이드, 아크릴로니트릴, 부타디엔, 스티렌 또는 다른 단량체로부터 선택된 단량체를 포함할 수 있는 하나 초과의 유형의 성분 단량체와의 공중합체를 포함할 수 있다.

"대립유전자"는 표적 뉴클레오티드 서열의 게놈 변이체를 지칭하며, 번역될 때 기능적 또는 기능 장애 유전자 생성물을 초래할 수 있다. 두 가지 대립유전자 형태는 "야생형 대립유전자" 및 "돌연변이체" 또는 "변이체" 대립유전자로 지칭될 수 있다. "야생형"은 집단에서 우세한 뉴클레오티드 서열을 의미한다. "돌연변이체" 또는 "변이체"는 집단에서 덜 빈번한 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 돌연변이체 또는 변이체 뉴클레오티드 서열은 기능적 영향력을 가질 수도 있고 가지지 않을 수도 있다.

"다형성" 또는 "다형성 부위"는 2개 이상의 핵산 그룹에서 하나의 변이체를 지칭한다. "단일 뉴클레오티드 변이체"("단일 뉴클레오티드 다형성", "SNP" 또는 "단일 뉴클레오티드 변경"이라고도 함)는 단일 뉴클레오티드만을 포함하는 변이체를 지칭한다. 단일 뉴클레오티드 변이체는 다형성 부위에서 하나의 뉴클레오티드의 다른 뉴클레오티드로의 치환, 기준 뉴클레오티드 서열로부터의 뉴클레오티드의 결실, 기준 뉴클레오티드 서열로의 뉴클레오티드의 삽입을 포함할 수 있다. 단일 뉴클레오티드 변이체는 흔하거나(예를 들어, 집단의 적어도 1%로 존재) 희귀할 수 있다(예를 들어, 집단의 1% 미만으로 존재).

"키트"는, 예를 들어, 조성물을 생성하거나 장치를 제조하거나 방법을 수행하기 위해 함께 사용하기 위해 제공되거나 모여있는 일련의 구성요소를 의미한다. 키트는 하나 이상의 구성요소를 포함할 수 있다. 키트의 구성요소는 하나의 패키지 또는 여러 패키지로 제공될 수 있으며 각 패키지는 하나 이상의 구성요소를 포함할 수 있다. 키트의 나열된 구성요소는 결국 단일 물리적 부품 또는 키트 사용을 위해 결합되는 여러 부품으로 제공될 수도 있다. 예를 들어, 키트의 기구 구성요소는 완전히 조립된 상태로 제공되거나 사용 전에 조립되는 여러 기구 부품으로 제공될 수 있다. 유사하게, 키트의 액체 시약 구성요소는 완전한 액체 제형을 제공하기 위해 조합되는 하나 이상의 건조 시약과 하나 이상의 액체 희석제로 또는 완전한 액체 제형을 제공하기 위해 조합되는 둘 이상의 액체 용액으로 용기 내 완전한 액체 제형으로서 제공될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 검정을 위한 키트 구성요소는 상이한 보관 요구사항, 예를 들어, 4℃ 대 -70℃의 보관 온도로 인해 종종 개별적으로 운송되고 보관된다.

B. 개요

샘플에서 하나 이상의 표적 분석물을 확인, 검출 또는 정량화하기 위한 키트 및 이의 제조 및 사용 방법이 본원에 기술되어 있다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 지지체 표면 상의 개별 결합 도메인에 고정되거나 고정될 수 있는 하나 이상의 포획 분자를 포함한다. 한 측면에서, 포획 분자는 프로브 또는 반응 생성물에 부착된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 단일 가닥 포획 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그를 포함하는 프로브는 표적 분석물을 포획 분자로 향하게 하기 위해 표적 분석물과 회합된다. 한 측면에서, 표적 분석물은 올리고뉴클레오티드 태그를 포함하는 제1 프로브 및 표지를 포함하는 제2 프로브와 회합된다. 한 측면에서, 표적 분석물은 올리고뉴클레오티드 태그 및 표지를 포함하는 검출 프로브와 회합된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열을 주형으로 사용하여 반응 생성물이 생성된다. 한 측면에서, 반응 생성물은 올리고뉴클레오티드 태그 및 표지를 포함한다. 한 측면에서, 반응 생성물은 올리고뉴클레오티드 태그 및 표지를 포함하는 검출 프로브와 회합된 표적 분석물을 포함한다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드와 반응 생성물 상의 태그의 상보적 뉴클레오티드 서열 사이의 혼성화는 반응 생성물을 지지체 표면에 고정시켜 검출 복합체를 형성하고, 포획된 반응 생성물은 부가된 표지를 기반으로 확인, 검출 또는 정량화될 수 있다.

한 측면에서, 지지체 표면에 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 고정시키는 방법이 제공된다. 한 측면에서, 상기 방법은 지지체 표면 상에 티올 반응성 그룹을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 고정시키는 것을 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 지지체 표면 상의 하나 이상의 결합 도메인에 고정된다. 한 측면에서, 상기 방법은 결합되지 않은 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위해 티올 함유 세척 용액(본원에서 차단 용액(blocking solution) 또는 차단제(blocker)라고도 지칭됨)으로 지지체 표면을 세척하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 각각의 결합 도메인은 약 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02% 또는 0.01% 미만의 오염 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 본원에 기술된 샘플에서 하나 이상의 표적 분석물을 확인, 검출 또는 정량화하기 위한 방법 및 키트는 기존 방법에 비해 증가된 감도를 제공한다. 한 측면에서, 본 개시내용의 방법 및 키트는 샘플에서 표적 분석물을 나노몰(nanomolar), 적합하게는 피코몰(picomolar), 또는 더 적합하게는 펨토몰(femtomolar) 농도로 검출할 수 있다. 한 측면에서, 본 개시내용의 방법 및 키트는 적어도 약 0.1fM, 1fM, 25fM, 50fM, 75fM 또는 100fM 및 최대 약 500fM, 1pM, 10pM, 100pM, 500pM 또는 1nM, 또는 약 0.1fM 내지 약 1nM, 약 1fM 내지 약 100pM, 약 10fM 내지 약 10pM, 약 50fM 내지 약 1pM 또는 약 100fM 내지 약 500fM의 샘플 내 표적 분석물을 검출할 수 있다. 한 측면에서, 본 개시내용의 방법 및 키트는 약 0.1fM, 약 1fM, 약 2.5fM, 약 5fM, 약 10fM, 약 25fM, 약 50fM, 약 100fM, 약 250fMfM, 약 500fM, 약 1pM, 약 2.5pM, 약 5pM, 약 10pM, 약 25pM, 약 50pM, 약 100pM 또는 약 1nM의 샘플 내 표적 분석물을 검출할 수 있다.

특정 측면에서, 본원에 제공된 방법 및 키트는 샘플에서 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 치료용 올리고뉴클레오티드 또는 RNA, 예컨대 mRNA의 펨토몰 농도를 검출할 수 있으며, 이는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 필요 없이 유리하게 확인, 검출 및/또는 정량화를 가능케 한다.

한 측면에서, 본원에 제공된 방법 및 키트는 기존 방법과 비교하여 샘플에서 하나 이상의 표적 분석물을 확인, 검출 또는 정량화하는 데 필요한 시간을 줄일 수 있다. 한 측면에서, 본 개시내용의 방법 및 키트는 약 1시간 내지 약 48시간, 약 1.5시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 18시간, 약 2.5시간 내지 약 12시간, 약 3시간 내지 약 10시간, 약 3.5시간 내지 약 8시간, 약 4시간 내지 약 6시간 또는 약 4.5시간 내지 약 5시간 내에 샘플에서 하나 이상의 표적 분석물을 확인, 검출 또는 정량화할 수 있다. 한 측면에서, 본 개시내용의 방법 및 키트는 약 48시간 미만, 약 36시간 미만, 약 24시간 미만, 약 18시간 미만, 약 12시간 미만, 약 10시간 미만, 약 9시간 미만, 약 8시간 미만, 약 7시간 미만, 약 6시간 미만, 약 5시간 미만, 약 4시간 미만, 약 3시간 미만, 약 2시간 미만 또는 약 1시간 미만 내에 샘플에서 하나 이상의 표적 분석물을 확인, 검출 또는 정량화할 수 있다.

C. 포획 분자

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 지지체 표면 상의 개별 결합 도메인에 고정되거나 고정될 수 있는 하나 이상의 포획 분자를 포함한다. 한 측면에서, 포획 분자는 자연 발생 서열이 아니다. 또 다른 측면에서, 포획 분자는 재조합적으로 생성된다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 분자 세트에 대한 서열은 수학적 알고리즘을 사용하여 생성된다.

한 측면에서, 포획 분자는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 단일 가닥 포획 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 표적 분석물에 부착된다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 표적 분석물과 회합된 프로브에 부착된다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 표적 뉴클레오티드 서열을 주형으로 사용하여 생성된 반응 생성물에 부착된다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드 태그의 상보적 뉴클레오티드 서열 사이의 혼성화는 관심 표적 또는 반응 생성물을 지지체 표면에 고정시켜 검출 복합체를 형성한다. 포획된 표적 또는 반응 생성물은 부가된 표지를 기반으로 확인, 검출 또는 정량화될 수 있다.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 확인, 검출 또는 측정될 각각의 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 개별 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 복수의 포획 올리고뉴클레오티드와 이들의 상보적 올리고뉴클레오티드 태그 사이의 혼성화는 포획 올리고뉴클레오티드 어레이에 걸쳐 병렬로 동시에 일어난다. 어레이는 본원에 기술된 2개 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 따라서, 어레이는 2-150개 이상의 포획 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 또는 최대 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150개의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 어레이 내 올리고뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오티드의 "모 세트" 또는 "하위세트"(본원에서 "세트"로도 지칭됨)를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 또는 혼성화 반응에도 참여할 수 있는 비-자연 발생 화학 구조를 포함하는 구조적 유사체를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 단일 가닥 핵산 서열을 포함한다.

한 측면에서, 특정 어레이에 사용되는 포획 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 서로 적어도 약 0.5℃, 1℃, 2℃, 3℃, 4℃ 또는 5℃ 내에서 유사한 결합 에너지 또는 용융 온도(Tm)를 가지며, 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(T_m)는 올리고뉴클레오티드의 50%가 보체와 혼성화하고 50%는 용액에서 유리 상태인 온도를 말한다. T_m은 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 온도의 함수로서 올리고뉴클레오티드와 이의 보체의 흡광도 변화를 측정함으로써 결정될 수 있다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 50mM NaCl에서의 용융 온도(T_m)가 약 50℃ 내지 약 70℃, 55℃ 내지 약 65℃, 또는 적어도 약 50℃, 55℃ 또는 60℃ 및 최대 약 60℃, 65℃ 또는 70℃이다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 GC 함량이 약 40% 내지 약 60% 또는 약 40% 내지 약 50%이다.

한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 약 20 내지 약 100개, 약 30 내지 약 50개 또는 약 35 내지 약 40개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 적어도 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개 및 최대 약 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 75 또는 100개의 뉴클레오티드 길이이다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 적어도 20, 24, 30 또는 36개의 뉴클레오티드를 포함한다. 적어도 약 20, 24, 30 또는 36개의 뉴클레오티드 길이인 포획 올리고뉴클레오티드는 태그된 표적 또는 반응 생성물에 결합할 수 있고, 더 짧은 올리고뉴클레오티드와 비교하여 향상된 특이성(즉, 비-특이적 결합이 적음)으로 더 높은 승온에서 결합된 상태를 유지한다. 한 측면에서, 어레이 내 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 이의 상보적 올리고뉴클레오티드 태그의 핵산 서열과 길이가 동일하지 않다. 사실, 상보적 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그보다 더 긴, 예를 들어, 최대 5, 10, 15, 20 또는 25개의 염기만큼 더 긴 서열을 가진 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 한 측면에서, 태그된 표적 또는 반응 생성물 및 포획 올리고뉴클레오티드는 약 1:1의 비율로 포함된다. 또 다른 측면에서, 태그된 표적 또는 반응 생성물은 태그된 표적 또는 반응 생성물을 포획 올리고뉴클레오티드에 결합시킬 가능성을 증가시키기 위해 과량으로 존재한다. 한 측면에서, 태그된 반응 생성물 및 포획 올리고뉴클레오티드는 약 2:1, 3:1, 4:1 또는 5:1의 비율로 포함된다.

한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 지지체 표면에 공유적으로 또는 비공유적으로 고정된다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 지지체 표면 상의 하나 이상의 결합 도메인에 공유적으로 또는 비공유적으로 고정된다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 상의 음으로 하전된 포스페이트 그룹과 지지체 표면 상의 양전하 사이의 정전기적 상호작용을 통해 지지체 표면에 흡착된다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 표면에 고정된 제2 결합 파트너에 대한 포획 올리고뉴클레오티드에 (직접 또는 링커 모이어티를 통해) 부착된 제1 결합 파트너의 결합을 통해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 지지체 표면에 공유적으로 고정된다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 지지체 표면에 직접 고정된다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 지지체 표면에 고정된다.

한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 반응성 작용기를 포함한다. 한 측면에서, 작용기는 티올(-SH) 또는 아민(-NH₂) 그룹을 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 반응성 작용기를 통해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 포획 올리고뉴클레오티드에 부착되는 반응성 작용기를 통해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 티올 또는 아민 그룹을 통해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 링커(본원에서 "스페이서"라고도 지칭됨)를 통해 포획 올리고뉴클레오티드에 부착되는 티올 또는 아민 그룹을 통해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 링커는 약 3 내지 약 20개의 원자 또는 분자 또는 단위, 또는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 및 최대 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 원자 또는 분자 또는 단위를 포함한다. 한 측면에서, 링커는 탄소원자 링커이다. 한 측면에서, 링커는 에틸렌 글리콜 링커 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커이다. 한 측면에서, 링커는 최대 3, 4, 5 또는 6개의 연속 PEG 단위를 포함한다. 또 다른 측면에서, 링커는 3개의 연속 PEG 단위를 포함한다. 또 다른 측면에서, 링커는 6개의 연속 PEG 단위를 포함한다. 링커는 실시예 2에 나타낸 구조를 가질 수 있다.

한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 단백질로 전처리된 지지체 표면에 고정된다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 가교결합제를 통해 지지체 표면에 고정된다. 단백질과 핵산을 서로 연결하거나 다른 물질에 연결하기 위한 적합한 호모-이작용성 및 헤테로-이작용성 가교결합제는 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, Thermo Scientific Crosslinking Technical Handbook, published by Thermo Fisher Scientific, 2012)를 참조한다. 한 측면에서 가교결합제는 아민 반응성 모이어티(예를 들어, N-하이드록시석신이미드 또는 N-하이드록시설포석신이미드 에스테르) 및 티올 반응성 모이어티, 예컨대 말레이미드, 요오도석신이미드 또는 활성화된 디설파이드(예컨대 피리딜디설파이드)를 포함하는 헤테로-이작용성 가교결합제이고; 이러한 헤테로-이작용성 교차작용성 가교결합제는, 예를 들어, 설포석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(Sulfo-SMCC)를 포함한다. 한 측면에서, 아민 반응성 모이어티(예를 들어, SMCC의 N-하이드록시석신이미드(NHS) 모이어티)는 단백질과 반응하여 티올 반응성 모이어티(예를 들어, SMCC의 말레이미드 모이어티)를 단백질에 도입한다. 티올 반응성 모이어티는 결국 티올 변형된 포획 올리고뉴클레오티드와 반응하여 안정한 티오에테르 결합을 통해 연결된 단백질-올리고뉴클레오티드 접합체를 형성한다. 단백질-올리고뉴클레오티드 접합체의 어레이는 단백질을 흡착하거나 단백질과 반응하는 표면 상에 시약의 패턴을 인쇄하여 패턴화된 어레이를 생성함으로써 형성될 수 있다. 한 측면에서, 흑연 탄소 표면, 예를 들어, 스크린 인쇄된 카본 잉크 전극 상에 단백질-올리고뉴클레오티드 접합체를 인쇄함으로써 어레이가 형성된다. 예를 들어, 기재내용 전문이 참조로 포함된 미국 특허 공개공보 제2016/0069872호, 미국 특허 제6,977,722호 및 제7,842,246호 참조. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 단백질로 전처리되지 않은 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 상술된 바와 같이 올리고뉴클레오티드를 고정시키는 데 사용되는 단백질-올리고뉴클레오티드의 단백질 성분은 BSA이다.

한 접근법에서, 다음 요구사항 중 하나 이상을 충족하는 위에서 논의된 길이(예를 들어, 24, 30 또는 36-mer)의 포획 올리고뉴클레오티드 세트를 생성하기 위해 컴퓨터 알고리즘을 사용한다: (a) 약 40% 내지 약 50%의 GC 함량, (b) 약 30 내지 약 70%의 AG 함량, (c) 약 30% 내지 약 70%의 CT 함량, (d) 3개 이하의 서열의 염기 반복부의 최대 스트링; (e) 일렬로 7개 초과의 상보적 염기쌍 일치의 스트링과의 바람직하지 않은 올리고뉴클레오티드-올리고뉴클레오티드 상호작용이 없다; (f) 18개 이하의 연속 염기의 스트링과의 바람직하지 않은 올리고뉴클레오티드-올리고뉴클레오티드 상호작용이 없으며: (i) 각 엔드에 있는 말단 염기는 상보적으로 일치하고; (ii) 상보적 염기쌍 일치의 합에서 불일치의 합을 뺀 값이 7보다 크다; (g) 주어진 게놈, 예를 들어, 인간 게놈, 또는 자연의 서열의 서열(또는 서열의 보체 또는 둘 다)과 일치하는 20개 또는 이보다 긴 염기쌍(예를 들어, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 염기쌍)의 스트링이 없다; (h) 보체가 있는 서열(또는 보체가 있는 5' 엔드의 처음 24개의 올리고뉴클레오티드)에 대한 혼성화 자유 에너지의 차이는 약 1kCal/mol, 약 2kCal/mol, 약 3kCal/mol 또는 약 4kCal/mol 미만이다; (i) 스템에서 4개 이상 연속 일치되는 예측된 헤어핀 루프가 없다; (j) 스템에서 4개 이상 연속 일치되는 예측된 헤어핀 루프가 없고 6개 염기 초과의 루프 크기가 없다. 한 측면에서, 적어도 기준 (a) 내지 (h)가 고려된다. 이와 관련하여 바람직하지 않은 올리고뉴클레오티드-올리고뉴클레오티드 상호작용은 올리고뉴클레오티드 자체, 세트 내 다른 서열 또는 세트 내 다른 서열의 보체와의 상호작용을 지칭한다. 혼성화를 위한 자유 에너지(ΔG)는 일반적으로 지정된 이온 강도, 온도 및 pH, 예를 들어, 실온(약 25℃)에서 생리학적 이온 강도 및 pH(약 150mM NaCl, 약 pH 7.2) 또는 약 23℃에서 약 200mM의 1가 양이온, 약 pH 7.0, 또는 다른 관련 조건에 대해 계산된다. 대안적으로 또는 추가로, 다음 구성 중 하나 이상을 피할 수 있다: 검정에 사용되는 다른 포획 올리고뉴클레오티드와 쌍을 이룰 때 G/C 풍부 서열 사이에 위치하는 단일 뉴클레오티드 루프의 형성 또는 단일 뉴클레오티드 불일치.

한 측면에서, 포획 분자는 서열번호 1-774(표 1-12) 중 임의의 것으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1-774 중 임의의 것으로 표시되는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1-774 중 임의의 것으로 표시되는 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1-774 중 임의의 것으로 표시되는 서열의 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1-64 중 임의의 것으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1-64 중 임의의 것으로 표시되는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1-64 중 임의의 것으로 표시되는 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1-64 중 임의의 것으로 표시되는 서열의 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 10, 11 내지 13, 25 내지 26, 33 내지 37, 42, 44 내지 46, 54 및 59 내지 62 중 임의의 것으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 10, 11 내지 13, 25 내지 26, 33 내지 37, 42, 44 내지 46, 54 및 59 내지 62 중 임의의 것으로 표시되는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 10, 11 내지 13, 25 내지 26, 33 내지 37, 42, 44 내지 46, 54 및 59 내지 62 중 임의의 것으로 표시되는 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 10, 11 내지 13, 25 내지 26, 33 내지 37, 42, 44 내지 46, 54 및 59 내지 62 중 임의의 것으로 표시되는 서열의 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1-10 중 임의의 것으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1-10 중 임의의 것으로 표시되는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1-10 중 임의의 것으로 표시되는 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1-10 중 임의의 것으로 표시되는 서열의 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1-10 중 임의의 것으로 표시되는 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1-10 중 임의의 것으로 표시되는 서열의 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

한 측면에서, 알고리즘을 사용하여 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트를 생성하기 위해 염기 서열이 사용된다. 한 측면에서, 최대 4개 세트의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드가 생성된다: (a) 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 제1 세트는 염기 서열을 사용하여 생성된다; (b) 제1 세트의 포획 올리고뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 제2 세트가 생성될 수 있다; (c) 제1 세트의 포획 올리고뉴클레오티드 서열의 역 서열을 갖는 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 제3 세트가 생성될 수 있다; 및 (d) 제1 세트의 포획 올리고뉴클레오티드 서열의 역보체 서열을 갖는 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 제4 세트가 생성될 수 있다.

한 측면에서, 염기 서열을 사용하여 생성된 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 각각의 세트는 "모 세트"로 지칭된다. 모 세트로부터의 2개 이상의 올리고뉴클레오티드는 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 "하위세트"(본원에서 "세트"라고도 지칭됨)를 형성하도록 선택될 수 있으며, 하위세트의 각 올리고뉴클레오티드는 동일한 모 세트의 구성원이다(즉, 하위세트는 하나 초과의 모 세트로부터의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 없다).

예를 들어, 염기 서열은 다음을 생성하는 데 사용될 수 있다: (a) 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 제1 모 세트; (b) 제1 세트의 포획 올리고뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 제2 모 세트가 생성될 수 있다; (c) 제1 세트의 포획 올리고뉴클레오티드 서열의 역 서열을 갖는 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 제3 모 세트가 생성될 수 있다; 및 (d) 제1 세트의 포획 올리고뉴클레오티드 서열의 역보체 서열을 갖는 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 제4 모 세트가 생성될 수 있다.

하위세트(또는 세트)는 다음을 포함할 수 있다: (a) 제1 모 세트로부터의 2개 이상의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드; (b) 제2 모 세트로부터의 2개 이상의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드; (c) 제3 모 세트로부터의 2개 이상의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드; 또는 (d) 제4 모 세트로부터의 2개 이상의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트 또는 하위세트는 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 모 세트로부터 선택된 약 50 내지 약 150개, 약 50 내지 약 100개, 약 60 내지 약 75개 또는 약 60 내지 약 65개의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트 또는 하위세트는 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 모 세트로부터 선택된 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 및 최대 약 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125 또는 150개의 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 제1 염기 서열은 표 1에 나타낸 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 제1 세트(서열번호 1-64)를 생성하는 데 사용된다. 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 제1 세트의 상보적 서열은 표 4에 나타낸 또 다른 비-교차 반응성 서열 세트(서열번호 187-250)를 생성하는 데 사용될 수 있다. 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 제1 세트의 역 서열은 표 7에 나타낸 또 다른 비-교차 반응성 서열 세트(서열번호 373-436)를 생성하는 데 사용될 수 있다. 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 제1 세트의 역보체 서열은 표 10에 나타낸 또 다른 비-교차 반응성 서열 세트(서열번호 559-622)를 생성하는 데 사용될 수 있다.

한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 1(서열번호 1-64)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 서열을 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 4(서열번호 187-250)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 서열을 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 7(서열번호 373-436)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 서열을 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 10(서열번호 559-622)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 서열을 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 1(서열번호 1-64), 표 4(서열번호 187-250), 표 7(서열번호 373-436) 또는 표 10(서열번호 559-622)에 나타낸 모 세트로부터 선택된 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 및 최대 64개의 비-교차 반응성 서열의 하위세트이다.

한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 1(서열번호 1-64), 표 4(서열번호 187-250), 표 7(서열번호 373-436) 또는 표 10(서열번호 559-622)에 나타낸 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 1(서열번호 1-64), 표 4(서열번호 187-250), 표 7(서열번호 373-436) 또는 표 10(서열번호 559-622)에 나타낸 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 1(서열번호 1-64), 표 4(서열번호 187-250), 표 7(서열번호 373-436) 또는 표 10(서열번호 559-622)에 나타낸 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 제2 염기 서열은 표 2(서열번호 65-122)에 나타낸 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 제2 세트를 생성하는 데 사용된다. 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 이 제2 세트의 상보적 서열은 표 5(서열번호 251-308)에 나타낸 다른 비-교차 반응성 서열 세트를 생성하는 데 사용될 수 있다. 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 이 제2 세트의 역 서열은 표 8(서열번호 437-494)에 나타낸 또 다른 비-교차 반응성 서열 세트를 생성하는 데 사용될 수 있다. 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 이 제2 세트의 역보체 서열은 표 11(서열번호 623-680)에 나타낸 또 다른 비-교차 반응성 서열 세트를 생성하는 데 사용될 수 있다.

한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 2(서열번호 65-122)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 서열을 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 5(서열번호 251-308)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 서열을 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 8(서열번호 437-494)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 서열을 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 11(서열번호 623-680)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 서열을 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 2(서열번호 65-122), 표 5(서열번호 251-308), 표 8(서열번호 437-494) 또는 표 11(서열번호 623-680)에 나타낸 모 세트로부터 선택된 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 및 최대 64개의 비-교차 반응성 서열의 하위세트이다.

한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 2(서열번호 65-122), 표 5(서열번호 251-308), 표 8(서열번호 437-494) 또는 표 11(서열번호 623-680)에 나타낸 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 2(서열번호 65-122), 표 5(서열번호 251-308), 표 8(서열번호 437-494) 또는 표 11(서열번호 623-680)에 나타낸 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 2(서열번호 65-122), 표 5(서열번호 251-308), 표 8(서열번호 437-494) 또는 표 11(서열번호 623-680)에 나타낸 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 제3 염기 서열은 표 3(서열번호 123-186)에 나타낸 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 제3 세트를 생성하는 데 사용된다. 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 이 제3 세트의 상보적 서열은 표 6(서열번호 309-372)에 나타낸 또 다른 비-교차 반응성 서열 세트를 생성하는 데 사용될 수 있다. 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 이 제3 세트의 역 서열은 표 9(서열번호 495-558)에 나타낸 또 다른 비-교차 반응성 서열 세트를 생성하는 데 사용될 수 있다. 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드의 이 제3 세트의 역보체 서열은 표 12(서열번호 681-744)에 나타낸 또 다른 세트의 비-교차 반응성 서열을 생성하는 데 사용될 수 있다.

한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 3(서열번호 123-186)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 서열을 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 6(서열번호 309-372)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 서열을 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 9(서열번호 495-558)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 서열을 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 12(서열번호 681-744)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 서열을 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 3(서열번호 123-186), 표 6(서열번호 309-372), 표 9(서열번호 495-558) 또는 표 12(서열번호 681-744)에 나타낸 모 세트로부터 선택된 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 및 최대 64개의 비-교차 반응성서열의 하위세트이다.

한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 3(서열번호 123-186), 표 6(서열번호 309-372), 표 9(서열번호 495-558) 또는 표 12(서열번호 681-744)에 나타낸 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 3(서열번호 123-186), 표 6(서열번호 309-372), 표 9(서열번호 495-558) 또는 표 12(서열번호 681-744)에 나타낸 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 표 3(서열번호 123-186), 표 6(서열번호 309-372), 표 9(서열번호 495-558) 또는 표 12(서열번호 681-744)에 나타낸 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 서열번호 1-64로부터 선택된 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 포획 올리고뉴클레오티드; 서열번호 1-64로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 포획 올리고뉴클레오티드; 서열번호 1-64로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 포획 올리고뉴클레오티드; 서열번호 1-64로부터 선택된 서열을 갖는 포획 올리고뉴클레오티드; 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트는 서열번호 1-10으로부터 선택된 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 포획 올리고뉴클레오티드; 서열번호 1-10으로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 포획 올리고뉴클레오티드; 서열번호 1-10으로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 포획 올리고뉴클레오티드; 서열번호 1-10으로부터 선택된 서열을 갖는 포획 올리고뉴클레오티드; 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 단백질에 공유 결합되고 지지체 표면 상의 고정은 지지체 표면으로의 단백질의 흡착을 통해 달성된다. 사용될 수 있는 단백질의 예는 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 알부민, 면역글로불린 또는 지지체 표면에 흡착하는 능력에 대해 선택된 다른 단백질을 포함한다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 결합 파트너 쌍으로부터의 제1 결합 파트너에 (직접 또는 링커를 통해) 부착되고 고정은 이 제1 결합 파트너와 지지체 표면에 고정된 결합 파트너 쌍으로부터의 제2 결합 파트너의 결합에 의해 달성된다. 포획 올리고뉴클레오티드를 고정시키는 데 사용하기에 적합한 결합 파트너 쌍은 비오틴-스트렙트아비딘, 비오틴-아비딘, 항체-합텐, 항체-에피토프 태그(예를 들어, 항체-FLAG), 니켈-NTA 및 수용체-리간드 쌍과 같은 당업계에 공지된 결합 파트너 쌍을 포함한다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 티올(-SH) 또는 아민(-NH₂) 그룹을 통해 단백질 또는 제1 결합 파트너에 공유 결합된다. 이 결합은 직접적이거나 연결 그룹(예를 들어, Thermo Scientific Crosslinking Technical Handbook, published by Thermo Fisher Scientific, 2012에 기술된 것과 같은 이작용성 연결 그룹)을 통해 이루어질 수 있다. 한 측면에서, 티올 또는 아민 그룹은 포획 올리고뉴클레오티드의 5'- 또는 3'-엔드에 있다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 5'-말단 티올화 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 3'-말단 티올화 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 티올 그룹은 포획 올리고뉴클레오티드의 내부 위치에 통합된다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1489-1498(표 25) 중 임의의 것으로 표시되는 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1489-1498 중 임의의 것으로 표시되는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1489-1498로 표시되는 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1489-1498 중 임의의 것으로 표시되는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 티올(-SH) 또는 아민(-NH₂) 그룹을 통해 지지체 표면에 공유 결합된다. 한 측면에서, 티올 또는 아민 그룹은 포획 올리고뉴클레오티드의 5'- 또는 3'-엔드에 있다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 5'-말단 티올화 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 3'-말단 티올화 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 티올 그룹은 포획 올리고뉴클레오티드의 내부 위치에 통합된다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1489-1498(표 25) 중 임의의 것으로 표시되는 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1489-1498 중 임의의 것으로 표시되는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1489-1498로 표시되는 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1489-1498 중 임의의 것으로 표시되는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1489-1498로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 보체 또는 역보체(reverse/inverse complement)인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1489-1498로 표시되는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열의 보체 또는 역보체인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1489-1498로 표시되는 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 서열의 보체 또는 역보체인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1489-1498 중 임의의 것으로 표시되는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열의 보체 또는 역보체인 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 Luminex x-TAG 기술과 유사하게 천연 서열과의 혼성화를 감소시키기 위해 단지 3개의 염기(TAG)를 포함한다.

D. 고정 시약

한 측면에서, 지지체 표면은 검출 복합체를 지지체 표면에 고정시키기 위한 고정 시약을 포함한다. 예를 들어, 고정 시약은 낮은 결합 친화도 상호작용 및/또는 높은 분자량 표지(들) 또는 표지화 부위(들)를 갖는 검출 복합체를 안정화하는 데 도움을 줄 수 있다. 고정 시약은 IMPROVED METHODS FOR CONDUCTING MULTIPLEXED ASSAYS라는 제목으로 2020년 2월 28일 출원된 국제 출원 번호 PCT/US20/020288에 개시되어 있으며 이의 개시내용 전문이 본원에 참조로 포함된다.

한 측면에서, 고정 시약은 올리고뉴클레오티드 서열, 압타머, 압타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 합텐, 에피토프 또는 미모토프를 포함한다. 한 측면에서, 고정 시약은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 고정 올리고뉴클레오티드로 지칭될 수 있다. 한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드는 검출 복합체에 부착된 고정 서열 보체의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 고정 영역을 갖는 올리고뉴클레오티드가 검출 복합체에 부착된다. 한 측면에서, 고정 시약은 검출 복합체에 부착된 고정 영역에 결합하는 DNA-결합 단백질이다. 한 측면에서, 고정 시약은 인터칼레이터(intercalator)이고 검출 복합체에 부착된 고정 영역은 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 서열이다. 한 측면에서, 검출 복합체에 부착된 고정 영역은 고정 시약에 의해 결합되는 하나 이상의 변형된 올리고뉴클레오티드 염기를 포함한다.

한 측면에서, 고정 시약은 검출 복합체에 부착된 고정 서열 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 고정 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드는 검출 복합체에 부착된 연장된 서열(또는 앰플리콘)에 존재하는 고정 서열 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드는 검출 시약에 결합하지 않는 연장된 서열(또는 앰플리콘)의 고정 서열 보체에 혼성화하는 서열을 포함한다. 고정 올리고뉴클레오티드 서열은 본원에 기술된 연장 과정 동안 검출 복합체에 부착된 연장된 서열(또는 앰플리콘)에 혼성화할 수 있는 임의의 서열을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 고정 서열 보체에 혼성화하는 고정 올리고뉴클레오티드 서열은 약 20개의 뉴클레오티드 길이 내지 최대 약 30개의 뉴클레오티드 길이이다. 한 측면에서, 고정 시약은 고정 서열 및 올리고뉴클레오티드 태그를 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드 태그는 고정 시약을 지지체 표면에 고정시킨다. 한 측면에서, 고정 시약은 고정 서열, 올리고뉴클레오티드 태그 및 링커, 예컨대 폴리(A) 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.

고정 시약은 올리고뉴클레오티드를 고정시키기 위해 당업계에 공지된 방법을 사용하여 지지체 표면에 공유 또는 비공유로 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 한 측면에서, 고정 시약은 고체 지지체에 직접적으로 고정된다. 한 측면에서, 고정 시약은 고체 지지체에 간접적으로 고정된다. 한 측면에서, 고정 시약은 지지체 표면에 공유적으로 부착된다. 한 측면에서, 고정 시약은 지지체 표면에 비공유적으로 부착된다. 한 측면에서, 지지체 표면은 하나 이상 또는 복수의 포획 분자를 포함한다. 한 측면에서, 포획 분자는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 단일 가닥 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 고정 시약은 고정 서열을 포함한다. 한 측면에서, 고정 서열은 검출 복합체로부터 연장된 앰플리콘의 고정 서열 보체에 상보적이다. 한 측면에서, 고정 시약은 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다. 한 측면에서, 고정 시약은 고정 시약의 올리고뉴클레오티드 태그와 지지체 표면에 혼성화된 상보적인 서열을 갖는 포획 올리고뉴클레오티드 사이의 혼성화에 의해 지지체 표면에 고정된다.

한 측면에서, 고정 시약은 고정 서열 보체 또는 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적이지 않은 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 비상보적 영역은 검출 복합체의 고정 서열 보체에 상보적인 고정 올리고뉴클레오티드의 영역을 표면으로부터 멀리 연장시키는 기능을 하는 링커 서열을 포함한다. 한 측면에서, 링커 서열은 폴리(A) 서열을 포함한다.

한 측면에서, 고정 시약의 고정 서열은 약 10 내지 약 30개 또는 약 17 내지 약 25개의 핵산 길이의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 고정 시약의 고정 서열은 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19 또는 약 20개 및 최대 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29 또는 약 30개의 핵산 길이의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 고정 시약의 고정 서열은 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29 또는 약 30개의 핵산 길이의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 고정 시약은 약 17개 또는 약 25개의 올리고뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 고정 시약의 고정 서열은 5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(서열번호 1669)를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 고정 시약의 고정 서열은 5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(서열번호 1669)로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 고정 시약의 고정 서열은 5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(서열번호 1665)를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 고정 시약의 고정 서열은 5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(서열번호 1665)로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

한 측면에서, 각각의 고정 시약이 올리고뉴클레오티드 태그, 링커 및 고정 올리고뉴클레오티드를 포함하는 고정 시약 세트가 제공된다. 한 측면에서, 각각의 고정 시약은 5' 올리고뉴클레오티드 태그, 폴리 A 링커 및 3' 고정 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 10개의 고정 시약 세트가 10-스폿 검정에 사용하기 위해 제공된다. 한 측면에서, 10개의 고정 시약 세트가 10-스폿 검정 플레이트와의 사용을 위해 제공되며, 플레이트에서는 상보적 올리고뉴클레오티드 포획 분자가 검정 플레이트의 웰 내의 10개의 개별 결합 도메인에 고정되어 있다.

한 측면에서, 세트 내 하나 이상의 고정 시약은 동일한 링커 서열을 포함한다. 한 측면에서, 세트 내 하나 이상의 고정 시약은 세트 내 다른 고정 시약과는 상이한 링커 서열을 포함한다. 한 측면에서, 세트 내 각각의 고정 시약은 동일한 링커 서열을 포함한다. 한 측면에서, 링커 서열은 폴리 A 서열을 포함한다. 한 측면에서, 링커 서열은 약 1 내지 약 10개의 아데닌 염기를 포함한다. 한 측면에서, 링커 서열은 약 1, 약 2, 약 3, 약 4 또는 약 5개 및 최대 약 6, 약 7, 약 8, 약 9 또는 약 10개의 아데닌 염기를 포함한다. 한 측면에서, 링커 서열은 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9 또는 약 10개의 아데닌 염기를 포함한다. 한 측면에서, 링커 서열은 약 5개의 아데닌 염기를 포함한다. 한 측면에서, 링커 서열은 약 6개의 아데닌 염기를 포함한다. 한 측면에서, 링커 서열은 약 7개의 아데닌 염기를 포함한다.

한 측면에서, 하나 이상의 고정 시약은 세트 내 다른 고정 시약과 동일한 고정 서열을 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 고정 시약은 세트 내 다른 고정 시약과는 상이한 고정 서열을 포함한다. 한 측면에서, 세트 내 각각의 고정 시약은 동일한 고정 서열을 포함한다.

한 측면에서, 표 26에 제시된 것과 같은 10개의 고정 시약 세트가 10-스폿 검정 플레이트와의 사용을 위해 제공된다.

E. 지지체 표면

한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드가 지지체 표면에 고정된다. 포획 올리고뉴클레오티드는 기존 결합 검정에 사용되는 지지체 표면을 포함한 다양한 지지체 표면에 고정될 수 있다. 한 측면에서, 지지체 표면은 편평한 표면을 갖는다. 또 다른 측면에서, 지지체 표면은 곡면을 갖는다. 한 측면에서, 지지체 표면은 검정 플레이트, 슬라이드, 카트리지, 비드 또는 칩과 같은 검정 모듈을 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 색상 코딩된 미소구를 포함한다. 예를 들어, Yang 등 (2001) BADGE, BeadsArray for the Detection of Gene Expression, a High-Throughput Diagnostic Bioassay. Genome Res. 11(11):1888-1898 참조. 한 측면에서, 지지체 표면은 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드가 고정된 하나 이상의 비드를 포함한다.

지지체 표면은 폴리스티렌 및 폴리프로필렌과 같은 중합체, 세라믹, 유리, 예를 들어, 탄소계 잉크와 같은 탄소-중합체 복합물을 포함하는 복합재를 포함하는 다양한 적합한 물질로 만들어질 수 있다. 한 측면에서, 지지체 표면은 탄소계 지지체 표면이다.

한 측면에서, 지지체 표면은 하나 이상의 입자 또는 "비드"에 의해 제공된다. 한 측면에서, 비드는 지름이 최대 약 1cm(또는 10,000μm), 5,000μm, 1,000μm, 500μm 또는 100μm일 수 있다. 한 측면에서, 비드는 지름이 약 10nm 내지 약 100μm, 약 100nm 내지 약 10μm 또는 약 0.5μm 내지 약 5μm이다. 한 측면에서, 비드는 상자성이어서 자기장의 사용을 통해 비드를 포획하는 능력을 제공한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 스트렙트아비딘 또는 아비딘 코팅된 자기 비드에 의해 제공되고 비오틴 표지된 포획 올리고뉴클레오티드는 비드에 고정된다.

한 측면에서, 지지체 표면은 복수의 웰이 있는 플레이트, 즉 "멀티 웰 플레이트"이다. 멀티 웰 플레이트는 임의의 패턴 또는 구성으로 배열된 임의의 크기 또는 모양의 임의의 개수의 웰을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 멀티 웰 플레이트는 약 1 내지 약 10,000개의 웰을 포함한다. 한 측면에서, 멀티 웰 분석 플레이트는 플레이트 및 웰의 수, 크기, 모양 및 구성에 대한 산업 표준 형식을 사용한다. 표준 형식의 예는 96웰, 384웰, 1536웰 및 9600웰 플레이트를 포함하고 웰은 2차원 배열로 구성되어 있다. 다른 멀티 웰 형식은 단일 웰, 2웰, 6웰 및 24웰 및 6144웰 플레이트를 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 96웰 플레이트를 포함한다.

한 측면에서, 지지체 표면은 포획 분자가 결합 도메인이라고 지칭되는 알려진 위치에 인쇄되는 2차원 패턴화 어레이를 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 포획 올리고뉴클레오티드가 고정되는 개별 비중첩 어드레싱 가능한 결합 도메인의 패턴화 어레이를 포함하며, 각각의 결합 도메인에서 포획 올리고뉴클레오티드의 서열은 공지되어 있고 적절한 표적 분석물 또는 표적 반응 생성물과 상관될 수 있다. 한 측면에서, 특정 결합 도메인 내 모든 포획 올리고뉴클레오티드는 동일한 서열을 갖고, 하나의 결합 도메인 내 포획 올리고뉴클레오티드는 다른 결합 도메인 내 포획 올리고뉴클레오티드와 상이한 서열을 갖는다. 한 측면에서, 다중 결합 도메인은 지지체 표면에 정돈된 행과 열로 배열되고 각각의 결합 도메인의 정확한 위치와 서열은 컴퓨터 데이터베이스에 기록된다. 한 측면에서, 어레이는 대칭 그리드 패턴으로 배열된다. 또 다른 측면에서, 어레이는 방사상으로 분포된 라인, 나선형 라인 또는 정렬된 클러스터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 패턴으로 배열된다. 또 다른 측면에서, 각각의 결합 도메인은 하나 이상의 마이크로입자 또는 비드의 표면에 위치하며, 마이크로입자 또는 비드는 상이한 결합 도메인 사이가 구별되도록 코딩된다.

한 측면에서, 지지체 표면은 포획 분자 및 고정 시약이 결합 도메인으로 지칭되는 알려진 위치에 고정되는 2차원 패턴화 어레이를 포함한다. 한 측면에서, 포획 분자 및 고정 시약은 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 한 측면에서, 포획 분자 및 고정 시약은 2개의 개별 결합 도메인 상에 위치한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 복수의 개별 결합 도메인을 포함하고 포획 분자 및 고정 시약은 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 복수의 개별 결합 도메인을 포함하고 포획 분자 및 고정 시약은 2개의 개별 결합 도메인 상에 위치한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 플레이트의 웰이고, 웰은 포획 분자 및 고정 시약이 위치하는 복수의 개별 결합 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 웰은 포획 분자 및 고정 시약이 웰 내 2개의 개별 결합 도메인 상에 위치하는 복수의 개별 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 웰은 포획 분자 및 고정 시약이 웰 내 동일한 결합 도메인 상에 위치하는 복수의 개별 결합 도메인을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 웰은 포획 분자 및 고정 시약이 전극 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치하는 복수의 개별 결합 도메인을 포함하는 전극을 포함한다. 한 측면에서, 웰은 포획 분자 및 고정 시약이 전극 상의 2개의 개별 결합 도메인 상에 위치하는 복수의 개별 결합 도메인을 포함하는 전극을 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 전극을 포함하고 측정 단계는 전극에 전압 파형을 인가하여 전기화학발광(ECL) 신호를 생성하는 것을 포함한다.

한 측면에서, 지지체 표면은 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드에 상응하는 각각의 웰 내에 하나 이상의 개별 어드레싱 가능한 결합 도메인을 포함하는 멀티 웰 플레이트이다. 한 측면에서, 지지체 표면은 야생형 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 적어도 하나의 결합 도메인 및 돌연변이 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 별도의 결합 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 각각의 웰은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 결합 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 각각의 웰은 적어도 7, 10, 16 또는 25개의 결합 도메인을 포함한다.

한 측면에서, 지지체 표면은 적어도 24웰, 96웰 또는 384웰을 포함하는 멀티 웰 플레이트이고, 각각의 웰은 상이한 포획 올리고뉴클레오티드가 개별 결합 도메인에 고정된 최대 10개의 결합 도메인의 어레이를 포함한다. 더 특정한 측면에서, 지지체 표면은 각각의 웰이 최대 10개의 결합 도메인을 갖는 어레이를 포함하는 96웰 플레이트이다. 한 측면에서, 96웰 플레이트의 각 웰은 최대 10개의 결합 도메인을 포함하고, 그 위에 고정된 최대 10개의 개별 포획 올리고뉴클레오티드를 갖는다. 한 측면에서, 각각의 웰은 동일한 포획 올리고뉴클레오티드를 갖는 동일한 패턴 어레이를 포함한다. 또 다른 측면에서, 상이한 웰은 포획 올리고뉴클레오티드의 상이한 패턴 어레이를 포함할 수 있다.

한 측면에서, 지지체 표면은 개별 결합 도메인의 어레이를 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 각각의 웰에 개별 결합 도메인의 어레이를 포함하는 멀티 웰 플레이트를 포함한다. 한 측면에서, 각각의 결합 도메인은 단일 가닥 포획 올리고뉴클레오티드 및 고정 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 단일 가닥 포획 올리고뉴클레오티드 및 고정 올리고뉴클레오티드는 각각의 웰에서 하나 이상의 개별 결합 도메인에 고정된다. 한 측면에서, 각각의 결합 도메인은 단일 가닥 포획 올리고뉴클레오티드 및 고정 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 각각의 웰에 약 2 내지 약 150개의 개별 결합 도메인, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개, 또는 최대 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150개의 결합 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 각각의 웰에 최대 10개의 개별 결합 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 특정 결합 도메인 내 모든 포획 올리고뉴클레오티드는 동일한 서열을 갖고 특정 결합 도메인 내 모든 고정 올리고뉴클레오티드는 동일한 서열을 갖는다. 한 측면에서, 하나의 결합 도메인 내 포획 올리고뉴클레오티드는 다른 결합 도메인 내 포획 올리고뉴클레오티드와 상이한 서열을 갖는다. 한 측면에서, 하나의 결합 도메인 내 고정 올리고뉴클레오티드는 다른 결합 도메인 내 고정 올리고뉴클레오티드와 동일한 서열을 갖는다.

한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드 및 고정 올리고뉴클레오티드는 각각의 웰에서 개별 결합 도메인에 고정된다. 한 측면에서, 지지체 표면은 포획 올리고뉴클레오티드를 공동-고정시키고 개별 결합 도메인에 올리고뉴클레오티드를 고정시킴으로써 제조된다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드 및 고정 올리고뉴클레오티드는 멀티 웰 플레이트의 웰에서 어레이로 포획 올리고뉴클레오티드 및 고정 올리고뉴클레오티드를 스폿팅 또는 인쇄함으로써 고정된다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드 및 고정 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 접촉 핀 인쇄(contact pin printing) 또는 마이크로스탬핑(microstamping)을 포함하는 접촉 인쇄에 의해, 또는, 예를 들어, 포토리소그래피(photolithography), 레이저 라이팅(laser writing), 전기분무 증착(electrospray deposition) 및 잉크젯 인쇄를 포함하는 비접촉 인쇄에 의해 스폿팅 또는 인쇄된다.

한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드 및 포획 올리고뉴클레오티드는 모두 반응성 작용기를 포함한다. 한 측면에서, 작용기는 티올(-SH) 또는 아민(-NH₂) 그룹을 포함한다. 한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드 및 포획 올리고뉴클레오티드는 반응성 작용기를 통해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드, 고정 올리고뉴클레오티드 또는 둘 모두는 링커를 통해 포획 또는 고정 올리고뉴클레오티드에 부착되는 반응성 작용기를 통해 지지체 표면에 고정된다.

한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 티올 변형을 포함하고 티올 모이어티를 통해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 티올 변형된 포획 올리고뉴클레오티드는 n-머캅토프로판올 변형을 포함한다. 한 측면에서, 티올 변형된 포획 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 3' 엔드에 연결된 n-머캅토프로판올 변형을 포함한다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 링커(본원에서 "스페이서"로도 지칭됨)를 통해 포획 올리고뉴클레오티드에 부착되는 티올 또는 아민 그룹을 통해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 링커는 약 3 내지 약 20개의 원자 또는 분자 또는 단위, 또는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 및 최대 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 원자 또는 분자 또는 단위를 포함한다. 한 측면에서, 링커는 탄소원자 링커이다. 한 측면에서, 링커는 에틸렌 글리콜 링커 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커이다. 한 측면에서, 링커는 최대 3, 4, 5 또는 6개의 연속 PEG 단위를 포함한다. 또 다른 측면에서, 링커는 3개의 연속 PEG 단위를 포함한다. 또 다른 측면에서, 링커는 6개의 연속 PEG 단위를 포함한다.

한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드는 티올 변형을 포함하고 티올 모이어티를 통해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 티올 변형된 고정 올리고뉴클레오티드는 n-머캅토프로판올 변형을 포함한다. 한 측면에서, 티올 변형된 고정 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 3' 엔드에 연결된 n-머캅토프로판올 변형을 포함한다. 한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드는 링커(본원에서 "스페이서"로도 지칭됨)를 통해 고정 올리고뉴클레오티드에 부착되는 티올 또는 아민 그룹을 통해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 링커는 약 3 내지 약 20개의 원자 또는 분자 또는 단위, 또는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 및 최대 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 원자 또는 분자 또는 단위를 포함한다. 한 측면에서, 링커는 탄소원자 링커이다. 한 측면에서, 링커는 에틸렌 글리콜 링커 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커이다. 한 측면에서, 링커는 최대 3, 4, 5 또는 6개의 연속 PEG 단위를 포함한다. 또 다른 측면에서, 링커는 3개의 연속 PEG 단위를 포함한다. 또 다른 측면에서, 링커는 6개의 연속 PEG 단위를 포함한다.

한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드, 고정 올리고뉴클레오티드 또는 둘 모두는 티올 변형을 포함하고 티올 모이어티를 통해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드, 고정 올리고뉴클레오티드 또는 둘 모두는 링커를 통해 부착되는 티올 그룹을 통해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 링커는 탄소원자 링커이다. 한 측면에서, 링커는 에틸렌 글리콜 링커 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커이다. 한 측면에서, 링커는 최대 3, 4, 5 또는 6개의 연속 PEG 단위를 포함한다. 또 다른 측면에서, 링커는 3개의 연속 PEG 단위를 포함한다. 또 다른 측면에서, 링커는 6개의 연속 PEG 단위를 포함한다.

한 측면에서, 티올 변형된 포획 올리고뉴클레오티드 및 티올 변형된 고정 올리고뉴클레오티드는 완충 용액에 티올 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 인쇄 용액을 사용하여 고정된다. 한 측면에서, 인쇄 용액은 인산나트륨, NaCl, EDTA, 트레할로오스 및 Triton X-100을 포함한다. 한 측면에서, 티올 변형된 포획 올리고뉴클레오티드 및 티올 변형된 고정 올리고뉴클레오티드는 동일한 인쇄 용액에 포함된다. 한 측면에서, 티올 변형된 포획 올리고뉴클레오티드 및 티올 변형된 고정 올리고뉴클레오티드는 동시에 지지체 표면에 고정된다.

F. 전극

한 측면에서, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 포함하는 표적 분석물은 전기화학발광을 사용하여 확인, 검출 또는 정량화된다. 전기화학발광을 이용한 분석물의 다중 측정은 미국 특허 제7,842,246호 및 제6,977,722호에 기술되어 있으며 이들의 개시내용 전문이 본원에 참조로 포함된다.

한 측면에서, 지지체 표면은 하나 이상의 전극을 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 하나 이상의 작업 전극 및 하나 이상의 카운터 전극을 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 전기화학적 또는 전기화학발광 검정에 사용하기 위해 하나 이상의 전극 상에 형성된 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다.

한 측면에서, 결합 도메인은 포획 올리고뉴클레오티드로 코팅된 비드를 전극 표면에 수집함으로써 형성된다. 한 측면에서, 비드는 상자성이며 비드는 자기장의 사용을 통해 전극에 수집된다.

한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 지지체 표면 상의 하나 이상의 전극 상의 하나 이상의 결합 도메인에 공유적으로 또는 비공유적으로 고정된다. 한 측면에서, 다수의 개별 결합 도메인은 샘플 내 표적 분석물의 멀티플렉싱 측정을 위해 하나 이상의 전극에 존재한다.

한 측면에서, 전극은 검정 용기, 검정 흐름 세포, 검정 유체공학 또는 검정 수행에 유용한 기타 구성요소를 제공하는 검정 모듈 내에 제공된다. 전기화학발광 검정을 수행하기 위한 검정 모듈의 예는, 예를 들어, 멀티어레이 케이스, 검정 플레이트 케이스, 카트리지 케이스 등을 포함한다. 한 측면에서, 전극은 검정 용기, 검정 흐름 세포, 검정 유체공학 또는 검정 수행에 유용한 기타 구성요소를 제공하는 검정 모듈 내에 제공된다. 전기화학발광 검정을 수행하기 위한 검정 모듈의 예는 미국 특허 제6,673,533호, 제7,842,246호, 제9,731,297호 및 제8,298834호에서 찾을 수 있다. 한 측면에서, 지지체 표면은 적어도 하나의 전극을 포함하는 멀티 웰 플레이트이다. 한 측면에서, 멀티 웰 검정 플레이트의 각 웰은 적어도 하나의 전극을 포함한다. 한 측면에서, 멀티 웰 검정 플레이트의 적어도 하나의 웰은 작업 전극을 포함한다. 또 다른 측면에서, 멀티 웰 검정 플레이트의 적어도 하나의 웰은 작업 전극 및 카운터 전극을 포함한다. 또 다른 측면에서, 멀티 웰 검정 플레이트의 각 웰은 작업 전극 및 카운터 전극을 포함한다. 한 측면에서, 작업 전극은 카운터 전극에 인접하지만 카운터 전극과 전기적 접촉은 하지 않는다.

한 측면에서, 전극은, 예를 들어, 금, 은, 백금, 니켈, 강철, 이리듐, 구리, 알루미늄, 전도성 합금 또는 이들의 조합과 같은 금속을 포함하는 전도성 물질로 구성된다. 다른 측면에서, 전극은 실리콘 및 게르마늄과 같은 반도체 물질 또는 인듐 주석 산화물(ITO) 및 안티몬 주석 산화물(ATO)과 같은 반도체 필름을 포함한다. 다른 측면에서, 전극은 산화알루미늄 코팅된 알루미늄과 같은 산화물 코팅된 금속을 포함한다. 한 측면에서, 전극은 탄소계 물질을 포함한다. 한 측면에서 전극은 전도성 복합물, 잉크, 페이스트, 중합체 블렌드 및 금속/비금속 복합물을 함유하는 물질의 혼합물을 포함하며, 예를 들어, 전도성 또는 반전도성 물질과 비전도성 물질의 혼합물을 포함한다. 한 측면에서, 전극은 탄소, 유리질 탄소, 카본 블랙, 흑연 탄소, 탄소 나노튜브, 탄소 피브릴, 흑연, 탄소 섬유 및 이들의 혼합물과 같은 탄소계 물질을 포함한다. 한 측면에서, 전극은 전도성 탄소-중합체 복합물, 전도성 중합체 또는 매트릭스에 분산된 전도성 입자, 예를 들어, 카본 잉크, 탄소 페이스트 또는 금속 잉크를 포함한다. 한 측면에서, 작업 전극은, 예를 들어, 매트릭스, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트(EVA), 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 알코올, 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(ABS) 또는 이들 중합체 중 하나 이상의 공중합체에 분산된 전도성 탄소 입자, 예컨대 탄소 피브릴, 카본 블랙 또는 흑연 탄소를 포함하는 탄소-중합체 복합물로 제조된다.

