JP5026958B2

JP5026958B2 - リコンビナーゼポリメラーゼ増幅

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Publication number: JP5026958B2
Application number: JP2007514201A
Authority: JP
Inventors: オラフピーペンブルク，; コリンエイチ．ウィリアムズ，; ニアルエー．アームズ，; デレクエル．ステンプル，
Original assignee: アリーアサンディエゴ，インコーポレイテッド
Priority date: 2004-06-01
Filing date: 2005-04-11
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2025-04-11
Also published as: EP3985125A1; EP1759012B1; EP2336361A3; WO2005118853A2; AU2005250233B2; EP2336361B1; EP3540073A1; WO2005118853A3; JP5856576B2; ES2718482T3; JP2008188020A; EP3540073B1; JP2011103900A; JP2013102769A; AU2005250233A1; CA2569512C; JP2008500831A; ES2425354T3; EP1759012A2; CA2569512A1

Description

（発明の背景）
ＤＮＡの増幅能力は、現代の生物学的および医学的研究の中心にある。これは、ほとんどの分子生物学手法が、アッセイの感度を増大するために、またはさらなる処理に充分な材料を準備するために多量の同一分子を含有する試料に依存するためである。種々の核酸増幅手法のうち、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、その感度と効率のため、短い核酸配列の増幅において最もよく用いられている。

ＰＣＲは、非常に有用であるが、いくつかの様式において制限もある。ＰＣＲの第１の制限は、高温での多数回の熱融解（変性）サイクルと、その後の低温度でのハイブリダーゼーションおよび伸長に依存することである。効率を最大限にするため、およびノイズを最小限にするため、複数回の反応での複雑な温度制御が必要である。これには、特殊材料で構成された迅速な加熱／冷却ブロック（例えば、金めっき銀ブロック）を制御可能なサーモサイクラー、または試料を温度制御ゾーン間で移動させるロボット機構の使用が必要とされる。生理学的塩条件でのＤＮＡの融解に必要とされる高温のため、ＰＣＲ手法では、サイクルごとに新鮮なポリメラーゼを添加すること、または耐熱性ポリメラーゼを使用することのいずれかが必要である。新鮮なポリメラーゼを添加するためのアプローチは自動化されておらず、したがって、労力がかかり、エラー（例えば、混入物（莢雑物）、チューブの脱落、標識エラー）が生じやすい。さらにまた、酵素の添加および各反応物を個々に混合する必要性が、酵素添加ＰＣＲ方法を小規模に適用することが制限されるという大きな欠点を提示する。

新鮮なポリメラーゼの添加を伴う方法と比べ、ＰＣＲにおける耐熱性ポリメラーゼの使用は、最も広く実施されている。このアプローチは、耐熱性ポリメラーゼが限定数の生物にしか見られず、好熱性生物が用いる複製機構は充分理解されていないという欠点から困難を受ける。耐熱性ポリメラーゼの利用可能な範囲は、ＤＮＡ修復および／またはラギング鎖合成に関与する単一のポリペプチドポリメラーゼ酵素に限定される。ＤＮＡ修復および／またはラギング鎖ポリメラーゼは、発揮される連続的合成能（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）が不充分である（分布的合成）ため、ＤＮＡ増幅のための選択肢として不充分である。一部、修復および／またはラギング鎖ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ）を用いる結果として、および熱融解後、阻害性の二次または三次核酸構造の形成により、現行のＰＣＲプロトコルでは、数千より長い塩基対の配列は容易に増幅されない。より長い鋳型の信頼性のある合成（および増幅）は、ポリメラーゼ、およびずっと高いレベルの連続的合成能、鎖置換および二次構造分解を集約的に示し、熱変性されたＤＮＡを冷却時に形成し得る阻害性高次核酸構造の形成を制限する補助酵素性複合体に依存する。

ＰＣＲの第２の制限は、水性環境におけるオリゴヌクレオチド（ＰＣＲプライマー）と変性された鋳型ＤＮＡ（すなわち、増幅対象のＤＮＡ）との溶液ハイブリダーゼーションに依存することである。ＰＣＲ反応が有効であるためには、耐熱性ポリメラーゼが、ＰＣＲが温度において急速な活性の低下を有するため、短時間で行なう。さらに、迅速なターンアラウンドに重要な特徴である短時間での効率的なハイブリダーゼーションでは、ＰＣＲを高濃度オリゴヌクレオチドを有する環境において行なうことが必要である。高濃度のオリゴヌクレオチドはまた、溶液中に依然として存在する熱変性された相補鎖との競合において、標的配列とオリゴヌクレオチドとの迅速な相互作用を確実にする。高濃度オリゴヌクレオチドプライマーは、特に、標的配列のコピー数がＤＮＡ分子の複合混合物中に少なく存在する場合、問題を引き起こし得る。これは、例えば、ゲノムのＰＣＲにおいて、１つの遺伝子座内の遺伝的多型を測定する場合であり得る。

高いオリゴヌクレオチド濃度の使用に伴う問題の１つは、複合ＤＮＡ混合物において一部のみマッチする配列でミスプライミングの程度が増大されることである。ミスプライミングは、ＰＣＲにおいてプライマー配列が鋳型核酸に完全に相補的でない場合でさえ起こる鋳型ＤＮＡへのプライマーのハイブリダーゼーションをいい、これは核酸の非特異的増幅をもたらし得る。ミスプライミングによるノイズは、オリゴヌクレオチド濃度および出発ＤＮＡの全体的な複雑性とともに増加する。また、ミスプライミングの可能性は、標的配列のコピー数が減少するにつれて増加する。ミスプライミングの条件が有利である場合（すなわち、高いオリゴヌクレオチド濃度、高い複雑性、低いコピー数）、誤って増幅された配列は、主反応産物となり得る。したがって、標的配列を試料ＤＮＡから、過剰なミスプライミングバックグラウンドのない、ミスのない増幅のための条件およびオリゴヌクレオチドを同定するのが困難となり得る。したがって、ＰＣＲを用いるさらなる不都合点は、複雑な配列混合物からのミスのない割合の標的ＤＮＡ増幅の成功が限定的であることである。

ＰＣＲによって発生する特異性の問題および鋳型融解問題に対する解決法の１つは、細菌のＲｅｃＡリコンビナーゼタンパク質、またはその原核生物および真核生物の類縁体の生物学的特性に依存する方法を用いることである。このようなタンパク質は、単鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を被覆してフィラメントを形成し、次いで、これが、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を配列相同性の領域についてスキャンする。相同配列がある場合、核タンパク質フィラメント鎖は、短いハイブリッドとＤループとして知られる被置換鎖バブルとを生成しているｄｓＤＮＡを侵入する。Ｄループ内のフィラメント鎖の遊離の３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、新たな相補鎖が合成され得る。相補鎖は、伸長されるにしたがって元の対合鎖を置き換える。オリゴヌクレオチド対を、ＰＣＲで用いるのと同様にして用いることにより、熱融解（熱サイクリング）をなんら必要とせずに、標的ＤＮＡ配列を類似な様式で増幅することが可能となるはずである。これは、これまでＰＣＲにおいて使用不可能であった熱不安定性ポリメラーゼの使用を可能にし、ハイブリダーゼーションの代わりに鋳型スキャニングおよび鎖侵入による忠実度および感度を増大させるという両方の利点を有する。

核酸のインビトロ増幅のためのＲｅｃＡおよびそのホモログの使用は、以前に報告されている（Ｚａｒｌｉｎｇｅｔａｌ．に対する特許文献１、本明細書において「Ｚａｒｌｉｎｇ」という）が、この方法および結果は限定的である。Ｚａｒｌｉｎｇ法は、二本鎖ＤＮＡの指数関数的増幅を達成するにはその能力が限定的であるという重大な短所を有する。Ｚａｒｌｉｎｇ法が指数関数的増幅を達成できないのは、ＡＴＰではなくＡＴＰγＳの使用をする仕様によるものであり得る。Ｚａｒｌｉｎｇ法は、より安定なＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡフィラメント構造がもたらされるため、ＲｅｃＡ核タンパク質フィラメントの合成においてＡＴＰの代わりにＡＴＰγＳの使用を要求する。通常、フィラメントは５’→３’方向に合成され、ＲｅｃＡがＡＴＰを加水分解すると、同じ５’→３’方向に自発的に分解する。このプロセスは、合成および分解が同時に起こり、合成されるフィラメントの量が平衡状態であるという点で動的である。非加水分解性ＡＴＰアナログであるＡＴＰγＳが使用された場合、ＡＴＰγＳの加水分解およびフィラメントの５’→３’分解が阻害される。鎖交換の前および後の両方におけるＲｅｃＡ／ＡＴＰγＳフィラメントの大きな安定性は、該標的化方法（すなわち、Ｚａｒｌｉｎｇ法）では有用であるが、ＤＮＡ増幅には不利かつ非実用的である。

Ｚａｒｌｉｎｇ法では、鎖侵入に関与するＲｅｃＡタンパク質は、鎖交換後に交換された物質の二本鎖部分と会合した状態のままである。この相互作用は、新たに形成された二本鎖が、ＲｅｃＡの高親和性部位に結合するため起こる。被置換鎖は、別の単鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）（例えば、大腸菌ＳＳＢ）に結合しない限り、異なる低親和性部位を占める。構造変化をもたらすためにＡＴＰを用いた場合、自発的５’→３’分解が起こり得るが、交換複合体はかなり安定であり得、ＡＴＰ依存性分解を刺激するさらなる因子が必要となり得る。自発的か刺激誘導型かどうかとは無関係に、ＡＴＰγＳの存在下では、ＲｅｃＡフィラメントの５’→３’分解が阻害される（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）．
このようなＲｅｃＡ／ｄｓＤＮＡ複合体は、続いて侵入および合成のラウンドを開始するのに用いるＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡプライマー複合体によって標的化される正確な部位である。実際、ＲｅｃＡが結合した状態では、中間体はポリメラーゼに接近し得ず、ｄｓＤＮＡは、ＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡプライマー複合体によって確実にはそれ以上侵入され得なくなり、したがって、この点から増幅可能でなくなる。さらに、このような鋳型からの合成は、ＲｅｃＡのない鋳型の他方の末端開始された場合に起こり得、これは、最終的に、結合ＲｅｃＡの物理的置換をもたらし得る。しかしながら、多くのポリメラーゼがこのような様式でＲｅｃＡを置換し得るのか否かは明らかでない。またさらに、その合成ラウンドの開始部位は、代わりに今度は「ブロックされる」。かかる状況では、増幅は、時間に対して線形であるにすぎず、主に単鎖ＤＮＡ増幅産物を生成する。

したがって、記載のＺａｒｌｉｎｇ法は、良くても、各鋳型から少量のｓｓＤＮＡコピーの生成が起こり得るに過ぎない。Ｚａｒｌｉｎｇ法によって潜在的に示される線状増幅は、被置換鎖が継続的にＲｅｃＡ上の第２の相互作用部位に結合し、単鎖ＤＮＡが遊離されないため、ＳＳＢの存在下でのみ起こる（非特許文献４）。これは、おそらく、なぜ、Ｚａｒｌｉｎｇ法でＳＳＢを含む場合にさらなるより高速移動性の断片が観察されたかを説明する。このようなさらなる断片は、最も置換されやすい単鎖断片であった。したがって、Ｚａｒｌｉｎｇ法では、よくても、単鎖ＤＮＡの線状増幅のみが起こる。したがって、当該技術分野において、改善されたリコンビナーゼ依存性ＤＮＡ増幅方法の必要性が存在する。

本発明は、ＤＮＡの熱融解または耐熱性成分の何らかの必要性を回避する２つの新たな増幅ストラテジーを利用するものである。また、これらのストラテジーはＺａｒｌｉｎｇ法の非効率性を解決する。Ｚａｒｌｉｎｇストラテジーの場合のように、これらの方法は、細菌のＲｅｃＡタンパク質、またはその原核生物および真核生物の類縁体、特に、ファージＴ４ｕｖｓＸタンパク質生物学的特性に依存する。しかしながら、Ｚａｒｌｉｎｇ法とは対照的に、これらの方法は、ｄｓＤＮＡの指数関数的増幅を達成するために考案されたものである。これらの方法は、これを、ＡＴＰ−γ−Ｓ負荷非動的なフィラメントではなく動的なリコンビナーゼ／ＤＮＡフィラメントの存在下、同時に高い組換え活性の維持をなし得る環境において、標的核酸内の標的化可能な配列の迅速な再生を行なうことにより達成する。さらにまた、重要なことには、組換え中間体からの伸長の概念は、以前に、Ｚａｒｌｉｎｇアプローチ、およびまたＡｌｂｅｒｔｓ実験室（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）ならびにその他（非特許文献８；非特許文献９；特許文献２）の両方において、概念および限定的な実施の検討が行なわれたが、いずれの記載も、これまでに、１０^１２倍の出力の増幅能を有する極めてすばらしい特異的で感度のよい指数関数的ＤＮＡ増幅を可能にする実用的な方法を教示していない。これは、高いリコンビナーゼ／フィラメント活性を補助するこの必要な環境の確立（インビトロ環境における大量の必要な単鎖ＤＮＡ結合タンパク質の存在下では極めて難しいことが示されている）、およびこの環境が、完全に成分の厳密な組合せに依存性であるためである。これは、最も重要で意外なことには、非常に特異的なクラウディング剤を含み、これは、インビトロ系の挙動を顕著で本質的に予測不可能な様式で改変する。この特定容量占有剤に関する系の挙動の顕著で非常に予測不可能な改変は、おそらく、これがフラクタル様反応速度論、相分離効果または生化学的系において他のさらなる特性をもたらす能力を反映している。迅速かつ高度に幾何級数的なＤＮＡ増幅、ならびに他の使用のためのインビトロでの高い持続性かつ動的な組換え活性をもたらす条件を可能にするかかる正確な条件を特定することにより、本発明では、新たなインビトロ分子的手法の創出を可能にする。本発明者らは、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）のような条件を可能にして行なう記載の増幅方法について言及する。本発明者らは、本明細書において、この高活性で持続性だが動的な組換え環境に基づくまたさらなる方法を想定しており、これは、おそらく後にやがて実用化されよう。本発明は、この新たなアプローチの創出を可能にし、何十年もの研究にもかかわらず、インビトロ手法のための広範囲のリコンビナーゼが使用される適用は、ＡＴＰ−γ−Ｓの使用に依存する非常に限定的な数のものは別として、他になかった現行の環境とは対照的であるはずである。

本発明において、本発明者らは、さらに進んで、ＲＰＡ反応が、反応生成物の動的な検出に充分に組み込まれ得ることを示す。これにより、ＲＰＡ反応が、リアルタイム解析の２つの一般的な基準を達成することが確認される。第１に、生化学的センサー、例えば、感知用色素（ＳＹＢＲ緑または「第３の」プローブなど）は、ＲＰＡ反応環境に適合性である。かかる適合性は、ＲＰＡは、色素またはプローブの結合挙動を妨げ得る飽和量のＤＮＡ結合タンパク質用いるため、些細な仮定ではない。逆に、核酸への色素またはプローブの結合は、ＤＮＡ結合タンパク質の活性によって妨げられていたかもしれない。第２に、リアルタイム定量的適用において用いるためには、ＲＰＡは、相当な範囲の出発鋳型量にわたって、標的ＤＮＡの指数関数的ＤＮＡ増幅を示すのに必要であり、指数関数的増幅をセンサー系全体の検出範囲内の濃度まで容易に維持し得る。

また、本発明において、本発明者らは、ＲＰＡ反応を制御するアプローチ、潜在的に同調させる態様を開示する。現行のＲＰＡの構成では、ＤＮＡ標的化フェーズとＤＮＡ合成フェーズとの間に時間的分離はない。ＲＰＡでは、律速試薬をすべての試料に同時に供給するか、または反応物を非許容温度で合成されない限り、ＲＰＡのすべての反応が正確に同じ瞬間に開始するのを確実にすることは困難である。本発明者らは、侵入を充分間隔を空けた短いバーストに制限することにより、ＲＰＡ反応が開始され得、プライミング活性の個々の「ラウンド」が調整され得るアプローチを示す。リコンビナーゼ活性を短い制限されたバーストに制限するかかるアプローチにより、増幅が改善され得る。ＲＰＡにおいてＤＮＡ侵入を制御するための方法の１つは、遊離ＡＴＰの濃度の調整によるものであり得る。充分なＡＴＰまたは過剰のＡＤＰの非存在下では、リコンビナーゼ／ＤＮＡフィラメントが分解され、組換えが停止する。ケージ化ＡＴＰは、ｒｅｃＡ負荷を補助しないが、続いて、非ケージ物質が補助する［非特許文献１１］。したがって、ＲＰＡ反応におけるケージ化ＡＴＰアナログの使用（これは、光によるパルスにおいて脱保護され得、したがって、リコンビナーゼ活性のバーストを可能にする）は、ＲＰＡ反応の侵入フェーズを制御するための有効な手段であるはずである。あるいはまた、ＡＴＰ濃度は、別の方法、例えば、外部供給源からの反応物への周期的なＡＴＰの添加によって、または反応物中でＡＴＰの周期的な増加をもたらすことができる生化学的オシレータを確立することにより、周期的に制御され得る。

本発明において、本発明者らは、５’配列設計により如何にして理想的なリコンビナーゼ／ｓｓＤＮＡ負荷を達成するかの知識を拡張し、ＤＮＡ増幅反応に加えて、重要であるこの安定で動的な組換え環境が使用され得る状況の範囲を拡大する。本発明者らは、さまざまな分子的適用において、本発明の場合以外では熱的または化学的融解、または他の二本鎖標的化アプローチを必要とし得る任意のプロセスの古典的なハイブリダイゼーション工程に取って代わるために、如何にしてこの特有の構成を使用し得るかについて記載する。特に、合成オリゴヌクレオチドの存在下での安定で動的な組換え環境の使用は、他の酵素系との組合せにおいて、熱的または化学的融解の必要性がないこと、ならびにより広範囲の酵素の使用および熱サイクリング設備の回避が同時に可能であることにより、上記のポリメラーゼ系よりも有用である。
米国特許第５，２２３，４１４号明細書国際出願公開第０２／０８６１６７号パンフレットＰａｕｌｕｓ，Ｂ．Ｆ．ａｎｄＢｒｙａｎｔ，Ｆ．Ｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９７）３６，７８３２−８Ｒｏｓｓｅｌｌｉ，Ｗ．ａｎｄＳｔａｓｉａｋ，Ａ．ＪＭｏｌＢｉｏｌ（１９９０）２１６，３３５−５２Ｓｈａｎ，Ｑ．ｅｔａｌ．，ＪＭｏｌＢｉｏｌ（１９９７）２６５，５１９−４０Ｍａｚｉｎ，Ａ．Ｖ．ａｎｄＫｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ，Ｓ．Ｃ．ＥＭＢＯＪ（１９９８）１７，１１６１−８ＦｏｒｍｏｓａＴ，ＡｌｂｅｒｔｓＢＭ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ（１９８６）Ｍａｙ５；２６１（１３）：６１０７−１８ＭｏｒｒｉｃａｌａｎｄＡｌｂｅｒｔｓＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．（１９９０）Ｓｅｐ５；２６５（２５）：１５０９６−１０３ＭｏｒｒｉｃａｌＳＷ，ＷｏｎｇＭＬ，ＡｌｂｅｒｔｓＢＭ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．（１９９１）Ｊｕｌ２５；２６６（２１）：１４０３１−８ＳａｌｉｎａｓＦ，ＪｉａｎｇＨ，ＫｏｄａｄｅｋＴ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．（１９９５）Ｍａｒ１０；２７０（１０）：５１８１−６Ｍｏｒｅｌ，Ｐ．，Ｃｈｅｒｎｙ，Ｄ．，Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｓ．Ｄ．ａｎｄＣａｓｓｕｔｏ，Ｅ．（１９９７）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７２，１７０９１−６．Ｂｅｎｋｏｖｉｃ，Ｓ．Ｊ．，Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ，Ａ．Ｍ．ａｎｄＳａｌｉｎａｓ，Ｆ．（２００１）ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ７０，１８１−２０８．ＢｕｔｌｅｒＢＣ，ＨａｎｃｈｅｔｔＲＨ，ＲａｆａｉｌｏｖＨ，ＭａｃＤｏｎａｌｄＧ（２００２）ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＣｈａｎｇｅｓＩｎｄｕｃｅｄＢｙＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＢｉｎｄｉｎｇｔｏＲｅｃＡＵｓｉｎｇＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅＦＴＩＲ．ＢｉｏｐｈｙｓＪ８２（４）：２１９８−２２１０

（発明の概要）
本発明は、ＲＰＡと称するＤＮＡの増幅方法を提供し、以下の工程を含む。第１に、リコンビナーゼ因子を、第１および第２の核酸プライマーと接触させ、第１および第２の核タンパク質プライマーを形成する。第２に、第１および第２の核タンパク質プライマーを二本鎖標的配列に接触させて、前記第１の鎖の第１の部分に第１の二本鎖構造を形成させ、そして前記第２の鎖の第２の部分に二本鎖構造を形成させ、前記第１の核酸プライマーおよび前記第２の核酸プライマーの３’末端が、所与の鋳型ＤＮＡ分子で互いに向かって配向される。第３に、前記第１および第２の核タンパク質プライマーの３’末端はＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、第１および第２の二本鎖核酸ならびに核酸の第１および第２の被置換鎖を生成させる。最後に、第２および第３の工程を所望の増幅度に達するまで反復する。

本発明はまた、ネステッドＲＰＡ法を提供する。ネステッドＲＰＡでは、核酸の第１の領域をＲＰＡによって増幅させ、第１の増幅された領域を形成させる。次いで、完全に第１の増幅された領域内にある核酸の第２の領域をＲＰＡを用いて増幅し、第２の増幅された領域を形成させる。このプロセスは、必要なだけ多く反復され得る。例えば、完全に第２の領域内にある核酸の第３の領域は、第２の増幅された領域からＲＰＡによって増幅され得る。上記のような１、２および３ラウンドのＲＰＡに加え、本発明では、少なくとも４、好ましくは少なくとも５ラウンドのネステッドＲＰＡもまた想定される。

本発明はまた、ＲＰＡを用いた遺伝子型の検出方法を提供する。この方法は、正常または疾患状態、素因、または疾患状態の素因の欠如を検出するための遺伝子型特定に有用である。さらに、ＲＰＡは、ゲノム（例えば、病原体のゲノム）の存在を検出するために使用され得る。この使用では、該方法は診断および検出に有用である。

本発明はまた、有効な増幅反応を確立するのに必要なリコンビナーゼ、単鎖結合タンパク質、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドの性質および濃度を詳細に示す。本発明は、さらに、標的ＤＮＡの性質、長さ、および標的化オリゴヌクレオチドの組成、ならびに種々の条件下での増幅に最適な内部オリゴヌクレオチド長に関する詳細な実施可能性を提供する。本発明は、感度のよい、強力な、最適なシグナル対ノイズ比特性を有する組換えポリメラーゼ増幅系の確立に寄与するさらなる成分の包含または修飾された成分の使用を提供する。特に、１種類より多いリコンビナーゼの使用を示し、リコンビナーゼ大腸菌ｒｅｃＡおよびＴ４バクテリオファージｕｖｓＸ、ポリメラーゼ（例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片、Ｂｓｔポリメラーゼ、φ−２９ポリメラーゼ、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＰｏｌＩ（Ｂｓｕ））の遺伝子操作および修飾されたアナログの実用性、ならびに大腸菌およびＴ４（ｇｐ３２タンパク質）由来の単鎖ＤＮＡ結合タンパク質の実用性を詳細に示す。

改変された協同性および／または鎖同化特性を有する形態のｇｐ３２の実用性を示す。また、最適な反応環境の確立を助長するための、Ｔ４ｕｖｓＹタンパク質、および最も具体的には分子クラウディング剤、特に、ＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍとしても知られる）の使用を示す。さらに、本発明では、増幅挙動を改善するための、ＤＮＡ代謝に関与する他の酵素（例えば、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼおよびヌクレアーゼ）の効果および可能な使用を詳細に示す。本発明はまた、線状増幅を生成するスーパーコイルまたは線状鋳型に標的化されるプライマーの反復的な侵入／伸長に最適化された条件の使用、およびＤＮＡ配列決定のための本方法の使用を含む。また、本発明では、何らかの様式で標識されたオリゴヌクレオチドを、特定の産物種に指向し、結果としての反応体の出現または性質の変化を測定することによる反応の特異的増幅産物の検出における、リコンビナーゼの使用を記載する。

本発明はまた、とりわけ診断適用のためのＲＰＡ法の実施を改善するためのデータおよびアプローチを提供する。高い感度および特異性の試験のためのオリゴヌクレオチド長、塩基組成の注意深い設計、および修飾された主鎖糖残基に基づくストラテジーの使用。本発明者らはまた、オリゴヌクレオチドを核タンパク質フィラメントとしての異なる活性と組合せ、シグナル対ノイズ比を改善するためのアプローチを開示する。また、ゲル電気泳動を不要にし、場合によっては、「第３の」特異的オリゴヌクレオチドを用いる産物検出の方法を開示する。本発明者らは、緩衝化試料のみで再構成した場合、周囲温度で少なくとも１０日間保存され得、増幅活性を保持し得る活性な凍結乾燥物の構成を開示する。

本発明はまた、定量的リアルタイム適用におけるＲＰＡ法の使用を可能にする許可データを開示する。本発明者らは、ＳＹＢＲ緑またはＳＹＢＲ金の蛍光核酸結合色素の適切な希釈物がＲＰＡ反応と適合性であり、産物の蓄積ののモニタリングを可能にすることを示す。産物は、見かけ上指数関数的に、閾値検出レベルに達した後での定量を可能にするのに充分な時間継続して蓄積される。本発明者らは、このアプローチを用い、出発鋳型量の少なくとも４または５オーダーの大きさにわたってＲＰＡが定量的であることを実験的に示す。多くのパラレル反応の同時開始は、反応ミックスを氷上で確立し、次いで、試料を反応温度（３３〜３９℃）に同時にシフトすることにより達成される。あるいはまた、パラレルＲＰＡ反応は、他の手段、例えば、ＡＴＰまたはケージ化オリゴヌクレオチドプライマーの光誘発性脱ケージ化などによって同時に開始され得る。本発明者らは、ＲＰＡ系と適合性であり得る他の産物特異的リアルタイムモニタリングアプローチを詳細に示す。本発明者らはまた、実験室および非実験室状況の両方で廉価で携帯型の実施が可能となり得る低出力固相状態構成要素で構成された、リアルタイムＲＰＡデバイスの全体的な組成を記載する。

本発明はまた、必要な補助性ヌクレオシド三リン酸補因子（例えば、ＡＴＰなど）の存在を、反応中、限定された期間に制御することにより達成される、ＲＰＡ反応の制御方法を開示する。化学的ケージ化ヌクレオチド三リン酸を使用する場合、光保護基の脱ケージ化波長に対応する規定の光のバースト照射により、遊離ＡＴＰのパルスを生成させ得る。次いで、放出されるＡＴＰが、単鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）へのリコンビナーゼタンパク質の結合を可能にし、続いて、リコンビナーゼ−ｓｓＤＮＡ複合体の相同性検索および鎖交換活性を許容する。あるいはまた、ＡＴＰを、周期的に反応物に添加してもよい。経時的に、ＡＴＰの濃度は、リコンビナーゼ加水分解または過剰のＡＴＰおよびＡＤＰを加水分解するために特別に添加された他の反応成分による加水分解のいずれかの加水分解の結果として減少する。したがって、ＡＴＰ濃度の減少および／またはＡＤＰ濃度の増加によって規定される一定時間の後、リコンビナーゼ分子は、機能を停止し、ＤＮＡから解離する。続いて脱ケージ化波長の光のパルスを送達し、新たなＡＴＰを放出させてもよく、または新たなＡＴＰを添加し、再度リコンビナーゼ活性を起始させてもよい。このようにして、相同性検索およびプライミングの一連の期間の制御が可能となり、その結果、伸長の開始が段階的に行なわれる。

ＲＰＡ反応の侵入フェーズを制御するための第２の方法として、本発明者らは、一方のプライマーによって誘発される活性を他方から分離するためのアプローチについて記載する。この方法では、１つのプライマー標的部位でのリコンビナーゼ媒介性侵入およびそのプライマーからの合成の終了を利用する。これにより、単鎖被置換ＤＮＡが生成され、次いで、これは修飾され、これによって合成のリコンビナーゼ媒介性開始を補助することができない、第２の対向プライマー用鋳型として使用され得る。これにより、おそらく、ポリメラーゼの衝突によって生じる対立が回避される。

本発明はまた、サイズ分画の必要なく、増幅産物の多型性の性質を評価するためのアプローチを開示する。増幅反応生成物は、リコンビナーゼおよび／または単鎖ＤＮＡ結合タンパク質および他のアクセサリー分子の作用により、最初は単鎖または二本鎖のいずれかの特徴の固定化されたプローブと二本鎖ハイブリッドを形成することが許容される。リコンビナーゼ作用の動的環境において存在し、かつ多種多様なさらなる酵素性成分の活性に対して補助的である、産物とプローブ間で形成される不完全なハイブリッドを不安定化させる方法を記載する。生成されるハイブリッドは、分子的相互作用の有無を示すために用いられる多くの標準的なアプローチの１つにより検出される。

また、本発明では、他の触媒活性を伴って安定で持続性の動的な組換え環境を補助し、したがって、鎖侵入およびｓｓＤＮＡと二本鎖間での対合形成が、他の代謝酵素、特に、熱的または化学的融解を用いる系において従来のアプローチ、ならびに同等ではないが達成し得る他のプロセスでは必要であり得る非好熱性酵素の存在下で連続的に起こるのを可能にする、決定されたインビトロ条件の組合せを記載する。本発明者らはまた、最適化された配列を所望の配列内の特に５’末端に含めることにより、安定で動的な組換え系において高活性が可能となるようにオリゴヌクレオチドの設計を改善する知見を記載する。

本発明の他の実施形態、目的、態様、特徴、および利点は、添付の説明および特許請求の範囲から明らかとなろう。

（発明の詳細な説明）
本発明は、標的核酸ポリマーの増幅のための方法の１つであるリコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を提供する。また、本発明は、高いリコンビナーゼ活性が高度に動的な組換え環境において維持されており、ＡＴＰによって補助される一般的なインビトロ環境を提供する。ＲＰＡの利点の１つは、二本鎖鋳型の熱融解を必要とせずに行い得ることである。したがって、高価なサーモサイクラーの必要性も排除される。本発明では、ＲＰＡが標的核酸ポリマーの指数関数的増幅を可能にするように構成され得る２つの関連するストラテジーを記載する。

当該技術分野の現状および内容を説明するため、本明細書の至るところに種々の特許、特許出願公開公報および科学文献を引用する。それらの開示は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。

（リーディング鎖リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ｌｓＲＰＡ））
リーディング鎖リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ｌｓＲＰＡ）では、単鎖または部分的に単鎖の核酸プライマーを、相同な二本鎖または部分的に二本鎖の配列にリコンビナーゼ因子を用いて標的化させ、これによりＤループ構造が形成され得る。Ｄループの一部である侵入性単鎖プライマーを用い、ポリメラーゼ合成反応を開始させる。単一のプライマー種が標的核酸配列を、多数回の二本鎖侵入の後、合成を行なうことにより増幅する。２種類の対向するプライマーが用いられる場合、断片（標的配列）の増幅が達成され得る。ＬｓＲＰＡを、簡単に図１および２に示す。

増幅対象の標的配列は、本発明の方法のいずれにおいても、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。しかしながら、本発明の方法は二本鎖ＤＮＡに限定されない。何故なら、他の核酸分子（例えば、単鎖ＤＮＡまたはＲＮＡなど）は、当業者が機知の方法を用いることにより二本鎖ＤＮＡに変えることができるためである。好適な二本鎖標的ＤＮＡはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。本発明のＲＰＡでは、標的核酸が、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１，０００倍、さらにより好ましくは少なくとも１０，０００倍、最も好ましくは少なくとも１，０００，０００倍に増幅され得る。

標的配列は、リコンビナーゼ因子の補助により増幅される。リコンビナーゼ因子は、単鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を被覆してフィラメントを形成し得、次いで二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を、配列が相同性の領域についてスキャンし得る酵素である。相同配列がある場合、核タンパク質フィラメント（リコンビナーゼ因子を含む）鎖は、短いハイブリッドとＤループとして知られる被置換鎖バブルとを生成しているｄｓＤＮＡに侵入する。好適なリコンビナーゼ因子としては、大腸菌ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４ｕｖｓＸタンパク質、または任意の門由来の任意の相同なタンパク質もしくはタンパク質複合体が挙げられる。真核生物ＲｅｃＡホモログは、同定するため、この群の第１の構成員にちなんで一般的にＲａｄ５１と称される。他の非相同なリコンビナーゼ因子、例えば、ＲｅｃＴまたはＲｅｃＯなどが、ＲｅｃＡの代わりに使用され得る。リコンビナーゼ因子は、一般的に、ＡＴＰ、ＡＴＰγＳまたは他のヌクレオシド三リン酸およびそのアナログの存在を必要とする。リコンビナーゼ因子は、反応環境において使用されることが好ましい。標的化部位の再生は、１回のＤループ刺激合成の直後に起こり得る。リコンビナーゼ分解が関与する完全な組換え事象では、増幅の失速、または一方の末端から他方への一方向合成の周期化によって引き起こされる、ｓｓＤＮＡの非常に非効率な線状増幅が回避される。

また、当然、上記のリコンビナーゼ因子の任意の誘導体および機能的アナログも、それ自体がリコンビナーゼ因子としての機能を果たし得、これらの誘導体およびアナログもまた、本発明の実施形態として想定される。例えば、ｒｅｃＡの組換え特性のいくつかの態様を保持していることが示されているｒｅｃＡ由来の低分子ペプチドが使用され得る。このペプチドは、大腸菌ｒｅｃＡの残基１９３〜２１２を含み、単鎖オリゴの対合形成を媒介し得る（ＯｌｅｇＮ．Ｖｏｌｏｓｈｉｎ，ＬｉｊａｎｇＷａｎｇ，Ｒ．ＤａｎｉｅｌＣａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ，ＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓＤＮＡｐａｉｒｉｎｇＰｒｏｍｏｔｅｄｂｙａ２０−ａｍｉｎｏＡｃｉｄＰｅｐｔｉｄｅＤｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＲｅｃＡ．ＳｃｉｅｎｃｅＶｏｌ．２７２１０Ｍａｙ１９９６）。

ＡＴＰγＳの使用は、効率的な増幅と両立しないことがあり得る安定なリコンビナーゼ因子／ｄｓＤＮＡ複合体の形成をもたらすため、リコンビナーゼ因子／ｓｓＤＮＡプライマー複合体を負荷および維持するために、ＡＴＰおよび補助酵素を用いることが好ましい。あるいはまた、ＡＴＰγＳの使用の制限は、ＡＴＰγＳに結合したｒｅｃＡを交換複合体から外すことができるさらなる反応成分の使用によって解決され得る。この役割は、ＲｕｖＡ／ＲｕｖＢ複合体などのヘリカーゼによって果たされ得る。

用語「核酸ポリマー」または「核酸」は、本説明において用いる場合、広く解釈され得、ＤＮＡおよびＲＮＡならびに他のハイブリッド形成性核酸様分子、例えば、置換された主鎖を有するもの、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ主鎖の核酸、ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）核酸または修飾された塩基および糖を有する他の核酸が挙げられる。

構造的にＲＮＡと類似するＬＮＡモノマーは、ヌクレオチド糖環の２位の酸素をその４位の炭素に連結するメチレンリンカーを有する二環式化合物である。ＬＮＡポリマーは、標準的な塩基対合形成規則に従うが、その物理的特性によって、ミスマッチ識別適用用途に適している。ＬＮＡは、Ｅｘｉｑｏｎ（Ｄｅｎｍａｒｋ）またはＰｒｏｌｉｇｏ（ＵＳＡ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）から入手可能である。

本発明の一実施形態は、ＲＰＡを行なう方法に関する。該方法は、２つの工程を含む。第１の工程では、以下の試薬：（１）少なくとも１種類のリコンビナーゼ；（２）少なくとも１種類の単鎖ＤＮＡ結合タンパク質；（３）少なくとも１種類のＤＮＡポリメラーゼ；（４）ｄＮＴＰまたはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物；（５）クラウディング剤；（６）バッファー；（７）還元剤；（８）ＡＴＰまたはＡＴＰアナログ；（９）少なくとも１種類のリコンビナーゼ負荷タンパク質；（１０）第１のプライマー、および任意選択で第２のプライマー；ならびに（１１）標的核酸分子を、反応において合わせる。第２の工程では、該試薬を所望の増幅度に達するまでインキュベートする。

リコンビナーゼは、ｕｖｓＸ、ｒｅｃＡまたは両者の組合せであり得る。また、リコンビナーゼは、その活性を改善させるために酸性残基のＣ末端欠失を含み得る。本明細書に開示した任意のリコンビナーゼ濃度が使用され得るが、好ましいリコンビナーゼ濃度は、例えば、０．２〜１２μＭ、０．２〜１μＭ、１〜４μＭ、４〜６μＭ、および６〜１２μＭの範囲であり得る。

単鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、大腸菌ＳＳＢもしくはＴ４ｇｐ３２またはこれらのタンパク質の誘導体もしくは組合せであり得る。ｇｐ３２誘導体としては、少なくとも、ｇｐ３２（Ｎ）、ｇｐ３２（Ｃ）、ｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａ、ｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｑ、ｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｔ、ｇｐ３２Ｋ３Ａ、ｇｐ３２Ｒ４Ｑ、ｇｐ３２Ｒ４Ｔおよびそれらの組合せが挙げられ得る（図１３を参照）。ＤＮＡ結合タンパク質は、１μＭ〜３０μＭの濃度で存在し得る。

ＤＮＡポリメラーゼは、真核生物のポリメラーゼであってもよい。真核生物のポリメラーゼの例としては、ｐｏｌ−α、ｐｏｌ−β、ｐｏｌ−δ、ｐｏｌ−εならびにその誘導体および組合せが挙げられる。原核生物のポリメラーゼの例としては、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片、バクテリオファージＴ４ｇｐ４３ＤＮＡポリメラーゼ、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼＩラージフラグメント、φ−２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＰｏｌＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＶならびにその誘導体および組合せが挙げられる。好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、１０，０００単位（ユニット）／ｍｌ〜１０単位／ｍｌ、例えば５０００単位／ｍｌ〜５００単位／ｍｌの濃度である。別の好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くものである。また別の好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは鎖置換特性を含む。

本発明の方法において言及されるタンパク質はいずれも、その誘導体も含むと理解される。このようなタンパク質としては、少なくとも以下のもの：リコンビナーゼ、ポリメラーゼ、リコンビナーゼ負荷タンパク質、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質、アクセサリー因子、ＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡ核タンパク質フィラメント安定化剤などが挙げられる。これらのタンパク質の誘導体としては、少なくとも、Ｃ末端タグ、Ｎ末端タグ、またはＣ末端タグおよびＮ末端タグを含む融合タンパク質が挙げられる。好適な配列タグの非限定的な例としては、６−ヒスチジン（６×−ヒス；ＨＨＨＨＨＨ；配列番号：８２）、ｃ−ｍｙｃエピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号：８３）、ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号：８４）、プロテインＣ（ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ；配列番号：８５）、Ｔａｇ−１００（ＥＥＴＡＲＦＱＰＧＹＲＳ；配列番号：８６）、Ｖ５エピトープ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ；配列番号：８７）、ＶＳＶ−Ｇ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ；配列番号：８８）、Ｘｐｒｅｓｓ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ；配列番号：８９）、および血球凝集素（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号：９０）が挙げられる。好適なタンパク質タグの非限定的な例としては、β−ガラクトシダーゼ、チオレドキシン、ヒスパッチチオレドキシン、ＩｇＧ−結合ドメイン、インテイン−キチン結合ドメイン、Ｔ７遺伝子１０、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられる。当業者には、配列タグおよびタンパク質タグが、例えば、精製および／または同定目的のために互換的に使用され得ることが理解されよう。したがって、本明細書で用いる場合、用語「ヒス（Ｈｉｓ）タグ」および「ヘキサヒスチジンタグ」は、当該技術分野で知られ、このパラグラフに示したすべての好適な配列タグおよびタンパク質タグを包含する。

ＤＮＴＰとしては、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰが挙げられる。リーディング鎖／ラギング鎖ＲＰＡでは、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、およびＵＴＰもまた、ＲＮＡプライマーの合成に含め得る。また、ｄｄＮＴＰ（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＣＴＰ）は、断片ラダーを生成させるために使用され得る。ｄＮＴＰは、各ＮＴＰ種の１μＭ〜２００μＭの濃度で使用され得る。ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物は、ｄＮＴＰ（ｌμＭ〜２００μＭ）の１／１００〜１／１０００のｄｄＮＴＰ濃度で使用され得る。