한 측면에서, 작업 전극은 압출, 압착 또는 성형될 수 있는 하나 이상의 전도성 물질의 연속 전도성 시트 또는 필름으로 제조된다. 다른 측면에서, 작업 전극은, 예를 들어, 인쇄, 페인팅, 코팅, 스핀 코팅, 증발, 화학 기상 증착, 전해 증착, 무전해 증착, 포토리소그래피 또는 기타 전자장치 미세가공 기술에 의해 기판 상에 증착되거나 패터닝된 전도성 물질로 제조된다. 한 측면에서, 작업 전극은, 예를 들어, 잉크젯 인쇄, 레이저 인쇄 또는 스크린 인쇄에 의해 중합체성 지지체 상에 인쇄된 전도성 카본 잉크를 포함한다. 카본 잉크는 공지되어 있으며 Acheson Colloids Co.(예를 들어, Acheson 440B, 423ss, PF407A, PF407C, pM-003A, 30D071, 435A, Electrodag 505SS 및 Aquadag™), E. I. Du Pont de Nemours and Co.(예를 들어, Dupont 7105, 7101, 7102, 7103, 7144, 7082, 7861D 및 CB050), Conductive Compounds Inc.(예를 들어, C-100) 및 Ercon Inc.(예를 들어, G-451)가 생산하는 물질을 포함한다.

한 측면에서, 작업 전극은 연속 필름이다. 또 다른 측면에서, 작업 전극은 하나 이상의 개별 영역 또는 개별 영역의 패턴을 포함한다. 대안적으로, 작업 전극은 복수의 연결된 영역을 포함할 수 있다. 작업 전극에 노출된 전극 표면의 하나 이상의 영역은, 예를 들어, 작업 전극 위에 패턴화된 유전체 잉크층을 스크린 인쇄하거나 다이컷 절연 필름을 접착함으로써 작업 전극을 덮는 패턴화 절연층에 의해 한정될 수 있다. 노출된 영역은 작업 전극에 인쇄된 시약 어레이의 어레이 요소를 한정할 수 있으며 상술한 바와 같은 어레이 모양과 패턴을 가질 수 있다. 한 측면에서, 절연층은 노출된 작업 전극 표면의 일련의 원형 영역(또는 "스폿")을 한정한다.

카운터 전극은 작업 전극에 대해 일반적으로 상술한 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다. 한 측면에서, 작업 전극과 카운터 전극은 동일한 물질로 구성된다. 또 다른 측면에서, 작업 전극과 카운터 전극은 동일한 물질로 구성되지 않으며, 예를 들어, 작업 전극은 탄소 전극일 수 있고 카운터 전극은 금속 전극일 수 있다.

한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 수동 흡착에 의해 하나 이상의 전극에 고정된다. 또 다른 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 전극에 공유적으로 고정된다. 한 측면에서, 전극은, 예를 들어, 전극 표면 상에 포획 올리고뉴클레오티드와 같은 시약을 고정시키기 위해 유도체화되거나 변형된다. 한 측면에서, 전극은 시약의 고정을 개선하기 위해, 예를 들어, 시약의 고정을 위한 작용기를 도입하거나 흡착 특성을 향상시키기 위해, 화학적 또는 기계적 처리에 의해 변형된다. 도입될 수 있는 작용기의 예는 카복실산(COOH), 하이드록시(OH), 아미노(NH₂), 활성화 카복실(예를 들어, N-하이드록시 석신이미드(NHS)-에스테르), 폴리(에틸렌 글리콜), 티올, 알킬((CH₂)_n) 그룹 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 측면에서, 하나 이상의 시약, 예를 들어, 포획 올리고뉴클레오티드는 공유 또는 비공유 수단에 의해 탄소 함유 전극, 예를 들어, 카본 블랙, 피브릴 또는 다른 물질에 분산된 탄소에 고정된다. 티올 그룹을 갖는 포획 분자는 탄소 함유 전극, 예를 들어, 스크린 인쇄된 카본 잉크 전극에 단백질층 또는 화학적 가교결합층과 같은 추가 티올 반응성 층을 먼저 증착할 필요 없이 공유적으로 결합할 수 있음이 밝혀졌다. 한 측면에서, 티올 변형된 올리고뉴클레오티드와 같은 티올 그룹을 갖는 포획 분자를 전극 상에 포획 표면 및 어레이를 형성하기 위한 간단하고 견고하며 효율적이고 재현 가능한 공정을 제공하는 전극에 직접 부착시키는 방법이 제공된다. 한 측면에서, 티올 그룹을 갖는 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 먼저 티올 반응성 층을 전극에 첨가하지 않고 티올과 전극의 반응을 통해 스크린 인쇄된 카본 잉크 전극과 같은 탄소 함유 전극에 직접 고정된다.

한 측면에서, 전극은, 예를 들어, 전극의 물리적 특성, 화학적 조성 또는 표면-화학적 특성을 변경하기 위해, 예를 들어, 포획 올리고뉴클레오티드와 같은 시약의 고정을 돕기 위해, 또는 오염물을 감소시키거나, 다른 물질에 대한 접착력을 향상시키거나, 표면의 습윤성을 변경하거나, 물질의 침착을 촉진하거나, 패턴을 생성하거나, 균일성을 향상시키기 위해 플라즈마, 예를 들어, 글로우-방전 플라즈마(glow-discharge plasma)와 같은 저온 플라즈마로 처리된다. 유용한 플라즈마의 예는 산소, 질소, 아르곤, 암모니아, 수소, 플루오로카본, 물 및 이들의 조합을 포함한다. 한 측면에서, 산소 플라즈마는 탄소-중합체 복합재에서 탄소 입자로 전극을 처리하는 데 사용된다. 또 다른 측면에서, 시약의 커플링을 용이하게 하기 위해 카복실산 또는 다른 산화된 탄소 작용기를 탄소 또는 유기 물질(예를 들어, 활성화 에스테르 또는 아실 클로라이드)에 도입하기 위해 산소가 사용된다. 또 다른 측면에서, 암모니아 함유 플라즈마는 커플링 검정 시약에 사용하기 위한 아미노 그룹을 도입하는데 사용될 수 있다. 한 측면에서, 전극은 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드의 고정를 돕기 위해 전처리되지 않는다.

한 측면에서, 지지체 표면은 각각의 웰에 하나 이상의 작업 전극 또는 카운터 전극을 갖는 멀티 웰 플레이트와 같은 검정 모듈을 포함한다. 한 측면에서, 멀티 웰 플레이트는 각각의 웰에 복수의 작업 전극 또는 카운터 전극을 포함한다. 한 측면에서, 멀티 웰 플레이트의 작업 전극 또는 카운터 전극은 탄소, 예를 들어, 카본 잉크의 스크린 인쇄층을 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 포획 올리고뉴클레오티드 상의 티올 모이어티를 통해 스크린 인쇄된 카본 잉크에 고정된다. 한 측면에서, 작업 전극은 반응 생성물에 부착된 표지로부터 전기화학발광 신호를 유도하는 데 사용된다. 한 측면에서, 전기화학발광 신호는 3차 알킬 아민, 예를 들어, 트리프로필 아민 또는 부틸디에탄올아민과 같은 공반응물의 존재하에 루테늄-트리스-비피리딘으로부터 방출된다.

한 측면에서, 전극은 유전체 잉크(즉, 전기 절연 잉크)에 의해 한정되는 상술한 바와 같은 결합 도메인을 함유한다. 전극은 상술한 결합 도메인을 한정하는 패턴으로 그 위에 인쇄된 유전체가 있는 작동 전극이다. 한 측면에서, 결합 도메인은 노출된 작업 전극(또는 "스폿")의 대략 원형 영역이다. 전극은 웰의 바닥을 한정하는 마일라 시트(mylar sheet)에 사출 성형된 96웰 플레이트 상단을 부착하여 형성된 96웰 플레이트 내에 있다. 마일라 시트의 상부 표면은 각각의 웰이 대략 웰의 중심에 있는 카본 잉크 작업 전극과 대략 웰의 2개의 에지를 향하는 2개의 카본 잉크 카운터 전극을 포함하도록 인쇄된 스크린 인쇄된 카본 잉크 전극을 갖는다. 전도성 스루홀(conductive through-hole)을 통해 시트 상단에 연결된 마일라 시트 하단에 인쇄된 전극은 작업 전극과 카운터 전극에 전압을 인가하기 위한 접점을 제공한다.

G. 포획 분자를 고정시키는 방법

한 측면에서, 지지체 표면에 하나 이상의 포획 분자를 고정시키는 방법이 제공된다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 분자는 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 단일 가닥 포획 올리고뉴클레오티드 분자를 포함한다.

한 측면에서, 상기 방법은 탄소계 지지체 표면을 포함하는 지지체 표면에 하나 이상의 포획 분자를 고정시키는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 상기 방법은 하나 이상의 전극을 포함하는 지지체 표면에 하나 이상의 포획 분자를 고정시키는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 상기 방법은 하나 이상의 탄소계 전극을 포함하는 지지체 표면에 하나 이상의 포획 분자를 고정시키는 단계를 포함한다.

한 측면에서, 지지체 표면은 하나 이상의 전극을 포함하는 멀티 웰 플레이트이다. 한 측면에서, 지지체 표면은 각각의 웰에 하나 이상의 전극을 포함하는 멀티 웰 플레이트이다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 분자는 어레이의 지지체 표면에 고정된다.

한 측면에서, 상기 방법은 멀티 웰 플레이트의 제1 웰에서 제1 전극 상의 어레이에 2개 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 스폿팅 또는 인쇄하는 단계 및 후속적으로 멀티 웰 플레이트의 하나 이상의 추가 웰의 전극 상의 어레이에 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 인쇄하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 각각의 웰의 인쇄된 어레이 중 적어도 일부는 동일하다. 또 다른 측면에서, 각각의 웰의 인쇄된 어레이 중 적어도 일부는 상이하다.

한 측면에서, 하나 이상의 포획 분자는 결합 도메인으로 지칭되는 어레이 내 하나 이상의 알려진 위치에서 스폿팅 또는 인쇄된다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 개별 비중첩 어드레싱 가능한 결합 도메인에 고정되고 각각의 결합 도메인에서 포획 올리고뉴클레오티드의 서열은 공지되어 있고 표적 분석물과 상관될 수 있다. 한 측면에서, 특정 결합 도메인 내 모든 포획 올리고뉴클레오티드는 동일한 서열을 갖고, 하나의 결합 도메인 내 포획 올리고뉴클레오티드는 다른 결합 도메인 내 포획 올리고뉴클레오티드와 상이한 서열을 갖는다.

한 측면에서, 하나 이상의 포획 분자는 지지체 표면 상의 개별 결합 도메인 상에 스폿팅 또는 인쇄된다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드의 어레이는 지지체 표면 상의 개별 결합 도메인 상에 스폿팅 또는 인쇄된다. 한 측면에서, 포획 분자는, 예를 들어, 접촉 핀 인쇄 또는 마이크로스탬핑을 포함하는 접촉 인쇄에 의해, 또는, 예를 들어, 포토리소그래피, 레이저 라이팅, 전기분무 침착 및 잉크젯 인쇄를 포함하는 비접촉 인쇄에 의해 스폿팅 또는 인쇄된다. 일반적으로, 스폿팅 또는 인쇄 방법은 하나 이상의 포획 분자를 포함하는 하나 이상의 액적을 지지체 표면 상의 개별 결합 도메인 상에 적용하는 단계 및 액적이 건조되도록 하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 액적은 확산되어 지지체 표면의 영역을 덮게 된다. 한 측면에서, 지지체 표면은 더 높은 습윤성의 하나 이상의 영역 및 더 낮은 습윤성의 하나 이상의 영역을 포함하고, 더 높은 습윤성의 영역은 결합 도메인 또는 어레이 요소를 한정한다. 습윤성은 액체와 고체 표면 사이의 상호작용, 더욱 특히 수용액이 고체 표면에 퍼지지 않고 수축하여 액적을 형성하는 현상을 지칭한다. 한 측면에서, 고체 지지체는 소량의 수용액이 하나 이상의 개별 결합 도메인에 분배될 때 액적 형성을 조장하는 표면 특성이 있다. 더 높은 습윤성 영역에 인쇄된 포획 분자 용액은 더 낮은 습윤성 영역이 있는 경계까지 퍼져 결합 도메인의 모양과 위치를 정밀하게 제어한다. 한 측면에서, 결합 도메인은 작업 전극 상의 노출된 전극 표면의 영역이고, 작업 전극 상의 패턴화 절연층(예를 들어, 스크린 인쇄된 카본 잉크 전극 위의 스크린 인쇄된 유전체 잉크)은 노출된 전극 영역의 더 낮은 습윤성 경계를 한정한다.

올리고뉴클레오티드를 지지체 표면에 고정시키는 방법은 공지되어 있으며(예를 들어, Balasheb Nimse 등 (2014) Immobilization Techniques for Microarray: Challenges and Applications. Sensors. 14(2): 22208-22229 참조) 일반적으로 다음 메커니즘 중 하나 이상에 기초한다: (1) 예를 들어, 전하-전하 또는 소수성 상호작용을 통한 물리적 흡착; (2) 예를 들어, 화학 결합을 통한 공유 고정; 및 (3) 스트렙트아비딘-비오틴 고정과 같은 비공유 단백질-리간드 상호작용. 한 측면에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 작용화된 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 작용기를 포함하도록 변형되지 않은 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 아민, 니트로셀룰로오스, 폴리(l-리신), PAAH 및 디아조늄 모이어티 중 하나 이상을 포함하는 지지체 표면에 물리적 흡수에 의해 고정된다. 한 측면에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 티올(-SH), 아민(-NH₂) 또는 하이드라지드 그룹을 통한 공유 상호작용에 의해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 지지체 표면은, 예를 들어, 카복실(-COOH), 알데히드(-CHO), 에폭시(-CHCH₂O), 이소티오시아네이트(-N=C=S), 말레이미드(-HC₂(CO)₂NH) 또는 머캅토실란(-Si-R-SH)을 포함하는 반응성 작용기를 포함하거나 포함하도록 변형된다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 티올, 아민 또는 하이드라지드 그룹을 포함하는 반응성 작용기를 포함하거나 포함하도록 변형된다. 한 측면에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 지지체 표면에 존재하는 친핵성 또는 친전자성 작용기를 통해 지지체 표면에 고정된다.

한 측면에서, 하나 이상의 포획 분자는 티올 그룹을 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 분자는 포획 분자에 존재하는 티올 그룹을 통해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 상기 방법은 티올 그룹을 포함하는 하나 이상의 포획 분자를 탄소계 지지체 표면 상에 스폿팅 또는 인쇄하는 단계 및 티올 그룹을 통해 지지체 표면에 하나 이상의 포획 분자를 고정시키기 위해 인쇄된 지지체 표면을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 분자는 티올 그룹을 통해 지지체 표면에 공유적으로 부착된다.

한 측면에서, 하나 이상의 포획 분자는 포획 분자를 함유하는 액적(예를 들어, 50nL)을 지지체 표면 상에 인쇄하고, 액적이 퍼지게 하고, 액적이 건조되도록 하고, 포획 분자를 지지체 표면에 고정시키기에 충분한 시간(예를 들어, 밤새) 동안 건조된 액적을 인큐베이션함으로써 지지체 표면 상에 고정된다. 한 측면에서, 티올 그룹을 포함하는 하나 이상의 포획 분자는 포획 분자를 함유하는 액적을 지지체 표면 상에 인쇄하고, 액적이 퍼지게 하고, 액적이 건조되도록 하고, 포획 분자를 티올 그룹을 통해 지지체 표면에 고정시키기에 충분한 시간 동안 건조된 액적을 인큐베이션함으로써 탄소계 지지체 표면 상에 고정된다. 한 측면에서, 액적은 어레이에 인쇄된다. 한 측면에서, 액적은 하나 이상의 결합 도메인에 인쇄된다. 한 측면에서, 탄소계 지지체 표면은 하나 이상의 탄소계 전극을 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 분자는 티올 그룹을 통해 탄소계 전극에 공유적으로 부착된다. 한 측면에서, 지지체 표면에 인쇄된 액적의 확산을 제한하기 위해 패턴화 절연층이 탄소계 지지체 표면에 포함된다.

한 측면에서, 탄소계 지지체 표면은, 예를 들어, 지지체 표면에 하나 이상의 작용기를 도입하기 위해, 예를 들어, 포획 분자 상의 티올 그룹과 지지체 표면 사이의 반응성을 증가시키기 위해 전처리된다. 한 측면에서, 탄소계 지지체 표면은 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 단백질로 전처리된다. 또 다른 측면에서, 탄소계 지지체 표면은 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 티올 그룹을 통해 지지체 표면에 고정시키기 전에 지지체 표면에 임의의 작용기를 도입하기 위해 전처리되지 않는다. 한 측면에서, 지지체 표면은 포획 분자 및 지지체 표면 상의 티올 그룹의 반응성을 증가시키기 위해 단백질로 변형되지 않는다.

한 측면에서, 유리 포획 올리고뉴클레오티드(즉, 지지체 표면에 고정되지 않은 포획 올리고뉴클레오티드)를 제거하기 위해 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 표면에 스폿팅 또는 인쇄한 후 지지체 표면을 세척(또는 차단) 용액으로 세척한다(본원에서 "차단" 단계로도 지칭됨; 예를 들어, 실시예 3 참조). 한 측면에서, 지지체 표면은 인쇄 및 건조 후에 세척 용액으로 세척된다. 한 측면에서, 지지체 표면은 건조된 패키지에 포장되기 전에 세척된다. 또 다른 측면에서, 지지체 표면은 건조된 패키지에 포장된 후에 세척된다.

한 측면에서, 세척 또는 차단 단계는 세척 또는 차단 용액을 표면에 부가하고(예를 들어, 96웰 검정 플레이트의 경우 웰당 50uL의 용액) 30 내지 60분 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. 인큐베이션 온도는 임의의 편리한 온도, 예를 들어, 실온 또는 37℃일 수 있다. 인큐베이션은 표면을 진탕하면서 일어날 수 있다. 세척 또는 차단 단계는 세척 또는 차단 용액을 제거하고 PBS와 같은 버퍼로 표면을 헹구는 것을 포함할 수 있다.

한 측면에서, 세척 용액은 티올 함유 화합물을 포함한다. 세척 단계 동안 탄소계 전극 상의 하나의 결합 도메인으로부터 과량의 티올 함유 포획 분자가 다른 결합 도메인으로 이동하여 영구적으로 부착될 수 있다. 이러한 포획 분자의 이동 및 이에 따른 결합 도메인의 교차 오염은 세척 용액에 티올 함유 화합물을 포함함으로써 감소될 수 있다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 세척 용액 내 티올 함유 화합물은 유리(결합되지 않은) 포획 올리고뉴클레오티드와 경쟁하고 상이한 결합 도메인으로부터 제거되는 과량의 포획 올리고뉴클레오티드의 결합으로부터 결합 도메인의 교차 오염을 방지한다고 여겨진다. 한 측면에서, 세척 용액은 수용성 티올 함유 화합물을 포함한다. 한 측면에서, 세척 용액은 분자량이 약 200g/mol, 약 175g/mol, 약 150g/mol 또는 약 125g/mol 미만인 수용성 티올 함유 화합물을 포함한다. 한 측면에서, 수용성 티올 함유 화합물은 쯔비터이온을 포함한다.

한 측면에서, 세척 용액은 시스테인(cysteine)(예를 들어, L-시스테인), 시스테아민(cysteamine), 디티오트레이톨(dithiothreitol), 3-머캅토프로프리오노에이트 및 3-머캅토-1-프로판설폰산으로부터 선택된 수용성 티올을 포함한다. 한 측면에서, 수용성 티올 함유 화합물은 시스테인을 포함한다.

한 측면에서, 세척 용액은 pH 완충 성분을 포함한다. 한 측면에서, pH 완충 성분은 Tris를 포함한다. 한 측면에서, 세척 용액은 계면활성제를 포함한다. 한 측면에서, 계면활성제는 Triton X-100을 포함한다. 한 측면에서, 세척 용액은 금속 킬레이트제를 포함한다.

한 측면에서, 세척 용액은 약 5mM 내지 약 750mM, 약 10mM 내지 약 500mM, 약 25mM 내지 약 75mM 또는 약 50mM의 티올 함유 화합물을 포함한다. 한 측면에서, 세척 용액은 약 5mM 내지 약 750mM, 약 10mM 내지 약 500mM, 약 25mM 내지 약 75mM 또는 약 50mM 시스테인을 포함한다. 한 측면에서, 세척 용액은 약 10mM 내지 약 30mM, 또는 약 15mM 내지 약 25mM 또는 약 20mM의 버퍼, 예컨대 Tris를 포함한다. 한 측면에서, 세척액은 약 0.05% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.05% 내지 0.2% 또는 약 0.1%의 계면활성제, 예컨대 Triton X-100을 포함한다. 한 측면에서, 세척 용액은 pH가 약 7 내지 약 9, 약 7.5 내지 약 8.5 또는 약 8.0이다.

한 측면에서, 세척 또는 차단 용액은 다음 시약 중 하나 이상을 포함한다: (ⅰ) PS20, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(~ 1,000kD 또는 ~ 360kD), Ficoll 및 폴리에틸렌 글리콜(~ 3kD 및 ~ 10kD)을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 혼성화 검정에서 배경 신호를 감소시키는데 유용한 공지된 중합체, (ⅱ) 연어 정자 DNA, 청어 DNA, 송아지 흉선 DNA, 전단된 폴리A, 효모 tRNA; 및 헤파린을 포함하지만 이에 제한되지 않는 핵산 또는 기타 다중음이온, (ⅲ) BSA 및 폴리-BSA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 단량체성 및 중합체성 단백질 차단제, (ⅳ) 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS), triton-100 및 tween-20을 포함하지만 이에 제한되지 않는 계면활성제 및 (ⅴ) 포름아미드 및 프로필렌 글리콜을 포함하지만 이에 제한되지 않는 수소결합 불안정화제.

한 측면에서, 상기 방법은 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 지지체 표면에 고정한 다음 지지체 표면으로부터 과량의 고정되지 않은 포획 올리고뉴클레오티드를 세척 용액으로 세척하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 세척은 엄격한 세척 조건 하에서 고정된 포획 올리고뉴클레오티드를 세척하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 엄격한 세척 조건은 약 27℃ 내지 약 47℃의 온도, 약 21% 내지 약 41%의 포름아미드 농도, 약 300mM 내지 약 500mM의 염 농도 및 pH 약 7.5 내지 약 8.5를 포함한다. 한 측면에서, 높은 엄격도 조건은 약 37℃의 온도, 약 31%의 포름아미드 농도, 약 400mM의 염 농도 및 pH 8.0을 포함한다. 한 측면에서, 고정된 올리고뉴클레오티드는 적어도 5분, 10분, 30분 또는 60분 동안 높은 엄격도 조건에 노출된다. 또 다른 측면에서, 높은 엄격도 조건은 낮은 염 조건, 예를 들어, 염 농도가 약 40mM, 20mM, 15mM 또는 10mM 미만인 버퍼를 포함한다. 한 측면에서, 높은 엄격도 조건은 37℃에서 0.1X PBS와 같은 낮은 염 조건을 포함한다.

한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 어레이의 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 결합 도메인에서 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 어레이의 하나의 결합 도메인에 인쇄된 포획 올리고뉴클레오티드는 어레이의 다른 결합 도메인에 인쇄된 포획 올리고뉴클레오티드와 상이한 서열을 갖는다.

이론에 얽매이는 것은 아니지만, 세척 용액은 느슨하게 결합된 포획 올리고뉴클레오티드를 용액으로 가져오고, 이로부터 포획 올리고뉴클레오티드가 SH-공유결합 또는 다른 메커니즘을 통해 표면에 잠재적으로 재증착될 수 있는 것으로 여겨진다. 포획 올리고뉴클레오티드가 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 포획 올리고뉴클레오티드가 있는 결합 도메인에 재증착되는 경우, 이는 오염 포획 분자로 간주된다. 오염 포획 분자의 존재는 검정 결과를 방해할 수 있다. 한 측면에서, 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 어레이의 결합 도메인은 약 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02% 또는 0.01% 미만의 오염 포획 분자를 포함한다.

한 측면에서, 포획 분자 세트의 결합 파트너(즉, 올리고뉴클레오티드 태그) 사이의 교차 반응성은 약 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02% 또는 0.01%. 미만이다. 한 측면에서, 검정 특이성(비상보적 서열의 결합 또는 포획 올리고뉴클레오티드 교차 오염으로부터의 교차 반응성 포함)이 결정된다. 한 측면에서, 특이성은 하나 이상의 표지된 QC 프로브가 하나 이상의 복제 플레이트 표면에 고정된 상응하는 상보적 포획 분자에 혼성화되는 조건 하에서 하나 이상의 복제 플레이트에 하나 이상의 표지된 QC 프로브를 함유하는 하나 이상의 샘플을 부가함으로써 결정된다. 이어서 플레이트를 세척하여 과량의 QC 프로브를 제거하고 결합된 QC 프로브의 존재를 기본 표지의 검출 또는 2차 결합 파트너의 부가를 통해 검출한다. 교차 반응성은 각각의 어레이에 대해, 예를 들어, 멀티 웰 플레이트의 각각의 웰에 대해 비특이적 포획 뉴클레오티드가 있는 스폿에 대한 프로브의 결합으로부터 검출된 신호를 상응하는 상보적 포획 뉴클레오티드가 있는 스폿에 대한 프로브의 결합으로부터의 신호의 백분율로서 계산할 수 있다. 한 측면에서, 계산은 임의의 QC 프로브의 부재하에 검출된 비특이적 배경 신호에 대한 보정을 포함한다.

한 측면에서, 검정 특이성은 일련의 품질 관리(QC) 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 결정된다. 한 측면에서, QC 프로브는 표면에 고정된 비-교차 반응성 포획 분자 세트의 상응하는 포획 분자의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 세트는 서열번호 1-774 중 임의의 것으로 표시되는 서열을 갖는 비-교차 반응성 포획 분자 세트의 상응하는 포획 분자의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 QC 프로브를 포함한다. 한 측면에서, 상기 세트는 서열번호 1-64로 표시되는 비-교차 반응성 포획 분자 세트의 상응하는 포획 분자의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 QC 프로브를 포함한다. 한 측면에서, 상기 세트는 서열번호 1-10으로 표시되는 비-교차 반응성 포획 분자 세트의 상응하는 포획 분자의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 QC 프로브를 포함한다.

한 측면에서, QC 프로브는 표지를 포함한다. 한 측면에서, 표지는 QC 프로브에 직접 부착된다. 또 다른 측면에서, 표지는 링커를 통해 QC 프로브에 부착된다. 한 측면에서, 표지는 결합 쌍의 구성원인 화합물이며, 결합 쌍의 제1 구성원("1차 결합 시약"으로 지칭될 수 있음)은 기질, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드에 부착되고, 결합 쌍의 다른 구성원("2차 결합 시약"으로 지칭될 수 있음)은 검출 가능한 물리적 특성이 있다. 예 또는 기본 표지는 전이 금속, 예를 들어, 루테늄을 포함하는 유기금속 착물인 전기화학발광 표지를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 측면에서, 기본 표지는 스트렙트아비딘을 포함한다. 한 측면에서, 기본 표지는 MSD SULFO-TAG 표지된 스트렙트아비딘을 포함한다.

한 측면에서, 표지는 1차 결합 시약에 결합하는 2차 결합 시약을 포함한다. 한 측면에서, 1차 결합 시약은 비오틴, 합텐, 스트렙트아비딘, 아비딘 또는 항체 또는 항원을 포함한다. 한 측면에서, 2차 결합 시약은 비오틴, 합텐, 스트렙트아비딘, 아비딘 또는 항체 또는 항원을 포함한다. 한 측면에서, 2차 결합 시약은 전기화학발광 표지를 포함한다. 한 측면에서, 2차 결합 시약은 전이 금속, 예를 들어, 루테늄을 포함하는 유기금속 착체를 포함한다. 한 측면에서, QC 프로브는 비오틴을 포함하고 2차 결합 시약은 MSD SULFO-TAG 표지된 스트렙트아비딘을 포함한다. 한 측면에서, QC 프로브는 아래 구조에 나타낸 바와 같이 비오틴으로 3' 엔드에서 변형된다:

한 측면에서, 오염 포획 분자의 백분율은 실시예 4의 방법에 의해 측정된다.

한 측면에서, 플레이트 상의(인트라플레이트(intraplate)) 또는 2개 이상의 플레이트에 걸친(인터플레이트(interpolate)) 하나 이상의 결합 도메인의 균일성은 변동 계수(coefficient of variation, CV)를 결정하기 위한 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 한 측면에서, 인트라플레이트 또는 인터플레이트 결합 도메인은 CV가 약 10%, 9.5%, 9%, 8.5%, 8%, 7.5%, 7%, 6.5%, 6%, 5.5%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5% 또는 1% 미만이다. 한 측면에서, 평균 인트라플레이트 또는 인터플레이트 CV는 약 3% 내지 약 6% 또는 약 5% 미만이다. 한 측면에서, 결합 도메인 균일성은 실시예 5의 방법에 의해 측정된다.

H. 압타머 고정화

한 측면에서, 지지체 표면에 하나 이상의 압타머를 고정시키는 방법이 제공된다. 한 측면에서, 하나 이상의 압타머는 본원에 기술된 바와 같이 지지체 표면에 고정된 하나 이상의 단일 가닥 포획 분자에 결합함으로써 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 압타머는 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이며, 예를 들어, 소분자, 단백질, 핵산, 세포, 조직 및 유기체 비공유 상호 작용, 예컨대 정전기 및 소수성 상호작용을 포함하는 분자 표적에 결합하는 DNA, RNA 또는 XNA 압타머를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 압타머는 단백질 스캐폴드에 의해 표시되는 적어도 하나 이상의 가변 펩티드 도메인을 포함하는 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드이다. 한 측면에서, 고정된 압타머는 하나 이상의 표적 분석물에 대한 프로브로 사용된다. 한 측면에서, 고정된 압타머는 마이크로어레이에 사용된다.

I. 올리고뉴클레오티드 프로브

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 샘플의 표적 분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 프로브 시약을 포함한다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 샘플의 표적 분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "결합 파트너"는 특정 조건 세트 하에서 서로 특이적으로 결합하는 한 쌍의 모이어티의 구성원을 지칭하는데, 즉 결합 쌍은 환경에 존재하는 다른 모이어티를 실질적으로 배제하고 서로 결합한다. 결합 파트너는 폴리펩티드, 지질, 당지질, 핵산 분자, 탄수화물 또는 다른 분자와 같은 임의의 분자일 수 있고 이들과 또 다른 분자가, 예를 들어, 동족 항원이 있는 항체의 상호작용, 2개의 상보적 뉴클레오티드 서열 사이의 상호작용, 또는 비오틴과 스트렙트아비딘 또는 아비딘 사이의 상호작용을 포함하는 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 특이적으로 상호작용한다. 용어 "상응하는"은 결합 파트너 쌍의 한 구성원이 해당 쌍의 다른 구성원에 "상응"하는 것과 같은, 2개의 특정 결합 파트너 간의 관계를 지칭한다.

한 측면에서, 결합 파트너는 표적 분석물에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 측면에서, 결합 파트너는 올리고뉴클레오티드 프로브가 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있도록 표적 분석물의 올리고뉴클레오티드 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.

한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 올리고뉴클레오티드 태그 및 결합 파트너를 포함한다. 한 측면에서, 결합 파트너는 표적 뉴클레오티드 서열의 일부에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 단일 가닥 서열을 포함한다. 한 측면에서, 프로브는 포획 올리고뉴클레오티드의 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그 및 결합 파트너는 단일 올리고뉴클레오티드 가닥의 상이한 영역이다.

한 측면에서, 프로브는, 예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 펩티드 핵산(PNA) 또는 로킹된 핵산(LNA)을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 단일 가닥 핵산 서열이다. 한 측면에서, 프로브는 표지 또는 표지 부착에 적합한 반응성 작용기 또는 링커를 포함하도록 변형된 하나 이상의 변형된 질소 함유 염기 유사체 또는 염기를 포함한다.

한 측면에서, 프로브는 약 5 내지 약 100개, 약 10 내지 약 50개, 약 20 내지 약 30개, 또는 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25개 및 최대 약 30, 35, 40, 45, 50, 75 또는 100개의 뉴클레오티드 길이이다. 프로브는 화학적 또는 효소적 합성을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해, 또는 비특이적 핵산 절단 화학물질 또는 효소를 사용하는 더 큰 핵산의 절단에 의해, 또는 부위 특이적 제한 엔도뉴클레아제에 의해 제조될 수 있다. 일부 적용에서, 표적 서열의 상보적 영역에 혼성화되는 프로브는 중합효소에 의해 프로브의 연장을 프라이밍할 수 있고, 이는 표적 서열에서의 인접한 단일 가닥 영역의 복제를 위한 시작점으로 작용한다.

한 측면에서, 프로브는 표지를 포함한다. 한 측면에서, 표지는 프로브에 직접 부착된다. 또 다른 측면에서, 표지는 링커를 통해 프로브에 부착된다. 한 측면에서, 표지는 결합 쌍의 구성원인 화합물이며, 결합 쌍의 제1 구성원("1차 결합 시약"으로 지칭될 수 있음)은 기질, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드에 부착되고, 결합 쌍의 다른 구성원("2차 결합 시약"으로 지칭될 수 있음)은 검출 가능한 물리적 특성이 있다. 예 또는 기본 표지는 전이 금속, 예를 들어, 루테늄을 포함하는 유기금속 착물인 전기화학발광 표지를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 측면에서, 기본 표지는 MSD SULFO-TAG 표지이다.

한 측면에서, 2차 결합 시약은 1차 결합 시약에 결합한다. 한 측면에서, 1차 결합 시약은 비오틴, 합텐, 스트렙트아비딘, 아비딘 또는 항체 또는 항원을 포함한다. 한 측면에서, 2차 결합 시약은 비오틴, 합텐, 스트렙트아비딘, 아비딘 또는 항체 또는 항원을 포함한다. 한 측면에서, 2차 결합 시약은 전기화학발광 표지를 포함한다. 한 측면에서, 2차 결합 시약은 전이 금속, 예를 들어, 루테늄을 포함하는 유기금속 착체를 포함한다. 한 측면에서, 2차 결합 시약은 MSD SULFO-TAG 표지를 포함한다.

한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 올리고뉴클레오티드 태그 및 표적 보체, 예를 들어, 표적 핵산 서열의 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 올리고뉴클레오티드 태그, 표적 보체 및 검출 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 검출 올리고뉴클레오티드는 증폭 주형의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 갖는 검출 서열을 포함한다. 한 측면에서, 검출 올리고뉴클레오티드는 PCR(중합효소 연쇄 반응), LCR(리가아제 연쇄 반응), SDA(염기서열 치환 증폭), 3SR(자립 합성 반응), 또는 등온 증폭 방법, 예컨대 헬리카제 의존적 증폭 또는 회전 환 증폭(RCA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 증폭 반응에 대한 프라이머로서 기능한다. 한 측면에서, 검출 올리고뉴클레오티드는 증폭 주형과 접촉되고 검출 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭 주형을 증폭하기 위한 프라이머로서 사용된다. 한 측면에서, 검출 올리고뉴클레오티드는 증폭 주형과 접촉되고, 검출 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 회전 환 증폭(RCA)에 의한 증폭 주형의 증폭을 위한 프라이머로서 기능한다.

한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 프로브 세트가 제공된다. 한 측면에서, 10개의 올리고뉴클레오티드 프로브 세트가 제공된다. 한 측면에서, 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브는 올리고뉴클레오티드 태그, 표적 보체 및 검출 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브는 5' 올리고뉴클레오티드 태그, 표적 보체 및 3' 검출 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 10-스폿 검정에 사용하기 위한 10개의 올리고뉴클레오티드 프로브 세트가 제공된다. 한 측면에서, 상보적 올리고뉴클레오티드 포획 분자가 검정 플레이트의 웰 내 10개의 개별 결합 도메인에 고정되어 있는 10-스폿 검정 플레이트와 함께 사용하기 위한 10개의 올리고뉴클레오티드 프로브 세트가 제공된다.

한 측면에서, 세트에서 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브는 동일한 검출 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 세트에서 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브는 세트에서 다른 올리고뉴클레오티드 프로브와 상이한 검출 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 세트에서 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브는 동일한 검출 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.

한 측면에서, 표 27에 나타낸 것과 같은 10개의 올리고뉴클레오티드 프로브 세트가 10-스폿 검정 플레이트와 함께 사용하기 위해 제공된다.

한 측면에서, 하나 이상의 프로브 시약을 포함하는 키트가 제공된다. 한 측면에서, 최종 사용자는 하나 이상의 프로브 시약을 준비한다.

J. 올리고뉴클레오티드 태그

한 측면에서, 프로브는 포획 분자의 올리고뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다. 한 측면에서, 태그는 단일 가닥 포획 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 재조합적으로 생성된다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 자연 발생 서열이 아니다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 또는 비-자연 발생 화학 구조를 포함하는 구조적 유사체를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 단일 가닥 핵산 서열을 포함하며, 혼성화 반응에 참여한다.

한 측면에서, 태그는 프로브의 5'-엔드에 부착된다. 또 다른 측면에서, 태그는 프로브의 3'-엔드에 부착된다. 한 측면에서, 태그는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이지 않고 혼성화하지도 않는다.

한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열 및 올리고뉴클레오티드 태그 서열에 상보적인 서열은 프로브 내 하나의 핵산 가닥에 존재한다. 또 다른 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열 및 올리고뉴클레오티드 태그 서열에 상보적인 서열은 상이한 핵산 가닥 상에 존재한다. 한 측면에서, 프로브는 표적 서열 및 제1 가교 서열에 상보적인 서열을 갖는 제1 가닥 및 올리고뉴클레오티드 태그 서열 및 제1 가교 서열에 상보적인 제2 가교 서열을 갖는 제2 가닥을 포함하고, 상기 제1 및 제2 가닥은 제1 및 제2 가교 서열을 통해 혼성화되거나 혼성화될 수 있다.

한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 표지를 포함한다. 한 측면에서, 표지는 올리고뉴클레오티드 태그에 직접 부착된다. 또 다른 측면에서, 표지는 링커를 통해 올리고뉴클레오티드 태그에 부착된다. 한 측면에서, 표지는 올리고뉴클레오티드 태그의 5' 말단 뉴클레오티드에 부착된다. 또 다른 측면에서, 표지는 올리고뉴클레오티드 태그의 3' 말단 뉴클레오티드에 부착된다. 한 측면에서, 표지는 올리고뉴클레오티드 태그의 길이를 따라 부착된다.

한 측면에서, 표지는 방사성, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 흡광, 광산란, 전기화학, 자기 또는 효소 표지를 포함한다. 한 측면에서, 표지는 전기화학발광 표지를 포함한다. 한 측면에서, 표지는 합텐을 포함한다. 한 측면에서, 표지는 비오틴, 플루오레세인(fluorescein) 또는 디곡시제닌(digoxigenin)이다. 한 측면에서, 표지는 전이 금속을 포함하는 유기금속 착물을 포함한다. 한 측면에서, 전이 금속은 루테늄을 포함한다. 한 측면에서, 표지는 MSD SULFO-TAG™ 표지이다.

한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 표지로서 1차 결합 시약을 포함하고, 1차 결합 시약은 2차 결합 시약의 결합 파트너이다. 한 측면에서, 1차 결합 시약은 비오틴, 스트렙트아비딘, 아비딘 또는 항원을 포함한다. 한 측면에서, 2차 결합 시약은 비오틴, 스트렙트아비딘, 아비딘 또는 항체를 포함한다. 한 측면에서, 1차 결합 시약은 올리고뉴클레오티드를 포함하고 2차 결합 시약은 1차 결합 시약의 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드이다.

한 측면에서, 태그는 적어도 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 및 최대 약 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개, 또는 약 15 내지 약 40개 또는 약 20 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 태그는 상보적 포획 올리고뉴클레오티드 서열보다 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 및 최대 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개, 또는 약 1 내지 약 20개 또는 약 10 내지 약 15개 또는 약 12 내지 약 13개의 뉴클레오티드가 더 짧은 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 태그는 적어도 약 24, 30 또는 36개의 뉴클레오티드 길이인 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 1-774(표 1-12) 중 임의의 것으로 표시되는 서열을 갖는 포획 분자에 혼성화하는 서열을 갖는다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 1-744(표 1-12) 중 임의의 것으로 표시되는 서열을 갖는 상보적 포획 분자에 혼성화하는 서열을 갖는다. 한 측면에서, 태그는 서열번호 1-744 중 임의의 것으로 표시되는 서열의 적어도 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드인 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 태그는 서열번호 1-744 중 임의의 것으로 표시되는 서열의 적어도 약 24, 30 또는 36개의 연속 뉴클레오티드인 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 745-1488(표 13-24) 중 임의의 것으로 표시되는 핵산 서열을 갖는다.

한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 745-1488(표 13-24) 중 임의의 것으로 표시되는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 745-1488(표 13-24) 중 임의의 것으로 표시되는 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 745-1488(표 13-24) 중 임의의 것으로 표시되는 서열의 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 745-1488(표 13-24) 중 임의의 것으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 745-1488(표 13-24) 중 임의의 것으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열의 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 745-754, 755-757, 769-770, 777-781, 786, 788-790, 798 및 803-806 중 임의의 것으로 표시되는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 745-754, 755-757, 769-770, 777-781, 786, 788-790, 798 및 803-806 중 임의의 것으로 표시되는 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 745-754, 755-757, 769-770, 777-781, 786, 788-790, 798 및 803-806 중 임의의 것으로 표시되는 서열의 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 745-754, 755-757, 769-770, 777-781, 786, 788-790, 798 및 803-806 중 임의의 것으로 표시되는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 745-754, 755-757, 769-770, 777-781, 786, 788-790, 798 및 803-806 중 임의의 것으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 745-754 중 임의의 것으로 표시되는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 745-754 중 임의의 것으로 표시되는 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 745-754 중 임의의 것으로 표시되는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 745-754 중 임의의 것으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 "모 세트"로부터 선택된 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그 세트를 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그 세트는 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트에 상보적이다. 한 측면에서, 세트의 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그는 상응하는 포획 올리고뉴클레오티드 세트의 상응하는 상보적 서열에 혼성화하도록 구성된다. 한 측면에서, 세트의 올리고뉴클레오티드 태그는 상보적 서열 대비 0.05% 미만으로 상응하는 포획 올리고뉴클레오티드 세트의 비상보적 서열에 혼성화한다.

모 세트로부터의 2개 이상의 올리고뉴클레오티드는 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 "하위세트"를 형성하도록 선택될 수 있으며, 하위세트의 각각의 올리고뉴클레오티드는 원래의 모 세트의 구성원이다. 하위세트는 하나 초과의 모 세트로부터의 올리고뉴클레오티드 태그를 포함할 수 없다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그 세트 또는 하위세트는 비-교차 반응성 서열의 모 세트로부터 선택된 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 및 최대 64개의 비-교차 반응성 서열을 포함한다.

한 측면에서, 표 1(서열번호 1-64)에 나타낸 하나 이상의 포획 서열에 상보적인 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제1 세트가 생성된다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제1 세트는 표 13(서열번호 745-808)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다.

한 측면에서, 표 2(서열번호 65-122)에 나타낸 하나 이상의 포획 서열에 상보적인 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제2 세트가 생성된다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제2 세트는 표 14(서열번호 809-866)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다.

한 측면에서, 표 3(서열번호 123-186)에 나타낸 하나 이상의 포획 서열에 상보적인 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제3 세트가 생성된다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제3 세트는 표 15(서열번호 867-930)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다.

한 측면에서, 표 4(서열번호 187-250)에 나타낸 하나 이상의 포획 서열에 상보적인 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제4 세트가 생성된다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제4 세트는 표 16(서열번호 931-994)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다.

한 측면에서, 표 5(서열번호 251-308)에 나타낸 하나 이상의 포획 서열에 상보적인 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제5 세트가 생성된다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제2 세트는 17(서열번호 995-1052)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다.

한 측면에서, 표 6(서열번호 309-372)에 나타낸 하나 이상의 포획 서열에 상보적인 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제6 세트가 생성된다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제2 세트는 표 18(서열번호 1053-1116)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다.

한 측면에서, 표 7(서열번호 373-436)에 나타낸 하나 이상의 포획 서열에 상보적인 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제7 세트가 생성된다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제2 세트는 표 19(서열번호 1117-1180)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다.

한 측면에서, 표 8(서열번호 437-494)에 나타낸 하나 이상의 포획 서열에 상보적인 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제8 세트가 생성된다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제2 세트는 표 20(서열번호 1181-1238)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다.

한 측면에서, 표 9(서열번호 495-558)에 나타낸 하나 이상의 포획 서열에 상보적인 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제9 세트가 생성된다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제2 세트는 표 21(서열번호 1239-1302)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다.

한 측면에서, 표 10(서열번호 559-622)에 나타낸 하나 이상의 포획 서열에 상보적인 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제10 세트가 생성된다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제2 세트는 표 22(서열번호 1303-1366)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다.

한 측면에서, 표 11(서열번호 623-680)에 나타낸 하나 이상의 포획 서열에 상보적인 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제11 세트가 생성된다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제2 세트는 표 23(서열번호 1367-1424)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다.

한 측면에서, 표 12(서열번호 681-744)에 나타낸 하나 이상의 포획 서열에 상보적인 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제12 세트가 생성된다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그의 제2 세트는 표 24(서열번호 1425-1488)에 나타낸 모 세트로부터의 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다.

한 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그 세트는 표 1(서열번호 1-64), 표 2(서열번호 65-122), 표 3(서열번호 123-186), 표 4(서열번호 187-250), 표 5(서열번호 251-308), 표 6(서열번호 309-372), 표 7(서열번호 373-436), 표 8(서열번호 437-494), 표 9(서열번호 495-558), 표 10(서열번호 559-622), 표 11(서열번호 623-680) 또는 표 12(서열번호 681-744)의 포획 올리고뉴클레오티드의 서열에 상보적인 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 태그를 포함한다. 한 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그 세트는 표 13(서열번호 745-808), 표 14(서열번호 809-866), 표 15(서열번호 867-930), 표 16(서열번호 931-994), 표 17(서열번호 995-1052), 표 18(서열번호 1053-1116), 표 19(서열번호 1117-1180), 표 20(서열번호 1181-1238), 표 21(서열번호 1239-1302), 표 22(서열번호 1303-1366), 표 23(서열번호 1367-1424) 또는 표 24(서열번호 1425-1488)에 나타낸 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 태그를 포함한다.

또 다른 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그 세트는 표 1(서열번호 1-64), 표 2(서열번호 65-122), 표 3(서열번호 123-186), 표 4(서열번호 187-250), 표 5(서열번호 251-308), 표 6(서열번호 309-372), 표 7(서열번호 373-436), 표 8(서열번호 437-494), 표 9(서열번호 495-558), 표 10(서열번호 559-622), 표 11(서열번호 623-680) 또는 표 12(서열번호 681-744)의 포획 올리고뉴클레오티드의 서열에 상보적인 서열의 적어도 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 태그를 포함한다. 또 다른 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그 세트는 표 13(서열번호 745-808), 표 14(서열번호 809-866), 표 15(서열번호 867-930), 표 16(서열번호 931-994), 표 17(서열번호 995-1052), 표 18(서열번호 1053-1116), 표 19(서열번호 1117-1180), 표 20(서열번호 1181-1238), 표 21(서열번호 1239-1302), 표 22(서열번호 1303-1366), 표 23(서열번호 1367-1424) 또는 표 24(서열번호 1425-1488)에 나타낸 서열의 적어도 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 태그를 포함한다.

또 다른 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그 세트는 표 1(서열번호 1-64), 표 2(서열번호 65-122), 표 3(서열번호 123-186), 표 4(서열번호 187-250), 표 5(서열번호 251-308), 표 6(서열번호 309-372), 표 7(서열번호 373-436), 표 8(서열번호 437-494), 표 9(서열번호 495-558), 표 10(서열번호 559-622), 표 11(서열번호 623-680) 또는 표 12(서열번호 681-744)의 포획 올리고뉴클레오티드의 서열에 상보적인 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열의 적어도 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 태그를 포함한다. 또 다른 측면에서, 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그 세트는 표 13(서열번호 745-808), 표 14(서열번호 809-866), 표 15(서열번호 867-930), 표 16(서열번호 931-994), 표 17(서열번호 995-1052), 표 18(서열번호 1053-1116), 표 19(서열번호 1117-1180), 표 20(서열번호 1181-1238), 표 21(서열번호 1239-1302), 표 22(서열번호 1303-1366), 표 23(서열번호 1367-1424) 또는 표 24(서열번호 1425-1488)에 나타낸 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열의 적어도 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 태그를 포함한다.

한 측면에서, 세트의 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 745-808로부터 선택된 서열의 적어도 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 태그; 서열번호 745-808로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 태그; 서열번호 745-808로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열의 적어도 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 태그; 서열번호 745-808로부터 선택된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 태그; 및 이들의 조합으로부터 선택된다.

한 측면에서, 세트의 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그는 서열번호 745-754로부터 선택된 서열의 적어도 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 태그; 서열번호 745-754로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 태그; 서열번호 745-754로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열의 적어도 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 태그: 서열번호 745-754로부터 선택된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 태그; 및 이들의 조합으로부터 선택된다.

K. 표지된 올리고뉴클레오티드 생성물의 검출

한 측면에서, 샘플에서 하나 이상의 표적 분석물을 표지화하고 검출하기 위한 방법 및 키트가 제공된다. 한 측면에서, 샘플 내 하나 이상의 표적 분석물의 존재는 올리고뉴클레오티드 태그를 포함하는 반응 생성물을 생성함으로써 결정된다. 한 측면에서, 반응 생성물은 표지를 포함한다. 다양한 방법을 사용하여 반응 생성물을 생성할 수 있다. 한 측면에서, 반응 생성물은 샌드위치 검정, 올리고뉴클레오티드 결찰 검정(OLA), 프라이머 연장 검정(PEA), 직접 혼성화 검정, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기반 검정 또는 기타 표적화 증폭 검정 및 뉴클레아제 보호 검정을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본원에 기술된 방법에 의해 생성된다.

1. 샌드위치 검정

한 측면에서, 샌드위치 검정을 사용하여 샘플에서 하나 이상의 표적 분석물을 검출, 확인 또는 정량화하기 위한 방법 및 키트가 제공된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 표적화 프로브 및 검출 프로브를 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 포함한다. 한 측면에서, 표적화 프로브는 지지체 표면 및 제1 결합 파트너에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다. 한 측면에서, 제1 결합 파트너는 제1 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 제1 결합 파트너의 제1 핵산 서열은 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 제1 영역에 상보적이다. 한 측면에서, 제1 결합 파트너의 제1 핵산 서열은 치료용 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 RNA 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 miRNA, 치료용 RNA, mRNA, RNA 바이러스, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO) 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 한 측면에서, 제1 결합 파트너의 제1 핵산 서열은 샘플에서 항-약물 항체(ADA)에 의해 특이적으로 결합된다. 또 다른 측면에서, 제1 결합 파트너는 샘플 내 표적 분석물에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 한 측면에서, 검출 프로브는 표지 및 제2 결합 파트너를 포함한다.

한 측면에서, 제2 결합 파트너는 제2 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 제2 결합 파트너의 제2 핵산 서열은 표적 뉴클레오티드 서열의 제2 영역에 상보적이다. 한 측면에서, 제2 결합 파트너의 제2 핵산 서열은 치료용 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 RNA 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 miRNA, 치료용 RNA, mRNA, RNA 바이러스, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO) 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 한 측면에서, 제2 결합 파트너의 제2 핵산 서열은 샘플에서 항-약물 항체(ADA)에 의해 특이적으로 결합된다. 한 측면에서, 제1 결합 파트너의 제1 ASO 및 제2 결합 파트너의 제2 ASO는 동일한 항-약물 항체에 의해 특이적으로 결합된다.

한 측면에서, 제1 결합 파트너의 제1 ASO의 뉴클레오티드 서열 및 제2 결합 파트너의 제2 ASO의 뉴클레오티드 서열은 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 한 측면에서, 제2 결합 파트너는 샘플 내 표적 분석물에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 한 측면에서, 표적화 프로브 및 검출 프로브는 샘플 내 동일한 표적 분석물에 동시에 결합하여 반응 생성물을 형성할 수 있다. 한 측면에서, 반응 생성물은 샌드위치 복합체이다.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 복수의 표적 분석물을 병렬로 검출, 확인 또는 정량화하기 위해 멀티플렉싱 어레이에서 사용될 수 있는 복수의 프로브 세트를 포함한다. 한 측면에서, 각각의 프로브 세트는 또 다른 세트의 표적화 프로브와 상이한 제1 표적 분석물에 특이적으로 결합하는 제1 결합 파트너를 갖는 표적화 프로브 및 또 다른 세트의 표적화 프로브와 상이한 포획 올리고뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다. 한 측면에서, 각각의 프로브 세트는 제1 표적 분석물 및 표지에 특이적으로 결합하는 제2 결합 파트너를 포함하는 검출 프로브를 포함한다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 포함한다. 한 측면에서, 각각의 프로브 세트는 제1 결합 파트너가 제1 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 핵산 서열 및 포획 올리고뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 태그를 포함하는 표적화 프로브를 포함하고, 한 세트의 표적화 프로브에 대한 표적 뉴클레오티드 서열은 다른 세트의 표적화 프로브의 표적 뉴클레오티드 서열과 상이하다. 한 측면에서, 한 세트의 표적화 프로브의 올리고뉴클레오티드 태그의 서열은 다른 세트의 표적화 프로브의 올리고뉴클레오티드 태그의 서열과 상이한 포획 올리고뉴클레오티드 서열에 상보적이다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 하나 이상의 표적 뉴클레오티드에서 제2 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 제2 표적 뉴클레오티드 서열인 제2 결합 파트너를 갖는 검출 프로브를 포함한다.

한 측면에서, 상기 방법은 하나 이상의 표면을 갖는 하나 이상의 탄소계 전극; 및 본원에 기술된 하나 이상의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하는 어레이를 제공하는 단계로서, 하나 이상의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 탄소계 전극의 하나 이상의 표면 상의 하나 이상의 결합 도메인에 고정되는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 상기 방법은 하나 이상의 표적 분석물을 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부 및 표지에 상보적인 올리고뉴클레오티드 태그와 회합시킨 다음, 어레이를 하나 이상의 태그되고 표지된 표적 분석물 또는 반응 생성물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "회합하는" 또는 "회합된"은 올리고뉴클레오티드 태그 또는 표지가 표적 분석물에 공유 또는 비공유 결합됨을 의미한다. 한 측면에서, 하나 이상의 표적 분석물은 샌드위치 복합체에서 올리고뉴클레오티드 태그 및 표지와 회합된다. 한 측면에서, 표적 분석물은 올리고뉴클레오티드 태그 및 표지를 포함하는 반응 생성물을 생성하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법은 샌드위치 복합체 또는 반응 생성물의 올리고뉴클레오티드 태그가 상응하는 상보적 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화되는 조건 하에서 샌드위치 복합체 또는 반응 생성물을 지지체 표면과 함께 인큐베이션하고 어레이 위치에서 표지의 존재 또는 부재에 기반하여 표적 분석물을 확인, 검출 또는 정량화하는 단계를 포함한다.

2. 올리고뉴클레오티드 결찰 검정(OLA)

한 측면에서, 어레이는 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드 태그와 회합된 표적 분석물인 조성물과 접촉된다. 한 측면에서, 어레이는 복수의 표적 분석물을 포함하는 조성물과 접촉되며, 각각의 표적 분석물은 상이한 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드 태그와 회합되고 표적 분석물은 어레이 위치에서 올리고뉴클레오티드 태그의 결합을 기반으로 확인, 검출 또는 정량화될 수 있다. 한 측면에서, 어레이는 태그되고 표지된 반응 생성물을 포함하는 조성물과 접촉된다. 한 측면에서, 어레이는 복수의 태그되고 표지된 반응 생성물을 포함하는 조성물과 접촉되며, 각각의 표적 분석물은 상이한 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드 태그를 포함하는 반응 생성물을 생성하는 데 사용되고 샘플 내 표적 분석물은 어레이 위치에서 반응 생성물의 결합을 기반으로 확인, 검출 또는 정량화할 수 있다.

한 측면에서, 태그되고 표지된 반응 생성물은 올리고뉴클레오티드 결찰 검정(OLA)에 의해 제조되고 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열을 확인, 검출 또는 정량화하기 위해 포획 및 검출될 수 있다. 한 측면에서, 결찰 검정은 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열에서 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 검출, 확인 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 결찰 분석은 샘플에서 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)를 검출, 확인 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 결찰 검정은 샘플에서 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열의 증폭 후에 수행된다. 또 다른 측면에서, 결찰 검정은 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열이 증폭되지 않은 샘플에서 수행된다. 한 측면에서, 결찰 검정으로부터의 반응 생성물은 포획 및 검출 전에 증폭된다. 또 다른 측면에서, 결찰 검정으로부터의 반응 생성물은 포획 및 검출 전에 증폭되지 않는다. 결찰 검정의 반응 생성물은 공지된 방법을 사용하여 증폭될 수 있다.

올리고뉴클레오티드 결찰 반응을 수행하는 방법은 공지되어 있으며 일반적으로 다음 단계를 포함한다: 하나 이상의 관심 뉴클레오티드 서열을 함유하거나 함유할 수 있는 샘플을 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이고 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 프로브 쌍과 접촉시킨다. 표적 뉴클레오티드 서열의 인접 영역에 혼성화하는 프로브는 반응 생성물을 형성하기 위해 결찰된다. 한 측면에서, 이러한 단계는 반응 생성물의 다중 유전자복제를 수득하기 위해 반복될 수 있다. 한 측면에서, 결찰 반응 혼합물 내 뉴클레오티드 서열은 어닐링 단계 전에 변성된다. 표적 뉴클레오티드 서열은 샘플에서 반응 생성물의 존재, 부재 또는 양을 기반으로 검출, 확인 또는 정량화될 수 있다.

DNA 리가아제에 의한 프로브의 연결은 다음 세 가지 이벤트에 따라 달라진다: (1) 올리고뉴클레오티드 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열 내 상보적 서열에 혼성화되어야 한다; (2) 올리고뉴클레오티드 프로브는 5'에서 3' 방향으로 간섭 뉴클레오티드 없이 서로 인접해야 한다; 및 (3) 올리고뉴클레오티드 프로브는 결합 부위에서 표적 뉴클레오티드 서열과 완벽한 염기쌍 상보성을 가져야 한다. 프라이머와 표적 사이의 단일 뉴클레오티드 불일치는 결찰을 억제할 수 있다.

한 측면에서, 프로브는 (총 약 80개의 염기쌍에 대해) 표적 뉴클레오티드 서열에서 SNP 부위의 양쪽에 약 40개의 염기쌍을 포함하는 핵산 서열을 확인하고 약 18 내지 약 28개의 뉴클레오티드에 걸친 SNP의 상보적 서열 업스트림 및 다운스트림을 갖는 프로브를 생성함으로써 생성된다. 한 측면에서, SNP 위치가 상이한 2개의 표적화 프로브가 생성된다. 전형적으로, 야생형 및 변이체 대립유전자를 검출하기 위해 단 하나의 검출 프로브만 필요하다.

추가 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 작은 핵산, 예를 들어, 적어도 약 15개의 염기쌍, 적어도 약 16개의 염기쌍, 적어도 약 17개의 염기쌍, 적어도 약 18개의 염기쌍, 적어도 약 19개의 염기쌍, 적어도 약 20개의 염기쌍 및 최대 약 20개의 염기쌍 길이, 최대 약 25개의 염기쌍 길이, 최대 약 30개의 염기쌍 길이, 최대 약 40개의 염기쌍 길이 또는 최대 약 50개의 염기쌍 길이이다. 한 측면에서, 이러한 작은 핵산 표적을 검출하기 위한 프로브는 적어도 약 8개의 염기쌍, 적어도 약 9개의 염기쌍, 적어도 약 10개의 염기쌍, 적어도 약 11개의 염기쌍 또는 적어도 약 12개의 염기쌍 및 최대 약 20개의 염기쌍 길이, 최대 약 25개의 염기쌍 길이, 최대 약 30개의 염기쌍 길이, 최대 약 40개의 염기쌍 길이 또는 최대 약 50개의 염기쌍 길이를 포함하고, 상기 프로브 및 작은 핵산 표적은 본원에 기술된 바와 같이 또 다른 것을 혼성화한 후에 결찰된다.

올리고뉴클레오티드 프로브 서열의 길이는 OLA 반응을 위한 결찰 온도 요건(예를 들어, 약 62℃ 내지 약 64℃)에 따라 변할 수 있다. 프로브 길이가 주어진 반응 온도에 적합할 때까지 표적화 또는 검출 프로브에 염기를 부가하거나 제거할 수 있다.

표적화 및 검출 프로브의 서열 및 길이가 결정된 후, 올리고뉴클레오티드 태그가 표적화 프로브에 부가될 수 있다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 업스트림 표적화 프로브의 5' 엔드에 부가된다. 한 측면에서, 각각의 올리고뉴클레오티드 태그는 지지체 표면에 고정된 상이한 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적이다. 한 측면에서, 검출 프로브는 표지를 포함한다. 한 측면에서, 검출 프로브는 5' 포스페이트 그룹 및 3' 표지를 포함한다. 한 측면에서, 검출 프로브는 5' 포스페이트 그룹 및 3' 비오틴 표지를 포함한다.

한 측면에서, 상기 방법은 한 쌍을 초과하는 프로브의 사용을 포함한다. 한 측면에서, 한 쌍의 프로브가 샘플의 각 표적 서열에 대해 제공된다. 한 측면에서, SNP 쌍의 검출을 위해 3개의 프로브, 즉 단일 뉴클레오티드 다형성이 다른 2개의 표적 프로브 및 1개의 검출 프로브가 준비된다. 한 측면에서, 2개의 표적화 프로브는 관심 표적 핵산의 야생형 또는 변이체 단일 뉴클레오티드 다형성에 상보적인 5' 올리고뉴클레오티드 태그 및 3' 핵산을 포함하고 검출 프로브는 3' 표지를 포함한다. 한 측면에서, 3' 표지는 검출 가능한 2차 결합 시약에 결합하는 1차 결합 시약이다. 한 측면에서, 3' 표지는 비오틴을 포함하고 2차 결합 시약은 MSD SULFO-TAG 스트렙트아비딘을 포함한다. 한 측면에서, 다형성 부위에서 각각의 대립유전자에 대해 한 쌍의 프로브가 준비되며, 예를 들어, 2개의 프로브, 즉 야생형 대립유전자에 대해 1개 및 돌연변이 대립유전자에 대해 1개가 준비될 수 있다. 한 측면에서, 각각의 표적 뉴클레오티드 서열에 대해 결찰 반응이 수행된다. 또 다른 측면에서, 멀티플렉싱 결찰 반응은 하나를 초과하는 표적 뉴클레오티드 서열에 대해 수행된다. 한 측면에서, 멀티플렉싱 결찰 반응은 약 1 내지 약 100개, 또는 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25, 50, 75 또는 100개의 표적 뉴클레오티드 서열에 대해 수행된다. 한 측면에서, 멀티플렉싱 결찰 반응은 각각의 웰에서 최대 10개의 표적 뉴클레오티드 서열을 검출, 확인 또는 정량화하기 위해 수행된다. 한 측면에서, 복수의 대립유전자 쌍이 검출, 확인 또는 정량화된다. 한 측면에서, 최대 5개의 대립유전자 쌍(즉, 야생형 및 돌연변이체 SNP 쌍)이 각각의 웰에서 검출, 확인 또는 정량화된다. 한 측면에서, 검출, 확인 또는 정량화는 샘플이 변이체 대립유전자에 대해 동형접합인지, 이형접합인지 또는 널(null)인지를 결정하는 것을 포함한다.

한 측면에서, 프로브는 주형 의존적 리가아제, 예를 들어, 대장균 DNA 리가아제, T4 DNA 리가아제, T. 아쿠아티쿠스(Taq) 리가아제, T. 써모필러스 DNA 리가아제 또는 피로코쿠스 DNA 리가아제와 같은 DNA 리가아제를 사용하여 연결된다. 한 측면에서, 리가아제는 열안정성 리가아제이다. 또 다른 측면에서, 프로브는 화학적 결찰에 의해 연결된다. 한 측면에서, 혼성화 및 결찰은, 예를 들어, 다중 열순환 및 열안정성 리가아제를 사용하여 조합된 단계로 수행된다. 한 측면에서, 반응 혼합물은 적어도 약 100U/mL, 500U/mL 또는 1000U/mL 및 최대 약 1500U/mL 또는 2000U/mL 리가아제를 포함한다.

한 측면에서, 결찰 검정은 결찰 버퍼에서 샘플을 하나 이상의 프로브 쌍 및 리가아제와 배합함으로써 수행된다. 한 측면에서, 샘플, 프로브 및 리가아제는 결찰 버퍼와 배합되어 부피가 적어도 약 10μL, 15μL 또는 20μL 및 최대 약 20μL, 25μL 또는 50μL인 결찰 반응 혼합물을 형성한다.

한 측면에서, 각각의 프로브 쌍은 표적화 프로브 및 검출 프로브를 포함한다. 한 측면에서, 표적화 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열의 제1 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열 및 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다. 한 측면에서, 검출 프로브는 표지, 및 표적화 프로브 서열의 제1 핵산 서열이 상보적인 제1 영역에 인접한 표적 뉴클레오티드 서열의 제2 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 표적화 프로브의 5'-엔드는 포스포릴화(phosphorylated)되고 프로브 쌍이 표적 뉴클레오티드 서열에 어닐링될 때 검출 프로브의 3'-하이드록실에 인접하여, 두 프로브의 엔드가 포스포디에스테르 결합의 형성에 의해 결찰될 수 있다. 한 측면에서, 검출 프로브의 5'-엔드가 포스포릴화되고 프로브 쌍이 표적 뉴클레오티드 서열에 어닐링될 때 표적화 프로브의 3'-하이드록실에 인접하여, 두 프로브의 말단이 포스포디에스테르 결합의 형성에 의해 결찰될 수 있다.

한 측면에서, 표적화 프로브는 약 5 내지 약 100개, 약 10 내지 약 50개, 약 20 내지 약 30개, 또는 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25개 및 최대 약 30, 35, 40, 45, 50, 75 또는 100개의 뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 적어도 약 1nM, 2nM, 3nM, 4nM 또는 5nM 및 최대 약 5nM, 10nM, 25nM 또는 50nM의 표적화 프로브가 반응 혼합물에 포함된다.

한 측면에서, 표적화 프로브의 전체 길이는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이다. 또 다른 측면에서, 표적화 프로브의 일부는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이다. 한 측면에서, 표적화 프로브는 다형성 부위의 표적 뉴클레오티드 서열 다운스트림에 상보적이다. 한 측면에서, 표적화 프로브는 단일 뉴클레오티드 변이체를 포함하는 표적 뉴클레오티드 서열의 영역에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 대립유전자 특이적 프로브이다. 한 측면에서, 표적화 프로브는 단일 뉴클레오티드 다형성을 포함하는 표적 뉴클레오티드 서열의 영역에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 대립유전자 특이적 프로브이다. 한 측면에서, 표적화 프로브의 3'-말단 핵산은 표적 뉴클레오티드 서열의 다형성 핵산에 상보적이다. 또 다른 측면에서, 표적화 프로브의 3'-말단 핵산은 표적 뉴클레오티드 서열의 다형성 핵산의 뉴클레오티드 3'에 상보적이다.

한 측면에서, 표적화 프로브는 포획 분자에 특이적으로 결합하는 태그를 포함한다. 한 측면에서, 상기 태그는 단일 가닥 포획 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 태그는 표적화 프로브의 5'-엔드에 부착된다. 다른 측면에서, 상기 태그는 표적화 프로브의 3'-엔드에 부착된다. 한 측면에서, 상기 태그는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이지 않고 혼성화하지도 않는다.

한 측면에서, 상기 태그는 상보적 포획 올리고뉴클레오티드 서열보다 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 및 최대 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개, 또는 약 1 내지 약 20개 또는 약 10 내지 약 15개 또는 약 12 내지 약 13개의 뉴클레오티드가 짧은 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 태그는 적어도 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 및 최대 약 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개, 또는 약 15 내지 약 40개 또는 약 20 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이인 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

한 측면에서, 상기 태그는 서열번호 1-10으로 표시되는 포획 올리고뉴클레오티드에 대한 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 태그는 서열번호 1-10으로 표시되는 포획 올리고뉴클레오티드 서열의 약 20 내지 약 25개 또는 약 24개의 연속 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그는 포획 올리고뉴클레오티드의 서열을 기반으로 공지된 방법을 사용하여 제조된다.

한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 프로브의 각각의 쌍은 약 5 내지 약 100개, 약 10 내지 약 50개, 약 20 내지 약 30개, 또는 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25개 및 최대 약 30, 35, 40, 45, 50, 75 또는 100개의 뉴클레오티드를 갖는 검출 프로브를 포함한다.

한 측면에서, 표적화 및 검출 프로브는 용융 온도가 약 60℃ 내지 약 65℃ 또는 약 62℃ 내지 약 64℃이다. 한 측면에서, 표적화 및 검출 프로브는 용융 온도가 유사하다(즉, 약 1℃, 2℃, 3℃, 4℃ 또는 5℃ 이내).

한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 표적화 및 검출 프로브는 결찰 반응 혼합물에 1:1 비율로 포함된다. 또 다른 측면에서, 검출 프로브는 과량으로 포함되며, 예를 들어, 결찰 반응 혼합물은 표적 프로브와 비교하여 적어도 약 5x, 10x 또는 20x 더 많은 검출 프로브를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 적어도 약 10nM, 25nM, 50nM, 75nM, 100nM, 150nM 또는 200nM의 검출 프로브가 반응 혼합물에 포함된다.

한 측면에서, 검출 프로브의 전체 길이는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이다. 또 다른 측면에서, 검출 프로브의 일부는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이다. 한 측면에서, 검출 프로브는 다형성 부위의 표적 뉴클레오티드 서열 업스트림에 상보적이다. 한 측면에서, 검출 프로브는 단일 뉴클레오티드 변이체를 포함하는 표적 뉴클레오티드 서열의 영역에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 검출 프로브는 단일 뉴클레오티드 다형성을 포함하는 표적 뉴클레오티드 서열의 영역에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 검출 프로브의 5'-말단 핵산은 표적 뉴클레오티드 서열의 다형성 핵산에 상보적이다. 또 다른 측면에서, 검출 프로브의 5'-말단 핵산은 표적 뉴클레오티드 서열의 다형성 핵산의 5'인 핵산에 혼성화한다.

한 측면에서, 검출 프로브는 표지를 포함한다. 한 측면에서, 표지는 검출 프로브의 3' 엔드에 부착된다. 한 측면에서, 표지는 검출 프로브의 3' 엔드에 부착되고 5' 엔드는 표적 프로브의 3' 엔드가 혼성화하는 표적 뉴클레오티드 서열에 바로 인접한 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 핵산 서열을 갖는다. 한 측면에서, 표지는 검출 프로브의 5' 엔드에 부착되고 3' 엔드는 표적 프로브의 5' 엔드가 혼성화하는 표적 뉴클레오티드 서열에 바로 인접한 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 핵산 서열을 갖는다.

한 측면에서, 표적화 프로브는 표적화 프로브의 3' 엔드가 표적 뉴클레오티드 서열의 다형성 뉴클레오티드 바로 위에 위치하도록 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화화고 검출 프로브는 다형성 부위에 인접한 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화하여 결찰 반응을 위한 5' 엔드를 제공한다. 표적화 프로브가 표적 뉴클레오티드 서열의 다형성 뉴클레오티드에 상보적인 경우, 제1 올리고뉴클레오티드는 다형성 부위에서 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 것이고 결찰이 발생할 수 있다. 표적화 프로브가 뉴클레오티드 서열의 다형성 뉴클레오티드에 상보적이지 않은 경우, 제1 올리고뉴클레오티드는 다형성 부위에서 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화하지 않을 것이고 결찰이 발생하지 않을 것이다.

또 다른 측면에서, 표적화 프로브는 표적화 프로브의 말단 5'-염기가 표적 뉴클레오티드 서열의 다형성 뉴클레오티드 바로 위에 위치하도록 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화하고 검출 프로브는 다형성 부위에 인접한 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화하여 결찰 반응을 위한 3' 엔드를 제공한다.

또 다른 측면에서, 검출 프로브는 검출 프로브의 말단 5'-염기가 표적 뉴클레오티드 서열의 다형성 뉴클레오티드 바로 위에 위치하도록 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화하고 표적화 프로브는 다형성 부위에 인접한 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화하여 결찰 반응을 위한 3' 엔드를 제공한다.

또 다른 측면에서, 검출 프로브는 검출 프로브의 말단 3'-염기가 표적 뉴클레오티드 서열의 다형성 뉴클레오티드 바로 위에 위치하도록 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화하고 표적화 프로브는 다형성 부위에 인접한 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화하여 결찰 반응을 위한 5' 엔드를 제공한다.

한 측면에서, 상기 방법은 (ⅰ) 하나 이상의 표적 뉴클레오티드를 함유하는 샘플을 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프로브 및 DNA 리가아제와 접촉시켜 결찰 반응 혼합물을 형성하는 단계; (ⅱ) 프로브 쌍을 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 단계로서, 상기 쌍은 표적 뉴클레오티드 서열의 다형성 뉴클레오티드 바로 위에 위치한 말단 3' 또는 5' 염기를 갖는 포획 또는 검출 프로브를 포함하는 단계; (ⅲ) 표적화 프로브와 검출 프로브를 함께 결찰하여 표지되고 태그된 반응 생성물을 형성하는 단계; (ⅳ) 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드가 고정된 지지체 표면을 표지되고 태그된 반응 생성물과 접촉시키는 단계; (ⅴ) 태그가 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화되도록 하는 단계; 및 (ⅵ) 태그되고 표지된 반응 생성물의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.

한 측면에서, 결찰 검정에 사용되는 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열보다 과량으로(즉, nM 수준으로) 포함되며, 따라서 일부 경우에 올리고뉴클레오티드와 표적의 비특이적 결합이 플레이트 상에서 포지티브 신호로 검출될 수 있다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 비특이적 혼성화는 프로브가 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화되고 결찰 없이 혼성화된 상태로 남아 있는 결과일 수 있으며, 이는 결찰 반응 생성물로 인한 것이 아니라 브릿징 배경(bridging background)이라고 하는 비특이적 신호로 인한 신호를 초래하는 것으로 여겨진다.

한 측면에서, 상기 방법은 결찰 반응 혼합물에 하나 이상의 차단 프로브를 제공하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 결찰 반응 혼합물이 하나 이상의 차단 프로브를 포함하면 비특이적 가교 배경이 감소한다. 본원에서 사용되는 용어 "차단 프로브"는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이고 프로브 결찰 부위를 가로지르지만 태그 또는 표지를 포함하지 않는 단일 가닥 뉴클레오티드 서열, 또는 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화하도록 설계된 프로브에 상보적인 단일 가닥 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 한 측면에서, 차단 프로브는 프로브 서열과 거의 동일선상에 있다. 한 측면에서, 차단 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열 또는 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 프로브에 상보적인 적어도 약 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 및 최대 약 50, 75, 100, 150 또는 200개, 또는 약 20 내지 약 200개 또는 약 50 내지 약 100개의 뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 한 쌍의 차단 프로브가 결찰 반응 혼합물에 포함되며, 제1 차단 프로브는 연결 프로브와 동일한 서열을 갖지만 상보적인 올리고뉴클레오티드 태그가 없고; 제2 차단 프로브는 검출 프로브와 동일한 서열을 갖지만 비오틴 표지는 없다. 한 측면에서, 프로브 서열에 인접한 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 차단 프로브의 5'- 및 3'-엔드에 최대 2, 3, 4 또는 5개의 추가 뉴클레오티드가 부가될 수 있다.

이론에 얽매이는 것은 아니지만, 블로킹 프로브의 존재는 표적 뉴클레오티드 서열이 표적 서열에 어닐링되지만 결찰되지 않는 프로브에 대한 가교로서 기능하는 복합체의 형성을 감소시켜 복합체가 잘못된 신호를 생성할 수 있다고 여겨진다. 한 측면에서, 한 쌍의 차단 프로브가 결찰 반응 혼합물에 포함된다. 또 다른 측면에서, 하나 이상의 차단 프로브가 상응하는 OLA 프로브보다 과량으로 결찰 반응 혼합물에 포함된다. 한 측면에서, 하나 이상의 차단 프로브는 상응하는 OLA 프로브에 비해 적어도 약 10x, 20x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x 또는 100x 몰 과량으로 포함된다.

올리고뉴클레오티드 결찰 검정의 한 실시양태를 도 1에 도식적으로 나타냈다. 간단히 말하면, 다형성 부위(2)를 포함하는 표적 뉴클레오티드 서열(1)은 올리고뉴클레오티드 태그(4)를 갖는 표적화 프로브(3) 및 상기 다형성 부위에 상보적인 뉴클레오티드 및 표지(6)를 갖는 검출 프로브(5)를 포함하는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉된다. 올리고뉴클레오티드 프로브(3, 5)는 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있다. (도 1a) 다형성 부위에서 완벽한 상보성으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브(3, 5)는 결찰되어 태그되고(4) 표지된(6) 반응 생성물(11)을 형성한다. (도 1b) 태그되고(4) 표지된(6) 결찰 생성물(11)을 함유하는 반응 혼합물은 하나 이상의 결합 도메인(9)에 고정된 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드(7)를 갖는 지지체 표면 상에 도입된다. 신호(10)는 태그되고(4) 표지된(6) 결찰 생성물(11)이 태그된 올리고뉴클레오티드(4) 및 포획 올리고뉴클레오티드(7)에 함유된 상보적 뉴클레오티드 서열 사이의 혼성화를 통해 지지체 표면에 고정되면 검출된다. (도 1c).

한 측면에서, 멀티플렉스 리가아제 검출 반응이 제공된다. 한 측면에서, 샘플은 하나 이상의 대립유전자 특이적 프로브 및 하나 이상의 공통 프로브와 접촉된다. 한 측면에서, 하나 이상의 대립유전자 특이적 프로브는 포획 올리고뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열 및 관심 다형성에 상응하는 3' 서열을 갖는 5' 올리고뉴클레오티드 태그를 포함하는 업스트림 프로브를 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 공통 프로브는 5'-포스포릴화되고 3'-비오티닐화된 다운스트림 프로브이다. 한 측면에서, 멀티플렉스 결찰 프로브는 하나 이상의 표적 분석물을 함유하는 샘플과 접촉되어 혼성화되고 인접한 프로브는 DNA 리가아제로 결찰되어 결찰 생성물을 형성한다. 한 측면에서, 하나 이상의 고정된 포획 올리고뉴클레오티드는 결찰 생성물과 접촉되고 올리고뉴클레오티드 태그는 상응하는 포획 올리고뉴클레오티드와 혼성화한다. 고정된 결찰 생성물은, 예를 들어, 표지된 스트렙트아비딘, 예를 들어, SULFO-TAG 표지된 스트렙트아비딘을 사용하여 검출될 수 있다.

한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 결찰 검정(OLA)은 올리고뉴클레오티드 대사산물로도 지칭되는, 표적 뉴클레오티드 서열의 붕해 생성물을 함유할 수 있는 샘플에 함유된 표적 뉴클레오티드 서열의 검출, 확인 및/또는 정량화를 위해 사용된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 대사산물을 추가로 포함한다. 한 측면에서, OLA는 올리고뉴클레오티드 대사산물 대비 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 양을 측정하는 데 사용된다. 한 측면에서, OLA는 표적 뉴클레오티드 서열의 약동학 매개변수를 결정하는 데 사용된다. 한 측면에서, 측정된 약동학 매개변수는 클리어런스, 부피 분포, 혈장 농도, 반감기, 피크 시간, 피크 농도, 이용률 또는 이들의 조합이다. 약동학 매개변수의 측정 및 해석이 본원에 기술되어 있다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 치료용 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물은 치료용 올리고뉴클레오티드 대사산물이다. 치료용 올리고뉴클레오티드, ASO, 및 이들의 대사 및 약리학이 본원에 기술되어 있다.

한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물은 표적 뉴클레오티드 서열보다 1개 이상의 뉴클레오티드, 2개 이상의 뉴클레오티드, 3개 이상의 뉴클레오티드, 4개 이상의 뉴클레오티드, 5개 이상의 뉴클레오티드, 6개 이상의 뉴클레오티드, 7개 이상의 뉴클레오티드, 8개 이상의 뉴클레오티드, 9개 이상의 뉴클레오티드, 10개 이상의 뉴클레오티드, 15개 이상의 뉴클레오티드 또는 20개 이상의 뉴클레오티드가 더 짧다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물은 표적 뉴클레오티드 서열보다 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10% 더 짧다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 치료용 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물은 치료용 올리고뉴클레오티드 대사산물이다.

예시적인 실시양태가 도 15에 도시되어 있다. 도 15에서, 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플은 주형 올리고뉴클레오티드와 접촉된다. 주형 올리고뉴클레오티드는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 제1 서열, 및 제1 서열에 인접하고 표적 뉴클레오티드 서열의 결찰 파트너에 상보적인 제2 서열을 포함한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 주형 올리고뉴클레오티드의 제1 서열에 혼성화하고, 표적 뉴클레오티드 서열의 결찰 파트너는 주형 올리고뉴클레오티드의 제2 서열에 혼성화한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열 및 결찰 파트너는 주형 올리고뉴클레오티드의 전체 길이에 걸쳐 혼성화한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열 및 결찰 파트너는 주형 올리고뉴클레오티드와 혼성화하여 이중 가닥 복합체를 형성한다. 표적 뉴클레오티드 서열 및 결찰 파트너는 본원에 기술된 방법을 사용하여 함께 결찰되어 표적 뉴클레오티드 서열 결찰 생성물을 형성한다. 이어서, 표적 뉴클레오티드 서열 결찰 생성물은 표적 뉴클레오티드 서열 결찰 생성물에 상보적이고 표적 뉴클레오티드 서열 결찰 생성물에 혼성화되는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 프로브 쌍과 접촉된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열 결찰 생성물의 인접 영역에 혼성화할 수 있는 프로브가 표적 뉴클레오티드 서열 결찰 생성물에 부가된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열 결찰 생성물의 인접 영역에 각각 혼성화하는 2개의 인접 프로브가 결찰되어 반응 생성물을 형성한다. 한 측면에서, 프로브는 본원에 기술된 바와 같은 표적화 프로브 및 검출 프로브를 포함한다. 한 측면에서, 표적화 프로브 및 검출 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열 결찰 생성물의 전체 길이에 걸쳐 혼성화한다. 한 측면에서, 표적화 프로브는 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다. 표적화 프로브 및 올리고뉴클레오티드 태그는 본원에서 추가로 기술된다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적이다. 한 측면에서, 검출 프로브는 표지를 포함한다. 검출 프로브 및 표지는 본원에서 추가로 기술된다. 한 측면에서, 표지는 비오틴을 포함하고 검출 시약은 스트렙트아비딘에 연결된다. 또 다른 측면에서, 표지는 합텐을 포함하고, 검출 시약은 항체와 같은 합텐 결합 파트너에 연결된다. 표지, 검출 시약, 및 표지와 검출 시약 사이의 결합 방식은 본원에서 추가로 기술된다. 한 측면에서, 표면은 표지에 결합하기 위해 검출 시약과 접촉된다. 한 측면에서, 검출 시약은 전기화학발광 시약이다. 한 측면에서, 검출 시약은 MSD SULFO-TAG를 포함한다. 한 측면에서, 전기화학발광은 표적 뉴클레오티드 서열을 검출, 확인 및/또는 정량화하기 위해 본원에 기술된 바와 같이 측정된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열의 약동학적 매개변수를 결정하기 위해 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 양을 측정한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 치료용 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 치료용 올리고뉴클레오티드를 증폭시키지 않고 검출된다. 한 측면에서, 샘플에서 치료용 올리고뉴클레오티드는 핵산 추출 단계 없이 검출된다.

한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 대사산물도 포함한다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물은 표적 뉴클레오티드 서열의 검출, 확인 및/또는 정량화를 방해한다. 따라서, 샘플로부터 올리고뉴클레오티드 대사산물을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드에 특이적인 뉴클레아제(즉, "단일 가닥 특이적 뉴클레아제")는 표적 뉴클레오티드 서열 결찰 생성물 및 주형 올리고뉴클레오티드가 혼성화되는 동안 및 프로브의 부가 전에 도 15에 개략적으로 도시된 바와 같이 부가된다. 단일 가닥 특이적 뉴클레아제는 혼성화된 표적 뉴클레오티드 서열 결찰 생성물 및 주형 올리고뉴클레오티드에 실질적으로 반응하지 않으면서 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 대사산물을 특이적으로 제거한다. 한 측면에서, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제는 과량의 혼성화되지 않은 주형 올리고뉴클레오티드를 추가로 제거한다. 단일 가닥 특이적 뉴클레아제의 비제한적 예는 뉴클레아제 S1(예를 들어, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)로부터 단리됨), 뉴클레아제 P1(예를 들어, 페니실리움 시트리눔(Penicillium citrinum)으로부터 단리됨), 뉴클레아제 MB(예를 들어, 녹두 비그나 라디아타(Vigna radiata)로부터 단리됨), 및 알테로모나스 에스페지아나(Alteromonas espejiana), 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa) 및 우스티라고 메이디스(Ustilago maydis)로부터 단리된 뉴클레아제를 포함한다. 단일 가닥 특이적 뉴클레아제는, 예를 들어, RNase A, RNase H, RNase Ⅰ, RNase Ⅲ, RNase L, RNase P, RNase PhyM, RNase T1, RNase T2, RNase U2, RNase V, PNPase, RNase PH, RNase R, RNase D, RNase T, RNaseONE, 올리고리보뉴클레아제, 엑소리보뉴클레아제 Ⅰ 및 엑소리보뉴클레아제 Ⅱ와 같은 RNase도 포함할 수 있다. 본 방법에 적합할 수 있는 추가 뉴클레아제는 특정 DNase를 포함한다. 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 포함하는 추가 뉴클레아제는, 예를 들어, Yang, Q Rev Biophys 44(1):1-93 (2011) 및 Desai 등, FEMS Microbiol Rev 26:457-491 (2003)에 제공되어 있다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 치료용 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물은 치료용 올리고뉴클레오티드 대사산물이다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 RNA를 포함한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 miRNA, 치료용 RNA, mRNA, RNA 바이러스 또는 이들의 조합을 포함한다.

3. 프라이머 검정(PEA)

또 다른 측면에서, 샘플에서 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열은 프라이머 검정(PEA)을 사용하여 검출, 확인 또는 정량화된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)를 포함한다. 또 다른 측면에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 포함한다. 한 측면에서, 샘플에서 표적 뉴클레오티드 서열의 증폭 후에 프라이머 연장이 수행된다. 또 다른 측면에서, 프라이머 연장은 증폭되지 않은 샘플에서 수행된다.

프라이머 검정을 수행하는 방법은 공지되어 있으며 일반적으로 다음 단계를 포함한다: 샘플을 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브와 접촉시킨다. 한 측면에서, 프로브의 전체 길이는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이다. 또 다른 측면에서, 프로브의 일부는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이다. 한 측면에서, 프로브는 다형성 뉴클레오티드의 3' 엔드 바로 옆에 있는 표적 뉴클레오티드 서열의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하여 프로브가 다형성 뉴클레오티드 다운스트림에서 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화하도록 한다. 한 측면에서, 프로브는 약 5 내지 약 100개, 약 10 내지 약 50개, 약 20 내지 약 30개, 또는 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25개 및 최대 약 30, 35, 40, 45, 50, 75 또는 100개의 뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 프로브는 포획 분자에 특이적으로 결합하는 태그를 포함하는 표적화 프로브이다. 한 측면에서, 태그는 단일 가닥 포획 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 태그는 표적화 프로브의 5' 엔드에 부착된다. 한 측면에서, 태그는 표적화 프로브의 5' 엔드에 부착되고 표적화 프로브의 3' 말단 핵산은 표적 뉴클레오티드 서열의 다형성 부위 바로 다운스트림의 핵산에 상보적이다. 한 측면에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그는 포획 올리고뉴클레오티드의 서열을 기반으로 최종 사용자에 의해 공지된 방법을 사용하여 제조된다.

한 측면에서, 태그는 포획 올리고뉴클레오티드 서열보다 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 및 최대 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개, 또는 약 1 내지 약 20개 또는 약 10 내지 약 15개의 뉴클레오티드가 더 짧다. 한 측면에서, 태그는 적어도 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 및 최대 약 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개, 또는 약 15 내지 약 40개 또는 약 20 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이이다. 한 측면에서, 태그는 서열번호 1-64로 표시되는 포획 올리고뉴클레오티드에 대한 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 태그는 서열번호 1-10으로 표시되는 포획 올리고뉴클레오티드에 대한 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

한 측면에서, 하나 이상의 태그 올리고뉴클레오티드는 상응하는 포획 올리고뉴클레오티드의 전체 서열에 상보적인 서열을 함유한다. 한 측면에서, 하나 이상의 태그 올리고뉴클레오티드는 상응하는 포획 올리고뉴클레오티드 서열의 일부에만 상보적인 서열을 함유한다. 예를 들어, 제한 없이, 포획 올리고뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 링커를 함유할 수 있으며, 이는 그것이 부착되는 표면에 근접한(예를 들어, 티올 변형된 말단 뉴클레오티드로 시작되는) 태그 올리고뉴클레오티드 서열에 상보적이지 않은 올리고뉴클레오티드 서열로 이루어지거나 이를 포함할 수 있다. 태그와 포획 올리고뉴클레오티드 사이의 상보적 영역도 길이가 다를 수 있다. 본 발명의 일부 측면에서 올리고뉴클레오티드 사이의 상보적 영역은 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 뉴클레오티드 길이이다.

한 측면에서, 상기 방법은 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플을 표적화 프로브와 접촉시키는 단계, 및 표적화 프로브를 중합효소와, 예를 들어, ddA, ddT, ddC, ddG를 포함하는 하나 이상의 2'3'-디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(ddNTP)를 포함하는 프라이머 반응 혼합물의 존재하에 표적 뉴클레오티드에 혼성화하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 다형성 부위에 상보적인 ddNTP가 표지된다. 한 측면에서, 다형성 부위에 상보적이지 않은 ddNTP가 표지되지 않는다. 한 측면에서, 야생형 다형성 뉴클레오티드에 상보적인 ddNTP가 표지된다. 또 다른 측면에서, 돌연변이 다형성 뉴클레오티드에 상보적인 ddNTP가 표지된다. 한 측면에서, 표적화 프로브의 3' 엔드는 단일 ddNTP에 의해 연장된다. 한 측면에서, 표지된 ddNTP가 다형성 뉴클레오티드에 상보적일 때 프라이머는 표지된 하나의 ddNTP에 의해 연장되어 태그되고 표지된 반응 생성물을 형성한다. 표지된 ddNTP가 다형성 뉴클레오티드에 상보적이지 않으면 프라이머가 표지되지 않은 ddNTP에 의해 연장되고 검출되지 않는다.

적합한 중합효소는 DNA 중합효소, RNA 중합효소, DNA 의존적 RNA 중합효소(역전사효소) 및, 예를 들어, DNA 중합효소의 Klenow 단편을 포함하는 이들의 활성 서브유닛을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 측면에서, 중합효소는 DNA 중합효소이다. 한 측면에서, 중합효소는 Taq 중합효소와 같은 열안정성 중합효소이다.

프라이머 검정의 한 실시양태를 도 2에 도식적으로 나타냈다. 간단히 말하면, 다형성 부위(22)를 포함하는 표적 뉴클레오티드 서열(21)은 DNA 중합효소 및 2'3'-디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(ddNTP), 즉 ddA, ddT, ddC, ddG를 포함하는 프라이머 반응 혼합물의 존재하에 올리고뉴클레오티드 태그(25)를 이용하여 표적화 프로브(23)와 접촉되며, 다형성 부위에 상보적인 ddNTP(25)는 표지된다(26). 표적화 프로브의 3' 엔드는 단일 ddNTP에 의해 연장된다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 표지된 ddNTP가 다형성 뉴클레오티드에 상보적일 때 하나의 표지된 ddNTP에 의해 프라이머가 연장되어 태그되고 표지된 반응 생성물을 형성한다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, 다형성 뉴클레오티드가 표지된 ddNTP에 상보적이지 않을 때 표지되지 않은 ddNTP에 의해 프라이머가 연장되어 표지되지 않은 반응 생성물이 생성되고 이는 검출되지 않을 것이다.

4. 직접 혼성화

한 측면에서, 직접 혼성화 방법을 사용하여 샘플에서 하나 이상의 표적 분석물을 검출, 확인 또는 정량화하기 위한 방법 또는 키트가 제공된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산의 서열에 상보적인 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드(본원에서 "표적 특이적 포획 올리고뉴클레오티드"로 지칭됨)를 포함한다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 복수의 표적 분석물을 병렬로 검출, 확인 또는 정량화하기 위해 멀티플렉싱 어레이에서 사용될 수 있는 복수의 표적 특이적 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 상기 방법은 하나 이상의 표적 특이적 포획 분자가 고정되는 지지체 표면을 제공하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 편평한 표면을 갖는다. 한 측면에서, 지지체 표면은 복수의 웰을 갖는 플레이트, 즉 "멀티 웰 플레이트"이다. 멀티 웰 플레이트는 임의의 패턴 또는 구성으로 배열된 임의의 크기 또는 모양의 임의의 개수의 웰을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 지지체 표면은 곡면을 갖는다. 한 측면에서, 지지체 표면은 검정 플레이트, 슬라이드, 카트리지, 비드 또는 칩과 같은 검정 모듈을 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 하나 이상의 입자 또는 "비드"에 의해 제공된다. 한 측면에서, 지지체 표면은 색상 코딩된 미소구를 포함한다. 예를 들어, Yang 등 (2001) BADGE, BeadsArray for the Detection of Gene Expression, a High-Throughput Diagnostic Bioassay. Genome Res. 11(11):1888-1898 참조. 한 측면에서, 지지체 표면은 하나 이상의 표적 특이적 포획 올리고뉴클레오티드가 고정된 하나 이상의 비드를 포함한다.

한 측면에서, 하나 이상의 표적 특이적 포획 분자는 어레이의 결합 도메인에 고정된다. 한 측면에서, 지지체 표면은 하나 이상의 표면을 갖는 하나 이상의 탄소계 전극 및 하나 이상의 탄소계 전극의 하나 이상의 표면 상의 하나 이상의 결합 도메인에 고정된 하나 이상의 표적 특이적 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 하나 이상의 표적 분석물을 함유하거나 함유하는 것으로 추정되는 샘플은 하나 이상의 표적 핵산 상의 서열에 상보적인 하나 이상의 서열을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 및 표지된 프라이머가 표적 분석물에 혼성화되는 조건 하에서 하나 이상의 표적 분석물에 상보적인 서열을 포함하는 표지된 프라이머와 접촉된다. 이어서 표적 분석물은 PCR 증폭과 같은 공지된 기술을 사용하여 증폭되어 표지된 반응 생성물을 형성할 수 있다.

한 측면에서, 하나 이상의 표적 특이적 포획 올리고뉴클레오티드 서열이 고정된 지지체 표면은 하나 이상의 표지된 반응 생성물의 올리고뉴클레오티드 태그가 지지체 표면 상에서 상응하는 상보적 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화하여 고정된 검출 복합체를 형성할 수 있는 조건 하에서 표지된 반응 생성물과 접촉되고, 표지의 존재 또는 부재를 기반으로 표적 분석물을 어레이 위치에서 확인, 검출 또는 정량화한다.

한 측면에서, 직접 혼성화는 샘플에서 바이러스의 존재를 검출, 확인 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 직접 혼성화는 인체 유두종바이러스(human papillomavirus, HPV) 유전자형분석에 사용될 수 있다. 인체 유두종바이러스(HPV) 감염은 자궁경부암의 주요 원인이다. 200개 초과의 HPV 유전자형이 확인되었으며 약 40개가 생식기 감염을 일으킨다. HPV 유형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 및 82는 발암성으로 간주된다. Munoz 등 (2003) Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. N. Engl. J. Med. 3(48):518.

한 측면에서, 직접 혼성화는 샘플에서 박테리아의 존재를 검출, 확인 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 직접 혼성화는 샘플에서 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)(C. 트라코마티스)를 검출, 확인 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 직접 혼성화는 C. 트라코마티스에 대한 세 가지 주요 혈청형(혈청형 A-C) 중 하나 이상을 검출, 확인 또는 정량화하는 데 사용된다.

한 측면에서, 직접 혼성화는 샘플에서 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)의 존재를 검출, 확인 또는 정량화하는 데 사용된다. 2600개 초과의 상이한 혈청형이 확인되었으며 장티푸스성 및 비-장티푸스성 서보바르(servovar)로 나눌 수 있다. Gal-mor 등 (2014) Same species, different diseases: how and why typhoidal and non-typhoidal Salmonella enterica sevovars differ. Front. Microbiol. 5(391) doi: 10.3389/fmicb.2014.00391.

한 측면에서, 직접 혼성화는 올리고뉴클레오티드 대사산물을 함유할 수 있는 샘플에 있는 표적 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 치료용 올리고뉴클레오티드의 검출, 확인 및/또는 정량화에 사용된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 대사산물을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 직접 혼성화는 올리고뉴클레오티드 대사산물 대비 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 양을 측정하는 데 사용된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열의 약동학 매개변수를 결정하기 위해 직접 혼성화가 사용된다. 한 측면에서, 측정된 약동학 매개변수는 클리어런스, 부피 분포, 혈장 농도, 반감기, 피크 시간, 피크 농도, 이용률 또는 이들의 조합이다. 약동학 매개변수의 측정 및 해석이 본원에 기술되어 있다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 치료용 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)이다. 치료용 올리고뉴클레오티드, ASO, 및 이들의 대사 및 약리학이 본원에 기술되어 있다.

예시적인 실시양태가 도 16에 도시되어 있다. 도 16에서, 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플은 표적 뉴클레오티드 서열과 표적 뉴클레오티드 서열 보체가 혼성화하는 조건 하에서 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 포함하는 표적 뉴클레오티드 서열 보체와 접촉된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열 및 표적 뉴클레오티드 서열 보체는 전체 길이에 걸쳐 혼성화된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열 분석물 및 표적 뉴클레오티드 서열 보체가 혼성화하여 이중 가닥 혼성화 복합체를 형성한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 대사산물을 추가로 포함한다. 표적 뉴클레오티드 서열의 대사산물, 예를 들어, ASO와 같은 치료용 올리고뉴클레오티드가 본원에 기술되어 있다. 한 측면에서, 상기 방법은 올리고뉴클레오티드 대사산물을 제거하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열과 표적 뉴클레오티드 서열 보체가 혼성화되는 동안 단일 가닥 특이적 뉴클레아제가 샘플에 첨가된다. 한 측면에서, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제는 혼성화된 표적 뉴클레오티드 서열 및 표적 뉴클레오티드 서열 보체에 실질적으로 반응하지 않으면서 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 대사산물을 특이적으로 제거한다. 한 측면에서, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제는 과량의 혼성화되지 않은 표적 뉴클레오티드 서열 보체를 추가로 제거한다. 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 포함하는 적합한 뉴클레아제의 예가 본원에서 제공된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 치료용 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물은 치료용 올리고뉴클레오티드 대사산물이다.

한 측면에서, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제에 의한 올리고뉴클레오티드 대사산물 및/또는 혼성화되지 않은 표적 뉴클레오티드 서열 보체의 제거 후, 표적 뉴클레오티드 서열의 인접 영역에 혼성화할 수 있는 프로브가 부가된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열의 인접한 영역에 각각 혼성화하는 2개의 인접한 프로브가 결찰되어 반응 생성물을 형성한다. 한 측면에서, 상기 프로브는 본원에 기술된 바와 같은 표적화 프로브 및 검출 프로브를 포함한다. 한 측면에서, 표적화 프로브 및 검출 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 혼성화한다. 한 측면에서, 표적화 프로브는 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다. 표적화 프로브 및 올리고뉴클레오티드 태그는 본원에서 추가로 기술된다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적이다. 한 측면에서, 검출 프로브는 표지를 포함한다. 검출 프로브 및 표지는 본원에서 추가로 기술된다. 한 측면에서, 검출 프로브는 검출 시약에 결합할 수 있다. 한 측면에서, 검출 프로브는 비오틴 표지를 포함한다. 한 측면에서, 표지는 비오틴을 포함하고 검출 시약은 스트렙트아비딘에 연결된다. 또 다른 측면에서, 표지는 합텐을 포함하고, 검출 시약은 항체와 같은 합텐 결합 파트너에 연결된다. 표지, 검출 시약, 및 표지와 검출 시약 사이의 결합 방식은 본원에서 추가로 기술된다. 한 측면에서, 표면은 표지에 결합하기 위해 검출 시약과 접촉된다. 한 측면에서, 검출 시약은 전기화학발광 시약이다. 한 측면에서, 검출 시약은 MSD SULFO-TAG를 포함한다. 한 측면에서, 전기화학발광은 표적 뉴클레오티드 서열을 검출, 확인 및/또는 정량화하기 위해 본원에 기술된 바와 같이 측정된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열의 약동학적 매개변수를 결정하기 위해 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 양을 측정한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 치료용 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물은 치료용 올리고뉴클레오티드 대사산물이다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 RNA를 포함한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 miRNA, 치료용 RNA, mRNA, RNA 바이러스 또는 이들의 조합을 포함한다.

5. 중합효소 연쇄 반응(PCR)

한 측면에서, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 샘플에서 하나 이상의 표적 분석물을 검출, 확인 또는 정량화하기 위한 방법 또는 키트가 제공된다. 한 측면에서, 표적 핵산은 PCR을 사용하여 증폭된다. 한 측면에서, 하나 이상의 PCR 프라이머 세트를 포함하는 방법 또는 키트가 제공되며, 각 프라이머 세트는 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 포함한다. 한 측면에서, 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 업스트림 및 다운스트림 PCR 프라이머를 사용하여 증폭된다.

한 측면에서, 샘플 내 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 분석물은 하나 이상의 변형된 업스트림 또는 다운스트림 프라이머를 사용하여 증폭된다. 한 측면에서, 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 분석물은 상보적 서열을 갖는 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화하도록 구성된 올리고뉴클레오티드 태그 서열을 포함하는 하나 이상의 업스트림 프라이머를 사용하여 증폭된다. 한 측면에서, 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 분석물은 표지를 포함하는 하나 이상의 다운스트림 프라이머를 사용하여 증폭된다. 한 측면에서, 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 분석물은 상보적 서열을 갖는 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화하도록 구성된 올리고뉴클레오티드 태그 서열을 포함하는 하나 이상의 다운스트림 프라이머를 사용하여 증폭된다. 한 측면에서, 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 분석물은 표지를 포함하는 하나 이상의 업스트림 프라이머를 사용하여 증폭된다.

한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 변형된 PCR 프라이머를 사용하여 증폭되어 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화하도록 구성된 올리고뉴클레오티드 태그를 포함하는 PCR 반응 생성물을 형성한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 표지를 포함하는 PCR 반응 생성물을 형성하기 위해 하나 이상의 변형된 PCR 프라이머를 사용하여 증폭된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 변형된 PCR 프라이머를 사용하여 증폭되어 지지체 표면 및 표지에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화하도록 구성된 올리고뉴클레오티드 태그를 포함하는 PCR 반응 생성물을 형성한다. PCR 반응 생성물을 표지화하는 방법은 공지되어 있고, 예를 들어, 표지를 포함하는 표지화된 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP) 또는 변형된 업스트림 또는 다운스트림 프라이머를 포함한다.

한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 지지체 표면 상의 어레이의 결합 도메인에 고정된다. 한 측면에서, PCR 반응 생성물은 올리고뉴클레오티드 태그를 상응하는 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화함으로써 지지체 표면 상에 포획되어 지지체 표면에 고정되는 검출 복합체를 형성한다.

한 측면에서, 하나 이상의 표적 분석물이 결찰 매개 증폭(LM PCR)을 사용하여 검출, 확인 또는 정량화된다. 한 측면에서, 하나 이상의 표적 분석물은 본원에 기술된 방법과 조합된 멀티플렉스 "결찰 매개 증폭"을 사용하여 검출, 확인 또는 정량화된다. 한 측면에서, 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 분석물은 업스트림 및 다운스트림 프로브를 사용하여 역전사된다. 한 측면에서, 업스트림 프로브는 T7과 같은 범용 프라이머 부위에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 올리고뉴클레오티드 태그 서열 및 유전자 특이적 서열을 포함하고, 다운스트림 프로브는 업스트림 프로브 및 T3와 같은 범용 프라이머 부위의 유전자 특이적 단편과 인접한 유전자 특이적 단편을 포함한다. 한 측면에서, 다운스트림 프로브는 5'-포스포릴화된다. 한 측면에서, 프로브는 표적에 어닐링되고, 유리 프로브는 제거되며, 어닐링된 프로브는 리가아제를 사용하여 결찰되어 증폭 주형을 생성한다. 한 측면에서, PCR은 T3 및 5'-비오티닐화된 T7 프라이머로 수행된다. 한 측면에서, 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 태그가 상응하는 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화되는 조건 하에서 비오티닐화된 앰플리콘과 접촉된다. 한 측면에서, 포획된 표지된 앰플리콘은 표지된 스트렙트아비딘, 예를 들어, SULFO-TAG 표지된 스트렙트아비딘과 함께 인큐베이션되어 포획된 표지된 앰플리콘이 검출, 확인 또는 정량화될 수 있다. 예를 들어, Peck 등 (2006) A method for high-throughput gene expression signature analysis. Genome Biol. 7(7):R61 참조.

한 측면에서, 표적 분석물은 cDNA이다. 한 측면에서, 표적 분석물은 mRNA이다. 한 측면에서, cDNA는 올리고-dT 프라이머를 사용하여 폴리-A 테일 mRNA로부터 합성된다. 한 측면에서, 랜덤 프라이밍된 cDNA 합성을 사용하여 mRNA로부터 cDNA를 생성할 수 있다.

6. 뉴클레아제 보호 검정(NPA)

한 측면에서, 뉴클레아제 보호 검정을 사용하여 샘플에서 하나 이상의 표적 분석물을 검출, 확인 또는 정량화하기 위한 방법 또는 키트가 제공된다. 한 측면에서, 표적 분석물을 함유하거나 함유하는 것으로 추정되는 샘플에서 표적 분석물을 검출, 확인 또는 정량화하기 위해 뉴클레아제 보호 검정이 사용된다. 한 측면에서, 표적 분석물은, 예를 들어, 단일 가닥 RNA를 포함하는 단일 가닥 핵산을 포함한다. 한 측면에서, 표적 분석물은 미세RNA(miRNA)를 포함한다. 한 측면에서, 샘플은 표적 분석물이 프로브에 혼성화하여 태그된 반응 생성물을 형성하는 조건 하에서 표적 분석물의 서열에 상보적인 서열 및 올리고뉴클레오티드 태그 서열을 포함하는 하나 이상의 단일 가닥 프로브와 접촉된다. 한 측면에서, 프로브는 표적 분석물의 핵산 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 태그 서열 및 단일 가닥 RNA 서열을 포함하는 DNA/RNA 혼성 프로브이다. 한 측면에서, 상기 혼성 프로브는 비오틴 표지를 포함한다.

한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드가 고정된 지지체 표면은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 태그 서열이 지지체 표면에 고정된 상응하는 포획 올리고뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 조건 하에서 태그된 반응 생성물을 포함하는 혼합물과 접촉된다. 올리고뉴클레오티드 태그가 지지체 표면 상의 상응하는 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화되도록 허용된 후, 지지체 표면을 세척하고 단일 가닥 RNA에 특이적인 RNase, 예를 들어, RNase A 또는 RNase Ⅰ과 RNase가 단일 가닥 RNA 분자를 분해하고 혼성화된 표적 RNA가 없는 스폿에 결합된 과량의 프로브를 제거하고 프로브와 표적 RNA 사이의 임의의 불일치 부위를 절단할 수 있는 조건하에 접촉시킨다.

한 측면에서, miRNA 분석은 DNA/RNA 키메라 프로브가 어닐링 온도의 증분 감소 동안 표적 miRNA에 혼성화하는 단계적 프로브 혼성화 단계를 포함한다.

한 측면에서, 직접 표면 코팅을 사용한 뉴클레아제 보호 검정(NPA)은 올리고뉴클레오티드 대사산물로도 지칭되는 표적 뉴클레오티드 서열의 붕해 생성물을 함유할 수 있는 샘플 내에 있는 표적 뉴클레오티드 서열의 검출, 확인 및/또는 정량화에 사용된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 대사산물을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 직접 표면 코팅을 사용한 NPA는 올리고뉴클레오티드 대사산물 대비 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 양을 측정하는 데 사용된다. 한 측면에서, 직접 표면 코팅을 사용한 NPA는 치료용 올리고뉴클레오티드의 약동학 매개변수를 결정하는 데 사용된다. 한 측면에서, 측정된 약동학 매개변수는 클리어런스, 부피 분포, 혈장 농도, 반감기, 피크 시간, 피크 농도, 이용률 또는 이들의 조합이다. 약동학 매개변수의 측정 및 해석이 본원에 기술되어 있다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 치료용 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물은 치료용 올리고뉴클레오티드 대사산물이다. 치료용 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 이들의 대사 및 약리학이 본원에 기술되어 있다.

한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물은 표적 뉴클레오티드 서열보다 1개 이상의 뉴클레오티드, 2개 이상의 뉴클레오티드, 3개 이상의 뉴클레오티드, 4개 이상의 뉴클레오티드, 5개 이상의 뉴클레오티드, 6개 이상의 뉴클레오티드, 7개 이상의 뉴클레오티드, 8개 이상의 뉴클레오티드, 9개 이상의 뉴클레오티드, 10개 이상의 뉴클레오티드, 15개 이상의 뉴클레오티드 또는 20개 이상의 뉴클레오티드가 더 짧다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물은 표적 뉴클레오티드 서열보다 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10% 더 짧다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 치료용 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물은 치료용 올리고뉴클레오티드 대사산물이다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 치료용 올리고뉴클레오티드를 증폭시키지 않고 검출된다. 한 측면에서, 샘플에서 치료용 올리고뉴클레오티드는 핵산 추출 단계 없이 검출된다.

예시적인 실시양태가 도 17에 도시되어 있다. 도 17에서, 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 포함하는 표적 뉴클레오티드 서열 보체가 포획 올리고뉴클레오티드로 사용된다. 표적 뉴클레오티드 서열 보체는 하나의 엔드에 표지를 포함하고 나머지 엔드에 표면 부착 모이어티를 포함한다. 포획 올리고뉴클레오티드를 표면에 고정시키는 방법은 본원에 기술되어 있으며, 예를 들어, 정전기적 상호작용, 상보적 결합 파트너, 상보적 반응성 작용기, 링커(예를 들어, 반응성 작용기를 포함하는 가교결합제) 등을 포함한다. 한 측면에서, 표면은 표적 뉴클레오티드 서열 보체의 표면 부착 모이어티를 통해 표적 뉴클레오티드 서열 보체로 코팅된다. 한 측면에서, 표면 부착 모이어티는 티올을 포함한다. 한 측면에서, 표면 부착 모이어티는 비오틴을 포함한다.

한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열 보체 코팅된 표면은 표적 뉴클레오티드 서열 보체와 표적 뉴클레오티드 서열이 혼성화하는 조건 하에서 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플과 접촉된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열 및 표적 뉴클레오티드 서열 보체는 전체 길이에 걸쳐 혼성화된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열과 표적 뉴클레오티드 서열 보체가 혼성화하여 이중 가닥 혼성화 복합체를 형성한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 대사산물을 추가로 포함한다. 표적 뉴클레오티드 서열의 대사산물, 예를 들어, ASO와 같은 치료용 올리고뉴클레오티드가 본원에 기술되어 있다. 한 측면에서, 상기 방법은 올리고뉴클레오티드 대사산물을 제거하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열과 표적 뉴클레오티드 서열 보체가 혼성화되는 동안 단일 가닥 특이적 뉴클레아제가 샘플에 첨가된다. 한 측면에서, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제는 혼성화된 표적 뉴클레오티드 서열-표적 뉴클레오티드 서열 보체에 실질적으로 반응하지 않으면서 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 대사산물을 특이적으로 제거한다. 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 포함하는 적합한 뉴클레아제의 예가 본원에서 제공된다.

한 측면에서, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제에 의한 올리고뉴클레오티드 대사산물의 제거 후, 표면은 표적 뉴클레오티드 서열 보체 상의 표지에 결합할 수 있는 검출 시약과 접촉된다. 한 측면에서, 표지는 비오틴을 포함하고 검출 시약은 스트렙트아비딘에 연결된다. 또 다른 측면에서, 표지는 합텐을 포함하고, 검출 시약은 항체와 같은 합텐 결합 파트너에 연결된다. 표지, 검출 시약, 및 표지와 검출 시약 사이의 결합 방식은 본원에서 추가로 기술된다. 한 측면에서, 검출 시약은 전기화학발광 시약이다. 한 측면에서, 검출 시약은 MSD SULFO-TAG를 포함한다. 한 측면에서, 전기화학발광은 표적 뉴클레오티드 서열을 검출, 확인 및/또는 정량화하기 위해 본원에 기술된 바와 같이 측정된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열의 약동학 매개변수를 결정하기 위해 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 양을 측정한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 치료용 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물은 치료용 올리고뉴클레오티드 대사산물이다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 RNA를 포함한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 miRNA, 치료용 RNA, mRNA, RNA 바이러스 또는 이들의 조합을 포함한다.