ＲＰＡで用いられるクラウディング剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストランおよびフィコールが挙げられる。クラウディング剤は、反応物の１％〜１２容量％または１％〜１２重量％の濃度であり得る。あらゆるＰＥＧが有用であるが、好ましいＰＥＧとしては、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、分子量１５０００〜２０，０００のＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍとしても知られる）、およびそれらの組合せが挙げられる。

ＲＰＡにおけるバッファー溶液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、Ｔｒｉｓ−酢酸塩バッファー、またはそれらの組合せであり得る。バッファーは、１０〜１００ｍＭの濃度で存在し得る、緩衝化されたｐＨは、６．５〜９．０であり得る。バッファーは、Ｍｇイオン（例えば、Ｍｇ酢酸塩の形態で）を、１〜１００ｍＭ（５〜１５ｍＭの濃度が好ましい）の濃度でさらに含有し得る。好ましいＭｇ濃度の一例は１０ｍＭ（Ｍｇ濃度またはＭｇ酢酸塩濃度）である。

使用される還元剤としては、ＤＴＴが挙げられる。ＤＴＴ濃度は１ｍＭ〜１０ｍＭであり得る。

ＡＴＰまたはＡＴＰアナログは、ＡＴＰ、ＡＴＰ−γ−Ｓ、ＡＴＰ−β−Ｓ、ｄｄＡＴＰまたはそれらの組合せのいずれかであり得る。好ましいＡＴＰまたはＡＴＰアナログ濃度は１〜１０ｍＭである。

リコンビナーゼ負荷タンパク質としては、例えば、Ｔ４ｕｖｓＹ、大腸菌ｒｅｃＯ、大腸菌ｒｅｃＲならびにこれらのタンパク質の誘導体および組合せが挙げられ得る。これらのタンパク質の好ましい濃度の一例は０．２〜８μＭである。

使用されるプライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノ主鎖核酸、ホスホロチオレート主鎖核酸およびそれらの組合せから作製されたものであり得る。これらにおけるそれらの組合せは、単一の核酸分子を示すものであり得、１個以上の別の塩基に連結された１個の塩基の１個以上を含有し得る。このような分子の好ましい濃度は、２５ｎＭ〜１０００ｎＭの範囲であり得る。好ましい一実施形態では、プライマーは、その３’末端の２つの塩基間に非リン酸結合を含有し得、３’→５’ヌクレアーゼ活性に対して抵抗性である。別の実施形態では、プライマーは、ロックされた核酸をその３’の最後の塩基または３’の最後から２番目の塩基に含有し得る。例えば、配列５’−ＡＧＴ−３’の核酸では、Ｔが３’最後の塩基であり、Ｇが３’の最後から２番目の塩基である。プライマーは、少なくとも２０塩基長または少なくとも３０塩基長であり得る。好ましい一実施形態では、プライマー２０〜５０塩基長である。別の好ましい実施形態では、プライマー２０〜４０塩基長、例えば、３０〜４０塩基長である。

プライマーは、標的核酸分子に相補的でないさらなる５’配列を含有し得る。このような５’配列は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有し得る。プライマーは、単鎖３’末端を有する部分的に二本鎖であり得る。

また、任意の本発明の方法の任意の核酸は、検出可能な標識で標識されたものであり得る。検出可能な標識としては、例えば、蛍光色素、酵素、蛍光消光剤、酵素阻害剤、放射性標識およびそれらの組合せが挙げられる。

標的核酸は、単鎖または二本鎖であり得る。単鎖核酸は、本発明の方法において二本鎖核酸に変換され得ることがわかっている。標的核酸は、スーパーコイルまたは線状であり得る。増幅対象の配列（標的核酸）は、他の配列間の中間に存在するものであり得る。増幅対象の配列はまた、線状核酸の一方の末端に存在するものであり得る、一実施形態では、標的核酸は線状であり、非標的核酸に連結されていない。換言すると、標的核酸が線状である場合、これは、以下の形式：
１．［非標的核酸］−［標的核酸］ −［非標的核酸］
２．［非標的核酸］−［標的核酸］
３．［標的核酸］−［非標的核酸］
４．［標的核酸］
のいずれかであり得る。

上記の構成は、単鎖核酸および二本鎖核酸の両方を表すことが意図されることに注意されたい。「１」は、２つの末端を有する線状標的核酸分子であって、非標的核酸分子に両方が連結されていることを示すものであり得る。「２」は、２つの末端を有する線状標的核酸分子であって、一方が非標的核酸分子に連結されていることを示すものであり得る。「３」は、線状核酸分子（非標的核酸を有しない）である標的核酸分子として示され得る。

別の実施形態では、標的核酸は、ポリメラーゼによって二本鎖核酸に変換されるか、加熱または化学的処理の作用によって変性される二本鎖核酸に変換される単鎖核酸であり得る。

標的核酸は、反応中、任意の濃度、例えば、１０，０００コピー未満、１０００コピー未満、１００コピー未満、１０コピー未満または１コピーであり得る。反応容量は、５μｌ、１０μｌ、２０μｌ、３０μｌ、５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、３００μｌ、１ｍｌ、３ｍｌ、１０ｍｌ、３０ｍｌ、５０ｍｌまたは１００ｍｌであり得る。

反応物は、５分間〜１６時間、例えば、１５分間〜３時間または３０分間〜２時間インキュベートさせ得る。インキュベーションは、所望の増幅度に達するまで行なわれ得る。所望の増幅度は、１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍または１００００００倍の増幅であり得る。インキュベーション温度は、２０℃〜５０℃、２０℃〜４０℃、例えば、２０℃〜３０℃であり得る。本発明の方法の利点の１つは、温度が重要でなく、正確な制御は好ましいが、絶対的に必要でないことである。例えば、現場環境では、試料を身体の隙間（ｃｒｅｖｉｃｅ）に入れることにより、ＲＰＡを室温または体温付近（３５℃〜３８℃）に維持することで充分である。さらにまた、ＲＰＡは、鋳型核酸の温度誘導性融解なしで行なわれ得る。

本発明の別の実施形態では、ＲＰＡは、アクセサリー因子をさらに含む。このアクセサリー因子としては、ＤＮＡに対して、それぞれ巻き解き、弛緩、および解離活性を有するヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リゾルベースおよびそれらの組合せが挙げられる。また、アクセサリー因子としては、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、ＲｕｖＣ、ＲｅｃＧ、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＴ、ＤｎａＢ、ＤｎａＣ、ＤｎａＧ、ＤｎａＸクランプ負荷体、ポリメラーゼコア複合体、ＤＮＡリガーゼおよびスライディングクランプおよびそれらの組合せが挙げられ得る。スライディングクランプは、大腸菌β−二量体スライディングクランプ、真核生物のＰＣＮＡスライディングクランプ、またはＴ４スライディングクランプｇｐ４５およびそれらの組合せであり得る。加えて、アクセサリー因子としては、β−クランプ、ＤｎａＸクランプ負荷体、およびポリメラーゼコア複合体からなるＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素複合体が挙げられ得る。このような後者のアクセサリー因子は、リーディングおよびラギングＲＰＡの実行を可能にし得る。

別の実施形態では、ＲＰＡは、ＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡ核タンパク質フィラメント安定化剤の存在下で行なわれ得る。かかる安定化剤の例としては、ＲｅｃＲ、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＦおよびそれらの組合せが挙げられる。このような安定化剤は、０．０１μＭ〜２０μＭの濃度で存在し得る。安定化剤の他の例としては、ｕｖｓＸ／ｓｓＤＮＡ核タンパク質複合体を安定化させるＴ４ｕｖｓＹタンパク質が挙げられる。

ＲＰＡの他の構成要素としては、ＡＴＰ再生のための系（ＡＤＰをＡＴＰに変換）が挙げられる。かかる系は、例えば、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼであり得る。

また、ＲＰＡ反応は、ＡＤＰをＡＭＰから再生させるための系およびピロリン酸塩をリン酸塩（ピロリン酸塩）に変換するための系を含み得る。

好ましい一実施形態では、上記のＲＰＡ反応は、大腸菌成分により、ｒｅｃＡ、ＳＳＢ、ｒｅｃＯ、ｒｅｃＲおよび大腸菌ポリメラーゼを用いて完全に行なわれる。

別の好ましい実施形態では、ＲＰＡ反応は、Ｔ４成分により、ｕｖｓＸ、ｇｐ３２、ｕｖｘＹ、およびＴ４ポリメラーゼを用いて行なわれる。

好ましい一実施形態では、ＲＰＡは、以下の試薬：（１）０．２〜１２μＭの濃度のｕｖｓＸリコンビナーゼ；（２）１〜３０μＭの濃度のｇｐ３２単鎖ＤＮＡ結合タンパク質；（３）５００〜５０００単位／ｍｌの濃度のＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント（Ｂｓｕポリメラーゼ）；（４）１〜３００μＭの濃度のｄＮＴＰまたはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物；（５）１％〜１２％（重量または容量基準）の濃度のポリエチレングリコール；（６）１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；（７）１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のＤＴＴ；（８）１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のＡＴＰ；（９）０．２μＭ〜８μＭの濃度のｕｖｓＹ；（１０）第１のプライマー、および任意選択で第２のプライマー（これらのプライマーは５０ｎＭ〜１μＭの濃度である）；ならびに（１１）少なくとも１つのコピーの標的核酸分子を合わせることにより行なわれ得る。反応物が合成された後、これを、所望の増幅度に達するまでインキュベートする。これは、通常、２時間以内、好ましくは、１時間以内、例えば５０分間である。

本発明の利点の１つは、ＲＰＡ用試薬（おそらく、クラウディング剤およびバッファーは例外）は、使用前に、フリーズドライ（すなわち、凍結乾燥）され得ることである。フリーズドライ試薬は、活性を維持するために冷蔵を要しないという利点をもたらす。例えば、ＲＰＡ試薬のチューブは、室温で保存し得る。この利点は、冷蔵の利用が限定される現場条件で特に有用である。

一実施形態では、ＲＰＡ試薬は、チューブの底面上、またはビーズ（もしくは別の型の固相支持体）上にフリーズドライさせ得る。ＲＰＡ反応を行なうため、凍結乾燥試薬の組成に応じて、バッファー溶液中でクラウディング試薬と共に、または単に緩衝化溶液もしくは水中でこの試薬を再構成させる。次いで、標的核酸または標的核酸を含有することが疑われる試料を添加する。また、再構成された液が試料ＤＮＡを含有していてもよい。再構成された反応物を充分な時間インキュベートし、増幅された核酸が存在する場合に検出される。

検出は、任意の方法、例えば、アガロースまたはＰＡＧＥゲルでの電気泳動後、臭化エチジウム染色を用いるなどして行なわれ得る。

任意の本発明の方法において、使用前にフリーズドライさせ得る試薬は、少なくとも、リコンビナーゼ、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰもしくはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物、還元剤、ＡＴＰまたはＡＴＰアナログ、リコンビナーゼ負荷タンパク質、ならびに第１のプライマー、および任意選択で第２のプライマー、またはこれらの任意の組合せを含み得る。

好ましい一実施形態では、試薬は、構成したとき以下の濃度：（１）０．２〜１２μＭの濃度のｕｖｓＸリコンビナーゼ；（２）１〜３０μＭの濃度のｇｐ３２単鎖ＤＮＡ結合タンパク質；（３）５００〜５０００単位／ｍｌの濃度のＴ４ｇｐ４３ＤＮＡポリメラーゼまたはＢｓｕポリメラーゼ；（４）１〜３００μＭの濃度のｄＮＴＰまたはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物；（５）１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のＤＴＴ；（６）１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のＡＴＰ；（７）０．２μＭ〜８μＭの濃度のｕｖｓＹを有するように試薬を合わせることにより合成される。任意選択で、第１のプライマーおよび任意選択で第２のプライマーは、再構成されたときそれらの濃度が５０ｎＭ〜１μＭとなり得る場合に添加され得る。試薬は、使用前にフリーズドライさせる。フリーズドライ性能および寿命を改善するため、トレハロース糖などの安定化剤をフリーズドライさせた混合物中に、例えば、再構成された反応物中、２０ｍＭ〜２００ｍＭ、最も最適には４０ｍＭ〜８０ｍＭで含めてもよい。所望により、凍結乾燥試薬は、使用前、１日間、１週間、１ヶ月または１年以上保存させ得る。

使用時、試薬を、バッファー（ａ）１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；および（ｂ）１％〜１２％（重量または容量基準）の濃度のポリエチレングリコール、または（ｃ）水により再構成する。プライマーは、フリーズドライする前に添加しない場合、この段階で添加し得る。最後に、標的核酸または標的核酸を含有することが疑われる試料を添加し、反応を開始させる。標的または試料、核酸は、早期の抽出工程または加工処理工程の結果として再構成バッファー中に含有され得る。反応物を、所望の増幅度に達するまでインキュベートする。

本明細書のどこかに記載した任意のＲＰＡ反応条件がフリーズドライさせ得る。例えば、以下の試薬は、構成したとき、以下の濃度：（１）１００〜２００ｎｇ／μｌｕｖｓＸリコンビナーゼ；（２）６００ｎｇ／μｌｇｐ３２；（３）２０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼまたはＴ４ポリメラーゼ；（４）２００μＭｄＮＴＰ；（５）１ｍＭＤＴＴ（６）３ｍＭＡＴＰまたはＡＴＰアナログ；（７）１６ｎｇ／μｌ〜６０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ；（８）５０ｎＭ〜３００ｎＭの第１のプライマーおよび５０ｎＭ〜３００ｎＭの第２のプライマー；（９）８０ｍＭ酢酸カリウム；（１０）１０ｍＭ酢酸マグネシウム；（１１）２０ｍＭクレアチンリン酸；（１２）５０ｎｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼを有するように各試薬を合わせることによって合成され得る。試薬は、チューブの底面上、またはマルチウェル容器のウェル内でフリーズドライされ得る。試薬は、移動相固体支持体、例えばビーズもしくは細片、またはウェルで乾燥またはこれらに結合させ得る。

使用時、試薬の入ったチューブを、（１）１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファーおよび１％〜１２％（重量または容量基準）の濃度のポリエチレングリコールで再構成し得る。試薬が乾燥されているか、移動相固体支持体に結合されている場合、支持体をチューブ内に落とし入れて再構成してもよい。上記のように、プライマーは、試薬の一部として乾燥させてもよく、または再構成後に添加してもよい。最後に、標的核酸または標的核酸を含有することが疑われる試料を添加し、反応を開始させる。反応物を、所望の増幅度に達するまでインキュベートする。

別の例として、以下の試薬を、各試薬を、構成したとき、以下の濃度：（１）１００〜２００ｎｇ／μｌｕｖｓＸリコンビナーゼ；（２）３００〜１０００ｎｇ／μｌｇｐ３２；（３）１０〜５０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼまたはＴ４ポリメラーゼ；（４）５０〜５００μＭｄＮＴＰ；（５）０．１〜１０ｍＭＤＴＴ；（６）３ｍＭＡＴＰまたはＡＴＰアナログ；（７）１６ｎｇ／μｌ〜６０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ；（８）５０ｎＭ〜１０００ｎＭの第１のプライマーおよび５０ｎＭ〜１０００ｎＭの第２のプライマー；（９）４０ｍＭ〜１６０ｍＭ酢酸カリウム；（１０）５ｍＭ〜２０ｍＭ酢酸マグネシウム；（１１）１０ｍＭ〜４０ｍＭクレアチンリン酸；（１２）５０ｎｇ／μｌ〜２００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼを有するように合わせることより合成し得る。これらの試薬をフリーズドライし、保存する。使用時、試薬を、１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファーおよび１％〜１２％（重量または容量基準）の濃度のポリエチレングリコールにより再構成する。上記（８）のプライマーは、フリーズドライ前に除き、再構成後に加えてもよい。ＲＰＡを開始するため、標的核酸または標的核酸を含有することが疑われる試料を添加する。反応物を、所望の増幅度に達するまでインキュベートする。

本発明の別の実施形態は、ＲＰＡを行なうためのキットを含む。該キットは、ＲＰＡに関して上記した任意の試薬を上記の濃度で含み得る。該キットの試薬はフリーズドライさせてもよい。例えば、該キットは、（１）１００〜２００ｎｇ／μｌｕｖｓＸリコンビナーゼ；（２）３００ｎｇ／μｌ〜１０００ｎｇ／μｌｇｐ３２；（３）１０ｎｇ／μｌ〜５０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼまたはＴ４ポリメラーゼ；（４）５０μＭ〜５００μＭｄＮＴＰ；（５）０．１〜１０ｍＭＤＴＴ；（６）１ｍＭ〜５ｍＭＡＴＰまたはＡＴＰアナログ；（７）１６ｎｇ／μｌ〜６０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ；（８）５０ｎＭ〜１０００ｎＭの第１のプライマーおよび５０ｎＭ〜１０００ｎＭの第２のプライマー（任意選択）；（９）４０ｍＭ〜１６０ｍＭ酢酸カリウム；（１０）５ｍＭ〜２０ｍＭ酢酸マグネシウム；（１１）１０ｍＭ〜４０ｍＭクレアチンリン酸；（１２）５０ｎｇ／μｌ〜２００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼを含み得る。

好ましい実施形態では、ＲＰＡは、ＤＮＡ合成開始後にリコンビナーゼ因子／ｄｓＤＮＡ複合体の効率的な分解を促進し得るいくつかの補助酵素を用いて行なう。このような補助酵素としては、３’→５’分解を刺激できるもの、および５’→３’分解を補助できるものが挙げられる。

補助酵素には、ＲｅｃＡを３’→５’方向に置換し得、リコンビナーゼ因子／ｄｓＤＮＡ複合体の３’→５’分解を刺激し得るいくつかのポリメラーゼが含まれる（Ｐｈａｍｅｔａｌ．，２００１）。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、大腸菌ＰｏｌＶおよび他の種の相同なポリメラーゼが挙げられる。通常、大腸菌の一生において、ＲｅｃＡの３’→５’方向の置換は、ＳＳＢ、スライディングクランプおよびＤＮＡポリメラーゼと協調したＳＯＳ−損傷−標的化合成の一部として起こる。大腸菌においてこの活性に不可欠なポリメラーゼは、ＰｏｌＶであり、これは、最近見出されたポリメラーゼのスーパーファミリー（ＵｍｕＣ，ＤｉｎＢ，Ｒａｄ３０およびＲｅｖｌが含まれる）の一構成員であり、そのインビボ機能は、損傷ＤＮＡ鋳型のコピーである。ＲＰＡに重要であるＲｅｃＡフィラメントのインビトロ３’→５’分解は、ＰｏｌＩ、ＰｏｌＩＩＩまたはＰｏｌＩＶ単独では触媒され得ない。ＰｏｌＶのみが、ＳＳＢと協調して、測定可能なＡＴＰ非依存性３’→５’ＲｅｃＡ／ｄｓＤＮＡ分解活性を有する。実際には、ＰｏｌＶは、該ポリメラーゼの前方へとＤＮＡから３’→５’方向にＲｅｃＡを押して除去する（Ｐｈａｍｅｔａｌ．，２００１；Ｔａｎｇｅｔａｌ．，２０００）。ＰｏｌＶまたは機能的ホモログを含めると、増幅効率が改善され得る。

他の補助酵素としては、ヘリカーゼと呼ばれる一類型の酵素が挙げられ、これは、ｄｓＤＮＡからのＲｅｃＡの分解を促進するために使用され得る。これは、５’→３’および３’→５’の両方向での分解を促進する。ヘリカーゼは、インビボ組換えプロセスの不可欠成分であり、組換え中間体の分枝点の１つの場所から別の場所への移動、鎖の分離、およびＤＮＡに結合した成分の分解および再循環を行なう機能を果たす。侵入／合成の第１のラウンドがＲＰＡで起こった後、２つの新たなＤＮＡ二本鎖が、さらなる合成ラウンドのためにプライマーが結合するはずである部位に結合したＲｅｃＡの存在によって「マーク」される。かかる状況では、ｄｓＤＮＡは、５’→３’方向のＡＴＰ加水分解依存性解離（これは、限定的であり得る）または何らかの活発なプロセスによる３’→５’解離のいずれかによって、活発に置換されるまで、ＲｅｃＡまたはホモログの高親和性部位を占める傾向にある。中間体からのＲｅｃＡの分解を刺激するために理想的なヘリカーゼ複合体は、大腸菌タンパク質ＲｕｖＡおよびＲｕｖＢからなる。ＲｕｖＡＢ複合体は、分枝点移動を促進し、ＲｅｃＡタンパク質を解離してＲｅｃＡの再循環を可能にする（Ａｄａｍｓｅｔａｌ．，１９９４）。通常、ＲｕｖＡＢ複合体は、組換え中間体、特にホリデイジャンクション様構造に標的化される。作用時、ＲｕｖＡＢ複合体はＤＮＡを取り囲み、強制的にＲｅｃＡをＤＮＡからＡＴＰ誘発性に転座させる（ＣｒｏｍｉｅａｎｄＬｅａｃｈ，２０００；ＥｇｇｌｅｓｔｏｎａｎｄＷｅｓｔ，２０００）。このＲｅｃＡ解離活性は、ＲｅｃＡにより結合された、ホリデイジャンクションをもたないスーパーコイルｄｓＤＮＡを用いて示された（Ａｄａｍｓｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ１９９４）。ＲｕｖＡＢ複合体は、ＤＮＡで覆われたＲｅｃＡ内の分岐構造を認識し得る。ＲＰＡ混合物中へのＲｕｖＡＢの取込みにより、鎖の交換および置換後、ｄｓＤＮＡからのＲｅｃＡの解離が促進され、同じ部位から複製された鋳型の新たな合成が可能になる。加えて、ＲｕｖＡＢ複合体は、ＲｕｖＣと協調して機能を果たし得、最終に、ホリデイジャンクションが切断され、消失する。ＲＰＡ反応混合物に添加されるＲｕｖＣにより、侵入部位で形成されるホリデイジャンクションなどの複雑な構造を消失させ得る。リゾルベース活性（例えば、ＲｕｖＣによって提供されるもの）は、標的化オリゴヌクレオチドが部分的に二本鎖である場合、特に重要である。かかる状況では、逆転の分枝点移動によりホリデイジャンクションが生成され得、次いで、これは、ＲｕｖＡＢＣ複合体により消失され得、明白に分離された増幅産物が生成される。

さらに他の補助酵素としては、大腸菌ＲｅｃＧタンパク質が挙げられる。ＲｅｃＧは、分枝構造の分解を刺激し得る。インビボでこのタンパク質は、リーディング鎖およびラギング鎖の両方を巻き解き、複製フォークを引き戻して４方向ジャンクションを生成させるのを誘導することにより、ＤＮＡ損傷部位で複製フォークを逆転する機能を果たす。（Ｃｏｘｅｔａｌ．，２０００；ＤｉｌｌｉｎｇｈａｍａｎｄＫｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ，２００１；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｅｔａｌ．，２００１）。インビボでは、かかるジャンクションは、鎖スイッチングの基質としての機能を果たし、損傷バイパスを可能にする。インビトロでは、ＲｅｃＧは、Ｄループに結合し、逆転の分枝点移動を誘発することにより、Ｄループ構造の減少をもたらす。ＲｅｃＧは、二本鎖エレメントをいずれかの一端にを有するジャンクションを優先させ、したがって、単鎖領域および二本鎖領域の両方の標的化部位に相同な、部分的に二本鎖の標的化オリゴヌクレオチドが理想的であり得る。これにより、逆転の分枝点移動およびホリデイジャンクションの形成が刺激され得、これは、ＲｕｖＡＢＣ複合体によって消失され得る。インビボでは、ＲｅｃＧおよびＲｕｖＡＢは競合し、分枝点移動が両方向で誘発されるため、異なる組換え結果をもたらし得る（ＭｃＧｌｙｎｎａｎｄＬｌｏｙｄ，１９９９；ＭｃＧｌｙｎｎｅｔａｌ．，２０００）。いずれの場合も、該タンパク質は、ＲｅｃＡで被覆されたジャンクションＤＮＡを標的化し、これを活発に分解する。

ＲＰＡ反応混合物に有用な他の補助酵素は、ＡＴＰおよびＳＳＢの存在下でのＲｅｃＡ核タンパク質フィラメントの継続的な生成を可能にするものである。適切な時点でのＲｅｃＡの除去を可能にするためには、ＲＰＡ反応においてＡＴＰγＳではなくＡＴＰを用いることが好ましい。残念ながら、ＡＴＰにより形成されるＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡフィラメントは、自発的に５’→３’方向に解重合し、この場合必要であるＳＳＢの存在下で、有意な割合での再重合は起こらない。この問題に対する解決策は、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＲ、あるいはＲｅｃＦタンパク質の使用である。あるいはまた、Ｔ４ｕｖｓＸ核タンパク質フィラメントを安定化させるため、ｕｖｓＹタンパク質が同様にして使用され得る。ＳＳＢおよびＡＴＰの存在下では、ＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡフィラメントは解離する（Ｂｏｒｋｅｔａｌ．，２００１；Ｗｅｂｂｅｔａｌ．，１９９５；Ｗｅｂｂｅｔａｌ．，１９９７；Ｗｅｂｂｅｔａｌ．，１９９９）。ＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡをＲｅｃＯおよびＲｅｃＲタンパク質の存在下でインキュベートした場合、この解離は起こらない。実際、ＲｅｃＲタンパク質は、該フィラメントと会合したままであり、その構造を無限に安定化させる。ｓｓＤＮＡがＳＳＢに結合された場合であっても、ＲｅｃＲおよびＲｅｃＯの存在下、ＲｅｃＡのフィラメントは置換性ＳＳＢを再合成する。Ｔ４ファージ系では、同様の特性はｕｖｓＹタンパク質に帰属する。したがって、要すれば、ＲｅｃＯおよびＲｅｃＲの存在下でＡＴＰを用いてＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡフィラメントの完全性を維持することにより、またはｕｖｓＹの存在下でｕｖｓＸ／ｓｓＤＮＡフィラメントの完全性を維持することにより、ＡＴＰγＳの使用不要にすることが可能である。ＲｅｃＦタンパク質は、見かけ上、反対の様式でＲｅｃＯおよびＲｅｃＲ系と相互作用する。ＲｅｃＦはＲｅｃＲと競合し、フィラメント分解をインビトロで誘発する傾向にある。すべての３つの成分はインビボで一緒に、侵入性構造の生成を制御する一方、ｓｓＤＮＡのＲｅｃＡ被覆の程度を制限する機能を果たすようである。別の好ましい実施形態では、ＲｅｃＦを適切な濃度でＲＰＡ反応に含め、インビボプロセスの動力学特性を再現させる。また、ＲｅｃＦは、侵入が起こった後、ＲｅｃＡ被覆中間体の解離を助長し得る。

上記のように、ＡＴＰγＳではなくＡＴＰの使用および／または置換性のポリメラーゼおよびヘリカーゼ（例えば、ＲｕｖＡ／ＲｕｖＢ複合体）、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＲおよびＲｅｃＦの使用、あるいはまたＴ４ｕｖｓＸリコンビナーゼとｕｖｓＹタンパク質との使用は、標的化部位の継続的な再生を誘発することにより、二本鎖ＤＮＡの指数関数的増幅を可能にするはずである。しかしながら、この方法は、依然として、２つの反対の標的化部位で生じ得る開始速度の差に対して応答性である。かかる差異は、増幅効率の低下、および一部の単鎖ＤＮＡの生成をもたらし得る。ＰＣＲ方法では、温度サイクルにより、いずれか一方からの調和された合成がもたらされるため、このような複雑な状況が大きく回避される。別の実施形態では、まさに記載のようなＰＣＲ状態と同様の状況が、４２℃では非機能性であるが、２５〜３７℃の範囲のより低温では機能するＲｅｃＡの温度感受性（ｔｓ）変異体を用いることにより誘導され得る（Ａｌｅｘｓｅｙｅｖｅｔａｌ．，１９９６；Ｈｉｃｋｓｏｎｅｔａｌ．，１９８１）。この場合、いずれかの末端からの合成は、許容温度を周期的に低下させ、次いで、反応を、変異ＲｅｃＡタンパク質の機能に非許容性だが、その他の成分には許容性の温度まで上昇させることにより、同期化され得る。ＲＰＡを、ｔｓＲｅｃＡ変異体を用いて反応温度サイクルとの組合せで行なうことにより、生成されるＤＮＡ分子の数を制御することができる。これは、温度サイクルを提供するためのある種の機構を必要とするが、その温度は、好熱性生物由来タンパク質の使用を必要とし得るものより充分低い。実際、かかる反応サイクルを制御するには、簡単な化学系または携帯型低出力温度サイクルデバイスで充分であり得る。

ＲＰＡでは、すべての他の今日の核酸増幅方法のように、ポリメラーゼを用いて鋳型核酸分子のコピーを生成させる。組込みが、新たな合成部位と隣接する二本鎖核酸の短い伸長鎖の末端糖上の遊離３’−ヒドロキシル部分を必要とすることは、大部分の核酸ポリメラーゼにとって必要不可欠である。この二本鎖核酸の伸長鎖は、典型的には、鋳型上で、プライマーと呼ばれるポリメラーゼ合成反応の開始部位として役立つ短い相補配列によって形成される。場合によっては、合成反応をプライミングするために３’修飾（例えばスルフヒドリルなど）が使用され得る。鋳型と塩基対合し、ポリメラーゼによって伸長されるプライマー核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る、インビボではゲノムＤＮＡの複製中、プライマーゼ酵素によって、ＲＮＡプライマー配列が鋳型ＤＮＡ上に新たに合成される。典型的には、インビトロ反応では、プライマーを、多くの場合化学的合成される短い単鎖ＤＮＡ（または修飾したＤＮＡもしくはＲＮＡ）として供給し、通常、オリゴヌクレオチドプライマーとよばれる。プライマーは、多くの場合、特異的配列であるが、ランダムプライマーもまた使用され得る。プライマーは、その特異的塩基対合形成能力によって、相補配列に標的化される。オリゴヌクレオチドプライマーと標的核酸間のハイブリッド形成は、典型的には、溶液中にて、自発的アニーリングを可能にする塩、ｐＨおよび温度条件下での両者のインキュベーションによって形成される。

ＰＣＲの場合、オリゴヌクレオチドプライマーは、２つの主な理由により、通常、大過剰である。第１に、高濃度により迅速なアニーリングが誘発される。第２に、融解、アニーリングおよび伸長のラウンドにより反応が進行するにつれて、プライマーが消費され、限定的となる。ＰＣＲで標的化される核酸は、多くの場合、最初は二本鎖特性であり、そうでない場合は、最初の合成サイクル後、二本鎖となる。かかる二本鎖分子は、大部分の原核生物および真核生物のタンパク質の酵素性活性および安定性に適切な温度および溶媒条件では、新たなオリゴヌクレオチドをアニーリングすることができない。したがって、増幅サイクルを可能にするためには、元の鋳型および新たに合成された鎖を、まず、アニーリングが再度起こり得る前に分離しなければならない。実際には、これは熱融解によって成される。ＰＣＲでは、少なくとも８０℃の温度が、１００塩基対より大きい長さの大部分の二本鎖核酸分子の熱融解に必要とされる。ほとんどのＰＣＲプロトコルにおいて、９０〜１００℃の温度がＤＮＡの融解に適用される。かかる温度では、希少な耐熱性酵素のみ使用が可能である。このようなポリメラーゼは、典型的には、好熱性原核生物由来のものである。

ＲＰＡの利点は、熱融解なしで、二本鎖鋳型からの伸長のための遊離３’−ＯＨを保有する二本鎖核酸の短い伸長鎖の形成が可能なことである。これは、大腸菌由来のＲｅｃＡタンパク質（または他の門由来のＲｅｃＡ類縁体、例えば、Ｔ４ｕｖｓＸタンパク質）を用いることにより達成される。ＡＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ＵＴＰ、ＡＴＰγＳ、あるいは他の型の可能性あるヌクレオシド三リン酸およびこれらのアナログの存在下では、ＲｅｃＡまたはｕｖｓＸは、単鎖ＤＮＡの周囲に核タンパク質フィラメントを形成する。次いで、このフィラメントは二本鎖ＤＮＡをスキャンする。相同配列が位置付けられる場合、リコンビナーゼは、鎖侵入反応およびオリゴヌクレオチドと標的ＤＮＡの相同な鎖との対合形成を触媒する。元の対合形成鎖は鎖侵入によって置換され、該領域内に単鎖ＤＮＡのバブルができる。

ＲｅｃＡタンパク質は、市販の供給源から得られ得る。あるいはまた、これは、標準的なプロトコル、例えば（Ｃｏｘｅｔａｌ．，１９８１；Ｋｕｒａｍｉｔｓｕｅｔａｌ．，１９８１）に従って精製したものであり得る。ＲｅｃＡホモログは、好熱性生物、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（Ｒａｓｈｉｄｅｔａｌ．，２００１）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ（Ｗｅｔｍｕｒｅｔａｌ．，１９９４）、Ａｑｕｉｆｅｘｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ（Ｗｅｔｍｕｒｅｔａｌ．，１９９４）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｋｏｍｏｒｉｅｔａｌ．，２０００）、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｗｅｔｍｕｒｅｔａｌ．，１９９４）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ（Ｓｐｉｅｓｅｔａｌ．，２０００）、およびＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＫａｔｏａｎｄＫｕｒａｍｉｔｓｕ，１９９３）から精製されている。また、ＲｅｃＡは、他の原核生物、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＰｉｅｒｒｅａｎｄＰａｏｌｅｔｔｉ，１９８３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＬｏｖｅｔｔａｎｄＲｏｂｅｒｔｓ，１９８５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＳｔｅｆｆｅｎａｎｄＢｒｙａｎｔ，２０００）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｇｏｏｄｍａｎｅｔａｌ．，１９８７）、Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ（Ｗｅｓｔｅｔａｌ．，１９８３）、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ（ＢｅｔｔｅｒａｎｄＨｅｌｉｎｓｋｉ，１９８３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｋｕｒｕｍｉｚａｋａｅｔａｌ．，１９９４）、真核生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＨｅｙｅｒａｎｄＫｏｌｏｄｎｅｒ，１９８９）、Ｕｓｔｉｌａｇｏｍａｙｄｉｓ（ＢｅｎｎｅｔｔａｎｄＨｏｌｌｏｍａｎ，２００１）、例えば、脊椎動物、例えばヒトＲａｄ５１（Ｂａｕｍａｎｎｅｔａｌ．，１９９７）およびＸｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ（Ｍａｅｓｈｉｍａｅｔａｌ．，１９９６）、ならびに植物、例えば、ブロッコリー（Ｔｉｓｓｉｅｒｅｔａｌ．，１９９５）から精製されている。また、本発明者らは、ここに、大腸菌ｒｅｃＡ、およびＴ４ｕｖｓＸタンパク質が、Ｃ末端のヘキサヒスチジンタグを用いて過剰発現培養物から精製され得、依然として生物学的に活性な状態であることを示す。これは、組換えタンパク質の作製に、非常に実用的である。

記載の明瞭化のため、リーディング鎖リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅方法（ｌｓＲＰＡ）は、４つのフェーズに分割され得る。

（１）配列標的化）
ＲＰＡは、ＲｅｃＡまたは機能的ホモログ（例えば、Ｔ４ｕｖｓＸタンパク質など）で被覆された合成オリゴヌクレオチドを用いた配列標的化により開始される。指数関数的増幅を可能にするためには、２つのかかる合成オリゴヌクレオチドは、それらの遊離３’末端が互いに向かって配向されるように使用し得る。このようなオリゴヌクレオチドおよびリコンビナーゼタンパク質を含む核タンパク質フィラメントは、複合体ＤＮＡ内の標的を、迅速かつ特異的に同定する。いったん標的化されると、リコンビナーゼタンパク質は鎖交換を触媒し、その結果、Ｄループ構造が形成される。効率的な増幅のための手順には、ＡＴＰγＳではなくＡＴＰを用いることが必要であり得る。ＡＴＰを用いる場合、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＲ，および／またはＲｅｃＦの分子が効率的な増幅に不可欠であることが示され得、またはｕｖｓＸリコンビナーゼを用いる場合は、ｕｖｓＹタンパク質が使用され得る。

（２）ＤＮＡ合成の開始）
ＤＮＡポリメラーゼは、侵入性オリゴヌクレオチドと鋳型ＤＮＡ間のハイブリッドを検出し、これに結合し、ハイブリッドにおいて露出された遊離３’−ヒドロキシルからのＤＮＡ合成を開始する。この３’−ヒドロキシルの露出および続くＤＮＡ合成は、鎖交換によって形成された二本鎖ハイブリッドからのリコンビナーゼタンパク質の分解を必要とすることがあり得る。この分解が達成されるためには、おそらく、侵入複合体からのリコンビナーゼの自発的分解を補助し得るＡＴＰを用いることが必要であり得る。さらに、分解は、反応混合物中に含める他のタンパク質（例えば、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、ＲｕｖＣ、ｒｅｃＧ、他のヘリカーゼ）または他の刺激成分（これらは、リコンビナーゼを鎖交換産物から外す機能を果たし得る）の使用によって刺激／増強され得る。

（３）鎖置換ＤＮＡ合成およびレプリコン分離）
ＤＮＡポリメラーゼが、侵入性オリゴヌクレオチド、またはそれらの部分的に伸長された産物の遊離３’−ヒドロキシルを用いて鋳型ＤＮＡの相補的コピー合成すると、該ポリメラーゼは、反応物中に含まれた単一の鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）で被覆されたものであり得る単鎖ＤＮＡと置換される。理想的な構成では、標的核酸配列の両末端でのオリゴヌクレオチドの侵入が同様の時間枠内で起こり、その結果、同じ鋳型核酸上の２つのポリメラーゼがまず互いに向かって進行する。これらの伸長している複合体が互いに出合うと、元の鋳型は簡単に離れ落ち、ポリメラーゼは、鎖置換の必要なく合成を継続し、今度は、ＳＳＢ結合ｓｓＤＮＡ鋳型をコピーする。立体障害のため、両ポリメラーゼが出合うと、ポリメラーゼは一時的に鋳型から分離された状態となり得、２つの鋳型鎖の分離が可能となる。

（４）合成の終了および再侵入）
いったん鋳型鎖が離れると、ポリメラーゼは、鋳型の末端までの伸長を終了し得る（または、最初の鋳型が所望の産物より長い場合は、第２の対向標的化部位としての機能を果たす配列を通過する）。指数関数的増幅を可能にするためには、新たな産物が、元の鋳型と同様に、両方の標的化末端からの様式で標的化および複製されることが必要である。新たに合成された標的化部位は、標的化リコンビナーゼ／オリゴヌクレオチドフィラメントに自由に利用可能である。また、合成のプライミングに最初に使用された部位は、反応において、鎖交換産物からのリコンビナーゼの分解に有利な条件の使用の結果として遊離状態のはずである。この後者の部位での再侵入は、該ポリメラーゼが第２の標的化部位を通過して合成され、この第２の部位でプライミングされ、そして第１の部位に戻るのに要した時間より短い時間で起こると、単鎖ＤＮＡが主要産物でなくなり、指数関数的増幅が起こる。多数の合成複合体が同じ鋳型上で機能すると、非常に短い増幅時間が達成され得る可能性が生じる。

（リーディング鎖／ラギング鎖同時合成を用いたリコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ））
（リーディング鎖ＲＰＡ）ｌｓＲＰＡの本発明者らの記載において、本発明者らは、標的化配列を再生し、したがって、二本鎖ＤＮＡの指数関数的増幅を可能にする能力を有する多成分系について詳細に示す。Ｚａｒｌｉｎｇ法とは異なり、ｌｓＲＰＡは、単鎖ＤＮＡの線状産生を回避する。この問題を解決するため、単鎖産物の可能性および同時末端開始の必要性を完全に回避する別のアプローチがある。この方法は、必然的に、より複合的な反応混合物を伴う。それにもかかわらず、この場合、必要とされる成分はすべて、充分理解されており、単一の系に合成されやすいはずである。この系は、細胞の正常な複製サイクル中に起こる事象を反復し、リーディング鎖／ラギング鎖連結型合成を可能にする。この方法リーディング鎖／ラギング鎖ＲＰＡを、簡単に図１および３に示す。

正常なインビボ複製、二本鎖ＤＮＡは、同時に２つの鎖に分離され、両者ともコピーされ、複製機構によって２つの新たな二本鎖ＤＮＡ分子がもたらされる。この「機構」は、リーディング鎖合成を、短いＲＮＡプライマーがプライマーゼ酵素によって鋳型核酸上に合成される従来の５’→３’ラギング鎖合成と対にする。ラギング鎖合成中、オカザキ断片と呼ばれる短い断片のＤＮＡが生成され、これは、互いにライゲートして連続するラギング鎖を形成する。この同時リーディング−鎖／ラギング−鎖合成は、原核生物のゲノム全体の複製を担い、真核生物の生物も同様である。この系の不可欠成分は同定されており、生化学的にキャラクタライズされている。該成分はインビトロで合成されされ得、リーディング−鎖合成のみを用いて起こり得るものより効率的な増幅を達成する。