추가 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 작은 핵산, 예를 들어, 적어도 약 15개의 염기쌍, 적어도 약 16개의 염기쌍, 적어도 약 17개의 염기쌍, 적어도 약 18개의 염기쌍, 적어도 약 19개의 염기쌍, 또는 적어도 약 20개의 염기쌍 및 최대 약 20개의 염기쌍 길이, 최대 약 25개의 염기쌍 길이, 최대 약 30개의 염기쌍 길이, 최대 약 40개의 염기쌍 길이 또는 최대 약 50개의 염기쌍 길이이다. 한 측면에서, 이러한 작은 핵산 표적을 검출하기 위한 프로브는 적어도 약 8개의 염기쌍, 적어도 약 9개의 염기쌍, 적어도 약 10개의 염기쌍, 적어도 약 11개의 염기쌍 또는 적어도 약 12개의 염기쌍 및 최대 약 20개의 염기쌍 길이, 최대 약 25개의 염기쌍 길이, 최대 약 30개의 염기쌍 길이, 최대 약 40개의 염기쌍 길이 또는 최대 약 50개의 염기쌍 길이를 포함하고, 상기 프로브 및 작은 핵산 표적은 본원에 기술된 바와 같이 또 다른 것을 혼성화한 후에 결찰된다.

7. 혼성화/보호 검정

한 측면에서, 혼성화/보호 검정은 올리고뉴클레오티드 대사산물을 함유할 수 있는 샘플 내에 있는 표적 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 치료용 올리고뉴클레오티드의 검출, 확인 및/또는 정량화에 사용된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 대사산물을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 혼성화/보호 검정은 올리고뉴클레오티드 대사산물 대비 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 양을 측정하는 데 사용된다. 한 측면에서, 혼성화/보호 검정은 치료용 올리고뉴클레오티드의 약동학 매개변수를 결정하는 데 사용된다. 한 측면에서, 측정된 약동학 매개변수는 클리어런스, 부피 분포, 혈장 농도, 반감기, 피크 시간, 피크 농도, 이용률 또는 이들의 조합이다. 약동학 매개변수의 측정 및 해석이 본원에 기술되어 있다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 치료용 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)이다. 치료용 올리고뉴클레오티드, ASO, 및 이들의 대사 및 약리학이 본원에 기술되어 있다.

예시적인 실시양태가 도 18에 도시되어 있다. 도 18에서, 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플은 (ⅰ) 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 표적 뉴클레오티드 서열 보체 서열; (ⅱ) 올리고뉴클레오티드 태그 및 (ⅲ) 표지를 포함하는 표적 뉴클레오티드 서열 보체 프로브와 접촉된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열 보체 프로브의 올리고뉴클레오티드 태그는 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적이다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열의 올리고뉴클레오티드 태그는 이중 가닥이고, 올리고뉴클레오티드 태그의 한 가닥은 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적이다. 올리고뉴클레오티드 태그 및 포획 올리고뉴클레오티드는 본원에서 추가로 기술된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열 보체 프로브의 표지는 검출 시약에 결합할 수 있다. 한 측면에서, 표지는 비오틴을 포함하고 검출 시약은 스트렙트아비딘에 연결된다. 또 다른 측면에서, 표지는 합텐을 포함하고, 검출 시약은 항체와 같은 합텐 결합 파트너에 연결된다. 표지, 검출 시약, 및 표지와 검출 시약 사이의 결합 방식은 본원에서 추가로 기술된다.

한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 표적 뉴클레오티드 서열 보체 프로브에 혼성화한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열 및 표적 뉴클레오티드 서열 보체 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열 및 표적 뉴클레오티드 서열 보체 서열의 전체 길이에 걸쳐 혼성화한다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 이중 가닥이고, 표적 뉴클레오티드 서열 및 표적 뉴클레오티드 서열 보체 서열이 혼성화하여 이중 가닥 혼성화 복합체를 형성한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 대사산물을 추가로 포함한다. 표적 뉴클레오티드 서열의 대사산물, 예를 들어, ASO와 같은 치료용 올리고뉴클레오티드가 본원에 기술되어 있다. 한 측면에서, 상기 방법은 올리고뉴클레오티드 대사산물을 제거하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열과 표적 뉴클레오티드 서열 보체가 혼성화되는 동안 단일 가닥 특이적 뉴클레아제가 샘플에 첨가된다. 한 측면에서, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제는 혼성화된 표적 뉴클레오티드 서열-표적 뉴클레오티드 서열 보체에 실질적으로 반응하지 않으면서 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 대사산물을 특이적으로 제거한다. 한 측면에서, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제는 과량의 혼성화되지 않은 표적 뉴클레오티드 서열 보체 프로브를 추가로 제거한다. 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 포함하는 적합한 뉴클레아제의 예가 본원에서 제공된다.

한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물 및/또는 혼성화되지 않은 표적 뉴클레오티드 서열 보체 프로브의 제거 후, 혼성화된 표적 뉴클레오티드 서열-표적 뉴클레오티드 서열 보체 프로브는 표면 상의 포획 올리고뉴클레오티드에 대한 표적 뉴클레오티드 서열 보체 프로브 상의 올리고뉴클레오티드 태그의 결합을 통해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물 및/또는 혼성화되지 않은 표적 뉴클레오티드 서열 보체 프로브는 혼성화된 표적 뉴클레오티드 서열-표적 뉴클레오티드 서열 보체 프로브의 고정 전에 제거되어 동시 제거/고정, 또는 고정 후 제거 형식에 비해 향상된 감도를 제공한다. 한 측면에서, 검출 시약이 표면에 첨가되고, 검출 시약은 표적 뉴클레오티드 서열 보체 프로브 상의 표지에 결합한다. 한 측면에서, 검출 시약은 전기화학발광 시약이다. 한 측면에서, 검출 시약은 MSD SULFO-TAG를 포함한다. 한 측면에서, 전기화학발광은 표적 뉴클레오티드 서열을 검출, 확인 및/또는 정량화하기 위해 본원에 기술된 바와 같이 측정된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열의 약동학 매개변수를 결정하기 위해 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 양을 측정한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 치료용 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 대사산물은 치료용 올리고뉴클레오티드 대사산물이다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 RNA를 포함한다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 miRNA, 치료 RNA, mRNA, RNA 바이러스 또는 이들의 조합을 포함한다.

8. 신호 증폭

한 측면에서, 표지된 반응 생성물로부터의 신호는, 예를 들어, 적은 수의 결합 이벤트의 검출, 예를 들어, 개별 검출 복합체의 검출을 개선하기 위해 증폭된다. 한 측면에서, 표지된 반응 생성물로부터의 검출 가능한 신호는 다중 표지 또는 검출 표지화 부위를 포함하는 앰플리콘을 생성함으로써 증폭되고, 이로써 반응 생성물에 대한 검출 가능한 신호가 증폭된다. 한 측면에서, 표지된 반응 생성물로부터의 검출 가능한 신호는 다중 표지 또는 검출 표지화 부위를 포함하는 연장된 프로브를 반응 생성물에 부착함으로써 증폭되고, 이로써 반응 생성물에 대한 검출 가능한 신호가 증폭된다. 한 측면에서, 반응 생성물은 검출 복합체를 형성하기 위해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 표지된 검출 복합체로부터의 검출 가능한 신호는 검출 복합체에 다중 표지 또는 검출 표지 부위를 포함하는 연장된 프로브를 부착함으로써 증폭되고, 이로써 검출 가능한 신호가 증폭된다. 한 측면에서, 고정 시약은 검출 복합체를 안정화시키기 위해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 표지된 반응 생성물로부터의 검출 가능한 신호는 반응 생성물에 다중 표지 또는 검출 표지화 부위를 함유하는 연장된 프로브를 부착함으로써 증폭되고 고정 시약은 검출 복합체를 안정화시키기 위해 지지체 표면에 고정되는데, 예를 들어, "IMPROVED ASSAY METHODS"라는 제목으로 2014년 3월 12일에 출원된 국제 출원번호 WO 2014/165061 및 "IMPROVED METHODS FOR CONDUCTING MULTIPLEXED ASSAYS"라는 제목으로 2020년 2월 28일에 출원된 국제 출원번호 PCT/US2020/020288에 기술된 바와 같고 이의 개시내용 전문이 본원에 참조로 포함된다.

한 측면에서, 검출 복합체는 본원에 기술된 바와 같이 생성된 반응 생성물을 지지체 표면에 고정함으로써 형성된다. 한 측면에서, 반응 생성물은 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드와 반응 생성물에 부착된 올리고뉴클레오티드 태그의 상보적 뉴클레오티드 서열 사이의 혼성화에 의해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 검출 복합체는 고정 시약을 통해 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 고정 시약은 고정 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드는 검출 복합체에 부착된 고정 서열 보체의 올리고뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

한 측면에서, 표지된 검출 복합체로부터의 신호는 증폭된다. 한 측면에서, 표지된 검출 복합체로부터의 신호는 다중 표지 또는 검출 표지화 부위를 함유하는 하나 이상의 앰플리콘을 생성함으로써 증폭된다. 한 측면에서, 표지된 검출 복합체로부터의 신호는 다중 표지 또는 검출 표지화 부위를 함유하는 연장된 뉴클레오티드 서열을 검출 복합체에 부착함으로써 증폭된다. 한 측면에서, 다중 표지 또는 검출 표지화 부위를 포함하는 연장된 뉴클레오티드 서열이 검출 복합체에 부착되고 검출 복합체는 고정 시약을 통해 지지체 표면에 고정된다.

한 측면에서, 샘플에서 분석물은 본원에 기술된 바와 같은 반응 생성물을 형성하고, 반응 생성물을 포획 분자에 고정시켜 검출 복합체를 형성함으로써 검출된다. 한 측면에서, 포획 분자는 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 반응 생성물은 포획 올리고뉴클레오티드의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다. 한 측면에서, 반응 생성물은 검출 서열을 포함한다. 한 측면에서, 검출 서열은 하나 이상 또는 다수의 검출 가능한 표지 또는 검출 표지화 부위를 포함하는 연장된 서열 또는 앰플리콘을 형성하도록 연장된다.

한 측면에서, 검출 서열은 PCR(중합효소 연쇄 반응), LCR(리가아제 연쇄 반응), SDA(염기서열 치환 증폭), 3SR(자립 합성 반응) 또는 등온 증폭 방법, 예를 들어, 헬리카제 의존적 증폭 또는 회전 환 증폭(RCA)과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 증폭 기술에 대한 프라이머로서 사용된다. 한 측면에서, 검출 서열은 증폭 주형과 접촉되고 검출 서열은, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 증폭 주형의 증폭을 위한 프라이머로서 사용된다. 한 측면에서, 검출 서열은 증폭 주형과 접촉되고, 검출 서열은, 예를 들어, 회전 환 증폭(RCA)에 의한 증폭 주형의 증폭을 위한 프라이머로서 기능한다.

한 측면에서, 증폭 주형은 선형 증폭 주형이다. 한 측면에서, 증폭 주형은 원형 증폭 주형이다. 한 측면에서, 검출 서열을 연장하는 것은 검출 서열을 원형 증폭 주형과 접촉시키는 것과 회전 환 증폭(RCA)에 의해 검출 서열을 연장하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 검출 서열을 연장하는 것은 검출 서열을 선형 증폭 주형과 접촉시키는 것, 예를 들어, 선형 주형의 5' 및 3' 엔드를 결찰시켜 원형을 형성함으로써 원형 증폭 주형을 형성하는 것, 및 RCA의 원형 주형을 연장하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 앰플리콘은 다중 검출 표지화 부위를 포함한다. 한 측면에서, 연장된 서열은 다수의 검출 표지화 부위를 포함한다. 한 측면에서, 연장된 서열은 연장 후 표면 상에 국소화된 채로 남아 있다.

RCA 기술은 당업계에 공지되어 있고(예를 들어, Baner 등, Nucleic Acids Research, 26:5073 5078, 1998; Lizardi 등, Nature Genetics 19:226, 1998; Schweitzer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10113 119, 2000; Faruqi 등, BMC Genomics 2:4, 2000; Nallur 등, Nucl. Acids Res. 29:e118, 2001; Dean 등, Genome Res. 11:1095 1099, 2001; Schweitzer 등, Nature Biotech. 20:359 365, 2002; 미국 특허 제6,054,274호, 제6,291,187호, 제6,323,009호, 제6,344,329호 및 제6,368,801호 침조) 선형 RCA(LRCA) 및 지수 RCA(ERCA)와 같은 변형을 포함한다. RCA는 원본 표적 DNA(이 경우 검출 서열)에 부착된 유전자복제 사슬과 함께 수천 개의 원형 주형 유전자복제를 생성하여 신속한 신호 증폭을 가능케 한다.

한 측면에서, 증폭 주형은 선형 주형이며, 이의 5' 및 3' 엔드는 결찰되어 원형 주형을 생성할 수 있다. 한 측면에서, 검출 서열은 증폭 주형의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 검출 올리고뉴클레오티드는 증폭 반응을 위한 프라이머로서 기능한다. 한 측면에서, 검출 올리고뉴클레오티드는 RCA에 대한 프라이머로서 기능한다. 한 측면에서, RCA는 검출 올리고뉴클레오티드를 연장하여 연장된 서열 또는 앰플리콘을 형성한다.

한 측면에서, 증폭 주형은 5' 말단 뉴클레오티드 서열 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열을 갖는 선형 증폭 주형이다. 한 측면에서, 증폭 주형의 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 검출 서열에 혼성화할 수 있다. 한 측면에서, 증폭 주형은 고정 시약의 고정 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 내부 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 증폭 주형의 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 내부 서열과 중복되지 않는다. 한 측면에서, 증폭 주형은 고정 시약의 고정 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제1 내부 뉴클레오티드 서열 및 검출 시약의 핵산 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제2 내부 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 증폭 주형의 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 제1 또는 제2 내부 서열과 중복되지 않는다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5' 말단 포스페이트 그룹을 갖는다.

한 측면에서, 증폭 주형은 약 40 내지 약 100개의 뉴클레오티드 길이인 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 증폭 주형은 약 50 내지 약 78개의 뉴클레오티드 길이인 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 증폭 주형은 약 53 내지 약 76개의 뉴클레오티드 길이인 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 증폭 주형은 약 50 내지 약 70개의 뉴클레오티드 길이인 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 증폭 주형은 약 53 내지 약 61개의 뉴클레오티드 길이인 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 증폭 주형은 약 54 내지 약 61개의 뉴클레오티드 길이인 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 증폭 주형은 약 61개의 뉴클레오티드 길이인 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 증폭 주형은 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54 또는 약 55개 및 최대 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68개, 약 69개, 약 70개, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75 또는 약 76개의 뉴클레오티드 길이인 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, 증폭 주형은 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75 또는 약 76개의 뉴클레오티드 길이인 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드이다.

한 측면에서, 증폭 주형의 5' 및 3' 말단 서열의 길이의 합은 약 14 내지 약 24개의 뉴클레오티드 길이이다. 한 측면에서, 증폭 주형의 3' 및 5' 말단 서열의 길이의 합은 약 14 내지 약 19개의 뉴클레오티드 길이이다. 한 측면에서, 증폭 주형의 3' 및 5' 말단 서열의 길이의 합은 약 14, 약 15, 약 16 또는 약 17개 및 최대 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23 또는 약 24개의 뉴클레오티드 길이이다. 한 측면에서, 증폭 주형의 3' 및 5' 말단 서열의 길이의 합은 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23 또는 약 24개의 뉴클레오티드 길이이다. 한 측면에서, 증폭 주형의 3' 및 5' 말단 서열의 길이의 합은 약 14 또는 약 15개의 뉴클레오티드 길이이다.

한 측면에서, 증폭 주형은 5'-GTTCTGTC-3'(서열번호 1666)의 5' 말단 서열 및 5'-GTGTCTA-3'(서열번호 1667)의 3' 말단 서열을 갖는다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(서열번호 1668)을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(서열번호 1668)로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(서열번호 1669)를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(서열번호1669)로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'(서열번호 1670)을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'(서열번호 1670)로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA-3'(서열번호 1671)을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA-3'(서열번호 1671)로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

한 측면에서, 지지체 표면은 포획 분자 및 고정 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 하나 이상의 단계에서 반응 생성물이 포획 분자 및 검출 시약에 결합된다. 한 측면에서, 반응 생성물은 포획 분자 및 검출 시약에 동시에 또는 실질적으로 동시에 결합된다. 한 측면에서, 반응 생성물은 포획 분자 및 검출 시약에 순차적으로(어떤 순서로든) 결합된다. 한 측면에서, 포획 분자, 반응 생성물 및 검출 시약을 포함하는 지지체 표면 상에 검출 복합체가 형성된다. 한 측면에서, 검출 시약은 본원에서 검출 올리고뉴클레오티드로 지칭되는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 검출 올리고뉴클레오티드는 고정 시약의 고정 서열에 상보적이고 그와 혼성화할 수 있는 고정 서열 보체를 포함하는 연장된 서열(또는 앰플리콘)을 형성하도록 연장된다. 한 측면에서, 고정 서열은 고정 서열 보체에 혼성화되고 지지체 표면에 결합된 연장된 서열이 검출된다.

한 측면에서, 연장된 서열(또는 앰플리콘)은 표지된 검출 시약의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상 또는 복수의 검출 표지화 부위를 포함한다. 한 측면에서, 표지된 검출 시약은 검출 표지화 부위의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열 및 검출 가능한 표지를 포함한다. 한 측면에서, 검출 가능한 표지는 전기화학발광 표지를 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상 또는 복수의 표지된 검출 시약은 앰플리콘에 혼성화하고 검출 복합체를 검출하는 데 사용된다. 한 측면에서, 연장 과정은 앰플리콘에 상보적인 하나 이상의 표지된 프로브의 부가 없이 표면에서 앰플리콘을 직접 검출하는 데 사용되는 표지된 뉴클레오티드 염기를 앰플리콘에 통합한다.

한 측면에서, 검출 서열은 약 10 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이인 핵산 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 서열은 약 12 내지 약 28개의 뉴클레오티드 길이인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 서열은 약 13 내지 약 26개의 뉴클레오티드 길이인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 서열은 약 14 내지 약 24개의 뉴클레오티드 길이인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 서열은 약 11 내지 약 22개의 뉴클레오티드 길이인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 서열은 약 12 내지 약 21개의 뉴클레오티드 길이인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 서열은 약 13 내지 약 20개의 뉴클레오티드 길이인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 서열은 약 13 내지 약 18개의 뉴클레오티드 길이인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 서열은 약 14 내지 약 19개의 뉴클레오티드 길이인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 서열은 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14 또는 약 15개 및 최대 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29 또는 약 30개의 뉴클레오티드 길이인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 서열은 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29 또는 약 30개의 뉴클레오티드 길이인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 서열은 약 14개의 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 서열은 약 15개의 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

한 측면에서, 검출 프로브의 검출 올리고뉴클레오티드는 증폭 주형의 5' 말단 서열에 상보적인 제1 서열 및 증폭 주형의 3' 말단 서열에 상보적인 인접한 제2 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 시약의 핵산 서열은 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(서열번호 1672)와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 시약의 핵산 서열은 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(서열번호 1672)의 적어도 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18 또는 약 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 시약의 핵산 서열은 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(서열번호 1672)의 적어도 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18 또는 약 19개의 연속 뉴클레오티드에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 시약의 핵산 서열은 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(서열번호 1672)의 14 또는 15개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 시약의 핵산 서열은 서열 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(서열번호 1672)를 포함한다. 한 측면에서, 검출 시약의 핵산 서열은 서열 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(서열번호 1672)로 이루어진다. 한 측면에서, 검출 시약의 핵산 서열은 서열 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(서열번호 1668)을 포함한다. 한 측면에서, 검출 시약의 핵산 서열은 서열 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(서열번호 1668)로 이루어진다.

한 측면에서, 예를 들어, 도 22 및 23에 도시된 바와 같이 고정 시약 및 신호 증폭 과정이 모두 사용된다. 예를 들어, 표적 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)를 포함하는 표적 분석물을 포함하는 샘플은 표적 보체가 표적 올리고뉴클레오티드에 혼성화하여 반응 생성물을 형성하는 조건 하에서 표적 보체, 올리고뉴클레오티드 태그 및 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 검출 프로브와 접촉된다. 한 측면에서, 표적 보체는 RNA를 포함하고, 올리고뉴클레오티드 태그 및 검출 올리고뉴클레오티드는 DNA 서열을 포함한다. 한 측면에서, 표적 보체는 RNA이고, 올리고뉴클레오티드 태그 및 검출 올리고뉴클레오티드는 DNA이다.

한 측면에서, 샘플은 고정 서열 및 올리고뉴클레오티드 태그를 포함하는 고정 시약과도 접촉된다. 한 측면에서, 고정 서열 및 올리고뉴클레오티드 태그는 모두 DNA 서열을 포함한다.

한 측면에서, 지지체 표면은 반응 생성물의 올리고뉴클레오티드 태그, 결합되지 않은 프로브 및 고정 시약이 혼성화하여 지지체 표면에 고정된 올리고뉴클레오티드를 포획하는 조건 하에서 반응 생성물, 결합되지 않은 프로브 및 결합되지 않은 고정 시약을 포함하는 혼합물과 접촉된다. 본원에 사용된 "결합되지 않은 프로브"는 표적 올리고뉴클레오티드에 혼성화되지 않은 검출 프로브를 지칭한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 고정된 "결합되지 않은 프로브"에서 단일 가닥 RNA를 분해하기 위해 RNase와 접촉된다.

한 측면에서, 검출 혼합물이 지지체 표면에 부가된다. 한 측면에서, 검출 혼합물은 회전 환 증폭을 위한 선형 주형 및 리가아제를 포함한다. 한 측면에서, 검출 혼합물은, 예를 들어, 결찰 버퍼, 아데노신 트리포스페이트(ATP), 소 혈청 알부민(BSA), Tween 20, T4 DNA 리가아제 및 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 추가 성분도 포함한다. 한 측면에서, 검출 혼합물은, 예를 들어, BSA, 버퍼, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP), Tween 20, Phi29 DNA 중합효소 또는 이들의 조합을 포함하는, 회전 환 증폭을 위한 하나 이상의 성분을 포함한다. 한 측면에서, 검출 혼합물은 아세틸-BSA를 포함한다.

한 측면에서, 선형 DNA 주형은 원형화되고 원형 DNA 주형은 회전 환 증폭에 의해 증폭되어 검출 올리고뉴클레오티드를 연장하고 하나 이상의 검출 표지화 부위 및 고정 올리고뉴클레오티드 서열 보체를 포함하는 앰플리콘을 생성한다. 한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드 서열 보체는 지지체 표면에 고정된 고정 올리고뉴클레오티드 서열에 혼성화된다. 한 측면에서, 하나 이상 또는 다수의 표지된 검출 시약은 신호를 증폭하기 위해 앰플리콘의 검출 표지화 부위에 혼성화한다.

한 측면에서, 샘플에서 표적 분석물은 연장된 서열에 결합된 검출 가능한 표지를 검출함으로써 검출된다. 한 측면에서, 연장된 서열은 지지체 표면으로부터 용리액으로 방출되고 용리액 내의 연장된 서열이 검출된다.

한 측면에서, 샘플에서 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위한 방법이 제공되며, 상기 표적 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) 표적 보체가 표적 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산 서열에 혼성화하여 반응 생성물을 형성하는 조건 하에서 올리고뉴클레오티드 태그, 표적 보체 및 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 검출 프로브와 샘플을 접촉시키는 단계;

(b) 반응 생성물의 올리고뉴클레오티드 태그가 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화하여 고정된 검출 복합체를 형성하는 조건 하에서 반응 생성물을 함유하는 혼합물과 포획 올리고뉴클레오티드가 고정된 지지체 표면을 접촉시키는 단계;

(c) 증폭 주형을 포함하는 검출 혼합물과 고정된 검출 복합체를 접촉시키는 단계;

(d) 검출 표지화 부위를 포함하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 앰플리콘을 형성하기 위해 증폭 주형을 증폭시키는 단계;

(f) 검출 표지화 부위에 결합된 표지를 검출하는 단계.

한 측면에서, 샘플은 (a)에서 고정 시약 및 검출 프로브와 접촉되며, 상기 고정 시약은 올리고뉴클레오티드 태그 및 고정 서열을 포함한다.

한 측면에서, 검출 프로브는 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 태그, 단일 가닥 RNA 표적 보체 및 단일 가닥 DNA 검출 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 고정 시약은 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 태그 및 단일 가닥 DNA 고정 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 방법은 고정된 검출 복합체를 RNase와 접촉시켜 결합되지 않은 프로브의 단일 가닥 RNA를 분해하는 단계를 (c) 전에 포함한다.

(a) 샘플을

상기 검출 프로브의 표적 보체는 표적 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산 서열에 혼성화하여 올리고뉴클레오티드 태그, 표적 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산 서열을 포함하는 이중 가닥 RNA 듀플렉스 및 표적 보체를 포함하는 반응 생성물을 형성하는 단계;

(d) 회전 환 증폭(RCA) 주형 및 중합효소를 포함하는 검출 혼합물과 고정된 검출 복합체를 접촉시키는 단계;

(e) RCA에 의해 주형을 증폭하여 검출 복합체에 부착된 연장된 서열을 형성하는 단계로서, 상기 연장된 서열은 검출 표지화 부위를 포함하는 다중 핵산 서열을 포함하는 단계;

(f) 검출 시약의 핵산 서열이 검출 표지화 부위에 혼성화하는 조건 하에서 전기화학발광(ECL) 표지 및 연장된 서열의 검출 표지화 부위에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 검출 시약과 연장된 서열을 접촉시키는 단계; 및

한 측면에서, 샘플에서 표적 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 방법이 제공된다. 한 측면에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) 샘플을

상기 표적화 프로브의 제1 핵산 서열 및 상기 검출 프로브의 제2 핵산 서열은 표적 올리고뉴클레오티드의 인접한 핵산 서열에 상보적인 단계;

(b) 표적화 프로브 및 검출 프로브가 표적 올리고뉴클레오티드 및 핵산 리가아제의 상응하는 뉴클레오티드 서열에 결합하고 핵산 리가아제가 표적화 및 검출 프로브를 결찰시켜 올리고뉴클레오티드 태그 및 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 반응 생성물을 형성하는 조건 하에서 핵산 리가아제의 존재하에 표적 올리고뉴클레오티드, 표적화 프로브 및 검출 프로브를 포함하는 혼합물을 인큐베이션하는 단계;

(b) 반응 생성물의 올리고뉴클레오티드 태그가 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화하여 고정된 검출 복합체를 형성하는 조건 하에서 반응 생성물을 포함하는 혼합물과 포획 올리고뉴클레오티드가 고정된 지지체 표면을 접촉시키는 단계;

(d) 증폭 주형을 증폭하여 검출 표지화 부위를 포함하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 앰플리콘을 형성하는 단계;

(e) 검출 시약의 핵산 서열이 검출 표지화 부위에 혼성화하는 조건 하에서 표지 및 검출 표지화 부위에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 검출 시약과 앰플리콘을 접촉시키는 단계; 및

(f) 지지체 표면에 결합된 표지를 검출하는 단계.

한 측면에서, 상기 방법은 (b)에서 형성된 반응 생성물을 변성 조건에 노출시켜 표적 올리고뉴클레오티드로부터 반응 생성물을 분리시키는 것을 포함한다.

L. 샘플

본원에 기술된 방법 또는 키트는 하나 이상의 표적 분석물을 함유하거나 함유하는 것으로 추정되는 샘플에서 하나 이상의 표적 분석물을 검출하는 데 적합하다. 한 측면에서, 표적 분석물은 표적 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 표적 분석물은 표적 단백질을 포함한다. 한 측면에서, 샘플은 하나 이상의 관심 원핵 또는 진핵 DNA 또는 RNA 서열을 포함하거나 포함하는 것으로 추정된다. 한 측면에서, 샘플은 인간, 또는 비인간 영장류, 개, 고양이, 소, 양, 가금류, 말을 포함하지만 이에 제한되지 않은 다른 포유동물과 같은 유기체; 또는 식물, 박테리아, 진균, 원생생물 또는 바이러스와 같은 기타 유기체로부터 수득된 생물학적 샘플이다. 한 측면에서, 생물학적 샘플은 조직, 세포, 세포 추출물 또는 생검과 같은 고체 물질; 또는 소변, 혈액, 타액, 양수, 감염 또는 염증 부위의 삼출물, 구강 세포(buccal cell)를 함유하는 구강 세척물, 뇌척수액 또는 윤활액(synovial fluid)과 같은 생물학적 유체를 포함한다. 한 측면에서, 샘플은 개체로부터 단리된다. 또 다른 측면에서, 샘플은 개체 그룹에서 유래된다. 한 측면에서, 샘플은 하나 이상 또는 다수의 개별 샘플 또는 풀링된 샘플을 포함한다.

한 측면에서, 샘플은 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, cDNA, 전체 게놈 증폭 DNA 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 단일 또는 이중 가닥 DNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 표적 DNA 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 샘플은 리보솜 RNA, mRNA, miRNA, siRNA, RNAi 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 단일 또는 이중 가닥 RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 표적 RNA 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 샘플은 PCR 생성물, 플라스미드(plasmid), 코스미드(cosmid), DNA 라이브러리, 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome, YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC), 합성 올리고뉴클레오티드, 제한 단편, DNA/RNA 혼성물, PNA(펩티드 핵산) 또는 DNA/RNA 모자이크 핵산과 같은 앰플리콘인 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 포함하는 것으로 추정된다. 이중 가닥 핵산의 경우 표적 뉴클레오티드 서열은 어느 가닥에나 존재할 수 있다. 한 측면에서, 샘플은 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 포함하지 않는다.

한 측면에서, 샘플은 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 치료용 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 샘플은 올리고뉴클레오티드 대사산물도 함유할 수 있다. 본원에서 사용되는 "치료용 올리고뉴클레오티드"는 생체분자와 상호작용하여 치료 효과를 제공할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)이다. ASO는 일반적으로 약 5, 10, 15, 20 또는 25개의 뉴클레오티드 길이 내지 약 30, 35, 40, 45 또는 50개의 뉴클레오티드 길이인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. ASO는 RNA 처리에 영향을 미치고/거나 단백질 발현을 조절할 수 있다. ASO는 단일 가닥 RNA에 결합하여 RNA를 비활성화시키는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 한 측면에서, ASO는 유전자에 대한 메신저 RNA(mRNA)에 결합하고, 이로써 유전자를 불활성화시킨다. 한 측면에서, 유전자는 질환 유전자이다. 따라서, ASO는 질병 유전자의 mRNA를 불활성화시켜 특정 질환 유발 단백질의 생산을 예방하거나 개선할 수 있다. 한 측면에서, ASO는 DNA, RNA 또는 이들의 조합을 포함한다.

올리고뉴클레오티드, 예를 들어, ASO와 같은 치료용 올리고뉴클레오티드는 샘플에서 뉴클레아제의 존재, 온도, pH, 염 농도 등과 같은 다양한 요인으로 인해 시간이 지남에 따라 붕해, 예를 들어, 단축될 수 있다. 특정 측면에서, 샘플에서 치료용 올리고뉴클레오티드의 붕해는 치료용 올리고뉴클레오티드에 대한 약력학적 반응을 나타낸다. 본원에서 치료용 올리고뉴클레오티드 대사산물이라고도 지칭되는 붕해된 또는 단축된 치료용 올리고뉴클레오티드는 치료 효과를 잃을 수 있다. 한 측면에서, 샘플은 치료용 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 치료용 올리고뉴클레오티드 대사산물을 포함한다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드 대사산물은 치료용 올리고뉴클레오티드보다 1개 이상의 뉴클레오티드, 2개 이상의 뉴클레오티드, 3개 이상의 뉴클레오티드, 4개 이상의 뉴클레오티드, 5개 이상의 뉴클레오티드, 6개 이상의 뉴클레오티드, 7개 이상의 뉴클레오티드, 8개 이상의 뉴클레오티드, 9개 이상의 뉴클레오티드, 10개 이상의 뉴클레오티드, 15개 이상의 뉴클레오티드 또는 20개 이상의 뉴클레오티드가 더 짧다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드 대사산물은 치료용 올리고뉴클레오티드보다 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10% 더 짧다.

한 측면에서, 본원에 제공된 방법은 치료용 올리고뉴클레오티드 대사산물 대비 샘플에서 치료용 올리고뉴클레오티드의 양을 측정하는 데 사용된다. 한 측면에서, 치료용 올리고뉴클레오티드의 약동학 매개변수는 생물학적 환경, 예를 들어, 환자에서 치료용 올리고뉴클레오티드의 붕해 속도 및/또는 양을 측정함으로써 결정된다. 따라서, 한 측면에서, 본원에 제공된 방법은 치료용 올리고뉴클레오티드의 약동학 매개변수를 결정하는 데 사용된다. 한 측면에서, 측정된 약동학 매개변수는 클리어런스, 부피 분포, 혈장 농도, 반감기, 피크 시간, 피크 농도, 이용률 또는 이들의 조합이다. 약동학 매개변수의 측정 및 해석은 본원에서 추가로 기술된다.

한 측면에서, 샘플은 하나 이상의 항-약물 항체(ADA)를 포함한다. 한 측면에서, ADA는 치료용 단백질 또는 치료용 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 치료용 폴리펩티드에 결합한다. 한 측면에서, ADA는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 짧은 간섭 RNA, 미세RNA 및 CRISPR/Cas용 합성 가이드 가닥을 포함하지만 이에 제한되지 않는 치료용 올리고뉴클레오티드에 결합한다. 한 측면에서, ADA는 바이오의약품에 결합할 수 있다. 한 측면에서, ADA는 치료제의 기능적 활성을 억제할 수 있다.

한 측면에서, 샘플은 하나 이상의 증폭되지 않은 표적 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 샘플은 생물학적 샘플로부터의 서열의 증폭 또는 클로닝에 의해 수득된 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 전체 게놈 증폭(WGA), 역전사 후 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 염기서열 치환 증폭(SDA) 또는 회전 환 증폭(RCA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 방법에 의해 달성될 수 있다.

한 측면에서, 샘플은 하나 이상의 표적 단백질을 포함하거나 포함하는 것으로 추정된다. 한 측면에서, 표적 단백질은, 예를 들어, 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA에 결합할 수 있는 DNA 결합 도메인을 갖는 단백질을 포함하는 DNA 결합 단백질을 포함한다. DNA 결합 단백질의 예는 전사 인자, 중합효소, 뉴클레아제 및 히스톤을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 측면에서, DNA 결합 단백질은 특정 DNA 서열, 예를 들어, 전사 인자에 결합한다.

한 측면에서, 하나 이상의 표적 분석물이 생물학적 샘플로부터 정제된다. 샘플로부터 표적 분석물을 정제하는 방법은 공지되어 있다. 생물학적 샘플로부터 뉴클레오티드 서열을 정제하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 예를 들어, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 또는 음이온 교환 고압 액체 크로마토그래피(AEX HPLC) 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)를 포함한다. 생물학적 샘플로부터 단백질을 정제하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 전기영동과 같은 크로마토그래피를 포함한다.

한 측면에서, 샘플은 하나 이상의 표적 분석물, 예를 들어, 세포주로부터 정제된 게놈 DNA 또는 전체 게놈 증폭 DNA를 적어도 약 1μg, 2μg, 3μg, 4μg, 5μg, 6μg, 7μg, 8μg, 9μg 또는 10μg 및 최대 약 20μg, 25μg, 30μg, 35μg, 40μg, 45μg 또는 50μg, 또는 약 1μg 내지 약 50μg 또는 약 5μg 내지 약 20μg 포함한다. 한 측면에서, 샘플은 하나 이상의 표적 분석물을 포함하는 샘플, 예를 들어, 하나 이상의 증폭 생성물을 포함하는 샘플, 예를 들어, 세포주 DNA로부터 생성된 PCR 앰플리콘을 적어도 약 0.1μL, 0.5μL, 1μL, 2μL, 3μL, 4μL, 5μL 및 최대 약 6μL, 7μL, 8μL, 9μL, 10μL, 15μL, 20μL 또는 25μL, 또는 약 1μL 내지 약 25μL 또는 약 0.1μL 내지 약 5μL 포함한다. 한 측면에서, 샘플은 분석물 농도가 적어도 약 1ng/μL, 5ng/μL 또는 10ng/μL 및 최대 약 25ng/μL, 50ng/μL 또는 100ng/μL이다.

한 측면에서, 샘플은 표적 분석물의 적어도 하나의 복제물을 포함한다. 한 측면에서, 샘플은 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³, 10² 또는 10¹개 미만의 복제수의 표적 핵산을 포함한다. 한 측면에서, 이러한 복제물은 샘플의 약 0.001mL 내지 약 1mL 또는 샘플의 약 1mL, 0.1mL, 0.01mL 또는 0.001mL로 존재한다.

M. 샘플 증폭

본원에 기술된 방법 또는 키트는 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열이 증폭되지 않은 샘플과 관련하여 사용될 수 있지만, 샘플에서 표적 뉴클레오티드의 양을 증가시키기 위해 증폭 단계를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 표적 뉴클레오티드 서열이 하나 이상의 희귀 돌연변이, 예를 들어, 암과 관련된 하나 이상의 희귀하거나 낮은 대립유전자 분획 돌연변이를 포함할 때 표적 뉴클레오티드 서열을 증폭하는 것이 바람직할 수 있다.

한 측면에서, 고정된 검출 복합체는 증폭 시약과 접촉되며, 검출 복합체 및 증폭 시약은 각각 결합 쌍의 구성원을 포함한다. 일부 측면에서, 결합 쌍은 수용체-리간드 쌍, 항원-항체 쌍, 합텐-항체 쌍, 에피토프-항체 쌍, 미모토프-항체 쌍, 압타머-표적 분자 쌍 또는 인터칼레이터-표적 분자 쌍을 포함한다. 일부 측면에서, 결합 쌍은 비오틴/스트렙트아비딘 또는 비오틴/아비딘이다.

한 측면에서, 증폭 시약은 검출 서열을 포함한다. 한 측면에서, 검출 서열은 증폭 주형의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 검출 서열은 고정 서열 및 올리고뉴클레오티드 태그를 포함하는 고정 시약에 상보적인 핵산 서열을 포함한다.

한 측면에서, 검출 서열은 하나 이상의 검출 가능한 표지 또는 검출 표지화 부위를 포함하는 연장된 서열 또는 앰플리콘을 형성하도록 연장된다. 한 측면에서, 표지는 검출 가능한 표지를 부착하기에 적합한 결합 파트너를 포함한다. 한 측면에서, 표지는 비오틴을 포함하고 스트렙트아비딘을 포함하는 검출 가능한 표지에 결합할 수 있다.

한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭된다. PCR 증폭 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, Saiki 등, Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase, Science, 239:487-491 참조. 간단히 말하면, PCR 증폭에서 표적 뉴클레오티드 서열은 증폭될 특정 뉴클레오티드 서열 옆에 있는 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉된다. 반복된 열 변성 사이클, 상보적 서열에 대한 프라이머의 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 어닐링된 프라이머의 연장은 약 2ⁿ의 표적 단편의 기하급수적 축적을 초래하고, 여기서 n은 사이클 수이다.

또 다른 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 중합효소가 단일 뉴클레오티드를 원형 주형에 어닐링된 프라이머에 연속적으로 부가하는 등온 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 증폭 기술인 회전 환 증폭(RCA)을 사용하여 증폭되어 원형 주형에 상보적인 복수의, 예를 들어, 수십에서 수백 개의 탠덤 반복부를 함유하는 긴 단일 가닥 DNA 또는 RNA 서열을 초래한다.

또 다른 측면에서, 전체 게놈 증폭(WGA)은 게놈 DNA 샘플을 증폭하는 데 사용된다. 전체 게놈 증폭 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어, 다중 이동 증폭(Multiple Displacement Amplification, MDA), 축퇴 올리고뉴클레오티드(Degenerate Oligonucleotide PCR, DOP-PCR) 및 프라이머 연장 사전증폭(Primer Extension Preamplification, PEP)을 포함한다. DOP-PCR 및 PEP는 표준 PCR 기술을 기반으로 하지만 MDA는 등온 반응 설정을 사용한다.

일부 측면에서, 증폭은 DNA 또는 RNA 합성을 개시하기 위해 중합효소에 의해 사용되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용을 포함한다. 프라이머는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 펩티드 핵산(PNA), 로킹된 핵산(LNA), 포스포로티오에이트-연결 함유 DNA 또는 이들의 조합일 수 있고 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일반적으로, 프라이머는 약 10 내지 약 100개, 또는 약 15 내지 약 30개, 또는 적어도 약 10, 15 또는 20개 및 최대 약 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 뉴클레오티드 길이인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 일부 측면에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 증폭되는 주형의 영역이 프라이머에 의해 한정되도록 표적 뉴클레오티드 서열의 특정 영역에 상보적인 특정 프라이머이다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조하기 위한 방법은 공지되어 있다. 한 측면에서, 시판되는 증폭 프라이머가 사용될 수 있다. 한 측면에서, 프라이머는 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순수하다.

한 측면에서, 샘플은 PCR 생성물을 포함한다. 한 측면에서, PCR 생성물은 약 25bp 내지 약 500bp, 또는 약 50bp 내지 약 300bp 또는 약 75bp 내지 약 200bp의 길이이다. 한 측면에서, PCR 프라이머는 용융 온도가 멀티플렉싱 PCR 검정에 사용되는 다른 프라이머와 유사하다(즉, 약 5℃ 또는 1℃ 이내).

N. 검출

한 측면에서, 표적 분석물은 어레이에서 검출, 확인 또는 정량화된다. 한 측면에서, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 PCR 반응 생성물, OLA 반응 생성물, PEA 반응 생성물, 샌드위치 복합체 또는 NPA 반응 생성물을 포함하는 반응 생성물은 어레이에서 검출, 확인 또는 정량화될 수 있다. 한 측면에서, 어레이는 멀티플렉스 어레이이고, 표적 분석물은 어레이 상의 고정된 표적 분자에 부착된 표지의 검출에 의해 검출, 확인 또는 정량화된다. 한 측면에서, 지지체 표면은 태그된 반응 생성물을 함유하는 혼성화 혼합물과 접촉하고 반응 생성물은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그와 이의 상응하는 상보적 포획 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 의해 지지체 표면에 고정되어 검출 복합체를 형성한다. 한 측면에서, 반응 생성물은 고체 지지체가 반응 생성물과 접촉되기 전에 증폭된다. 한 측면에서, 반응 생성물은 적어도 약 10x, 20x, 30x, 40x 또는 50x 증폭된다.

한 측면에서, 혼성화 혼합물은 혼성화 버퍼를 포함한다. 한 측면에서, 반응 생성물의 존재 또는 양은 반응 생성물에 부착된 표지에 기초하여 검출, 확인 또는 정량화될 수 있다. 한 측면에서, 지지체 표면은 반응 생성물이 그 위에 고정된 후 세척 버퍼로 세척된다.

한 측면에서, 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열의 존재는 지지체 표면에 고정된 반응 생성물의 검출에 기초하여 검출, 확인 또는 정량화된다. 한 측면에서, 고정된 반응 생성물의 존재는 형광, 시간-분해 형광, 형광 공명 에너지 전달(FRET), 형광 편광(FP), 발광, 화학발광, 생물발광, 인광, 광 산란 또는 전극 유도 발광을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 반응 생성물 상의 표지로부터의 발광을 모니터링함으로써 검출된다. 또 다른 측면에서, 표지는 광 산란, 흡광도, 형광 등과 같은 측정 가능한 신호를 유발하는 화학적 활성이 있는 효소 또는 기타 화학적 반응 종을 포함한다. 효소 표지의 예는 호스래디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase) 또는 알칼리성 포스파타제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 측면에서, 표지는 비오틴, 플루오레세인 또는 디곡시제닌을 포함하지만 이에 제한되지 않는 검출 가능한 합텐이다. 한 측면에서, 반응 생성물은 비오틴 표지를 포함한다.

한 측면에서, 반응 생성물은 지지체 표면에 위치한 하나 이상의 결합 도메인 상에 고정된다. 한 측면에서, 하나 이상의 결합 도메인은 하나 이상의 전극 상에 위치하고 검출, 확인 또는 정량화는 하나 이상의 전극에 전압 파형을 인가하여 포획된 반응 생성물 상의 표지를 자극하여 전기화학적 또는 발광 신호를 생성하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 검출, 확인 또는 정량화는 전기화학발광 신호를 측정하고 신호를 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 존재 또는 양과 상관시키는 것을 포함한다. 한 측면에서, 방출된 빛의 강도는 방출된 빛이 샘플 내 표적 뉴클레오티드의 양에 대한 정량적 측정을 제공할 수 있도록 샘플 내 표적의 양에 비례한다.

한 측면에서, 지지체 표면은 반응 생성물이 그 위에 고정된 후에 검출 혼합물과 접촉된다. 한 측면에서, 검출 혼합물은 전기화학발광 표지를 포함한다. 전기화학발광 표지의 예는 다음을 포함한다: ⅰ) 금속이, 예를 들어, 트리스-비피리딜-루테늄(RuBpy) 모이어티와 같은 Ru 함유 및 Os 함유 유기금속 화합물을 포함하는 Ⅷ족의 귀금속으로부터 유래된 유기금속 화합물 및 ⅱ) 루미놀 및 관련 화합물. 한 측면에서, 검출 혼합물은 하나 이상의 전기화학발광 공반응물, 및 pH 완충제, 세제, 방부제, 소포제, 염, 금속 이온 또는 금속 킬레이트제와 같은 하나 이상의 추가 성분도 포함한다. 용어 "전기화학발광 공반응물"은 전기화학발광 표지에 참여하는 종을 지칭하며 트리프로필아민(TPA), 옥살레이트 이온, 아스코르브산 및 RuBpy용 과황산염 및 루미놀용 과산화수소와 같은 3차 아민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전기화학발광을 측정하기 위한 방법은 공지되어 있으며 측정용 기기는 시판된다. 예를 들어, 전기화학발광을 사용하는 분석물의 멀티플렉싱 측정은 Meso Scale Diagnostics, LLC, MULTI-ARRAY® 및 SECTOR® Imager 라인 또는 제품에서 사용된다(예를 들어, 개시내용 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제7,842,246호 및 제6,977,722호 참조).

한 측면에서, 비오틴은 반응 생성물에 공유적으로 부착되고 검출 혼합물은 아비딘 모이어티를 통해 고정된 반응 생성물에 결합하는 스트렙트아비딘 접합된 표지를 포함한다. 한 측면에서, 스트렙트아비딘 접합된 표지는 전기화학발광(ECL) 표지이다. 한 측면에서, 전기화학발광 표지는 Sulfo-TAG NHS-Ester(Meso Scale Diagnostics)와 같은 n-하이드록시석신이미드 에스테르이다.

한 측면에서, 상기 키트 또는 방법은 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 검출, 확인 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 관심 SNP의 존재는 샘플에서 야생형 대립유전자와 변이체 대립유전자 사이의 비율을 측정함으로써 검출된다. 한 측면에서, 상기 비율은 샘플에 존재하는 야생형 및 변이체 대립유전자에 대한 검출 가능한 표지의 비율을 측정함으로써 결정된다. 한 측면에서, 야생형 및 변이체 대립유전자에 대한 전기화학발광 표지의 비율이 결정된다. 샘플에 존재하는 야생형 또는 변이체 대립유전자의 비율을 측정하기 위해 다음 공식을 사용할 수 있다:

ECL 비율 WT = (신호WT-) / (신호WT-Bkg + 신호MUT-Bkg)

ECL 비율 MUT = (신호MUT-Bkg) / (신호WT-Bkg + 신호MUT-Bkg)

여기서 신호WT는 야생형 대립유전자에 대해 검출된 ECL 신호이고, 신호MUT는 변이체 대립유전자에 대해 검출된 신호이고 Bkg는 배경 신호이다. 한 측면에서, 배경 신호는 결합 도메인 사이에서 변할 수 있기 때문에 배경 신호는 야생형 또는 변이체 대립유전자에 해당하는 결합 도메인에 대해 특이적이다. 한 측면에서, 배경 값은 "리가아제 없는 대조군" 샘플에 대한 2개의 웰에서 복제 스폿에 대한 평균 값이다.

상기 비율은 샘플에 존재하는 야생형 및 변이체 서열의 백분율을 추산한다. 한 측면에서, 샘플에 대한 가능성은 동형접합 야생형, 이형접합 또는 동형접합 변이체이다. 한 측면에서, 동형접합 야생형 또는 변이체에 대한 비율은 약 0.8보다 커야 하고, 이형접합의 경우는 약 0.3 내지 약 0.7이어야 하며, 변이체(또는 야생형)의 부재는 약 0.2 미만이어야 한다. 동형접합 대립유전자의 비율은 신호 가변성으로 인해 1.0보다 클 수 있다. 유사하게, 대립유전자가 없으면 배경 차감으로 인해 비율이 0보다 작을 수 있다.

한 측면에서, 상기 키트 또는 방법은 암 돌연변이의 하나 이상의 희귀하거나 낮은 대립 유전자 분획을 검출하는 데 사용된다. 한 측면에서, 샘플에 존재하는 희귀하거나 낮은 대립 유전자 분획 돌연변이의 빈도는 다음 공식을 사용하여 ECL 신호로부터 검량선을 생성하여 결정된다:

ECL 비율 MUT = (신호MUT) / (신호WT + 신호MUT).

모든 신호가 검량선과 비교되고 배경이 맞도록 고려되므로 검량선을 만들 때 배경 차감이 필요하지 않다. 검량선은 주어진 대립유전자에 대해 검출 가능한 가장 낮은 변이체 대립유전자 백분율을 설정하고 샘플 데이터를 상기 곡선에 다시 맞추면 각 샘플에 존재하는 변이체 백분율을 결정할 수 있다.

한 측면에서, 검정은 검출 한계(LOD)가 웰당 약 1×10⁵ 내지 10×10⁵개, 또는 약 10×10⁵, 9×10⁵, 8×10⁵, 7×10⁵, 6×10⁵, 5×10⁵, 4×10⁵, 3×10⁵, 2×10⁵ 또는 1×10⁵개 미만의 분자이다. 한 측면에서, OLA 기반 검정에 대한 LOD는 웰당 약 1×10⁵ 내지 5×10⁵개 또는 약 2×10⁵개의 분자이다. 한 측면에서, PEA 기반 검정에 대한 LOD는 웰당 약 4×10⁵ 내지 약 6×10⁵개 또는 약 5×10⁵개의 분자이다.

O. 사용 방법

샘플에서 하나 이상의 표적 분석물을 확인, 검출 또는 정량화하기 위한 방법 및 키트가 본원에 기술되어 있다. 한 측면에서, 표적 분석물은 뉴클레오티드 서열이다. 또 다른 측면에서, 표적 분석물은 단백질이다. 한 측면에서, 표적 분석물은 야생형 뉴클레오티드 또는 펩티드 서열을 함유하거나 함유하는 것으로 추정된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 결실, 부가, 치환, 전이, 전위, 재배열 또는 전좌와 같은 돌연변이를 함유하거나 함유하는 것으로 추정된다. 한 측면에서, 돌연변이는 미스센스(missense), 넌센스(nonsense), 사일런트(silent) 또는 스플라이스 부위(splice-site) 돌연변이를 포함한다.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 샘플에서 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 검출, 확인 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 샘플에서 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), 복제물 변이체(CNV) 또는 다른 서열 변이체 또는 돌연변이를 검출, 확인 또는 정량화하는 데 사용된다.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는, 예를 들어, 다중 게놈 또는 종, 다중 개체, 또는 조직 또는 세포의 혼합물에서 유래되는 종양 샘플과 같은 생물학적 샘플로부터의 핵산 혼합물을 함유하는 샘플에서 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열을 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 샘플에 존재할 수 있는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 검출하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 적어도 약 50% 또는 최대 약 100%의 빈도로 존재하는 단일 뉴클레오티드 변이체를 검출하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 변이체는 존재하지 않는다. 또 다른 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 샘플에 존재하는 뉴클레오티드 서열의 약 1% 초과로 존재하는 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 샘플에 존재하는 뉴클레오티드 서열의 약 5% 또는 10% 미만으로 존재하는 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 야생형 핵산 서열뿐만 아니라 표적 영역에 돌연변이가 있는 뉴클레오티드 서열의 이종 혼합물을 함유하는 생물학적 샘플에서 핵산 돌연변이를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용될 수 있으며, 상기 돌연변이는 표적 뉴클레오티드 서열의 약 1% 내지 약 5%로 존재할 수 있다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 생물학적 샘플 또는 조직 생검에서 암성 또는 전암성 조직의 존재를 나타내는 표적 뉴클레오티드에서 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 전립선암, 유방암, 결장암, 췌장암 또는 자궁경부암과 같은 암을 나타내는 단일 뉴클레오티드 암 관련 돌연변이를 분석하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 샘플에서 뉴클레오티드 서열의 약 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04% 또는 0.05% 미만으로 존재하는 돌연변이를 검출하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 혈액 샘플, 세포외액, 세포외 소포 또는 액체 생검에 존재하는 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열을 검출하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 정상 세포의 배경에서 순환하는 종양 세포에서의 돌연변이 또는 혈액에서 종양 유래 세포 유리 DNA(tumor-derived cell-free DNA)의 검출을 포함하지만 이에 제한되지 않는 종양학에서 하나 이상의 관심 돌연변이를 검출하는데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 약물 개발에 중요한 하나 이상의 돌연변이를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 샘플에서 RNA를 검출, 확인 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는, 예를 들어, 미세RNA(miRNA), 소핵소체 RNA(small nucleolar RNA, snoRNA) 및 구형 핵산(SNA)을 포함하는 샘플에서 비코딩 RNA를 검출, 확인 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 유전자형분석 검정에 사용된다. 유전자형분석 방법은 공지되어 있고 일반적으로, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용한 프로브 혼성화, 프로브 결찰 및 신호 증폭 단계, 증폭 생성물을 지지체 표면에 고정하는 단계 및 표적 분석물의 검출 단계를 포함한다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 인간 유전자형분석 검정을 위해 사용된다. 또 다른 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 식물 유전형분석 검정, 예를 들어, 농업유전체 검정(agrigenomic assay)을 위해 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는, 예를 들어, 유전자 발현 분석 또는 전사체(transcriptome) 분석에서 전사 활성(코딩 및 비코딩)을 특성화하는 데 사용된다.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 미세RNA(miRNA) 발현의 다중 분석에 사용될 수 있다. miRNA는 작은 비코딩 RNA(약 20-22개의 뉴클레오티드 길이)로, 예를 들어, 세포 분화 및 증식, 발달 시기, 조혈, 면역 반응, 아폽토시스 및 신경계 패턴화를 포함한 기본적인 세포 과정을 조절한다. 인간 게놈은 미세RNA(miRNA)를 암호화하는 약 2000개의 유전자를 포함한다. (Kawahara (2014) Human diseases caused by germline and somatic abnormalities in microRNA and mciro-RNA related genes. Congenital Anomalies. 54:12-21). miRNA 수준, 발현 시기, 위치 또는 표적 인식의 변경은 파괴적인 결과를 초래할 수 있으며 miRNA의 발현 프로파일링은 다양한 생물학적 과정에 관한 귀중한 정보를 제공할 수 있다. 1차, 전구체 및 성숙 miRNA 수준의 분석과 miRNA 표적의 확인 및 특성화는 miRNA 생합성 단계나 특정 돌연변이 또는 질병의 기능을 결정하는 데 중요할 수 있다. (Van Wynsberghe 등 (2011) Analysis of microRNA Expression and Function. Methods Cell Biol. 106:219-252 참조). miRNA의 서열 길이 가변성(isomiR)은 변경된 표적화 능력 또는 특이성을 초래할 수 있다. (Cammaerts 등, (2015) Genetic variants in microRNA genes: impact on microRNA expression, function, and disease. Front. Genet. 6:186).

발달 이상 및 암을 포함한 다양한 인간 질환은 miRNA 유전자 또는 miRNA 처리 기전을 암호화하는 miRNA 관련 유전자 또는 표적 mRNA의 3'UTR에 있는 miRNA 결합 부위 내에서 생식계열 또는 체세포 돌연변이로 인해 발생한다. miRNA 및 miRNA 관련 유전자는 DGCR8(디조지증후군(DiGeorge syndrome), DICER1(흉막폐모세포종(pleuropulmonary blastoma), 낭포성 신장종(cystic nephroma), 난소 세르톨리라이디히형 종양(ovarian Sertoli-Leydig-type tumor), 송과체모세포종(pineoblastoma), 비상피성 난소 종양(nonepithelial ovarian tumor)), TARBP2(대장 종양, 위 종양), XPO5(결장 종양, 위 종양, 자궁내막 종양), mR-14 및 miR-146(5q-증후군), mi-R-17, miR-18a, miR-19a, miR-19b, miR-20a 및 miR-92a(페인골드 증후군(Feingold syndrome) 2), miR15a 및 miR-16-1(만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 전립선 종양), miR-16-1(만성 림프구성 백혈병), miR-96(중증 난청(severe deafness)), miR-84(EDICT 증후군), SLITRK1(투렛 증후군(Tourette's syndrome)), IRGM(크론병(Crohn's disease)) 및 HDAC6(X-연관 우성 연골이형성증(X-linked dominant chondrodysplasia))을 포함하지만 이에 제한되지 않는 인간 질환과 관련된다. (Kawahara, Y. (2014) Human diseases caused by germline and somatic abnormalities in microRNA and mciro-RNA related genes. Congenital Anomalies. 54:12-21.)

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 샘플에서 하나 이상의 표적 miRNA 서열을 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 단일 염기 뉴클레오티드 차이가 있는 미세RNA를 확인, 검출 또는 수량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법은 고정된 포획 올리고뉴클레오티드 서열에 상보적인 태그 서열 및 miRNA 서열에 상보적인 서열을 포함하는 하나 이상의 표지된 프로브의 사용을 포함한다. 한 측면에서, 상기 표지는 비오틴 표지를 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 표지는 화학발광 표지를 포함한다. 한 측면에서, 상기 방법은 태그 서열과 포획 올리고뉴클레오티드 서열의 결합에 적합한 조건 하에서 하나 이상의 고정된 포획 올리고뉴클레오티드가 있는 지지체 표면을 고정된 포획 올리고뉴클레오티드 서열에 상보적인 태그 서열 및 표적 miRNA 서열에 상보적인 서열을 포함하는 하나 이상의 프로브와 접촉시키는 것을 포함한다. 이어서 상기 지지체 표면을 세척하여 과량의 프로브를 제거한 다음 miRNA 서열이 고정된 프로브 서열에 혼성화할 수 있는 조건 하에서 하나 이상의 표적 miRNA 서열을 포함하거나 포함하는 것으로 추정되는 샘플과 접촉시킨다.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 암, 알츠하이머병, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell anemia), 뒤시엔느 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 지중해 빈혈(thalassemia) 또는 헌팅턴병(Huntington's disease)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 장애 또는 질환과 관련된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 변이체를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 시토크롬 p450과 같은 다형성 유전자의 하나 이상의 다형성을 검출하는 데 사용될 수 있다.

간렌즈핵변성증(hepatolenticular degeneration)(APP7B), 비만(MC4R), 제2형 당뇨병(IRS1), 낭포성 섬유증(CTFR), 레트 증후군(Rett syndrome)(MECP2), 알츠하이머병(APP), 크로이츠펠트-야콥 증후군(Creutzfeldt-Jakob syndrome)(PRNP), 가족성 지중해열(Familial Mediterranean fever)(MEFV), 위장관 기질 종양(gastrointestinal stromal tumor)(KIT), 크롬친화성세포종(pheochromocytoma)(RET), 뒤시엔느 근이영양증(DMD), 요붕증, 신경원성(diabetes insipidus, neurogenic)(AVP), 약체 X 증후군(fragile X syndrome)(FMR1), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제 결핍증(ornithine carbamoyltransferase deficiency disease)(OTC), 브루가다증후군(Brugada syndrome)(SCN5A), 마판증후군(Marfan syndrome)(FBN1), 진성다혈구증(polycythemia vera)(JAK2), 다낭성 신장, 상염색체 열성(polycystic kidney, autosomal recessive)(PKHD1), 악성 고열증(malignant hyperthermia)(RYR1) 및 카나반병(Canavan disease)(ASPA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 질환이 유전적 변이와 관련된 것으로 공지되어 있다. Pinero 등 (2015) DisGeNET: a discovery platform for the dynamical exploration of human diseases and their genes. 데이터베이스: doi: 10.1093/database/bav028.

한 측면에서, 예를 들어, 크로이츠펠트-야콥병(PRNP), 뎅기 쇼크 증후군(Dengue shock Syndrome)(MICB), B형 간염(HLA-DPA1 및 HLA-DPB1); C형 간염(IL28B); HIV-1 및 AIDS(HLA-C, HLA-B, HCP5, MICA, PSORS1C3, ZNRD1, RNF39, PARD3B 및 CXCR6); 한센병(leprosy)(LACC1, NOD2, RIPK2, CCDC122 및 TNFSF15); 수막구균성 질환(meningococcal disease)(CFH), 말라리아(HBB); 및 결핵(GATA6, TAGE1, RBBP8 및 CABLES1)을 포함하는 전염병 표현형과 관련된 하나 이상의 SNP를 검출, 확인 또는 정량화하기 위한 방법 또는 키트가 제공된다. Fareed 및 Afzal (2012) Single nucleotide polymorphism in genome-wide association of human population: A tool for broad spectrum science. Egypt. J. Med. Human Genet. 14:123-134.

한 측면에서, 예를 들어, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 당뇨병, 위장관 질환, 지질 대사 장애 및 신경정신 질환을 포함하는 질환과 관련된 하나 이상의 SNP를 검출, 확인 또는 정량화하기 위한 방법 또는 키트가 제공된다. 자가면역 질환과 관련된 SNP는 공지되어 있고, 예를 들어, 류마티스성 관절염(SPRED2, ANKRD55, IL6ST, PXK, RBPJ, CCR6, IRF5, TRAF1-C5, NTAFIP3 근처의 염색체 6q23.3, 및 OLIG3) 및 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus)(BANK1)와 관련된 SNP를 포함한다. 심혈관 질환과 관련된 SNP는 공지되어 있고, 예를 들어, 심방 세동/심방 조동(atrial fibrillation/atrial flutter)(PITX2 근처의 염색체 4q25); 관상동맥 질환(CDKN2A/B 및 MTHFD1L), 관상동맥 심장질환(DAB2IP); 및 심근 질환(CDKN2A/B)과 관련된 SNP를 포함한다. 당뇨병과 관련된 SNP는 공지되어 있고, 예를 들어, 제1형 당뇨병(FUT2, C12orf30, ERBB3, KIAA0350, PTPN2, CD226, TRAFD1 및 PTPN11); 및 제2형 당뇨병(KCNQ1, SLC30A8, FTO, HHEX, CDKAL1, CDKN2B, IGFBP2, CDKN2A/B 및 IGF2BP2)과 관련된 SNP를 포함한다. 위장 장애와 관련된 SNP는 공지되어 있고, 예를 들어, 셀리악병(KIA1109, TENR, IL2 및 IL21); 크론병(PTPN2, IRGM, NKX2-3, ATG16L1, BSN, MST1 및 IRGM); 담석(ABCG8 및 SH2B3/LNK); 및 염증성 장 질환(IL23R)과 관련된 SNP를 포함한다. 지질 대사 장애와 관련된 SNP는, 예를 들어, HDL-콜레스테롤(GALNT2 및 MVK/MMAB); LDLl-콜레스테롤(CELSR2, PSRC1, SORT1, CILP2 및 PBX4); 트리글리세리드(BCL7B, TBL2, MLXIPL, CILP2, PBX4, TRIB1, GALNT2, ANGPTL3, DOCK7, ATG4C, GCKR, TRIB1, NCAN/CILP2 및 MLXIPL)와 관련된 SNP를 포함한다. 신경정신 질환과 관련된 SNP는 공지되어 있고, 예를 들어, 근위축성 축삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis)(DPP6); 후기 발병 알츠하이머병(GAB2)이 있는 APOE e4(GAB2); 양극성 장애(DGKH, PALB2, NDUFAB1 및 DCTN5); 다발성 경화증(KIAA 0350, IL2RA 및 IL7RA); 하지 불안 증후군(restless leg syndrome)(BTBD9, MEIS1, BTBD9, MAP2K5 및 LBXCOR1); 및 조현병(CSF2RA)과 관련된 SNP를 포함한다. Fareed 및 Afzal (2012) Single nucleotide polymorphism in genome-wide association of human population: A tool for broad spectrum science. Egypt. J. Med. Human Genet. 14:123-134.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 암과 관련된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 변이체를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 핵산 서열은 야생형 서열이다. 한 측면에서, 핵산 서열은 돌연변이체 또는 변이체 서열이다. 한 측면에서, 뉴클레오티드 서열의 돌연변이는 암과 관련된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 BRAF 또는 KRAS와 같은 하나 이상의 종양유전자 또는 원종양유전자, 또는 BRCA1, BRCA2, PTEN, CTFR 및 TP53과 같은 하나 이상의 종양 억제 유전자, 및 이들의 조합에 대한 야생형, 돌연변이체 또는 변이체 핵산 서열의 존재 또는 부재를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. (예를 들어, Concert Genetics (2017) The Current Landscape of Genetic Testing 참조).

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 의학적으로 관련된 암에 대한 DNA 또는 RNA 기반 마커를 검출하는 데 사용된다. 또 다른 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 효과적인 암 요법의 선택을 돕기 위해 약(medicine)을 개인화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 유전성 암에 걸릴 위험이 있는 사람을 확인하는 데 사용된다. 유전성 암은, 예를 들어, 리-프라우메니증후군(Li-Fraumeni syndrome)(p53), 가족성 샘종 폴립증(familial adenomatous polyposis)(APC), 유방암(BRCA1; BRCA2; PALB2; TP53; CHEK2; ATM; NBS/NBN; BLM; PTEN; MRE11; BRIP1; BARD1; RAD50; RAD51C; RAD51D; RECQL; FANCC; 및 FANCM), 및 유전성 비용종성 대장암(hereditary non-polyposis colorectal cancer, HNPCC) 증후군(MLH1; MSH2; MSH3; MSH6; PMS2; EPCAM; APC; MUTYH; NTHL1; POLE; POLD1; SMAD4; BMPR1A; 및 STK11)을 포함하여 특정 유전자의 생식계열 돌연변이를 확인함으로써 진단할 수 있는 암에 사람이 걸릴 위험을 상당히 높이는 유전적 결함 그룹을 지칭한다. Sokolenko 및 Imyanitov (2018) Molecular Diagnostics in Clinical Oncology. Front. Molec. Bio. 5(76):1-15.

암에 대한 추가적인 SNP 마커는 공지되어 있으며, 예를 들어, 유방암(FFGFR2, TNCR9/LOC643714, MAP3K1, LSP1 및 ERBB4); 기저세포암(basal cell carcinoma)(RHOU, PADI4, PADI6, RCC2, ARHGEF10L, KRT5, CDKN2A/B, TCF2, IGF2, IGF2A, INS 및 TH); 결장직장암(ORF, DQ515897 및 SMAD7); 폐암(CHRNA3, CHRNA5, CHRNB4, PSMA4, LOCI23688 및 TRNAA-UGC); 흑색종(CDC91L1), 신경모세포종(neuroblastoma)(FLJ22536, FLJ44180 및 BARD1); 및 갑상선암(FOXE1 및 NKX2-1)에 대한 마커를 포함한다. Fareed 및 Afzal (2012) Single nucleotide polymorphism in genome-wide association of human population: A tool for broad spectrum science. Egypt. J. Med. Human Genet. 14:123-134.

한 측면에서, 예를 들어, 자폐증(autism), 지적 장애 및 뇌전증과 같은 신경 발달 장애, 선천성 심장 결함 및 기타 선천적 기형을 포함하는 인간 질환과 관련된 하나 이상의 복제물 변이체(CNV) 또는 이수성(aneuploidy)을 검출, 확인 또는 정량화하기 위한 방법 또는 키트가 제공된다. 한 측면에서, CNV는 결실을 포함한다. 또 다른 측면에서, CNV는 중복을 포함한다. 결실 CNV와 관련된 장애의 예는 머리 크기, 정신 장애 및 대사(KCTD13 및 PRRT2), 수면 조절 및 대사(RAI1), 안면 외양(ELN), 심장 이상, 영아 고칼슘혈증(infantile hypercalcemia), 성장 또는 발달 지연(LIMK-1), 이형 특징(dysmorphic feature), 발달 지연, 심장 결함(GATA4), 지적 장애, 뇌전증, 발작, 얼굴 및 손가락의 이형(CHRNA7), 지적 장애, 뚜렷한 안면 특징, 뇌전증, 심장 결함, 비뇨생식 기형(KANSL1) 및 이형 안면 특징, 구개심장안면증후군(velocardio-facial syndrome), 선천성 심장병, 학습 장애, 청력 상실(TBX1)에 영향을 미치는 장애를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 복제 CNV와 관련된 장애의 예는 머리 크기, 정신 장애 및 대사(KCTD13 및 PRRT2), 수면 조절 및 대사(RAI1), 안면 외양(ELN), 이형 특징, 발달 지연, 심장 결함(GATA4), 언어 및 언어 능력 지연, 자폐증, 뇌전증(LIMK-1), 지적 장애, 자폐증, 재발성 귀 감염, 처진 귀(low set ears), 비만(CHRNA7), 발달 지연, 소두증(microcephaly), 안면 이형, 비정상 손가락 및 다모증(hirsutism), 성장 장애(failure to thrive)(KANSL1) 및 이형 안면 특징, 구개인두부전(velopharyngeal insufficiency), 선천성 심장병, 지적 장애, 언어 능력 지연, 청력 상실 및 성장 장애(TBX1)에 영향을 미치는 장애를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. Golzio 및 Katsanis (2013) Genetic Architecture of Reciprocal CNVs. Curr. Opin. Genet. Dev. 23(3):240-248. CNV와 관련하여 자주 관찰되는 장애는 윌리엄스(Willaims)(ELN, 결실 표현형), 프레더-윌리(Prader-Willi) 또는 안젤만(Angelman)(UBE3A, 결실 표현형), 스미스-마제니스(Smith-Magenis)(RAI1, 결실 표현형), 포토키-룹스키(Potocki-Lupski)(RAI1, 중복 표현형), 쿨렌-데 브리에스(Koolen-de Vries)(MAPT, KANSL1, 결실 표현형), 디조지/구개심장안면(DiGeorge/Velo-cario-facial)(TBX1, HIRA, 결실 표현형), 및 신낭포(renal cyst) 및 당뇨병(HNFIB, 결실 표현형)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. Martin 등 (2015) CNVs, Aneuploidies and Human Disease. Clinics and Perinatology. 42(2):227-242, Aouiche 등 (2018) Copy number variation related disease genes. Quant. Biol. 6(2):99-112도 참조.

한 측면에서, 본원에 기술된 방법 또는 키트는 상응하는 치료제의 사용과 관련된 정보를 제공하기 위한 동반 진단 장치로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법 또는 키트는 유방암 또는 난소암에 대한 Lynparza®(올라파립(olaparib)), Talzenna®(탈라조파립(talazoparib)) 또는 Rubraca®(루카파립(rucaparib))와 같은 치료제와 관련된 환자 관리를 위한 BRCA1 또는 BRCA2; 비소세포폐암에 대한 Iressa®(제피티닙(gefitinib)), Gilotrif®(아파티닙(afatinib)) 또는 Vizimpro®(다코미티닙(dacomitinib)), Tarceva®(에롤티닙(eroltinib)) 또는 Tagrisso®(오시머티닙(osimertinib))와 같은 치료제와 관련된 환자 관리를 위한 EGFR; 비소세포폐암에 대한 Keytruda®(펨브로리주맙(pembrolizimab)) 또는 Tecentriq®(아테졸리주맙(atezolizumab))과 같은 치료제와 관련된 환자 관리를 위한 PD-L1; 급성 골수성 백혈병에 대한 Tibsovo®(이보시데닙(ivosidenib))와 같은 치료제와 관련된 환자 관리를 위한 IDH1; 만성 골수성 백혈병에 대한 Tasigna®(닐로티닙(nilotinib))와 같은 치료제와 관련된 환자 관리를 위한 BCR-ABL; 비소세포폐암에 대한 Zykadia®(세리티닙(ceritinib)), Xalkori®(크리조티닙(crizotinib)) 및 Alecensa®(알렉티닙(alectinib))와 같은 치료제와 관련된 환자 관리를 위한 ALK; 급성 골수성 백혈병에 대한 Idhifa®(에나시데닙(enasidenib))와 같은 치료제와 관련된 환자 관리를 위한 IDH2; 결장직장암에 대한 Vectibix®(파니투무맙(panitumumab))와 같은 치료제와 관련된 환자 관리를 위한 RAS; 급성 골수성 백혈병에 대한 Rydapt®(미도스타우린(midostaurin)) 및 Xospata®(길테리닙(gilterinib))와 같은 치료제와 관련된 환자 관리를 위한 FLT3; 공격적인 전신 비만세포증(aggressive systemic mastocytosis)에 대한 Gleevec®(이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate))과 같은 치료제와 관련된 환자 관리를 위한 KIT(D816V); 골수이형성 증후군/골수증식성 질환에 대한 Gleevec®(이마티닙 메실레이트)과 같은 치료제와 관련된 환자 관리를 위한 PDGFRB; 결장직장암에 대한 Erbitux®(세툭시맙) 또는 Vectibix®(파니투무맙)와 같은 치료제와 관련된 환자 관리를 위한 KRAS 또는 EGFR; 위장관 간질 종양에 대한 Gleevec®(이마티닙 메실레이트) 또는 Glivec®(이마티닙 메실레이트)과 같은 치료제와 관련된 환자 관리를 위한 c-KIT; 유방암에 대한 Herceptin®(트라스투주맙(trastuzumab)), Perjeta®(퍼투주맙(pertuzumab)) 또는 Kadcyla®(아도-트라스투주맙(ado-trastuzumab))와 같은 치료제와 관련된 환자 관리를 위한 HER-2; 위암 및 위식도암에 대한 Herceptin®(트라스투주맙)과 같은 치료제와 관련된 환자 관리를 위한 HER-2; 흑색종에 대한 Braftovi®(엔코라페닙(encorafenib)), Mektovi®(비니메티닙(binimetinib)), Mekinist®(트라마테닙(tramatenib)), Tafinilar®(다브라페닙(dabrafenib)), Zelboraf®(베무라페닙(vemurafenib)) 또는 Cotellic®(코비메티닙(cobimetinib))과 같은 치료제와 관련된 환자 관리를 위한 BRAF; 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 유전자를 검출, 확인 또는 정량화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, fda.gov에서 이용 가능한 FDA List of Cleared or Approved Companion Diagnostic Devices (In Vitro and Imaging Tools) 참조.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는, 예를 들어, 임상 진단, 식품 안전 테스트, 환경 모니터링 또는 생물방어(biodefense)를 위해 임상 또는 환경 샘플에서 병원성 유기체를 검출하기 위해 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 변이체를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 바이러스, 박테리아, 기생충 및 진균 병원체를 포함하는 하나 이상의 병원체를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 하나 이상의 항생제 또는 항바이러스 내성 병원성 유기체를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 하나 이상의 병원성 게놈의 존재를 검출하도록 구성된 하나 이상의 프로브 세트를 포함한다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 병원체 검출, 유전자형분석, 바이러스 검출, 독성 마커(virulence marker) 검출, 항생제 내성 검출 또는 발병 조사를 위한 고처리량 스크리닝에 사용된다. 예를 들어, Fourier 등 (2014) Clinical Detection and Characterization of bacterial pathogens in the genomics era. Genome Medicine. 6:114 참조. 한 측면에서, 바이러스 병원체의 검출 및 유전형분석을 위한 방법 또는 키트가 제공된다. 예를 들어, Wang 등 (2002) Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. PNAS. 99(24):15687-15692 참조.

바이러스 게놈 서열은 공지되어 있으며, 예를 들어, 공개적으로 이용 가능한 모든 바이러스 게놈 서열을 분류하고 ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses에서 액세스할 수 있는 NCBI Viral Genomes Resource를 사용하여 찾을 수 있다. 유사하게, 미생물 게놈 서열은 공지되어 있고, 예를 들어, 공개적으로 이용 가능한 모든 미생물 게놈 서열을 분류하고 ncbi.nlm.nih.gov/genome/microbes에서 액세스할 수 있는 NCBI Microbial Genome Resource를 사용하여 찾을 수 있다.

또 다른 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 하나 이상의 바이러스, 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1, H3 및 H5를 포함하는 인플루엔자 A 및 B 바이러스; 파라인플루엔자 바이러스 유형 1, 2, 3 및 4; 호흡기 세포융합 바이러스 유형 A 및 B; 아데노바이러스; 메타뉴모바이러스(metapneumovirus, MPV); 리노바이러스; 엔테로바이러스; 및 OC43 및 229E와 같은 코로나바이러스(CoV) 또는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스, NL63 및 HKU1; 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1; 및 인간 보카바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 호흡기 바이러스를 검출, 확인 또는 정량화하는 데 사용될 수 있다. 한 측면에서, 바이러스 캡시드(capsid)(CA) 단백질을 검출하기 위한 방법 또는 키트가 제공된다.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 분류학적 과(family) 또는 하위과(subfamily)에 고유하지만 그 과 내의 종에 의해 공유되는 게놈 영역과 일치하는 하나 이상의 "디스커버리(discovery)" 프로브를 포함한다. "디스커버리" 프로브는 과 내에서 더 천천히 진화하는 서열을 표적으로 하며 알려진 과 내에서 종을 탐지하는 데 유용하다. 또 다른 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 개별 종 또는 균주에 고유한 고도의 가변 영역을 표적으로 하는 하나 이상의 "센서스(census)" 프로브를 포함한다. "센서스" 프로브는 샘플에서 유기체의 특정 균주를 확인하는 데 유용하다. McLoughlin, K.S. (2011) Microarrays for Pathogen Detection and Analysis. Brief. Funct. Genomics. 10(6):342-353.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 병원성 박테리아와 관련된 핵산 서열을 검출, 확인 또는 정량화하는 데 사용된다. 다양한 호기성 및 혐기성 박테리아를 확인하는 데 사용되는 일반적인 유전자 표적은 16S rRNA 또는 rDNA이다. 박테리아 RNA 중합효소의 β-서브유닛을 암호화하는 rpoB 유전자는 박테리아 확인, 예를 들어, 빠르게 성장하는 마이코박테리아 확인에도 사용할 수 있다. 다른 박테리아 유전자 표적은 tuf(연장 인자 Tu), gyrA 또는 gyrB(자이라제(gyrase) A 또는 B), soda(망간 의존성 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(manganese-dependent superoxide dismutase)) 및 열 충격 단백질을 포함한다. Petti, C.A. (2007) Detection and Identification of Microorganisms by Gene Amplification and Sequencing. Clin. Infect. Dis. 44:1108-1114.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 대변 표본에서 하나 이상의 병원성 유기체를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 인간 대변 표본에서 하나 이상의 바이러스, 기생충 또는 박테리아 핵산 서열을 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 캄필로박터(Campylobacter), 클로스트리디움 디피실 독소(Clostridium dificile toxin) A/B, 대장균(Escherichia coli) O157, 엔테로톡신 대장균(enterotoxin E. coli, ETEC) LT/ST, 시가 유사 독소 생성 대장균(shiga-like toxin producing E. coli, STEC) stx1/stx2, 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 및 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 박테리아 또는 박테리아 독소를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 아데노바이러스(adenovirus), 노로바이러스(norovirus) 및 로타바이러스(rotavirus)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 바이러스를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 크립토스포리디움(Cryptosporidium), 엔타메바 히솔리티카(Entamoeba hisolytica) 또는 지아르디아(Giardia)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 기생충을 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 장기 이식 결과와 관련된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 변이체를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 장기 이식 절차에 유용한 정보를 제공하기 위해 인간 백혈구 항원(HLA)을 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. 인간 백혈구 항원(HLA) 분자는 거의 모든 유핵 세포에서 발현되며 이식 거부에 중요하다. 시스템은 매우 다형성이다. HLA 클래스 Ⅰ에는 HLA-A, -B 및 -Cw의 세 가지 고전적 유전자좌가 있고 클래스 Ⅱ에는 HLA-DR, -DQ, -DP, -DM 및 -DO의 다섯 가지 유전자좌가 있다. Mahdi, B.M. (2013) A glow of HLA typing in organ transplantation. Clin. Transl. Med. 2:6. 7,500개가 넘는 상이한 대립유전자와 5,458개가 넘는 발현된 항원이 현재 공지되어 있다. (Laperrousaz 등 (2012) HLA and non-HLA polymorphisms in renal transplantation. Swiss Med. Wkly. 142:w13668.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 환자의 순환에서 핵산, 예를 들어, 핵산 치료제를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. 다양한 핵산 치료제가 공지되어 있으며, 안티센스 올리고뉴클레오티드, DNA 압타머 및 유전자 요법과 같은 DNA 치료제, 및 미세RNA, 짧은 간섭 RNA, 리보자임, RNA 디코이(decoy) 및 원형 RNA와 같은 RNA 치료제를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예는 거대세포바이러스(cytomegalovirus, CMV) 망막염의 관리를 위한 Fomivirsen 및 아포지단백 B-100 합성 억제제인 Mipomersen을 포함한다. 유전자 치료에 사용되는 올리고뉴클레오티드의 예는 종양 억제 유전자 p53의 발현을 위한 Gendicine과 지질단백질 리파아제 결핍 환자를 위한 Alipgene이 있다. Miravirsen은 간 특이적 미세RNA-122를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 임상 시험에서 추가 치료용 핵산은 기재내용 전문이 본원에 참고로 포함된 Sridharan and Gogtay (2016) Therapeutic Nucleic Acids: Current Clinical Status. Br. J. Clin. Pharmacol. 82(3):659-672에 나열되어 있다.

한 측면에서, 유전자 발현 연구를 위한 방법 또는 키트가 제공된다. 한 측면에서, 샘플에서 mRNA 발현을 검출, 확인 또는 정량화하기 위한 방법 또는 키트가 제공된다. 한 측면에서, 하나 이상의 조절 다형성(rSNP)을 검출, 확인 또는 정량화하기 위한 방법 또는 키트가 제공된다. 용어 "조절 다형성"은 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 엑소닉 영역(exonic region) 외부에서 발생하는 다형성을 의미한다. 시스-작용 조절 다형성은 동일한 대립유전자에 존재하는 유전자의 복제물에 작용하며, 전형적으로 조절하는 유전자의 위치 또는 그 근처에 존재한다. 트랜스-작용 조절 다형성은 다른 유전자의 발현에 영향을 미치는 한 유전자의 다형성이다. Knight, J.C. (2005) Regulatory Polymorphisms underlying complex disease traits. J. Mol. Med. (Berl.). 83(2):97-109. 인간 유전자에 대한 시스- 및 트랜스-작용 다형성 조절인자는 공지되어 있으며 Cheung 등 (2010) Polymorphic Cis- and Trans-Regulation of Human Gene Expression. PLOS Biol. 8(9):e1000480에 기술된 것들을 포함하며 이의 기재내용 전문이 본원에 참조로 포함된다.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 DNA 메틸화 다형성 또는 다른 후생유전적 변이와 같은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 변이체를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 반복서열 불안정성(microsatellite instability, MSI)을 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. MSI는 손상된 DNA 불일치 복구로 인한 돌연변이 소인을 나타낸다. MSI는, 예를 들어, Schlotterer 등, "Microsatellite Instability," eLS 2004; doi:10.1038/npg.els.0000840에 추가로 기술되어 있다.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는, 예를 들어, CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat), 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 및 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 포함하는 유전자 편집 기술로 인해 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 변이체를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 샘플에서 하나 이상의 단백질을 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 단백질은 DNA 결합 단백질이다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 샘플로부터 하나 이상의 표적 DNA 결합 단백질을 분리하는 데 사용된다. 또 다른 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 샘플에서 하나 이상의 DNA 결합 단백질의 정체를 확인하거나 샘플에서 DNA 결합 단백질의 상대적 양을 결정하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 전사 인자-DNA 결합 상호작용을 측정하기 위해 사용된다. 한 측면에서, DNA 결합 단백질이 결합하는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 서열은 본원에 기술된 바와 같이 지지체 표면에 고정되고 DNA 결합 단백질을 함유하거나 함유하는 것으로 추정되는 샘플과 접촉된다. 한 측면에서, 고정된 DNA 서열은 DNA 결합 단백질이 지지체 표면 상의 고정된 DNA 서열에 결합하는 조건 하에서 DNA 결합 단백질을 함유하거나 함유하는 것으로 추정되는 샘플과 접촉된다. 이어서 상기 표면을 세척하여, 예를 들어, 비특이적으로 결합된 단백질을 포함한 파편(debris)을 제거한다. 한 측면에서, 표적 DNA 결합 단백질은 고정된 DNA로부터 용출되고, 예를 들어, 웨스턴 블롯 또는 질량 분석법에 의해 검출된다. 또 다른 측면에서, 고정된 표적 DNA 결합 단백질은, 예를 들어, 단백질에 특이적으로 결합하는 표지된 항체 또는 전기화학발광 표지를 사용하여 표지되고 검출된다. 한 측면에서, 샘플은 하나 이상의 DNA 결합 단백질을 포함하는 세포 용해물이다. 한 측면에서, 지지체 표면은 마이크로웰 플레이트이다. 한 측면에서, 마이크로플레이트 형식은, 예를 들어, 돌연변이 또는 활성화 검정을 위한 고처리량 분석과 관련하여 사용된다.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 병원성 또는 약물 내성과 관련된 단일 뉴클레오티드 변이체 또는 단일 뉴클레오티드 다형성과 같은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 변이체를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. 또 다른 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 특정 산업 또는 농업 적용과 관련된 단일 뉴클레오티드 변이체 또는 단일 뉴클레오티드 다형성과 같은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 변이체, 예를 들어, 유전자 변형 유기체(genetic modified organism, GMO)와 관련된 돌연변이를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 하나 이상의 변이체, 예를 들어, 단일 뉴클레오티드 변이체가 질환과 연관되어 있는지를 결정하기 위해 전장 게놈 연관 연구(genome wide association studies, GWAS)에서 사용될 수 있다.

한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 변이체를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다. 한 측면에서, 상기 방법 또는 키트는 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성을 포함할 수 있는 약 1 내지 약 100개, 또는 약 5 내지 약 100개의 한정된 단일 뉴클레오티드 변이체를 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용된다.

한 측면에서, 샘플에서 복수의 표적 뉴클레오티드 서열을 동시, 병렬 확인, 검출 또는 정량화하기 위한 방법 및 키트가 제공된다. 한 측면에서, 샘플에서 최대 100개의 표적 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 샘플에서 약 1 내지 약 100개 또는 약 5 내지 약 100개의 표적 뉴클레오티드 서열을 확인, 검출 또는 정량화하기 위한 방법이 제공된다. 한 측면에서, 사용자 또는 제조자가 특정 사용자 요구 사항에 기초하여 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 멀티플렉싱 결합 검정을 구성할 수 있는 방법 또는 키트가 제공된다.

한 측면에서, 상기 방법은 주형으로서 표적 뉴클레오티드 서열을 사용하여 태그되고 표지된 반응 생성물을 생성하는 단계 및 지지체 표면을 상기 태그되고 표지된 반응 생성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 지지체 표면은 다수의 포획 분자가 고정되는 하나 이상의 결합 도메인의 패턴화된 어레이를 포함한다. 한 측면에서, 포획 분자는 개별 결합 도메인에 고정된 단일 가닥 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 결합 도메인은 특정 뉴클레오티드 서열을 갖는 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 태그되고 표지된 반응 생성물은 포획 올리고뉴클레오티드의 서열에 상보적인 서열을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다. 한 측면에서, 태그되고 표지된 반응 생성물은 올리고뉴클레오티드 결찰 검정(OLA)에 의해 생성된다. 또 다른 측면에서, 태그되고 표지된 반응 생성물은 프라이머 연장 검정(PEA)에 의해 생성된다. 한 측면에서, 상기 표지는 전기화학발광(ECL) 표지이고 지지체 표면은 고정된 반응 생성물의 표지로부터 전기화학발광 방출을 유발하기에 적합한 하나 이상의 작업 전극 및 하나 이상의 카운터 전극을 포함한다.

한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 야생형 서열을 포함하거나 함유하는 것으로 추정된다. 한 측면에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 결실, 부가, 치환, 전이, 전위, 재배열 또는 전좌와 같은 돌연변이를 포함하거나 함유하는 것으로 추정된다. 한 측면에서, 돌연변이는 미스센스, 넌센스, 사일런트 또는 스플라이스 부위 돌연변이를 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 확인, 검출 또는 정량화하기 위한 방법 및 키트가 제공된다. 한 측면에서, 집단의 적어도 약 1%에 존재하는 하나 이상의 공통 단일 뉴클레오티드 SNP를 확인, 검출 또는 정량화하기 위한 방법 및 키트가 제공된다. 또 다른 측면에서, 샘플에서 낮은 빈도로 존재하는 돌연변이, 예를 들어, 샘플에서 0.05% 또는 0.01% 미만으로 존재하는 돌연변이를 확인, 검출 또는 정량화하기 위한 방법 및 키트가 제공된다.

한 측면에서, 복수의 표적 분석물에 대한 멀티플렉싱 결합 검정을 수행하는 방법이 제공된다. 멀티플렉스 결합 검정은 공지되어 있고, METHODS FOR CONDUCTING MULTIPLEXED ASSAYS라는 제목으로 2015년 9월 8일에 출원된 미국 특허 공보 제2016/0069872호에 기술된 것들을 포함하며, 이의 개시내용은 전문이 본원에 포함된다.

한 측면에서, 멀티플렉싱 결합 검정을 수행하는 방법은 적어도 제1 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 포획 올리고뉴클레오티드가 제1 결합 도메인에 고정되고 제2 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 포획 올리고뉴클레오티드가 제2 결합 도메인에 고정되는 지지체 표면을 제공하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열은 동일하지 않다. 한 측면에서, 지지체 표면은 하나 이상의 단계에서 적어도 제1 표적화제, 제1 결합 시약, 제2 표적화제 및 제2 결합 시약과 접촉된다. 한 측면에서, 제1 표적화제는 제1 연결제(linking agent)에 작동 가능하게 연결된 제1 태그 서열을 포함한다. 한 측면에서, 제1 태그 서열은 제1 포획 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 제2 표적화제는 제2 연결제에 작동 가능하게 연결된 제2 태그 서열을 포함한다. 한 측면에서, 제2 태그 서열은 제2 포획 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 제1 결합 시약은 제1 보충 연결제에 작동 가능하게 연결된 제1 분석물에 특이적으로 결합하는 제1 분석물 결합 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 제2 결합 시약은 제2 보충 연결제에 작동 가능하게 연결된 제2 분석물에 특이적으로 결합하는 제2 분석물 결합 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 제1 연결제는 제1 보충 연결제의 결합 파트너이고 제2 연결제는 제2 연결제의 결합 파트너이다. 한 측면에서, 지지체 표면은 적어도 제1 및 제2 브릿징제(bridging agent)와 접촉된다. 한 측면에서, 제1 브릿징제는 제1 연결제에 결합하는 제1 연결제 결합 부위 및 제1 보충 연결제에 결합하는 제1 보충 연결제 결합 부위를 포함하고, 제2 브릿징제는 제2 연결제에 결합하는 제2 연결제 결합 부위 및 제2 보충 연결제에 결합하는 제2 보충 연결제 결합 부위를 포함한다.

한 측면에서, 지지체 표면은 적어도 제1 관심 분석물 및 제2 관심 분석물을 함유하거나 함유하는 것으로 추정되는 샘플과 접촉된다. 한 측면에서, 적어도 제1 검출 복합체 및 제2 검출 복합체가 형성된다. 한 측면에서, 제1 검출 복합체는 제1 결합 도메인 상에 형성되고 제1 표적화제, 제1 포획 올리고뉴클레오티드, 제1 브릿징 시약 및 제1 분석물을 포함한다. 한 측면에서, 제1 검출 복합체는 제1 결합 도메인 상에 형성되고 제1 표적화제, 제1 포획 올리고뉴클레오티드, 제1 브릿징제, 제1 브릿징 시약 및 제1 분석물을 포함한다. 한 측면에서, 제2 검출 복합체는 제2 결합 도메인 상에 형성되고 제2 표적화제, 제2 포획 올리고뉴클레오티드, 제2 결합 시약 및 제2 분석물을 포함한다. 한 측면에서, 제2 검출 복합체는 제2 결합 도메인 상에 형성되고 제2 표적화제, 제2 포획 올리고뉴클레오티드, 제2 브릿징제, 제2 결합 시약 및 제2 분석물을 포함한다. 한 측면에서, 상기 방법은 제1 및 제2 검출 복합체를 통해 제1 및 제2 결합 도메인 상에 각각 고정된 제1 및 제2 분석물의 양을 측정하는 단계를 포함한다.

P. 수동 및 자동화 실시양태

본원에 개시된 방법은 수동, 자동화 기술 또는 둘 다 사용하여 수행할 수 있다. 자동화 기술은 부분적으로 자동화된 것, 예를 들어, 하나 이상의 모듈식 기기 또는 완전 통합식 자동화 기기일 수 있다.

자동화 시스템의 예는 각각의 전문이 참조로 포함된, 공동 소유의 국제 특허 출원 공보 WO 2018/017156 및 WO 2017/015636, 및 국제 특허 출원 공보 WO 2016/164477에서 논의되고 기술되어 있다.

본원의 방법이 수행될 수 있는 자동화 시스템(모듈식 및 완전 통합식)은 다음 자동화 서브시스템을 포함할 수 있다: 하드웨어(예를 들어, 개인용 컴퓨터, 랩탑, 하드웨어 프로세서, 디스크, 키보드, 디스플레이, 프린터), 소프트웨어(예를 들어, 드라이버, 드라이버 컨트롤러 및 데이터 분석기와 같은 프로세스) 및 데이터베이스(들)를 포함할 수 있는 컴퓨터 시스템(들); 액체 취급 서브시스템(들), 예를 들어, 샘플 취급 및 시약 취급, 예를 들어, 로봇 피펫팅 헤드, 주사기, 교반 장치, 초음파 혼합 장치, 자기 혼합 장치; 샘플, 시약 및 소모성 저장 및 취급 서브시스템(들), 예를 들어, 로봇 조작기, 튜브 또는 뚜껑 또는 호일 피어싱 기구, 뚜껑 제거 기구, 선형 및 원형 컨베이어 및 로봇 조작기와 같은 운반 장치, 튜브 랙(tube rack), 플레이트 캐리어(plate carrier), 트로프 캐리어(trough carrier), 피펫 팁 캐리어(pipet tip carrier), 플레이트 진탕기(plate shaker); 원심분리기, 검정 반응 서브시스템(들), 예를 들어, 유체 기반 및 소모성 기반(예를 들어, 튜브 및 다중 웰 플레이트); 용기 및 소모성 세척 서브시스템(들), 예를 들어, 플레이트 세척 장치; 자기 분리기 또는 자기 입자 농축기 서브시스템(들), 예를 들어, 플로우 셀, 튜브 및 플레이트 유형; 세포 및 입자 검출, 분류 및 분리 서브시스템(들), 예를 들어, 유세포분석기 및 Coulter 계수기; 비색, 비탁, 형광 및 ECL 검출기와 같은 검출 서브시스템(들); 온도 제어 서브시스템(들), 예를 들어, 공기 처리, 공기 냉각, 공기 가열, 팬, 송풍기, 수조; 폐기물 서브시스템(들), 예를 들어, 액체 및 고체 폐기물 용기; 전역 고유 식별자(global unique identifier, GUI) 검출 서브시스템(들), 예를 들어, 플랫 베드 및 완드 유형과 같은 1D 및 2D 바코드 스캐너; 샘플 식별자 감지 하위 시스템(들), 예를 들어, 플랫 베드(flat bed) 및 완드(wand) 유형과 같은 1D 및 2D 바코드 스캐너; 샘플 식별자 검출 서브시스템(들), 예를 들어, 플랫 베드 및 완드 유형과 같은 1D 및 2D 바코드 스캐너. 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 및 질량 분석기와 같은 크로마토그래피 시스템과 같은 분석 하위 시스템(들)도 모듈식 또는 완전 통합식일 수 있다.

샘플 확인 및 준비를 수행하는 시스템 또는 모듈은 검정을 수행하고 검출을 수행하거나 두 가지 모두를 수행하는 시스템 또는 모듈과 결합될 수 있다(또는 시스템 또는 모듈에 인접해 있거나 인접하거나 로봇 방식으로 연결되거나 커플링될 수 있다). 동일한 종류의 다중 모듈식 시스템을 결합하여 처리량을 높일 수 있다. 모듈식 시스템(들)은 화학, 생화학 및 핵산 분석과 같은 다른 유형의 분석을 수행하는 모듈(들)과 조합될 수 있다.

자동화 시스템은 배치, 연속, 무작위 접근(random-access) 및 현장 진단(point-of-care) 워크플로우와 단일, 중간 및 높은 샘플 처리량을 허용할 수 있다.

상기 시스템은, 예를 들어, 다음 장치 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 플레이트 밀봉기(예를 들어, Zymark), 플레이트 세척기(예를 들어, BioTek, TECAN), 시약 분배기 및/또는 자동화 피펫팅 스테이션 및/또는 액체 취급 스테이션(예를 들어, TECAN, Zymark, Labsystems, Beckman, Hamilton), 인큐베이터(예를 들어, Zymark), 플레이트 진탕기(예를 들어, Q.Instruments, Inheco, Thermo Fisher Scientific), 화합물 라이브러리 또는 샘플 저장 및/또는 화합물 및/또는 샘플 회수(retrieval) 모듈. 이러한 장치 중 하나 이상은 전체 검정 공정이 자동으로 수행될 수 있도록 로봇 조립체를 통해 본 발명의 기구에 연결된다. 대안적 실시양태에 따르면, 용기(예를 들어, 플레이트)는 기구와 다양한 장치(예를 들어, 플레이트 스택) 사이에서 수동으로 이동된다.

자동화 시스템은 다음 기능 중 하나 이상을 수행하도록 구성될 수 있다: (a) 검출 서브시스템 안팎으로 플레이트와 같은 소모품 이동, (b) 다른 서브시스템 간에 소모품 이동, (c) 소모품 보관, (d) 샘플 및 시약 취급(예를 들어, 시약 혼합 및/또는 시약을 소모품에 도입), (e) 소모품 진탕(예를 들어, 시약 혼합 및/또는 반응 속도 증가를 위함), (f) 소모품 세척(예를 들어, 플레이트 세척 및/또는 검정 세척 단계 수행(예를 들어, 웰 흡인), (g) 튜브 또는 플레이트와 같은 소모품 또는 유동 셀에서 ECL 측정. 자동화 시스템은 랙, 96 또는 384 웰 플레이트와 같은 멀티웰 플레이트에 배치된 개별 튜브를 처리하도록 구성될 수 있다.

본원에 기술된 바와 같이 자동화 시스템에서 구성요소 및 모듈을 통합하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, Sargeant 등, Platform Perfection, Medical Product Outsourcing, May 17, 2010 참조).

실시양태에서, 자동화 시스템은 완전히 자동화되고, 모듈식이며, 컴퓨터화되고, 광범위한 분석물에 대해 시험관 내 정량 및 정성 테스트를 수행하고, 광도측정 검정, 이온 선택적 전극 측정 및/또는 전기화학발광(ECL) 검정을 수행한다. 실시양태에서, 시스템은 다음 하드웨어 유닛을 포함한다: 제어 유닛, 코어 유닛 및 적어도 하나의 분석 모듈.

실시양태에서, 제어 유닛은 모든 기구 기능을 제어하기 위해 그래픽 사용자 인터페이스(graphical user interface)를 사용하고, 모니터와 같은 판독 장치, 키보드 및 마우스와 같은 입력 장치(들), 및, 예를 들어, Windows 운영 체제를 사용하는 개인용 컴퓨터를 포함한다. 실시양태에서, 코어 유닛은 각각의 할당된 분석 모듈로의 샘플 운반을 관리하는 여러 구성요소를 포함한다. 코어 유닛의 실제 구성은 분석 모듈의 구성에 의존하며, 이는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 당업자에 의해 구성될 수 있다. 실시양태에서, 코어 유닛은 적어도 샘플링 유닛과 하나의 랙 로터(rack rotor)를 주요 구성요소로 포함한다. 컨베이어 라인(들)과 제2 랙 로터는 확장 가능하다. 몇 가지 다른 코어 유닛 구성요소는 샘플 랙 로더/언로더(sample rack loader/unloader), 포트(port), 바코드 판독기(랙 및 샘플용), 물 공급 장치 및 시스템 인터페이스 포트를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 분석 모듈은 ECL 검정을 수행하고 시약 영역, 측정 영역, 소모품 영역 및 사전 세척 영역을 포함한다.

Q. 키트

한 측면에서, 샘플에서 하나 이상의 표적 분석물을 확인, 검출 또는 정량화하기 위한 검정을 수행하기 위한 키트가 제공된다. 한 측면에서, 상기 키트는 하나 이상의 관심 표적 단백질 또는 뉴클레오티드 서열을 확인, 검출 또는 정량화하기 위해 제조업체 또는 최종 사용자에 의해 맞춤화될 수 있다. 한 측면에서, 최종 사용자는 표적 분석물 또는 반응 생성물과 회합된 올리고뉴클레오티드 태그와 각 결합 도메인에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드 사이의 상보성을 기반으로 어레이의 각 결합 도메인으로 향할 표적 분석물을 지정할 수 있다. 한 측면에서, 상기 키트는 사용자의 사양을 기반으로 구성될 수 있는 멀티 웰 검정 플레이트를 제공하며, 예를 들어, 최종 사용자는 분석물 세트를 선택하고 해당 분석물 세트에 대한 사용자 맞춤형 멀티플릭싱 검정을 구성할 수 있다.

한 측면에서 키트가 제공된다. 한 측면에서, 상기 키트는 본원에 기술된 바와 같은 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 표 1(서열번호 1-64), 표 2(서열번호 65-122), 표 3(서열번호 123-186), 표 4(서열번호 187-250), 표 5(서열번호 251-308), 표 6(서열번호 309-372), 표 7(서열번호 373-436), 표 8(서열번호 437-494), 표 9(서열번호 495-558), 표 10(서열번호 559-622), 표 11(서열번호 623-680) 또는 표 12(서열번호 681-744) 또는 이의 변이체로부터 선택된 2개 이상의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 서열번호 1-64 또는 이의 변이체로부터 선택된 2개 이상의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 서열번호 1-10 또는 이의 변이체로부터 선택된 2개 이상의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트를 포함한다. 한 측면에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 적어도 24, 30 또는 36개의 뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 및 최대 64개의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 최대 10개의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 용기에 제공된 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 용기 내 상기 포획 올리고뉴클레오티드는 동일한 서열을 갖고 각 용기는 다른 용기의 포획 올리고뉴클레오티드의 서열과 상이한(및 상보적이지 않은) 서열을 갖는 포획 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 한 측면에서, 상기 키트는 별도의 용기에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 및 최대 64개의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 별도의 용기에 최대 10개의 표적 뉴클레오티드 서열을 확인, 검출 또는 정량화하는 데 사용할 수 있는 최대 10개의 상이한 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 지지체 표면 및 본원에 기술된 바와 같은 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 지지체 표면에 고정된 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 어레이의 지지체 표면에 고정된 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드 세트를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 어레이 내에 공지된 위치가 있는 하나 이상의 개별 결합 도메인에 고정된 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 비드 어레이에 고정된 2개 이상의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 지지체 표면 상의 하나 이상의 결합 도메인에 고정된 하나 이상의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 2개 이상의 고유 결합 도메인에 고정된 2개 이상의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 각각의 고유 결합 도메인에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드의 서열은 동일하다. 한 측면에서, 상기 키트는 적어도 몇몇 포획 올리고뉴클레오티드가 지지체 표면에 공유 결합되지 않은 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 적어도 몇몇 포획 올리고뉴클레오티드가 티올 그룹을 통해 탄소 기반 표면, 예를 들어, 탄소계 전극에 공유 결합되지 않은 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 결합 도메인은 티올 그룹을 통해 지지체 표면에 공유 결합되지 않은 10%, 15%, 20%, 25%, 50% 또는 75% 초과의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 약 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02% 또는 0.01% 미만의 오염 포획 올리고뉴클레오티드를 갖는 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 작용기를 포함하는 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 티올 그룹을 포함하는 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 티올 그룹을 통해 탄소계 지지체 표면에 공유 결합된다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 티올 그룹에 부착된다. 한 측면에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 티올 그룹을 통해 하나 이상의 전극에 부착된다.

또 다른 측면에서, 상기 키트는 본원에 기술된 바와 같은 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그 세트를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 상보적 포획 올리고뉴클레오티드 대비 비-상보적 포획 올리고뉴클레오티드에 결합하는 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그 세트를 0.05% 미만으로 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 표 13(서열번호 745-808), 표 14(서열번호 809-866), 표 15(서열번호 867-930), 표 16(서열번호 931-994), 표 17(서열번호 995-1052), 표 18(서열번호 1053-1116), 표 19(서열번호 1117-1180), 표 20(서열번호 1181-1238), 표 21(서열번호 1239-1302), 표 22(서열번호 1303-1366), 표 23(서열번호 1367-1424) 또는 표 24(서열번호 1425-1488) 또는 이의 변이체로부터 선택된 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 세트를 포함한다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 적어도 20, 24, 30 또는 36개의 뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 용기에 제공된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 올리고뉴클레오티드 태그를 포함하며, 용기 내 올리고뉴클레오티드 태그는 동일한 서열을 갖고 각 용기는 다른 용기의 올리고뉴클레오티드의 서열과 상이한(상보적이지 않은) 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 태그를 함유한다. 한 측면에서, 상기 키트는 별도의 용기에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 및 최대 64개의 교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 최대 10개의 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 태그 세트를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 지지체 표면을 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 탄소계 지지체 표면을 포함한다. 한 측면에서, 상기 지지체 표면은 적어도 하나의 전극을 포함한다. 한 측면에서, 상기 전극은 탄소계 전극이다. 한 측면에서, 상기 지지체 표면은 하나 이상의 카본 잉크 전극을 포함한다. 한 측면에서, 상기 지지체 표면은 적어도 하나의 작업 전극 및 적어도 하나의 카운터 전극을 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 멀티 웰 검정 플레이트를 포함하는 지지체 표면을 포함한다. 한 측면에서, 상기 멀티 웰 플레이트의 하나 이상의 웰은 하나 이상의 전극을 포함한다. 한 측면에서, 상기 지지체 표면은 하나 이상의 웰이 하나 이상의 작업 전극 및 하나 이상의 카운터 전극을 포함하는 멀티 웰 플레이트를 포함한다. 한 측면에서, 상기 지지체 표면은 하나 이상의 기준 전극을 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 포획 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 어레이가 인쇄되는 하나 이상의 전극을 갖는 지지체 표면을 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 포획 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 어레이가 인쇄된 하나 이상의 멀티 웰 플레이트를 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 키트는 하나 이상의 멀티 웰 플레이트, 및 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 바이알을 포함하며, 포획 올리고뉴클레오티드는 멀티 웰 플레이트 상에 인쇄될 수 있다. 한 측면에서, 최종 사용자 또는 제조자는 올리고뉴클레오티드 태그를 표적 분석물과 회합시키거나 키트와 함께 제공된 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드 태그를 갖는 반응 생성물을 생성함으로써 어떤 표적 뉴클레오티드 서열이 확인, 검출 또는 정량화되는지 맞춤화할 수 있다.

한 측면에서, 상기 키트는 지지체 표면 상의 하나 이상의 결합 도메인에 고정된 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 멀티 웰 플레이트의 웰 내의 하나 이상의 결합 도메인에 고정된 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 전극 상의 하나 이상의 결합 도메인에 고정된 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 멀티 웰 플레이트의 하나 이상의 웰 내의 전극 상의 하나 이상의 결합 도메인에 고정된 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 멀티 웰 플레이트의 웰 내의 하나 이상의 결합 도메인에 최대 10개의 포획 올리고뉴클레오티드가 고정되어 있는 하나 이상의 멀티 웰 플레이트를 포함하고, 각각의 결합 도메인은 웰 내의 다른 결합 도메인에 있는 포획 올리고뉴클레오티드의 서열과 상이한 서열을 갖는 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25개의 고유 결합 도메인에 고정된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25개의 개별 포획 올리고뉴클레오티드를 갖는 지지체 표면을 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 하나 이상의 웰의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25개의 고유 결합 도메인에 고정된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25개의 개별 포획 올리고뉴클레오티드를 갖는 멀티 웰 플레이트를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 하나 이상의 멀티 웰 플레이트를 포함하며, 각 웰은 어레이에 고정된 최대 10개의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 상기 멀티 웰 플레이트는 멀티 웰 플레이트의 각 웰 내에서 1 내지 10개의 검출 검정을 생성하도록 구성될 수 있다.

한 측면에서, 상기 키트는 당업계에 공지되어 있고 24웰, 96웰 및 384웰 플레이트를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는 표준 형식 멀티 웰 플레이트를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 하나 이상의 96웰 플레이트를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 하나의 멀티 웰 플레이트를 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 키트는 10개의 멀티 웰 플레이트를 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 키트는 10 내지 100개의 멀티 웰 플레이트를 포함한다.

한 측면에서, 샘플에서 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열을 확인, 검출 또는 정량화하기 위한 발광 검정, 예를 들어, 전기화학발광 검정을 수행하기 위한 키트가 제공된다. 한 측면에서, 상기 키트는 전기화학발광 검정을 수행하는데 유용한 하나 이상의 검정 구성요소를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 올리고뉴클레오티드 태그를 이의 상응하는 상보적 포획 올리고뉴클레오티드 서열에 혼성화하기 위한 적절한 조건(예를 들어, 엄격한 조건)을 제공하는 데 사용될 수 있는 혼성화 버퍼를 포함한다. 한 측면에서, 혼성화 버퍼는 포름아미드와 같은 핵산 변성제를 포함한다. 한 측면에서, 혼성화 버퍼는 혼성화 버퍼를 형성하기 위해 조합될 수 있는 2개의 개별 성분으로서 제공된다.

한 측면에서, 상기 키트는 인쇄 후 지지체 표면으로부터 유리(즉, 고정되지 않은) 포획 분자를 제거하기 위한 세척 용액의 용기를 포함한다. 한 측면에서, 세척 용액은 수용액이다. 한 측면에서, 세척 용액은 티올 함유 화합물을 포함한다. 한 측면에서, 상기 티올 함유 화합물은 수용성이며 분자량이 약 200g/mol, 175g/mol, 150g/mol 또는 125g/mol 미만이다. 한 측면에서, 티올 함유 화합물은 시스테인, 시스테아민, 디티오트레이톨, 3-머캅토프로프리오네이트, 3-머캅토-1-프로판설폰산 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 한 측면에서, 티올 함유 화합물은 시스테인을 포함한다. 한 측면에서, 티올 함유 화합물은 쯔비터이온을 포함한다.

한 측면에서, 세척 용액 내의 수용성 티올 함유 화합물은 워시오버(wash-over)를 방지하기 위해 유리 포획 올리고뉴클레오티드와 경쟁한다. 워시오버는, 예를 들어, 느슨하게 결합된 포획 분자가 표면으로부터 용액, 예를 들어, 세척 버퍼, 검정 희석액 또는 샘플로 방출되고 하나 이상의 인접한 결합 도메인으로 이동하는 경우 포획 분자가 인접한 결합 도메인에 재침착되는 것을 지칭한다. 워시오버를 줄이려면 느슨하게 결합된 포획 분자를 제거하고 재침착을 방지해야 한다. 워시오버는 실제 교차 반응성이 없더라도 상이한 분석물 간의 명백한 교차 반응성을 증가시킬 수 있다.

이론에 얽매이는 것은 아니지만, 세척 용액의 작용 메커니즘은 다음과 같다고 생각된다: 세척 용액은 느슨하게 결합된 포획 올리고뉴클레오티드를 용액으로 가져오며, 이로부터 포획 올리고뉴클레오티드가 SH-공유 결합 또는 기타 메커니즘을 통해 잠재적으로 표면에 재증착될 수 있다. 포획 올리고뉴클레오티드가 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 포획 올리고뉴클레오티드를 갖는 결합 도메인 상에 재증착되는 경우, 이는 오염 포획 분자로 간주된다. 오염 포획 분자의 존재는 검정 결과를 방해할 수 있다. 한 측면에서, 세척 용액은 수용성 티올 함유 화합물, 예를 들어, 시스테인을 포획 올리고뉴클레오티드보다 큰 몰 과량(적어도 10,000x)으로 포함하며, 이는 티올 함유 화합물의 티올 그룹이 결합하고 표면의 이용 가능한 부위에 결합하기 위해 느슨한 포획 올리고뉴클레오티드를 능가하도록 한다. Triton X-100(0.1%)은 SH 그룹과의 표면 반응성을 비활성화한다; Tris 분자는 아마도 표면에 결합할 가능성이 있는 아민 그룹의 존재로 인해 용액 내 결합을 감소시킨다. 한 측면에서, 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 어레이의 결합 도메인은 약 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02% 또는 0.01% 미만의 오염 포획 분자를 포함한다.