複製「機構」の不可欠成分は、現在、大腸菌およびある種の他の生物（例えば、Ｔ４ファージなど）について充分キャラクタライズされている。この機構は、ＰｏｌＩＩＩホロ酵素（ＧｌｏｖｅｒａｎｄＭｃＨｅｎｒｙ，２００１；ＫｅｌｍａｎａｎｄＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，１９９５）およびプライモソーム（Ｂｅｎｋｏｖｉｃｅｔａｌ．，２００１；Ｍａｒｉａｎｓ，１９９９）を含む。ＰｏｌＩＩＩホロ酵素は１０種類のポリペプチド成分で構成されている。各ホロ酵素は、２つの非対称に配向されたコア構造を含有し、各々は、ポリメラーゼ（αサブユニット）および２つのさらなるコア成分εサブユニット（これは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する）およびθサブユニットからなる。コア複合体に加え、別の組のポリペプチドが、ホロ酵素に連続合成能を提供し、リーディング鎖／ラギング鎖合成を対にする。β−二量体スライディングクランプは鋳型ＤＮＡを取り囲み、複合体を鋳型に極めて高親和性で付加させる。スライディングクランプは、τ_２’γδδ’χψポリペプチドサブユニットを含むＤｎａＸクランプ負荷体によってＤＮＡ上に負荷される。

記載の明瞭化のため、ＲＰＡ法は、４つのフェーズに分割され得る。実際、すべてのフェーズは、１回の反応で同時に起こる。

（１）配列標的化）
ＲＰＡは、ＲｅｃＡまたはＴ４ｕｖｓＸまたは機能的ホモログで被覆された合成オリゴヌクレオチドを用いた配列標的化により開始される。かかる核タンパク質フィラメントは、複合体ＤＮＡ内の標的を、迅速かつ特異的に同定する。いったん標的化されると、ＲｅｃＡまたはｕｖｓＸタンパク質は鎖交換を触媒し、その結果、Ｄループ構造が形成される。効率的な増幅のための手順には、ＡＴＰγＳではなくＡＴＰを用いることが必要であり得る。しかしながら、リーディング鎖合成とラギング鎖合成の連携は、合成開始後に非常に迅速にリコンビナーゼが外されることの必要性を不要にし得る。ＡＴＰを用いる場合、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＲ、およびＲｅｃＦを細菌のｒｅｃＡリコンビナーゼとともに用いる必要があり得、またはＴ４ｕｖｓＹタンパク質が、Ｔ４ｕｖｓＸタンパク質の場合の効率的な増幅に不可欠であることが示され得る。

２）プライモソーム合成
プライモソームはＤループで合成され得る。通常、大腸菌では、Ｄループ構造はＲｅｃＡによって、インビボでの損傷ＤＮＡを救済する機構の一部として、または他の形態の組換え中に形成される。ＲｅｃＡ媒介性鎖交換およびプライモソーム合成の組合せ作用の目的は、複製フォークを生成させることである。複製フォークは、分離された鋳型ＤＮＡ鎖およびレプリソームを含む核タンパク質構造である。レプリソームは、ポリメラーゼホロ酵素複合体、プライモソーム、および両方の鋳型ＤＮＡ鎖を同時に複製するのに必要とされる他の成分からなる。プライモソームは、複製フォーク進行に必要なＤＮＡ巻き解きおよびオカザキ断片プライミング機能の両方を提供する。同様のプライモソーム合成が、ｇｐ５９およびｇｐ４１タンパク質によって指向されるＴ４ファージの組換え中間体において起こる。

プライモソーム合成は、遺伝的および生化学的解析により大腸菌において集中的に研究されている。このプロセスに必要な最小の組のポリペプチドはよく知られており、精製された成分として存在する。プライモソーム合成タンパク質は、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＴ、ＤｎａＣ、ＤｎａＢ、およびＤｎａＧである。これらのタンパク質は、インビトロでプライモソーム複合体をバクテリオファージΦＸ１７４ＤＮＡ上で合成するのに充分であることが示されている（ＫｏｒｎｂｅｒｇａｎｄＢａｋｅｒ，１９９２；Ｍａｒｉａｎｓ，１９９２）。ＰｒｉＡは、ΦＸ１７４染色体上のプライモソーム合成部位（ＰＡＳ）に結合する。次いで、ＰｒｉＢ、ＤｎａＴ、およびＰｒｉＣが、順次にＰｒｉＡ−ＤＮＡ複合体に結合する。ＰｒｉＢは、ＰＡＳにおいてＰｒｉＡを安定化し、ＤｎａＴの結合を助長するようである（Ｌｉｕｅｔａｌ．，１９９６）。ＰｒｉＣは、合成反応全体に対して部分的にのみ必要とされる。ＰｒｉＣを反応から除くと、プライミングが３〜４倍低下する（ＮｇａｎｄＭａｒｉａｎｓ，１９９６ａ；ＮｇａｎｄＭａｒｉａｎｓ，１９９６ｂ）。細菌では、ＰｒｉＣの機能はＰｒｉＢと遺伝学的に重複する。次いで、ＤｎａＣがＤｎａＢを複合体内にＡＴＰ依存的様式で負荷する。このＰｒｉＡＢＣ−ＤｎａＢＴ複合体は、染色体において転座を行なう能力がある。ＤｎａＧプライマーゼは、一過的に複合体と相互作用し、ＲＮＡプライマーを合成し得る。

大腸菌での複製中、ＤｎａＢおよびＤｎａＧは、それぞれ、ヘリカーゼおよびプライマーゼとしての機能を果たす。これらの２つの成分は、ＰｏｌＩＩＩホロ酵素と会合してオカザキ断片用のプライマーを合成するために継続的に必要とされる。したがって、ＤｎａＢおよびＤｎａＧは、複製フォークと関連する移動性プライモソームのコア成分である。記載のその他のプライモソーム成分は、ＤＮＡ上でのプライモソームの合成、および二量体ポリメラーゼの会合に不可欠である。プライモソーム合成タンパク質は、ＲｅｃＡおよび鎖交換によって形成される組換え中間体における複製フォークの再確立に必要とされる。ＰｒｉＡは、ＤＮＡ合成のための能力であるレプリソームの合成を組換え中間体において開始し得る。Ｄループをインビトロで標的化することは、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢおよびＤｎａＴの混合物により可能であり、その結果、これらはＤｎａＢおよびＤｎａＣを組み込む能力をもつ。いったんプライモソームがＤループに形成されると、複製開始のために残存しているものはすべて、ホロ酵素複合体を該部位に負荷する。あるいはまた、ファージＴ４系では、ｇｐ５９ヘリカーゼ負荷体タンパク質が漸増し、ｇｐ４１複製性ヘリカーゼをＤループ構造に呼び込む（ｒｅｃｒｕｉｔ）。

（３）フォーク合成およびＤＮＡ合成の開始）
複製フォークは、プライモソーム合成部位で合成される。大腸菌では、Ｄループの侵入鎖上の遊離３’末端の存在により、先に記載のＤｎａＸクランプ負荷体複合体が刺激され、β−二量体がこの部位に合成され、スライディングクランプとして作用する。ホロ酵素および２つのコア単位は、骨格τサブユニットによって一緒に連結されている。τサブユニットはまた、β−二量体、クランプ負荷体、およびプライモソームのＤｎａＢヘリカーゼ成分のための相互作用表面を有する。このような多重相互作用は、２つの非対称に連結されたコアポリメラーゼ複合体を用いてリーディング鎖およびラギング鎖の両方の合成を調和させるのに必要である。ｕｖｓＹおよびｇｐ３２タンパク質ならびに他の成分を伴うＴ４ファージｇｐ５９／４１タンパク質では、ｇｐ４４およびｇｐ６２タンパク質によって助長されるスライディングクランプｇｐ４５の調和合成によってレプリソーム合成が開始される。

大腸菌では、プライモソームプライマーゼＤｎａＧが短いＲＮＡプライマーを、巻き解かれたラギング鎖ＤＮＡ鋳型上で合成する。ホロ酵素の存在下では、クランプ負荷体がＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を認識し、第２のβ−二量体クランプをこの部位上に負荷する。活性なプライモソームの存在およびτサブユニットとＤｎａＢとの相互作用は、同時リーディング鎖／ラギング鎖合成を確実にするのに重要である。この相互作用がないと、ポリメラーゼは、連結されずにプライモソーム部位から離れる。

これで複製フォークが合成される。今度は、リーディング鎖およびラギング鎖の両方の合成が同時に起こり、ＤｎａＢヘリカーゼが鋳型鎖を、接近しているホロ酵素から分離する。ラギング鎖ホロ酵素コアが、１〜２キロベース長のオカザキ断片を生成させる。ラギング鎖ポリメラーゼは、いったん先のＲＮＡプライマーに遭遇すると、β−クランプから解離し、新たに合成されたクランプ（リーディング鎖の前面付近に負荷される）から合成が開始される。リーディング鎖コアに物理的に固定されているため、同じラギング鎖ホロ酵素コアが再使用される。

β−二量体クランプ、コアサブユニットおよびクランプ負荷体間には、動的な相互作用が存在する。それらの親和性は、物理的環境に応じて入れ替わり得る。オカザキ断片の末端で「廃棄」されたβ−二量体は、クランプ負荷体、または存在し得る過剰δサブユニットによる能動的な除去によって再利用され得る。

オカザキ断片の末端のＲＮＡプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼＩの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって除去される。次いで、ＤＮＡリガーゼがオカザキ断片同士を連結し、連続的なラギング鎖を形成する。

４）フォークの集合および終結
ＲＰＡでは、複製は２つの遠隔部位で開始され、複製フォークは、互いに向かって配向される。複製フォークが１点に集中すると、２つの元の鋳型鎖は、各フォークの後方および前方の両方において完全に分離された状態となり、互いから解離する。次いで、各フォークのリーディング鎖コアは合成を終了し、残存するＲＮＡプライマーがプロセッシングされ、最終生成物が２つの二本鎖分子となる。本発明者らには、かかるアプローチによって、ＤＮＡが数メガベース（Ｍｂ）程度に増幅されることは当然予測され得る。本開示では、メガベースは、メガ塩基対も包含する。ＰｏｌＩＩＩホロ酵素の既知の合成速度に基づき、本発明者らには、複製フォークが、１Ｍｂ断片の場合でおよそ１Ｍｂ／１０００秒、すなわち、およそ１５〜２０分間／サイクルの速度で進行すること予測され得る。

最終的な考慮事項は、ＤＮＡの迅速な指数関数的増幅が達成される機構である。このプロセスの重要な点は、ヘリカーゼ、リゾルベースならびにＲｅｃＯ、ＲｅｃＲおよびＲｅｃＦタンパク質の混合物の使用により、標的化部位の効率的な再侵入を可能にすることである。適切な条件下では、再侵入およびプライモソーム合成は、ホロ酵素がフォーク合成部位から離れた後、短時間で可能であるはずである。ＤＮＡは、多くの点で単に分岐された状態であるため、継続的な侵入は問題を示さないはずである。各分枝は、接近しているフォークに遭遇すると、自然に消失する。この条件では、たった１回ＤＮＡが複製されるのに要する時間と同様の時間内で、膨大な量の増幅を達成することが可能であり得る。しかしながら、合成終了前でのヌクレオチド枯渇を回避するため、標的化オリゴヌクレオチドの濃度を制限することは重要であり得る。

ホロ酵素複合体に加え、複製機構では、プライモソームとして知られる別の複合体が用いられ、これは、ラギング鎖を合成し、複製フォークを前方に移動させる。プライモソーム複合体は、ＤｎａＢにコードされるヘリカーゼおよびＤｎａＧにコードされるプライマーゼを含む。最後に、ホロ酵素およびプライモソームのタンパク質に加え、複製には、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮＡリガーゼの活性が必要とされる。これらの後者の２つの成分は、オカザキ断片のプロセッシングに必要とされる。

（ネステッドＲＰＡ）
別の実施形態では、ＲＰＡ増幅は、本明細書において「ネステッドＲＰＡ」という方法で行なわれ得る。希少な配列の検出における困難さは、標的配列に対して非標的が高比率であり得ることである。ＲＰＡが標的ＤＮＡと非標的ＤＮＡとの間を識別し、標的配列のみを増幅する能力は、感度の改善の重要な側面である。非標的と標的との識別は、プライマーおよび反応条件の特異性を反映する。反応が特異的であるほど、生成される特異的標的配列の相対量が多くなり、産物の検出が容易になる。したがって、特異性が増大すると、感度も増大し得る。

感度および特異性の改善の必要性は、ネステッドＲＰＡを用いることにより対処され得る。ネステッドＲＰＡは、ＤＮＡの第１の領域の第１のＲＰＡを伴う。次いで、反応混合物を、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、７５、または１００倍以上に希釈して第１のプライマー対の濃度を低下させ、第２のプライマー対を反応混合物中に導入し、ＲＰＡが反復される。本発明の一実施形態によれば、第２のプライマー対は、第１のプライマー対に対して内部となり、第１のＲＰＡ産物のサブ配列が増幅されるように設計される。この方法により特異的増幅が増大する、すなわち、非特異的バックグラウンド増幅産物が低減され、したがって、感度が増大する。かかる非特異的増幅産物は、隣接プライマーに対して偶然部分相同性となることにより生じるが、ネステッドプライマーに対して増幅が継続されるのに充分な相同性をも有することはあり得ない。ＲＰＡの検出および特異性は、第２のプライマー対の一方または両方を、第２のプライマー対の一方または両方により増幅されたプライマーのみが検出されるように標識することにより、さらに改善され得る。

ネステッドＲＰＡは、２組のプライマーの使用に限定されない。当然、特異性または感度を増大させるために、より多くの組のプライマーが使用され得る。したがって、３、４または５対のプライマーが使用され得る。さらにまた、本発明の別の実施形態として、図４に示すように、異なる組のプライマーが共通のプライマーを共有し得る。

図４において、プライマーセットは、順次使用するように設計されている。例えば、第１のＲＰＡは、プライマーセット１を用いて行なわれ、第１のＲＰＡの増幅産物を用いる第２のＲＰＡは、プライマーセット２を用いて行なわれ、第２のＲＰＡの増幅産物を用いる第３のＲＰＡは、プライマーセット３を用いて行なわれ、第３のＲＰＡの増幅された配列を用いる第４のＲＰＡは、プライマーセット４を用いて行なわれ、最後に、第４のＲＰＡの増幅産物を用いて行なわれる第５のＲＰＡは、プライマーセット５を用いて行なわれる。この場合、プライマーセット１、２および３は、共通のプライマーであるプライマー（ａ）を共有する。プライマー３、４および５は、共通のプライマーであるプライマー（ｂ）を共有する。

ネステッドＲＰＡは、記載のＲＰＡ法の任意の２つ、およびその２つの方法の任意の特定の順序での組合せを用いて行なわれ得る。すなわち、ＲＰＡは、リーディング鎖ＲＰＡのみによって、リーディング鎖／ラギング鎖ＲＰＡのみによって、またはリーディング鎖ＲＰＡとリーディング鎖／ラギング鎖ＲＰＡとの任意の特定の順序での組合せによって行なわれ得る。

任意の本発明のＲＰＡ法の利点の１つは、増幅産物のサイズである。ＰＣＲなどの現行の増幅方法は、上限が約１０Ｋｂに制限されるが、ＲＰＡ法は、核酸領域を数百メガベースまで増幅できる。リーディング鎖／ラギング鎖ＲＰＡでは、増幅対象の標的配列のサイズは、数百メガベース、例えば、５００メガベース未満、３００メガベース未満、１００メガベース未満、７０メガベース未満、５０メガベース未満、２５メガベース未満、１０メガベース未満、５メガベース未満、２メガベース未満、１メガベース未満、５００ｋｂ未満、２００ｋｂ未満、１００ｋｂ未満、５０ｋｂ未満、２５ｋｂ未満、または１０ｋｂ未満、５ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂなどであり得る。ｌｓＲＰＡでは、標的配列のサイズは、メガベース範囲内、例えば、５メガベース未満、２メガベース未満、１メガベース未満、５００ｋｂ未満、２００ｋｂ未満、１００ｋｂ未満、５０ｋｂ未満、２５ｋｂ未満、または１０ｋｂ未満、５ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満であり得る。

（リコンビナーゼ媒介性増幅反応の再構成および可能性のための一般的な考慮事項）
ｌｓＲＰＡおよびリーディング／ラギングＲＰＡはともに、オリゴヌクレオチドプライマーを標的化するリコンビナーゼタンパク質の同様の使用に依存するが、これらは、増幅中に新たな娘二本鎖が形成される様式が異なる。リーディング／ラギングＲＰＡでは、リーディング鎖およびラギング鎖が同時に合成される完全な複製フォークが確立され、その結果、２つの新たな二本鎖が同時に形成される。リーディング鎖ＲＰＡ（ｌｓＲＰＡ）では、リーディング鎖合成のみが起こり、その結果、合成により、産物として１つの二本鎖および１つの被置換単鎖ＤＮＡが生成される。

ＲＰＡでは、鎖交換後に開始されるＤＮＡ合成は、ポリメラーゼによってなされる。新たに合成される鎖の伸長中、ポリメラーゼは、単独または放出鎖の置換を媒介できるヘリカーゼとの組合せのいずれかで、放出鎖を置換し得るはずである。侵入性プライマーの伸長は、最終的に、放出鎖の単鎖ＤＮＡとしての解放をもたらす。幾何級数的な増幅が起こること、および反応が膨大な二本鎖ＤＮＡを生成することを確実にするためには、この被置換単鎖ＤＮＡが、反対方向からのＤＮＡ合成の鋳型として役立つことが必要である。これは、ｌｓＲＰＡを用いる増幅のための中心的な考慮事項である。２つの他の中心的な考慮事項は、用いるポリメラーゼ種、および飽和レベルの単鎖結合タンパク質の存在下で効率的に機能する安定で動的なリコンビナーゼ系の存在である。これらの考慮事項は、リーディング／ラギングＲＰＡおよびｌｓＲＰＡの両方に重要である。

（Ａ）被置換鎖からの二本鎖ＤＮＡの生成の確保）
ｌｓＲＰＡにおける第２のＤＮＡ鎖の生成は、いくつかの方法の１つにおいて達成され得る。

１）被置換単鎖ＤＮＡが、単純に、第２の「対向」標的化オリゴヌクレオチドの侵入および伸長により置換された相補鎖にハイブリダイズし得る。あるいはまた、被置換単鎖ＤＮＡは、第２の「対向」オリゴヌクレオチドと直接ハイブリダイズし得る。かかるハイブリダイゼーション事象は、自発的に起こり得るか、またはＤＮＡ結合タンパク質、例えば、リコンビナーゼまたは単鎖ＤＮＡ結合タンパク質などの鎖同化活性によって媒介され得る。ハイブリダイゼーション後、ポリメラーゼは、遊離３’末端から伸長し、二本鎖産物を生成させる。これを効率的に行なうためには、反応環境は、相補的単鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションが可能なものでなければならず、状況は、常にＲＰＡ反応の他の態様と適合性であるとは限らことに注意されたい。環境によっては、オリゴヌクレオチドと、大部分のＤＮＡ結合タンパク質との相互作用が不可能な修飾された主鎖とのハイブリダイズが、使用され得る。

２）鎖置換合成が、同時に反対のオリゴヌクレオチドプライマーから同じ鋳型において始まる場合、この２つの集合性複製複合体は、最終的に鋳型の中央のどこかで出合う。これらの集合性複合体が互いに通過できる場合、鋳型鎖は分離し、各複合体は、二本鎖鋳型ではなく単鎖をコピーすることにより複製を終了し、さらなる鎖置換は必要とされない。

３）放出鎖がヘアピンを形成する能力を有する場合、自己プライミングする第２の鎖の合成が起こり得る。この活性は、一末端でヘアピンと共有結合により連結された二本鎖をもたらし得、これは、さらなる侵入／伸長反応のための標的となり得る。この状況は、種々の長さおよび構造を有する産物が生成されるため、多くの適用にとって理想的ではない。しかしながら、これは、検出アッセイ、例えば、一部の診断試験では許容され得る。さらにまた、最初の数ラウンドの侵入／伸長後、大部分の放出鎖が自己プライミングできるように、プライマーを操作することが可能であり得る。この様式の二本鎖ＤＮＡ形成は、非常に効率的であり得る。

これらの３つの一般的なプロセスのうちどれがｌｓＲＰＡ反応において支配的であるかは、多くの要素に依存する。最も重要な要素は、標的内での離れている２つのオリゴヌクレオチドプライマーの間隔、侵入速度、およびオリゴヌクレオチドと鋳型との配列である。

第２の一般的な形式のＲＰＡであるリーディング／ラギングＲＰＡでは、実質的な単鎖ＤＮＡの生成は、完全な複製フォークが侵入部位で確立されることにより回避される。完全な複製フォークは、リーディング鎖およびラギング鎖（これは、放出鎖に相当し得る）の両方の同時コピーを可能にする。リーディング／ラギングＲＰＡは、単鎖ＤＮＡの生成が回避される点で洗練されているが、完全な複製フォークを生成させるのに多数の異なるタンパク質が必要とされる。それでもなお、ＲＰＡ反応の最適化のほとんどの態様は、ｌｓＲＰＡおよびリーディング／ラギングＲＰＡの両方に当てはまる。

（Ｂ）ポリメラーゼまたはポリメラーゼ／ヘリカーゼ系の選択）
ｌｓＲＰＡ法は、いくつかの点でＰＣＲと類似する。どちらの方法も、標的ＤＮＡにおいて互いに向かって指向される３’末端に関して配向される対のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、どちらの方法も、反応生成物が後続のラウンドのＤＮＡ合成の標的として使用されることにより幾何級数的な増幅を達成する。しかしながら、反応組成において根本的な差がある。例えば、ＲＰＡでは、標的ＤＮＡは合成前で二本鎖であるが、ＰＣＲでは、鎖の熱分離後、単鎖である。ＲＰＡでは、ＤＮＡ合成は、必然的に、鎖置換できるＤＮＡポリメラーゼまたはポリメラーゼ複合体を用いなければならない。さらにまた、一部コピーされた鎖は、鋳型を介して被置換鎖と物理的に会合するため、ポリメラーゼが一時的に鋳型から解離した場合、新たな鎖の３’末端、および最終的に新たな鎖全体が、分枝点移動の作用またはバブル移動として知られる別の現象の作用によって失われるというリスクがある。これは、理想的に連続的合成能のポリメラーゼがＲＰＡ反応に使用されることを示唆する。また、集合性複製複合体が、ポリメラーゼの解離なしで容易に互いに通過することができない場合、一部のプロセッシング性のポリメラーゼは、一部の鋳型でのＲＰＡ反応を阻害し得ることを考慮することは重要である。まとめると、ポリメラーゼの理想的な選択は、具体的なＲＰＡ反応の正確な形式および目的、特に、増幅対象の産物のサイズに依存する。

（Ｃ）ノイズ抑制環境における安定で持続性の活性なリコンビナーゼ活性の確立）
第３の考慮事項は、如何にして、低温度で見られる異常プライマーアニーリングによって生じるノイズを抑えつつ、安定だが動的なリコンビナーゼ活性を確立するかである。これは、見かけ上、両立しないいくつかの要件が均衡する反応環境確立することを意味する。効率的なＲＰＡのためには、リコンビナーゼタンパク質は、標的二本鎖ＤＮＡをスキャンするオリゴヌクレオチド／リコンビナーゼフィラメントに合成しながら、活性な状態を維持しなければならない。このような複合体はまた、鎖交換終了後、ＤＮＡ合成を許容するために分解されなければならない。これは、単鎖ＤＮＡタンパク質高含有環境で起こるはずである。このようなタンパク質は、二次構造を融解することにより、異常オリゴヌクレオチド挙動を抑制しながら、組換えおよびＤＮＡ合成を刺激することが必要である。基本的に、リコンビナーゼおよび単鎖結合タンパク質は、オリゴヌクレオチド結合に対して競合状態にある。該単鎖結合タンパク質は、合成中の効率的な鎖置換を可能にするのに必要であるが、これらは、リコンビナーゼよりも単鎖ＤＮＡに対して高い親和性を有し、より協同的に結合するため、組換え活性が抑制される。

機能的リコンビナーゼ／複製反応環境の確立は、ヌクレオチド補因子を必要とする。ＲｅｃＡ、および他のリコンビナーゼは、フィラメントを単鎖ＤＮＡ上で合成し、相同性検索を行ない、鎖交換を終了するためにヌクレオチド補因子、例えばＡＴＰなどを必要とする。本発明者らは、ＡＴＰ−γ−Ｓなどの非加水分解性アナログは、ＲＰＡと不適合性であり得ると推測した。何故なら、ＡＴＰ−γ−Ｓの存在下で形成される３−鎖ＤＮＡ／ｒｅｃＡ中間体の極めて高い安定性により、プライマー標的での再侵入が抑制され得、したがって、効率的な増幅が抑制され得るためである。これらは、組換え中間体へのポリメラーゼの任意の有用な接近を抑制することさえあり得る。大腸菌ｒｅｃＡを用いてＤＮＡを増幅する以前の試み（Ｚａｒｌｉｎｇｅｔａｌ）は、おそらく、記載の反応においてＡＴＰ−γ−Ｓによって制限された。

反応におけるＡＴＰの要件、およびリコンビナーゼ−複合体が動的に形成され、かつ分解されるという事実は、主に、重要な反応成分間での複雑な相互作用および競合により、さらなる複雑性をもたらす。特に、単鎖結合タンパク質、例えば、大腸菌単鎖結合タンパク質（大腸菌ＳＳＢまたはＴ４ファージｇｐ３２タンパク質など）は、放出鎖を収集するそれらの能力および二次構造を単鎖ＤＮＡに融解し、したがって、リコンビナーゼ負荷を増強する能力の両方のため、ｒｅｃＡおよびホモログによる組換えを刺激するのに必要である。ＲＰＡでは、単鎖結合タンパク質が、被置換ＤＮＡ鎖に結合して安定化し、好ましくない分枝点移動を抑制することにより、ＤＮＡ合成をさらに刺激することがあり得る。

単鎖結合タンパク質が明白に必要であるにもかかわらず、これらのタンパク質は、一般的に、単鎖ＤＮＡに対してｒｅｃＡまたはｕｖｓＸなどのリコンビナーゼよりも相当高い親和性を有し、リコンビナーゼ／ＤＮＡフィラメントの核生成を阻害し得る。またさらに、ＡＴＰの存在下で形成されるフィラメントが末端依存性分解を受けるに従い（Ｂｏｒｋ，ＣｏｘａｎｄＩｎｍａｎＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００１Ｄｅｃ７；２７６（４９）：４５７４０−３）、かかるフィラメントは、単鎖結合タンパク質によって急速に飽和され、反応開始直後に不活化されることがあり得る。したがって、効率的なＲＰＡには、反応成分の不活化を抑制する条件が、強力な増幅の確立することにおいて重要である。

本発明者らは、ＡＴＰおよび大腸菌単鎖結合タンパク質ＳＳＢの存在下で大腸菌ｒｅｃＡタンパク質、またはｇｐ３２の存在下でＴ４ｕｖｓＸタンパク質を用いて、潜在的に安定な反応組成を予測した。本発明者らは、ｒｅｃＯ、ｒｅｃＲ、およびおそらくｒｅｃＦタンパク質（Ｂｏｒｋ，ＣｏｘａｎｄＩｎｍａｎＥＭＢＯＪ．２００１Ｄｅｃ１７；２０（２４）：７３１３−２２）の存在は、予め負荷したｒｅｃＡフィラメントが安定化され、かつｒｅｃＡが、ＳＳＢ結合オリゴヌクレオチド上で成功裏に核生成を行ない得る環境をもたらし得ることを提案した。同様のリコンビナーゼ負荷系は、他の生物において報告されている（例えば、バクテリオファージＴ４の組換え／複製／修復系）。Ｔ４リコンビナーゼｕｖｓＸは、第３の成分ｕｖｓＹタンパク質の作用により、Ｔ４単鎖ＤＮＡ結合タンパク質ｇｐ３２で被覆された単鎖ＤＮＡ上に負荷され得る（ＭｏｒｒｉｃａｌａｎｄＡｌｂｅｒｔｓＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９９０Ｓｅｐ５；２６５（２５）：１５０９６−１０３）。興味深いことに、インビボでのこの組換え系の主な役割は、複製成分を組換え中間体、例えば、Ｄループにて合成することにより、組換え依存性ＤＮＡ合成を可能にすることである（ＦｏｒｍｏｓａａｎｄＡｌｂｅｒｔｓＣｅｌｌ．１９８６Ｄｅｃ５；４７（５）：７９３−８０６）。このプロセスは、合成オリゴヌクレオチドの侵入によって作製させるＤループによって誘発されるＲＰＡにおいて起こるはずであるものと類似する。３つの成分ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹおよびｇｐ３２間の相互作用に加え、これらの成分と、複製機構（例えば、ポリメラーゼ、クランプ負荷体、プライマーゼ／ヘリカーゼおよびｄｄａヘリカーゼとの間の相互作用もまた存在する（Ｒｅｄｄｙ，ＷｅｉｔｚｅｌａｎｄＶｏｎＨｉｐｐｅｌ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１９９３Ａｐｒ１５；９０（８）：３２１１−５．，ＨａｃｋｅｒａｎｄＡｌｂｅｒｔｓ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９９２Ｏｃｔ１５；２６７（２９）：２０６７４−８１）。これらの要素を総合すると、Ｔ４組換え／複製機構の成分は、おそらく、大腸菌同等物よりも、ＲＰＡにさらにより理想的であり得ることが示唆される。

ｒｅｃＯおよびｒｅｃＲまたはｕｖｓＹなどのリコンビナーゼ負荷タンパク質の使用に加え、リコンビナーゼ活性と単鎖ＤＮＡ結合タンパク質の活性との間の適切な均衡を作り出すためには、他の方法がある。リコンビナーゼおよび単鎖ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合および／または協同性の挙動は、変異によって調節され得る。また、異なる供給源由来のリコンビナーゼは異なる特性を有する（Ｅｇｇｌｅｒ，ＬｕｓｅｔｔｉａｎｄＣｏｘ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００３Ｍａｙ２；２７８（１８）：１６３８９−９６．Ｅｐｕｂ２００３Ｆｅｂ２０，Ｖｉｌｌｅｍａｉｎｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２０００Ｏｃｔ６；２７５（４０）：３１４９６−５０４）。これは、ある範囲のリコンビナーゼおよび単鎖ＤＮＡ結合タンパク質活性が利用され得ることを示唆する。一組の最適化実験において変異タンパク質または異なる種由来のタンパク質を使用すると、競合するリコンビナーゼおよび単鎖結合活性の最適比の特定がもたらされ得る。最終的に、この活性は均衡され得、その結果、２つのＤＮＡ結合種のＤＮＡ会合／解離が、充分なリコンビナーゼ活性を単鎖ＤＮＡ結合タンパク質の充分なＤＮＡ融解活性と一緒にし、その必要な機能も果たすことを可能にする。また、ミスプライミングによるノイズの低減も、オリゴヌクレオチド配列設計、反応バッファー、部分的に修飾されたオリゴヌクレオチドの使用、部分二本鎖オリゴヌクレオチドの使用、または他の特異的反応成分（以下に詳述）の添加などのパラメータの最適化により達成され得る。

ここに、本発明者らは、ＲＰＡ法を検証する実験の結果を提供する。特に、本発明者らは、ＤＮＡ増幅を補助できる反応組成の説明および実証を提供する。本発明者らは、比較的短い合成オリゴヌクレオチドが、特異的配列を標的化ため、およびＤＮＡ合成の開始を補助するために使用され得ることを実証する。本発明者らは、ある種のリコンビナーゼの特定の型および濃度、単鎖結合タンパク質、ＡＴＰ、およびオリゴヌクレオチド濃度の要件を記載する。本発明者らは、さらに、クラウディング剤（例えば、ポリエチレングリコールなど）、リコンビナーゼ負荷因子および／または改変され生化学的活性を有する変異タンパク質を含めることにより、所望の速度挙動を伴って、活発で動的な組換え系を補助する反応環境の最適化およびモジュレーションについて記載する。本発明者らは、少なくとも分布性ポリメラーゼ（例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片）の存在下で、増幅プライミング部位間の間隔を最適化した場合、増幅効率に実質的な改善がみられることを確立する。本発明者らは、オリゴヌクレオチドプライマーの非特異的分解を回避するために、ポリメラーゼエキソヌクレアーゼ活性とオリゴヌクレオチド保護剤間の均衡が採用されなければならないことを確立する。本発明者らは、線状（または弛緩）ＤＮＡ基質内に組み込まれた配列の増幅は比較的非効率的である（少なくとも、クレノウなどの非常に分布性ポリメラーゼの場合）が、線状ＤＮＡ基質の末端に向かって指向される増幅反応は非常に有効であることを示す。本発明者らは、熱的または化学的融解法または制限酵素消化法を含むｌｓＲＰＡ反応においてより効率的に増幅される標的ＤＮＡを調製する方法を提供する。本発明者らはまた、単鎖結合タンパク質の性質は、効率的なＲＰＡ反応確立するのに重要である証拠を提供し、この論理的根拠を提供する。さらにまた、本発明者らは、ノイズを低減するため、および比較的低温または周囲温度で部分二本鎖オリゴヌクレオチドまたは完全もしくは部分的にリン酸塩主鎖を欠くオリゴヌクレオチドの使用によって行なわれる増幅反応を最適化するための改善および新規なアプローチを提案する。本発明者らはまた、ＤＮＡ代謝に関与する他の酵素およびタンパク質が、ＲＰＡ反応影響を及ぼし得、一部は、反応効率および特異性を改善するように構成され得る証拠を提供する。これらとしては、トポイソメラーゼ（これは、組換え／複製中間体を弛緩させ得、組み込まれた配列の標的化助長し得る）、およびヘリカーゼ、例えば、Ｔ４ｄｄａヘリカーゼまたはＴ４ｇｐ４１（これは、特に、非鎖置換ポリメラーゼが使用される場合、ポリメラーゼ開始および伸長効率を改善し得る）が挙げられる。最後に、本発明は、ｐｒｉＡおよびｒｕｖＡ／Ｂヘリカーゼが、増幅効率を最適化するするのに使用され得る活性を有することを示す。

（ＲＰＡ試薬および反応パラメータの選択）
リーディング鎖ＲＰＡ、リーディング鎖／ラギング鎖ＲＰＡ、およびネステッドＲＰＡの詳細は、上記した。このセクションでは、任意の上記の３つの方法のための試薬およびパラメータの選択を記載する。

ＲＰＡの利点の１つは、ＲＰＡの増幅産物が他の分子生物学手順に使用され得る二本鎖ＤＮＡであることである。したがって、ＲＰＡは、分子生物学における他の方法と組合せ得る。例えば、ＲＰＡの出発材料は、ＰＣＲで増幅した断片であり得る。あるいはまた、ＲＰＡの産物がＰＣＲで使用され得る。

必要であれば、任意の本発明の方法におけるＲＰＡ産物を精製してもよい。例えば、ネステッドＲＰＡ法では、増幅産物を、各ＲＰＡ工程後で後続のＲＰＡ工程前に精製し得る。核酸の精製方法は、当該技術分野で知られており、少なくとも、フェノール抽出、核酸沈殿（例えば、塩およびエタノールにより）、カラムクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除、イオンカラム、親和性カラムなど）またはこれらの手法の任意の組合せが挙げられ得る。

上記のように、ＲＰＡに使用されるプライマーは、「二本鎖」または「二本鎖構造を形成できる」ものであり得る。これらの用語は、反応溶液（例えば、ＲＰＡ反応溶液またはＰＣＲ反応溶液）中で二本鎖状態で存在するＤＮＡ分子をいう。ＰＣＲ溶液の組成は公知である。ＲＰＡ反応の組成は、この詳細説明のセクションおよび実施例に示す。

プライマーは、リコンビナーゼ因子の存在下での標的ＤＮＡへのハイブリダーゼーションのための単鎖領域を有し得る。単鎖領域は、例えば、約１０塩基、約１５塩基、約２０塩基、約２５塩基、約３０塩基、約４０塩基、および約５０塩基であり得る。さらに長い領域、例えば、約７５塩基、約１００塩基、約１５０塩基以上を使用してもよいが、必要ではない。単鎖領域の選択は出発核酸の複雑さに依存し、そのため、例えば、ヒトゲノムは、より長いプライマーを必要とし得るが、プラスミドは、ずっと短いプライマーを必要とし得る。

二本鎖ＤＮＡ内の２つの核酸鎖は、完全に相補的である必要はない。例えば、二本鎖ＤＮＡの二本鎖領域は、配列が１％まで異なり得る。すなわち、２つの核酸鎖の配列は、１００塩基中１塩基だけ異なり得、溶液中で、なお二本鎖状態で存在し得る。相補配列において１％差を有する核酸は、この開示の目的のため、二本鎖ＤＮＡと想定する。

また、標的核酸（すなわち、本発明のＲＰＡ法によって増幅される核酸）は、部分的に二本鎖および部分的に単鎖であり得る。例えば、図５の任意の構成の核酸が、本発明の標的核酸として好適であり得る。上記のように、標的核酸はＲＮＡであり得る。ＲＮＡは、公知の方法を用いて二本鎖ｃＤＮＡに変換することができる。この二本鎖ｃＤＮＡを標的核酸として使用し得る。図５に示すように、鋳型核酸は、３’突出端、５’突出端または平滑末端から選択される末端の任意の組合せを有し得る。

本発明のｌｓＲＰＡ法は、少なくとも以下の工程を含む。第１に、リコンビナーゼ因子を、２種類の核酸プライマー（本明細書において第１および第２のプライマーという）に接触させ、２種類の核タンパク質プライマー（本明細書において第１の核タンパク質プライマーおよび第２の核タンパク質プライマーという）を形成させる。

第２に、第１および第２の核タンパク質プライマーを鋳型核酸に接触させ、二本鎖構造を第１の鎖の第１の部分、および第２の二本鎖構造を第２の鎖の第２の部分に形成させる。２種類のプライマーは、図６Ａに示すように、ハイブリダイズするとき、これらが互いを指向するように設計する。あるいはまた、プライマー１およびプライマー２は、図６Ｂに示すように、異なる標的核酸にハイブリダイズし得る。

第３に、核タンパク質プライマーを、それらの３’末端で伸長させ、第１および第２の二本鎖核酸を生成させる（図７Ａ）。プライマーが異なる標的核酸にハイブリダイズする場合、プライマーの伸長により被置換鎖が生成する（図７Ｂ）。この場合、プライマー伸長により生じた２つの被置換鎖がハイブリダイズし、新たな二本鎖鋳型核酸を形成し得る（図７Ｃ）。

工程２および３は、所望の増幅度に達するまで反復される。このプロセスは、標的核酸へのプライマーハイブリダーゼーションおよび伸長を連続的に進行させることが可能である点で、動的なプロセスである。本発明の利点の１つは、増幅が、反応の開始後、温度サイクルまたは酵素添加を必要とせずに、連続的に行なわれることである。

一実施形態では、工程２および３を少なくとも５回反復する。好ましくは、少なくとも１０回反復する。より好ましくは、少なくとも２０回、例えば、少なくとも３０回反復する。最も好ましくは、この２つの工程を少なくとも５０回反復する。増幅工程（例えば、工程２および３）の複数回反復のため、本発明のＲＰＡは、好ましくは、プライマー／標的核酸比は少なくとも１００：１、好ましくは少なくとも３００：１、最も好ましくは少なくとも１０００：１で開始する。すなわち、標的核酸の１回コピーにつき、少なくとも１００、３００または１０００コピーのプライマーが存在する。

任意選択の工程において、全体的な増幅効率を増大させるため、充分なラウンドの増幅後、一定時間後、さらなる成分を反応に加えてもよい。一実施形態では、このさらなる成分は、以下の：リコンビナーゼ因子、１種類以上のプライマー、ポリメラーゼ、および１種類以上のさらなる因子（以下の別のセクションに記載）のうちの１種類以上のであり得る。

好ましい実施形態では、少量割合の第１のＲＰＡ反応物が、後続のラウンドまたはＲＰＡ増幅のための鋳型ＤＮＡの供給源として用いられる。この方法では、第１のＲＰＡ増幅反応は、標的核酸上で行なわれる。第１のＲＰＡ反応後、全反応物の少量割合が、後続のラウンドのＲＰＡ反応のための標的核酸の代用として用いられる。その割合は、例えば、第１の反応物の約１０％未満であり得る。好ましくは、その割合は第１の反応物の約５％未満であり得る。より好ましくは、その割合は第１の反応物の２％未満であり得る。最も好ましくは、その割合は最初の反応物の１％未満であり得る。