한 측면에서, 세척 용액은 티올 함유 화합물, pH 완충 성분, 계면활성제 또는 이들의 조합을 포함하고 pH가 약 7 내지 약 9이다.

한 측면에서, 세척 용액은 약 5mM 내지 약 750mM, 약 10mM 내지 약 500mM, 약 25mM 내지 약 75mM 또는 약 50mM 시스테인을 포함한다. 한 측면에서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, Triton X-100이다. 한 측면에서, 세척액은 약 10mM 내지 약 30mM, 또는 약 15mM 내지 약 25mM, 또는 약 20mM의 버퍼, 예컨대 Tris를 포함한다. 한 측면에서, 세척액은 약 0.05% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.05% 내지 0.2%, 또는 약 0.1%의 계면활성제, 예컨대 Triton X-100을 포함한다. 한 측면에서, 세척 용액은 pH가 약 7.5 내지 약 8.5, 또는 약 8.0이다. 한 측면에서, 세척 버퍼는 약 15mM 내지 약 25mM Tris, 약 pH 8.0, 약 0.05% 내지 약 0.15% triton X-100 및 약 25mM 내지 75mM 시스테인을 포함한다. 더 특별한 측면에서, 세척액은 약 20mM Tris, 약 pH 8.0, 약 0.1% triton X-100 및 약 50mM 시스테인을 포함한다.

한 측면에서, 세척 용액의 하나 이상의 성분이 건조 형태로 키트에 제공된다. 한 측면에서, 세척 용액의 하나 이상의 성분을 재구성하기 위한 액체 희석제가 키트에 제공된다.

한 측면에서, 상기 키트는 표지를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 한 측면에서, 상기 표지는 방사성, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 흡광, 광산란, 전기화학, 자기 및 효소 표지에서 선택된다. 한 측면에서, 상기 표지는 전기화학발광 표지를 포함한다. 한 측면에서, 상기 표지는 전이 금속을 포함하는 유기금속 착물을 포함한다. 한 측면에서, 상기 전이 금속은 루테늄을 포함한다. 한 측면에서, 상기 표지는 MSD SULFO-TAG™ 표지이다.

한 측면에서, 상기 표지는 2차 결합 시약의 결합 파트너인 1차 결합 시약을 포함한다. 한 측면에서, 2차 결합 시약은 비오틴, 스트렙트아비딘, 아비딘 또는 항체를 포함한다. 한 측면에서, 2차 결합 시약은 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 항체를 포함한다. 한 측면에서, 상기 표지는 비오틴, 플루오레세인 및 디곡시제닌으로부터 선택된 합텐을 포함한다. 한 측면에서, 상기 표지는 제1 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 1차 결합제이고, 2차 결합제는 1차 결합제의 제1 올리고뉴클레오티드 서열에 상보적인 제2 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 전기화학발광 표지를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 더 특별한 측면에서, 상기 키트는 트리스-비피리딜-루테늄(RuBpy)과 같은 Ru 함유 또는 Os 함유 유기 금속 화합물을 함유하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 한 측면에서, 상기 표지는 전이 금속을 포함하는 유기금속 착물을 포함한다. 한 측면에서, 상기 전이 금속은 루테늄을 포함한다. 한 측면에서, 상기 표지는 MSD SULFO-TAG™ 표지(MesoScale, Rockville, MD)를 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 키트는 루미놀 또는 기타 관련 화합물을 함유하는 하나 이상의 용기를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 하나 이상의 전기화학발광 공반응물을 함유하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 전기화학발광 공반응물은 지지체 표면에 공유적으로 또는 비공유적으로 고정된다. 한 측면에서, 하나 이상의 전기화학발광 공반응물은 지지체 표면의 하나 이상의 작업 전극에 고정된다.

한 측면에서, 상기 키트에 포함된 표지는 1차 결합 시약 및 2차 결합 시약을 포함한다. 한 측면에서, 2차 결합 시약은 비오틴, 스트렙트아비딘, 아비딘 또는 항체를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 다중 검정용이다. 한 측면에서, 상기 키트는 재밀봉 가능한 백 또는 용기에 담겨 있다. 한 측면에서, 상기 백 또는 용기는 실질적으로 물에 불투과성이다. 한 측면에서, 상기 백은 포일, 예를 들어, 알루미늄 포일이다. 한 측면에서, 상기 키트 및 시약은 건조 상태로 보관되며 상기 키트는 검정 시약을 건조 상태로 유지하기 위한 건조재를 포함할 수 있다.

한 측면에서, 상기 키트는 건조된 패키지에 포장된 하나 이상의 고정된 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하는 지지체 표면을 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 건조 패키지에 포장되기 전에 티올 함유 세척 용액으로 세척된 지지체 표면을 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 하나 이상의 고정된 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하는 지지체 표면을 포함하며, 지지체 표면은 건조된 패키지에 포장되기 전에 티올 함유 세척 용액으로 세척되지 않았다.

한 측면에서, 상기 키트는 다음 검정 구성요소 중 하나 이상을 포함한다: 하나 이상의 비-교차 반응성 포획 올리고뉴클레오티드; 및 하나 이상의 버퍼, 예를 들어, 세척 버퍼, 혼성화 버퍼, 결합 버퍼 또는 판독 버퍼. 한 측면에서, 혼성화 버퍼는 핵산 변성제를 포함한다. 한 측면에서, 핵산 변성제는 포름아미드를 포함한다. 한 측면에서, 혼성화 버퍼는 혼성화 버퍼를 형성하기 위해 조합될 수 있는 2개의 개별 성분으로서 제공된다. 한 측면에서, 결합 버퍼는 계면활성제를 포함한다. 한 측면에서 판독 버퍼는 전기화학발광(ECL) 판독 버퍼를 포함한다.

한 측면에서, ECL 판독 버퍼는 ECL 공반응물로 지칭될 수 있는 ECL 표지와 상호작용하는 화합물을 포함한다. 통상적으로 사용되는 공반응물은 Ru(Bpy)₃ ⁺²로부터의 ECL을 위한 3차 아민(예를 들어, 미국 특허 제5,846,485호 참조), 옥살레이트 및 과황산염, 및 루미놀로부터의 ECL을 위한 과산화수소(예를 들어, 미국 특허 제5,240,863호 참조)를 포함한다. 한 측면에서, ECL 공반응물은 3차 아민을 포함한다. 한 측면에서, ECL 공반응물은 3차 알킬아민을 포함한다. 한 측면에서, ECL 공반응물은 3차 하이드록시알킬아민을 포함한다. 한 측면에서, ECL 공반응물은 쯔비터이온성 3차 아민을 포함한다. 한 측면에서, ECL 공반응물은 2차 아민을 포함한다. 한 측면에서, ECL 공반응물은 트리부틸아민(TBA), (디부틸)아미노에탄올(DBAE), (디에틸)아미노에탄올(DEAE), 트리에탄올아민(TEA), 부틸디에탄올아민(BDEA), 프로필디에탄올아민(PDEA), 에틸디에탄올아민(EDEA), 메틸디에탄올아민(MDEA), tert-부틸디에탄올아민(tBDEA), 디부틸아민(DBA), 부틸에탄올아민(BEA), 디에탄올아민(DEA), 디부틸아민 프로필설포네이트(DBA-PS), 디부틸아민 부틸설포네이트(DBA-BS), 부틸에탄올아민 프로필설포네이트(BEA-PS), 부틸에탄올아민 부틸설포네이트(BEA-BS), 디에탄올아민 프로필설포네이트(3-[비스-(2-하이드록시-에틸)-아미노]-프로판-1-설폰산; DEA-PS로도 공지됨) 또는 디에탄올아민 부틸설포네이트(DEA-BS)로부터 선택된다. ECL 공동 반응물은 "COMPOSITIONS AND METHODS FOR ASSAY MEASUREMENTS"라는 제목으로 2020년 7월 1일에 출원된 미국 출원 제63/047,167호에 기술되어 있으며 이의 개시내용 전문이 본원에 참조로 포함된다. 한 측면에서, 상기 키트는 표지와 같은 하나 이상의 검정 구성요소를 포함한다. 한 측면에서, 상기 표지는 전기화학발광 표지와 같은 발광 표지이다. 한 측면에서, 상기 키트는 적어도 하나의 전기화학발광 공반응물을 포함한다. 한 측면에서, 전기화학발광 공반응물은 3차 아민, 트리프로필아민 또는 N-부틸디에탄올아민을 포함한다.

한 측면에서, 상기 표지는 2차 결합 시약의 결합 쌍인 1차 결합 시약을 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 2차 결합 시약을 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 하나 이상의 플레이트 웰에 건조 형태의 하나 이상의 검정 구성요소를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 고유한 키트 식별자를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 하나 이상의 다른 검정 구성요소를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 희석제, 차단제, 안정화제, 세제, 염, pH 버퍼 및 보존제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 검정을 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 하나 이상의 그러한 구성요소의 용기를 포함한다. 또 다른 측면에서, 하나 이상의 시약이 키트와 함께 제공되는 검정 지지체 표면에 포함된다.

한 측면에서, 상기 키트는 하나 이상의 프로브를 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열에 결합시키기 위한 적절한 조건을 제공하기 위해 사용될 수 있는 결합 버퍼를 포함한다. 한 측면에서, 결합 버퍼는 계면활성제를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 표지의 존재를 검출하기 위한 적절한 조건을 제공하기 위해 사용될 수 있는 판독 버퍼를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는, 예를 들어, 3차 아민, 트리프로필아민 및 N-부틸디에탄올아민을 포함하는 하나 이상의 전기화학발광 공반응물을 포함하는 전기화학발광 판독 버퍼를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 사용 설명서 또는 고유한 키트 식별자를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 표적 뉴클레오티드 서열에서 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하기 위한 하나 이상의 검정 구성요소를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 다음 구성요소 중 하나 이상을 포함한다: 관심 핵산 내 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브; 하나 이상의 차단 프로브; 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트; 하나 이상의 표지된 뉴클레오시드 트리포스페이트; 표지된 디데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트; 리가아제 또는 중합효소.

한 측면에서, 상기 키트는 관심 핵산 내 표적 서열에 상보적인 제1 서열 및 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드 태그를 갖는 하나 이상 또는 복수의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는, 예를 들어, 리가아제 버퍼 또는 DNA 리가아제를 포함하는, 올리고뉴클레오티드 결찰 검정을 사용하여 표적 뉴클레오티드 서열을 확인, 검출 또는 정량화하기 위한 하나 이상의 검정 구성요소를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 샘플에서 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열을 검출, 확인 또는 정량화하기 위한 하나 이상의 검정 구성요소를 포함하며, 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열은 다형성 뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 복수의 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 복수의 쌍의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 프로브 쌍은 표적화 프로브 및 검출 프로브를 포함한다. 한 측면에서, 표적화 프로브는 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그 및 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 제1 영역에 상보적인 제1 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 검출 프로브는 표지 및 표적화 프로브 서열의 제1 핵산 서열이 상보적인 제1 영역에 인접한 표적 뉴클레오티드 서열의 제2 영역에 상보적인 제2 핵산 서열을 포함하고, 표적화 또는 검출 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열의 다형성 뉴클레오티드 위에 위치한 말단 3' 또는 5' 뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 상기 표지는 검출 프로브의 3' 말단에 부착된다.

한 측면에서, 표적화 프로브는 검출 프로브의 5' 말단 뉴클레오티드가 상보적인 영역에 인접한 표적 뉴클레오티드 서열의 영역에 상보적인 말단 3' 뉴클레오티드를 갖는다. 한 측면에서, 검출 프로브의 말단 5' 뉴클레오티드는 표적 뉴클레오티드 서열의 다형성 뉴클레오티드에 상보적이다.

한 측면에서, 상기 키트는 표적 뉴클레오티드 서열에 결합하는 제1 및 제2 검출 프로브를 포함하고, 제1 및 제2 검출 프로브는 말단 5' 뉴클레오티드에서만 상이하다. 한 측면에서, 제1 검출 프로브는 야생형 서열에 상보적이고 제2 검출 프로브는 돌연변이 서열에 상보적이다.

한 측면에서, 상기 키트는 리가아제를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트 또는 방법은 하나 이상의 차단 프로브를 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 차단 프로브는, 예를 들어, 암 돌연변이의 희귀하거나 낮은 대립유전자 분획의 검출을 위해 분석 감도를 증가시키는 데 사용된다. 한 측면에서, 차단 프로브는 주형 분자가 결찰되지 않은 프로브를 포획 올리고뉴클레오티드와 혼성화할 수 있고 결찰되지 않은 프로브로부터 잘못된 신호를 생성할 수 있는 복합체로 연결하는 것을 방지함으로써 OLA 검정에서 배경 신호를 감소시키는 데 사용된다. 한 측면에서, 차단 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이고 프로브 결찰 부위를 가로지르지만 태그 또는 표지를 포함하지 않는 단일 가닥 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 차단 프로브는 프로브 서열과 거의 동일선상에 있다. 한 측면에서, OLA 검정에 사용되는 야생형 또는 변이체 표적화 프로브와 동일한 서열을 갖는 제1 차단 프로브 및 검출 프로브와 동일한 서열을 갖는 제2 차단 프로브를 포함하지만 5' 포스페이트 또는 3' 표지는 포함하지 않는 한 쌍의 차단 프로브가 사용된다.

한 측면에서, 차단 프로브는 적어도 약 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 및 최대 약 50, 75, 100, 150 또는 200개, 또는 약 20 내지 약 200개, 또는 약 50 및 약 100개의 뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 한 쌍의 차단 프로브가 결찰 반응 혼합물에 포함되며, 제1 차단 프로브는 연결 프로브와 동일한 서열을 갖지만 올리고뉴클레오티드 태그는 갖지 않고; 제2 차단 프로브는 검출 프로브와 동일한 서열을 갖지만 표지는 없다. 한 측면에서, 프로브 서열에 인접한 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 차단 프로브의 5'- 및 3'-엔드에 최대 2, 3, 4 또는 5개의 추가 뉴클레오티드가 부가될 수 있다. 한 측면에서, 상기 키트는 각 올리고뉴클레오티드 프로브 쌍에 대해 적어도 한 쌍의 차단 프로브를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 프라이머 연장 검정에 사용하기 위한 하나 이상의 구성요소를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 프라이머 연장 검정에 사용하기 위한 하나 이상의 표적화 프로브를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 샘플 내 복수의 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 표적 핵산 서열을 포함하는 복수의 프로브를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는, 예를 들어, 중합효소, 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(ddNTP)를 포함하는, 프라이머 연장 검정을 위한 다른 검정 구성요소를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 하나 이상의 표지되거나 표지되지 않은 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 표지되거나 표지되지 않은 디데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함한다.

한 측면에서, 표적화 프로브는 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그; 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 표적화 핵산 서열; 및 표지를 포함한다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 표적화 프로브의 5' 엔드에 부착되고 표적화 핵산 서열은 샘플 내 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열에서 다형성 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드에 상보적인 3' 엔드를 갖는다. 한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 표적화 프로브의 5' 엔드에 부착되고 표적화 핵산 서열은 샘플 내 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열의 다형성 뉴클레오티드에 상보적인 말단 3' 뉴클레오티드를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 키트와 함께 제공된 지지체 표면 상의 포획 올리고뉴클레오티드에 결합하는 올리고뉴클레오티드 태그 및 표적 분석물에 특이적인 결합 파트너를 포함하는 하나 이상의 표적 특이적 프로브를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 올리고뉴클레오티드 태그 및 하나 이상의 표적 분석물의 핵산 서열에 혼성화하는 핵산 서열을 갖는 하나 이상의 표적 특이적 프로브를 포함한다. 한 측면에서, 최종 사용자는 하나 이상의 관심 표적 분석물에 대한 하나 이상의 표적 특이적 프로브를 생성한다.

한 측면에서, 상기 키트는 표지된 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 표지된 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 2차 결합 시약을 포함한다. 한 측면에서, 표지된 뉴클레오시드 트리포스페이트는 2차 결합 시약의 결합 파트너인 1차 결합 시약을 포함한다. 한 측면에서, 2차 결합 시약은 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 항체를 포함하고 표지된 뉴클레오시드 트리포스페이트는 비오틴 또는 합텐 표지를 포함한다. 한 측면에서, 표지된 뉴클레오시드 트리포스페이트는 방사성, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 광흡수, 광산란, 전기화학, 자기 또는 효소 표지를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 전기화학발광 표지로 표지화된 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 표적 뉴클레오티드 서열의 다형성 뉴클레오티드에 상보적인 표지된 디데옥시 뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 멀티 웰 플레이트, 예를 들어, 96웰 플레이트와 같은 지지체 표면을 포함하고, 멀티 웰 플레이트의 각각의 웰은 하나 이상의 결합 도메인에 고정된 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 멀티 웰 플레이트의 각각의 웰은 1 내지 10개의 결합 도메인을 포함하고, 고유 포획 올리고뉴클레오티드가 웰 내 각각의 결합 도메인에 고정된다. 한 측면에서, 상기 키트는 다음 반응 성분 중 하나 이상도 포함한다: 세척 버퍼, 혼성화 버퍼, 표지, 희석제 및 판독 버퍼. 한 측면에서, 세척 버퍼는 티올 함유 화합물을 포함한다. 한 측면에서, 세척 버퍼는 수용액이다. 한 측면에서, 티올 함유 화합물은 수용성이며 분자량이 약 200g/mol, 175g/mol, 150g/mol 또는 125g/mol 미만이다. 한 측면에서, 티올 함유 화합물은 시스테인, 시스테아민, 디티오트레이톨, 3-머캅토프로프리오네이트, 3-머캅토-1-프로판설폰산 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 한 측면에서, 티올 함유 화합물은 시스테인을 포함한다. 한 측면에서, 상기 표지는 전기화학발광 표지를 포함한다. 한 측면에서, 상기 표지는 2차 결합 파트너를 포함한다. 한 측면에서, 상기 표지는 MSD Sulfo-Tag 표지된 스트렙트아비딘을 포함한다.

(c) 증폭 주형;

(d) 핵산 리가아제;

(e) 핵산 중합효소; 및

(f) 표지 및 핵산 서열을 포함하는 검출 시약.

한 측면에서, 상기 키트는 올리고뉴클레오티드 태그 및 고정 올리고뉴클레오티드를 포함하는 고정 시약도 포함한다. 한 측면에서, 고정 시약은 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드는 약 10 내지 약 30개의 핵산 길이이다. 한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드는 17개 또는 25개의 올리고뉴클레오티드 길이이다. 한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드는 5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(서열번호 1669)를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 고정 올리고뉴클레오티드는 5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(서열번호 1665)로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

한 측면에서, 상기 키트는 5' 말단 뉴클레오티드 서열 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열을 갖는 선형 증폭 주형을 포함한다. 한 측면에서, 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 검출 서열에 혼성화할 수 있다. 한 측면에서, 증폭 주형은 고정 시약의 고정 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 내부 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 증폭 주형의 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 내부 서열과 중복되지 않는다. 한 측면에서, 증폭 주형은 고정 시약의 고정 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제1 내부 뉴클레오티드 서열 및 검출 시약의 핵산 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제2 내부 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 증폭 주형의 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 제1 및 제2 내부 서열과 중복되지 않는다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5' 말단 포스페이트 그룹을 포함한다.

한 측면에서, 증폭 주형은 약 53 내지 약 61개의 뉴클레오티드 길이이다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-GTTCTGTC-3'(서열번호 1666)의 5' 말단 서열 및 5'-GTGTCTA-3'(서열번호 1667)의 3' 말단 서열을 갖는다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(서열번호 1668)를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(서열번호 1669)를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'(서열번호 1670)로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 측면에서, 증폭 주형은 5'-GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA-3'(서열번호 1671)를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

한 측면에서, 증폭 주형은 원형 증폭 주형이다.

한 측면에서, 검출 프로브는 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 태그, 단일 가닥 RNA 표적 보체 및 단일 가닥 DNA 검출 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 고정 시약은 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 태그 및 단일 가닥 DNA 고정 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 키트는 RNase를 포함한다.

한 측면에서, 검출 프로브의 검출 올리고뉴클레오티드는 증폭 주형의 5' 말단 서열에 상보적인 제1 서열 및 증폭 주형의 3' 말단 서열에 상보적인 인접한 제2 서열을 포함한다. 한 측면에서, 검출 시약의 핵산 서열은 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(서열번호 1672)의 14개 또는 15개의 연속 뉴클레오티드에 대해 서열 동일성이 적어도 90%인 서열을 갖는다. 한 측면에서, 검출 시약의 핵산 서열은 서열 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(서열번호 1672)를 포함한다. 한 측면에서, 검출 시약의 핵산 서열은 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(서열번호 1668)를 포함한다.

한 측면에서, 검출 시약의 표지는 전기화학발광(ECL) 표지를 포함한다.

한 측면에서, 지지체 표면은 탄소계 지지체 표면을 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 탄소계 전극을 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 카본 잉크 전극을 포함한다. 한 측면에서, 지지체 표면은 멀티 웰 플레이트 검정 소모품을 포함하고, 플레이트의 각 웰은 카본 잉크 전극을 포함한다.

한 측면에서, 지지체 표면은 비드를 포함한다.

한 측면에서, 복수의 포획 올리고뉴클레오티드는 어레이를 형성하기 위해 개별 결합 도메인에서 고상 지지체에 고정된다. 한 측면에서, 복수의 포획 올리고뉴클레오티드 및 적어도 하나의 고정 시약은 어레이를 형성하기 위해 개별 결합 도메인에서 고상 지지체에 고정되며, 각각의 결합 도메인은 복수의 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나 및 적어도 하나의 고정 시약을 포함한다.

(a) 약 40% 내지 약 50%의 GC 함량;

(b) 약 30 내지 약 70%의 AG 함량;

(c) 약 30% 내지 약 70%의 CT 함량;

(d) 3개 이하의 서열의 염기 반복부의 최대 스트링;

(i) 각 엔드에 있는 말단 염기는 상보적으로 일치하고;

한 측면에서, 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드는 하기로부터 선택된다:

(e) 5' 말단 뉴클레오티드 서열 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 증폭 주형, 고정 시약의 고정 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제1 내부 뉴클레오티드 서열 및 검출 시약의 핵산 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제2 내부 뉴클레오티드 서열로서, 상기 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 증폭 주형의 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 제1 및 제2 내부 서열과 중첩되지 않는 선형 증폭 주형;

(f) 핵산 리가아제; 및

(g) 핵산 중합효소.

한 측면에서, 고정 시약은 지지체 표면에 고정된다. 한 측면에서, 고정 시약은 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 태그 및 단일 가닥 DNA 고정 올리고뉴클레오티드를 포함하고; 검출 프로브는 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 태그, 단일 가닥 RNA 표적 보체 및 단일 가닥 DNA 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하고; 키트는 RNase를 추가로 포함한다.

(c) 검출 올리고뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드 서열의 제2 영역에 상보적인 제2 핵산 서열을 포함하는 검출 프로브로서, 상기 표적화 프로브의 제1 핵산 서열 및 상기 검출 프로브의 제2 핵산 서열은 표적 뉴클레오티드의 인접한 서열에 상보적인 검출 프로브;

(d) 증폭 주형;

(e) 핵산 리가아제;

(f) 핵산 중합효소; 및

(g) 표지 및 핵산 서열을 포함하는 검출 시약.

(d) 검출 올리고뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드 서열의 제2 영역에 상보적인 제2 핵산 서열을 포함하는 검출 프로브로서, 상기 표적화 프로브의 제1 핵산 서열 및 상기 검출 프로브의 제2 핵산 서열은 표적 뉴클레오티드의 인접한 서열에 상보적인 검출 프로브:

(f) 핵산 리가아제;

(g) 핵산 중합효소; 및

한 측면에서, 상기 키트는 선형 증폭 주형, 및 결찰 버퍼, 아데노신 트리포스페이트(ATP), 소 혈청 알부민(BSA), Tween 20, T4 DNA 리가아제 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 검출 혼합물을 포함한다. 한 측면에서, 검출 혼합물은 BSA, 버퍼, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP), Tween 20, Phi29 DNA 중합효소 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 회전 환 증폭을 위한 하나 이상의 성분을 포함한다. 한 측면에서, 검출 혼합물은 아세틸-BSA를 포함한다.

한 측면에서, 상기 키트는 ECL 판독 버퍼를 포함한다.

R. 데이터베이스

질환 및 장애의 유전적 연관성에 대한 정보를 제공하고 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본원에 기술된 방법 및 키트와 관련하여 사용될 수 있는 정보 및 서열을 제공하는 다양한 데이터베이스가 이용 가능하다:

유전적 연관성 데이터베이스(Genetic Association Database)

복잡한 질환 및 장애의 유전적 연관성 데이터의 데이터베이스. 데이터베이스는 2014년 9월 1일 현재 "동결" 상태이다. 그러나 2014년 8월 18일 현재 모든 데이터는 텍스트 또는 SQL 형식으로 다운로드할 수 있다.

geneticassociationdb.nih.gov

ClinVar

NCBI 데이터베이스에는 병원성, 돌연변이 유형 등으로 결과를 표시하는 필터가 포함되어 있다.

ncbi.nlm.nih.gov/clinvar?term=human%5Borgn%5D

뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)

관심있는 공통 유전자 목록을 제공한다.

neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/genetic-markers

게놈 보틀(Genome in a bottle, GIAB) (생물학의 계측을 위한 공동 이니셔티브(The Joint Initiative for Metrology in Biology))

전체 인간 게놈 시퀀싱을 임상 실습으로 번역할 수 있는 기술 인프라를 개발하기 위해 NIST가 주관하는 공공-민간-학계 컨소시엄. 고도로 특성화된 기준 물질에 대한 게놈 제공

jimb.stanford.edu/giab-resources/

ENSEMBL 게놈 브라우저(ENSEMBL genome browser)

Ensembl은 게놈 연구를 위한 기준 데이터 세트 및 분석 도구를 생성, 통합 및 배포하는 척추동물 게놈용 게놈 브라우저이다.

ensembl.org/index.html

COSMIC 게놈 브라우저(COSMIC Genome Browser)

암에서 발견되는 체세포 돌연변이 목록을 제공한다.

cancer.sanger.ac.uk/cosmic/browse/genome

NCI 게놈 데이터 커몬즈(NCI Genomic Data Commons)

정밀 의학을 지원하는 암 게놈 연구 전반에 걸쳐 데이터 공유를 가능하게 하는 통합 데이터 저장소를 암 연구 커뮤니티에 제공한다.

portal.gdc.cancer.gov

NCBI 리소스(NCBI Resources)

SNP 및 기타 변형(삽입, 삭제, 전좌 등)을 포함하는 dbSNP 및 dbVAR

ncbi.nlm.nih.gov/snp

ncbi.nlm.nih.gov/dbvar

게놈 변이체 아카이브 데이터베이스(Database of Genomic Variants archive)

모든 종에서 공개적으로 이용 가능한 게놈 구조 변이체의 보관, 접근 및 배포를 제공하는 저장소.

ebi.ac.uk/dgva

IGSR: 국제 게놈 샘플 리소스(The International Genome Sample Resource)

1000 게놈 프로젝트의 저장소

internationalgenome.org/data

InSiGHT 변이체 데이터베이스(InSiGHT variant databases)

InSiGHT는 위장관 암에 기여하는 유전자에서 재배열된 DNA 변이체의 가장 포괄적인 데이터베이스를 보유하고 관리한다.

insight-group.org/variants/databases

The UCSC 게놈 브라우저(The UCSC Genome Browser)

genome.ucsc.edu

S. 참조에 의한 포함

특허, 특허출원, 논문, 교과서 등을 포함하는 본원에 인용된 모든 참고문헌과 거기에 인용된 참고문헌은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

T. 포획 올리고뉴클레오티드

[표 1]

[표 2]

[표 3]

[표 4]

[표 5]

[표 6]

[표 7]

[표 8]

[표 9]

[표 10]

[표 11]

[표 12]

U. 올리고뉴클레오티드 태그

[표 13]

[표 14]

[표 15]

[표 16]

[표 17]

[표 18]

[표 19]

[표 20]

[표 21]

[표 22]

[표 23]

[표 24]

[표 25]

V. 샘플 신호 증폭 시약

표 26은 10-스폿 검정에서 신호를 증폭하는 데 사용할 수 있는 10개의 고정 시약 샘플 세트를 제공하며, 각 고정 시약은 5' 올리고뉴클레오티드 태그 및 3' 고정 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 아래 제공된 세트에서 10개의 고정 시약 각각은 동일한 고정 서열을 포함한다.

표 27은 표 26에 나타낸 10개의 고정 시약 샘플 세트와 관련하여 사용될 수 있는 10-스폿 검정으로부터의 신호를 증폭하는 데 사용될 수 있는 10개의 올리고뉴클레오티드 프로브의 샘플 세트를 제공한다. 한 측면에서, 세트 내 각각의 프로브는 5' 올리고뉴클레오티드 태그, 표적 상보 서열, 폴리 A 링커 및 3' 검출 서열을 포함한다. 한 측면에서, 검출 서열 및 폴리 A 링커는 세트 내 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브에 대해 동일하다.

작업 실시예

본 발명은 본원에 기술된 특정 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기술된 것 이외에 방법의 다양한 변형이 상기 설명 및 수반되는 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 그러한 수정은 청구항 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

실시예 1. 비상호작용 포획 올리고뉴클레오티드의 선택

소프트웨어를 사용하여 100,000 내지 1,000,000개의 뉴클레오티드 서열 그룹을 무작위로 생성하였다. 36-mer의 여러 그룹이 생성되었다. 각 그룹 내에서 GC 함량(40% ≤ GC 함량 ≤ 50%), AG 함량(30% ≤ AG 함량 ≤ 70%) 및 CT 함량(30% ≤ CT 함량 ≤ 70%)에 대한 기준을 충족하지 않는 서열을 제거하였으며, GC(또는 AG 또는 CT) 함량은 G 또는 C(각각 A 또는 G, 또는 C 또는 T)인 뉴클레오티드의 백분율을 나타낸다. 3개의 염기보다 긴 염기 반복부 스트레치가 있는 경우 서열도 제거하였다. 그룹 내에서 일련의 비상호작용 서열을 그룹으로부터 첫 번째 무작위로 선택된 서열로 시작하는 반복 프로세스에서 선택하였다. 추가 서열은 이미 세트에 있는 서열과의 예측된 상호작용 결여를 기반으로 세트에 한 번에 하나씩 부가하였다. 서열이 다음 기준을 충족하는 경우 서열을 세트에 부가하였다: (a) 일렬로 7개 초과의 상보적 염기쌍 일치의 연속 시리즈가 있거나 (b) (ⅰ) 각 엔드에 있는 말단 염기가 상보적으로 일치하고 (ⅱ) 상보적 염기쌍 일치의 합에서 불일치의 합을 뺀 값이 7보다 큰, 18개 이하의 서열을 갖는 서열 자체, 세트의 이전 구성원 또는 세트의 이전 구성원의 보체가 있는 서열의 정렬을 찾을 수 없다. 이 접근법을 사용하여 대략 50 내지 150개의 서열 세트를 확인할 수 있었다(예를 들어, 서열번호 1 내지 64, 65 내지 122 및 123 내지 186). 추가 세트는 원래 세트 중 하나에서 모든 서열의 보체를 역전하거나 찾음으로써 생성될 수 있다(예를 들어, 서열번호 187 내지 250, 251 내지 308, 309 내지 372, 373 내지 436, 437 내지 494, 495 내지 558, 559 내지 622, 623 내지 680 및 681 내지 744). 서열은 자연에서 일치하는 서열을 찾을 확률이 매우 낮을 정도로 충분히 길다. 인간 게놈에 대한 선택된 세트의 BLAST 검색은 20개의 염기쌍보다 긴 일치하거나 상보적인 서열을 찾지 못하였다. 10개 서열의 하위세트 및 세트 중 하나로부터의 30개의 서열(각각 서열번호 1 내지 10, 11 내지 13, 25 내지 26, 33 내지 37, 42, 44 내지 46, 54 및 59 내지 62)을 35-mer 전체 세트에 대한 자유 에너지 분포의 대략 중심에 있는 (35-mer 5' 엔드에서 시작하는 35-mer 서열의 처음 24개의 뉴클레오티드에 상보적인 24-mer 프로브에 대한 혼성화를 위한) 혼성화 자유 에너지를 갖는 것으로 선택하였다(계산된 자유 에너지 범위는 대략 -24 내지 대략 -22kcal/mol)이다. 10개의 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 다음 실시예에서 포획 시약으로서 이들 서열의 사용을 입증하였다.

실시예 2. 포획 올리고뉴클레오티드 어레이의 형성

어레이는 10-스폿 96웰 MULTI-ARRAY® 플레이트(Meso Scale Diagnostics, LLC.)에서 형성하였다. 이 96웰 플레이트는 사출 성형된 96웰 플레이트 상단을 웰의 바닥을 한정하는 마일라 시트에 부착하여 형성한다. 마일라 시트의 상부 표면은 각각의 웰이 대략 웰의 중심에 있는 카본 잉크 작업 전극과 대략 웰의 2개의 에지를 향하는 2개의 카본 잉크 카운터 전극을 포함하도록 인쇄된 스크린 인쇄된 카본 잉크 전극을 갖는다. 작업 전극에는 배열 요소의 위치를 한정하는 노출된 작업 전극의 10개의 대략적인 원형 영역(또는 "스폿")을 정의하는 패턴으로 그 위에 인쇄되는 유전체(즉, 전기 절연 잉크)가 있다. 전도성 스루홀을 통해 시트 상단에 연결된 마일라 시트 하단에 인쇄된 전극은 작업 전극과 카운터 전극에 전압을 인가하기 위한 접점을 제공한다. 예를 들어, 탄소계 전극이 통합된 플레이트에 대한 설명은 미국 특허 제6,977,722호 및 제7,842,246호 참조.

서열번호 1 내지 10의 포획 올리고뉴클레오티드 어레이는 (아래 구조로 나타낸 바와 같이 6-mer 폴리에틸렌글리콜(PEG6) 스페이서를 통해 올리고뉴클레오티드의 3' 엔드에 연결된 n-머캅토프로판올 변형을 사용하여) 전극의 개별 지점에 티올 변형된 포획 올리고뉴클레오티드를 함유하는 50nL 액적을 증착함으로써 인쇄하였다. 인쇄 용액은 인산나트륨, NaCl, EDTA, 트레할로오스 및 Triton X-100을 함유하는 완충 용액에 티올 올리고뉴클레오티드를 포함하고 카본 잉크 표면을 포화시키는 데 필요한 양 대비 과량의 올리고뉴클레오티드와 충분한 Triton X-100을 포함하여 액적이 인쇄된 유전체 잉크층에 의해 한정되는 대로 스폿의 가장자리로 퍼졌다. 액적을 밤새 건조되도록 두었고, 이 시간 동안 올리고뉴클레오티드는 카본 잉크 표면에 결합되었다. 플레이트는 건조제와 함께 밀봉된 파우치에 포장하였다.

실시예 3. 어레이에서 올리고뉴클레오티드를 포획하기 위해 상보적 서열을 갖는 비오틴 표지된 올리고뉴클레오티드를 측정하기 위한 절차

이 절차에서 포획 올리고뉴클레오티드 어레이가 있는 플레이트를 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조하고, 예를 들어, 샌드위치 혼성화 검정, 올리고뉴클레오티드 결찰 검정(OLA) 및 중합효소 연장 검정(PEA)의 비오틴 표지된 생성물을 측정하는 데 사용하였다. 이 절차에는 비특이적 스폿의 교차 오염을 방지하면서 과도한 고정되지 않은 포획 올리고뉴클레오티드를 용해시키기 위해 어레이를 먼저 차단 용액으로 처리하는 초기 차단 단계가 포함되었다. 전체 절차는 다음 단계를 포함하였다.

1. 차단

20mM Tris-HCl 버퍼, pH 8.0(Tris는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄을 지칭함)에 50mM L-시스테인 및 0.1%(w/v) Triton X-100을 함유하는 50uL의 용액을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온(또는 37℃)에서 30 내지 60분 동안 진탕하면서 배양하였다. 인산염 완충 생리식염수(PBS)로 웰을 3회 세척하여 차단 단계를 완료하였다.

2. 샘플 첨가

20mM Tris-HCl, pH 8.0에 31% 포름아미드, 400mM NaCl, 1mM EDTA, 0.01% Triton X-100을 함유하는 버퍼에 비오틴 표지된 생성물을 함유하는 50uL의 테스트 샘플을 각 웰에 첨가하였다. 샘플을 첨가한 후, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하여 엄격한 결합 조건을 제공하고 실온에서 5분 동안 냉각시키고 PBS로 3회 세척하였다.

3. 엄격한 조건하의 고온 침지(선택적)

50uL의 0.1X PBS(염 농도 ~ 15mM)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 30분 동안 진탕하면서 인큐베이션한 후, 플레이트를 실온에서 5분 동안 냉각시키고 PBS로 3회 세척하였다. 이 선택적 단계는, 예를 들어, 비오틴 표지된 OLA 생성물이 잘못된 포획 올리고뉴클레오티드에 비특이적으로 결합하는 것을 최소화하거나 비공유 혼성화 상호작용을 통해 비오틴에 지시 서열이 연결되는 것을 방지함으로써, OLA 검정과 같은 검정에서 개선된 특이성을 제공한다.

4. 2차 결합 시약 첨가

비오틴 표지된 프로브를 검출하기 위해, 500mM NaCl, 1mM EDTA, 0.01% Triton X-100, 20mM Tris-HCl, pH 8.0에 SULFO-TAG ECL 표지(Meso Scale Diagnostics, LLC.)로 표지된 1ug/mL의 스트렙트아비딘을 함유하는 50uL의 용액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 30분 동안 진탕하면서 인큐베이션한 후 PBS로 3회 세척하였다.

5. ECL 검출

ECL 표지로부터 ECL을 측정하기 위해, ECL 공반응물로서 부틸디에탄올아민(BDEA)을 함유하는 150uL의 ECL 판독 버퍼(COMPOSITIONS AND METHODS FOR CARRYING OUT ASSAY MEASUREMENTS라는 제목으로 2019년 1월 3일에 출원된 동시 계류 중인 특허 출원 62/787,892 참조)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 SECTOR Imager 600 또는 QuickPlex SQ120 ECL 플레이트 판독기에서 분석하였다. 플레이트 판독기는 플레이트 하단의 전기 접점에 접촉하고, 각 웰 내의 작업 전극과 카운터 전극에 전압 파형을 적용하고, ECL을 이미지화하고, 각 어레이 요소의 총 ECL 방출에 비례하는 ECL 신호를 보고하였다.

실시예 4. 포획 올리고뉴클레오티드 어레이의 균일성 및 교차 반응성

실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된 다수의 플레이트는 포획 올리고뉴클레오티드(사열번호 745 내지 754)의 (5' 엔드로부터) 처음 24개의 뉴클레오티드에 상보적인 비오틴 함유 QC 프로브 세트를 사용하여 어레이 요소 사이의 교차 반응성 및 코팅의 균일성에 대해 테스트하였다. 선택적 고온 침지 단계 없이 실시예 3에 기술된 절차에 따라 플레이트를 테스트하였다. 사용된 QC 프로브는 아래 구조로 나타낸 바와 같이 비오틴 변형으로 3' 엔드에서 변형된 프로브를 포함하였었다.

코팅의 균일성을 측정하기 위해, 6개 플레이트의 모든 웰을 2pM의 10개의 비오틴 표지된 QC 프로브의 혼합물을 함유하는 샘플과 2nM의 동일한 프로브의 비-비오틴 변형 버전으로 테스트하였다. 각 포획 올리고뉴클레오티드로부터의 ECL 신호에 대해 평균 및 인트라플레이트 변동 계수(CV)를 결정하였다(즉, 주어진 플레이트에서 주어진 지점으로부터의 신호에 대한 평균 및 CV). 6개 플레이트에 걸친 평균 인트라플레이트 CV는 모든 포획 올리고뉴클레오티드에 대해 5% 미만이었고 범위는 3.6% 내지 4.6%였다. 인트라플레이트 신호 평균의 CV는 모든 포획 올리고뉴클레오티드에 대해 6% 미만이었고 범위는 3.5% 내지 5.5%였다.

어레이 특이성(비상보적 서열의 결합 또는 포획 올리고뉴클레오티드 교차 오염으로 인한 교차 반응성 포함)을 측정하기 위해, 200pM의 개별 비오틴 표지된 QC 프로브를 함유하는 샘플을 하나의 플레이트에 첨가하였다(QC 프로브당 8개의 복제물 및 16개의 블랭크 샘플). 각각의 비특이적 포획 뉴클레오티드에 대한 각각의 개별 QC 프로브의 중간 교차 반응성을 각 특이성 샘플의 8개의 복제물에 대해 결정하였으며, 교차 반응성은 각 웰에 대해 프로브와 스폿의 결합으로부터의 신호를 특정 상보적 포획 뉴클레오티드(어떠한 QC 프로브도 없는 경우 비특이적 배경 신호에 대한 보정 후)를 사용한 프로브와 스폿의 결합으로부터의 신호의 백분율로서 계산하였다. 90개의 가능한 비특이적 프로브/포획 상호작용에 대해 81개(90%)의 교차 반응성은 0.01% 이하였고 최대 교차 반응성은 0.03%였다.

실시예 5. 포획 올리고뉴클레오티드에 대한 링커의 비교

모델 12-mer 포획 올리고뉴클레오티드 및 모델 24-mer 포획 올리고뉴클레오티드를 사용하여 탄소계 전극에 올리고뉴클레오티드를 연결하는 데 사용되는 올리고뉴클레오티드와 티올 사이의 상이한 길이의 링커 사용을 비교하였다. 링커는 실시예 2에 기술된 바와 같은 PEG6 스페이서가 있는 링커, 3-mer 폴리에틸렌글리콜(PEG3) 스페이서가 있는 것을 제외한 유사한 링커 및 아래 나타낸 바와 같은 폴리에틸렌글리콜 스페이서가 없는 링커를 포함한다.

포획 올리고뉴클레오티드는 실시예 2에 기술된 바와 같이 96웰 플레이트의 탄소 전극에 고정되었고 혼성화가 포름아미드가 없는 실온에서 수행되었다는 점을 제외하고는 실시예 4에 기술된 것과 유사한 조건 하에서 포획 서열에 상보적인 다양한 농도의 비오틴 변형된 QC 프로브로 테스트하였다. 도 3은 상이한 링커에 대한 웰 내의 프로브 분자 수의 함수로서 측정된 ECL 신호를 나타내고, QC 프로브와 포획 올리고뉴클레오티드의 결합으로부터의 ECL 신호가 12-mer 및 24-mer 포획 올리고뉴클레오티드 링커 둘 다에 대한 링커 길이에 따라 증가함을 입증한다.

실시예 6. 어레이를 제조하기 위한 차단 조건의 비교

어레이로부터 과량의 포획 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위한 차단 조건을 비교하였다. 인쇄된 어레이가 있는 플레이트를 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조하고 차단 용액의 조성을 변화시킨 것을 제외하고는 실시예 4에 기술된 바와 같이 차단 및 세척하였다. 이어서 어레이의 특이성을 실시예 4에 기술된 바와 같이 특성화하였다. 도 4는 다른 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 QC 프로브에 대한 노출로부터 생성된 서열번호 5의 포획 올리고뉴클레오티드를 사용한 스폿에 대한 교차 반응성을 나타낸다. 상기 도면은 차단 단계를 생략하면 상이한 스폿에서 포획 올리고뉴클레오티드의 교차 오염으로 인해 상당한 교차 반응이 관찰됨을 보여준다. PBS에 BSA를 함유하는 기존 차단 용액은 미미한 개선만 제공한다. 관찰된 교차 반응성은 차단 용액으로 Tris + Triton X-100을 사용할 때 크게 개선되었다. Tris/Triton 제형에 시스테인을 첨가하면 교차 반응성이 검출될 수 없는 수준(≤ 0.01%)으로 감소한다. 그러나 제형에 BSA를 첨가해도 동일한 개선이 이루어지지 않았다. 별도의 실험에서, 5 내지 50에서 500mM 범위의 시스테인 농도가 차단에 효과적인 것으로 측정되었고, 또한 시스테인이 아닌 BSA로 차단하면 상보적 포획 올리고뉴클레오티드에 대한 QC 프로브의 원하는 상호작용으로부터 신호를 감소시킬 수 있는 것으로 측정되었다(데이터는 표시되지 않음).

교차 오염을 줄이는 데 유용한 다른 차단제(데이터는 표시되지 않음)는 시스테인과 같은 티올 차단제만큼 효과적이지는 않지만 (ⅰ) PS20, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(~ 1,000kD 및 ~ 360kD), Ficoll 및 폴리에틸렌 글리콜(~ 3kD 및 ~10kD), (ⅱ) 연어 정자 DNA, 청어 DNA, 송아지 흉선 DNA, 전단된 폴리A, 효모 tRNA를 포함한 핵산 및 기타 다중음이온; 및 헤파린, (ⅲ) BSA 및 폴리-BSA를 포함하는 단량체성 및 중합체성 단백질 차단제, (ⅳ) 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS), triton-100 및 tween-20을 포함하는 계면활성제, 및 (ⅴ) 포름아미드 및 프로필렌 글리콜과 같은 수소 결합 불안정화제를 포함하였다.

차단 및 세척 단계는 어레이를 제조하는 동안 및 어레이를 포장하기 전에 수행될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 그러나 어레이를 사용하기 직전에 이 단계를 수행하면 최상의 성능을 얻을 수 있다. 차단 후에도 고정된 올리고뉴클레오티드와의 약한 염기-염기 상호작용을 통해 결합된 일부 느슨하게 결합된 교차 오염 올리고뉴클레오티드가 여전히 있을 수 있다. 이들은 일반적으로 검정에 사용되는 엄격한 혼성화 조건 동안 분리되지만 장기간 어레이에서 건조 및 저장되면 비가역적으로 고정될 수 있다.

실시예 7. 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 결찰 검정(OLA) 절차.

SNP의 검출은 도 1에 도시된 바와 같은 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 수행한다: (ⅰ) 서열번호 745 내지 754로부터 선택된 서열을 포함하는 5' 엔드를 향한 서열을 포함하는 지시 프로브(즉, 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된 어레이 내 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나에 혼성화하는 서열) 및 SNP 부위 및 이로부터의 다운스트림에서 분석물 핵산 서열에 상보적인 3' 엔드의 제1 프로브 서열(이에 3' 엔드는 분석물 내 SNP 뉴클레오티드에 상보적임) 및 (ⅱ) SNP의 바로 업스트림의 분석물 뉴클레오티드 서열에 상보적인 제2 프로브 서열을 갖는 검출 프로브이며 3' 말단에 비오틴 모이어티를 포함한다. 분석물과 리가아제의 존재하에 지시 프로브가 SNP 뉴클레오티드와 일치하는 경우에만 프로브 쌍이 결찰된다. SNP 위치에서 상이한 뉴클레오티드의 수준(예를 들어, 야생형 뉴클레오티드 대 돌연변이체 뉴클레오티드의 수준)을 비교할 때, 각각의 대안으로 지시 프로브가 제공된다. 일부 검정의 경우, SNP에 대한 OLA 지시 및 검출 프로브의 서열은 코딩 영역의 센스 DNA 가닥 서열(BRAF1799, NRAS181 및 NRAS182의 경우)을 포함하는 반면, 다른 검정의 경우 OLA 지시 및 검출 프로브의 서열은 코딩 영역의 안티센스 DNA 가닥 서열을 포함한다(TP53, PIK3CA, KRAS 및 APC의 경우).

각각의 OLA 프로브에 대해 차단 올리고뉴클레오티드 프로브를 개발하였다. 차단 프로브는 분석물 결합 부분의 일치된 서열(즉, 쩨1 또는 제2 프로브 서열)을 사용한다. 일부 경우에, 분석물의 표적 서열에 인접한 상응하는 뉴클레오티드에 상보적인 3' 또는 5' 엔드에 약간(예를 들어, 3개)의 추가 뉴클레오티드가 있을 수 있지만, 이러한 추가 뉴클레오티드는 일반적으로 차단 활성을 제공하는 데 필요하지 않다.

프로브의 성능을 테스트하는 데 사용할 수 있는 각 야생형 및 돌연변이체 표적에 대해 합성 DNA 주형도 생성되었다.

올리고 어레이에서 테스트된 7개의 SNP에 대한 OLA 프로브의 서열은 아래 표 26에 나열되어 있으며 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역은 굵게 표시되어 있다.

[표 26]

OLA 검정 절차는 다음 단계를 포함한다.

1. OLA 반응 혼합물 제조

테스트할 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, PCR 증폭 DNA, 게놈 증폭 DNA 또는 합성 DNA 분석물)을 Taq DNA 리가아제 반응 버퍼(New England Biolabs)에서 각 지시 프로브, 각 검출 프로브 및 500U/mL Taq DNA 리가아제와 조합한다. 대안적으로, HiFi Taq DNA 리가아제 버퍼(New England Biolabs)를 사용하여 결찰 특이성을 개선할 수 있다. 높은 수준의 표적 DNA(PCR 생성물에서와 같이)의 경우, 지시 및 검출 프로브는 각각 5nM 및 100nM이다. 낮은 수준의 표적 DNA의 경우, 상기 프로브는 10nM 및 200nM 농도이다.

2. OLA 반응 실행

열순환기에서 반응 혼합물을 (ⅰ) 95℃에서 2분 동안 가열하고, (ⅱ) 95℃에서 30초 동안 가열하는 과정을 30 사이클 실행한 다음 62℃로 5분(낮은 수준의 표적 DNA의 샘플의 경우) 또는 2분(높은 수준의 표적 DNA의 샘플의 경우) 동안 냉각시키고, (ⅲ) 95℃에서 5분 동안 가열한다. 임의로, 최종 가열 조건 이전에, 제1 및 제2 프로브 서열에 상보적인(또는 이를 포함하는) 차단 프로브는 지시 및 검출 프로브의 비공유 복합체의 재형성을 방지하기 위해 OLA 프로브에 비해 50배 과량이다.

3. ECL 검정으로 OLA 반응 생성물 측정

OLA 반응 생성물을 희석하여 대략 다음 수준의 버퍼 및 염을 함유하는 용액을 제공한다: 20mM Tris-HCl, pH 8.0 중 31% 포름아미드, 400mM NaCl, 1mM EDTA, 0.01% Triton X-100. 이 샘플을 분석하여 실시예 3에 기술된 바와 같이 반응 생성물을 검출한다.

선택적으로, 어떠한 결찰된 생성물도 없는 경우 검정 배경 신호를 결정하기 위해 리가아제를 첨가하지 않고 공정을 반복할 수 있다. SNP 위치에서 여러 대체 뉴클레오티드를 측정할 때, 각각의 특정 신호를 비교하여 각각의 백분율을 결정할 수 있다. 예를 들어, SNP 위치에서 야생형 및 돌연변이체 뉴클레오티드의 수준을 측정할 때 야생형(WT)에 대한 특정 신호는 SS_WT = S_WT - B_WT로서 야생형 지시 프로브를 포획하는 어레이 요소에서 측정된 신호로부터 결정될 수 있으며, SS는 특정 신호, S는 리가아제 존재 시 신호, B는 리가아제 부재 시 배경이다. 마찬가지로 돌연변이체(M)에 대한 특정 신호는 SS_M = S_M - B_M으로 돌연변이 지시 프로브를 포획하는 어레이 요소로부터 결정된다. SNP 위치에서 야생형 또는 돌연변이체인 뉴클레오티드의 백분율은 각각 %WT = SS_WT/(SS_WT + SS_M) 및 %M = SS_M/(SS_WT + SS_M)으로 계산된다. 이러한 비율은, 예를 들어, 게놈 DNA를 분석하여 이형접합성을 확인하는 데 사용할 수 있다. 이형접합성을 측정하기 위한 가능한 %M 문턱값은 %M < 0.2(동형접합 야생형), 0.3 < %M < 0.7(이형접합 돌연변이체) 및 0.8 < %M(동형접합 돌연변이체)이다. 많은 적용의 경우, 배경 보정된 특정 신호(SS) 대신 신호(S)를 사용하여 백분율을 계산할 수도 있다.

실시예 8. OLA를 사용한 합성 DNA 표적에서의 SNP 검출

흑색종 및 결장암을 포함하여 암에서 흔한 다섯 가지 돌연변이 검출을 위해 OLA 검정을 실행하였다: BRAF c.1799T>A(p.V600E); NRAS c.181C>A(p.Q61K); PIK3CA c.1633 G>A(p.E545K), KRAS c. 35G>A(p.G12D) 및 APC c.4348C>T(p.R1450*), 여기서 c.1799T>A는 T에서 A로의 뉴클레오티드 1799의 유전적 돌연변이를 나타내고 p.V600E는 V에서 E로의 코딩된 단백질의 아미노산 600의 생성된 변화를 나타낸다. OLA 검정은 고온 침지 및 차단 프로브를 사용하여 분석물 및 상응하는 지시, 검출 및 차단 프로브(라인 1489-1523)로서 주형 서열을 사용하여 실시예 7에 기술된 바와 같이 실행하였다. 도 5는 BRAF 돌연변이(1799A)에 대한 검정으로부터의 신호를 웰당 첨가된 주형 분자(돌연변이체 또는 야생형) 수의 함수로 나타내고 상기 검정이 야생형에 비해 돌연변이에 대한 특이성이 높음을 입증한다. 도 6은 모든 10개의 검정에 대한 신호를 주형 분자 수의 함수로 나타내고 검정 신호가 주형 농도에 따라 선형으로 증가함을 보여준다. 상이한 검정에 대한 검출 한계는 모두 웰당 약 2 × 10⁵개의 분자였다. 각각의 검정에 대해, 표 27은 올바른 주형의 10⁸개의 복제물 대 SNP 부위에서 단일 불일치가 있는 주형의 10⁸개의 복제물에 대해 측정된 신호를 비교한다. 10⁸개의 주형 분자에 대한 일치된 서열 대 불일치된 서열에 대한 신호의 비율로 제공되는 특이성은 대다수 검정(WT>Mut 치환에 대해 87 내지 629 범위)에 대해 100보다 컸으며 이는 검정이 야생형의 1% 미만 수준에서 희귀 돌연변이를 검출할 수 있아야 함을 나타낸다.

[표 27]

실시예 9. 비특이적 검정 배경을 감소시키기 위한 차단 올리고의 사용.

OLA 검정은 결찰이 발생하기 위해 분석물 DNA(주형)에 대한 프로브의 혼성화가 필요하다. 프로브와 주형은 결찰 이벤트 없이도 혼성화된 상태를 유지할 수 있다. 이 복합체는 (지시 프로브를 통해) 플레이트에 고정된 포획 올리고에 결합할 수 있고 여기에서 브릿징 배경이라고 불리는 신호를 (검출 프로브를 통해) 생성할 수 있다. 하나의 대립유전자가 다른 대립유전자보다 풍부도가 낮은 경우(예를 들어, 희귀 암 돌연변이) 브릿징 배경은 희소 대립유전자 분석물에 대한 결찰 이벤트에서 유래한 신호와 유사할 수 있어서 브릿징 배경이 실제 특정 신호로 잘못 해석되어 돌연변이가 없는 샘플에 대한 위양성 결과를 초래할 수 있다.

브릿징 배경 완화를 위한 접근 방식 중 하나는 고온(95C, 및 4C로의 (또는 얼음 위에서의) 빠른 냉각)에서 DNA 혼성물을 녹이는 것이다. 이 절차는 브릿징 배경 완화에 도움이 되지만 샘플에서 풍부도가 낮은 돌연변이의 검출을 위해 필요한 정도까지는 아니다. 또한, 이 접근법은 제어하기 어렵기 때문에 샘플 취급의 작은 변화(플레이트에 로딩하는 동안 가열 및 취급 후 얼마나 빨리 냉각되는지)가 잠재적으로 배경에 영향을 미치는 원하지 않는 DNA 복합체 형성을 위한 조건을 만들 수 있다.

브릿징 배경 형성을 평가하기 위해, 리가아제가 반응 믹스에 첨가되지 않은 것을 제외하고 실시예 8에 기술된 바와 같이 10-플렉스 OLA 검정(BRAF, NRAS181, PIK3CA, KRAS 및 APC)을 위해 OLA 샘플을 제조하였다. 반응당 10⁹개의 복제물의 합성 주형을 반응 혼합물에 사용하였고, 검정 웰당 반응의 1/10(10⁸개의 복제물/웰)을 실시예 7에 기술된 바와 같이 차단 올리고의 존재 및 부재하에 플레이트에서 테스트하였다.