ＲＰＡに使用されるプライマーは、好ましくはＤＮＡであるが、ＰＮＡおよびＲＮＡもまたプライマーとしての使用に好適である。実際には、ＤＮＡ複製では、ＤＮＡポリメラーゼは、ゲノムＤＮＡをＲＮＡプライマーから伸長させることに注意されたい。

合成オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡプライマーとしての機能を果たし得、ＲｅｃＡまたはそのホモログによる核タンパク質フィラメントの形成のための基質として使用され得る。１５ヌクレオチド程度の短い配列は、二本鎖ＤＮＡを標的化することができる（Ｈｓｉｅｈｅｔａｌ．，１９９２）。かかるオリゴヌクレオチドは、標準的なホスホロアミデート化学合成法または他の方法に従って合成され得る。場合によっては、修飾塩基および／またはリンカー主鎖化学合成法が望ましく、機能的であり得る。さらに、オリゴヌクレオチドを、その末端の５’または３’のいずれかに、種々の目的の機能を果たす基、例えば、蛍光基、消光剤、保護（ブロック）基（可逆性またはそうでない）、磁性タグ、タンパク質などで修飾してもよい。場合によっては、単鎖オリゴヌクレオチドは、鎖侵入のために使用され得、別のある場合では、部分的のみ単鎖核酸が、使用され得る（侵入性核酸の配列の５’伸長鎖が既にオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしている）。

本発明の別の実施形態では、プライマーは、標的核酸に相同でない５’領域を含み得る。本発明の方法は、プライマーが標的核酸に完全に相補的でない場合であっても、機能的であるばずであることに注意されたい。プライマーは、さらなる配列をその５’末端に有することにより非相補的であり得る。このようなさらなる配列は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位の配列または配列決定プライマーに相補的である配列であり得る。制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、増幅された配列のその後の切断に有用であり得る。制限エンドヌクレアーゼ認識部位の外側の核酸を切断する制限エンドヌクレアーゼの使用もまた想定される。配列決定プライマーに相補的である配列は、市販のプライマーまたは市販の配列決定装置を用いた増幅産物の迅速なＤＮＡ配列決定を可能にし得る。

核タンパク質フィラメントの形成は、ＡＴＰ、ならびに補助タンパク質（例えば、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＲおよびＲｅｃＦ）、またはＴ４タンパク質の場合はｕｖｓＹの存在下での、ＲｅｃＡタンパク質またはそのホモログとのプライマー（オリゴヌクレオチド）のインキュベーションによって行なわれ得る。３７℃で、ＲｅｃＡバッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、２ｍＭＡＴＰ、２ｍＭＤＴＴおよび１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）中にてインキュベートすると、ＲｅｃＡは、らせん状フィラメントをｓｓＤＮＡ上に形成し、６個のプロトマー／１巻きを有する。該ＤＮＡは、該タンパク質らせんの内部に位置する。ｄｓＤＮＡの存在下では、ＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡ核タンパク質フィラメントは、少なくとも１０^７ｂｐ／時間の速度でＤＮＡをスキャンし得る。スキャニングの様式は明らかでないが、（＞１０^３ｂｐ／秒）の速度であり、これは、主溝の一側面に沿って容易に接近し得るわずかに数塩基対の初期物質のみを含むものであり得る。成功裏の結合は、三重らせん状中間体への移行をもたらし得、これは、次いで、鎖侵入および置換が続き、Ｄループが形成される。かかる連結分子は、らせん状フィラメントの形成について上記のものと同様の条件下で形成され得、したがって、ｓｓＤＮＡ、相同なｄｓＤＮＡ、ＲｅｃＡ、ＡＴＰ、補助タンパク質ならびに好適なバッファー条件および温度条件の存在下では、連結分子が自発的に形成される。ＡＴＰが使用される場合、合成は、可逆的であり平衡に達するが、ＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡフィラメントは、ＳＳＢの存在下であっても、補助タンパク質ＲｅｃＯおよびＲｅｃＲによって安定化され得る。あるいはまた、Ｔ４ｕｖｓＸタンパク質は、ｕｖｓＹタンパク質の存在下で安定化され得る。耐熱性タンパク質の場合、インキュベーションの温度は、より高温であり得る。ＡＴＰの継続的な供給が必要とされる場合、標準的なＡＴＰ再生系を反応物中に含めてもよい。

ＤＮＡポリメラーゼは、侵入性鎖の遊離３’−ヒドロキシルを用い、新たなヌクレオチドの組込みによりＤＮＡ合成を触媒し得る。いくつかのポリメラーゼは、侵入性鎖の３’−ヒドロキシルを用いて合成を触媒し、同時に、合成が起こるにつれて他の鎖に置換し得る。例えば、大腸菌ポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩは、侵入されたＤループを伸長させるために使用され得る（Ｍｏｒｅｌｅｔａｌ．，１９９７）。また、大腸菌内のＳＯＳ−損傷−標的化変異に通常使用される大腸菌ポリメラーゼＶが使用され得る（Ｐｈａｍｅｔａｌ．，２００１）。このようなポリメラーゼはすべて、それらの相互作用およびβ−二量体クランプ、ならびに単鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）および他の成分との協同により高度に連続的合成能となり得る。また、原核生物、ウイルスおよび真核生物由来の他のポリメラーゼも、侵入性鎖を伸長させるために使用され得る。

本発明の別の実施形態では、プライマーは、部分的に二本鎖、部分的に単鎖で少なくとも１つの単鎖は３’突出端であり得る。この実施形態では、図８Ａに示すように、プライマーは侵入性鎖および非侵入性鎖を含み得る。この場合、侵入性鎖が標的ＤＮＡにハイブリダイズして伸長された後、これは、図８Ｂに示すように、第２のプライマーの標的核酸としての機能を果たす。第２のプライマーの伸長により、図８Ｃに示すように、非侵入性鎖が置換され得る。この実施形態では、標的核酸が増幅されるにつれて、プライマー１の非侵入性鎖が置換される。プライマー１およびプライマー２の両方が部分的に二本鎖プライマーである場合、標的核酸が増幅されるにつれて、プライマー１およびプライマー２の両方の非侵入性鎖が溶液中に蓄積される。

本発明の一実施形態では、ＲＰＡ反応において少なくとも２つのプライマーが、部分的に二本鎖および部分的に単鎖であり、各々は、二本鎖領域を形成するのに充分に相補的な配列を有する侵入性オリゴヌクレオチド鎖と非侵入性オリゴヌクレオチド鎖とのハイブリダーゼーションによって生成される。好ましくは、この２つのオリゴヌクレオチド鎖は、関連する領域にわたって充分に相補的であり、ＲＰＡ反応条件において二本鎖構造を形成し得る。

本発明の一実施形態では、プライマー（単鎖および部分的に二本鎖プライマーを含む）は、検出可能な標識で標識されている。蛍光消光剤もまた、検出可能な標識とみなされることに注意されたい。例えば、蛍光消光剤を蛍光色素に接触させ得、消光の量を検出する。検出可能な標識は、伸長反応を妨げないようなものでなければならない。プライマーが、侵入性鎖および非侵入性鎖を有する部分的に二本鎖である場合、検出可能な標識は、侵入性鎖の伸長反応を妨げ得ないような様式で結合されていなければならない。部分的に二本鎖プライマーの非侵入性鎖は伸長されないため、非侵入性鎖の標識に対して制限はないが、唯一の例外は、非侵入性鎖上の標識が侵入性鎖の伸長反応を妨げてはならないことである。標識されたプライマーは、増幅産物のより迅速な検出という利点をもたらす。また、非組込み標識、すなわち、伸長されていない標識オリゴヌクレオチドの検出は、反応の状態のモニタリングを可能にする。

ＲＰＡ反応のモニタリングは、例えば、一部の割合のＲＰＡ反応物の取り出し、非組込み画分の単離、および非組込みプライマーの検出を伴い得る。非組込みプライマーのサイズは５０ｂｐ未満、４０ｂｐ未満、３０ｂｐ未満または２５ｂｐ未満であり得、増幅産物のサイズは１Ｋｂ超、２Ｋｂ超、５Ｋｂ超または１０Ｋｂ超であり得るため、組込みプライマーと非組込みプライマーとの間に大きなサイズ差がある。非組込みプライマーの単離は、サイズ排除クロマトグラフィー、例えば、スピンカラムなどを用いて速やかに行なわれ得る。プライマーが標識されている場合、スピンカラムおよび測定（例えば、蛍光または放射能）を含むモニター手順が１分未満で行なわれ得る。伸長されたプライマーを未伸長プライマーから分離するための別の方法は、ＰＡＧＥの使用を伴う。例えば、伸長されたプライマーは未伸長プライマーから、ゲル電気泳動によって５分間未満で分離され得る。伸長されたプライマーを分離するためのまた別の方法は、固定化されたオリゴヌクレオチドの使用を伴う。例えば、増幅されたＤＮＡ配列内に特有に見られる配列に相同なオリゴヌクレオチドが、プライマー伸長によって特異的に生成された核酸を捕捉するために使用され得る。このような捕捉オリゴヌクレオチドは、チップまたは他の基材上に固定化させてもよい。捕捉オリゴヌクレオチドによる伸長されたオリゴヌクレオチドの捕捉は、必要により、ＲｅｃＡタンパク質媒介法、または伝統的な溶液ハイブリダーゼーションによって行なわれ得る。

本発明の別の実施形態では、二本鎖プライマーは、プライマーの２つの鎖の分離が検出され得るように標識され得る。上記のように、多数回のラウンドの伸長後、部分的に二本鎖プライマーの侵入性鎖および非侵入性鎖は分離される。この分離後、非侵入性鎖は、ＲＰＡ反応に関与しない。この特性が、いくつかの様式で、ＲＰＡ反応を検出およびモニターするために使用され得る。

この適用いおいて、検出可能な標識は、蛍光標識または酵素であり得、そして標識消滅剤（標識インヒビターともいう）は蛍光消光剤または酵素阻害剤であり得る。このような場合では、標識は、蛍光または酵素阻害によって検出される。標識の検出可能性は、蛍光標識が使用される場合は蛍光であり得、酵素が使用される場合は、酵素活性であり得る。

第１の方法では、侵入性鎖が標識で標識されたものであり得、非侵入性鎖が、検出可能な標識消滅剤で標識されたものであり得る。部分的に二本鎖プライマー上の標識消滅剤（標識インヒビター）の付近の標識は、高度に検出可能でないものであり得る。ＲＰＡ後、侵入性鎖は非侵入性鎖から分離され得、したがって、標識および標識消滅剤は分離され得る。この分離は、標識をより検出可能にし得る。したがって、検出可能な標識の量の増加の測定により、ＲＰＡ反応がモニターされ得る。

第２の方法は、侵入性鎖が標識消滅剤で修飾され、一方、非侵入性鎖が標識が修飾される以外は、第１の方法と同様である。次いで、ＲＰＡを進行させ、標識が標識消滅剤から分離されるという結果（方法１と同じ）を伴う。したがって、標識の全体的な検出可能性が増大し得る。

第３の方法は、二本鎖プライマーの一方の非侵入性鎖を標識で標識することを含む。また、第２の二本鎖プライマーの非侵入性鎖を標識消滅剤で標識する。２つの非侵入性鎖は、互いに相補的となるように設計する。この構成では、ＲＰＡ反応は、最初は蛍光である。ＲＰＡ反応が進行するにつれて、２つの非侵入性鎖は置換されて分離し、これらは、相補的となるように設計されているため、互いにハイブリダイズする。これらがハイブリダイズする場合、標識および標識消滅剤が互いに接近され、反応の蛍光が減少する。ＲＰＡ反応の進行は、標識検出可能性の減少をモニターすることにより測定され得る。

第４の方法では、第１および第２の二本鎖プライマーの非侵入性鎖が第１の標識および第２の標識で標識される。また、２つの非侵入性鎖は、互いに相補的となるように設計される。第３の方法のように、ＲＰＡ後、２つの非侵入性鎖は互いにハイブリダイズして、２つの標識の近接がＲＰＡ反応の進行を反映する。２つの標識の近接は、例えば、直接観察または非侵入性鎖の単離によって測定され得る。上記のように、プライマーおよび他の低分子核酸の単離は、サイズ排除カラム（スピンカラムを含む）またはゲル電気泳動によって行なわれ得る。

本発明の別の実施形態では、プライマーの一方または両方の非侵入性鎖は、第２の領域核酸に相同であり、そのため、プライマーは、核酸の第２の領域にハイブリダイズしてプライマーＤＮＡ合成を行ない得る。この方法を用い、第１のＲＰＡのプライマー由来の非侵入性鎖を用いる第２のＲＰＡ反応が開始され得る。第２のＲＰＡの産物をモニターし、第１のＲＰＡの進行が測定され得る。

本発明のまた別の実施形態では、非侵入性鎖は、非侵入性鎖の配列に特異的なバイオセンサーによって検出される。例えば、バイオセンサーは、非侵入性鎖に相補的な核酸配列を有する表面であり得る。バイオセンサーにより、非侵入性鎖の結合に起因する特性がモニターされ得る。この特性は検出可能な標識であり得る。

任意の本発明の方法に好適な検出可能な標識としては、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害剤、蛍光マーカー、発色団、発光マーカー、放射性同位体（例えば、放射性ヌクレオチド）、および結合対の一構成員が挙げられる。より具体的な例としては、フルオレセイン、フィコビリンタンパク質、テトラエチルローダミン、およびβ−ｇａｌが挙げられる。結合対としては、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、抗原／抗体、リガンド／レセプター、ならびに該結合対のアナログおよび変異が挙げられ得る。

本発明のリコンビナーゼ因子は、ＲｅｃＡ、ｕｖｓＸ、ＲａｄＡ、ＲａｄＢ、Ｒａｄ５１、またはこれらのタンパク質の機能的アナログもしくはホモログであり得る。所望により、リコンビナーゼは温度感受性（本明細書において「ｔｓ」という）リコンビナーゼ因子であり得る。ｔｓリコンビナーゼが使用される場合、ＲＰＡ反応は、ある１つの温度（許容温度）で開始され、別の温度（非許容温度）で終了し得る。許容温度の組合せは、例えば、２５℃／３０℃、３０℃／３７℃、３７℃／４２℃などであり得る。好ましい実施形態では、ｔｓタンパク質は可逆的である。可逆的ｔｓタンパク質の活性は、非許容温度から許容温度にシフトされると、回復される。

好ましい実施形態では、ＲＰＡは、ＡＴＰ、ＡＴＰアナログ、または別のヌクレオシド三リン酸の存在下で行なわれる。ＡＴＰアナログは、例えば、ＡＴＰγＳ、ｄＡＴＰ、ｄｄＡＴＰ、または別のヌクレオシド三リン酸アナログ（例えば、ＵＴＰ）であり得る。

ＲＰＡ反応物に添加され得る他の有用な試薬としては、ヌクレオチド三リン酸（すなわち、ｄＮＴＰ、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰならびにその誘導体およびアナログ）およびＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。リーディング／ラギングＲＰＡに有用な他の有用な試薬としては、ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰならびにその誘導体およびアナログ）が挙げられる。ＲＰＡ反応の利点の１つは、使用されるポリメラーゼの類型に対して制限がないことである。例えば、真核生物および原核生物の両方のポリメラーゼが使用され得る。原核生物のポリメラーゼとしては、少なくとも、大腸菌ｐｏｌＩ、大腸菌ｐｏｌＩＩ、大腸菌ｐｏｌＩＩＩ、大腸菌ｐｏｌＩＶおよび大腸菌ｐｏｌＶが挙げられる。真核生物のポリメラーゼとしては、例えば、ｐｏｌ−α、ｐｏｌ−β、ｐｏｌ−δ、およびｐｏｌ−εからなる群より選択されるマルチプロテインポリメラーゼ複合体が挙げられる。

本発明の別の実施形態では、ＲＰＡ法は、ポリメラーゼプロセッシング性または忠実度を改善するために、アクセサリー成分の存在下で行なわれる。真核生物および原核生物の両方のアクセサリー成分が使用され得る。好ましくは、アクセサリー成分は、大腸菌由来のアクセサリータンパク質である。有用なアクセサリータンパク質としては、単鎖結合タンパク質、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、およびリゾルベースが挙げられる。他の有用なアクセサリータンパク質としては、大腸菌β−二量体スライディングクランプ、真核生物のＰＣＮＡスライディングクランプおよびＴ４スライディングクランプｇｐ４５からなる群より選択される、スライディングクランプが挙げられる。他のアクセサリー成分としては、β−クランプ、ＤｎａＸクランプ負荷体およびポリメラーゼコア複合体からなるＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素複合体が挙げられる。さらに他のアクセサリー成分としては、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、ＲｕｖＣ、およびＲｅｃＧが挙げられる。さらなる成分の使用により与えられる特性により、ＰＣＲなどの現行の方法で以前は成功裏に標的化されなかった大きなＤＮＡの増幅が可能となり得る。

別の実施形態では、ＲＰＡは、リコンビナーゼ／ｓｓＤＮＡ核タンパク質フィラメントを安定化させるために使用される因子の存在下で行なわれる。例えば、該因子は、ＲｅｃＲ、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＦ、もしくはこれらのタンパク質の組合せ、またはＴ４成分が使用される場合は、Ｔ４ｕｖｓＹタンパク質であり得る。また、生化学的相互作用を好都合な様式で調節するために分子クラウディング剤が使用され得る。他の有用な因子としては、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＤｎａＴ、ＤｎａＢ、ＤｎａＣ、およびＤｎａＧが挙げられる。

本発明の利点の１つは、ＲＰＡ反応が、ＰＣＲ反応と比べて低い温度で行なわれ得ることである。例えば、ＲＰＡ法は２０℃〜５０℃で行なわれ得る。好ましくは、ＲＰＡ法は４５℃未満で行なわれる。より好ましくは、ＲＰＡ法は４０℃未満で行なわれ得る。さらにより好ましくは、ＲＰＡ法は３５℃未満で行なわれ得る。最も好ましくは、ＲＰＡ法は３０℃未満で行なわれ得る。ＲＰＡ法がこのような低い温度で行なわれ得る理由の１つは、ＲＰＡが、鋳型核酸の温度誘導性融解なしで行なわれ得るからである。さらに、ＰＣＲとは異なり、絶対温度の制御は必要でなく、温度は、ＲＰＡに有害に影響することなく変動し得る。例えば、変動の量は、上記規定の温度範囲内の任意の点であり得る。また、二本鎖ＤＮＡの融解に必要な温度も、本発明の方法には存在しない不都合点である早期の酵素不活化に寄与する。

ＲＰＡは、遺伝子型の有無を試験するために行なわれ得る。試験対象の遺伝子型は、疾患または疾患に対する素因と関連し得る。あるいはまた、遺伝子型は、正常な表現型または疾患に対する特別な抵抗性を付与する表現型と関連し得る。上記に開示した遺伝子型は、任意の標準的な遺伝子バリアント、例えば、点変異、欠失、挿入、逆位、フレームシフト変異、交差事象、または遺伝子配列の多重コピーの有無（例えば、ミニ染色体の存在）であり得る。

遺伝子型を検出する方法の１つは、ＲＰＡ反応においてプライマー対間の間隔を検出することである。プライマー対間の間隔は、増幅された配列のサイズを反映する。該方法では、２種類のプライマーが、標的領域（例えば、遺伝子など）全体に存在するように選択される。次いで、ＲＰＡを、プライマー対を用いて行ない、ＲＰＡ産物を解析する。解析は、増幅産物のサイズまたは配列の測定を伴い得る。ＤＮＡ配列のサイズの測定方法としては、少なくとも、アガロースゲル、ＰＡＧＥゲル、質量分析、パルスフィールドゲル、遺伝子チップ、スクロース沈降などの手法が挙げられ、公知である。多くのＤＮＡ配列決定方法およびそれらのバリアントがあり、例えば、ジデオキシ末端および変性ゲル電気泳動を用いるＳａｎｇｅｒ配列決定（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｎｉｃｈｌｅｎ，Ｓ．＆Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５，５４６３−５４６７（１９７７））、化学的切断および変性ゲル電気泳動を用いるＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒ配列決定（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．＆Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７４，５６０−５６４（１９７７））、ピロ配列決定検出（ＤＮＡポリメラーゼ反応中、ピロリン酸塩（ＰＰｉ）が放出される）（Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．，Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．＆Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１，３６３，３６５（１９９８））、およびオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダーゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）（Ｌｙｓｏｖ，Ｌ，Ｆｌｏｒｅｎｔ’ｅｖ，Ｖ．Ｌ．，Ｋｈｏｒｌｉｎ，Ａ．Ａ．，Ｋｈｒａｐｋｏ，Ｋ．Ｒ．＆Ｓｈｉｋ，Ｖ．Ｖ．ＤｏｋｌＡｋａｄＮａｕｋＳＳＳＲ３０３，１５０８−１５１１（１９８８）；ＢａｉｎｓＷ．＆ＳｍｉｔｈＧ．Ｃ．Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ１３５，３０３−３０７（１９８８）；Ｄｒｎａｎａｃ，Ｒ．，Ｌａｂａｔ，Ｌ，Ｂｒｕｋｎｅｒ，Ｉ．＆Ｃｒｋｖｅｎｊａｋｏｖ，Ｒ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４，１１４−１２８（１９８９）；Ｋｈｒａｐｋｏ，Ｋ．Ｒ．，Ｌｙｓｏｖ，Ｙ．，Ｋｈｏｒｌｙｎ，Ａ．Ａ．，Ｓｈｉｃｋ，Ｖ．Ｖ．，Ｆｌｏｒｅｎｔｉｅｖ，Ｖ．Ｌ．＆Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，Ａ．Ｄ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ２５６．１１８−１２２（１９８９）；ＰｅｖｚｎｅｒＰ．Ａ．ＪＢｉｏｍｏｌＳｔｒｕｃｔＤｙｎ７，６３−７３（１９８９）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｍａｓｋｏｓ，Ｕ．＆Ｅｌｄｅｒ，Ｊ．Ｋ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１３，１００８−１０１７（１９９２））である。

遺伝子型の検出方法の１つは、特定の遺伝子型に特異的であるプライマーを用いることである。例えば、プライマーは、ある１つの遺伝子型が効率的に増幅されるが、別の遺伝子型は非効率的か全く増幅されないように設計され得る。一実施形態では、プライマーは、ある１つの遺伝子型（例えば、遺伝的疾患の遺伝子型）に相補的であるが別の遺伝子型（例えば、正常な遺伝子型）にはそうでない３’配列を含み得る。

測定された対象の遺伝子型は、疾患、例えば、活性化された癌遺伝子存在；ハンティングトン疾患の遺伝子の存在または抗癌遺伝子の非存在などを示すものであり得る。

プライマーの３’塩基は、ＲＰＡ反応の特異性および効率の決定に特に重要である。プライマーは、３’塩基が、ある１つの遺伝子型に相補的であるが、別の遺伝子型には相補的でないように設計され得る。これにより、ある１つの遺伝子型の効率的なＲＰＡおよび第２の遺伝子型の非効率的なＲＰＡ（あれば）が可能になる。この方法は、プライマー対の一方のプライマーのみが、異なる表現型（異なる増幅効率を有することにより）を識別し得る場合に有効であることに注意されたい。好ましい実施形態では、ＲＰＡ反応において両方のプライマーが異なる遺伝子型を識別し得る。この上記の例では、プライマーは、その３’末端の１つの塩基によって、ある１つの遺伝子型に相補的であるが、第２の遺伝子型には相補的でない。好ましい実施形態では、プライマーは、その３’末端の少なくとも１つの塩基によって第２の遺伝子型に相補的でない。好ましくは、プライマーは、その３’末端の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の塩基によって第２の遺伝子型に相補的でない。最も好ましくは、プライマーは、完全に非相補的であるか、第２の遺伝子型にハイブリダイズし得ないが、第１の遺伝子型にはハイブリダイズし得る。

上記の方法の一部では、増幅産物の有無は、遺伝子型の有無の表示を提供する。このような場合、ＲＰＡ反応は、本明細書に至るところに記載した方法によってモニターされ得る。

好ましい実施形態では、遺伝子型特定のためのＲＰＡ反応では、患者の遺伝子型に関係ない配列が増幅される。しかしながら、患者の遺伝子型は、増幅された配列の特徴を改変する。例えば、増幅され配列は、異なるサイズ、または別の遺伝子型ではなく、ある１つの遺伝子型のための配列であり得る。このように、ＲＰＡ反応は、増幅反応が成功裏に行なわれたこと示すための内部対照を含有する。当然、１種類以上のさらなる対のプライマーを、ＲＰＡ反応の実施の対照としてを含むＲＰＡ法も想定される。

別の実施形態では、ＲＰＡ反応は、核酸分子の有無を測定するために使用され得る。
核酸分子は、任意の生物に由来し得る。例えば、試料の微生物組成が、種々の微生物の核酸に指向される一連のＲＰＡ反応を用いることにより測定され得る。ＲＰＡは、微生物の検出に特に有用である。一実施形態では、病原体は、ウイルス、細菌、寄生虫および真菌から選択される。さらなる実施形態では、病原体は、インフルエンザ、風疹、水痘−帯状疱疹、肝炎Ａ、肝炎Ｂ，他の肝炎ウイルス、単純疱疹、ポリオ、天然痘，ヒト免疫不全ウイルス、ワクシニア、狂犬病、エプスタイン−バー、レトロウイルス、およびライノウイルスから選択されるウイルスである。別の実施形態では、病原体は、大腸菌、ヒト結核菌、サルモネラ、クラミジアおよび連鎖球菌属から選択される細菌である。またさらなる実施形態では、病原体は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ、およびＯｎｃｈｏｃｅｒｃａから選択される寄生虫である。しかしながら、本発明を上記の特定の属および／または種に限定することを意図しない。

ここに、本発明者らは、ＲＰＡによるＤＮＡの効率的な増幅を可能にする反応条件の規定を補助するデータを提示する。

（単鎖ＤＮＡ結合タンパク質）
単鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＲＰＡ反応に必要とされる。このようなタンパク質は単鎖ＤＮＡに結合し、二次構造を解き、放出鎖置換を助長し、分枝の移動を抑制する。ＲＰＡでは、それらの活性が、いくつかの異なる期（フェーズ）において必要とされる。本発明者らは、２種類の単鎖ＤＮＡ結合タンパク質の大腸菌ＳＳＢおよびバクテリオファージＴ４ｇｐ３２の活性を調べた。Ｔ４ｇｐ３２は、本発明者らの手技で最も有用であることが示された。さらにまた、本発明者らは、ヘキサヒスチジン（ヒス）ペプチドタグをＮ末端またはＣ末端に含めることにより、このタンパク質のいくつかの異なる形態を作製し、先に記載されたいくつかの点変異を調べた。ｇｐ３２改変体の活性を図２１に概略的に示す。

（ｇｐ３２の改変体形態）
Ｔ４ｇｐ３２タンパク質は、ＲＰＡ反応に潜在的に有用ないくつかの特徴を有する。主なｇｐ３２は、比較的小さなＤＮＡ結合部位（８〜１０ヌクレオチド）を有し、広範囲の塩濃度下で同様の結合特性を示し、モノマー間で高い（制限のない）協同性を示す（Ｓｃｈｅｅｒｈａｇｅｎｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｍｏｌＳｔｒｕｃｔＤｙｎ．１９８６Ａｐｒ；３（５）：８８７〜９８；Ｋｕｉｌｅｔａｌ．，ＢｉｏｐｈｙｓＣｈｅｍ．１９８８Ｄｅｃ；３２（２−３）：２１１〜２７）。対照的に、大腸菌ＳＳＢタンパク質は、塩濃度に伴って変化するいくつかの異なるＤＮＡ結合様式を有し、これらはすべて比較的大きなＤＮＡ結合部位（３２、５６または６５ヌクレオチド）を有し（Ｆｅｒｒａｒｉｅｔａｌ．，ＪＭｏｌＢｉｏｌ．１９９４Ｆｅｂ１１；２３６（１）：１０６〜２３）、複雑な協同性挙動が存在する（ＬｏｈｍａｎおよびＦｅｒｒａｒｉ，ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ．１９９４；６３：５２７−７０）。合成オリゴヌクレオチドを用いる場合、放出鎖の初期サイズは小さいため、本発明者らは、ｇｐ３２タンパク質の特性はＲＰＡに最適であろうと推論した。本発明者らは、Ｎ−末端ヒスタグを有するｇｐ３２（ｇｐ３２（Ｎ））を発現させ、精製した。最初の実験では、本発明者らは、ｇｐ３２（Ｎ）が、大腸菌ｒｅｃＡリコンビナーゼと異種系で合わせた場合であっても、大腸菌ＳＳＢタンパク質と少なくとも同程度に機能することを見出した（図１２）。これは、ｇｐ３２がモノマーサブユニットの間で極めて高い協同性を示し、ｒｅｃＡは、そのｇｐ３２の存在下でオリゴヌクレオチド結合に関して有効に競合し得ることは起こりえないようであったので、驚くべき結果である。しかしながら、本発明者らがｇｐ３２（Ｎ）の挙動を非タグ化ｇｐ３２比較した場合、本発明者らは、これら２種類のタンパク質は、等価な挙動を示さないことを見出した。Ｎ−末端ヒスタグは、モノマー間の協同性に必要とされる場合、ｇｐ３２タンパク質の「Ｂ」ドメインに直接隣接するため、本発明者らは、ｇｐ３２（Ｎ）が協同性を減衰させたにちがいないと推論した。従って、本発明者らは、Ｃ−末端ヒスタグを有するｇｐ３２タンパク質（ｇｐ３２（Ｃ））を作製し、そして３位のリシンからアラニンへの変化（Ｋ３→Ａ）、または４位のアルギニンからグルタミンへの変化（Ｒ４→Ｑ）もしくは４位のアルギニンからトレオニンへの変化いずれか（Ｒ４→Ｔ）を有する以前に公表された変異体に従うｇｐ３２（Ｃ）の点変異形態を、作製した（図２１）。このような３種類の点変異タンパク質は、漸減する協同性を示す（図２２）（Ｖｉｌｌｅｍａｉｎ，ｅｔａｌ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２０００Ｏｃｔ６；２７５（４０）：３１４９６−５０４）。本発明者らは、これらのタンパク質の能力を２つの異なる濃度で、線状化した鋳型に対して、侵入／伸長反応を補助するために、バクテリオファージＴ４ｕｖｓＸタンパク質および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片との組合せで試験した（図２２）。まず、本発明者らは、ｇｐ３２（Ｃ）が、いずれの濃度でも他のｇｐ３２改変体よりもずっと少ない産物をもたらすこと（図２２でｇｐ３２（Ｎ）と比較）およびこの産物が、ｇｐ３２（Ｎ）とは対照的にもっぱら完全長であることに注目する。本発明者らは、これらの結果を一連の点変異対立遺伝子により得られたの結果と比較した場合、ｇｐ３２（Ｎ）タンパク質が、ｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４→Ｔ（これは、協同性が有意に減衰されたと報告された）で得られたプロフィールに非常に類似することに注目した。これは、ｇｐ３２（Ｎ）のＮ末端ヒスタグが、Ｂドメインの機能を点変異と同様の様式で妨げることを示唆する。

いくつかの他の関連の観察結果がある。第１に、最大の協同性、すなわち、ｇｐ３２（Ｃ）＞ｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａを示すと考えられているタンパク質は、あまり産物を産生しないようである。第２に、ｇｐ３２（Ｃ）およびｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａについて、より少ない一本鎖結合タンパク質タンパク質を使用した場合により多くの増幅産物が生成され、このことは、より多くのタンパク質を使用する場合にラン−オンアッセイにおいてより多くの産物を生成するｇｐ３２（Ｎ）およびｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｔとは対照的である。総合すると、このような観察結果は、ある説明を示す。ｇｐ３２種は、徐々により協同性となる場合、オリゴヌクレオチドに対してより安定なフィラメントを徐々に形成し、リコンビナーゼが負荷する（ｌｏａｄ）ことを徐々により困難にする。従って、協同性が最も高いｇｐ３２種が用いられると、リコンビナーゼを負荷したフィラメントの利用可能性が大いに制限される。ｇｐ３２の濃度が上昇する場合、リコンビナーゼが負荷することは、ｇｐ３２単鎖ＤＮＡ結合活性によってさらに抑制される。これと一致して、ｇｐ３２の協同性が漸減するにつれて、増幅産物の量が増加する。このことは、リコンビナーゼで被覆されたフィラメントの形成の実質的な増加と一致する。比較的非協同性ｇｐ３２モノマーは、オリゴヌクレオチドを被覆する可能性が低く、リコンビナーゼｕｖｓＸがその代わりに種を供給する（ｓｅｅｄ）のを可能にする。本発明者らは、ｇｐ３２（Ｎ）およびｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｔの場合、ＤＮＡラン−オンアッセイにおいて、ｇｐ３２（Ｎ）またはｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｔが増加するにつれて、より多くの産物が生成されることに注目する。この対照は、より多くの協同性ｇｐ３２改変体を用いた結果である。可能性の１つは、鎖交換反応の間またはその反応後、組換えおよび合成中間体を安定化させるためにｇｐ３２が必要とされることである。これが起こり得るのは、ｇｐ３２協同性が非常に減衰されて、もはや反応のこれらの態様に関与しなくなり得るため、またはリコンビナーゼがｇｐ３２の漸増から外れて（ｏｕｔ−ｔｉｔｒａｔｅ）、反応を停止させるためである。増幅の結果対ラン−オンアッセイの結果の対照性は、協同性の最適量が、最も協同性ｇｐ３２改変体が有する量より少ないものであり得ることを示す。従って、ＲＰＡ変異ｇｐ３２改変体（協同性の減衰を有する）では、これらが、より高レベルのリコンビナーゼ負荷を可能にするため、最も適切であり得る。しかしながら、ｇｐ３２協同性の減衰は、ｇｐ３２活性の少ない環境で起こり得るミスプライミング事象によって生じるノイズに対してバランスをとらなければならない。

最後に、７．５μｇと１５μｇのｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａを用いたとき、ＲＰＡにおいて生成される産物の量に実質的な差がある。７．５μｇレベルは、より弱い協同性変異体を用いた結果により類似する。３７℃で２時間保持した反応過程中、場合によって最も可能性が高いことは、反応物中、単鎖ラン−オン産物の量は、ｇｐ３２がそれ以上有効には単鎖ＤＮＡを飽和しない点まで増加する。かかる状況では、２つのことが起こり得る。第１は、相同性検索フィラメントの数の急速な増加が、侵入速度の有意な上昇をもたらし得る。次いで、放出鎖を安定化させるｇｐ３２の欠如が、安定化されていないクレノウによる多くの不完全な伸長をもたらし、おそらく、より高速のバブル移動をもたらし、新生鎖を鋳型から分離させ得る。従って、より多くの合成鎖が完全長となり得なくなる。

（多重侵入／伸長反応におけるｇｐ３２機能のモデル）
本発明者らは、前に、ｒｅｃＡおよびｇｐ３２（Ｎ）を伴う非相同性系では、所与の鋳型からの１回より多いサイクルの侵入および伸長を可能にするためにポリエチレングリコールが必要とされることに注目した。ここでは、本発明者らは、この観察結果を合理的に説明し、なぜ、複数回のＤＮＡ末端標的化が、特異的型の単鎖ＤＮＡ結合タンパク質を必要とするのかを説明するためのモデルについて記載する。ｇｐ３２活性が、鎖交換プロセス中に放出鎖を安定化させるために必要であることは明白である。これが起こらなければ、リコンビナーゼが分解されるにつれて、放出鎖がその相補鎖と再ハイブリダイズし、侵入オリゴヌクレオチドと置換される。鎖交換後、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質に対して異なる要件を出し得る２つの状態のうちの１つ状態で、放出鎖が存在し得る。これらの２つの状態は、一本鎖検索ＤＮＡと二本鎖標的ＤＮＡとの間の関係の結果として生じる。組換え事象が線状二本鎖ＤＮＡの一端まで延び得、そして放出鎖がその相補鎖から一端で完全に除去されることが可能ならば、放出鎖は、一端において非拘束的となる。この非拘束的状態では、インカミングＤＮＡ鎖およびその相補鎖を含む新規二本鎖が、巻き戻されてＢ形ＤＮＡを形成する。このことは、対合形成反応の間に標的ＤＮＡが侵入リコンビナーゼフィラメントの活性によって巻かれた状況にあるため、必要である。非拘束的放出鎖は、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質に容易に結合し得、これにより、分枝の移動が発生し、侵入鎖が除去されることが抑制される。

あるいはまた、組換え事象が、標的二本鎖の末端まで延びない場合（組み込まれた配列が標的化される場合に起こり得る）、放出鎖は、組換え領域の上流および下流相補鎖と物理的に連結されているため、位相的に拘束される。かかる中間体は非常に不安定である。なぜなら、新生された二本鎖が巻き戻され得ず、放出鎖もその周囲で巻き戻させないままであるからである。また、放出鎖は、両末端で拘束されているため、これは、エネルギー的に不安定であり、新規ハイブリッドは、相当伸びた鎖（ｓｔｒａｉｎ）に置かれる。従って、この状況の単鎖ＤＮＡ結合タンパク質の活性には、インカミング鎖を放出し、元の二本鎖を巻き戻す相当な駆動力があるため、さらに高度な要求が課される（図６）。

反復鎖侵入および線状ＤＮＡ標的の伸長に有効な条件を確立するための取り組みにおいて、本発明者らは、少なくとも分配性ポリメラーゼ（例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片）を用いた場合、線状配列の末端に標的化したオリゴヌクレオチドのみが、鋳型完全長まで容易に伸長されることに注目した。本発明者らは、特定の条件下で、例えば、ｒｅｃＡをｇｐ３２（Ｎ）または大腸菌ＳＳＢとともに用いた場合、侵入と伸長とが１ラウンドだけ、各標的鋳型上で容易に起こり得ることを見出した。この観察は、いくつかの異なる環境下で起こり、完全に解放される放出鎖（らせん接合）または位相的に拘束される中間体（並行接合）のいずれかをもたらす、侵入事象の結果を考慮することにより理解され得る。最後に、本発明者らは、特定の他の条件であって、単一の鋳型からの複数回の侵入と伸長とに許容性のある、ＲＰＡ反応の理想的に適した状況を特定した。本発明者らは、この観察を強化し、最適なＲＰＡ反応が設計され得る枠組みを構成するための本発明者らのデータに基づくモデルを提案する。このモデルは、異なる反応環境の下でｇｐ３２タンパク質の挙動を考慮し、ｇｐ３２挙動を他の反応成分の効果とともに示す（図２９）。

このモデルは、標的二重鎖の末端と、初めに標的に対して５’突出端を有する侵入オリゴヌクレオチドとの間の、組換え事象の性質および結果を概略的に示す。この状況は、本発明者らが試験した実験環境典型例である。この出発状況にもかかわらず、最初のサイクル以外のすべてのサイクルで、標的二重鎖ＤＮＡの５’末端に並ぶ５’末端を有する侵入オリゴヌクレオチドを含む。これを、本発明者らは、バックファイヤー合成と称する状態である。なぜなら、標的ＤＮＡ相補鎖が、第１のラウンド中、伸長され得る３’末端を有して、その侵入プライマーの突出領域をコピーするからである。ｇｐ３２（Ｎ）タンパク質（ＰＥＧの非存在下）を用いて行なった実験は、一旦標的が５’末端においてオリゴヌクレオチドに対して端を揃える（ｆｌｕｓｈ）と（すなわち第１ラウンド後）、後続の侵入／伸長サイクルは、非常に非効率となるか、またはまったく起こらないことを示す。初期の実験では、ラン−オン産物対出発鋳型についてほぼ等モル量を示すのみであった。なぜ、このようなことが起こったのか？。

本発明者らは、この再侵入／伸長のブロックは、侵入するオリゴヌクレオチドが、稀に完全にリコンビナーゼによって被覆されるため生じると考える。従って、標的の５’平滑末端への完全な交換もまた非常に稀に起こり、対応する放出鎖が拘束された状態のまま存在する（図１３）。この交換は最初は不完全であり、中間体は不安定である。これは、位相的に拘束された放出鎖の存在下では、新たな二本鎖をＢ−ＤＮＡらせんへと弛緩させることが可能でないことに起因する。かかる不安定な中間体は、リコンビナーゼが取り外されるにつれて、元の二重鎖に巻き直し、侵入鎖を放出する傾向を有する。

しかしながら、本発明者らは、ｇｐ３２（Ｎ）の存在下でポリエチレングリコールなどのクラウディング剤を含める場合、後続の侵入／伸長が起こることを見出した。１つの可能性は、このような条件下では、不安定な中間体が、ｇｐ３２（Ｎ）によって一時的に安定化され、その結果、伸長が起こり得ることである。ポリエチレングリコールは、障害のあるｇｐ３２（Ｎ）の不充分な協同性を部分的にレスキューする用に作用し、他の場合では不安定なこれらの中間体の安定化を可能にする可能性がある。この結論は、Ｎ−末端にヒスタグを有するｇｐ３２が協同的に減衰されることを示す本発明者らのデータ、および分子間の相互作用の有効性を増強しこれによってモノマー間のより不十分な相互作用を部分的に構成するクラウディング剤の公知の能力の両方によって、支持される。本発明者らは、最初、この実験は、別途既報（ＬａｖｅｒｙＰＥ，ＫｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉＳＣ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９９２Ｍａｙ５；２６７（１３）：９３０７−１４）のように、ｒｅｃＡフィラメントがＰＥＧの存在下でより十分になることを示すことにより最良に説明され得ると考えたが、このことは、行き止まり（ｄｅａｄ−ｅｎｄ）の１回ラウンドのみの侵入から、生産的な多重ラウンドの侵入／伸長への、観察されたスイッチングを充分に説明していないと考えた。

末端指向標的での完全長の多重ラン−オンのＰＥＧ刺激と、真に組み込まれた標的でのずっと不十分な活性との差は（図１５）、上記に示したような中間体の一時的な安定化は、実質的な伸長をもたらすのに、単独では不十分であることを示す。これが、組み込まれた標的でのラン−オンアッセイの場合であれば、末端指向標的での再侵入において同様な機能が果たされるが、これはその場合ではない（図１５）。あるいはまた、効率間の差は、ｇｐ３２が中間体を一時的に安定化させると仮定することにより説明され得、その中間体においてインカミングオリゴヌクレオチドの５’伸長部は対合形成されておらず遊離であり、おそらく長さに依存してｇｐ３２で被覆さえされる。この未交換セグメントがｇｐ３２で被覆されていない場合、またはｇｐ３２が容易に解離し得る場合（これは、協同性のない場合であり得る）、オリゴヌクレオチドの最も５’側の部分は、分枝の迅速な移動により、対合形成されるようになり得る（図２９、シナリオ１）。実際、ＤＮＡ末端において、実際に組み込まれる配列と再侵入との間に差がある（図１５）。組み込まれる標的に関して、放出鎖の非拘束的解放をもたらす二次的な分枝の移動は、末端が遠すぎるため起こり得ない。

従って、本発明者らは、小さなＤＮＡ結合サイズ、およびサブユニット間の高い協同性により、ｇｐ３２タンパク質が、拘束された並行接合構造を充分な時間安定化させることによって複数の侵入伸長反応を可能にすることが、可能にされると結論付け得る。可能性のある種々の結果が存在する（図２９）。最初は交換されなかった５’末端のオリゴヌクレオチドの最後の小さなセクションが、分枝の移動事象を介してハイブリダイズされるようになるか、または放出鎖上でのｇｐ３２の取り外しが、分枝の移動を介して侵入／伸長オリゴヌクレオチドが減少されるようになるを可能にする。あるいはまた、放出鎖上へのリコンビナーゼの負荷および再侵入により、インカミング鎖が放出される（バブル移動）。分枝の移動によるハイブリダイゼーションが起こると、拘束されない構造が生じ、これは、容易に安定化され伸長され得る。ｇｐ３２の取り外しまたはバブル移動のいずれかが起これば、新たに伸長する鎖は、それが完全に伸長される前に消失するというかなりのリスクが存在する。大きな結合部位を有する単鎖ＤＮＡ結合タンパク質（大腸菌ＳＳＢなど）、または乏しい協同性を有するもの（ｇｐ３２（Ｎ）など）がＰＥＧの非存在下で使用されると、一時的な安定化は起こらず、そして侵入オリゴヌクレオチドは、伸長されずに排出される。

従って、このモデル、および種々のｇ３２形態の存在下でのリコンビナーゼ負荷フィラメントの頻度に関する初期の結論に基づき、本発明者らは、増幅反応の種々の要件を最良に満たす、リコンビナーゼとｇｐ３２分子の活性とのバランスが突き止められなけばならないと結論付ける。本発明者らは、ＲＰＡ反応の異なる反応期における単鎖ＤＮＡ結合タンパク質の必要性および効果について、以下のように、要約することができる。

（フェーズ（期）１）
単鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、リコンビナーゼ負荷が一貫して起こり得るように二次構造を解くことにより、リコンビナーゼ負荷のための単鎖ＤＮＡの調製を補助し得る。従って、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質の解く活性は望ましく、また、プライマーの非特異的アニーリングを止めること（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）において１つの役割を果たす。しかしながら、このことにもかかわらず、過剰のレベルのタンパク質および過剰の協同性は、侵入に利用可能なリコンビナーゼ負荷フィラメントの数を有意に減少させ得る。

（フェーズ２）
単鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、リコンビナーゼがバラバラになると、放出鎖を収集し、インカミングオリゴヌクレオチドの自発的排出を抑制する。
並行接合の不安定性とは、組み込まれた配列において侵入が起こることを意味し、オリゴヌクレオチド末端が二本鎖末端と端を揃えた（ｆｌｕｓｈ）（増幅のほとんどのサイクル中で起こり得る）場合を含む。これは、多くの状況で有意な協同活性が必要とされ得ることを意味する。一般に、このフェーズのこの反応は、高度に協同性の単鎖ＤＮＡ結合タンパク質の余剰分から恩恵を受ける。

（フェーズ３）
単鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ合成中に形成される、置き換えられる鎖に結合する。フェーズ２のように、この置き換えられる鎖は、非拘束であっても位相的に拘束されていてもよく、このような２つの環境は、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質に対して異なる要求を課す。

（フェーズ４）
ＲＰＡ反応の特定の構成では、置換された単鎖の放出鎖は、パートナーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして後続の新たな二重鎖の生成を可能にしなければならない。多くの単鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、相補鎖がアニーリングするの抑制するが、Ｔ４ｇｐ３２タンパク質は、相補的ＤＮＡの再アニーリングを助長する。従って、バクテリオファージＴ４ｇｐ３２タンパク質は、このフェーズに理想的なタンパク質である。

（オリゴヌクレオチド長）
ＲＰＡで使用される比較的短い合成オリゴヌクレオチドプライマーを用い、どれだけ有効にｒｅｃＡまたは他のリコンビナーゼが使用され得るかを支持する証拠は、ほとんど発表されていない。また、かかる短いＤＮＡオリゴヌクレオチドがリコンビナーゼにより能動的に負荷された状態で維持される、安定な反応環境が形成され得るか否かは明らかでない。ｒｅｃＡを用いて行なわれる研究のほとんどでは、比較的大きな基質、例えば、単鎖形態および二本鎖形態のバクテリオファージＭ１３ゲノム（数千残基）を、ドナーＤＮＡおよびアクセプターＤＮＡとして用いる。リコンビナーゼ活性の実験アッセイは、多くの場合、中間体の形成、または完結した組換え事象から構成され、電気泳動移動または電子顕微鏡によって測定される（ＨａｒｒｉｓＬＤ，ＧｒｉｆｆｉｔｈＪ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９８７Ｊｕｌ５；２６２（１９）：９２８５−９２）。いくつかの実験では、短いオリゴヌクレオチドの使用が記載されている。１５ヌクレオチドほどの短い配列は、非加水分解性補因子アナログＡＴＰ−γ−Ｓの存在下で、ｒｅｃＡとともに機能的相同性検索複合体を合成することが示されているが、短いオリゴヌクレオチドとＡＴＰとを組み合わせた調査は、明瞭でない（ＨｓｉｅｈＰ，Ｃａｍｅｒｉｎｉ−ＯｔｅｒｏＣＳ，Ｃａｍｅｒｉｎｉ−ＯｔｅｒｏＲＤ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１９９２Ｊｕｌ１５；８９（１４）：６４９２−６）。リコンビナーゼの相同性検索機能は、鎖交換を終了し侵入複合体から解放して、ポリメラーゼなどの他のＤＮＡ代謝タンパク質による接近を可能にするのには、必ずしも充分でとは限らない。実際、研究により、ｒｅｃＡは、検索に必要とされる１５ヌクレオチドよりかなり長いオリゴヌクレオチド長で、低ＡＴＰ加水分解速度（ＤＮＡ結合活性と機能的リコンビナーゼ活性との組合せの有用なインジケータ）と高加水分解速度との間での移行を示すことが示されている。さらにまた、ヌクレオチド補因子の型は、かかる加水分解の移行が起こる長さに影響するようである（ＫａｔｚＦＳ，ＢｒｙａｎｔＦＲ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００１Ｓｅｐ１８；４０（３７）：１１０８２−９）。また、バクテリオファージＴ４リコンビナーゼｕｖｓＸは、短いオリゴヌクレオチドに対して種々の特性を示すことが示されており、塩基組成に対していくらか感受性を示す（ＦｏｒｍｏｓａＴ，ＡｌｂｅｒｔｓＢＭ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９８６Ｍａｙ５；２６１（１３）：６１０７−１８）。このことにも関わらず、ｕｖｓＸおよびｒｅｃＡはともに、ＡＴＰなどの加水分解性ヌクレオチドの存在下で、ほぼ３０塩基対以上の単鎖基質により組換え事象行なうことができ、これは、かかる短い合成標的化オリゴヌクレオチドの使用が合理的であることを示す（ＳａｌｉｎａｓＦ，ＪｉａｎｇＨ，ＫｏｄａｄｅｋＴ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９９５Ｍａｒ１０；２７０（１０）：５１８１−６；ＦｏｒｍｏｓａＴ，ＡｌｂｅｒｔｓＢＭ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９８６Ｍａｙ５；２６１（１３）：６１０７−１８）。

線状化ＤＮＡ標的の末端と相同性の３３残基を有するオリゴヌクレオチドは、大腸菌のクレノウ断片によって伸長し得る対合形成中間体を形成し得る（図９）。この実験などは、３３ヌクレオチド程度の短い相同性の長さは、ＡＴＰの存在下でリコンビナーゼ／ｓｓＤＮＡフィラメントを適切な標的に指向させ、完全な鎖交換を可能にするのに充分であることを示す。同様の結果が、バクテリオファージＴ４ｕｖｓＸタンパク質を用いた場合に見られる。

最小のオリゴヌクレオチド長の要件に加え、オリゴヌクレオチドが、組換えに必要とされる最小の長さを超えてかなり伸長された場合、少なくとも分布性ポリメラーゼが使用される場合、侵入／伸長効率の進行的な低下がみられ得る。可能性の１つは、リコンビナーゼ／ｓｓＤＮＡフィラメントの性質にある。リコンビナーゼにより被覆されたフィラメントは、リコンビナーゼがランダム種を組み込み（ｓｅｅｄ）、次いでそのフィラメントを５’−３’方向に伸長させると、５’範囲の被覆の分布があるため、その被覆まで種々の５’範囲を有する。ほぼ２５〜３０ヌクレオチド未満が被覆される場合、鎖交換には核タンパク質フィラメントが不十分であるので、組換えはほとんど起こり得ない。これより多くのものが被覆されると、組換えの観点からは潜在的に有益であるが、交換に必要とされる最小の長さを超えて１０〜２０より大きい残基が添加されると、益々より活性なフィラメントが充分な長さのＤＮＡのリコンビナーゼを有して交換を可能にするが、ｇｐ３２が結合するのに充分な５’非被覆ＤＮＡを維持し、このことは５’末端の協同性結合を介して、分枝の移動フェーズを抑制し得、放出鎖が非拘束的となるのを抑制し得る可能性がある。この考えと一致して、本発明者らは、複数回の侵入事象の刺激は、Ｔｅｓｔｅｒ（テスター）３ｂｉｏと比べてより長いオリゴヌクレオチドプライマーＴｅｓｔｅｒ１ｂｉｏオリゴヌクレオチドであまり明白でなかったことに注目する（図１５）。これらのオリゴヌクレオチド間の唯一の差は、第１のものが、相同な最初の３３残基の先に２５個のさらなる突出端ヌクレオチドを有するが、第２のものは、１５個だけのさらなる残基を有することである。この説明とは無関係に、この実験観察により、最適最大の長さが存在し得ることを主張する。

短い方のオリゴヌクレオチドが効率的なＲＰＡに最良であると思われる他の理由がある。ＲＰＡ反応に使用される比較的低温度では、オリゴヌクレオチドの安定な二次構造においてかなりの増加があり、また、プライマー対の間での不適切なハイブリダイゼーションの大きな可能性がある。単鎖ＤＮＡ結合タンパク質が全体的に過剰であるにも関わらず、ＡＴＰの存在下でリコンビナーゼにより形成される核タンパク質フィラメントの不安定性によって示される反応の動的な性質は、タンパク質の存在する（オンである）オリゴヌクレオチドとタンパク質のない（オフである）オリゴヌクレオチドとの一定のサイクル移行、および非被覆の非保護のオリゴヌクレオチドについて、定常状態の濃度が存在し得ることを意味する。従って、短いオリゴヌクレオチドの使用は、所望されない分子内相互作用および分子間相互作用の可能性を低減させるはずである。

本発明者らのデータは、オリゴヌクレオチドの最適長が、３０ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの間にあること、および漸増的により大きいオリゴヌクレオチドは、侵入／伸長の速度を低下させ得ることを示す。しかしながら、オリゴヌクレオチドの長さを、検索オリゴヌクレオチドの３’領域内または５’領域内の二重鎖領域に適合するように延ばすことが望ましいこともあり得る。従って、本発明の一態様では、好ましいプライマー長は約３０塩基〜約５０塩基の間である。これらの基準の少なくとも１つに適合するプライマーサイズの例としては、３０塩基〜４５塩基の間、３０塩基〜４０塩基の間、３０塩基〜３５塩基の間、３５塩基〜４０塩基の間、４０塩基〜４５塩基の間、および４５塩基〜５０塩基の間のプライマーが挙げられる。上記で参照したプライマーサイズが好ましいが、３０塩基未満の最適プライマー長を有するリコンビナーゼおよび／または単鎖結合タンパク質もまた可能であり、想定される。

（オリゴヌクレオチド組成、配列および単鎖／二本鎖特性）
（１）組成および配列）
インビトロＤＮＡ合成反応での使用、特にＰＣＲにおける使用のためのオリゴヌクレオチドを設計するためのソフトウェアは、充分確立されている。ＲＰＡ法の考慮事項は類似であり、オリゴヌクレオチドの融解温度の最適化、オリゴヌクレオチド内のヘアピン形成の回避、および所与の反応に存在する他のオリゴヌクレオチドとの相補性に対する選択が挙げられる。ＲＰＡは、比較的低温度で行なわれるため、かかる考慮事項は潜在的により重要になる。本発明者らは、ＲＰＡ反応において伸長されたプライマー産物の蓄積を観察し、これは明らかに、鋳型非依存的でありそして使用するプライマーの組合せに依存的である。生成される異常産物のサイズは、これらがプライマー二量体であるか、または単一のオリゴヌクレオチドの自己プライミングの結果を示す。このような好ましくないプライマーアーティファクトは、ＰＣＲなどの他の方法でよく知られている。従って、好ましくない副反応が回避されるオリゴヌクレオチドプライマー対を設計することは重要である。本発明者らは、ヘアピンを形成し得るオリゴヌクレオチドは、ＲＰＡ反応において誤って自己プライミングし得ることを観察した。

オリゴヌクレオチド配列設計の最適化の他に、プライマー二量体形成を低減または排除するためのさらなるアプローチがある。本発明者らは、反応ノイズが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを用いることによって有意に低減され得ることを観察した。これは、ミスプライミングが、ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性によって短くなったオリゴヌクレオチドに起因し得ることを示す。従って、３’−５’エキソヌクレアーゼ編集（ｅｄｉｔｉｎｇ）活性、ピロホスホリル分解（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｙｓｉｓ）、または任意の他の同様の編集活性は、ノイズ源であり得る。エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼの使用およびピロホスファターゼによるピロリン酸塩の除去に加え、最後の結合および／または最後から２番目の結合において非加水分解性主鎖を有する合成オリゴヌクレオチドの使用は、反応ノイズを低減するのに有益であり得る。代替的な主鎖が、相当な範囲の利用可能な化学物質、例えば、ホスホロチオレート、モルホリノ、ロックした（ｌｏｃｋｅｄ）核酸、またはペプチド核酸などから選択され得る。

（２）単鎖／二重鎖特性）
また、オリゴヌクレオチドの３’末端で異常伸長を阻止することも、ハイブリッドの形成に関して標的化オリゴヌクレオチドの３’領域と効率的に競合し得る短いコンペティターオリゴヌクレオチドを設計し、これを含めることによって達成され得る。このようなアプローチは、種々の様式で構成され得る。

１）標的化オリゴヌクレオチドの最も３’側の残基に対して完全が相補鎖を含む短い独立したオリゴヌクレオチドが使用され得る。このオリゴヌクレオチドは、反応温度で、中程度に効率的に標的化オリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成し得るのに十分な長さであり得る。これは６〜１５の間の残基長であり得る。この短いオリゴヌクレオチドは、その３’末端にブロック基（例えば、ジデオキシ糖または他の３’ブロック基）を有することにより伸長不能である。また、このオリゴヌクレオチドは、編集活性による３’−５’方向の塩基の除去を阻止するため、主鎖結合の最後および／または最後から２番目において非リン酸結合を必要とし得る。大部分のタンパク質被覆されていない標的化オリゴヌクレオチドは、この短いオリゴヌクレオチドと二重鎖を形成し得るが、これは、ＲＰＡ反応の速度および効率を有意には減少させないはずである。第１に、低ＲＰＡ反応温度では、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされていないオリゴヌクレオチドとの間に平衡が存在し得るため、常に、一群の利用可能な遊離した融解された標的化オリゴヌクレオチドが存在する。このオリゴヌクレオチドは、反応物中の他のランダム配列よりも良好なコンペティターであるため、他の一過的な相互作用対して好都合である。第２に、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ｒｅｃＡ、ｕｖｓＸ、ｇｐ３２および大腸菌ＳＳＢ）は、二重鎖ＤＮＡを融解する傾向にあり、従って、タンパク質が結合していない場合にハイブリッドがその反応温度で比較的安定であっても、それらのハイブリッドはオリゴヌクレオチドの単鎖部分に結合して二重鎖の領域へと協同的に伸長する場合に、その二重鎖の融解が起こる可能性があり、これによって二重鎖状態は、裸のオリゴヌクレオチド上にのみ存在する傾向にある。最後に、リコンビナーゼは、単鎖ＤＮＡ領域と二本鎖標的との間で開始される鎖交換を、両ＤＮＡが二本鎖である領域の中へと伸長させる能力を有する。これは、ＡＴＰ依存性の分枝の移動活性であるようである。総合すると、これらの考慮事項は、短い二本鎖領域は、ＲＰＡ反応の速度を有意に低下させないはずであるが、その代わりに、標的化プライマーの３’領域への結合に関して、反応に利用可能な他のオリゴヌクレオチド配列よりも良好なコンペティターであることにより、タンパク質被覆されないオリゴヌクレオチドから生成されるプライマー二量体または他のアーティファクトの形成を抑制するように作用するはずであることを示す。エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼが使用される場合、このオリゴヌクレオチドを、最後の３’ヌクレオチドよりもむしろ、その最後から２番目において、そのオリゴヌクレオチドの最も５’側の塩基が対合するように設計することが、最適であり得る。なぜなら、多くのポリメラーゼが完全な平滑末端へとさらなる塩基を付加する傾向にあるからである。

２）第２のアプローチでは、標的化オリゴヌクレオチドは、最初の標的ＤＮＡには存在しない５’突出端を有し、この突出端は、同じ標的化オリゴヌクレオチドの３’末端の配列に正確な逆相補的であり、おそらく、最も３’側の塩基のみが対合形成していないままである（図３５パートＤ）。この相補的オリゴヌクレオチドの長さは、比較的短いが、反応物中に存在する他のオリゴヌクレオチド配列よりずっとより良好なコンペティターであるのに充分長くなければならない。例えば、６〜１０ヌクレオチドが最適であり得る。第１のアプローチについて上記のように、この構成は、任意の他の配列よりもずっとより効率的に自身に対してヘアピン構造を形成する、任意の非被覆オリゴヌクレオチドをもたらすことがあり得る。設計では、標的化オリゴヌクレオチドの５’末端ではなく、オリゴヌクレオチドの３’塩基または最後から２番目の３’塩基を、完全な塩基−対合形成環境に置くので、これは、末端が平滑である場合に多くのポリメラーゼによってしばしば触媒される単一の残基の添加以外では、伸長され得ない。この状況では、ポリメラーゼの編集活性を無処置のままにしておくのがよいことがあり得る。このようなヘアピン形成オリゴヌクレオチドは、タンパク質負荷フィラメントの活性を阻止することなく、裸のオリゴヌクレオチドの誤った活動を抑制し得る。

しかしながら、このアプローチを採用するためのいくつかの重要な考慮事項がある。第１に、リコンビナーゼ負荷が、二本鎖部分の初期融解なしで部分的に二本鎖の裸のオリゴヌクレオチドにおいて直接開始される場合、リコンビナーゼは、最適であり得るほど５’末端の近くまでは標的化オリゴヌクレオチドを伸長し得ない。第２に、増幅反応が第１のラウンドより多く継続される場合、先の合成ラウンドで生成された産物の能動的な置換があり、完全な置換が起これば、被置換鎖のまさに３’末端（これは、すぐ隣の配列に相補的である）は、ヘアピンとなり得、速やかに自己プライマーになる。このような迅速な自己プライミング事象は、ＤＮＡ合成、および新規な二本鎖ＤＮＡの形成をもたらし、両方の鎖が一端でヘアピンによって連結され得る。これは、さらなるラウンドの侵入／合成のための基質となり、二量体様産物、およびおそらくより多くの複合体産物の形成をもたらし得る（図３５を参照）。本発明者らは、この状況は、診断試験に完璧に許容可能であり得ると予測する。増幅された配列はすべて、真正標的ＤＮＡの存在に依存性であり、特有のオリゴヌクレオチド間配列を含有するため、および自己プライミング事象は、効率的に機能させるために遺伝子操作され得るため、これは、診断アッセイの理想的な形式を示し得る。本発明者らは、既に、特異的標的から見かけ上生成される単位長さの増幅ＤＮＡ断片より大きい生成を行ない、この機構が、特異的オリゴヌクレオチド設計の非存在下で作用し得るのではないかと考える。同様の活性が報告されているが、この場合、活性は、単一の非常に大きな単鎖ＤＮＡを用い、全く異なる様式で開始された（ＭｏｒｒｉｃａｌＳＷ，ＷｏｎｇＭＬ，ＡｌｂｅｒｔｓＢＭ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９９１Ｊｕｌ２５；２６６（２１）：１４０３１−８）。

３）最終アプローチでは、３’末端をブロックした別個の短いオリゴヌクレオチドが、アプローチ１に記載のようにして使用される。しかしながら、この場合、標的化オリゴヌクレオチドの５’末端と短いコンペティターオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端との間の連結が遺伝子操作される（図３５パートＢおよびＣ）。このアプローチは、コンペティターオリゴヌクレオチドが標的化オリゴヌクレオチドに近接して固定されることにより、この反応において、任意の他の配列を有するこのオリゴヌクレオチドの効率的な競合が確保されること以外は、アプローチ１と同様である。

（ポリメラーゼ選択）
ＲＰＡに使用され得るＤＮＡポリメラーゼはたくさんある。しかしながら、所与の適用に最適なＲＰＡ形式を設計する際に考慮すべきいくつかの基準がある。本発明者らは、ＲＰＡ反応において活性を有するいくつかの異なるポリメラーゼを同定し、どの特性が種々の環境に特異的利点をもたらすのかを推測した。刺激的な結論の１つは、非相同性系由来のポリメラーゼが有効に使用され得ることである。本発明者らは、以下に、ＲＰＡに最も関連するポリメラーゼ活性を記載する。

（ポリメラーゼ連続的合成能）
ポリメラーゼ連続的合成能（プロセッシビティー）は、ＤＮＡ鋳型との各個々の相互作用において触媒された、組込み事象の代表的な数値として測定される。分子生物学適用において使用されているポリメラーゼ酵素の多くは、多くの場合、その主な役割がＤＮＡ修復およびオカザキ断片の連続合成である大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの機能的アナログであるため、高度に連続合成的ではない。連続的合成能は、ＲＰＡにとって、ＰＣＲよりも不可欠な考慮事項である。ＲＰＡでは二本鎖鋳型を使用するため、分配性ポリメラーゼは、接合を有する部分的にコピーされた鎖をもたらし、これは、分枝の移動によって排出され得る。また、本発明者らは、バブル移動は、さまざまなＲＰＡ構成で起こり得ることを示す証拠を有する。バブル移動において、鋳型ＤＮＡの親鎖は、複製複合体のすぐ後ろで再ハイブリダイズし、新たに合成された鎖の放出をもたらし、この鎖は、元の組換え事象の放出鎖の代わりに単鎖ＤＮＡとして遊離している。この再ハイブリダイゼーションは、以前に、Ｔ４組換え／ＤＮＡ合成系において報告されており、ｕｖｓＸリコンビナーゼによる放出鎖の被覆および後続の再侵入を伴うと考えられている。あるいはまた、非協同性単鎖ＤＮＡ結合タンパク質の存在下で、モノマーは放出鎖の一方の末端から徐々に失われ得、５’−３’方向に進む進行的な分枝の移動をもたらし得、複製複合体に追従し得る。

従って、ポリメラーゼが時期尚早に鋳型から解離すると、バブル移動または分枝の移動は、不完全な単一鎖として鋳型から分離される新たに合成された鎖をもたらし得る。これは、かかる切断型産物が、反対側から生成される同様の産物との生産的なハイブリッドを形成するのに短すぎる場合、これらの好ましくない短い産物は直線的に蓄積されるため、ＲＰＡ反応にとって破滅的であり得る。Ｔ４単鎖ＤＮＡ結合タンパク質ｇｐ３２は、好ましくない分枝の移動を軽減し得る。しかしながら、ＲＰＡでは、大きなＤＮＡ断片を効率的に増幅するために、可能な場合は、比較的連続合成性のポリメラーゼまたはポリメラーゼ複合体の使用が求められ、。現在、チオレドキシンとの複合体において一般に使用されているいくつかの単純なポリメラーゼ、例えば、φ−２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７ＤＮＡポリメラーゼは連続合成性であることがわかっている。しかしながら、比較的プロセッシング性のポリメラーゼの既知の類型のうちのすべてが、ＲＰＡに好適なさらなる特性の組合せを有し得るわけではない；φ−２９ポリメラーゼは、これまで、幾何級数的なＲＰＡ増幅を補助できるとは示されておらず、おそらく、組換え中間体上への効率的な負荷ができないことによる。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼは、有効であるのに充分な鎖置換活性を欠く。対照的に、本発明者らは、バチルス属由来の関連するＰｏｌＩ酵素（例えば、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＰｏｌＩ（Ｂｓｕ））は、相対的に連続合成性であることおよびエキソヌクレアーゼのない（エキソヌクレアーゼマイナス）状態をＢｓｔポリメラーゼと共有するが、３０〜３７℃範囲の温度において最適な溶解性および活性のプロフィールを保持していることにより、最適な特性を示し得ると推測した。さらに、スライディングクランプを包含するマルチサブユニット複製複合体（例えば、バクテリオファージＴ４、大腸菌などに由来のもの）が使用され得るが、現行のＲＰＡ反応について優れたシグナル：ノイズおよび反応速度論特性を維持する有効なインビトロ反応においてこれらの成分すべてを組み立てることは、依然として難題である。本発明者らは、Ｂｓｔポリメラーゼと関連するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のポリメラーゼＩを精製した。このポリメラーゼは、容易に過剰産生され、大腸菌からＮ−末端の６ヒスチジン（ｈｅｘｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）タグを用いて精製され、ＲＰＡに対する理想的な生化学的特質を有するようである。

最後に、分配性ポリメラーゼがＲＰＡにより適切であり得るいくつかの状況がある。多くの構成では、ＤＮＡ合成は、対向する末端から開始され、複製複合体は互いに向かって移動し、複合体同士の衝突の可能性があり、どちらもそれ以上は進行しない膠着状態がもたらされる。これは、一方のポリメラーゼを鋳型から一時的に解離させること、または使用するポリメラーゼが解離なく有効に互いを通過できることのいずれかを必要とする。ＲＰＡの理想的なポリメラーゼに対する種々の要件の結果、本発明者らは、実験的証拠が最良の指針であることを示し、これまでに、ユーバクテリウム属由来、特にバチルス属由来のＰｏｌＩクラス酵素が、現在、最良の特性を有することを示している。

（ＤＮＡポリメラーゼと関連する存在する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性）
多くのＤＮＡポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、一部はまた、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性も有するが、これは、ポリメラーゼが前方に移動するにつれて、置換ではなく、一方のＤＮＡ鎖の消化が鎖進行的にもたらされるため、おそらくＲＰＡにおいて好ましくない。３’−５’エキソヌクレアーゼは、潜在的に利点を有すると同時に明白な不都合点を有する。一方では、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、複製反応の忠実度を増大させ、また、組込み間違いの地点でのポリメラーゼの失速を抑制し得る。高忠実度の増幅は多くのＤＮＡ適用に望ましい。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性はまた、大きなＤＮＡ断片の増幅に適切であり得る。組込み間違いによる失速は、効率的な増幅を阻害し得る。

このような３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の明白な利点にもかかわらず、いくつかの不都合点がある。本発明者らは、３’−５’エキソヌクレアーゼを有するポリメラーゼを用いた場合、遊離オリゴヌクレオチドが末端依存性分解に供され得ることを観察した。これは、比較的協同性の飽和量のｇｐ３２タンパク質を一部のポリメラーゼ（例えば、クレノウ断片）と共に用いることにより大幅に抑制され得るが、強力なエキソヌクレアーゼを有する酵素（例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼまたはφ−２９ＤＮＡポリメラーゼ）を用いる場合、ｇｐ３２は不十分なようであり、オリゴヌクレオチドは完全に分解されるようである。これらのデータにより、反応におけるエキソヌクレアーゼ活性の有効性を少なくともある程度に制限することは好都合であることを論じる。

本発明者らは、一部のポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が、反応中のノイズに実質的に寄与し得ることを見出した。ＲＰＡ反応に使用される比較的低温では、反応中、非被覆単鎖ＤＮＡ分子が、不適切なハイブリッドを低相補性で他のＤＮＡと形成する有意な傾向がある。かかるハイブリッドは、ＤＮＡポリメラーゼ伸長をプライミングする。伸長が起こるためには、最後の塩基または最後の２つの塩基が正しくその相補鎖と対合形成されなければならない。オリゴヌクレオチド内またはオリゴヌクレオチド間の不十分に相補性のセグメントは、低温度で弱いハイブリッドを形成し得、これらは、稀に、良好なハイブリッド適合性によりまさに３’末端で合わさる。それでも、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の存在下では、対合形成していない最も３’側の塩基は、正しく対合形成された３’末端が形成されるまで切断され、これは、通常、正しくない塩基がポリメラーゼによって挿入された場合に起こる。本発明者らのデータは、分枝の移動またはバブル移動によって置換された部分的に伸長された鎖は、３’末端を対合形成していないままに残して自身に対して折り返らされ（フォールドバック）得、この末端はトリミングされ、従って、不適切なポリメラーゼ伸長が促進されることを示す。従って、ＲＰＡに使用されるポリメラーゼからエキソヌクレアーゼ活性を制限または除去する充分な理由がある。オリゴヌクレオチド分解を抑制する方法は他にもあり、これもまた使用され得る。

（３’末端への接近）
侵入後に形成される組換え中間体は、ＤＮＡポリメラーゼに接近可能でなければならない。標的化オリゴヌクレオチドの３’末端付近の構造は、それ以外は単鎖ＤＮＡとハイブリダイズした（ＰＣＲの状況である）オリゴヌクレオチドの３’末端と等価ではない。その代わり、侵入オリゴヌクレオチドの３’末端のすぐ下流またはやや下流で鋳型鎖にハイブリダイズする放出鎖が、ポリメラーゼ負荷をブロックし得る。さらに、放出鎖が拘束されているか拘束されていないかは、ある種のポリメラーゼが成功裏に負荷を与える能力に影響を与え得る。特定のポリメラーゼがこのような状況において有効に機能を果たし得るか否かは、実験的により取り組まなければならない。本発明者らは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、およびＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから精製されたＢｓｔＤＮＡポリメラーゼは、かかる組換え中間体に負荷を与え、伸長させ得ることを見出している。また、Ｔ４ｄｄａヘリカーゼおよびＴ４ｇｐ４１ヘリカーゼなどのヘリカーゼが、組換え中間体を連続合成し、鋳型と放出鎖を交換事象の下流で分離させ、他のポリメラーゼが使用されるのを可能にする機能を果たし得るが、これらのヘリカーゼもまた、ＲＰＡの他の側面を妨げ得る（下記参照）。最後に、ＲＰＡ反応において相乗的に作用するポリメラーゼの混合物（例えば、一方のポリメラーゼが組換え中間体の３’末端への接近に効率的であり、他方は、連続合成性の鎖置換合成活性を有する）用いることは有益であり得る。

（協同性成分の相互作用）
本発明者らは、異種系由来の酵素性成分を種々のＲＰＡ形式において一緒に有効に組合せ得ることを示した。例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、およびＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓポリメラーゼＩのラージフラグメントはいずれも、バクテリオファージＴ４ｇｐ３２タンパク質の存在下で、バクテリオファージＴ４のｕｖｓＸリコンビナーゼにより生成される組換え産物を伸長させ得る。これは、大腸菌ＰｏｌＩと類似するポリメラーゼの類型が、一般的にＲＰＡ反応において有効であることを示唆し、これは、それらの修復活性に必要とされる組換え中間体への接近と組合せた、それらの鎖置換酵素としての異なる特性を反映し得る。さらにまた、組換え中間体の伸長が、広く異なる構造群に由来するポリメラーゼによって容易に媒介され得ることは不確実である。バックファイヤー合成によって安定化される末端指向組換え中間体により初期に示されたにもかかわらず、本発明者らは、φ−２９ポリメラーゼを用いてＲＰＡ反応を誘発することはできなかった。これは、この酵素が組換え中間体上に容易に負荷され得ないことを反映し得る。同じ生物由来のタンパク質を一緒に用いた場合、さらなる相乗効果があり得る。例えば、バクテリオファージＴ４成分（例えば、ｕｖｓＹおよびｕｖｓＸ、ならびにｇｐ３２）の間に物理的相互作用があることが知られている。このことは、他の成分に拡張され得、例えば、Ｔ４ポリメラーゼは、ｇｐ４１ヘリカーゼと、物理的にｇｐ３２と機能的に相互作用する（ＦｏｒｍｏｓａおよびＡｌｂｅｒｔｓＰＮＡＳ８０，２４４２−２４４６，１９８３）。しかしながら、ＲＰＡ効率を向上させるために同じ生物由来の成分を使用することは、一見魅力的であるにもかかわらず、本発明者らは、Ｔ４ポリメラーゼによる連続合成性のＤＮＡ合成に用いられる一部のヘリカーゼは、本発明で確立した有効なＲＰＡ環境と容易には組合せられ得ないことを見出した。初期の実験により、Ｔ４ｄｄａヘリカーゼを含めることは、ＲＰＡ環境においてオリゴヌクレオチドの被覆を崩壊させ、過剰のプライマーノイズをもたらし、ＲＰＡ反応の感度を妨げることが示された。これは、以前に公表された報告［差込参照：ＪＢＣ．１９９１Ｍａｙ２５；２６６（１５）：９７１２−８Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｐａｒｉｎｇｂｙｂａＤＮＡｈｅｌｉｃａｓｅ．ＫｏｄａｄｅｋＴ］と一致する。

（複製複合体衝突の解決）
いくつかの形式のＲＰＡでは、例えば、大きなＤＮＡ産物が所望される場合、連続合成性のポリメラーゼが最適な選択であり得る。しかしながら、この条件では、複製複合体が同じ鋳型で互いに集中する有意な可能性がある。複製複合体は、直接対面して（ｈｅａｄ−ｔｏｈｅａｄ）動かなくなる状態になり、その結果、いずれも通過することができないという危険がある。この状況で最も有用なのは、連続合成性で、かつ衝突を解決できるポリメラーゼであり、φ２９ＤＮＡポリメラーゼについて実証されているとおりである（Ｅｌｉａｓ−ＡｒｎａｎｚＭ，ＳａｌａｓＭ．ＥＭＢＯＪ．１９９７Ｓｅｐ１５；１６（１８）：５７７５−８３）。あるいはまた、かなり高頻度に解離させる分配性能力と組合せた有用な複製実行を可能にするための、連続的合成能の理想的なレベルの微細だが重要な均衡も、この問題を解決し得る。

（リコンビナーゼ）
本発明者らは、大腸菌ｒｅｃＡタンパク質およびバクテリオファージＴ４ｕｖｓＸタンパク質の両方をＲＰＡ実験においてアッセイした。これらのタンパク質はともに、一部の限定的なタンパク質配列相同性を共有し、共通の先祖から進化したと考えられる。これらのタンパク質の核タンパク質フィラメントの結晶学および電子顕微鏡研究では、ＡＴＰおよびＡＤＰが結合した両方の状態で形成されたらせんのピッチの点で保存されたフィラメント構造が示され、これは、それらの作用機構において顕著な類似性を示す。さらにまた、すべての原核生物は、ｒｅｃＡに高度に相同なタンパク質を有し、このことは、リコンビナーゼの主要な活性が、進化を通じて保存されていることを示す。従って、１つのリコンビナーゼからわかることは、別のものに当てはまり得、または置き換えられ得る。

しかしながら、それらの類似性に加え、ＲＰＡに関連してｒｅｃＡとｕｖｓＸとの間に差異があり、組換え／複製機構のさらなる成分がＲＰＡ反応に使用されるため、生物特異的タンパク質−タンパク質相互作用は反応効率に対して有意な影響を有し得る。ｕｖｓＸのヌクレオチド加水分解速度はｒｅｃＡのものより１０〜２０倍大きく、これは、組換え反応がより加速された速度で行なわれ得ることを示す（ＦｏｒｍｏｓａＴ，ＡｌｂｅｒｔｓＢＭ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９８６Ｍａｙ５；２６１（１３）：６１０７−１８．）。加水分解速度の増加は、いくつかの様式でＲＰＡ反応に有益であり得る。

１）オリゴヌクレオチドに対してｕｖｓＸのより動的なターンオーバーは、核タンパク質フィラメントの全体的な再生を増加させ、侵入オリゴヌクレオチドの最も５’末端へのほぼ完全なリコンビナーゼの覆いをもたらし得る。

２）成功裏の組換え事象によるリコンビナーゼのより迅速な完全さおよび分解は、より効率的なポリメラーゼの接近を可能にする。

３）より活性なリコンビナーゼは、より柔軟な核タンパク質フィラメントを生成する。

ｕｖｓＸとｒｅｃＡとの間の別の大きな差は、ｕｖｓＸが、ＡＴＰをＡＤＰ＋リン酸塩に、およびＡＭＰ＋ピロリン酸塩に加水分解するが、ｒｅｃＡおよび他のリコンビナーゼはそれをしないことである（ＦｏｒｍｏｓａＴ，ＡｌｂｅｒｔｓＢＭ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９８６Ｍａｙ５；２６１（１３）：６１０７−１８．）。この差の生物学的な重要性はわかっていないが、活性はＲＰＡ効率に影響を与え得る。例えば、ＡＴＰおよびＡＤＰにより形成される核タンパク質フィラメントのピッチは異なり、ＡＤＰへのＡＴＰの加水分解はフィラメント全体の柔軟性と関連する。ＡＭＰ結合ｕｖｓＸは、異なるピッチを採用し、異なる柔軟性を有し得ることがあり得る。

バクテリオファージＴ４リコンビナーゼｕｖｓＸは、バブル移動として知られる合成後のＤＮＡ置換の様式を刺激する。バブル移動では、ｕｖｓＸは放出鎖上に組立られ、放出鎖の再侵入を媒介し、従って、新たに合成された鎖を置換する。この様式は、新たに合成された鎖を置換することにより、位相的に拘束された領域の長さが限定的となるため、生物学的重要性を有し得る。このプロセスは、ｒｅｃＡに関しては報告されていないが、起こる可能性がある。それでも、バブル移動のいくつかの態様は実際のｕｖｓＸとｒｅｃＡとの間の差異を示す。例えば、バブル移動モデルにより、ｕｖｓＸ結合ＤＮＡは、侵入ＤＮＡまたは部分的に伸長されたＤＮＡの末端まで伸長するが、この構造は、依然として伸長のためのポリメラーゼによる接近が可能であることあり得ることが示されている（ＦｏｒｍｏｓａＴ，ＡｌｂｅｒｔｓＢＭ．Ｃｅｌｌ．１９８６Ｄｅｃ５；４７（５）：７９３−８０６）。これは、ｒｅｃＡについては確実には観察されておらず、何らかが存在するとすると、それと反対であり得る証拠がある（ＸｕＬ，ＭａｒｉａｎｓＫＪ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００２Ａｐｒ１９；２７７（１６）：１４３２１−８）。ｕｖｓＸフィラメントおよびｒｅｃＡフィラメントが、リコンビナーゼ解離を伴って、またはこれなしで、３’末端におけるポリメラーゼ負荷を促進するそれぞれの能力において、どれだけ類似しているかは明らかでない。本発明者らは、ｕｖｓＸ（Ｃ）とｒｅｃＡ（Ｃ）との間の差異が有するという考えと一致して、それらの差異がＲＰＡ効率に影響し得るということを見出した。ｒｅｃＡに関する本発明者らの所見とは反対に、ｕｖｓＸは、Ｎ−末端タグ化ｇｐ３２をポリエチレングリコールの非存在下で使用した場合であっても、末端構造標的に対する複数回の侵入を媒介し得る（図２３）。従って、ｕｖｓＸは、ＲＰＡにおける使用により最適であり得る。