도 7에서 볼 수 있듯이, 배경은 올리고를 차단하지 않고 테스트한 샘플에 대해 7,000 내지 30,000 카운트 범위였으며, 이는 아마도 잔류 주형에 대한 재혼성화("브릿징")를 통해 지시 프로브를 검출 프로브에 비공유적으로 부착하는 일정 수준 때문일 것이다. 차단 올리고가 있는 경우 동일한 샘플에 대한 배경 신호가 180~550 카운트로 크게 떨어진다. 차단 올리고가 없는 경우, 브릿징 배경은 주형 농도가 증가함에 따라 증가하며(데이터는 표시되지 않음). 높은 주형 농도(예를 들어, 웰당 10⁸개 이상의 복제물)에서 가장 중요해진다. 따라서 차단 프로브는 주형 농도가 높은 실험 조건에 가장 유용하다(예를 들어, 야생형 서열의 높은 배경에서 희귀 암 돌연변이 검출).

실시예 10. OLA 감도 및 특이성에 대한 차단 올리고의 효과.

검정 감도 및 특이성에 대한 차단 올리고의 효과를 평가하기 위해, 세 가지의 OLA 검정을 차단 올리고의 존재 및 부재하에 테스트하였다: BRAF c.1799T>A(p.V600E); NRAS c. 181C>A(p.Q61K); 및 NRAS c. 182A>T(p.Q61L). 실시예 8에 기술된 BRAF 및 NRAS181 검정, 및 실시예 7에 열거된 서열(라인 1524-27)을 사용하는 NRAS182 검정을 위해 합성 주형 및 OLA 프로브를 사용하여 OLA 샘플을 제조하였다. 실시예 7에 기술된 바와 같이 OLA 샘플을 테스트하였다; 최종 가열 단계 전에 차단 올리고를 첨가하거나 첨가하지 않고 각 샘플을 테스트하였다. 각각의 검정에 대해, 표 28은 가열 및 플레이트에 로딩하기 전에 샘플에 첨가된 차단 올리고가 있거나 없는 SNP 부위에서 단일 불일치가 있는 주형의 2×10⁸개의 복제물에 대해 올바른 주형의 2×10⁸개의 복제물에 대해 측정된 신호를 비교한다. 이 표는 차단 올리고의 첨가가 특정 신호(즉, 올바른 지점의 표적에 대한 신호)에 미미한 영향만 미쳤음을 보여주며, 차단 올리고가 검정 감도를 감소시키지 않았음을 보여준다. 상기 표는 또한 잘못된 스폿의 비특이적 신호가 크게 감소하여 특이성이 향상되었음을 보여준다. 10⁸개의 주형 분자에 대한 일치된 서열 대 불일치된 서열에 대한 신호의 비율로 제공되는 특이성은 차단 올리고가 샘플에 첨가되었을 때 최대 15배 향상되었다. 특이성 향상은 차단 올리고가 있는 경우의 특이성을 차단 올리고가 없는 경우의 특이성으로 나누어 계산하였다.

[표 28]

실시예 11. OLA 형식에서 비특이적 배경을 줄이기 위한 고온 침지 또는 차단 프로브의 사용

실시예 3에서 비오틴 표지된 올리고뉴클레오티드를 포획하고 측정하는 절차는 비특이적 혼성화 반응을 최소화하기 위해 엄격한 조건(높은 온도 포함)에서 혼성화를 수행한다. 그러나 혼성화 후 플레이트 세척 전에 플레이트를 냉각시키면 세척 단계를 통해 지속될 수 있는 일부 비특이적 혼성화 반응이 발생할 수 있는 덜 엄격한 조건 하에서 약간의 시간이 제공된다. 이 효과를 완화하기 위한 한 가지 접근 방식은 4℃로 (또는 얼음 위에서) 빠르게 냉각시켜 비특이적 혼성화의 동역학을 늦추는 것이지만 플레이트 냉각 타이밍을 제어하기 어려울 수 있다. 따라서, 관찰된 비특이적 혼성화를 개별적으로 또는 동시에 크게 감소시키는 것으로 밝혀진 두 가지 다른 접근법, 즉 차단 프로브의 사용 및 고온 침지 단계의 사용을 개발하였다.

10-플렉스 OLA 검정은 5개의 상이한 SNP: NRAS c.182A>T, TP53 c.524G>A, PIK3CA c.1633G>A, KRAS c.35G>A 및 APC c.4348C>T의 야생형 및 돌연변이체 형태를 측정하기 위해 실시예 2에 기술된 플레이트를 사용하여 개발하였다. OLA 샘플은 실시예 7의 서열표(라인 1526-36)로부터의 NRAS 182 및 TP53에 대한 추가 서열과 함께 실시예 8에 기술된 바와 같이 PIK3C, KRAS 및 APC에 대한 합성 주형 및 OLA 프로브를 사용하여 제조하였다. 이 검정에서, KRAS SNP 분석을 위한 비오틴 표지된 검출 프로브는 결찰이 없을 때 해당 스폿에서 상승된 배경 신호로 이어지는, 포획 올리고뉴클레오티드 어레이의 스폿 6에서 포획 올리고뉴클레오티드와 약한 상호작용을 하는 것으로 밝혀졌다. 도 8은 상기 검정을 실시예 7에 기술된 바와 같이 실행하지만 분석물 또는 리가아제가 없고 차단 올리고뉴클레오티드 또는 고온 침지 단계를 사용하지 않았을 때 스폿 6에 대해 관찰된 상승된 배경 신호를 보여준다.

차단 올리고뉴클레오티드는 OLA 프로토콜 동안 결찰 단계가 완료될 때 (OLA 프로브에 비해 50배 과량으로) 첨가되었지만 최종 95℃ 변성 단계 전에 첨가되었다. 도 8은 차단 프로브의 첨가가 비특이적 결합 수준을 크게 감소시켰음을 보여준다.

고온 침지 단계는 포획 올리고뉴클레오티드 어레이에 대한 OLA 생성물의 인큐베이션 및 과량의 결합되지 않은 시약을 제거하기 위한 어레이의 세척 후에 수행한다. 사용된 고온 침지는 엄격한 조건 - 저염(0.1X PBS) 및 승온(37℃) - 하에 추가 30분 인큐베이션으로 약하게 결합된 뉴클레오티드를 분리한 다음 씻어낸다. 도 8은 차단 프로브와 같이 고온 침지 단계가 비특이적 결합 수준을 크게 감소시켰음을 보여준다. 차단 프로브와 고온 침지 단계를 모두 사용하면 더 큰 감소를 달성할 수 있다. 차단 프로브 및 고온 침지 단계는 OLA 생성물의 실제 신호에 큰 영향을 미치지 않았다(데이터는 표시되지 않음).

실시예 12. 전체 게놈 증폭(WGA) 생성물 및 증폭되지 않은 게놈 DNA에서 돌연변이를 검출하기 위한 OLA의 사용

BRAF 또는 NRAS 유전자의 돌연변이와 관련하여 이형접합성 세포주를 표 29에 나타낸 바와 같이 ATCC 수집물로부터 선택하였다.

[표 29]

세포주 A2058 및 NCI-H1299의 DNA를 REPLI-g 증폭 키트(QIAGEN), 10ng/반응을 사용하여 전체 게놈 증폭(WGA)에 적용하였다; 세포주 HL-60로부터의 DNA를 증폭 없이 OLA 반응에 사용하였다. OLA 검정은 상기 실시예 8에 기술된 바와 같이 수행하였다. 2개의 WGA DNA 샘플을 BRAF, NRAS181, PIK3CA, KRAS 및 APC 검정으로 테스트하였고, HL60 gDNA를 BRAF, TP53, PIK3CA KRAS 및 NRAS182 검정으로 테스트하였다. 5-15ug의 DNA 샘플을 OLA 반응에 사용하였고 2-6ug은 ECL 검정 웰에 사용하였다.

각각의 샘플에 대해 수행된 각각의 검정에 대해, 표 30-32는 표적 돌연변이를 갖는 측정된 서열 %(실시예 7에 기술된 바와 같이 계산됨)를 나타낸다. 측정된 돌연변이 백분율이 20% 미만이면 동형접합성 야생형 샘플로 분류하고, 30% 내지 70%의 돌연변이 백분율은 이형접합성(50% 돌연변이)으로 분류하며, 80% 초과의 돌연변이 백분율은 동형접합성 돌연변이로 분류하였다. 표들은 각 세포주가 예측된 유전자형에 따라 올바르게 분류되었음을 보여준다.

[표 30]

[표 31]

[표 32]

실시예 13. PCR 생성물 검출을 위한 OLA의 사용

야생형 배경에서 낮은 수준의 돌연변이를 모방하는 BRAF c.1799T>A 및 NRAS c. 181C>A 돌연변이에 대한 모의 암 샘플을 생성하기 위해, 상이한 ATCC 세포주로부터의 게놈 DNA(표 29)를 미리 지정된 수준으로 혼합하여 0 내지 50% 범위의 돌연변이체 수준을 생성하였다. 표에 나타낸 바와 같이, 각 세포주는 흑색종에서 흔히 볼 수 있는 세 가지 돌연변이 중 하나에 대해 이형접합성이었다: BRAF c.1799T>A(p.V600E); NRAS c. 181C>A(p.Q61K). BRAF c.1799T>A 샘플을 생성하기 위해, 세포주 A2058 및 NCI-H1299의 게놈 DNA를 혼합하였다. NRAS c. 181C>A 샘플을 생성하기 위해, 세포주 A2058 및 NCI-H1299의 게놈 DNA를 혼합하였다. NRAS 및 BRAF 앰플리콘은 각 모의 암 샘플에 대해 중합효소 연쇄 반응(PCR)(35 사이클, 10ng의 게놈 DNA 투입)에 의해 생성되었다.

돌연변이체 및 야생형 SNP에 대한 올리고뉴클레오티드 결찰 검정을 실시예 8에 기술된 바와 같이 PCR 증폭된 샘플에 대해 수행하였다. PCR 생성물을 희석하고 OLA 믹스 20ul당 0.01ul를 사용하였다; 검정 웰당 OLA 생성물의 1/10을 플레이트에서 테스트하였다(0.001ul의 PCR 생성물/검정 웰). 결과는 돌연변이체 뉴클레오티드가 있는 각 SNP의 백분율을 계산하는 데 사용하였다. (세포주 DNA의 혼합물에 기초한) 돌연변이체 뉴클레오티드의 예측된 백분율의 함수로서 계산된 백분율은 표 33 및 34와 도 9에 제공되어 있다. 상기 도면 및 표는 계산된 비율이 예측된 비율에 근접함을 보여주며, 또한 거의 모든 검정에서 0.2%만큼 낮은 돌연변이율이 순수한 야생형 샘플과 구별될 수 있음을 보여준다.

[표 33]

[표 34]

실시예 14. 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 검출하기 위한 중합효소 연장 검정(PEA) 절차

SNP의 검출은 도 2에 도시된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 수행한다: 서열번호 745 내지 754로부터 선택된 서열(즉, 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된 어레이 내 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나에 혼성화하는 서열)을 포함하는 5' 엔드를 향한 서열을 포함하는 지시 프로브 및 SNP 부위로부터 다운스트림의 분석물 핵산 서열에 상보적인 3' 엔드의 제1 프로브 서열(이에 3' 엔드가 상기 분석물에서 SNP 뉴클레오티드로부터 다운스트림 위치의 뉴클레오티드에 싱보적임). 분석물, 중합효소 및 SNP 부위에 상보적인 비오틴 변형 디데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트(ddNTP)가 있는 경우, 지시 프로브는 비오틴 변형 뉴클레오티드를 포함하도록 연장된다. SNP 위치에서 상이한 뉴클레오티드의 수준을 비교할 때(예를 들어, 야생형 뉴클레오티드 대 돌연변이체 뉴클레오티드의 수준), 반응은 SNP 위치에서 뉴클레오티드에 대한 적절한 ddNTP로 상이한 웰에서 반복된다.

PEA 검정 절차는 다음 단계를 포함한다:

1. PEA 반응 혼합물 제조

테스트할 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, PCR 증폭 DNA, 전체 게놈 증폭 DNA 또는 합성 DNA 분석물)을 50nM 지시 프로브, 관심 SNP 뉴클레오티드에 상보적인 2uM의 각 비오틴-ddNTP 및 표지되지 않은 ddNTP 및 ThermoPol® 반응 버퍼 중 120U/mL의 Therminator™ DNA 중합효소와 조합한다.

2. PEA 반응 실행

열순환기에서 반응 혼합물을 (ⅰ) 96℃에서 2분 동안 가열하고, (ⅱ) 95℃에서 30초 동안 가열하는 과정을 30 사이클 실행한 다음 30초 동안 55℃로 냉각시키고 30초 동안 72℃로 가열한다.

3. ECL 검정에 의한 PEA 반응 생성물 측정

PEA 반응 생성물을 희석하여 대략 다음 수준의 버퍼 및 염이 있는 용액을 제공한다: 31% 포름아미드, 400mM NaCl, 1mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.0 중 0.01% Triton X-100. 이 샘플을 분석하여 실시예 3에 기술된 바와 같이 반응 생성물을 검출한다.

중합효소가 없는 상태에서 선택적으로 측정을 반복하여 연장된 프로브가 없는 배경 신호를 결정할 수 있다. 실시예 7에 OLA 형식에 대해 기술된 바와 같이, 주어진 SNP 위치에서 상이한 뉴클레오티드를 검출하는 검정에 대한 신호 또는 배경 보정된 특이적 신호의 비교는 각각의 뉴클레오티드를 갖는 샘플 내 핵산의 백분율을 평가하는 데 사용될 수 있다.

실시예 15. 합성 DNA 표적에서 SNP 검출을 위한 PEA의 사용

프라이머 연장 검정(PEA)의 올리고뉴클레오티드 프로브는 흑색종에서 흔히 발생하는 세 가지 돌연변이의 검출을 위해 설계되었다: BRAF c.1799T>A(p.V600E); NRAS c. 181C>A(p.Q61K); 및 NRAS c. 182A>T(p.Q61L). 관심있는 각 SNP 위치에 대해 지시 프로브가 생성되었다. 초기 프로토타입 포획 어레이는 이전 실시예의 어레이와 관련하여 사용하였다. 지시 프로브는 캡에 표시된 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역과 함께 아래 표 35에 나열되어 있다.

[표 35]

상이한 포획 서열의 사용을 제외하고, 분석물로서 주형 서열을 사용하여 실시예 14 및 3에 기술된 바와 같이 검정을 실행하였다. 이 실험에서는 고온 침지 단계를 사용하지 않았다. 도 10은 웰당 첨가된 주형 분자(돌연변이체 또는 야생형) 수의 함수로서 BRAF 돌연변이(1799A)에 대한 검정으로부터의 신호를 나타내고 상기 검정이 야생형에 비해 돌연변이에 대해 특이성이 높음을 입증한다. 도 11은 주형 분자 수의 함수로서 6개 검정 모두에 대한 신호를 보여주고(각 검정에 대한 올바른 주형 사용) 검정 신호가 주형 농도에 따라 선형으로 증가함을 입증한다. 상이한 검정에 대한 검출 한계는 모두 웰당 약 5 × 10⁵개의 분자였다. 각각의 검정에 대해, 표 36은 올바른 주형의 10⁸개의 복제물 대 SNP 부위에서 단일 불일치가 있는 주형의 10⁸개의 복제물에 대해 측정된 신호를 비교한다. 10⁸개의 주형 분자에 대한 일치된 서열 대 불일치 서열에 대한 신호의 비율로 제공되는 특이성은 대략 10² 내지 10³의 범위였으며, 이는 검정이 야생형의 1% 미만 수준에서 희귀 돌연변이를 검출할 수 있어야 함을 나타낸다.

[표 36]

실시예 16. PCR 생성물 검출을 위한 PEA의 사용

NRAS 및 BRAF 앰플리콘을 표 29에 제시된 ATCC 세포주로부터 추출된 게놈 DNA를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)(35 사이클, 60ng의 게놈 DNA 투입)으로 생성하였다. 표에서 볼 수 있듯이, 각 세포주는 흑색종에서 흔히 볼 수 있는 세 가지 돌연변이 중 하나에 대해 이형접합성이었다: BRAF c.1799T>A(p.V600E); NRAS c. 181C>A(p.Q61K); 또는 NRAS c. 182A>T(p.Q61L). 야생형 배경에서 낮은 수준의 돌연변이를 모방하는 모의 암 샘플을 만들기 위해 세포주 DNA를 미리 지정된 수준으로 혼합하여 0 내지 50% 범위의 돌연변이 수준을 만들었다. BRAF를 생성하기 위해 c. 1799T>A 샘플, 세포주 A2058 및 NCI-H1299로부터의 게놈 DNA를 혼합하였다. NRAS를 생성하기 위해 c. 181C>A 샘플, 세포주 A2058 및 NCI-H1299로부터의 게놈 DNA를 혼합하였다. NRAS를 생성하기 위해 c. 182A>T 샘플, 세포주 A2058 및 HL-60로부터의 게놈 DNA를 혼합하였다.

돌연변이체 및 야생형 SNP에 대한 프라이머 연장 검정을 실시예 15에 기술된 바와 같이 샘플에 대해 수행하였다. 각각의 샘플에 대해, PCR 생성물의 두 가지 상이한 희석액을 테스트하였다. 결과를 돌연변이체 뉴클레오티드가 있는 각 SNP의 백분율을 계산하는 데 사용하였다. (세포주 DNA의 혼합물을 기준으로 한) 돌연변이체 뉴클레오티드의 예측된 백분율의 함수로서의 계산된 백분율은 표 및 그래픽 형식으로 제공된다: BRAF 1799T>A 결과(표 37 및 도 12); NRAS 181C>8 결과(표 38 및 도 13); NRAS 182A>T 결과(표 39, 도 14). 상기 도 및 표는 계산된 비율이 예측된 비율에 근접함을 보여주며, 또한 거의 모든 검정에서 0.2%만큼 낮은 돌연변이율이 순수한 야생형 샘플과 구별될 수 있음을 보여준다.

[표 37]

[표 38]

[표 39]

실시예 17. 낭포성 섬유증(CF) 돌연변이를 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 결찰 검정(OLA)

낭포성 섬유증(CF)은 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절인자(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR) 유전자의 돌연변이로 인해 발생한다. 가장 일반적인 돌연변이인 ΔF508은 단백질의 508번째 위치에서 아미노산 페닐알라닌(F)의 손실을 초래하는 3개의 뉴클레오티드의 결실이다(Δ는 결실을 나타냄). ΔF508 돌연변이는 전 세계 CF 사례의 2/3(66-70%), 미국 사례의 90%를 차지한다. ΔF508 돌연변이는 북유럽 혈통의 사람들에게서 가장 높은 비율을 보인다. 다음으로 가장 흔한 돌연변이는 G542X 돌연변이로 미국에서 CF 사례의 약 5%를 차지한다.

CF 돌연변이는 실시예 7에 기술된 방법을 사용하여 검출할 수 있다. CF 돌연변이 검출을 위한 OLA 프로브는 표 40에 나열되어 있다. 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역은 굵게 표시되어 있다.

[표 40]

실시예 18. BRCA 돌연변이를 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 결찰 검정(OLA)

BRCA 돌연변이는 종양 억제 유전자인 BRCA1 또는 BRCA2 유전자의 생식계열 돌연변이이다. 이 유전자의 돌연변이는 감염된 사람에게 유전성 유방암-난소암 증후군을 일으킬 수 있다. 이러한 유전자의 일반적인 돌연변이는 BRCA1*185delAG(엑손 2), BRCA1*5382insC(엑손 20) 및 BRCA2*6174delT(엑손 11)를 포함한다.

BRCA 돌연변이는 실시예 7에 기술된 방법을 사용하여 검출할 수 있다. BRCA 돌연변이 검출을 위한 OLA 프로브는 표 41에 열거되어 있다. 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역은 굵게 표시되어 있다.

[표 41]

실시예 19. 폐암 SNP 패널

폐암 발병 위험 증가와 관련된 9개의 SNP 패널을 개발하였다. 이러한 돌연변이는 다음과 같다:

- rs1801133(MTHFR C677T)

- rs1801270(CDKN1A c.93C>A)

- rs3842 (ABCB1 c.*193A>G)

- rs1051730(CHRNA3 D398N)

- rs8034191(LOC123688 또는 HYKK c.337+256T>C)

- rs212090(ABCC1 c.*866T>A)

- rs2273535(AURKA F31I)

- rs17879961(CHEK2 c.599T>C)

- rs2243828(MPO c.-764T>C)

각각의 돌연변이에 사용된 프로브 서열은 아래 표 42(업스트림) 및 43(다운스트림)에 제공되어 있다.

[표 42]

[표 43]

각 돌연변이에 대한 프로브를 테스트하기 위해, 제1 또는 제2 가닥으로부터의 프로브를 선택하고 HL-60 세포주에서 추출한 DNA에 대해 테스트하였다. Gentra Puregene Cell Kit(Qiagen Cat# 158388)를 사용하여 DNA를 추출하고 MyTaq HS Master Mix(Bioline Cat# BIO-25045), 및 각각 표 44 및 45에 제시된 검정 특이적 PCR 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 10ng DNA를 증폭시켰다.

[표 44]

[표 45]

증폭 후, 실시예 7에 기술된 바와 같이 OLA를 수행하고 WT 및 돌연변이체 대립유전자의 빈도를 측정하였다. 각 SNP에 대한 결과를 표 46에 나타냈다.

[표 46]

실시예 20. RNase 보호 검정을 사용한 miRNA 검출

RNase 보호 검정은 miRNA 정량화에 사용할 수 있다. 검정에서, 포획 올리고뉴클레오티드 서열 및 miRNA 상보적 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 태그 서열을 함유하는 DNA/RNA 키메라 프로브를 사용한다. 올리고뉴클레오티드 태그 서열은 키메라 프로브의 5' 엔드에 포함된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 서열일 수 있고 miRNA 상보적 서열은 말단 3' 비오틴과 함께 키메라 프로브의 3' 엔드의 단일 가닥 RNA(ssRNA) 서열일 수 있다. miR-122에 대한 서열은 표 47에 제시되어 있고 키메라 프로브는 표 48에 제시되어 있다.

간단히 말하면, miRNA는 다음과 같이 검출할 수 있다:

1). miRNA를 열 순환기에서 키메라 프로브에 혼성화하여 혼성화 생성물을 형성한다.

2). 하나 이상의 공지된 차단제를 사용하여 검정 플레이트를 차단한다.

3). 혼성화 생성물의 올리고뉴클레오티드 태그 서열이 검정 플레이트 상의 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 조건하에 차단된 검정 플레이트에 포름아미드와의 혼성화 생성물을 첨가한다. 37℃에서 인큐베이션한다.

4). RNase A 또는 RNase I(30℃ - 37℃)로 ssRNA의 온플레이트 분해를 수행하여 다음을 분해한다:

a). 프로브에 혼성화되지 않은 ssRNA;

b). 상보적 miRNA 없이 플레이트에 혼성화된 프로브; 및

c). 키메라 프로브에 대한 단일 염기 불일치만큼 작은 RNA;

5). SULFO-TAG 표지된 스트렙트아비딘(SA-SULFO-TAG™)(Meso Scale Diagnostics, LLC, Rockville, MD)을 첨가하고 실온에서 인큐베이션한다.

6). 판독 버퍼 B를 검정 플레이트에 첨가하고 MSD Imager로 ECL 신호 생성을 측정한다; 및

7). 정량화를 위해 검량선과 결과를 비교한다.

위의 프로토콜은 합성 miR-122 miRNA를 검출하는 데 사용하였다. 결과는 miR-122가 160fM 농도에서 검출되었음을 보여주며, 이는 동일한 miRNA의 500fM 검출을 달성한 Rissin 등, PLOS One (2017)에 의해 보고된 결과보다 개선되었음을 나타낸다.

[표 47]

[표 48]

실시예 21. 세 가지 프로토콜을 사용한 ASO 검출(RNase 보호, Taq DNA 리가아제를 사용한 OLA 및 T4 DNA 리가아제를 사용한 OLA)

모델 DNA ASO(GGC TAA ATC GCT CCA CCA AG; 서열번호 1646)는 RNase 보호 검정, Taq DNA 리가아제가 있는 OLA 및 T4 DNA 리가아제가 있는 OLA의 세 가지 상이한 프로토콜을 사용하여 검출되었다. 세 가지 프로토콜 모두에 사용된 버퍼는 다음과 같다: 차단 버퍼는 Tris-HCl, 세제 및 시스테인을 함유하고; 혼성화 버퍼 1("HB1")는 Tris-HCl, 세제, EDTA, 염 및 포름아미드를 함유하며; 세 가지 프로토콜 모두에서 사용된 혼성화 버퍼 2("HB2")는 Tris-HCl, 세제 및 EDTA를 함유하고; 희석 버퍼는 세제인 Tris-HCl, EDTA 및 염을 함유하였다.

A. RNase 보호 검정

캘리브레이터와 2개의 블랭크 사이에 4배 희석으로 10-포인트 검량선을 설정하였다. 최고 캘리브레이터(Cal-1) 농도는 166pM(~1 × 10⁸개의 복제물/μL)이었다. 분석물 또는 캘리브레이터는 혈장이 가장 가능성이 높은 샘플 유형인 사용자 사례 시나리오를 입증하기 위해 물 또는 혈장에 원래 희석되었다. 시작 샘플 크기는 20μL였다.

혈장 샘플에 2X RNAsecure(20μL)를 첨가하고 혼합물을 10분 동안 60℃로 가열하였다. 이어서 키메라 프로브가 포함된 5X 마스터 믹스를 샘플에 첨가하였다(10μL). 샘플은 다음 프로토콜을 사용하여 프로브에 혼성화하였다: 80℃ - 2분; 65℃ - 5분(이어서 각각 5분 동안 1℃씩 50℃로 낮춤); 37℃ - 유지.

플레이트를 혼성화 동안 37℃에서 30분 동안 차단 버퍼로 차단하였다. 혼성화된 생성물을 혼성화 버퍼 2에서 75μL로 희석하고 20μL의 혼성화 버퍼 1을 함유하는 2개의 웰에 30μL를 첨가하였다(2:3 비율의 HB1:HB2/샘플). 플레이트에 대한 혼성화를 37℃에서 1시간 동안 수행하였다.

RNase Ⅰ을 플레이트에 첨가하고 37℃에서 3분 동안 분해를 완료하였다. 스트렙트아비딘 A-SULFO-TAG(희석 버퍼 중)를 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 검정 판독 버퍼를 첨가하고 플레이트를 판독하였다.

B. Taq DNA 리가아제를 사용한 OLA

캘리브레이터와 2개의 블랭크 사이에 4배 희석으로 10-포인트 검량선을 설정하였다. 최고 캘리브레이터(Cal-1) 농도는 166pM(~1 × 10⁸개의 복제물/μL)이었다. 분석물 또는 캘리브레이터는 혈장이 가장 가능성이 높은 샘플 유형인 사용자 사례 시나리오를 입증하기 위해 물 또는 혈장에 원래 희석되었다. 시작 샘플 크기는 10μL였다.

프로브, Taq DNA 리가아제 및 Taq 리가아제 버퍼가 함유된 2X 마스터 믹스를 만들었다. OLA 전에 각 샘플(10μL)과 물(15μL)에 25μL를 첨가하였다. OLA 사이클링을 다음과 같이 수행하였다: 95℃ - 2분; 95℃ - 30초; 37℃ - 5분; 4℃ - 유지.

플레이트를 사이클링 동안 37℃에서 30분 동안 차단 버퍼로 차단하였다. OLA 생성물을 혼성화 버퍼 2에서 75μL로 희석하고 20μL의 혼성화 버퍼 1을 함유하는 2개의 웰에 30μL를 첨가하였다(2:3 비율의 HB1:HB2/샘플). 플레이트에 대한 혼성화를 37℃에서 1시간 동안 수행하였다. 혼성화 후 스트렙트아비딘-SULFO-TAG(희석 버퍼 중)를 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 검정 판독 버퍼를 첨가하고 플레이트를 판독하였다.

C. T4 DNA 리가아제를 사용한 OLA

프로브와 T4 DNA 리가아제 버퍼로 2X 마스터 믹스를 만들고 샘플에 첨가하였다(20μL). 샘플을 2분 동안 95℃까지 상승시키고 50% 상승률로 65℃까지 냉각시킨 다음 3% 상승률(ramp rate)로 4℃까지 냉각시킴으로써 프로브에 혼성화하였다. T4 DNA 리가아제를 첨가하고 실온에서 결찰을 30분 동안 완료하였다. 효소는 65℃에서 10분 동안 인큐베이션하여 불활성화시켰다.

플레이트를 결찰/비활성화 동안 37℃에서 30분 동안 차단 버퍼로 차단하였다. 결찰 생성물을 혼성화 버퍼 2에서 75μL로 희석하고 20μL의 혼성화 버퍼 1을 함유하는 2개의 웰에 30μL를 첨가하였다(2:3 비율의 HB1:HB2/샘플). 플레이트에 대한 혼성화를 37℃에서 1시간 동안 수행하였다. 혼성화 후, 스트렙트아비딘-SULFO-TAG(희석 버퍼 중)를 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하였다. 검정 판독 버퍼를 첨가하고 플레이트를 판독하였다.

실시예 22. 2개의 프로토콜을 사용한 ADA 검출(1단계 및 2단계)

안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 항-약물 항체(ADA)를 검출하기 위한 두 가지 방법을 개발하였다. 동일한 표적화 프로브 및 검출 프로브는 두 방법 모두에서 사용할 수 있다. 표적화 프로브는 12-mer 올리고뉴클레오티드 태그 서열 GAZA(서열번호 1647) 또는 24-mer 올리고뉴클레오티드 서열 ACTGGTAACCCAGACATGATCGGT(서열번호 745) 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열(ASO)을 포함할 수 있다. 원하는 경우 올리고뉴클레오티드 태그 서열과 ASO 사이에 스페이서 서열이 포함될 수 있다. 검출 프로브는 비오틴 표지 및 표적화 프로브와 함께 사용되는 동일한 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.

A. "1단계"

"1단계" ADA 검출 방법의 개략도는 도 19에 나와 있다.

간단히 말하면, 적어도 약 250nM 표적화 프로브 및 적어도 약 250nM 검출 프로브는 폴리프로필렌 플레이트에서 표적화 및 검출 프로브 상의 ASO에 대한 항-약물 항체(ADA)를 포함할 수 있는 샘플과 조합되어 혼합물을 형성한다. 혼합물을 1시간 동안 진탕(700rpm)하면서 실온에서 인큐베이션하여 ADA가 샘플에 존재하는 경우 표적화 프로브 및 검출 프로브 상의 ASO에 결합하도록 한다.

올리고뉴클레오티드 태그 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지는 포획 올리고뉴클레오티드가 웰당 50μL의 N-PLEX 차단제로 차단된 96웰 N-PLEX 플레이트(MSD)를 37℃에서 30분 동안 진탕(700rpm)하면서 인큐베이션한다. 이어서 플레이트를 세척하고 폴리프로필렌 플레이트의 혼합물 50μL를 N-PLEX 플레이트의 각 웰로 옮기고 실온에서 1시간 동안 진탕(700rpm)하면서 인큐베이션하여 혼합물 중 표적화 프로브의 올리고뉴클레오티드 태그가 플레이트에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화하도록 한다. 플레이트를 세척하여 혼합물로부터 결합되지 않은 종을 제거하고 희석액에 있는 50μL의 스트렙트아비딘-SULFO-TAG를 N-PLEX 플레이트의 각 웰에 첨가하고 30분 동안 진탕(700rpm)하면서 실온에서 인큐베이션하여 스트렙트아비딘-SULFO-TAG가 플레이트에 고정된 임의의 검출 프로브 상의 비오틴 부분에 결합하도록 한다. 플레이트를 세척하고 150μL의 MSD 판독 버퍼를 플레이트의 각 웰에 첨가하고 ADA의 존재를 확인한다.

ADA에 대해 테스트 중인 샘플에 상당한 수준의 ASO 약물도 함유되어 있는 경우(예를 들어, 샘플이 약물을 투여받았지만 아직 제거되지 않은 환자의 것인 경우), 샘플의 ASO는 ADA와 복합체로 존재할 수 있다. 이것이 발생하면 순환하는 ASO는 ADA와 표적화 및 검출 프로브의 결합을 차단하고 검정에 의한 ADA 검출을 방해할 수 있다. 한 측면에서, 검정은 샘플에 존재하는 ASO가 ADA의 측정을 방해하는 수준을 결정하기 위해 샘플에서 ASO의 존재에 대한 검정의 감도를 결정하기 위해 테스트된다. 한 측면에서, 검정이 샘플에서 ASO로부터의 방해에 민감한 경우, 방법은 검정을 수행하기 전에 샘플에서 ASO를 ADA로부터 분리하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 한 측면에서, 분리는 샘플을 ASO와 ADA 사이의 결합 상호작용을 변성시키거나 달리는 불안정화시키지만 ADA의 온전성을 유지하는 조건에 노출시킴으로써 달성된다. 한 측면에서, 분리는 샘플을 산성화함으로써 달성된다. 한 측면에서, 분리는 샘플을 염기성화함으로써 달성된다. 한 측면에서, 분리는 샘플을 가열함으로써 달성된다. 한 측면에서, 분리는 변성제를 샘플에 첨가함으로써 달성된다. 한 측면에서, 샘플은, 예를 들어, 산성화되거나 염기성화된 샘플을 중화함으로써, 가열된 샘플을 냉각시킴으로써 또는 변성제로 처리된 샘플을 희석함으로써 ADA-ASO 복합체의 형성을 안정화시키는 조건하에 표적화 및 검출 프로브와 조합된다. 한 측면에서, ASO는 테스트 전에 샘플에서 선택적으로 붕해된다. 한 측면에서, ASO는 핵산 및 단백질의 상이한 성질에 기초하여 선택적으로 붕해된다. 한 측면에서, ASO는, 예를 들어, 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제 또는 다른 비특이적 뉴클레아제, 포스포릴라아제 또는 포스포모노에스테라아제와 같은 포스포디에스테르 결합을 가수분해할 수 있는 효소를 사용하여 효소적으로 선택적으로 붕해된다. 한 측면에서, ASO는 효소적으로 붕해되지만 프로브 붕해는 검정을 수행하기 전에 뉴클레아제를 억제함으로써 방지된다.

한 측면에서, 예를 들어, 양성 대조군 항체를 함유하는 샘플에서 상이한 농도의 ASO를 스파이킹함으로써, 순환하는 ASO로부터의 방해를 평가하기 위해 표적화 및 검출 프로브 상의 ASO에 특이적으로 결합하는 양성 대조군 ADA가 사용된다. 또 다른 측면에서, 표적화 프로브 및 검출 프로브의 ASO 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 양성 대조군 올리고뉴클레오티드는 검정 조건을 최적화하기 위해 사용된다(도 20).

B. "2단계"

"2단계" ADA 검출 방법의 개략도는 도 21에 나와 있다.

올리고뉴클레오티드 태그 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지는 포획 올리고뉴클레오티드가 50μL/웰의 N-PLEX 차단제로 차단된 96웰 N-PLEX 플레이트(MSD)를 37℃에서 30분 동안 진탕(700rpm)하면서 인큐베이션한다. 이어서 플레이트를 세척하고 혼성화 버퍼에 적어도 약 250nM 표적화 프로브를 함유하는 혼합물 50μL를 N-PLEX 플레이트의 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 진탕(700rpm)하면서 인큐베이션한다. 표적화 프로브의 올리고뉴클레오티드 태그는 플레이트에 혼성화된 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화된다. 이어서 플레이트를 세척하고 희석액과 조합된 표적화 및 적어도 약 250nM 검출 프로브 상의 ASO에 대한 항-약물 항체(ADA)를 포함할 수 있는 50μL의 샘플을 N-PLEX 플레이트의 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 진탕(700rpm)하면서 인큐베이션하여 ADA가 존재하는 경우 플레이트에 고정된 표적화 프로브의 ASO에 특이적으로 결합하도록 한다. 이어서 플레이트를 세척하고 희석액 중 50μL의 검출 프로브를 웰당 N-PLEX 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 진탕(700rpm)하면서 인큐베이션하여 검출 프로브의 ASO가 플레이트에 고정된 ADA에 결합할 수 있도록 한다. 플레이트를 세척하고 희석액 중 50μL의 스트렙트아비딘-SULFO-TAG를 N-PLEX 플레이트의 각 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 진탕(700rpm)하면서 인큐베이션하여 스트렙트아비딘이 플레이트에 고정된 검출 프로브의 비오틴 모이어티에 결합하도록 한다. 플레이트를 세척하고 웰당 150μL의 MSD 판독 버퍼를 첨가하고 ADA의 존재를 확인한다.

ADA에 대해 테스트 중인 샘플에 상당한 수준의 ASO 약물도 함유되어 있는 경우(예를 들어, 샘플이 약물을 투여받았지만 아직 제거되지 않은 환자의 것인 경우), 샘플의 ASO는 ADA와의 복합체로 존재할 수 있다. 이것이 발생하면 순환하는 ASO는 ADA와 표적화 및 검출 프로브의 결합을 차단하고 검정에 의한 ADA 검출을 방해할 수 있다. 한 측면에서, 검정은 샘플에 존재하는 ASO가 ADA의 측정을 방해하는 수준을 결정하기 위해 샘플에서 ASO의 존재에 대한 검정의 감도를 결정하기 위해 테스트된다. 한 측면에서, 검정이 샘플에서 ASO로부터의 방해에 민감한 경우, 방법은 검정을 수행하기 전에 샘플에서 ASO를 ADA로부터 분리하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 한 측면에서, ASO와 ADA 사이의 결합 상호작용을 변성시키거나 달리는 불안정화시키는 조건에 샘플을 노출시킴으로써 분리가 달성된다. 한 측면에서, 분리는 샘플을 산성화함으로써 달성된다. 한 측면에서, 분리는 샘플을 염기성화함으로써 달성된다. 한 측면에서, 분리는 샘플을 가열함으로써 달성된다. 한 측면에서, 분리는 변성제를 샘플에 첨가함으로써 달성된다. 한 측면에서, 샘플은, 예를 들어, 산성화되거나 염기성화된 샘플을 중화함으로써, 가열된 샘플을 냉각시킴으로써 또는 변성제로 처리된 샘플을 희석함으로써 ADA-ASO 복합체의 형성을 안정화시키는 조건하에 표적화 및 검출 프로브와 조합된다.

한 측면에서, ASO는 테스트 전에 샘플에서 선택적으로 붕해된다. 한 측면에서, ASO는 핵산 및 단백질의 상이한 성질에 기초하여 선택적으로 붕해된다. 한 측면에서, ASO는, 예를 들어, 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제 또는 다른 비특이적 뉴클레아제, 포스포릴라아제 또는 포스포모노에스테라아제와 같은 포스포디에스테르 결합을 가수분해할 수 있는 효소를 사용하여 효소적으로 선택적으로 붕해된다. 한 측면에서, ASO는 효소적으로 붕해되지만 프로브 붕해는 검정을 수행하기 전에 뉴클레아제를 억제함으로써 방지된다.

한 측면에서, 예를 들어, 양성 대조군 항체를 함유하는 샘플에서 상이한 농도의 ASO를 스파이킹함으로써 순환하는 ASO로부터의 방해를 평가하기 위해 표적화 및 검출 프로브 상의 ASO에 특이적으로 결합하는 양성 대조군 ADA가 사용된다. 또 다른 측면에서, 표적화 프로브 및 검출 프로브의 ASO 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 양성 대조군 올리고뉴클레오티드는 검정 조건을 최적화하기 위해 사용된다(도 20).

실시예 23. 연장된 검출 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)의 검출

MSD의 N-PLEX 플랫폼을 사용한 올리고뉴클레오티드 검출은 전통적으로 프로브 또는 프라이머에 통합된 비오티닐화 올리고를 사용하여 수행되었으며, 이는 스트렙트아비딘 표지된 SULFO-TAG™을 사용하여 검출된다. 이 실시예에서 RNase 보호 검정의 신호는 모델 20-mer 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)에 대한 새로운 키메라 프로브를 사용하여 프로브의 비오틴을 검출 올리고뉴클레오티드로 교체하여 증폭되었다. 5' 엔드에 DNA 올리고뉴클레오티드 태그(5' ACTGGTAACCCAGACATGATCGGT 3')(서열번호 745), 이어서 RNA 표적 상보 서열(5' CUUGGUGGAGCGAUUUAGCC 3')(서열번호 1663)과 3' 엔드에 DNA 검출 서열(5' GACAGAACTAGACAC 3')(서열번호 1664)을 포함하는 (도 24에 나타낸) 키메라 프로브가 생성되었다, 5' 엔드에 DNA 올리고뉴클레오티드 태그(5' ACTGGTAACCCAGACATGATCGGT3')(서열번호 745) 및 DNA 고정 서열(5' AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA 3')(서열번호 1665)을 포함하는 (도 24에 나타낸) 고정 시약이 생성되었다.

방법론은 도 122 개략적으로 도시되어 있고 아래에 설명되어 있다.

예를 들어, 실시예 21에 기술된 바와 같이, 모델 ASO를 사용하여 검량선을 생성하였다.

상술한 키메라 프로브 및 고정 시약을 모델 ASO 분석물을 포함하는 샘플에 첨가하고 혼성화하여 반응 생성물(ASO/프로브 복합체)을 형성하였다.

포획 올리고뉴클레오티드가 고정된 MSD N-PLEX 플레이트를 차단 버퍼로 37℃에서 30분 동안 차단하고 Dulbecco의 인산염 완충 생리식염수를 함유하는 세척 버퍼(1x DPBS)로 세척하였다. 반응 생성물(ASO/프로브 복합체)을 포함하는 샘플을 MSD N-PLEX 플레이트에 첨가하고 ASO/프로브 복합체를 N-PLEX 플레이트에 혼성화하기 위해 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 엄격한 세척 단계(37℃에서 30분 동안 0.1x DPBS, 약 700rpm에서 진탕) 전에 1x DPBS로 세척하였다. 이어서 플레이트를 세척하고(1x DPBS) RNase Ⅰ을 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 결합되지 않은 프로브, 즉 플레이트에 고정되었지만 ASO에 혼성화되지 않은 프로브에서 RNA를 붕해하였다. 이어서 플레이트를 세척하고(1x DPBS) 강화 시약(E1: 선형 주형; E2: 아세틸-BSA; 및 E3: T4 리가아제)을 첨가하고 RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 MSD 세척 버퍼(PBS-T)로 세척하고 검출 시약(D1)과 Phi29 중합효소(D2)를 첨가하고 27℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 MSD 세척 버퍼(PBS-T)로 세척하고 MSD GOLD 판독 버퍼를 첨가하여 ASO의 존재를 검출하였다.

RNase 보호 검정과 함께 N-PLEX에 S-PLEX를 사용하면, 배경 신호의 증가와 양성 신호의 증가가 관찰되었지만 ASO의 검출 한계가 10배 이상 증가하였다.

실시예 24: 연장된 검출 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)의 검출

이 실시예에서는 실시예 23으로부터의 ASO를 엄격한 세척 단계가 생략된 수정된 검정을 사용하여 검출하였다. 결과는 실시예 23에서 사용된 검정의 결과와 유사하였다.

실시예 25. 올리고뉴클레오티드 결찰 검정(OLA) 및 연장된 검출 서열을 사용한 안티센스 올리고뉴클레오티드(OLA)의 검출

이 실시예에서는 실시예 23으로부터의 모델 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)를 연장된 검출 서열을 이용한 올리고뉴클레오티드 결찰 검정(OLA)을 사용하여 검출하였다.

간단히 말하면, Taq DNA 리가아제 반응 버퍼에서 모델 ASO를 지시 프로브(본원에서는 표적 프로브라고도 함) 및 검출 프로브와 조합하여 OLA 반응 혼합물을 제조하였다. OLA 반응은 반응 생성물을 생성하기 위해 열순환기에서 실행하였다.

우리는 또한 이것이 올리고뉴클레오티드 결찰 검정(OLA) 매개된 ASO 검출을 위한 실행 가능한 옵션임을 확립할 수 있었다.