バクテリオファージＴ４ｕｖｓＸリコンビナーゼは、十分に特徴付けられた、そのパートナー負荷タンパク質ｕｖｓＹとの相互作用を有する。大腸菌ｒｅｃＯおよびｒｅｃＲがｕｖｓＹの機能的アナログであり得ることを示す報告にもかかわらず、本発明者らは、ＲＰＡ反応の有意な改善を観察しなかった。これは、本発明者らのタンパク質調製物に伴う問題に起因し得るか、または大腸菌ＳＳＢでなく異種ｇｐ３２の使用に起因し得る。

最後に、ｕｖｓＸは、本発明者らが最適な単鎖ＤＮＡ結合タンパク質であると示したｇｐ３２と、より良好な挙動を示し得る。なぜならこれらｕｖｓＸとｇｐ３２とは、協調して機能するように進化し、関連する相互作用を有し得るためである。実際、ｕｖｓＸおよびバクテリオファージＴ４組換え依存性複製機構の他の成分（例えば、ｄｄａヘリカーゼ）は、最適ＲＰＡ反応の確立に有用であり得る既知のタンパク質−タンパク質相互作用を有する（ＨａｃｋｅｒＫＪ，ＡｌｂｅｒｔｓＢＭ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９９２Ｏｃｔ１５；２６７（２９）：２０６７４−８１）。

ＲＰＡに対するｕｖｓＸの見かけ上の利点にもかかわらず、有用であり得る大腸菌ｒｅｃＡの特徴がある。ｒｅｃＡ核タンパク質フィラメントはより安定であることが報告されており、このことは一部の環境において実用的であり得る。ＡＴＰ加水分解速度が低いほど、持続性のＡＴＰ再生系の確立に対して負荷がより少なくなり、ＡＭＰおよびピロリン酸の生成がないことは、これらの副生成物の再生および処理の必要性を不要にする。また、他のｒｅｃＡホモログがＲＰＡに最適である活性を有する場合があり得る。

（動的な組換え系の確立）
ＲＰＡを強化するため、反応を、充分な数の活性な被覆された相同性検索リコンビナーゼ／ＤＮＡフィラメントを供給するように構成することは重要である。また、相同性検索の終了後、フィラメントは、効率的に分解されるか、あるいはそれ以外に処理され、ＤＮＡポリメラーゼおよび他の成分の負荷を可能にしなければばらない。また、オリゴヌクレオチド融解の助長、および置換された放出鎖の収集の両方のために、充分な量の単鎖ＤＮＡ結合タンパク質が存在することは不可欠である。最終的に、強力なＲＰＡでは、連続合成性の鎖置換ＤＮＡ合成が必要となる。このような要件の基礎をなすことは、リコンビナーゼと単鎖ＤＮＡ結合タンパク質の二者間の競合である。

単鎖ＤＮＡ結合タンパク質の存在下で、リコンビナーゼ負荷ＤＮＡフィラメントは不安定であることは広く知られている。ヌクレオチド補因子の加水分解は、相同性検索に厳格には必要とされないという所見と合わせると、ｒｅｃＡをフィラメント上に負荷し、安定な相同性検索複合体を生成させるために、ヌクレオチドの非加水分解性ヌクレオチドアナログ、例えば、ＡＴＰ−γ−Ｓの使用につながる。ＡＴＰ−γ−Ｓを用いるｒｅｃＡ媒介性増幅方法は報告されている（Ｚａｒｌｉｎｇｅｔａｌ．）が、広くは使用されていない。本発明者らは、以前に、この方法の欠陥を特定し、これは、本発明者らの実験結果において観察され得る。Ｚａｒｌｉｎｇｅｔａｌ．の方法は、おそらく失敗に終わる。なぜなら、リコンビナーゼ負荷フィラメントが動的で分解可能である必要があり、かつ、他のＡＴＰ−加水分解依存性事象が、鎖交換を完了し、ＤＮＡポリメラーゼ他の成分の侵入オリゴヌクレオチドの３’末端への負荷を可能にする必要があるためである。ＡＴＰ−γ−Ｓの使用、ならびに他の修飾（例えば、リコンビナーゼのＣ末端からの酸性配列の除去など）は、ＤＮＡに対して一定の一般的な高親和性をもたらし、これは、鎖交換および侵入複合体からの解離を抑制し得る。従って、ＡＴＰ−γ−Ｓ負荷ｒｅｃＡフィラメントは、組換え事象において、異常に長時間、標的部位上に有効にロックされた状態になる。従って、非加水分解性ヌクレオチドアナログは、一般的に、リコンビナーゼ媒介性複製および増幅に許容性でない。その代わりに、リコンビナーゼ負荷を補助できるＡＴＰまたは他の加水分解性ヌクレオチドが使用されなけれならない。ＡＴＰの場合、リコンビナーゼは、定常的にオリゴヌクレオチドと結合し、また、これから解離しており、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質と競合状態である。本発明者らは、この競合がもたらす問題に、一般的に２つの様式により取り組んだ；第１に、ｕｖｓＸに特異的なリコンビナーゼ負荷タンパク質ｕｖｓＹタンパク質を含めること、第２に、変異および／またはクラウディング剤を含めることによって、ｇｐ３２とリコンビナーゼｕｖｓＸおよびｒｅｃＡとの協同性挙動を調節すること。しかしながら、リコンビナーゼの全体的な負荷／非負荷活性を調節するために、限定的な量の非加水分解性アナログ（例えば、ＡＴＰ−γ−Ｓ）、またはリン酸化不能なアナログ（例えば、ＡＤＰ−β−Ｓ）を含め得ることは、可能である。

（さらなる反応成分）
いくつかの特定の反応成分は、ＲＰＡ反応有効性に対して有意な影響を有する。

（ポリエチレングリコール）
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、組換え／ＤＮＡ合成に対して著しい効果を有する。第１に、本発明者らは、ＰＥＧが、例えば、ｒｅｃＡをｇｐ３２（Ｎ）と組合せた場合に起こる複数回の侵入／伸長サイクルの回数に影響することを見出した。また、本発明者らは、ＰＥＧが、いくつかの異なる様式で構成した増幅反応を刺激することを見出した（図１５、実施例３）。また、いくつかの構成において、ＰＥＧにより、形成される産物長さ分布が改変されることがわかった（図２８）。まとめると、ポリエチレングリコール、およびおそらく他の同様のクラウディング剤は、ｇｐ３２とリコンビナーゼの協同性に影響し、ポリメラーゼの連続的合成能に影響し、溶液中でのハイブリダイゼーション速度およびオリゴヌクレオチドの挙動に影響し得る。これらは、反応体を相分配することおよび／またはフラクタル様反応速度論の進行を引き起こすことにより、細胞様環境に入れ得る。さらにまた、ポリエチレングリコールの鎖長は重要であるようである。試験したもののうち、平均分子量１４５０および１５，０００〜２０，０００のＰＥＧ（ＰＥＧ「化合物」）が最良の結果をもたらすことがわかった。ｇｐ３２機能、特に、協同性が減衰されたｇｐ３２改変体の機能におけるＰＥＧによる助長は、上記に詳述した。また、ＰＥＧはリコンビナーゼ負荷フィラメントの安定性を増大させ得、増大された持続性により、ＲＰＡ有効性が増大し得る。最も重要なことには、本発明者らは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１４５０では不十分で、ＰＥＧ化合物では非常に効率的）を用いずには、微量の試料を検出可能なレベルまで増幅できる増幅条件の確立を完全にはできていない。おそらく、他の因子もＲＰＡ反応を刺激し得る。しかしながら、この効果は、ポリビニルアルコールを用いた予備実験では明白でなかった。従って、ポリエチレングリコール、より詳しくはＰＥＧの特定の改変体の特異的特徴は必須であり得る。

どのような様式でＰＥＧ化合物（ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ）が、かかる有意な刺激性効果を発揮するのかは不明である。容量排除が反応速度に影響を及ぼし得る様式の反応速度論モデルにより、クラウディング成分と比較した試験下において、基質および酵素の分子量が大きく強調され得る。しかしながら、本発明者らが試験した２番目に最も有効な薬剤ＰＥＧ１４５０もまた最小であり、ＰＥＧ１４５０とＰＥＧ化合物との間のポリエチレングリコール中間体による刺激は、あまり有効でなかった。従って、本発明者ら平均鎖長のみに加えた特性が、これらの薬剤の効果に不可欠であるのではないかと考える。例えば、特定の相転移は、異なるＰＥＧで種々の温度で起こり得る。また、ＰＥＧのアルコール基は、例えばタンパク質とのさらなる相互作用もたらし得、またはイオン環境に影響し得ることが知られている。本発明者らは、５％ＰＥＧ化合物（室温で保存中、７．０未満のｐＨを示す）を、ＲＰＡに使用されるＴｒｉｓ−緩衝化溶液に添加すると、ｐＨの急激な上昇が引き起こされることに注目する（データ示さず）。

結果として、現在、実験による確認以外に、どの容量排除剤が、高レベル動的組換え環境および特にＲＰＡを刺激する適正な特性を有するかを調べるための公式化された様式は、存在しない。

（ＡＴＰ再生系成分）
ＡＴＰ再生系は、リコンビナーゼが、核酸に結合したとき、極めて高いＡＴＰ加水分解速度を有するので、持続性の組換え反応を可能にするのに非常に重要である。特に、ｕｖｓＸタンパク質はｒｅｃＡより１０〜２０倍高い加水分解速度を有し、１分当たりモノマー当たりＡＴＰ２００分子を消費し得る。いくつかの系が利用可能であり、本発明者らは、クレアチンキナーゼ／クレアチンリン酸系を常套的に使用した。ｕｖｓＸを用いる場合、生成されるＡＭＰはＡＴＰに変換されなければならない。本発明者らは、ＡＭＰ１分子とＡＴＰ１分子とを２つのＡＤＰ分子に変換するニワトリのミオキナーゼを使用した。次いで、ＡＤＰをＡＴＰに、クレアチンキナーゼ／クレアチンリン酸系を用いて変換する。ＡＴＰの不十分な再生は反応速度を低下させ、検出可能なレベルの産物が蓄積される前に反応が停止することがあり得る。

（ピロホスファターゼ）
ＤＮＡ合成中、およびｕｖｓＸを用いた場合にＡＴＰがＡＭＰ＋ＰＰｉに加水分解されるため、ピロリン酸塩（ＰＰｉ）が蓄積される。反応物中のＰＰｉ蓄積は、いくつかの有害な結果を有し得る。有意なピロリン酸塩蓄積は、許容され得ない速度の加ピロリン酸分解をもたらし、それにより、ポリメラーゼの合成反応が逆方向に誘発され、最も３’側のヌクレオチドを二本鎖鋳型から除去する。これは、好適な二本鎖領域が現れて迅速な伸長が可能になるまで、ポリメラーゼの編集活性が３’−末端を元にトリミングする傾向にあるため、許容され得ないレベルのプライマーノイズ、または放出鎖の好ましくない自己プライミングのレベルの上昇をもたらし得る。さらに、ピロホスファターゼ蓄積は、リコンビナーゼの阻害およびポリメラーゼ合成反応の遅延をもたらす。

（シグナルの改善：ＲＰＡ反応の設計によるノイズ）
ＲＰＡは、高い感度および特異性を示す。しかしながら、標的をまったく含有しない試料は、多くの場合、プライマーにのみ由来する産物を生成させる。かかる現象は、他の方法では珍しいことではない。例えば、ＰＣＲ法では、最終的に非特異的産物、例えば、いわゆる「プライマー二量体」が生成される。ＲＰＡは、小さなアンプリコンがインキュベーション期間内で多数回の倍増を達成するのを可能にするサイクル制御がないため、いくぶん、かかるプライマー関連性アーティファクトがもたらされる傾向がある。反応産物の電気泳動により、シグナルとノイズの容易な分離が可能になる。しかしながら、簡単な非実験室用の診断用産物では、他のアプローチを採用しなければならない。従って、本発明者らは、かかる非ゲル診断試験を、充分な信号対ノイズで機能させるため、および検出を容易に行なうためのアプローチを開示する。本発明者らはまた、周囲温度で多くの日数保存し得る（非実験室での容易な使用のための必要条件）反応凍結乾燥物の組成物を開示する。

（ＲＰＡ系における信号対ノイズ比）
ＤＮＡ増幅系は、一般的に、真の標的から開始されないＤＮＡの増幅が起こり得るという事実に対処する。この「ノイズ」は、特に、見かけ上標的が少ない条件下では、許容される感度および増幅の評価方法に対して制限を与え得る。初期のＲＰＡ構成は、優れた感度を提供するが、本発明者らは、リコンビナーゼを主とする系の新規な特性により、特異性を改善するためのこれまで利用されていないアプローチ、および新規な産物検出スキームの開発に適合性となると考える。

ＰＣＲと同様に、ＲＰＡ増幅反応は、一般的に、所望の標的ＤＮＡに隣接する２つのオリゴヌクレオチドを組み合わせることにより確立される。ＰＣＲの場合のように、倍増事象が起こり、指数関数的なＤＮＡ増幅が確保され、約１５０〜４００ｂｐの断片について１０^１２倍もの多量の増幅が可能になる。

３０〜３５残基で、標準的な設計アルゴリズムに許容され得るプライマーを試験すると、大部分は、標的を高い感度および特異性で増幅する（図４１）。例えば、かかる「良好な」プライマーは、２〜３コピー／マイクロリットルの出発標的濃度から標的を成功裏に増幅し得、有意なレベルの正確なアンプリコンを生成させ得る。しかしながら、このコピー密度未満では、良好なプライマーでさえ、ノイズ（スミア、ラダー形成および／またはウェルの染色）を生じる傾向にあり、これは、すべての反応産物のゲル電気泳動によってアッセイされる（図４１を参照）。このような産物は、見かけ上、純粋にプライマー起源のものである（しかし、侠雑大腸菌ＤＮＡが存在することがあり、理論的には、高度に非効率的な偽アンプリコンを特定している可能性がある）。

場合によっては、標的ＤＮＡは、特に希少なものでないこともあり得、例えば、ヒト個体の限定的なＳＮＰプロフィールを調べることが所望され、適量の血液試料が容易に得られ得る場合である。他方、病原体用の一部の試験では、ほんの数コピーを実用上非常に有用であるように検出することが必要であり得、特に、この状況を、標的の完全な非存在と明白に識別することが必要であり得る。

コピー数が非常に低レベルか全く無い実験において生成されるノイズのレベルおよび性質を調べるための本発明者らの取り組み、ならびにプライマーの長さおよび組成を調べる他の実験により、いくつかの重要な観察が明らかとなった。本発明者らは、これらが、ＲＰＡを用いる理想的な高感度のよい携帯型診断系の開発を助長すると考える。

第１に、本発明者らは、およそ３０残基未満のオリゴヌクレオチドが、ＲＰＡにおいてあまり有効でなく、顕著に低「ノイズ性」となり、２５〜２６に縮小すると、可視性ノイズは全く生じないことを見出した（図４５および５２を参照）。それでも、より短いオリゴヌクレオチドは依然として、少なくとも、ハイブリダーゼーションに基づく伸長が可能であり（図５２を参照）、これらの（リコンビナーゼ媒介性）ＲＰＡ事象における「活性」は、おそらくゼロではなく、代わりに、縮小とともに徐々に減少する（図４５）。これにより、ある程度の活性／ノイズ調整が可能になる。

第２に、本発明者らは、５’伸長部のさらなる少数の残基以外は同一であるプライマーが、ノイズの程度の有意な多様性を示し（すべてが＞３０残基の場合であっても）、これは、最も５’側の塩基（１つまたは複数）の性質こそが、ノイズの機構および尤度において有意な役割を果たすことを示唆することに注目する（図４２、４５および４７を参照）。

第３に、ロックされた核酸（ＬＮＡ）糖を最も３’側の末端に有するプライマーは、ゲル電気泳動によって測定される場合のノイズを低減／排除する。また、これは、「標準的な」ポリメラーゼ濃度で、一方のみを用いた場合では産物の量をわずかに低下させ、両方を用いた場合では有意に低下させるが、ポリメラーゼ濃度を増加させる場合に充分に活性が維持されている。そして高ポリメラーゼ濃度下では、ノイズは依然として抑制されているようである。

最後に、低い標的濃度ノイズは、試料ＤＮＡではなくプライマーに、大部分が／単独に由来するようであり、従って、本発明者らはこのノイズを「プライマー体操」と称する。このことは、試料ＤＮＡがゼロに減少させる実験から明白である。従って、プライマー同士が相互作用し得る限定的な機構に着目し、それらプライマー自身の間にこの問題に対する解決策を見出すことが可能である。どのようにしてノイズが生じ得るのかは、以下のセクションに詳細に記載する。この解析の重要な結論は、核タンパク質フィラメント組換え／プライミング活性の低下が、真のアンプリコン生成よりもプライマーノイズ生成に対してより深刻に影響を及ぼし得ることである。

（プライマーノイズが生じ得る方法の解析）
ＰＣＲまたは従来のハイブリダーゼーションを伴う他の方法とは異なり、ＲＰＡが、活性な相同性検索複合体としてＡＴＰ加水分解を行なう伸長された核タンパク質フィラメントの形成に依存性であることは、オリゴヌクレオチド活性を決定するパラメータに対して、以前、インビトロ増幅反応では見られなかった様式で影響を及ぼし得る。本発明者らは、オリゴヌクレオチド活性の上記の３０残基未満での急速な低下が、組換え速度の低下を反映していること、そしてこれのことがおそらくは、別途、大腸菌ｒｅｃＡリコンビナーゼの場合のＡＴＰ加水分解の長さ依存性に関して行なった所見（ＢｉａｎｃｏＰＲおよびＷｅｉｎｓｔｏｃｋＧＭ）に対応することを、示す。特に、短い配列の長さおよび組成は、ＡＴＰ加水分解に影響することが示された。ほぼ３０残基以上は、最大ＡＴＰ加水分解（１モルのＤＮＡ結合ｒｅｃＡに対するＡＴＰのモル数）に必要とされ、この場合、ｒｅｃＡは、合成オリゴヌクレオチドに結合されており、より短い配列は、約１５残基まで、存在しなくなるまで加水分解速度の著しい低下を示す。本発明者らは、低増幅挙動の観察結果を、ＡＴＰ加水分解に関する以前のデータと関連させた。なぜなら、核タンパク質組換え活性がＡＴＰ加水分解速度によって影響されると考える明白な論理的根拠があるためである。ある意味では、本発明者らが観察した最低速度のオリゴヌクレオチドは、非加水分解性ＡＴＰ−γ−Ｓと結合されたものであって、交換終了（分解されたらせん接合の形成）の速度がほぼゼロのものである（ＲｉｄｄｌｅｓＰＷおよびＬｅｈｍａｎＩＲ）。本発明者らはまた、ＡＴＰ−γ−ＳがＲＰＡ反応を有効に害すること（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇｅｔａｌ．）を証明した。本発明者らは、核タンパク質フィラメントにおける高速のＡＴＰ加水分解は「高速」プライマーの活性を支持し、低速のＡＴＰ加水分解は「低速」プライマーの活性を支持する。これらは、主に、単位時間内に完了する完全な組換え事象の平均数を異にする。単純に解釈すると、ＡＴＰ−加水分解は、フィラメントの動的活性に必要とされる。３０残基未満のオリゴヌクレオチドは、より安定な、非動的となり、最終的に、ＡＴＰ−γ−Ｓを用いた場合に生じるロックされた状態になり、交換を完了できなくなる（「低速」オリゴヌクレオチドは、配列を容易に位置づけ得るが、容易に分解されて完了およびポリメラーゼ接近を可能にすることができない）。

（真の産物およびノイズに関する核タンパク質フィラメント活性への依存性の生じ得る差）
なぜ低活性な「低速」オリゴヌクレオチドを選択することに何らかの利点があり得るのかを理解するため、本発明者らは、どのようにしてプライマー「体操」ノイズが生じ得るのかを探究することが必要である。短縮したオリゴヌクレオチドはノイズを、特異的シグナルよりも高速で低減し得るのか？真の標的およびノイズ産物の両方で見られる増幅のうちの幾何級数的フェーズとは異なり、出発プライマー由来のノイズ性標的の初期形成フェーズは、おそらくより複雑であり、おそらくかなり低速である。図４３に、本発明者らは、個々のプライマーが幾何級数的な増幅能力を有する構造に変換された状態となり得る２つの一般的な機構を詳細に示した。図示したどちらのストラテジーも、単一のプライマー種由来のアンプリコンの形成を示す。どちらの場合も、第１の工程は、３’−末端での短いヘアピンの形成によるオリゴヌクレオチドの自己プライミングを伴なう。ストラテジー１では、生じるヘアピンは、有意なミスマッチのため、幾何級数的増加（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ）フェーズにおいて容易に増幅しない。幾何級数的増加フェーズのアンプリコンになる代わりに、これらは、ストラテジー２に記載するものとより類似した工程により進行する必要があり得る。この場合、第１の自己プライミング事象の後、元のオリゴヌクレオチドの５’末端に対する逆相補体が関与する第２のものが続く。かかるモデル作製からいくつかの簡単な見解がある。第１は、２つ型の事象が起こらなければならないことであり、オリゴヌクレオチドの３’末端からの伸長がなければならず、次いで、第２の同様の３’ヘアピンおよび伸長がなければならず、これは、元のオリゴの５’末端に対する逆相補体が関与する。幾何級数的フェーズを進行する第１の事象の非常に希少で不安定な性質は、大部分のオリゴが、ＳＳＢまたはリコンビナーゼ（これらは、ｓｓＤＮＡに結合したときＤＮＡ融解活性を有する）のいずれかで被覆された場合、最も強く阻害されることになることに注意されたい。逆に、自発的に分解する動的なリコンビナーゼフィラメントは、オリゴヌクレオチドの全部または一部が被覆されていない時間枠を作りだす。従って、この非常に稀な限定的工程は、プライマーＡＴＰ加水分解速度に対して、動態性に対して、および外挿によるオリゴヌクレオチド長に対して、感度がよいものであり得る。従って、オリゴヌクレオチドを短縮することは、特に有効でノイズを抑制し得、真の標的増幅速度の低速化を正当化してその増幅速度の低速化を達成するためのするのに充分である。

このような最終の幾何級数的増幅フェーズのアンプリコンは、逆の反復配列である。これは、一方から生じる侵入／伸長が、自身において直ちに折り返して長いヘアピンを形成する鎖を置換することを意味する。この分子は、親と類似のものに変換し戻されるために、リコンビナーゼ作用によって標的化されなければならないが、真の標的は、溶液ハイブリダーゼーションをさらに使用し得る。これは、リコンビナーゼに基づく侵入の際に、プライマーのアーティファクトが、幾何級数的な増幅を達成することをさらに必要とし、その結果、これらは、おそらく、組換え速度のさらなる低下によって急速に抑制される。さらに、内部反復配列の存在は、さらに長く、より多様な型のこのようなアンプリコンが急速に生じ得ることを意味し、これは、ゲルのほぼ上端まで泳動するスミアまたはラダーの共通の表現型と一致する。

第３の見解は、指数関数的増幅中にＤＮＡの所与の種が倍増するのに要する時間が、組換え速度とポリメラーゼによる鋳型のダウン合成に要する時間との組合せであることである。プライマーノイズ産物（少なくとも初期に）は非常に小さいため、ＤＮＡ合成に要する時間は非常に短く、そのため、主な速度制限は組換え速度であり得る。従って、核タンパク質組換え速度の減少とともに一般的な増幅の遅延は、長いものより短いアンプリコンにより深刻に影響を及ぼし、従って、一般的に、真のアンプリコンに好都合である。

本発明者らは、上記の観察を利用し、異なる長さ、組成および濃度のプライマーを組み合わせる方法を考案し、高度に感度のよい特異的な反応を得る。

（一次オリゴヌクレオチド設計：）
上記の４つの観察は、ある程度、直接的なオリゴ設計原理に有用である。

（オリゴヌクレオチド長）
最適なプライマー長は、およそ３０残基であり得、場合によっては、数残基短いものが優れた信号対ノイズ比をもたらす。平均プライマー長を短くするとノイズ生成が減少し、２６〜２８量体を用いると、完全に非存在となるようである（図４５）。標的の増幅もまた減少するが、本発明者らは、ノイズは、シグナルよりも急速に減少するのではないかと考える。どのようにしてノイズが生じ得るかの以前の解析では、本発明者らは、なぜ、プライマーノイズが正しいアンプリコンよりも、組換え速度の減少によって影響され得るかには、いくつかの理由があると結論づけている。

（最も５’側配列の最適化）
最も５’側残基の伸長部以外は、同一の配列を有するオリゴヌクレオチドの活性を比較することにより、本発明者らは、オリゴヌクレオチドノイズの程度の有意な多様性が観察されることに注目した（図４２、４５、４７を参照）。可能性の１つは、これが、純粋に、上記のように、核タンパク質活性に対する長さの多様性の効果を反映していることである。しかしながら、これは、比較対象のプライマーがすべて３０残基以上である場合での唯一の理由であり得る。例えば、図４２では、オリゴヌクレオチドＮＥＳＴ−１およびＪｌは、Ｊｌがいくつかのさらなる５’残基を含有する以外は同一である。よりノイズ性，であるどころか、このオリゴヌクレオチドはノイズ性が低いが、非常に良好に増幅する。この場合などに基づき、本発明者らは、２つの他の同様の機構を提案する。第１には、オリゴヌクレオチドを指数関数的に増幅可能にすることは、最も５’側配列の逆相補的な鎖によるプライミング事象を必要とし得、この事象は、不可欠に、５’末端の塩基の正確な配列に依存する。これは、最も５’側塩基の変化がノイズ生成の有意な多様性をもたらし得ることを意味する。第２に、オリゴヌクレオチドが３０塩基より大きい場合であっても、５’配列の塩基組成でさえ、プライマーの組換え活性に影響を及ぼし得る。これを補助する証拠は、伸長鎖ホモポリマーからなる５’タグをプライマーに添加すると、その結果が観察される実験に由来する。図４７は、１回のランのＣ残基またはＧ残基がオリゴヌクレオチドＪｌおよびＫ２に付加され、続いて、すべての生じ得る修飾オリゴヌクレオチドおよび非修飾オリゴヌクレオチドを、単独または生じ得る組合せで含有する増幅反応が確立された実験を示す。驚くべきことに、既に、非常に感受性で特異的であると決定されているこのようなオリゴヌクレオチドは、このような特定の伸長鎖ホモポリマーを添加することによって改善されなかった。代わりに、１回のランのシトシンを５’末端に添加すると、これは、単独でインキュベートした場合、非特異的産物の産生の増加をもたらすが、グアノシンの伸長鎖は逆の効果を有し、単独で放置すると、オリゴヌクレオチドが非常に静的となることが観察された。また、元の親の非修飾オリゴヌクレオチドの組合せとは別に、見かけ上、成功裏に正しい産物を生成する唯一の対合は、２つのシトシンテイルオリゴヌクレオチド（すなわち、最もノイズ性のオリゴヌクレオチド）の組合せであった。このような観察を正当化し得る説明の１つは、５’末端のシトシンの伸長鎖が、結果として生じる核タンパク質フィラメントをより活性にするが、グアノシンはあまりそうしないことである。まとめると、長さなどのオリゴヌクレオチド組成は、速度挙動に影響を及ぼし得、さらなる無関係の配列５’末端は、この点において有意な影響を有し得る。最適なプライマーは、５’配列設計に対する合理的なアプローチにより見い出され得る。いくつかの異なる最も５’側塩基も試行され得、最良の選択が使用され得る。さらに、タグがその配列が標的に無関連である５’末端に配置され得ることがあり得るが、逆相補鎖からのヘアピンプライミングのスナップバックに対する抵抗性を付与する。多くのオリゴヌクレオチドに作用する最適な配列の決定が可能であり得る。反応成分の存在下でオリゴヌクレオチドのＡＴＰ加水分解速度の測定もまた、最適プライマー対の設計において有用であること証明し得、すべてが同一の増幅速度挙動を共有するプライマーミックスの作製可能にし得る。長さなどの、このような観察結果および改善は、これらが、リコンビナーゼ誘発性増幅系の特異的特徴および根本的な生化学に依存するため、他の系では明白ではないだろう。

（ロックされた核酸、リボース、または他の糖修飾）
ロックされた核酸（ＬＮＡ）は、連鎖がリボースの糖環の２’および４’炭素が遺伝子操作されたヌクレオチドである。かかる糖を、最も特別にはまさに３’位置に含有するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲアッセイ成功裏に使用されており、正しい３’塩基対合の識別を有意に改善することが示されている（ＶｅｓｔｅｒＢ．ａｎｄＷｅｎｇｅｌＪ．を参照）。本発明者らは、ＬＮＡ残基は、オリゴヌクレオチド内の多すぎる位置に存在しないならば、ＲＰＡ系により耐容性であり得ると予測した。これらは、ＰＣＲ増幅の特異性を増加させることが知られているため、ＲＰＡ系におけるシグナル−ノイズを良好に改善し得る。

最も３’側の位置にホスホロチオレート連鎖を用いた以前の実験では、ＲＰＡにおいて機能を適正に証明することができず、顕著によりノイズ性であった（データ示さず）。本発明者らは、これを、糖−リン酸塩主鎖と相互作用するｕｖｓＸおよびｇｐ３２の両方が、このような主鎖に結合し得ず、深刻に異常な反応挙動をもたらしたことの反映と解釈した。しかしながら、ｇｐ３２結合は、ＲＮＡおよびＤＮＡに結合するその能力によって示されるように、糖にあまり依存性でない（改変された低協同性を有するにもかかわらず）（ＫｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉＳＣｅｔａｌ．）。従って、本発明者らは、正常なリン酸塩基を保持しているＬＮＡ糖はｇｐ３２との機能性を維持し得ると予測した。

本発明者らは、ロックされた核酸糖を最も３’側の位置に有するオリゴヌクレオチドを増幅反応に用いる実験を行なった。糖修飾を有するが有しない同一のオリゴヌクレオチドを有する反応物と、１つの修飾オリゴヌクレオチドおよび１つの非修飾オリゴヌクレオチドを伴なう反応物間の比較を行なった。実験に基づくと、一方または両方のオリゴヌクレオチドがロックされた核酸残基を３’位置に有する場合、ＲＰＡは、ＤＮＡを増幅し得るようである。注目すべきことには、３’末端のＬＮＡヌクレオチドの存在は、「標準的な」ポリメラーゼ濃度下で産物蓄積を有意に低下させ、見かけ上、関連するノイズを排除した。非常に低いノイズおよび産物の低減は、成功裏の組換え頻度の低下、ポリメラーゼ離脱の低減、またはその組合せのために生じ得る。どのような理由であれ、この所見に基づくと、ロックされた核酸を一方または両方のプライマーに使用することがノイズを有意に低減または排除するが、真の産物の許容され得る増幅速度が維持されることは、合理的である。本発明者らは、ポリメラーゼ濃度を数倍（約３０〜４０ｎｇ／μｌから１５０ｎｇ／μｌに）増加させると、産物レベルが高いレベルに戻り得るが、ノイズレベルは等速度では上昇しないことを見出した。

同様に、他の糖修飾された残基は、ある程度の頻度でオリゴヌクレオチド中にで存在する場合、改善された信号対ノイズ挙動を示し得る。例えば、リボース、２’−Ｏ−メチル修飾、非環式糖、あるいは他のものが有用であることが示され得る。

（核タンパク質フィラメントを差次的活性と組み合わせることにより信号対ノイズを改善するアプローチ）
プライマーからの組換えおよび／または伸長の速度を、それらの長さ、塩基組成および分布および修飾糖（あるいは他の主鎖修飾）の使用に基づいて制御するできることは、最適信号対ノイズ特性により増幅反応により設計する機構を示す。本発明者らが想定している好都合に使用されるオリゴヌクレオチド組合せストラテジーには、２つの一般的な方法がある。第１は、単一のチューブネスティングが起こるストラテジーであり、第２のものは、より従来型のオリゴヌクレオチドと、真のアンプリコンが容易に形成されるが、ノイズ性アンプリコンは単一のオリゴヌクレオチドしか伴なわないように対合形成された非ノイズ性オリゴヌクレオチドを用いるものである。

（単一チューブネスティング）
ネスティングは、第１の増幅をアウタープライマー対を用いて行ない、次いで、第２の増幅をインナープライマー対を用いて行なうことにより、改善された感度および信号対ノイズが可能となるプロセスである。その最もよく見られる状況では、このアプローチは、ＰＣＲ法との組合せで使用されている。主に、第１のラウンドでは、標的がランダムＤＮＡより効率的に増幅され、その結果、第１の増幅後、バックグラウンドに対して明白なアンプリコンが得られるには均一性が不充分であっても、なお、比較的非常に高含有状態であるため、第１のものに対して内部であるプライマーによる第２の増幅では、非常に明瞭な結果が容易にもたらされる。実際には、これは、通常、１つの増幅の実施、次いで、小部分を新たなチューブへの取り出し、および内部「ネステッド」プライマーによる第２の増幅の実施に依存する。

ネスティングの概念は、別途において見られるが、本発明者らの結果は、関与するプライマーすべてを単一の反応で合わせる魅力的な代替ネスティングアプローチを示す。論理的根拠は、インナーおよびアウターオリゴヌクレオチド対が組換えおよび／または伸長速度において差次的に活性であり、異なる濃度で存在することである。例えば、アウター対は高速組換え／伸長速度を有するように、インナー対は低速組換え／伸長速度を有するように構成され得る。また、アウター対は低濃度（だが、なお許容され得る活性には充分に高濃度）で存在させ得るが、インナー対は高濃度で存在させ得る。次いで、何が起こり得るか？単離において、インナー対は、ミスはないが、望ましい時間枠内で許容され得る増幅度が達成され得ないようなかなり低速で増幅され得る。対照的に、単離において、アウター対は、ある程度のプライマーノイズにもかかわらず、高速で増幅され得るが、消耗により、かなり低濃度で停止し得る。しかしながら、組合せると、これらの２つの挙動は、うまく潜在的に相補的であり得る。実際には、アウタープライマー対は、一般的に、高速で、３０残基長より大きく、３’末端が非修飾であり、おそらく、「高速性」を促進するさらなる５’残基を含有するものであり得る。インナープライマーは低速であり得、これは、おそらく、縮小すること、３’末端をＬＮＡなどで修飾すること、低速性配列を５’末端に付加することなどにより付与される。

（非ノイズ性／ノイズ性核タンパク質対）
本発明者らが得た実験データは、プライマー誘発性スミアまたはラダーの大部分は、一方のプライマー種のみに由来する配列を含有することを示す（図４６を参照）。真実ならば、この事実単独で、反応に使用した２種類のプライマーが産物に物理的に会合しているか否かを単に調べることにより、シグナルをノイズと識別する簡単なアプローチが示される。従って、本発明者らは、これが、非常に静的なオリゴヌクレオチドを高速の（よりノイズ性）オリゴヌクレオチドと組み合わせることによりさらに改善され得ることを示す。静的なオリゴヌクレオチド、例えば、短いオリゴヌクレオチドは、よりノイズ性のものとともに存在している場合、依然として効率的に機能し得る（ハイブリダーゼーション反応において機能し得るものとする）（図５２を参照）。しかしながら、これらが、単に、その反応速度論がリコンビナーゼ促進型ノイズ増幅と非常に異なる正常なハイブリダーゼーションにより増幅に関与しているだけの場合、ノイズには関与しない状態で維持され得、より高速なオリゴヌクレオチド単独が関与する。

（第３のプライマーおよび検出プロトコル）
プライマーが上記の体操単独に主として関わる可能性は、増幅が効率的に起こったか否かを調べるためのを簡単なアプローチを示す。簡単な非ゲル検出形式の１つは、一方が色素もしくは酵素または他の容易に検出可能な基で標識されたオリゴヌクレオチド、および他方が固定化可能な基、例えば、ビオチンで標識されたものを用いるものであり得る。（図５Ｏパート１を参照）。従って、主反応の反応期の前、その間、またはその後に、固定化可能なオリゴヌクレオチドを表面に固定化させ得、反応の最後に、この表面を適切なバッファーで洗浄し得る。他方の標識されたプライマーが固定化可能なプライマーと同時会合した場合（これは、容易に測定され得る）、産物の増幅が起こっている。

これ以上に、本発明者らは、真の産物増幅に対するさらなるレベルのストリンジェンシーがもたらされ得るさらなる方法を想像する。簡単なさらなるアプローチは、表面上に液相アンプリコンを捕捉する機能を果たす「第３の」プライマーを伴なう。このプライマーでは、静的なもの（例えば、上記のような短いオリゴ）に遺伝子操作されること、または反応の反応後期でのみ系に添加されることのいずれかによってノイズの発生が抑制され得る。この第３のプライマーは、新規な内部配列を標的化し得るが、標的を、別途記載の「バックファイヤー」合成により固定し、崩壊性分枝の移動を回避し得ない（図５０、パート２および３）。

（ＲＰＡ反応物の凍結乾燥）
非実験室用または患者の近くでの診断用および法医学的試験を構成するため、周囲安定性試薬を提供することが必要である。明白な方法の１つは、これを、反応物を凍結乾燥することにより達成することであり、試料ＤＮＡ、あるいは、独立して安定であり、試料とともに添加され得る任意の他の成分（例えば、試料核酸を溶解するために使用されるバッファー）のみが除外される。

凍結乾燥は、充分確立された方法であるが、反応系のすべての成分が成功裏に同じ条件下で同時に凍結乾燥および再構成される保証はない。本発明者らは、ＲＰＡ反応物を種々の最終反応成分により、またはなしで凍結乾燥することを試みた。図５３は、本発明者らが成功裏に、試料ＤＮＡおよび一部のバッファー成分以外のすべてを含有するＲＰＡ反応物（これは、周囲温度で安定に保存され得、試料ＤＮＡの再構成に使用され得る）の凍結乾燥をなし得たことを示す。これらの実験において、二糖の糖トレハロースは、凍結乾燥物安定化させ、少なくとも１０日間、室温での保存を可能にするために必要であることがわかる。

（ＲＰＡ反応のリアルタイム反応速度論解析）
ＤＮＡ増幅反応の反応速度論解析を行なうことが可能なことは、同様の反応の単に末端−点解析と比べ、非常に大きな実用性を提供する。１つには、これは、試料中に存在するＤＮＡまたはＲＮＡのコピー数の測定を可能にし、研究、医療、および環境試験での適用に多くの用途を有する。直接的な定量適用に加え、動的反応産物検出は、他の問題に対する優れた解決策、例えば、改変され蓄積反応速度論によって一ヌクレオチド多型性対立遺伝子の識別を可能になることなど、および非ゲル系形式標的の有無を評価する機構をもたらす。

ＲＰＡは、熱サイクリングを不要とすることにより特異的ＤＮＡ標的を増幅するＰＣＲの優れた代替法を提供する。ＲＰＡでは、必要とされる機器はあまり高価でなく、非実験室設備で行なうことがより簡単になる。

現在、ＤＮＡ蓄積のリアルタイム解析は、ＰＣＲとの組合せで、もっとも広く使用されている。ＰＣＲは、産物検出閾値に達した後、数回のサイクルまでＤＮＡの指数関数的増幅を示し、種々の蛍光系センサーが使用される場合は比較的廉価な光学機器を用いて行ない得る。従って、所与の試料が検出可能性閾値を超えるサイクル数を、対照試料の同等の結果との組合せで評価することは、身元不明の試料中に存在するコピー数の値決定を可能にする。いくつかのセンサーアプローチが報告されており、多くが現在、使用されている。蛍光副溝結合色素が使用され得、これは、いったんＤＮＡに結合すると、強い蛍光を発する。かかる色素の例としては、ＳＹＢＲ金およびＳＹＢＲ緑（Ｗｉｔｔｗｅｒｅｔａｌ．［１］）が挙げられる。さらなる他のアプローチが成功裏に実施されており、これらは、標的特異性の付加から、さらに大きい感度および特異性を可能にする（特に、初期試料試料、低標的レベルで）感知までに至る。簡単な形式の一例は、各々、フルオロフォアで標識された、アンプリコンの隣接する内部配列認識する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。標的が存在する場合、２つのフルオロフォアは、互いに接近して位置した状態になり、蛍光蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こり、これは、好適な励起および発光フィルターにより検出され得る（Ｗｉｔｔｗｅｒｅｔａｌ．１９９７［２］）。他の好ましい系では、プローブが、フルオロフォアおよび消光剤の存在と組み合わせて用いられる。一部の方法では、標的アンプリコンへのハイブリダイゼーションは、ヘアピン会合フルオロフォアおよび消光剤の分離を引き起こし、従って、蛍光を増加させる。別の方法では、プローブのハイブリダイゼーションは、５’−３’エキソヌクレアーゼを有する接近しているポリメラーゼの作用により評価され、これは、プローブを攻撃し、フルオロフォアと消光剤の永続的な分離をもたらす（いわゆる「Ｔａｑｍａｎ」プローブ）［ＨｅｉｄＣＡ，ＳｔｅｖｅｎｓＪ，ＬｉｖａｋＫＪ，ＷｉｌｌｉａｍｓＰＭ．，ＲｅａｌｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ．ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．（１９９６）６：９８６−９４］。これらのアプローチなどの実施は広く文書化されている。

ＰＣＲ反応中、いくつかの異なる一時的に独立した反応期が確認され得る。すべてのＤＮＡは、すべてのＤＮＡ鎖を融解するのに使用される高温（例えば、９４℃）で単鎖である。続いて、増幅プライマーは、第２の低温、例えば、５０〜６５℃でアニーリングされ得る。最後に、主に二本鎖産物が生成するプライマーの伸長が、典型的には７０〜７５℃で行なわれる。ＰＣＲの制御されたサイクル性により、サイクル中の特定の異なる点でＤＮＡの蓄積レベルを評価することが所望および必要とされる。これは、合成段階の最後で行なわれ得る。あるいはまた、用いるアプローチに応じて、別の時点で別の（第４の）温度で蛍光を測定することが望ましい場合もある。

ＰＣＲとは異なり、ＲＰＡ反応は、主に、単一の温度で作業を行なうように構成される。ＲＰＡの現行の構成は、反応期がなく、従って、試料中には、完結した種々の反応「段階」が同時に存在する（フェーズ決定は、理論的には、例えば、ＡＴＰの制御された脱ケージ化などのアプローチによって得られ得る）。このように任意の所与の瞬間にフェーズ決定がない結果として、二本鎖ＤＮＡ、単鎖ＤＮＡ（例えば、被置換鎖およびオリゴヌクレオチドなど）、ならびに不均一な性質の中間体（例えば、三重らせん中間体および／または相同性検索複合体）の混合物が生じやすい。反応混合物の不均一性にもかかわらず、一般的な場合、定常状態レベルの二本鎖ＤＮＡ、あるいは単鎖ＤＮＡは、反応中、産物が蓄積されるにつれて増加する。これに基づくと、産物蓄積の測定に対する直接的なアプローチが容易に使用され得ることは、合理的なようである。

ここで、本発明者らは、ＲＰＡと適合性で、蓄積される反応産物リアルタイム検出を可能にするＳＹＢＲ緑およびＳＹＢＲ金色素の量を記載する。また、これは、配列特異的モニタリングプロトコルがＲＰＡと適合性である場合である。かかるアプローチとしては、２つの蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの使用（これらは、ハイブリダイゼーションすると、蛍光蛍光共鳴エネルギー移動を行なう）または二重標識プローブの使用（例えば、ハイブリダイゼーションがＦＲＥＴの改変をもたらすまで、もしくは関連するヌクレアーゼ活性によって分離されるまで消光されているもの）が挙げられ得る。本発明者らは、ある種のポリメラーゼのいわゆる５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に依存する「Ｔａｑｍａｎ」アプローチは、このようなヌクレアーゼが、実際には、ＲＰＡ反応を阻害する構造特異的ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼであるため、ＲＰＡ反応に使用され得ない証拠を提供する。さらにまた、プローブの天然ヘアピン形成特性が不可欠であるある種のアプローチ（例えば、分子ビーコン）は、プローブが、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質およびリコンビナーゼの存在下で融解状態である可能性のため、ＲＰＡにおいてはあまり成功裏ではない。

図５４は、ＳＹＢＲ金およびＳＹＢＲ緑染色がＲＰＡと適合性であるか否かを調べるための実験の結果を示す。ＳＹＢＲ金を用いた初期の実験は、ＳＹＢＲ金色素の種々の希釈物を供給ストック（ＤＭＳＯ中、分子プローブから１０，０００×ストックで示す）から作製し、ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子座の断片を増幅するプライマーを用いて行なった（図１Ａ、Ｂ）。反応は、最終濃度が１×（ストックから１：１０，０００）または０．４×（ストックから１：２５，０００）の場合、明白に阻害されるが、０．２×（ストックから１：５０，０００）では有意に観察されなかった。この０．２×の濃度を、次いで、同じ２つのヒト特異的プライマー確立した５０マイクロリットル反応物の希釈列において最大濃度として、全ヒトゲノムＤＮＡの２つの（低）標的濃度（２または２０コピー／マイクロリットル出発コピー密度）で使用した（図５４Ｃ）。マスターミックスを氷上で合成し、アリコートを、氷温まで冷却した９６−ウェルマイクロプレートのウェル内に入れた。いったん混合したら、本発明者らは、プレートを、ステージを３７℃に設定した蛍光マイクロプレートリーダーに移した。リーダーは、４８５ｎｍでの励起、５２８ｎｍでの発光、１分間隔で１時間にわたって蛍光の読みが収集されるように設定した。同じ実験において、ＳＹＢＲ緑色素は、同じ程度（Ｄ）に希釈し、同様の試料において同時にアッセイした。この実験で、ＳＹＢＲ金またはＳＹＢＲ緑を用いたリアルタイムＲＰＡ反応の構成に関連するいくつかの重要な要素が明らかになった。第１に、ＳＹＢＲ金内での検出時間の直接比較する実験は、見かけ上、１：５０，０００倍希釈物でさえ、高希釈物と比べて反応を遅延させることを示す。実際、１：１００，０００または１：８０，０００では、有意により高速の反応反応速度論が得られ、従って、先の末端−点解析で許容され得ると思われた１：５０，０００よりも良好な量のＳＹＢＲ金が使用されるようであり得る。しかしながら、最大希釈物で得られた相対最大の蛍光シグナルは、低希釈物よりも有意に小さく、これは、色素が限定的になることを示す。また、ＳＹＢＲ金の最大希釈でさえ、バックグラウンドを超えて蛍光を増加させ、ＳＹＢＲ緑実験における試料よりも後に検出され、すべてのＳＹＢＲ金濃度での全体的な蛍光シグナルはＳＹＢＲ緑の場合よりもずっと小さかった。対照的に、ＳＹＢＲ緑試料は、すべての場合で、ＳＹＢＲ金実験の場合よりも早期に検出された。結論として、本発明者らは、両方の色素がリアルタイムＲＰＡにおいて使用され得るが、ＳＹＢＲ緑のほうが、標準的な解析よりロバストなようであることを示す。１：５０，０００〜１：１００，０００の最終希釈物で良好に機能を果たすようであるが、さらに濃縮した試料（１：５０，０００）では、全体的により高い蛍光およびより長い検出可能な指数関数的反応期が得られ、これは、１：５０，０００希釈がこれらの実験において最良であることを示す。また、本発明者らは、より高いＳＹＢＲ緑濃度で成功裏にアッセイしたが、最終的に阻害が起こり得るという一部の示唆が見られた。本発明者らは、１：５０，０００〜１：２５，０００は、動的リアルタイムＲＰＡアッセイに最適ＳＹＢＲ緑濃度であることを示す。

図５５は、系の、異なるコピー数のＤＮＡ標的（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡ中に存在）間での識別能力を測定する２つの実験の一例を示す。５００，０００、５０，０００、５，０００、５００、５０または０コピーのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＤＮＡの鋳型分子の開始数を種々の試料中に存在させ、増幅を、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＳｐｏＯＢ遺伝子座特異的プライマーＢｓＪｌおよびＢｓＫ２を用いて行なった。多くの独立した実験において、系は、図５６に示す代表的な実験と同様のプロフィールを、成功裏にもたらした。指数関数的反応期曲線間の間隔は、定量的な系に必要とされる１０倍コピー数希釈物間で同様であることに注意されたい。本発明者らは、ＲＰＡは、出発鋳型数の大きさの少なくとも４次数にわたって定量的であると結論付けるが、より大きな範囲にわたる定量的結果も生じ得る。第２のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ漸増実験（図５５Ｃ）において、最大標的濃度の漸減は意外に早期であることに注意されたい。後の実験は、これが、ほぼ倍レベルを用いた後の実験（図５６）と比べ、比較的低レベルのｇｐ３２およびｕｖｓＸがこれらの実験において使用された結果として、散発的に生じ得ることを示す。

本発明者らはまた、ＳＹＢＲ緑ＲＰＡ系が、いくつかのヒトＤＮＡ希釈物を増幅することにより、ある範囲のヒトＤＮＡの出発鋳型コピーをモニターする能力を同様に調べた。図５７は、かかる解析の結果を示す。予測されたとおり、データは予測されたプロフィールフィットし、これは、ＲＰＡが定量的な様式での挙動を示し、ＳＹＢＲ緑で容易にアッセイされ得ることを示す。同様の追跡効果が、最大標的試料で観察されたが、後の実験で修正された（このとき、より高量のｇｐ３２およびｕｖｓＸを使用した）（図５７ＣとＢを参照、末端−点産物レベル全体で付随物が増加する）。

本発明者らは、蛍光色素を用い、ＲＰＡ反応の反応速度論をモニターすることが可能であること、およびこれは、さらに試料中の特異的標的の量を示すために使用され得ることを示す。最も簡単な解釈は、二本鎖ＤＮＡが、ＳＹＢＲ緑蛍光の検出限界を超える質量点まで、ＲＰＡ反応において指数関数的様式で蓄積されることである。しかしながら、ＳＹＢＲ緑ＲＰＡ反応の蛍光プロフィールがさらなる活性を反映していることはあり得る。例えば、ＲＰＡ産物は、一部の環境下で、他の産物との組換え反応に関与し、そのＳＹＢＲ緑結合挙動が充分理解されていない複合体中間体もたらし得る。また、産物蓄積の反応速度論プロフィールは、出発コピー数と部分的にのみ関連する反応熟成現象の結果として改変され得る。これは、これらの早期実験の一部において最大コピー数試料で観察される偽早期蛍光追跡の基礎となり得るが、ｕｖｓＸおよびｇｐ３２レベルを増加させた後の実験では、この現象は回避された。

本発明者らは、いくつかの場合において、水分制御により、同様の時間枠内で試料の最低濃度（典型的には、１コピー／マイクロリットル開始密度またはそれ未満）に対してリンス処理が開始されるようであるが、水分制御産物の蓄積の反応速度論は、標的含有試料（より低速の倍増時間を示すより浅い指数関数的反応期を有する）とは異なるようであること観察した。この観察は、おそらく、アンプリコンが有するＲＰＡ系における合成速度を低下させる構造的特性（例えば、内部反復配列）によるものである。本発明者らは、前に、プライマー誘発性アンプリコンが、多くの場合、１回の二本鎖倍増に、真の標的アンプリコンに充分であり得る１ラウンドではなく、２ラウンドの侵入／合成を必要とし得る逆の反復配列構造を含有する傾向があり得る可能性に関して述べた。この現象の起源とは無関係に、本発明者らは、高性能のデータ解析ソフトウエアおよび好適な実験内部対照により、このノイズが特定され、真の標的増幅の反応速度論挙動と識別され得ると推測する。さらにまた、本発明者らは、異なるアンプリコン間で、検出に達するのに要した時間内、および曲線の傾きにおいていくつかの異なる多様性を観察した。これは、異なるプライマーの活性の多様性、および異なるアンプリコンの種々の長さおよび配列組成は、平均倍増時間がアンプリコン間で異なり得ることを示すため、予測され得る。この基準単独による蛍光プロフィールの傾きは、異なる型のアンプリコン間で異なり得、これは、解析に有用に使用され得る。

ここで行なった実験は、ＲＰＡ反応反応速度論は、試料中の標的ＤＮＡの存在を評価するのに要する時間を、後のゲル電気泳動と比べて減少させるために使用され得ることを示す。本発明者らがここで用いた実験設備は、使用した９６ウェルプレートは厚手のプラスチック製であり、蛍光光度計上の加熱したプレートは、試料ウェルと直接接触していないため、理想とは程遠い。本発明者らは、５０μｌ容量反応がこの条件下の温度に達するのに５分間までを要し、おそらく１００μｌ容量では、８分間と推測する。最適化されたデバイスでは、このような長いラグ時間は存在し得ない。従って、本発明者らは、臨床的に重要な量のヒトＤＮＡ（例えば、１０００〜３０００コピー、約３ｎｇ〜９ｎｇ）の増幅は、容易にほぼ３０分間以内に、適切な設備により、ここに示した典型的な条件を用いて評価され得ると推測する。９６ウェルプレートおよび従来の蛍光光度計を用いるこのような実験の制限にもかかわらず、このようなパイロット実験は非常に有望であり、ＲＰＡ反応の反応速度論のモニタリングが定量を追跡可能なアプローチをもたらすこと、およびこの定量が、ＤＮＡレベルを少なくとも５次数の大きさにわたって評価するために実用的に行なわれ得ることを示す。

（ＡＴＰ濃度に媒介されるＲＰＡ反応制御）
ＲＰＡは、多目的な方法であるが、反応においてリコンビナーゼが活性な場合に、正確に制御する特徴を組込むことによって改善され得る。かかる制御は、ケージ化ＡＴＰの光分解によるＡＴＰの周期的な解放によって得られ得る。あるいはまた、ＡＴＰまたは他のヌクレオシド三リン酸の反応濃度を、反復的な手動添加または生化学的オシレータの使用によって周期的に調節し得る。

ケージ化ＡＴＰは、ＤＮＡ結合および大腸菌ｒｅｃＡタンパク質のリコンビナーゼ機能いずも補助することができない［ＢｕｔｌｅｒＢＣ，ＨａｎｃｈｅｔｔＲＨ，ＲａｆａｉｌｏｖＨ，ＭａｃＤｏｎａｌｄＧ（２００２）ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＣｈａｎｇｅｓＩｎｄｕｃｅｄＢｙＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＢｉｎｄｉｎｇｔｏＲｅｃＡＵｓｉｎｇＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅＦＴＩＲ．ＢｉｏｐｈｙｓＪ８２（４）：２１９８−２２１０］。しかしながら、光分解後、解放されたＡＴＰは、リコンビナーゼ機能を可能にする。これまで研究されたすべての原核生物のリコンビナーゼは、一次配列相同性および構造的相同性を有するｒｅｃＡタンパク質の直接ホモログである。またさらに、研究されたすべてのｒｅｃＡホモログ（真核生物のホモログを含む）は、リコンビナーゼ機能を可能にするためにＡＴＰへの結合を必要とする。本発明者らは、従って、同様の現象が、Ｔ４ｕｖｓＸおよび他のリコンビナーゼによって相応に媒介されると予測する。

リコンビナーゼ作用の調節におけるヌクレオチドの役割は、比較的充分文書化されている。原核生物のリコンビナーゼ、例えば、大腸菌ｒｅｃＡおよびＴ４ファージｕｖｓＸの場合、リコンビナーゼは、ＡＴＰをＡＤＰに加水分解する（ｕｖｓＸの場合はＡＭＰ）。加水分解は、リコンビナーゼがＤＮＡに結合している限り、高活性で起こっている。ＡＤＰ結合状態は、ＤＮＡに対する親和性がより低く、一般的に、ＤＮＡからのフィラメント分解（および改変され核タンパク質フィラメントピッチ）と関連する。典型的なインビトロ条件下では、ＡＴＰは、ＡＤＰに対して過剰で比較的高濃度に維持され、核タンパク質フィラメントにおけるＡＴＰへのＡＤＰの迅速な交換による早期分解の抑制が確保される。従って、反応中のリコンビナーゼは、ＡＴＰ：ＡＤＰ比に応答し、ＡＤＰ濃度がＡＴＰ濃度を超える場合、ある程度、核タンパク質フィラメントの正味分解が起こる。

ＲＰＡ反応は、リコンビナーゼが合成単鎖オリゴヌクレオチド上に負荷され、相同性検索活性を行なう作用に依存する。リコンビナーゼの記載の活性は、ヌクレオシド三リン酸（最も明白にはＡＴＰ）の存在に依存性である。リコンビナーゼがＤＮＡ結合状態のとき、これらは、ヌクレオシド三リン酸を高速で加水分解し、例えば、Ｔ４ｕｖｓＸタンパク質は、タンパク質１分子あたり３７℃で、１分間に２００分子のＡＴＰを単鎖ＤＮＡ上で加水分解することが知られている（しかし、より短いオリゴヌクレオチドでの速度はより多様性であり得る）。従って、特に、オリゴヌクレオチドがほぼマイクロモル濃度で存在する場合、大部分のオリゴヌクレオチドがリコンビナーゼフィラメントと会合する活性な組換え反応を維持するためのＡＴＰの大量供給の必要性がある。

典型的なＲＰＡ反応中で起こり得る反応ヌクレオチドレベルの不安定性が考慮される。一対のオリゴヌクレオチドを使用し、各々１μＭ反応の濃度でオリゴヌクレオチドは３５残基長である場合、リコンビナーゼで１０％飽和のオリゴヌクレオチドでは、結合リコンビナーゼ濃度はほぼ２．８μＭである（３〜５％ＰＥＧ化合物中１０％飽和の値は、本発明者らの実験の結果とほぼ一致するが、わずかに、高いか低いこともあり得る）。これは、公表された加水分解速度に基づくと、毎分、ＡＴＰの０．５６ｍＭ溶液を同等量のＡＤＰに変換し得る。従って、反応を開始するのにＡＴＰの３ｍＭ溶液を使用し、ＡＴＰ再生系が存在しない場合、わずか３分間後に、ＡＤＰ濃度がＡＴＰと等しいレベルに上昇し得、リコンビナーゼは不活性となり得る。

本発明者らは、０．６μＭの全オリゴヌクレオチド濃度、およびほぼ３μＭのｕｖｓＸ濃度を常套的に使用した。このｕｖｓＸのすべてがオリゴヌクレオチドに結合するならば、ＡＴＰのほぼ０．６ｍＭ溶液は３分間で消費され、オリゴヌクレオチドに対して反応速度２００モル量／分が得られる。しかしながら、本発明者らのデータ（限定的な加水分解データ）に基づくと、単鎖ＤＮＡに対するｕｖｓＸ分子の完全な結合が、本発明者らの典型的なＲＰＡ条件下で達成されることはありそうにない。しかしながら、形式的には、１モノマーあたりの加水分解速度が、本発明者らが用いたオリゴヌクレオチド長さで低くなることはあり得る。このような代替例は、場合によっては、本発明者らが、再生系の存在なしで、標的ＤＮＡを臭化エチジウム染色レベルによって検出可能なレベルまで増幅できたという事実によって示される。他の実験では、このレベルの増幅を達成するのにほぼ３０分間を要することが示され、演繹により、本発明者らは、最大のわずか０．１５ｍＭＡＴＰは、おそらく、各３分の期間（レベルの４分の１）で消費されたと計算する。

反応におけるｕｖｓＹ有効濃度の解析は、予測される化学量論と一致する。本発明者らは、ｕｖｓＸタンパク質と比べて等モル濃度のほぼ半分のｕｖｓＹをを常套的に使用した。公表したデータは、ｕｖｓＹタンパク質は、おそらく、６量体としての機能を果たすことを示す。これがそうであり、１つの６量体が負荷に必要とされ、各負荷フィラメントを安定化させるとすれば、１個のオリゴヌクレオチド（３０〜３５量体）につき、ほぼ１２〜１４個のｕｖｓＸ分子の必要性があり得るが、オリゴヌクレオチド１個あたり６個のｕｖｓＹ分子が必要であり得、すなわち、ほぼ半分のモル濃度である。この実験的に測定された最適が、ｕｖｓＸに対して等モル濃度の半分のｕｖｓＹが必要とされるという理論的推測を充分満足させる。

まとめると、０．６μＭオリゴヌクレオチド、３μＭｕｖｓＸおよび１〜３μＭｕｖｓＹを用いる典型的なｕｖｓＸ−補助ＲＰＡ反応におけるＡＤＰへのＡＴＰの変換は、約５０μＭ／分であり、それ以上ではない。反応中、１分間にｕｖｓＸ分子あたり、ほぼ１６分子のＡＴＰが加水分解される。この数字は、すべてのｕｖｓＸ分子がｓｓＤＮＡに結合してＡＴＰを２００分子／ｕｖｓＸ／分で加水分解すると予測した場合より６倍すくなく、おそらく、ほんの一部の割合のｕｖｓＸが任意の一時点で結合していること、加水分解速度が短いオリゴヌクレオチドで低いこと、および／または再生のない反応物において、ＡＤＰレベルが上昇すると、加水分解速度有意に低下することのいずれかを反映している。本発明者らは、最後の要素が最終的に重要となり得るが、大部分の反応において、これは、主要な要素ではないことを示す。

典型的なＲＰＡ反応におけるＡＴＰの消費速度を実験的に推測したが、ここで、ＡＴＰ濃度のどのサイズのパルスが、リコンビナーゼ活性の好適なバーストを刺激するために使用する必要があり得るかの推定が依然として残る。これを行なうため、本発明者らは、特定のリコンビナーゼのＫｍをある程度推定する必要がある。

ｒｅｃＡによるＡＴＰ加水分解のＫｍは、２０μＭであると報告されている。従って、活性促進されるには、リコンビナーゼ系に解放される必要がある遊離ＡＴＰは比較的少ない。これがまたｕｖｓＸ、についても真であると仮定すると、反応濃度をゼロから５０ΜｍＭまで変化させるＡＴＰのパルスは、ＡＤＰレベルが１：１比まで蓄積される時間まで、相同性検索充分に補助し得る。標準条件下では、これはほぼ３０秒間であり得、最終的に、２５μＭＡＤＰおよび２５μＭＡＴＰをもたらし得る。リコンビナーゼ活性の３０秒間のバーストは、１ラウンドの侵入が起こるのに必要とされるものよりも長いものであり得る。ＡＴＰのさらなるパルスは、リコンビナーゼ活性のさらなるバーストを容易にもたらし得る。例えば、５０μＭ上昇のさらなるパルスは、２５μＭＡＤＰと比べ、ＡＴＰレベルを７５μＭに上昇させ得る。３０秒後、ＡＴＰレベルは５０μＭＡＴＰおよび５０μＭＡＤＰに平衡化し、反応は、再度、停止する。さらなるパルスは、ＡＴＰを１００μＭに、およびＡＤＰを５０μＭに上昇させ、３０秒後、さらに各々７５μＭで平衡化される。従って、過剰ＡＴＰの３０秒間のバーストが、５０μＭバースト中に解放され、リコンビナーゼ活性のバーストを補助し得る。もちろん、ＡＤＰおよびＡＴＰの絶対濃度全体を変化させることは、反応挙動に影響を及ぼすことがあり得、調整が必要となり、おそらく、わずかに、ＡＴＰより大量のパルスが各ラウンドでの解放に必要であり得る。それでも、３ｍＭのケージ化ＡＴＰの出発濃度（本発明者らの先の実験で使用したものと同様）および５０μＭのパルスでは、６０の独立したパルスを補助することが可能であるのは明白である。ＡＤＰ濃度の全体的な増加を担うためにバーストサイズを進行的に増加させる必要があったとしても、３０サイクルで対応できることがかなり起こり得る。さらにまた、ＡＤＰは反応物から、ＡＤＰ代謝酵素を反応物中に含めることによって除去され得る。これは、ＡＤＰの加水分解、あるいはまた、ＡＴＰへのＡＤＰの再生および一定の供給源ＡＴＰ活性代替消費（例えば、ＮＡＤＨ生成など）を含み得る。

ケージ化ＡＴＰは、容易に市場で入手可能であり、最近、脱ケージ化を誘発するのに使用され得る廉価な低出力デバイスが入手可能となっている。光発光ダイオード（ＬＥＤ）の進歩は、波長３６５ｎｍの光を生成させるための小さな廉価な低出力供給源の開発をもたらした。本発明者らは、かかるデバイスを、携帯型で電池式の低出力加熱セルに組み込むことを想定している。あるいはまた、短期間のリコンビナーゼ活性が、小容量のさらなるＡＴＰの添加を単に反復することにより、またはオシレータ系（例えば、ホスホフルクトキナーゼオシレータなど）を用いることにより生成され得る。

（非対称なプライマーの使用によって媒介されるＲＦＡ反応制御）
一方向ＲＰＡ反応は、単一のプライマー標的部位から誘発され得る。対向プライマーの非存在下では、かかる反応では単鎖ＤＮＡが生成される。本発明者らは、３’ロックされた核酸（ＬＮＡ）［ＤｉＧｉｕｓｔｏＤＡ，ＫｉｎｇＧＣ（２００４）ＳｔｒｏｎｇｐｏｓｉｓｉｏｎａｌｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆＬＮＡｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｗｉｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｎｄｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇａｓｓａｙｓ．ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ３２（３）：ｅ３２］ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、特定のポリメラーゼ、例えば、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓポリメラーゼＩによるリコンビナーゼ媒介性伸長のプライマーとしての機能を果たし得ないが、他のポリメラーゼ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉクレノウ断片プライマーとしての機能を果たすことを見出し、これは、かかる３’ＬＮＡキャッププライマーが、標的単鎖ＤＮＡにハイブリダイズすると、ポリメラーゼ伸長反応においてプライマーとしての機能を果たし得ることを示す以前のデータと一致する。本発明者らはまた、すべてのポリメラーゼが組換え中間体から開始できるわけではないようであり、おそらく、一部のポリメラーゼでは、単鎖ＤＮＡのより長い伸長鎖が、プライマーと結合していることが必要とされることを反映していることを見出した。例えば、本発明者らは、φ−２９ポリメラーゼは、組換え中間体からの合成を開始できないことを見出した。しかしながら、また、本発明者らは、これが、３’ＬＮＡキャッププライマーから合成され得る証拠を有する。最後に、公表された報告と一致して、本発明者らは、所与のリコンビナーゼでは、リコンビナーゼ補助鎖交換が効率的に起こるのに必要とされる最小のプライマー長があることを見出した。具体的には、２７〜３０塩基対より短いオリゴヌクレオチドは、ｕｖｓＸには不充分な基質である。それでも、２０〜２７ヌクレオチド程度の短いプライマーは、ハイブリダイゼーション媒介性プライミングを補助するのに完全に充分であり得る。従って、長いプライマーと短い方のプライマーを組合せることにより、一方プライマーは侵入誘発性伸長に、他方はハイブリダイゼーション誘発性伸長に使用されるように、ＲＰＡ反応を偏向させることができる。

総合すると、このような事実は、反応が、合成が一方から開始され、これが通過した場合にのみ、第２の部位が反対の合成を開始するような様式で合成され得る、さまざまな構成を示唆する。例えば、ＲＰＡ反応は、一方のプライマーが通常のオリゴヌクレオチドであり、対向プライマーが３’ＬＮＡキャップオリゴヌクレオチドであるように構成され得る。同じ反応に、３’ＬＮＡキャップオリゴヌクレオチドを使用し得ないが、侵入構造から作用するポリメラーゼを、３’ＬＮＡキャップオリゴヌクレオチドを使用し得るが、ハイブリダイゼーション構造のみから作用するものと混合する。リコンビナーゼ媒介性侵入および通常のプライマーからの伸長により、単鎖ＤＮＡ分子が生成され、次いで、これは、３’ＬＮＡキャップ対向プライマーがその標的部位とハイブリダイズすると、第２のポリメラーゼによる合成の鋳型としての機能を果たし得る。あるいはまた、ハイブリダイゼーションにおいてのみ機能を果たす短い第２のプライマーは、非対称なプライマー使用を確実にすることもあり得る。オリゴヌクレオチドの長さおよび性質の他の構成も、種々のポリメラーゼとともに、所望の効果をもたらすために使用され得る。従って、非対称なプライマーの使用は、複製フォーク衝突による任意の妨害を解決するはずである。しかしながら、通常のプライマーからの合成により置換された単鎖ＤＮＡの再侵入を回避するため、リコンビナーゼ活性を制御することもまた、必要であり得る。

非対称なプライマーの組合せおよびＡＴＰレベルの制御は、長い（＞１０ｋｂ）ＤＮＡを増幅するのに充分な条件を提供し得る。長いＤＮＡの増幅効率に影響を及ぼし得る他の要因の１つは、他の鋳型ＤＮＡ、他の非鋳型ＤＮＡ、およびＲＰＡ反応そのものの産物、例えば、被置換単鎖ＤＮＡによる妨害である。リコンビナーゼが置換された単鎖ＤＮＡと会合し、鋳型ＤＮＡにおける侵入反応を媒介し得る可能性に加え、単鎖ＤＮＡと試料由来の他の非鋳型ＤＮＡが、標的鋳型ＤＮＡにより不適切にハイブリダイズし、効率的な複製を妨げ得る可能性もある。このような問題を一部回避するため、少なくとも最初の数ラウンドの複製で、空間的に鋳型ＤＮＡを固定し、他の長いＤＮＡとの会合を抑制することが有用であり得る。これを達成する簡便な手段の一例は、ＲＰＡ反応物を、平均孔径を、小さなＲＰＡ成分（例えば、酵素およびプライマーなど）の自由な移動が許容されるが、長いＤＮＡの自由な移動は許容されないように調整したゲルマトリックス（例えば、ポリアクリルアミドゲル）中で合成することである。低い出発濃度の試料ＤＮＡは、物理的に分離されており、互いに会合することができないが、小さいＲＰＡ成分は、比較的自由に鋳型分子会合する状態である。Ｃｈｕｒｃｈおよびその協働者らは、ポリアクリルアミドゲルをこのようにしてＰＣＲおよび協働に使用して、空間的に分子されたアンプリコン（２次元に分離可能であり、ポリメラーゼコロニーまたはポロニーとして知られる）をもたらすことを報告している［ＭｉｔｒａＲ，ＣｈｕｒｃｈＧ（１９９９）ＩｎｓｉｔｕｌｏｃａｌｉｚｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔａｃｔｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍａｎｙｉｎｄｉｖｉｄｕａｌＤＮＡｍｏｌｅｃｉｌｅｓ．ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ２７（２４）：ｅ３４ｉ−ｖｉ］。典型的には、ポロニーは、異なる鋳型からアンプリコンをイメージングするために使用され、そのため、顕微鏡スライド上で作製される。しかしながら、長いＤＮＡの増幅では、個々のポロニーを分離し、従って、反応物が任意の適切な容器内で合成され得ることが必要であり得る。

ポロニーアッセイ自体は、ＰＣＲではなくＲＰＡの使用から恩恵を被り得る。ＰＣＲの使用には少なくとも２つの問題がある。第１は、ポロニーは、通常、顕微鏡スライド上で作製され、ガラスは不充分な熱伝導体であるため、ＰＣＲに必要とされる時間は、通常のバルク反応期ＰＣＲよりも有意に長くなり得る。これは、増幅産物の拡散が、かなり大きなポロニーサイズ、高密度ハイスループットアッセイとの不適合性をもたらすことを意味する。第２に、ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡの熱融解を必要とするため、９０℃を超える温度が伸長期間に必要とされる。このような高い温度は拡散速度を増大させ、平均ポロニーサイズをさらに増大させる。低い一定の温度を伴なうＲＰＡは、このような問題の両方を解決する。

（多型性状態の所与のアンプリコンの同定を可能にするためのＲＰＡ動的な組換え環境の使用）
規定の核酸配列の有無は、試料核酸と以前に性質が測定されている核酸プローブとでハイブリッドを形成させた後、かかる相互作用を検出する適切な方法を行なうことにより測定され得ることは、広く実証されている。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の主鎖オリゴヌクレオチドが空間的に分離され、支持体に固定化されているマイクロアレイは、広く使用されている。次いで、試料中の相同配列の有無が、適切なバッファーおよび固定化されとプローブと試料核酸間でのハイブリッド形成を可能にする温度条件下で、試料を共インキュベートすることにより測定される。この場合、試料およびプローブは、ともに、ハイブリダイズできるように完全または部分的に融解状態で提供される。標識が試料中に組み込まれている場合は、続いて、相互作用が定量され得る。

配列特異的ハイブリッドを形成させる代替アプローチが報告されており、この場合、関与する核酸の一方は、最初は二本鎖であり、三重鎖タンパク質含有ハイブリッドが、リコンビナーゼ酵素、例えば、大腸菌ｒｅｃＡの作用によって、非加水分解性ヌクレオシド三リン酸アナログの存在下で形成される（米国特許第５，４６０，９４１号および米国特許第５，２２３，４１４号を参照）。また、リコンビナーゼを用いるが、四重鎖構造を形成させることにより無タンパク質組換え中間体を安定化させることを追求する代替法が報告されている（米国特許第５，２７３，８８１号を参照）。しかしながら、このようなアプローチは、方法および結果（以下にさらに詳述）の両方において、本明細書に記載のものとは異なる。

多くの場合、ハイブリッド形成のプロセスは、標的の存在と非存在が識別され、さらに、完全にマッチしているか否かを調べるのに充分な忠実度である。例えば、短いプライマー（例えば、７〜１８ヌクレオチド長）は、ハイブリダーゼーション条件をストリンジェントに制御すると、完全な相補鎖と不完全な相補鎖を識別し得る。しかしながら、核酸が長く、完全なハイブリッドと不完全なハイブリッド間に少しだけ多様性がある場合（例えば、１００以上の領域に数ヌクレオチド）、かかる改変体と完全なマッチ間でハイブリダーゼーション効率に充分に大きな差が存在することは起こりにくい。

本発明は、増幅反応産物と、規定の位置（個々の位置の各々はを示す純粋な集団の断片を含有し、既知の反復長さの１つが集団内に存在する）に存在させた予め合成および固定化したプローブ核酸とでハイブリッドを形成させることによる試料核酸の多型性状態の測定に関する。

組換えポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）法によって増幅されるＤＮＡ配列は、以下の理由により、かかるハイブリッド−形成系アッセイの理想的な標的である。第１に、ＲＰＡ法を、例えば、増幅プライマーの比率を変えることにより、ほどんど二本鎖ＤＮＡ産物、またはほとんど単鎖ＤＮＡ産物が生成させるように構成することが可能である。第２に、ＲＰＡ反応物は、二本鎖ＤＮＡを熱的に融解する必要なく、最初は二本鎖のＤＮＡと単鎖ＤＮＡ間のハイブリッドの会合を、可能にするのに必要な成分すべてを含有する。従って、さらなる試料の取り扱いは、ほとんど必要とされない。

リコンビナーゼ、およびリコンビナーゼの継続的な存在を伴なう不十分に規定されていない「三重らせん」中間体の状態の関連する相補的核酸のハイブリッドを安定化させるＡＴＰの非加水分解性アナログ、例えば、ＡＴＰ−γ−Ｓの使用を用いる他の方法が報告されている。しかしながら、かかるアプローチは、このような高度に安定な構造は動的でなく、他の因子による接近に対する反応産物の有意な抵抗性を提示するため、本明細書に記載の状況では機能しない。結果として、リコンビナーゼの非加水分解性ＡＴＰアナログとの使用は、有意な程度のミスマッチ含むＤＮＡ間の極めて安定なハイブリッドの形成をもたらし、従って、配列間の効率的な識別が許容されない。対照的に、本明細書に記載のアプローチでは、ＡＴＰまたは他の加水分解性アナログを利用する動的な系を用い、この場合、ハイブリッドは容易に不安定化され、かつ生成される。正味の結果は、完全な相補鎖の相互作用の大幅な富化である。

好ましい実施形態では、ＲＰＡ反応またはその付随物の終了後、反応混合物をプローブ分子のアレイに、各増幅された多型性ＤＮＡが第１の場合において全く同じか相補的な配列を含有する正確な固定化プローブ核酸に配置されるように接触させる。この初期のハイブリッド形成反応が充分な効率または忠実度で起こらなければ（非常に類似した配列の場合にそうあり得る）、リコンビナーゼ誘発性反応の動的な性質により、ミスマッチが解消されるはずである。これは、不完全なハイブリッドがバブルおよび非二本鎖特性を含有するためであり、これは、完全なマッチと比べ、このようなハイブリッド上へのリコンビナーゼの再負荷を助長し、ハイブリッド崩壊速度の増加を引き起こす機能を果たす。新たな二本鎖形成事象の発生が許容され、完全なハイブリッドが形成された場合のみ、これらは、さらなる反応に対して比較的に抵抗性となる。実際には、ＳＴＲ反復単位の可能な数すべてが反復の順に整列されると、最後には、正確なマッチでピークとなり、直接隣接部では弱くなり、さらに遠くでは非存在となるハイブリッドの形成の勾配がもたらされ得る。ミスマッチバブルのサイズが増大するた、リコンビナーゼが単鎖バブル領域上に負荷される傾向が進行的に大きくなる（図５８および５９）。

さらに、動的なリコンビナーゼ系が、完全なハイブリッドと不完全なハイブリッドを識別するのに充分に特異的でない場合、さらなるハイブリッド崩壊性成分を反応中に含め得る。かかる因子としては、限定されないが、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、ポリメラーゼ、および他のＤＮＡ結合因子が挙げられる。特定の形態のＤＮＡまたは構造を選択的に標的化し、ミスマッチまたはバブルと相互作用し、分解するが、完全なハイブリッドには作用しない種々のヘリカーゼおよびヌクレアーゼを存在させる。例えば、大腸菌ＰｒｉＡヘリカーゼは、単鎖ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡに隣接して露出した領域と相互作用し、これは、ＳＴＲハイブリダーゼーションにおいて起こり得る反復数のミスマッチにおいて起こり得、続いて、ＤＮＡを３’→５’方向に巻き戻す作用を行ない得る。かかる不安定化により、リコンビナーゼのこのような分離され鎖上への再負荷を許容し、代わりに新たな代替ハイブリッドの形成が許容され得る。経時的に、かかる機構では、正確な標的とプローブ間のみのハイブリッドを富化させ得る。同様に、大腸菌、ＤｎａＢの複製ヘリカーゼは単鎖ＤＮＡ上に負荷され、ＰｒｉＡとは反対に、二本鎖ＤＮＡを５’−３’方向に巻き戻す。バクテリオファージＴ４のｄｄａヘリカーゼは単鎖ＤＮＡ上に負荷される。ｄｄａヘリカーゼは、非常に強力なため、その経路において他のＤＮＡ結合タンパク質を置換し得る。ｄｄａヘリカーゼは、非常に高度に親和性のストレプトアビジン−ビオチン相互作用を崩壊させることが示されており（ビオチンがオリゴヌクレオチドの３’末端にある場合）、従って、ｄｄａヘリカーゼは、表面上の固定化されたプローブ複合体不安定化させるために使用され得る（ＢｙｒｄａｎｄＲａｎｅｙ，２００４）（ＭｏｒｒｉｓａｎｄＲａｎｅｙ，１９９９）。

あるいはまた、大腸菌ＲｕｖＡおよびＲｕｖＢ遺伝子産物は、二本鎖ＤＮＡを包囲し、ＤＮＡに沿って分枝点を誘発し得るヘリカーゼを形成する。このようにして、バブルは、鋳型の末端に「押し込まれ」、充分な不安定化を引き起こし、リコンビナーゼ負荷ならびに他の事象を可能にし得る。二本鎖特性の不完全性を標的化し得るヌクレアーゼとしては、例えば、ミスマッチまたはバブルで二本鎖ＤＮＡにニック形成し得るＳｌヌクレアーゼが挙げられ得る。構造特異的特性を有する他のかかるヌクレアーゼがある。かかるニックは、鎖置換ポリメラーゼ伸長を開始させる機能を果たし得る。あるいはまた、ヌクレアーゼがプローブＤＮＡを切断する場合、経時的に、後に生じるシグナル完全なハイブリッドが形成された時点でのみ残存するような、固定化部位から解放される化学基または酵素性基を有することが可能である。

従って、必要な成分組み合わせることにより、完全なハイブリッドが有意に支配的であり、不完全な部位が枯渇されるか、または検出不可能となる環境を作り出すことが可能であるはずである。このアプローチに重要なことは、完全なハイブリッドおよび不完全なハイブリッドの安定性が、異なる多型性特徴を有する反応産物の感度のよい識別を可能にするように、ハイブリッドが形成および崩壊され得る動的環境の確立である。この環境は、記載のようなｇｐ３２、ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、ＰＥＧ化合物およびＡＴＰ再生系を含む動的／安定なリコンビナーゼ系によって理想的に提供される。