SEQUENCE LISTING <110> MESO SCALE TECHNOLOGIES, LLC. <120> KITS FOR DETECTING ONE OR MORE TARGET ANALYTES IN A SAMPLE AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME <130> 0076-0050WO1 <140> PCT/US2021/048854 <141> 2021-09-02 <150> 63/073,635 <151> 2020-09-02 <160> 1675 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 accgatcatg tctgggttac cagttagtcg tgtctc 36 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2 tcgtcttgaa ccaatgacca aatgcaagcc ctccat 36 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 3 atacgagggc acaggagcta ttagtgtagc gaaagg 36 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial 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<220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 39 gtagatccct acattcagaa atgcgtctgt tgacgg 36 <210> 40 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 40 gtgtgctaag tgcgcgaata taatagcaag tagttg 36 <210> 41 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 41 cgcaagcaga taatgagtta gttaggcaca catcat 36 <210> 42 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 42 agtatcacgc tcctaggctt gtaacagatt ggctag 36 <210> 43 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 43 ccatacaatt cgtcaatcta tgtgacactg tccacc 36 <210> 44 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 44 acatgacggg ttgctcaaca taagacgtta ctcagc 36 <210> 45 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 45 cggcggttaa taaacgtaac gacatgagtg tccctg 36 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 46 tttcaagtat ttccgacatt cctgcctagt tccgcg 36 <210> 47 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 47 ttcgtaacta gactagcgta cgtcgctata ggtctt 36 <210> 48 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 48 agtggaattc ggtgccgcgt ataaatcaac tgactg 36 <210> 49 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 49 tttgcctcat ccttacacaa gacaccttct cctaca 36 <210> 50 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 50 gatatcaaca acccaccctg ccttatcttc gtgtat 36 <210> 51 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 51 ccagatatag ttaaattagc tgcgcgtgta catacg 36 <210> 52 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 52 tgaatattac ccgtcccgcg accttcaatg agtcgt 36 <210> 53 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 53 tcatcaattg ggacatgtta ttcctccgta agcttg 36 <210> 54 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 54 ttatagaaca aagtcaaggg ccgtgcgtaa ttcggg 36 <210> 55 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 55 gcctcagtag gccctaagtt aacatcagct atgtac 36 <210> 56 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 56 agcaggccaa tggagtggta attcatcttg gcctca 36 <210> 57 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 57 taagtgtcgg ctcatatcta aagcagacgg acataa 36 <210> 58 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 58 cattgatatg atgatcctcg agccggtcga acttac 36 <210> 59 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 59 ggaagtactg gcgtctttcg acgcttatca aactac 36 <210> 60 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 60 aatatacgag aaacccataa gatagcgcgc attcgt 36 <210> 61 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 61 aacagctact acctgggtct taatgcggag gttgga 36 <210> 62 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 62 cccactgatc taacatgagg ccggtgggat ttgaaa 36 <210> 63 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 63 ccgacctcgt actaaccgct gccctgataa agaatt 36 <210> 64 <211> 36 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tggagcgtaa gccttggagc cttgatctag aatgaa 36 <210> 94 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 94 cgaagcgtct taaccttaga actttccagt gagtgg 36 <210> 95 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 95 cgaacattca gggttctggt tcgtcagtcg cctaaa 36 <210> 96 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 96 tcctcaatcg ctctacatcc gaggagcaag atacaa 36 <210> 97 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 97 tgtgttggga cggtaatgag gacacaatcg atcagt 36 <210> 98 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 98 agcttactca aacaagttag cactgaaggc tacaca 36 <210> 99 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 99 tcgaattgca gcaccgacct tgtgagtcct aaacat 36 <210> 100 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 100 agcgaagtga gagagaatgg tgatccgtgt gattat 36 <210> 101 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 101 tggaccggaa gggttaatcg tatgcggcat gaacaa 36 <210> 102 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 102 aatagggact ctaactcaat ctcgtgacag cataca 36 <210> 103 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 103 aggctcgtca aatggtcaaa ccttcacaaa caactc 36 <210> 104 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 104 ggaccgttct actcgacgaa cttacacttg gtcgta 36 <210> 105 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 105 tgcgacagtt gctacatgtc ctcttaccac ccttca 36 <210> 106 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 106 gccgtgaatc gtgctttgga tgctcaatat acacta 36 <210> 107 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 107 ctatctgcta ctcagagaaa cgaggttcag gatctc 36 <210> 108 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 108 gatcctggga ttattgatgt ggcacccaaa cgcaag 36 <210> 109 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 109 gcggaaccac agctttctta ggttgcatca atttag 36 <210> 110 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 110 atctgtgcgg tagatgcacg tcattagtct actata 36 <210> 111 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 111 ccgacgttat tcgattcggg aaacagactg tgcttc 36 <210> 112 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 112 tctggcgctg ggtagtaacg taacacagtt taatta 36 <210> 113 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 113 agtgggcgca gaacaaccgc agttaagata acacta 36 <210> 114 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 114 cgtacgtagg gacaccgaca tgagatataa cataga 36 <210> 115 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 115 catttcgccg tcttcgtaac aacaacggcg tttcgt 36 <210> 116 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 116 acgagtgacg gagtgactgg gtttggaatt atgctt 36 <210> 117 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 117 gtacttcagc gcggtgcgtg tagcatgaga attatc 36 <210> 118 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 118 tggctcttga acacgtaacg aactatcaat gcggtt 36 <210> 119 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 119 ttaaacaata agatcccaga acggagcctg gcccaa 36 <210> 120 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 120 atgaacactc tccatcttgc actaagtcag gaagca 36 <210> 121 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 121 ccctcagatt ctgtgattcc actttatagg acacgg 36 <210> 122 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 122 gacatcatat acgtgaacag caggagaacc aatacg 36 <210> 123 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 123 gctactgtgg agagggtttg tgaatctagg agcaca 36 <210> 124 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 124 acagcaatgc tagggagcaa taaacataac catcca 36 <210> 125 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 125 gagacgttct ctttccattt ggatcatttc ggaccg 36 <210> 126 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 126 aaccagaagt tgtggcccat actcgtttac tgggtg 36 <210> 127 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 127 gcgaatcgta actccaccac agagtacgac gatttg 36 <210> 128 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 128 cggtcgtagc ccttatattc gctcagtacg attgac 36 <210> 129 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 129 ggttccgctt gcgaccgttt agatgtttca gaacag 36 <210> 130 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 130 ggctgttcgc gtgatacgtc gtaaacctag atagtc 36 <210> 131 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 131 aaccatgtct agtatttgtc acgtcctgta tgaccg 36 <210> 132 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 132 tgtacttcgc cacacctgtc cttgtggttt gcctaa 36 <210> 133 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 133 actagggtcc ttcagagccg gtagatgtat ggcata 36 <210> 134 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 134 tttacactgg tatagggacg gtgtgtagcc gagcta 36 <210> 135 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 135 gtgggttaaa tatgatttgg aggacgagac gcgcat 36 <210> 136 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 136 aaagttctga cggctattcg cagtttccac ggaact 36 <210> 137 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 137 agattgcctt cgtgtgcaga atagcggcat cgtctt 36 <210> 138 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152 tcccgtgctc aattgcgatt actacaaaga gtagcc 36 <210> 153 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 153 tcaatttctc gccggagttt gccactgctt cctatg 36 <210> 154 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 154 atcactatac tatggacgca tggagagtgg gtatcc 36 <210> 155 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 155 cacggtttga ttagatgcaa tagcgttggc tgaatg 36 <210> 156 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 156 ctactctctg aatacattat ccgagtgggc gaggtt 36 <210> 157 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 157 ccgctggtaa gttgattgtg caacccgtaa ccttta 36 <210> 158 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 158 aggaataaag cgacataaga agagcatgca ctcttg 36 <210> 159 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 159 ctgactccta agtgatgaga acatatagcc cacagg 36 <210> 160 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 160 aatcgttcgt tagtgctacg ccttcactta agctat 36 <210> 161 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 161 caacctgtat cggagaccat ttgtaatcac atcgcc 36 <210> 162 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 162 atcaacgttt gcaataagat tcagctggag tagagc 36 <210> 163 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 163 actatgctcc ggtaatgggt cattagattc gaagga 36 <210> 164 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 164 ctacatcgac gaatgctttg tccactatta acgtcg 36 <210> 165 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 165 ttatcgtggt gtgataactg atttgctttc gggagt 36 <210> 166 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 166 ggatctacag tgactctatc gggttgggta gttctt 36 <210> 167 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 167 attcctgacc ggatggctgt aggacatagt tgtaag 36 <210> 168 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 168 atgctgacgc tgaggtacgc taacaggaca aatcca 36 <210> 169 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 169 acaattagcg gccatatctg ttaagtcatt cctccg 36 <210> 170 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 170 tgcataaaga atcctcggag tagttggatc ctgatg 36 <210> 171 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 171 ggacaggcca gttaaacatt gcgggaagct taacta 36 <210> 172 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 182 tcagtctgta tggagtatcg gcacttccac atcctg 36 <210> 183 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 183 tgcgggcaat agtagcttgg atctcgtgca attagg 36 <210> 184 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 184 aattccggtt taccgtcgct cacatttcct ggagac 36 <210> 185 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 185 agttgtgttg tgcgaaatta ggcggatgct acggga 36 <210> 186 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 186 acgttgcctg gctgagtgtg ttaatgatgt ctcgat 36 <210> 187 <211> 36 <212> DNA 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206 atccgcatcg tctacccgac ttaaatcacg gtactg 36 <210> 207 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 207 ctcagagaat acccaaatcc ggtataacgt agagac 36 <210> 208 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 208 agttaccgaa ccgctttccc gcagtctcaa agaaag 36 <210> 209 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 209 atatgaaacg ggcactgagc caagccgtgt aagtac 36 <210> 210 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 210 gtgcgattac tcgttattta cctacagaac accgag 36 <210> 211 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 211 ttgggtacta aaggccaggt tcgcttggga tgttac 36 <210> 212 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 212 ccgtatttat aattcgcgac tgttgcagca ctaccc 36 <210> 213 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 213 gagctcactg tgtatgtgtg tgataaatga ctgact 36 <210> 214 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 214 tggtccgaga tgcgaagggt gatgagcatc tttgaa 36 <210> 215 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 215 agaaactgta agagggacag gcgcactcga gactat 36 <210> 216 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 216 gttgccagta aagtaataca ggtagatcgc gtagga 36 <210> 217 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 217 caagaaggat tgtgtgacgg atcagcttcc gcagaa 36 <210> 218 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 218 ccgataagta ttggttgtat tcaagcggcg gaacca 36 <210> 219 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 219 gaattgagtt gaagcgtact gctcgtaaac gctcac 36 <210> 220 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 220 gttcagacga tttggcgttc caacaataac accctg 36 <210> 221 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 221 ccagcaagga ttcgatgttg aaagttcatt tgagcg 36 <210> 222 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 222 actgcacaat tcctaagaag catctgccca atacca 36 <210> 223 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 223 cgctgaccta atcgtaaatt tcgtgcatgg caagat 36 <210> 224 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 224 gtcctgcgga gagcgggttc ctgtttaagt agtata 36 <210> 225 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 225 ccgtcaacag acgcatttct gaatgtaggg atctac 36 <210> 226 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 226 caactacttg ctattatatt cgcgcactta gcacac 36 <210> 227 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 227 atgatgtgtg cctaactaac tcattatctg cttgcg 36 <210> 228 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 228 ctagccaatc tgttacaagc ctaggagcgt gatact 36 <210> 229 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 229 ggtggacagt gtcacataga ttgacgaatt gtatgg 36 <210> 230 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 230 gctgagtaac gtcttatgtt gagcaacccg tcatgt 36 <210> 231 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 231 cagggacact catgtcgtta cgtttattaa ccgccg 36 <210> 232 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 232 cgcggaacta ggcaggaatg tcggaaatac ttgaaa 36 <210> 233 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 233 aagacctata gcgacgtacg ctagtctagt tacgaa 36 <210> 234 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 234 cagtcagttg atttatacgc ggcaccgaat tccact 36 <210> 235 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 235 tgtaggagaa ggtgtcttgt gtaaggatga ggcaaa 36 <210> 236 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 236 atacacgaag ataaggcagg gtgggttgtt gatatc 36 <210> 237 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 237 cgtatgtaca cgcgcagcta atttaactat atctgg 36 <210> 238 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 238 acgactcatt gaaggtcgcg ggacgggtaa tattca 36 <210> 239 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 239 caagcttacg gaggaataac atgtcccaat tgatga 36 <210> 240 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 240 cccgaattac gcacggccct tgactttgtt ctataa 36 <210> 241 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 241 gtacatagct gatgttaact tagggcctac tgaggc 36 <210> 242 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 242 tgaggccaag atgaattacc actccattgg cctgct 36 <210> 243 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 243 ttatgtccgt ctgctttaga tatgagccga cactta 36 <210> 244 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 244 gtaagttcga ccggctcgag gatcatcata tcaatg 36 <210> 245 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 245 gtagtttgat aagcgtcgaa agacgccagt acttcc 36 <210> 246 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oligonucleotide" <400> 265 agatagacac gtcggatgat ataccacgct gttatt 36 <210> 266 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 266 aaggaattcg ctcgctgcag ttgaccttct acatac 36 <210> 267 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 267 tacctagtgg agggacctat acaagtcaaa tagcga 36 <210> 268 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 268 gtagagtttg ataagaatcg ggtaccaacc cacttt 36 <210> 269 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 269 gacaggttga tgatggttct agacaactaa tgcgtc 36 <210> 270 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 270 accttccatg gcattgaccc tgatggtgtt aatagt 36 <210> 271 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 271 ttcgcagcct atgcgttcac atggacctaa ctcgta 36 <210> 272 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 272 atatatacag cggcaacagg tgaaagacct tgacta 36 <210> 273 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 273 gtcggcctaa gcaatactcg ggcgtgctaa taatat 36 <210> 274 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 274 atcgacgata cccgacacaa cgccacgtag attcat 36 <210> 275 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 275 gggctagcaa tgtttattcg tccacggtga gtaact 36 <210> 276 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 276 tcatgcacat gtctgtagct tcaagtttcg cgaggg 36 <210> 277 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 277 acctgtccat ccagacagta agtagaggaa tcagtc 36 <210> 278 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 278 gagtctagcc agattggtgt catcctgcct gattgt 36 <210> 279 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 279 ttcattctag atcaaggctc caaggcttac gctcca 36 <210> 280 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 280 ccactcactg gaaagttcta aggttaagac gcttcg 36 <210> 281 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 281 tttaggcgac tgacgaacca gaaccctgaa tgttcg 36 <210> 282 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 282 ttgtatcttg ctcctcggat gtagagcgat tgagga 36 <210> 283 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 283 actgatcgat tgtgtcctca ttaccgtccc aacaca 36 <210> 284 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 284 tgtgtagcct tcagtgctaa cttgtttgag taagct 36 <210> 285 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 285 atgtttagga ctcacaaggt cggtgctgca attcga 36 <210> 286 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 286 ataatcacac ggatcaccat tctctctcac ttcgct 36 <210> 287 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 287 ttgttcatgc cgcatacgat taacccttcc ggtcca 36 <210> 288 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 288 tgtatgctgt cacgagattg agttagagtc cctatt 36 <210> 289 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 289 gagttgtttg tgaaggtttg accatttgac gagcct 36 <210> 290 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 290 tacgaccaag tgtaagttcg tcgagtagaa cggtcc 36 <210> 291 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 291 tgaagggtgg taagaggaca tgtagcaact gtcgca 36 <210> 292 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 292 tagtgtatat tgagcatcca aagcacgatt cacggc 36 <210> 293 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 293 gagatcctga acctcgtttc tctgagtagc agatag 36 <210> 294 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 294 cttgcgtttg ggtgccacat caataatccc aggatc 36 <210> 295 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 295 ctaaattgat gcaacctaag aaagctgtgg ttccgc 36 <210> 296 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 296 tatagtagac taatgacgtg catctaccgc acagat 36 <210> 297 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 297 gaagcacagt ctgtttcccg aatcgaataa cgtcgg 36 <210> 298 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 298 taattaaact gtgttacgtt actacccagc gccaga 36 <210> 299 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 299 tagtgttatc ttaactgcgg ttgttctgcg cccact 36 <210> 300 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gattcacaaa ccctctccac agtagc 36 <210> 310 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 310 tggatggtta tgtttattgc tccctagcat tgctgt 36 <210> 311 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 311 cggtccgaaa tgatccaaat ggaaagagaa cgtctc 36 <210> 312 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 312 cacccagtaa acgagtatgg gccacaactt ctggtt 36 <210> 313 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 313 caaatcgtcg tactctgtgg tggagttacg attcgc 36 <210> 314 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 314 gtcaatcgta ctgagcgaat ataagggcta cgaccg 36 <210> 315 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 315 ctgttctgaa acatctaaac ggtcgcaagc ggaacc 36 <210> 316 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 316 gactatctag gtttacgacg tatcacgcga acagcc 36 <210> 317 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 317 cggtcataca ggacgtgaca aatactagac atggtt 36 <210> 318 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 318 ttaggcaaac cacaaggaca ggtgtggcga agtaca 36 <210> 319 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 319 tatgccatac atctaccggc tctgaaggac cctagt 36 <210> 320 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 320 tagctcggct acacaccgtc cctataccag tgtaaa 36 <210> 321 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 321 atgcgcgtct cgtcctccaa atcatattta acccac 36 <210> 322 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 322 agttccgtgg aaactgcgaa tagccgtcag aacttt 36 <210> 323 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 323 aagacgatgc cgctattctg cacacgaagg caatct 36 <210> 324 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 324 aattcccgtt aagacgagcc cgtatcgcct tggaat 36 <210> 325 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 325 tgtgtagaca ataacgtctg tcaggcgagg cttata 36 <210> 326 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 326 ttctatagct aagtgtagat gggcgttaag ccagca 36 <210> 327 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 327 ttgagctatt tactatgtgc ggtttataac ctcccg 36 <210> 328 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 328 ttacaggtat tagctgctgc tcacaggcga actgat 36 <210> 329 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 329 gtctgttcat cccaggtata cgtagttgat accttt 36 <210> 330 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 330 cgacgttgtt caaactcata gaaactatcc ctggag 36 <210> 331 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 331 atccttgggt gcttacagac agttcgtcaa atagag 36 <210> 332 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 332 gaaagtacgg ccgagacact ttccttcata taactc 36 <210> 333 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 333 caagacagcc ctatatttgt gggtacacga ccagac 36 <210> 334 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 334 ggccaaagta aagactggtt tcgctatctg gatgtt 36 <210> 335 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 335 ttgcagttca agaaatggtg gatcgagcgc tttagt 36 <210> 336 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 336 gcaatcctat gacgcccagt gttagactac atgtcc 36 <210> 337 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 337 taacagcaca gtccaggttg aagcgagttc gaagat 36 <210> 338 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 338 ggctactctt tgtagtaatc gcaattgagc acggga 36 <210> 339 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 344 caagagtgca tgctcttctt atgtcgcttt attcct 36 <210> 345 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 345 cctgtgggct atatgttctc atcacttagg agtcag 36 <210> 346 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 346 atagcttaag tgaaggcgta gcactaacga acgatt 36 <210> 347 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 347 ggcgatgtga ttacaaatgg tctccgatac aggttg 36 <210> 348 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 348 gctctactcc agctgaatct tattgcaaac gttgat 36 <210> 349 <211> 36 <212> DNA 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tgctgtgcta ccgaaggtat attctg 36 <210> 364 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 364 taacccgttt gaaagcgcga tgatcaacag tttcgg 36 <210> 365 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 365 gaatttgcta gctcccagac aagatcgccg agtcat 36 <210> 366 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 366 ttagagggcc ataccaacac tttaacgtag tgaccc 36 <210> 367 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 367 cgatctgatt cggcacggat ccataacggt gttgaa 36 <210> 368 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 368 caggatgtgg aagtgccgat actccataca gactga 36 <210> 369 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 369 cctaattgca cgagatccaa gctactattg cccgca 36 <210> 370 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 370 gtctccagga aatgtgagcg acggtaaacc ggaatt 36 <210> 371 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 371 tcccgtagca tccgcctaat ttcgcacaac acaact 36 <210> 372 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 372 atcgagacat cattaacaca ctcagccagg caacgt 36 <210> 373 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 373 ctctgtgctg attgaccatt gggtctgtac tagcca 36 <210> 374 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 374 tacctcccga acgtaaacca gtaaccaagt tctgct 36 <210> 375 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 375 ggaaagcgat gtgattatcg aggacacggg agcata 36 <210> 376 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 376 atttgactac gccaccgttg tctttagtcc accact 36 <210> 377 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 377 tgtacagtac ttatctacgg cgacgtccat accttt 36 <210> 378 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 378 caaatctgag gttgagggac acccactcga attacc 36 <210> 379 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 379 atatacgtga gagaccaggc aacaccagga agattg 36 <210> 380 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 380 gctcactgcc atttaggcag ctgatcggac tcttaa 36 <210> 381 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 381 cgtctctggt tgtctcctga cgatttccaa acatcc 36 <210> 382 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 382 ctcagcctac cagcatggta acttagacct ctggaa 36 <210> 383 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 383 gagccttcct cttaaggagt gtctcttgtc tgtcaa 36 <210> 384 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 384 ttgcgaccct ctgtaatttg ctgttaccaa tgcact 36 <210> 385 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 385 ttggcaagta gcagccctat cgtagtagac cgtatc 36 <210> 386 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 386 ttctggtgtg agcttatcca tcaacactgc atccct 36 <210> 387 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 387 cggatatttc tcgggcgaac caatcgatct atcgtg 36 <210> 388 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 388 agatgcgcag ccgtgatacc gtcattggga atcata 36 <210> 389 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 389 acggacacct atgaaccaca gatctttctt tgtgga 36 <210> 390 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 390 gaggctaatt gactttcgtt tgcaacgagg cagagc 36 <210> 391 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 391 ggatggtaga ggtttgtgaa atacattcta aggcag 36 <210> 392 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 392 taggcgtagc agatgggctg aatttagtgc catgac 36 <210> 393 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 393 gagtctctta tgggtttagg ccatattgca tctctg 36 <210> 394 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 394 tcaatggctt ggcgaaaggg cgtcagagtt tctttc 36 <210> 395 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 395 tatactttgc ccgtgactcg gttcggcaca ttcatg 36 <210> 396 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 396 cacgctaatg agcaataaat ggatgtcttg tggctc 36 <210> 397 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 397 aacccatgat ttccggtcca agcgaaccct acaatg 36 <210> 398 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 398 ggcataaata ttaagcgctg acaacgtcgt gatggg 36 <210> 399 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 399 ctcgagtgac acatacacac actatttact gactga 36 <210> 400 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 400 accaggctct acgcttccca ctactcgtag aaactt 36 <210> 401 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 401 tctttgacat tctccctgtc cgcgtgagct ctgata 36 <210> 402 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 402 caacggtcat ttcattatgt ccatctagcg catcct 36 <210> 403 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 403 gttcttccta acacactgcc tagtcgaagg cgtctt 36 <210> 404 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 404 ggctattcat aaccaacata agttcgccgc cttggt 36 <210> 405 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 405 cttaactcaa cttcgcatga cgagcatttg cgagtg 36 <210> 406 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 406 caagtctgct aaaccgcaag gttgttattg tgggac 36 <210> 407 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 407 ggtcgttcct aagctacaac tttcaagtaa actcgc 36 <210> 408 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gtacagcaat gcaaataatt ggcggc 36 <210> 418 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 418 gcgccttgat ccgtccttac agcctttatg aacttt 36 <210> 419 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 419 ttctggatat cgctgcatgc gatcagatca atgctt 36 <210> 420 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 420 gtcagtcaac taaatatgcg ccgtggctta aggtga 36 <210> 421 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 421 acatcctctt ccacagaaca cattcctact ccgttt 36 <210> 422 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 422 tatgtgcttc tattccgtcc cacccaacaa ctatag 36 <210> 423 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 423 gcatacatgt gcgcgtcgat taaattgata tagacc 36 <210> 424 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 424 tgctgagtaa cttccagcgc cctgcccatt ataagt 36 <210> 425 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 425 gttcgaatgc ctccttattg tacagggtta actact 36 <210> 426 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 426 gggcttaatg cgtgccggga actgaaacaa gatatt 36 <210> 427 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 427 catgtatcga ctacaattga atcccggatg actccg 36 <210> 428 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 428 actccggttc tacttaatgg tgaggtaacc ggacga 36 <210> 429 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 429 aatacaggca gacgaaatct atactcggct gtgaat 36 <210> 430 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 430 cattcaagct ggccgagctc ctagtagtat agttac 36 <210> 431 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 431 catcaaacta ttcgcagctt tctgcggtca tgaagg 36 <210> 432 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 432 tgcttacgcg cgatagaata cccaaagagc atataa 36 <210> 433 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 433 aggttggagg cgtaattctg ggtccatcat cgacaa 36 <210> 434 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 434 aaagtttagg gtggccggag tacaatctag tcaccc 36 <210> 435 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 435 ttaagaaata gtcccgtcgc caatcatgct ccagcc 36 <210> 436 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 436 tgatactatc tctccgggcc tagaaacagt gcttgc 36 <210> 437 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 437 aactagtaag gaaactatgc atgagacttg ctgctg 36 <210> 438 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 438 aatacgtttc tgtctcctag acctccggca cgacaa 36 <210> 439 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 439 ggtcatcgat tcgcctttct gagtcgcaaa gtcatt 36 <210> 440 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 440 tgaggcatat ggttaactta ccgagcaagc ttctta 36 <210> 441 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 441 cgtatggatg gatgtttatc acgtgcgcga gagatt 36 <210> 442 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 442 gtgttggccg tttcgataaa ttagagttct ggtcta 36 <210> 443 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 443 ccctgctcgt catgaaacac gcttgtctaa ttcgat 36 <210> 444 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 444 cggcgctctc gaaatcagca ttaactcttt aacgcc 36 <210> 445 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 445 acgttacggg ttactctcga ctttatatca cgccag 36 <210> 446 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 446 cagtccagga gtccttatct cagatttgtt cggcga 36 <210> 447 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 452 ttccttaagc gagcgacgtc aactggaaga tgtatg 36 <210> 453 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 453 atggatcacc tccctggata tgttcagttt atcgct 36 <210> 454 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 454 catctcaaac tattcttagc ccatggttgg gtgaaa 36 <210> 455 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 455 ctgtccaact actaccaaga tctgttgatt acgcag 36 <210> 456 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 456 tggaaggtac cgtaactggg actaccacaa ttatca 36 <210> 457 <211> 36 <212> DNA 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oligonucleotide" <400> 481 gatttaacta cgttggattc tttcgacacc aaggcg 36 <210> 482 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 482 atatcatctg attactgcac gtagatggcg tgtcta 36 <210> 483 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 483 cttcgtgtca gacaaagggc ttagcttatt gcagcc 36 <210> 484 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 484 attaatttga cacaatgcaa tgatgggtcg cggtct 36 <210> 485 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 485 atcacaatag aattgacgcc aacaagacgc gggtga 36 <210> 486 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 486 agatacaata tagagtacag ccacagggat gcatgc 36 <210> 487 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 487 tgctttgcgg caacaacaat gcttctgccg ctttac 36 <210> 488 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 488 ttcgtattaa ggtttgggtc agtgaggcag tgagca 36 <210> 489 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 489 ctattaagag tacgatgtgc gtggcgcgac ttcatg 36 <210> 490 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 490 ttggcgtaac tatcaagcaa tgcacaagtt ctcggt 36 <210> 491 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 491 aacccggtcc gaggcaagac cctagaataa caaatt 36 <210> 492 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 492 acgaaggact gaatcacgtt ctacctctca caagta 36 <210> 493 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 493 ggcacaggat atttcacctt agtgtcttag actccc 36 <210> 494 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 494 gcataaccaa gaggacgaca agtgcatata ctacag 36 <210> 495 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 495 acacgaggat ctaagtgttt gggagaggtg tcatcg 36 <210> 496 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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oligonucleotide" <400> 535 aggaagctta gattactggg taatggcctc gtatca 36 <210> 536 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 536 gctgcaatta tcacctgttt cgtaagcagc tacatc 36 <210> 537 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 537 tgagggcttt cgtttagtca atagtgtggt gctatt 36 <210> 538 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 538 ttcttgatgg gttgggctat ctcagtgaca tctagg 36 <210> 539 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 539 gaatgttgat acaggatgtc ggtaggccag tcctta 36 <210> 540 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 540 acctaaacag gacaatcgca tggagtcgca gtcgta 36 <210> 541 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 541 gcctccttac tgaattgtct ataccggcga ttaaca 36 <210> 542 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 542 gtagtcctag gttgatgagg ctcctaagaa atacgt 36 <210> 543 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 543 atcaattcga agggcgttac aaattgaccg gacagg 36 <210> 544 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 544 tcactctaga taatccctaa ttggtggccc gcgttt 36 <210> 545 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 545 gtctaatggt tgcggtcgtt aaacgtctgt ggttgg 36 <210> 546 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 546 cgccttaagt gtataactgt cggcctctat gtcgca 36 <210> 547 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 547 atctcattct ctcgtggctg acgtctgatt tcacct 36 <210> 548 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 548 attacgagcc gcctagttac ccttcggaat taatga 36 <210> 549 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 549 tggattccag acgacacgat ggcttccata taagac 36 <210> 550 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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oligonucleotide" <400> 589 aagacgcctt cgactaggca gtgtgttagg aagaac 36 <210> 590 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 590 accaaggcgg cgaacttatg ttggttatga atagcc 36 <210> 591 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 591 cactcgcaaa tgctcgtcat gcgaagttga gttaag 36 <210> 592 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 592 gtcccacaat aacaaccttg cggtttagca gacttg 36 <210> 593 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 593 gcgagtttac ttgaaagttg tagcttagga acgacc 36 <210> 594 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 594 accataaccc gtctacgaag aatccttaac acgtca 36 <210> 595 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 595 tagaacggta cgtgctttaa atgctaatcc agtcgc 36 <210> 596 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 596 atatgatgaa tttgtccttg ggcgagaggc gtcctg 36 <210> 597 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 597 catctaggga tgtaagtctt tacgcagaca actgcc 36 <210> 598 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 598 cacacgattc acgcgcttat attatcgttc atcaac 36 <210> 599 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 599 gcgttcgtct attactcaat caatccgtgt gtagta 36 <210> 600 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 600 tcatagtgcg aggatccgaa cattgtctaa ccgatc 36 <210> 601 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 601 ggtatgttaa gcagttagat acactgtgac aggtgg 36 <210> 602 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 602 tgtactgccc aacgagttgt attctgcaat gagtcg 36 <210> 603 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 603 gccgccaatt atttgcattg ctgtactcac agggac 36 <210> 604 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 614 tcgtccggtt acctcaccat taagtagaac cggagt 36 <210> 615 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 615 attcacagcc gagtatagat ttcgtctgcc tgtatt 36 <210> 616 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 616 gtaactatac tactaggagc tcggccagct tgaatg 36 <210> 617 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 617 ccttcatgac cgcagaaagc tgcgaatagt ttgatg 36 <210> 618 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 618 ttatatgctc tttgggtatt ctatcgcgcg taagca 36 <210> 619 <211> 36 <212> DNA 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oligonucleotide" <400> 643 atgctcaatc caggtacact tgcgtatccg acgctt 36 <210> 644 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 644 atcagttcca gaaagtggac aacggcgaca tatata 36 <210> 645 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 645 tataataatc gtgcgggctc ataacgaatc cggctg 36 <210> 646 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 646 tacttagatg caccgcaaca cagcccatag cagcta 36 <210> 647 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 647 tcaatgagtg gcacctgctt atttgtaacg atcggg 36 <210> 648 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 648 gggagcgctt tgaacttcga tgtctgtaca cgtact 36 <210> 649 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 649 ctgactaagg agatgaatga cagacctacc tgtcca 36 <210> 650 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 650 tgttagtccg tcctactgtg gttagaccga tctgag 36 <210> 651 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 651 acctcgcatt cggaacctcg gaactagatc ttactt 36 <210> 652 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 652 gcttcgcaga attggaatct tgaaaggtca ctcacc 36 <210> 653 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 653 gcttgtaagt cccaagacca agcagtcagc ggattt 36 <210> 654 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 654 aggagttagc gagatgtagg ctcctcgttc tatgtt 36 <210> 655 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 655 acacaaccct gccattactc ctgtgttagc tagtca 36 <210> 656 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 656 tcgaatgagt ttgttcaatc gtgacttccg atgtgt 36 <210> 657 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 657 agcttaacgt cgtggctgga acactcagga tttgta 36 <210> 658 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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oligonucleotide" <400> 697 atattcggag cggactgtct gcaataacag atgtgt 36 <210> 698 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 698 acgaccgaat tgcgggtaga tgtgaatcga tatctt 36 <210> 699 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 699 gccctccaat atttggcgtg tatcatttat cgagtt 36 <210> 700 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 700 tagtcaagcg gacactcgtc gtcgattatg gacatt 36 <210> 701 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 701 tttccatagt tgatgcatat ggaccctact tgtctg 36 <210> 702 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 702 gaggtcccta tcaaagatac tcaaacttgt tgcagc 36 <210> 703 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 703 gagataaact gcttgacaga cattcgtggg ttccta 36 <210> 704 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 704 ctcaatatac ttcctttcac agagccggca tgaaag 36 <210> 705 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 705 cagaccagca catgggtgtt tatatcccga cagaac 36 <210> 706 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 706 ttgtaggtct atcgctttgg tcagaaatga aaccgg 36 <210> 707 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 707 tgatttcgcg agctaggtgg taaagaactt gacgtt 36 <210> 708 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 708 cctgtacatc agattgtgac ccgcagtatc ctaacg 36 <210> 709 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 709 tagaagcttg agcgaagttg gacctgacac gacaat 36 <210> 710 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 710 agggcacgag ttaacgctaa tgatgtttct catcgg 36 <210> 711 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 711 agttaaagag cggcctcaaa cggtgacgaa ggatac 36 <210> 712 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 762 gaaagcaaac gttgctccgt ctcg 24 <210> 763 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 763 aaacacttta tgtaagattc cgtc 24 <210> 764 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 764 tacccgactt aaatcacggt actg 24 <210> 765 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 765 ccaaatccgg tataacgtag agac 24 <210> 766 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 766 gctttcccgc agtctcaaag aaag 24 <210> 767 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 767 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 783 gcatttctga atgtagggat ctac 24 <210> 784 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 784 attatattcg cgcacttagc acac 24 <210> 785 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 785 taactaactc attatctgct tgcg 24 <210> 786 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 786 ttacaagcct aggagcgtga tact 24 <210> 787 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 787 cacatagatt gacgaattgt atgg 24 <210> 788 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 788 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1019 tggacgaata aacattgcta gccc 24 <210> 1020 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1020 ttgaagctac agacatgtgc atga 24 <210> 1021 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1021 tacttactgt ctggatggac aggt 24 <210> 1022 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1022 gatgacacca atctggctag actc 24 <210> 1023 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1023 cttggagcct tgatctagaa tgaa 24 <210> 1024 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1045 ttcgtaacaa caacggcgtt tcgt 24 <210> 1046 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1046 gtgactgggt ttggaattat gctt 24 <210> 1047 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1047 ggtgcgtgta gcatgagaat tatc 24 <210> 1048 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1048 acgtaacgaa ctatcaatgc ggtt 24 <210> 1049 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1049 atcccagaac ggagcctggc ccaa 24 <210> 1050 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1071 aaccgcacat agtaaatagc tcaa 24 <210> 1072 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1072 gtgagcagca gctaatacct gtaa 24 <210> 1073 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1073 tacgtatacc tgggatgaac agac 24 <210> 1074 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1074 tttctatgag tttgaacaac gtcg 24 <210> 1075 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1075 aactgtctgt aagcacccaa ggat 24 <210> 1076 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1123 tgttgcctgg tctctcacgt atat 24 <210> 1124 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1124 tcagctgcct aaatggcagt gagc 24 <210> 1125 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1125 atcgtcagga gacaaccaga gacg 24 <210> 1126 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1126 aagttaccat gctggtaggc tgag 24 <210> 1127 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1127 agacactcct taagaggaag gctc 24 <210> 1128 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1149 ctcgtcatgc gaagttgagt taag 24 <210> 1150 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1150 caaccttgcg gtttagcaga cttg 24 <210> 1151 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1151 gaaagttgta gcttaggaac gacc 24 <210> 1152 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1152 ctacgaagaa tccttaacac gtca 24 <210> 1153 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1153 tgctttaaat gctaatccag tcgc 24 <210> 1154 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1175 cagaaagctg cgaatagttt gatg 24 <210> 1176 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1176 tgggtattct atcgcgcgta agca 24 <210> 1177 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1177 gacccagaat tacgcctcca acct 24 <210> 1178 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1178 tgtactccgg ccaccctaaa cttt 24 <210> 1179 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1179 attggcgacg ggactatttc ttaa 24 <210> 1180 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1201 ggtacacttg cgtatccgac gctt 24 <210> 1202 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1202 aagtggacaa cggcgacata tata 24 <210> 1203 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1203 gcgggctcat aacgaatccg gctg 24 <210> 1204 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1204 ccgcaacaca gcccatagca gcta 24 <210> 1205 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1205 acctgcttat ttgtaacgat cggg 24 <210> 1206 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1227 ctaagccctt tgtctgacac gaag 24 <210> 1228 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1228 atcattgcat tgtgtcaaat taat 24 <210> 1229 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1229 tgttggcgtc aattctattg tgat 24 <210> 1230 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1230 gtggctgtac tctatattgt atct 24 <210> 1231 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1231 aagcattgtt gttgccgcaa agca 24 <210> 1232 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1253 acacgtctta tcgccgtagc agaa 24 <210> 1254 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1254 atgcccgagc agaattgccc ttaa 24 <210> 1255 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1255 gactgtctgc aataacagat gtgt 24 <210> 1256 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1256 cgggtagatg tgaatcgata tctt 24 <210> 1257 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1257 ttggcgtgta tcatttatcg agtt 24 <210> 1258 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1279 attacccagt aatctaagct tcct 24 <210> 1280 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1280 tacgaaacag gtgataattg cagc 24 <210> 1281 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1281 ctattgacta aacgaaagcc ctca 24 <210> 1282 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1282 tgagatagcc caacccatca agaa 24 <210> 1283 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1283 taccgacatc ctgtatcaac attc 24 <210> 1284 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1305 gattatcgag gacacgggag cata 24 <210> 1306 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1306 caccgttgtc tttagtccac cact 24 <210> 1307 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1307 atctacggcg acgtccatac cttt 24 <210> 1308 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1308 tgagggacac ccactcgaat tacc 24 <210> 1309 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1309 gaccaggcaa caccaggaag attg 24 <210> 1310 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1331 tccctgtccg cgtgagctct gata 24 <210> 1332 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1332 cattatgtcc atctagcgca tcct 24 <210> 1333 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1333 acactgccta gtcgaaggcg tctt 24 <210> 1334 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1334 ccaacataag ttcgccgcct tggt 24 <210> 1335 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1335 tcgcatgacg agcatttgcg agtg 24 <210> 1336 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1357 acaattgaat cccggatgac tccg 24 <210> 1358 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1358 cttaatggtg aggtaaccgg acga 24 <210> 1359 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1359 cgaaatctat actcggctgt gaat 24 <210> 1360 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1360 ccgagctcct agtagtatag ttac 24 <210> 1361 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1361 cgcagctttc tgcggtcatg aagg 24 <210> 1362 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1383 cctggatatg ttcagtttat cgct 24 <210> 1384 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1384 ttcttagccc atggttgggt gaaa 24 <210> 1385 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1385 taccaagatc tgttgattac gcag 24 <210> 1386 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1386 taactgggac taccacaatt atca 24 <210> 1387 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1387 cgcaagtgta cctggattga gcat 24 <210> 1388 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1409 gagcaaagag actcatcgtc tatc 24 <210> 1410 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1410 acggtgtagt tattagggtc ctag 24 <210> 1411 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1411 ttggattctt tcgacaccaa ggcg 24 <210> 1412 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1412 tactgcacgt agatggcgtg tcta 24 <210> 1413 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1413 caaagggctt agcttattgc agcc 24 <210> 1414 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1414 caatgcaatg atgggtcgcg gtct 24 <210> 1415 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1415 ttgacgccaa caagacgcgg gtga 24 <210> 1416 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1416 gagtacagcc acagggatgc atgc 24 <210> 1417 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1417 acaacaatgc ttctgccgct ttac 24 <210> 1418 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1418 tttgggtcag tgaggcagtg agca 24 <210> 1419 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1419 cgatgtgcgt ggcgcgactt catg 24 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1435 gatggccgag acttcctggg atca 24 <210> 1436 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1436 tgtggcaggg atatggtcac attt 24 <210> 1437 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1437 aggaggttta gtataaattg ggtg 24 <210> 1438 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1438 tgacgcttat cggcagtctt gaaa 24 <210> 1439 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1439 gataagacgt gtgcttccgt taga 24 <210> 1440 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1461 tacaagagta gtgaatcctc agtc 24 <210> 1462 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1462 ttccgcatcg tgattgcttg ctaa 24 <210> 1463 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1463 tgtttaccag aggctatgtc caac 24 <210> 1464 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1464 gacttagaat aacgtttgca acta 24 <210> 1465 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1465 ttactgggta atggcctcgt atca 24 <210> 1466 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1487 gcggattaaa gcgtgttgtg ttga 24 <210> 1488 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1488 aattgtgtga gtcggtccgt tgca 24 <210> 1489 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1489 accgatcatg tctgggttac cagttagtcg tgtctc 36 <210> 1490 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1490 tcgtcttgaa ccaatgacca aatgcaagcc ctccat 36 <210> 1491 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1491 atacgagggc acaggagcta ttagtgtagc gaaagg 36 <210> 1492 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1492 tcaccacctg atttctgttg ccaccgcatc agttta 36 <210> 1493 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1493 tttccatacc tgcagcggca tctattcatg acatgt 36 <210> 1494 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1494 ccattaagct cacccacagg gagttggagt ctaaac 36 <210> 1495 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1495 gttagaagga ccacaacgga ccagagagtg catata 36 <210> 1496 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1496 aattctcagg ctagtcgacg gatttaccgt cactcg 36 <210> 1497 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1521 tccaccacct cctcaaacag ctcaaaccaa gtgagaagta cctaaaaata aagcacctac 60 tgctgaaaag 70 <210> 1522 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 1522 ggtgctttat ttttaggtac ttctcr 26 <210> 1523 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 1523 cttggtttga gctgtttgag g 21 <210> 1524 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 1524 ctaatagctc ctgtgccctc gtatacatac tggatacagc tggaca 46 <210> 1525 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 1525 aatccgtcga ctagcctgag aattacatac tggatacagc tggact 46 <210> 1526 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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Synthetic probe" <400> 1611 tcccaccatg attgatgtgg gg 22 <210> 1612 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 1612 cagtaataac agcattgatt gttcttac 28 <210> 1613 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 1613 tcccaccatg attgatgtgg gg 22 <210> 1614 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 1614 cagtaataac agcattgatt gttcttac 28 <210> 1615 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 1615 ttccttgtca gaatccatta cctgta 26 <210> 1616 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 1616 ttgctgagtc acgagaacac g 21 <210> 1617 <211> 26 <212> DNA 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Sequence: Synthetic probe" <400> 1622 tgtaagagtt tttaggaccc act 23 <210> 1623 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 1623 gtgcttgtcc ccaggggata 20 <210> 1624 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 1624 ggtataggca cacaatggtg a 21 <210> 1625 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 1625 gtgcttgtcc ccaggggata 20 <210> 1626 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1626 gtcatcccta ttggcaggtt ac 22 <210> 1627 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1627 cagggccttc cttgtatctc 20 <210> 1628 <211> 23 <212> DNA <213> 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Synthetic oligonucleotide" <400> 1649 accgatcatg 10 <210> 1650 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1650 gtactagcca 10 <210> 1651 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1651 catgatcggt 10 <210> 1652 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1652 tggctagtac 10 <210> 1653 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 1653 actggtaacc cagacatgat cggtaggtga ttttggtcta gctacagt 48 <210> 1654 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 1654 actccctgtg ggtgagctta atggaggtga ttttggtcta gctacaga 48 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Claims

다음 단계를 포함하는, 샘플에서 표적 핵산 서열을 포함하는 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법:
(a) 표적 보체(target complement)가 표적 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산 서열에 혼성화하여 반응 생성물을 형성하는 조건 하에서 올리고뉴클레오티드 태그, 표적 보체 및 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 검출 프로브(detection probe)와 샘플을 접촉시키는 단계;
(b) 반응 생성물의 올리고뉴클레오티드 태그가 포획 올리고뉴클레오티드(capture oligonucleotide)에 혼성화하여 고정된 검출 복합체(immobilized detection complex)를 형성하는 조건 하에서 반응 생성물을 함유하는 혼합물과 포획 올리고뉴클레오티드가 고정된 지지체 표면을 접촉시키는 단계;
(c) 증폭 주형(amplification template)을 포함하는 검출 혼합물과 고정된 검출 복합체를 접촉시키는 단계;
(d) 검출 표지화 부위(detection labeling site)를 포함하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 앰플리콘(amplicon)을 형성하기 위해 증폭 주형을 증폭시키는 단계;
(e) 검출 시약의 핵산 서열이 앰플리콘의 검출 표지화 부위에 혼성화하는 조건 하에서 표지 및 검출 표지화 부위에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 검출 시약과 앰플리콘을 접촉시키는 단계; 및
(f) 검출 표지화 부위에 결합된 표지를 검출하는 단계.
제1항에 있어서, (a)에서 샘플이 고정 시약(anchoring reagent) 및 검출 프로브와 접촉되고, 고정 시약은 올리고뉴클레오티드 태그 및 고정 서열(anchoring sequence)을 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 검출 프로브가 단일 가닥(single stranded) DNA 올리고뉴클레오티드 태그, 단일 가닥 RNA 표적 보체 및 단일 가닥 DNA 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 방법.
제3항에 있어서, 고정 시약이 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 태그 및 단일 가닥 DNA 고정 서열을 포함하는 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 고정된 검출 복합체를 RNase와 접촉시켜 (c) 전에 결합되지 않은 프로브의 단일 가닥 RNA를 분해하는 단계를 포함하는 방법.
다음 단계를 포함하는, 샘플에서 표적 핵산 서열을 포함하는 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법:
(a) 샘플을
(ⅰ) 단일 가닥 DNA 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 태그, 단일 가닥 RNA 서열을 포함하는 표적 보체 및 단일 가닥 DNA 서열을 포함하는 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 검출 프로브; 및
(ⅱ) 단일 가닥 DNA 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 태그 및 단일 가닥 DNA 서열을 포함하는 고정 서열을 포함하는 고정 시약과 접촉시키는 단계로서,
검출 프로브의 표적 보체는 표적 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산 서열에 혼성화하여 올리고뉴클레오티드 태그, 표적 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산 서열을 포함하는 이중 가닥 RNA 듀플렉스(double stranded RNA duplex) 및 표적 보체를 포함하는 반응 생성물을 형성하는, 단계;
(b) 반응 생성물의 올리고뉴클레오티드 태그가 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화하여 지지체 표면에 검출 복합체를 형성하는 조건 하에서 반응 생성물을 포함하는 혼합물과 개별 결합 도메인에 복수의 포획 올리고뉴클레오티드가 고정된 하나 이상의 전극을 포함하는 지지체 표면을 접촉시키는 단계;
(c) 결합되지 않은 검출 프로브의 단일 가닥 RNA를 분해하기 위해 RNase와 지지체 표면을 접촉시키는 단계;
(d) 회전 환 증폭(rolling circle amplification, RCA) 주형 및 중합효소를 포함하는 검출 혼합물과 고정된 검출 복합체를 접촉시키는 단계;
(e) 검출 복합체에 부착된 연장된 서열을 형성하기 위해 RCA에 의해 주형을 증폭시키는 단계로서, 연장된 서열은 검출 표지화 부위를 포함하는 다중 핵산 서열을 포함하는 단계;
(f) 검출 시약의 핵산 서열이 검출 표지화 부위에 혼성화하는 조건 하에서 전기화학발광(electrochemiluminescent, ECL) 표지 및 연장된 서열의 검출 표지화 부위에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 검출 시약과 연장된 서열을 접촉시키는 단계; 및
(g) ECL 표지를 ECL 공반응물을 포함하는 ECL 판독 버퍼와 접촉시키고 전극에 전위를 인가함으로써 연장된 서열에 결합된 ECL 표지를 검출하는 단계.
다음 단계를 포함하는, 샘플에서 표적 뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법:
(a) 샘플을
(ⅰ) 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그 및 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 제1 영역에 상보적인 제1 핵산 서열을 포함하는 표적화 프로브; 및
(ⅱ) 검출 올리고뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드 서열의 제2 영역에 상보적인 제2 핵산 서열을 포함하는 검출 프로브를 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계로서,
표적화 프로브의 제1 핵산 서열 및 검출 프로브의 제2 핵산 서열은 표적 올리고뉴클레오티드의 인접한 핵산 서열에 상보적인 단계;
(b) 표적화 프로브 및 검출 프로브가 표적 올리고뉴클레오티드의 상응하는 뉴클레오티드 서열에 결합하고 핵산 리가아제(nucleic acid ligase)가 표적화 및 검출 프로브를 결찰시켜 올리고뉴클레오티드 태그 및 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 반응 생성물을 형성하는 조건 하에서 핵산 리가아제의 존재하에 표적 올리고뉴클레오티드, 표적화 프로브 및 검출 프로브를 포함하는 혼합물을 인큐베이션하는 단계;
(c) 반응 생성물의 올리고뉴클레오티드 태그가 포획 올리고뉴클레오티드에 혼성화하여 고정된 검출 복합체를 형성하는 조건 하에서 반응 생성물을 포함하는 혼합물과 포획 올리고뉴클레오티드가 고정된 지지체 표면을 접촉시키는 단계;
(d) 증폭 주형을 포함하는 검출 혼합물과 고정된 검출 복합체를 접촉시키는 단계;
(e) 검출 표지화 부위를 포함하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 앰플리콘을 형성하기 위해 증폭 주형을 증폭시키는 단계;
(f) 검출 시약의 핵산 서열이 검출 표지화 부위에 혼성화하는 조건 하에서 표지 및 검출 표지화 부위에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 검출 시약과 앰플리콘을 접촉시키는 단계; 및
(g) 지지체 표면에 결합된 표지를 검출하는 단계.
제7항에 있어서, 검출 프로브가 표적화 프로브의 3' 엔드에 인접한 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 5' 엔드를 갖는 방법.
제7항에 있어서, 표적 올리고뉴클레오티드로부터 반응 생성물을 분리시키기 위해 (b)에서 형성된 반응 생성물을 변성 조건에 노출시키는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭 주형이 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 증폭되는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭 주형이 회전 환 증폭(RCA)에 의해 증폭되는 방법.
제11항에 있어서, 증폭 주형이 원형 증폭 주형(circular amplification template)을 포함하는 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, RCA에 의해 생성된 앰플리콘이 고정된 검출 복합체에 부착된 연장된 서열을 포함하는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 앰플리콘이 다중 검출 표지화 부위를 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 증폭 주형이 5' 말단 뉴클레오티드 서열 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 증폭 주형, 및 검출 시약의 핵산 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 내부 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 증폭 주형의 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 내부 서열과 중첩되지 않는 방법.
제11항에 있어서, 증폭 주형이 5' 말단 뉴클레오티드 서열 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 증폭 주형, 고정 올리고뉴클레오티드 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제1 내부 서열 및 검출 시약의 핵산 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제2 내부 서열을 포함하고, 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 증폭 주형의 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 제1 및 제2 내부 서열과 중첩되지 않는 방법.
제16항에 있어서, 3' 및 5' 말단 서열의 길이의 합이 약 14 내지 약 24개의 뉴클레오티드 길이인 방법.
제17항에 있어서, 3' 및 5' 말단 서열의 길이의 합이 약 14개 또는 약 15개의 뉴클레오티드 길이인 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭 주형이 5'-GTTCTGTC-3'(서열번호 1666)의 5' 말단 서열 및 5'-GTGTCTA-3'(서열번호 1667)의 3' 말단 서열을 포함하는 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 올리고뉴클레오티드가 증폭 주형의 5' 말단 서열에 상보적인 제1 서열 및 증폭 주형의 3' 말단 서열에 상보적인 인접한 제2 서열을 포함하는 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, 증폭 주형이 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(서열번호 1668)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, 증폭 주형이 5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(서열번호 1669)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, 증폭 주형이 5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'(서열번호 1670)로 이루어진 서열을 포함하는 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, 증폭 주형이 5'- GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA-3'(서열번호 1671)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서, 검출 올리고뉴클레오티드가 5'-GACAGAACTAGACAC-3'(서열번호 1664)의 14개 또는 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭 주형이 약 50 내지 약 78개의 뉴클레오티드 길이의 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제26항에 있어서, 증폭 주형의 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드 서열이 약 53 내지 약 76개의 뉴클레오티드 길이, 약 50 내지 약 70개의 뉴클레오티드 길이, 약 53 내지 약 61개의 뉴클레오티드 길이 또는 약 54 내지 약 61개의 뉴클레오티드 길이인 방법.
제26항 또는 제27항에 있어서, 증폭 주형의 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드 서열이 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75 또는 약 76개의 뉴클레오티드 길이인 방법.
제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭 주형의 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드 서열이 약 61개의 뉴클레오티드 길이인 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 시약의 핵산 서열이 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(서열번호 1672)의 14개 또는 15개의 연속 뉴클레오티드에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 시약의 핵산 서열이 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(서열번호 1672)를 포함하는 방법.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 시약의 핵산 서열이 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(서열번호 1668)을 포함하는 방법.
제2항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 시약의 고정 서열이 약 10 내지 약 30개의 핵산 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 방법.
제2항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 시약의 고정 서열이 약 17개 또는 약 25개의 올리고뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 방법.
제2항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 시약의 고정 서열이 5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(서열번호 1669)를 포함하는 방법.
제2항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 시약의 고정 서열이 5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(서열번호 1665)로 이루어지는 방법.
제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체 표면이 하나 이상의 탄소계 전극을 포함하는 방법.
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체 표면이 하나 이상의 탄소계 전극을 포함하는 멀티 웰 플레이트(multi-well plate)를 포함하는 방법.
제38항 또는 제39항에 있어서, 전극이 카본 잉크 전극을 포함하는 방법.
제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체 표면이 하나 이상의 탄소계 전극을 포함하는 멀티 웰 플레이트를 포함하고, 복수의 포획 올리고뉴클레오티드가 개별 도메인에서 탄소계 전극에 고정되는 방법.
제40항에 있어서, 복수의 포획 올리고뉴클레오티드가 어레이의 개별 결합 도메인에서 지지체 표면에 고정되는 방법.
제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 표지가 전기화학발광(ECL) 표지를 포함하는 방법.
제42항에 있어서, 전극을 전기화학발광 공반응물을 포함하는 전기화학발광 판독 버퍼와 접촉시키고 전극에 전위를 인가함으로써 검정 신호를 생성하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드가 다음 요건 중 하나 이상을 충족하는 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 세트로부터 선택되는 방법:
(a) 약 40% 내지 약 50%의 GC 함량;
(b) 약 30 내지 약 70%의 AG 함량;
(c) 약 30% 내지 약 70%의 CT 함량;
(d) 3개 이하의 서열의 염기 반복부의 최대 스트링(string);
(e) 일렬로 7개 초과의 상보적 염기쌍 일치(complementary base pair match)의 스트링과의 바람직하지 않은 올리고뉴클레오티드-올리고뉴클레오티드 상호작용이 없음;
(f) 18개 이하의 연속 염기의 스트링과의 바람직하지 않은 올리고뉴클레오티드-올리고뉴클레오티드 상호작용이 없으며:
(i) 각 엔드에 있는 말단 염기는 상보적으로 일치하고;
(ii) 상보적 염기쌍 일치의 합에서 불일치(mismatch)의 합을 뺀 값이 7보다 큼;
(g) 게놈 또는 자연의 서열 또는 서열의 보체 또는 둘 다와 일치하는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개 또는 이보다 긴 염기쌍의 스트링이 없음;
(h) 보체가 있는 서열에 대한 혼성화 자유 에너지의 차이는 약 1kCal/mol, 약 2kCal/mol, 약 3kCal/mol 또는 약 4kCal/mol 미만임;
(i) 스템(stem)에서 4개 이상 연속 일치되는 예측된 헤어핀 루프가 없음; 그리고
(j) 스템에서 4개 이상 연속 일치되는 예측된 헤어핀 루프가 없고 6개 염기 초과의 루프 크기가 없음.
제44항에 있어서, 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드가 다음으로부터 선택되는 방법:
(a) 서열번호 1-64로부터 선택된 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 포획 올리고뉴클레오티드;
(b) 서열번호 1-64로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 포획 올리고뉴클레오티드;
(c) 서열번호 1-64로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 포획 올리고뉴클레오티드;
(d) 서열번호 1-64로부터 선택된 서열을 포함하는 포획 올리고뉴클레오티드; 및
(e) (a)-(d) 중 임의의 것으로부터 선택된 포획 올리고뉴클레오티드.
제44항에 있어서, 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드가 다음으로부터 선택되는 방법:
(a) 서열번호 1-10으로부터 선택된 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 서열을 포함하는 포획 올리고뉴클레오티드;
(b) 서열번호 1-10으로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 포획 올리고뉴클레오티드;
(c) 서열번호 1-10으로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 포획 올리고뉴클레오티드;
(d) 서열번호 1-10으로부터 선택된 서열을 포함하는 포획 올리고뉴클레오티드; 및
(e) (a)-(d) 중 임의의 것으로부터 선택된 포획 올리고뉴클레오티드.
다음을 포함하는, 샘플에서 표적 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 키트:
(a) 하나 이상의 고정된 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하는 지지체 표면;
(b) 올리고뉴클레오티드 태그, 표적 보체 및 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 검출 프로브;
(c) 증폭 주형;
(d) 핵산 리가아제;
(e) 핵산 중합효소; 및
(f) 표지 및 핵산 서열을 포함하는 검출 시약.
제47항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 태그 및 고정 올리고뉴클레오티드를 포함하는 고정 시약을 추가로 포함하는 키트.
제48항에 있어서, 고정 시약이 지지체 표면에 고정된 키트.
제48항 또는 제49항에 있어서, 고정 올리고뉴클레오티드가 약 10 내지 약 30개의 핵산 길이인 키트.
제50항에 있어서, 고정 올리고뉴클레오티드가 17개 또는 25개의 올리고뉴클레오티드 길이인 키트.
제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 올리고뉴클레오티드가 5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(서열번호 1669)를 포함하는 키트.
제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 올리고뉴클레오티드가 5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(서열번호 1665)로 이루어지는 키트.
제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭 주형이 5' 말단 뉴클레오티드 서열 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 증폭 주형, 및 고정 시약의 고정 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 내부 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 증폭 주형의 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 내부 서열과 중첩되지 않는 키트.
제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭 주형이 5' 말단 뉴클레오티드 서열 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 증폭 주형, 고정 시약의 고정 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제1 내부 뉴클레오티드 서열 및 검출 시약의 핵산 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제2 내부 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 증폭 주형의 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 제1 및 제2 내부 서열과 중복되지 않는 키트.
제54항 또는 제55항에 있어서, 증폭 주형이 5' 말단 포스페이트 그룹을 포함하는 키트.
제47항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭 주형이 약 53 내지 약 61개의 뉴클레오티드 길이인 키트.
제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 및 3' 말단 서열의 길이의 합이 약 14 내지 약 24개의 뉴클레오티드 길이인 키트.
제58항에 있어서, 3' 및 5' 말단 서열의 길이의 합이 약 14 내지 약 19개의 뉴클레오티드 길이인 키트.
제58항에 있어서, 3' 및 5' 말단 서열의 길이의 합이 약 14개 또는 약 15개의 뉴클레오티드 길이인 키트.
제47항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭 주형이 5'-GTTCTGTC-3'(서열번호 1666)의 5' 말단 서열 및 5'-GTGTCTA-3'(서열번호 1667)의 3' 말단 서열을 포함하는 키트.
제47항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭 주형이 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(서열번호 1668)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키트.
제47항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭 주형이 5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(서열번호 1669)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키트.
제47항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭 주형이 5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'(서열번호 1670)로 이루어진 서열을 포함하는 키트.
제47항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭 주형이 5'- GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA-3'(서열번호 1671)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키트.
제47항에 있어서, 증폭 주형이 원형 증폭 주형을 포함하는 키트.
제47항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 프로브가 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 태그, 단일 가닥 RNA 표적 보체 및 단일 가닥 DNA 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.
제67항에 있어서, 고정 시약이 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 태그 및 단일 가닥 DNA 고정 서열을 포함하는 키트.
제67항 또는 제68항에 있어서, RNase를 포함하는 키트.
제54항 또는 제55항에 있어서, 검출 프로브의 검출 올리고뉴클레오티드가 증폭 주형의 5' 말단 서열에 상보적인 제1 서열 및 증폭 주형의 3' 말단 서열에 상보적인 인접한 제2 서열을 포함하는 키트.
제47항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 시약의 핵산 서열이 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(서열번호 1672)의 14개 또는 15개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 키트.
제47항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 시약의 핵산 서열이 서열 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(서열번호 1672)를 포함하는 키트.
제47항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 시약의 핵산 서열이 서열 5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(서열번호 1668)를 포함하는 키트.
제47항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 시약의 표지가 전기화학발광(ECL) 표지를 포함하는 키트.
제47항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체 표면이 탄소계 지지체 표면을 포함하는 키트.
제47항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체 표면이 탄소계 전극을 포함하는 키트.
제47항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체 표면이 카본 잉크 전극을 포함하는 키트.
제47항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체 표면이 멀티 웰 플레이트 검정 소모품을 포함하고, 플레이트의 각각의 웰이 카본 잉크 전극을 포함하는 키트.
제47항에 있어서, 지지체 표면이 비드를 포함하는 키트.
제47항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 포획 올리고뉴클레오티드가 어레이를 형성하기 위해 개별 결합 도메인에서 고상 지지체에 고정되는 키트.
제80항에 있어서, 복수의 포획 올리고뉴클레오티드 및 적어도 하나의 고정 시약이 어레이를 형성하기 위해 개별 결합 도메인에서 고상 지지체에 고정되고, 각각의 결합 도메인은 복수의 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나 및 적어도 하나의 고정 시약을 포함하는 키트.
제47항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드가 다음 요건 중 하나 이상을 충족하는 비-교차 반응성 올리고뉴클레오티드 세트로부터 선택되는 키트:
(a) 약 40% 내지 약 50%의 GC 함량;
(b) 약 30 내지 약 70%의 AG 함량;
(c) 약 30% 내지 약 70%의 CT 함량;
(d) 3개 이하의 서열의 염기 반복부의 최대 스트링;
(e) 일렬로 7개 초과의 상보적 염기쌍 일치의 스트링과의 바람직하지 않은 올리고뉴클레오티드-올리고뉴클레오티드 상호작용이 없음;
(f) 18개 이하의 연속 염기의 스트링과의 바람직하지 않은 올리고뉴클레오티드-올리고뉴클레오티드 상호작용이 없으며:
(i) 각 엔드에 있는 말단 염기는 상보적으로 일치하고;
(ii) 상보적 염기쌍 일치의 합에서 불일치의 합을 뺀 값이 7보다 큼;
(g) 게놈 또는 자연의 서열 또는 서열의 보체 또는 둘 다와 일치하는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개 또는 이보다 긴 염기쌍의 스트링이 없음;
(h) 보체가 있는 서열에 대한 혼성화 자유 에너지의 차이는 약 1kCal/mol, 약 2kCal/mol, 약 3kCal/mol 또는 약 4kCal/mol 미만임;
(i) 스템에서 4개 이상 연속 일치되는 예측된 헤어핀 루프가 없음; 그리고
(j) 스템에서 4개 이상 연속 일치되는 예측된 헤어핀 루프가 없고 6개 염기 초과의 루프 크기가 없음.
제82항에 있어서, 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드가 다음으로부터 선택되는 키트:
(a) 서열번호 1-64로부터 선택된 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 포획 올리고뉴클레오티드;
(b) 서열번호 1-64로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 포획 올리고뉴클레오티드;
(c) 서열번호 1-64로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 포획 올리고뉴클레오티드;
(d) 서열번호 1-64로부터 선택된 서열을 포함하는 포획 올리고뉴클레오티드; 및
(e) (a)-(d) 중 임의의 것으로부터 선택된 포획 올리고뉴클레오티드.
제82항에 있어서, 지지체 표면에 고정된 포획 올리고뉴클레오티드가 다음으로부터 선택되는 키트:
(a) 서열번호 1-10으로부터 선택된 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 서열을 포함하는 포획 올리고뉴클레오티드;
(b) 서열번호 1-10으로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 포획 올리고뉴클레오티드;
(c) 서열번호 1-10으로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열의 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 포획 올리고뉴클레오티드;
(d) 서열번호 1-10으로부터 선택된 서열을 포함하는 포획 올리고뉴클레오티드; 및
(e) (a)-(d) 중 임의의 것으로부터 선택된 포획 올리고뉴클레오티드.
다음을 포함하는, 샘플에서 표적 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 키트:
(a) 하나 이상의 고정된 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하는 지지체 표면;
(b) 올리고뉴클레오티드 태그 및 고정 올리고뉴클레오티드를 포함하는 고정 시약;
(c) 올리고뉴클레오티드 태그, 표적 보체 및 단일 가닥 DNA 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 검출 프로브;
(d) 전기화학발광(ECL) 표지 및 핵산 서열을 포함하는 검출 시약.
(e) 5' 말단 뉴클레오티드 서열 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 증폭 주형, 고정 시약의 고정 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제1 내부 뉴클레오티드 서열 및 검출 시약의 핵산 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제2 내부 뉴클레오티드 서열로서, 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 증폭 주형의 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 제1 및 제2 내부 서열과 중첩되지 않음;
(f) 핵산 리가아제; 및
(g) 핵산 중합효소.
제85항에 있어서, 고정 시약이 지지체 표면에 고정되어 있는 키트.
제85항 또는 제86항에 있어서, 고정 시약이 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 태그 및 단일 가닥 DNA 고정 올리고뉴클레오티드를 포함하고; 검출 프로브가 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 태그, 단일 가닥 RNA 표적 보체 및 단일 가닥 DNA 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하고; 키트가 RNase를 추가로 포함하는 키트.
다음을 포함하는, 샘플에서 표적 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 키트:
(a) 고정된 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하는 지지체 표면;
(b) 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그 및 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 제1 영역에 상보적인 제1 핵산 서열을 포함하는 표적화 프로브;
(c) 검출 올리고뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드 서열의 제2 영역에 상보적인 제2 핵산 서열을 포함하는 검출 프로브로서, 표적화 프로브의 제1 핵산 서열 및 검출 프로브의 제2 핵산 서열은 표적 뉴클레오티드의 인접한 서열에 상보적인 검출 프로브;
(d) 증폭 주형;
(e) 핵산 리가아제;
(f) 핵산 중합효소; 및
(g) 표지 및 핵산 서열을 포함하는 검출 시약.
제88항에 있어서, 표적화 프로브가, 검출 프로브의 5' 말단 뉴클레오티드가 상보적인 영역에 인접한 표적 뉴클레오티드 서열의 영역에 상보적인 말단 3' 뉴클레오티드를 갖는 키트.
제89항에 있어서, 표적화 프로브의 말단 3' 뉴클레오티드가 표적 뉴클레오티드 서열의 다형성 뉴클레오티드에 상보적인 키트.
다음을 포함하는, 샘플에서 표적 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 키트:
(a) 고정된 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하는 지지체 표면;
(b) 올리고뉴클레오티드 태그 및 고정 올리고뉴클레오티드를 포함하는 고정 시약;
(c) 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 태그 및 샘플 내 표적 뉴클레오티드 서열의 제1 영역에 상보적인 제1 핵산 서열을 포함하는 표적화 프로브;
(d) 검출 올리고뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드 서열의 제2 영역에 상보적인 제2 핵산 서열을 포함하는 검출 프로브로서, 표적화 프로브의 제1 핵산 서열 및 검출 프로브의 제2 핵산 서열은 표적 뉴클레오티드의 인접한 서열에 상보적인 검출 프로브;
(e) 5' 말단 뉴클레오티드 서열 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 증폭 주형, 고정 시약의 고정 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제1 내부 뉴클레오티드 서열 및 검출 시약의 핵산 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 제2 내부 뉴클레오티드 서열로서, 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 증폭 주형의 5' 및 3' 말단 뉴클레오티드 서열은 제1 및 제2 내부 서열과 중첩되지 않음;
(f) 핵산 리가아제;
(g) 핵산 중합효소; 및
(h) 전기화학발광(ECL) 표지 및 핵산 서열을 포함하는 검출 시약.
제47항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 선형 증폭 주형, 및 결찰 버퍼, 아데노신 트리포스페이트(ATP), 소 혈청 알부민(BSA), Tween 20, T4 DNA 리가아제 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 검출 혼합물을 추가로 포함하는 키트.
제92항에 있어서, 검출 혼합물이 BSA, 버퍼, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(deoxynucleoside triphosphate, dNTP), Tween 20, Phi29 DNA 중합효소 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 회전 환 증폭을 위한 하나 이상의 성분을 포함하는 키트.
제92항 또는 제93항에 있어서, 검출 혼합물이 아세틸-BSA를 포함하는 키트.
제47항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, ECL 판독 버퍼를 추가로 포함하는 키트.