生産的なハイブリッドの有無または固定化部位からの標識の減少（例えば、上記のヌクレアーゼアプローチを参照）は、標準的な方法によって測定され得る。これらとしては、ＤＮＡ標的またはＤＮＡプローブ上に固定化された酵素の基質を用いた末端点における反応物のインキュベーションが挙げられる。他の検出アプローチも可能であり、別途広く報告されている。

（分子的手法における広範な使用のための動的な持続性のリコンビナーゼ環境）
本発明者らは、低い一定の温度で核酸の大規模に幾何級数的な増幅を可能にすることを念頭に、動的なリコンビナーゼ活性に完璧な環境の確立に取り組んだ。しかしながら、確立された環境は、他の酵素との組合せで明白に使用され得、または実際にはそれらなしで、さまざまな状況において、一般的に古典的なハイブリダイゼーション反応と置き換え得る。例えば、分子的クローニング手順は、大きなトラクトのＤＮＡを互いに、熱融解よりもずっとより有効に組換え、アニーリングする可能性を利用したものであり得る。また、インビトロ分子的プロセスに使用され得る多くの他の酵素は、大部分の中等温度好性の酵素と適合性の低温環境の恩恵を被り得る。かかる酵素としては、ポリメラーゼに加え、らせん変形（ゆがみ）認識ヌクレアーゼ（例えば、Ｓｌヌクレアーゼ）、ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、塩基修飾または除去酵素、リアーゼ、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼ、逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ活性、リゾルベース、ＲＮＡポリメラーゼ、および核酸に作用するか、または、これらと相互作用する任意の他の酵素が挙げられ得る。これらはまた、インビトロ系に適当なＤＮＡ代謝酵素に加え、検出プロトコルに使用される他の酵素、例えば、アルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼを伴ない得る。安定で動的な組換え系特有の特性と他の触媒活性の組合せにより、潜在的に非常に多数の新たな方法および適用が可能になる。

完全に低温動的な酵素性ハイブリダイゼーション系を他の酵素系と組み合わせることの重要な影響の認識に加え、本発明者らは、ＲＰＡを用いた実験に基づき、短いオリゴヌクレオチドプライマーを用いる高度に活性な組換えの合成に最適な配列知識を確立した。本発明者らは、非常に活性なプライマーが、特にピリミジン高含有分布によってキャラクタライズされたことに注目した。グアノシン残基は、対照的に、本発明者らが解析した最も活性なオリゴヌクレオチドにおいて不十分に提示されるようであり、先の結果では、オリゴヌクレオチドの５’末端に付加されると、これらは、その活性が低下することが示された。

本開示では、本発明者らは、オリゴヌクレオチドの５’末端へのＤＮＡ配列の付加の影響を試験する反応の動的なモニタリングの実験結果を報告する。それ以外は同一であるオリゴヌクレオチドのまさに５’伸長部への配列の付加は、ＲＰＡにおけるその活性に対して有意な効果を有する。本発明者らは、これらの観察結果は、単鎖、あるいは二本鎖、ＤＮＡ上のリコンビナーゼの負荷挙動の反映と最良に解釈されることを示す。これらはまた、ｓｓＤＮＡ上でのリコンビナーゼの規定のフェーズ決定の制御に役割を有する。

出発点として、本発明者らは、反応速度論研究（非リアルタイム）および一般的な観察により、一部のプライマー対は、他よりも迅速なＤＮＡ増幅を媒介できることに着目した。具体的には、迅速なプライマーは、ヒトＳＴＲマーカーＣＳＦ１ＰＯと特定され、これは、ほぼ３０秒間の平均倍増を有するようであり（開始から検出可能な産物蓄積までの単位時間の平均倍増として概算した）、検出可能なレベルの産物を数千コピーの標的から初めて１５分間以内に生成できるようであった（図６７を参照）。他のプライマー対は、同様の結果を達成するのに、典型的には２０〜３５分間要した。本発明者らは、この多様性源を知るために追求した。（図６７を参照、データ示さず）。

ＣＳＦ１ＰＯプライマーのＤＮＡ配列の解析により、これらは、比較的ピリミジン高含有であり、また、グアノシンはかなり少ないことが明らかになった。この観察結果は、本発明者らが、シトシンまたはグアノシン残基の伸長鎖のオリゴヌクレオチドの５’末端へのどのような付加が、ＲＰＡにおけるそれらの挙動に影響するかを調べた先の実験から得られた一部のデータと相関した。図６８に、リアルタイム増幅実験を示す。Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子形成遺伝子座ＳｐＯＢ（ＪｌおよびＫ２という）に特異的なプライマーを用いてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡ由来の断片を増幅する。図６７に示す実験では、本発明者らは、グアノシンの伸長鎖が全体的に「静的」反応を有するが、付加されたシトシンの伸長鎖は、「ノイズ性」増幅反応を有することに注目した。本発明者らは、この実験を反復し、反応をリアルタイムでをモニターし、所見を図６８に示す。結果は、付加され塩基は、まさに最後に、速度挙動およびおそらくプライマーの活性に影響するという考えと一致した。すべての塩基がゲノム標的とマッチするプライマーＪｌおよびＫ２は、まず、ＳＹＢＲ緑色素で検出可能なこの実験で３０分間をやや過ぎて産物を生成する（より高速の反応速度論は、後の実験で観察され、従来のマイクロプレートリーダーを用いた場合、これらの実験において起こったような非最適温度傾斜により、多様性が起こったかもしれない）。標的ＤＮＡを有する試料、および有しない試料は、この実験において、産物蓄積の少しの遅延、および改変体蓄積反応速度論によって識別可能であった。さらなるシトシン残基付加されたプライマーＪｌ（Ｃ）およびＫ２（Ｃ）は、有意により高速なＤＮＡの明白に増幅可能であった。しかしながら、本発明者らは、（プライマー誘発性）アーティファクトの蓄積は、標的ＤＮＡの場合と同様の時間幅において発生し、非付加プライマーよりも顕著に不充分に分離されることに注目した。本発明者らは、Ｃテイルプライマーは、単純により高速のプライマーであると推測する（しかし、この場合「よりノイズ性」でもある）。逆に、Ｇ残基が付加されたプライマーの蓄積反応速度論は、非常に不充分であり、明白に特定可能な予測された最終産物は、９０分間のゲル電気泳動であっても観察されなかった。

本発明者らの結果に基づき、このような所見を公表された研究を合わせると、配列−組成は、プライマー上へのリコンビナーゼ−負荷に影響し得、ピリミジンがこの負荷プロセスを助長し得るとう推測に至る。公表された研究は、この範囲で対立している。一部の研究では、大腸菌組換えホットスポットにおいて高含有なＧおよびＴ残基に対して組換えプロセスよりもｒｅｃＡ結合が優先する場合が作製された（ＴｒａｃｙａｎｄＫｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ）。逆に、蛍光異方性を用いて行なわれたｒｅｃＡ負荷動力学特性の研究では、驚くほど異なる結論がもたらされた（Ｂａｒ−ＺｉｖａｎｄＬｉｂｃｈａｂｅｒ）。この場合、ｒｅｃＡ核生成に対する障壁（核タンパク質フィラメント形成の低速フェーズ）は、組成に対して非常に感度がよく、ピリミジンに対する強く好都合な偏向が示された。このような後者の観察は、本発明者らの観察結果とさらに一致し得る。実際、ＲＰＡがかなり短いオリゴヌクレオチドを用いる傾向になると、有効な増幅挙動をもたらすのに、リコンビナーゼ核生成事象がどれだけ重要であるかがよりわかりやすくなる。迅速な核生成が、許容され得るレベルのフィラメント負荷を可能にするのに非常に望ましいだけでなく、さらに、これが、フィラメントのまさに５’末端方向で優先的に起こることが重要である。５’末端が核生成に不充分な基質である場合、内部配列はかなり良好であるが、大部分のフィラメントは、部分的にのみ負荷され、そのため、ＲＰＡにおいて適正に機能しない可能性がある。かかる部分的に負荷されたフィラメントは、ＡＴＰを適正に加水分解する負荷が不充分であり得、鎖交換を効率的に受けることができず、フィラメントの活性なプールから有効に誘出され得ない。さらに悪いことには、これらは、ＤＮＡと相同性検索複合体を形成することにより「毒」反応となり得、正常な動的な挙動を受けることが不可能になり得（これらが、加水分解を促進するのに必要な長さに満たないな場合）、標的ＤＮＡを非生産的な複合体に拘束し得る、これは、ＡＴＰ−γ−Ｓを用いた場合に起こる。

ピリミジンは良好な核生成部位であるという考えと一致する本発明者らの初期の結果、およびこの単独で観察された多様性の説明となる魅力的な可能性にもかかわらず、本発明者らは、上記のアッセイはいずれも本発明者らが用いている実験系と真に等価でないことを指摘しなければならない。フィラメントの負荷、非負荷、加水分解挙動などはすべて、増幅状況において協調して関連し、多数の要素が役割を果たし得る。また、リコンビナーゼフェーズ決定は、プライマーの活性の決定において役割を果たし得ること、およびこれは、特定の位置での優先的な核生成（以前にｒｅｃＡについて報告された現象）によって確立されることがあり得る（Ｖｏｌｏｄｉｎｅｔａｌ．；ＶｏｌｏｄｉｎａｎｄＣａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ）。この場合、核生成は、５’末端で優先的に起こり得、フィラメント全体に対する拘束されたフェーズが確立され得、フィラメント長さは、最後のタンパク質を３’末端に最も望ましい負荷で配置するために完全な長さを有することが必要であり得る。上記のような増幅状況と関連するさらなる複雑性に加え、これらの先の研究はすべて、Ｔ４ＵｖｓＸタンパク質ではなく大腸菌ＲｅｃＡタンパク質を用いて行なわれ、これらのタンパク質は一次配列レベルにおいて有意に多様であるため、ＲｅｃＡ研究の結論全てをＵｖｓＸタンパク質に外挿することが可能でない場合がある。それでも、配列組成、特に５’配列組成の重要性を認識し、本発明者らは、まさに５’末端への付加にどの配列が最も有効であるかをさらに深く解析し始めた。すなわち、本発明者らは、この系におけるリコンビナーゼの理想化された「着陸部位」および／または一般的な増幅およびインビトロプロセスのための他の有益な特性と関連する部位の決定を追求した。またさらに、本発明者らは、リコンビナーゼのフェーズ決定が、活性全体に有意な役割を果たし得、これが、オリゴヌクレオチドの組成および正確な長さによって影響される予測した。

本発明者らは、より大きな主活性の刺激において、チミジン残基の伸長鎖、またはシトシンとチミン（ピリミジン）の混合物を付加することが、シトシン残基の伸長鎖と同程度に有効であり得るか否かを調べた。この解析の結果を図６９に示す。興味深いことに、１回の実行においてチミンをオリゴヌクレオチドのまさに５’末端に付加すると、この実験では、増幅速度挙動が改善されなかった。実際、むしろ反対に、プライマーをチミン付加と組み合わせることにより、この実験では、非常に不充分な増幅挙動がもたらされた。本発明者らはまた、付加された配列が、シトシンとチミンの混合物であるプライマーを表示のようにして試験した。種々の組合せでのこのようなプライマーの挙動は、かなり多様で複雑であった。例えば、本発明者らは、この産物の一貫している（が証明されていない）単鎖同等物のさらなるバンドの存在に注目した。注意深い解析は、異なる組合せで、この生じ得る単鎖バンドの移動挙動は、第１の型または第２の型のいずれかであること、およびこれは、用いるプライマーと相関することを示す。簡単には、本発明者らは、これらの反応において、ある１つまたは他のプライマーがより活性となり、反応において非対称性、および親の非付加オリゴヌクレオチドでは見られない単鎖ＤＮＡ蓄積の発現をもたらしたではないかと考える。この結果を合理的に説明することは困難であるが、本発明者らは、この実験では、より多くのシトシンが存在する場合は、より活性のようである若干の傾向にもかかわらず、チミンの伸長鎖は有効でなく、混合ポリマーもあまり有効でないと結論付け得る。

本発明者らの次の実験では、オリゴヌクレオチドの末端にまたさらに残基を付加し、それらの挙動をリアルタイム解析において比較した。この場合も、いったん、プライマー間に多様性が見られ、この実験では、対照として、各プライマーをそれ自身においてインキュベートしたことを含めた。興味深いことに、本発明者らは、ここで使用した非常に低濃度の標的（１コピー／マイクロリットル開始密度）で、単一のプライマーによって生じたノイズは、プライマー対を用いた場合に観察された産物ＤＮＡの蓄積と同様の時間枠内のようであることに注目した。さらにまた、これは、先に試験したオリゴヌクレオチドＫ２（Ｃ）で非常に明白であり、Ｊｌオリゴヌクレオチドと組合せた場合、非常に迅速な増幅を担う。これは、オリゴヌクレオチドを個々にそれらのノイズ生成速度についてモニターすることが、それらの活性全体の測定において有用であることを示唆する。最後に、不可解なことに、Ｋ２（Ｃ）よりもたった１塩基対短いオリゴヌクレオチドである図７０の一連のうちのオリゴヌクレオチド９は、この強力かつ迅速な増幅挙動を欠いていた。この研究で使用したオリゴヌクレオチドはＨＰＬＣ精製しなかったが、本発明者らは、それでも、大部分のオリゴヌクレオチドは完全長形態であると推測する（製造業者により提供されたゲルの写真に基づく）。そのまま受け止めると、この驚くべき観察結果は、５’末端のＣ残基の数（５から６に変化）が、このオリゴヌクレオチドの一部の構造的特徴の有意な変換点であることを反映していると解釈すべきか、または一部のフェーズ決定挙動のさらなる影響を反映していると解釈され得るかのいずれかである。この後者の場合、本発明者らは、５’配列がフェーズ決定および第１のＵｖｓＸモノマーの堆積に強く影響し、このフェーズ決定が３’末端までずっと維持されると推測する。おそらく、最も３’側のＵｖｓＸモノマーが完全にオリゴヌクレオチドの末端上に存在しているか否か、または各ＵｖｓＸモノマーがその最大の数の主鎖残基に結合するのを許容するにはわずかに多すぎるか少なすぎる塩基対が存在するか否かは、組換えの進行が効率的に終了する可能性に充分影響し得る。また、これは、３’末端から突出している数塩基の「スペア」がある場合、プライマーノイズの増強を充分助長し得るため、バックグラウンドに影響に影響し得る。

結論として、本発明者らは、ここに、ＲＰＡおよび他のリコンビナーゼ誘発性の方法における最良の性能を引き出すのに、オリゴヌクレオチドの長さおよび配列組成がいかに重要であり得るかを示した。さらに、本発明者らは、非標的配列が５’オリゴヌクレオチドの末端に付加してＲＰＡにおけるその活性を調節し得ることを正式に示す。

ＤＮＡ増幅に加え、リコンビナーゼ系（加水分解性ＡＴＰアナログを含む）およびこの状況においてＤＮＡ分子の高負荷を確保する成分が、他の記載のハイブリダイゼーションアプローチの代用として使用され得る。

（ＲＰＡ反応における混入物の制御）
ＲＰＡは非常に敏感な検出方法であるため、本発明者らは、他の超感受性の増幅プロトコル（例えば、ＰＣＲなど）で見られるキャリーオーバー混入物（莢雑物）の問題に直面した。本発明者らは、ここに、ｄＵＴＰが、ＲＰＡ反応において部分的または完全にｄＴＴＰの代用として使用され得、従って、先のＲＰＡ反応の産物を真の試料標的と識別する簡単な方法が提供されることを示す。ＲＰＡ反応物をそれらの開始時にｄＵＴＰ脱グリコシル化酵素を不活化する目的で熱処理すること（ＰＣＲプロトコルでは、混入物制御の場合に行なう）は望ましくないため、本発明者らは、脱グリコシル化酵素阻害剤を反応物と混合し、開始を可能にする代替アプローチを提案する（図６１および６２を参照）。

（逆転写ＲＰＡ）
特異的ＲＮＡ分子の存在の検出が所望される環境では、これを検出するためにＲＰＡ使用することが可能であるが、逆転写酵素活性を用いてＲＮＡが、まずＤＮＡ形態に変換される。最も簡便なのは、逆転写およびＲＰＡがすべての単一の均一な環境で行なわれる場合であろう。本発明者らは、逆転写ＲＰＡ反応（ＲＴ−ＲＰＡ）が単一のチューブ環境内で逆転写酵素を反応環境中に含め、他の若干の変形（ゆがみ）を伴なうことにより行なわれ得ることを示す（図６０を参照）。

（側方流動（ラテラルフロー）膜を用いた増幅反応の直接的な検出および評価）
ＲＰＡの特徴は、携帯型易利用性診断用一体型製品の構成が理想的に適合される。ある一連の場合、特異的ＤＮＡ増幅反応が起こったか否かの評価は、定量的解析の必要性が中程度にすぎない場合、２つの標識プライマーが物理的にアンプリコン内で会合しているか否かを評価する簡単な形式によって行なわれ得る。本発明者らは、ここに、この簡単な着想が、有効であり、特に、広く使用されている手法側方流動ストリップ系がこの役割を果たすのに理想的であることを示す。ＲＰＡ反応物は、このような系のための試料ランバッファーと直接混合し得、アンプリコンの存在を、数分以内で測定し得る（図６３を参照）。

（ＲＰＡとの生物学的試料の粗調製物の適合性）
本発明者らは、ここに、血液の単純なライセートが直接ＲＰＡ反応において使用され得ることを示す。これは、ＲＰＡ系を含む診断用産物の形式が、ＲＰＡ反応物への直接添加前で、試料の処理ほんのわずかしか必要し得ない可能性を提供する（図６４を参照）。

（安定で持続性の動的な組換え環境における蛍光プローブの挙動）
本発明者らは、ここに、ＲＰＡに使用される動的な組換え環境の存在により、ＰＣＲなどの他の手法における同等の環境と比べて、蛍光プローブの挙動を改変することを示す。最も特別には、フルオロフォアおよび消光剤を含有する二重標識プローブが使用され、オリゴヌクレオチド内で２つの基を分離している塩基の数はより少ないのがよく、おそらく、これは、飽和ＤＮＡ結合タンパク質が、遊離した溶液中でＢ型二本鎖ＤＮＡとオリゴヌクレオチド存在するランダムコイルの両方の状態に対してプローブに伸長するためである（図７３）。さらにまた、本発明者らは、かかるプローブとそれらの標的ＤＮＡとの二本鎖ハイブリッドを特異的にプロセッシングするために使用され得る重要な酵素を同定した。このようなアプローチは、リアルタイム「第３の」プローブストラテジーがＲＰＡに関して構成されるはずであるアプローチ、およびＰＣＲにおいて充分確立されたアプローチ、例えば、「Ｔａｑｍａｎ」アプローチ、分子ビーコンなどとどのように違うのかを教示する。特に、本発明者らは、「Ｔａｑｍａｎ」アプローチは、おそらく、大腸菌ＰｏｌＩなどの酵素と会合する５’ヌクレアーゼが、ＲＰＡ反応を抑制するＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ活性を有するため、ＲＰＡでは使用され得ないと決定した。

（参考文献）

本明細書に示したように、本発明者らは、リコンビナーゼ−誘発配列標的化を鎖置換合成と組み合わせたインビトロＤＮＡ増幅系を開発した。これにより、全体的な熱的、化学的または酵素的鋳型融解なしで、ＤＮＡ増幅が可能になる。反応は感度がよく、特異的で、試料ＤＮＡの前処理なしで３７℃で操作される。１０^１２倍もの増幅が１〜１．５時間以内に観察される。１０コピー未満の所与の標的ＤＮＡが、複雑な試料中において、簡単な一工程反応で検出され得る。この方法は、さまざまな適用のためのＰＣＲの理想的な代替法であり、非常に携帯しやすいＤＮＡ診断用系を可能にする。

本発明の好ましい実施形態を、より充分に示すために実施例を示す。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲の限定と解釈されるべきでない。

実施例１：リーディング鎖リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ｌｓＲＰＡ）の一例
ＤＮＡ配列は、図１に示すリコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）法に従うリーディング鎖合成を用いて増幅され得る。図１は、ＲｅｃＡ／プライマー負荷を示す。鋳型ＤＮＡおよび／またはポリメラーゼの添加前、ＲｅｃＡおよびＳＳＢは、単鎖オリゴヌクレオチドプライマーへの結合に関して競合する。ＲｅｃＲおよびＲｅｃＯの存在下では、ＲｅｃＡは、単鎖プライマー上に選択的に安定化され、ＲｅｃＯおよびＲｅｃＲとの複合体状態のＲｅｃＡ核タンパク質フィラメントを形成する。この複合体は、二本鎖ＤＮＡを侵入し、オリゴヌクレオチドプライマー相同な部位にＤループを形成する能力を有する。あるいはまた、ＲｅｃＡ、ＲｅｃＯおよびＲｅｃＲを、反応混合物へのＳＳＢの導入前に、オリゴヌクレオチドプライマー上に前負荷し得る。

以下は、大腸菌ｒｅｃＡおよび大腸菌ｒｅｃＯおよびｒｅｃＲの安定化因子により組立られるＲＰＡ反応物の生じ得る組成を詳細に示す：

反応物は、最終濃度がＤ−ループ形成／分解成分、ポリメラーゼ／ヘリカーゼ／リゾルベースミックス、およびＤＮＡポリメラーゼおよび／または必要であれば最後に添加される鋳型を有する反応バッファーを満足するように合成する。例えば、Ｄ−ループ形成／分解成分およびポリメラーゼ／ヘリカーゼ／リゾルベースミックスの２倍濃縮溶液を１倍反応バッファー中で作製してもよい。反応は、２つの成分の各々（１倍反応バッファー中）を等容量で混合することにより開始され得る。任意選択で、上記のように、ＤＮＡポリメラーゼまたは鋳型（標的ＤＮＡ）を最後に添加してもよい。反応物を、反応体がすべて消費されるまでの充分な時間インキュベートする。典型的なインキュベーション時間は、１時間、２時間、３時間、５時間、１０時間または一晩（約１６時間）の範囲であり得る。迅速な温度変化のため小容量を必要とするＰＣＲとは異なり、ＲＰＡの反応容量に対する制限はない。１つの容器において、２５μｌ、５０μｌ、１００μｌ、１ｍｌ、１０ｍｌおよび１００ｍｌまたはそれ以上の反応容量で行なわれ得る。インキュベーション温度は、典型的な実験室温度、例えば、２５℃、３０℃、または３７℃であり得る。

鋳型ＤＮＡおよび／またはポリメラーゼの添加前、リコンビナーゼおよびＳＳＢは、単鎖オリゴヌクレオチドプライマーに対する結合に関して競合する。ＲｅｃＲおよびＲｅｃＯの存在下では、ＲｅｃＡは、単鎖プライマー上で選択的に安定化され、ＲｅｃＯおよびＲｅｃＲとの複合体状態のＲｅｃＡ核タンパク質フィラメントを形成する。この複合体は競合して、二本鎖ＤＮＡを侵入し、オリゴヌクレオチドプライマーに相同な部位にＤループを形成する能力を有する。あるいはまた、ＲｅｃＡ、ＲｅｃＯおよびＲｅｃＲを、反応混合物へのＳＳＢの導入前に、オリゴヌクレオチドプライマー上に予め負荷し得る（図１）。

侵入鎖は、ポリメラーゼによって５’→３’方向に伸長される。Ｄループが形成されて合成が進行するにつれて、置換された単鎖ＤＮＡがＳＳＢで被覆された状態になる。二本鎖ＤＮＡからのＲｅｃＡ解放が、５’→３’方向にＡＴＰ加水分解により、またはヘリカーゼ／リゾルベース活性またはポリメラーゼ活性の結果として起こり得る（図２Ａ，Ｂ）。新たなラウンドの侵入／合成が連続的に起こる。第３のラウンドの鎖−侵入／合成は、その末端が２つの対向するプライマー部位に対応する、解放された個々の産物を解放する。このような断片は、すぐに主要反応産物となり、高レベルまで蓄積される。各合成複合体が鋳型の末端まで進行すると、ＲｅｃＡタンパク質は、ポリメラーゼ活性またはヘリカーゼ（例えば、ＲｕｖＡＢなど）またはリゾルベース（例えば、ＲｕｖＣなど）の活性のいずれかにより置換される。いったん、プライマー、ＡＴＰ、デオキシヌクレオシド三リン酸または任意の他の限定的な成分が消費され、反応が停止する。

温度感受性リコンビナーゼ変異体を含めることにより、制御されたＤＮＡ合成の開始が可能になる。かかる状況では、開始反応を２５〜３７℃で行ない、Ｄループの形成を可能にする。伸長反応は、ＲｅｃＡ媒介性二本鎖侵入に非許容性である４２℃で行なう。サイクル数により反応産物の量が決定される。長時間の伸長フェーズにより、再侵入を妨げることなく、極めて長い鎖のＤＮＡの増幅が可能になる。

（実施例２：ネステッドＲＰＡ）
ＲＰＡ反応は、実施例１に記載のようにして行なう。反応物の一部、１０分の１（１／１０）および１００分の１（１／１００）の一部を取り出し、第２のラウンドのＲＰＡでのＤＮＡ鋳型の代わりに使用する。ＬｓＲＰＡ、リーディング／ラギングＲＰＡ、およびその組合せが、ネステッドＲＰＡに使用され得る。

（実施例３：同時リーディング鎖／ラギング鎖リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅）
ＤＮＡ配列は、同時リーディング鎖／ラギング鎖合成を用い、図２に示すリコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）法に従って、増幅され得る。この図は、ｌｓＲＰＡを具体的に示す。図２Ａは、ＲｅｃＡ／プライマー核タンパク質フィラメントが二本鎖鋳型ＤＮＡに侵入し、相同な標的部位と優先的に会合することを示す。Ｄループが形成され、合成が進行すると、置換された単鎖ＤＮＡは、ＳＳＢで被覆された状態になる（図２Ａ）。二本鎖ＤＮＡからのＲｅｃＡ解放がＡＴＰ加水分解によって、５’−３’方向に、またはヘリカーゼ／リゾルベースもしくはポリメラーゼ活性の結果として起こり得る（図２Ａ）。合成が継続されるにつれて（図２Ｂ）、ポリメラーゼは、ＳＳＢが結合した被置換単鎖鋳型に出合う。二本鎖標的部位は、ＲｅｃＡ／プライマー核タンパク質フィラメントによって再侵入される。後続のラウンドのｌｓＲＰＡは、再侵入された部位から進行する（図２Ｂ）。

以下は、大腸菌由来成分を用いたレプリソーム媒介性増幅の同様の成分を詳細に示す。反応物は、以下の組成により合成する。

反応物は、すべての試薬の最終濃度が上記のとおりとなるように組立てる。従って、例えば、各々の成分（Ｄループ形成／分解成分、ヘリカーゼ／リゾルベースミックス、プライモソーム複合体、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素複合体、ラギング鎖ミックス）の５倍濃縮溶液を、１倍反応バッファー中で作製する。次いで、この５つの溶液を一緒に等容量で混合し、反応を開始させる。この反応物を、反応体がすべて消費されるまでの充分な時間インキュベートする。典型的なインキュベーション時間は、１時間、２時間、３時間、５時間、１０時間または一晩（約１６時間）の範囲であり得る。上記のように、ＲＰＡの反応容量に対する制限はない。１つの容器において、２５μｌ、５０μｌ、１００μｌ、１ｍｌ、１０ｍｌおよび１００ｍｌまたはそれ以上の反応容量で行なわれ得る。インキュベーション温度は、典型的な実験室温度、例えば、２５℃、３０℃、または３７℃であり得る。

図３は、開始（図３Ａ）、合成（図３Ｂ）、およびポリメラーゼ増幅（図３Ｃ〜３Ｄ）を示す。第１に、プライモソームがＲｅｃＡ核タンパク質フィラメント侵入によって形成されるＤループ上に負荷される（図３Ａ）。プライモソームがＲＮＡプライマーの伸長鎖を合成する。最後に、プライモソームがクランプ負荷体を呼び寄せ（ｒｅｃｒｕｉｔ）、これが、スライディングクランプ二量体および非対称なＤＮＡポリメラーゼコアの両方を呼び寄せる（図３Ａ）。合成は、リーディング方向およびラギング方向の両方において同時に起こる。最終的に、ラギング鎖合成が停止し、ラギング鎖クランプが負荷解放される（図３Ｂ）。リーディング鎖の合成は、ラギング鎖合成の新たな部位が形成されるまで継続される（図３Ｂ）。リーディング鎖合成は継続され、一方で、ラギング鎖合成の新たな部位が形成される。ラギング鎖合成は前のオカザキ断片に戻って継続され、そこでラギング鎖クランプが負荷解放される（図３Ｃ）。ＤＮＡポリメラーゼＩはＲＮＡプライマーを除去してギャップ内に入り、一方、ＤＮＡリガーゼは、２つのオカザキ断片を連結して連続的なラギング鎖を形成する（図３Ｄ）。

（実施例４：非相同性成分大腸菌ｒｅｃＡ（Ｃ）およびＴ４ｇｐ３２（Ｎ）の合成を用いた増幅環境の確立）
図１８は、ｒｅｃＡ（Ｃ）をｇｐ３２（Ｎ）と、オリゴヌクレオチドであるＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ（５’ビオチン標識を有する）およびＳｉｚｅｒ（サイザー）１、Ｓｉｚｅｒ２、Ｓｉｚｅｒ３、Ｓｉｚｅｒ４またはＴｅｓｔｅｒ２の対の存在下で組合せた実験の結果を示す。これらの後者の非ビオチン化オリゴヌクレオチドは、共通のＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏオリゴヌクレオチドから進行的にさらに遠くなるように配置した。鋳型は、プラスミドから解放されるおよそ３００ｂｐの線状ＤＮＡ断片であった。Ｔｅｓｔｅｒ３ｂｉｏは、この断片の一方の末端に相補的となり、この配列に対して相対的な５’突出端を含むように設計した。

反応バッファーには、酢酸マグネシウムを１０ｍＭで（ＤＮＡへのｒｅｃＡ結合を補助するのに必要とされる）、および３ｍＭＡＴＰを含めた。また、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼ、ならびに２００μＭのｄＮＴＰＳおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を含むＡＴＰ再生系を含めた。ＰＥＧ化合物は、表示したとおりに用いた。大腸菌ｒｕｖＢ遺伝子を保有するプラスミドに由来する二本鎖鋳型ＤＮＡ（０．５ｆｍｏｌ）を出発標的として使用した。Ｓｉｚｅｒｌ、Ｓｉｚｅｒ２、Ｓｉｚｅｒ３、およびＳｉｚｅｒ４のオリゴヌクレオチドは、鋳型の他方の末端を認識しなかった。代わりに、このようなオリゴヌクレオチドをＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏと、それらの相対的な３’末端間の間隔の漸増を伴なって対向するように配置した。

３７℃で２時間のインキュベーション後、Ｔｅｓｔｅｒ２、３および４を使用した場合、正確なサイズの特異的断片の実質的な増幅が存在した。最良の条件（Ｓｉｚｅｒ２使用）では、本発明者らは、増幅産物は出発鋳型より１０^４倍多いと推測した。

（実施例５：大腸菌ｒｅｃＡ（Ｃ）およびバクテリオファージＴ４ｇｐ３２（Ｎ）の非相同性合成を用いた増幅産物の性質および反応の感度）
図１９は、オリゴヌクレオチドであるＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ（５’ビオチン標識を有する）およびＳｉｚｅｒ２の対の存在下、実施例１で用いたものと同様の条件下で、ｒｅｃＡ（Ｃ）をｇｐ３２（Ｎ）と組合せた実験の結果を示す。ＰＥＧ化合物またはＰＥＧ１４５０は、表示したとおりに用い、０．５ｆモルの鋳型を出発鋳型量として用いた。この実施例では、鋳型の進行的な希釈を調べた。あるいはまた、本発明者らは、プライマーと重複する末端を有しない線状化出発鋳型（大腸菌ｒｕｖＢ遺伝子のＣｌａＩ消化物を有するプラスミドを用いることにより）、およびクレノウ断片の希釈物の使用を探究した。正しいサイズの断片の増幅が、すべてのレーンで起こり、ＰＥＧ化合物の存在下の０．５ｆモル出発鋳型の場合が最も強かった。

このような最適な反応の産物をアガロースゲル上で電気泳動させ、臭化エチジウムで染色した場合、正確なサイズの二本鎖ＤＮＡの明白なバンドが観察された。この試料を、電気泳動前にＢｂｖＣｌ制限酵素で処理した場合、予期されたゲル移動度の増加が起こり、予期されたとおりの単一の切断物であることと一致した。正確なサイズの産物の増幅は、１００倍またはそれ以上の出発鋳型希釈物で観察されたが、産物は存在度が低く、メインバンドより小さい短い産物のラダーを含む。同様のパターンは、非切断鋳型を用いる場合、または鋳型を用いない場合に観察された。本発明者らは、このような研究で用いられるタンパク質は、１回のカラム精製でヌクレアーゼの使用なしで精製されるため、大腸菌ゲノムＤＮＡ（天然に、ｒｕｖＢ遺伝子を有する）有意に混入していると推論した。従って、本発明者らは、この試験系では、感度が十分高い場合に偽陽性がもたらされると考える。

（実施例６：ｇｐ３２（Ｎ）およびｕｖｓＸ（Ｃ）の合成を用いた増幅環境の確立）
図２４は、オリゴヌクレオチドであるＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏおよびＳｉｚｅｒ２の存在下で、ｕｖｓＸ（Ｃ）をｇｐ３２（Ｎ）と組合せた実験の結果を示す。この実験における鋳型ＤＮＡは、実施例１および２で使用した大腸菌ｒｕｖＢ遺伝子保有プラスミドのＥｃｏＲＶ消化物であった。Ｔｅｓｔｅｒ３ｂｉｏは、およそ３００塩基対断片の一方の末端を認識し、標的配列の末端に相対的な５’突出端を含んだ。Ｓｉｚｅｒ２は、この鋳型の他方の鎖を認識した。このオリゴヌクレオチドは組み込まれた配列に指向され、その結果、その３’末端がＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏの末端から約３回半のらせん状回転となった。

ＰＥＧ１４５０の存在下では、本発明者らは、反応の２時間以内に予期された断片の増幅を観察した。増幅が起こった場合、オリゴヌクレオチド集団のほぼすべてのが消費され、これは、３〜５×１０^４増幅を示す。反応成分を図２４に示す。一部の試料にはさらなる成分を含めた。本発明者らは、この反応に含めた２００μＭＡＤＰ−β−Ｓがこの条件下で形成される産物の量をわずかに増加させることを見出した。逆に、この場合で使用した条件下では、大腸菌トポイソメラーゼＩを含めることは、ＤＮＡ増幅に対して抑制的であった。使用した条件下で、本発明者らには、ｕｖｓＸ（Ｃ）δタンパク質の増幅は検出されなかった。しかしながら、ＰＥＧ１４５０はこれらの試料に含めず、また、ｕｖｓＸ（Ｃ）は、ＰＥＧ１４５０を含まないこの条件下で増幅されなかった。

（実施例７：Ｔ４組換えタンパク質を用いたヒトゲノムＤＮＡからの標的の増幅）
図３０は、数個のプライマー対を用いて特異的ＤＮＡ断片をヒトゲノムＤＮＡから増幅した実験の結果を示す。反応には、バクテリオファージＴ４ｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａ、ｕｖｓＸ（Ｃ）およびｕｖｓＹ（Ｎ）タンパク質、ならびにエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ断片、ならびにＡＤＰおよびＡＭＰを変換させるＡＴＰ再生系を構成するタンパク質を含めた。特異的ＤＮＡ断片を検出するため、本発明者らは、電気泳動により分離した反応産物をナイロン膜に移し、次いで、特有の非プライマー内部配列を認識するビオチン化プローブとハイブリダイズさせた。

３つのプライマー対を用い、各場合において、ゲノムＤＮＡ投入なし、１０，０００コピーの非切断ヒトゲノムＤＮＡ、および１０，０００コピーのＨｐａＩＩ切断ゲノムＤＮＡ（これは、プライマー対の少なくとも一方の末端に生成させる）間の比較を行なった。すべての場合で、所望のＤＮＡ配列の特異的増幅が起こったが、その効率は、プライマー対間、および非切断と切断ＤＮＡの間で多様性を示した。すべての場合で、ＤＮＡ試料の事前のＨｐａＩＩ消化は必須ではなかったが、増幅効率は改善された。すべての場合で、投入ゲノムＤＮＡは重要であった。最良の増幅（レーン４に示す）では、本発明者らは少なくとも１０^１１分子と推測し、これは、およそ１０^７程度の増幅を示す。

（実施例８：複合体ＤＮＡ−ヒトゲノムＤＮＡを標的化した場合のｌｓＲＰＡの感度）
図３１は、数個のプライマー対を用いて特異的ＤＮＡ断片をヒトゲノムＤＮＡから増幅した実験の結果を示す。反応には、バクテリオファージＴ４ｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａ、ｕｖｓＸ（Ｃ）およびｕｖｓＹ（Ｎ）タンパク質、ならびにエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ断片を含め、ＡＤＰおよびＡＭＰを変換させるＡＴＰ再生系を含めた。特異的ＤＮＡ断片を検出するため、本発明者らは、電気泳動により分離した反応産物をナイロン膜に移した。次いで、特有の非プライマー内部配列を認識するビオチン化プローブとハイブリダイズさせた。

３つのプライマー対を用い、各場合において、出発鋳型なし、およびおよそ１０、１００、１０００、３０００、および１０，０００コピーのゲノム標的間の比較を行なった。すべての場合で、少なくとも１０００コピーのゲノム標的を用いた場合に明白な増幅が検出された（１００コピーの最良のプライマー対で弱いシグナルが見られる）。本発明者らは、このようにして構成したｌｓＲＰＡ反応中では、非常に複雑な標的からのＤＮＡの増幅が、少なくとも１０００コピー（潜在的にはさらに高い）感度で可能であると結論付けた。

（実施例９：反応中での真の産物の蓄積とプライマー（鋳型非依存的）アーティファクト間の競合）
図３２は、一対のプライマーを用いて特異的ＤＮＡ断片をヒトゲノムＤＮＡから増幅した実験の結果を示す。反応には、バクテリオファージＴ４ｇｐ３２（Ｃ）、ｕｖｓＸ（Ｃ）およびｕｖｓＹ（Ｎ）タンパク質、ならびにエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ断片、ならびにＡＤＰおよびＡＭＰを変換させるＡＴＰ再生系を構成するタンパク質を含めた。ＰＥＧ１４５０は、１０％ｗ／ｖで含めた。オリゴヌクレオチドの１つは、すべての反応産物が増幅の最後に観察され得るように５’−ビオチンを含んだ。試料を１時間目、２時間目および３時間目に採取し、どれだけ反応が進行したかを観察した。試料の１つでは、最小の量のｕｖｓＹ（Ｎ）を用いた場合（５０ｎｇ／μｌ）、正確な断片の増幅が観察された（レーン４の矢印を参照）。この断片はＢｓｔＸＩによって、予期されたサイズの断片に切断され、これは、主に二本鎖であったことを示す。しかしながら、断片は、反応中、同時に蓄積される見かけ上鋳型非依存性のバンドよりも存在度が低かった。このようなバンドのサイズおよび鋳型非依存性性質は、これらがプライマーアーティファクト、例えば、プライマー二量体および／またはスナップバック合成産物であることを示した。特異的断片の増幅の欠如は、５０ｎｇ／μｌより高いｕｖｓＹ（Ｎ）濃度で、反応が最適以下で起こったことを示した。これは、後の実験で確認された。

（実施例１０：プライマーアーティファクトを厳密に制限または排除するため、および複合体鋳型から、感度が良くノイズの無い増幅を可能にするための反応組成の最適化）
図３６は、一対のプライマーを用いて特異的ＤＮＡ断片をヒトゲノムＤＮＡから増幅した実験の結果を示す。反応には、バクテリオファージＴ４ｇｐ３２（Ｃ）、ｕｖｓＸ（Ｃ）およびｕｖｓＹ（Ｎ）タンパク質、ならびにエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ断片、またはＢｓｔポリメラーゼ、ならびにＡＤＰおよびＡＭＰを変換させるＡＴＰ再生系を構成するタンパク質を使用した。オリゴヌクレオチドの１つは、すべての反応産物が増幅の最後に観察され得るように５’−ビオチンを含んだ。増幅された断片を、反応物の少量の試料をアクリルアミドゲル上で泳動させることによりサイズによって断片を分離した後、可視化した。この実験では、非切断ヒトゲノムＤＮＡを０コピー、４５コピーから漸増させ、次いで、標的コピー数を２８８０まで倍増させた。この実験では、２つのポリメラーゼ種の各々について、バッファーおよび温度の両方に関してわずかに異なる条件を用いた。クレノウ断片を用いた反応を３７℃で行ない、一方、Ｂｓｔポリメラーゼを用いた反応は４２℃で行なった。バッファー組成の詳細を図での説明に示す。

このような最適化された条件下での反応効率に注目すべきかつ重要なことは、ＰＥＧ化合物を５％最終重量／容量で両方の場合で含めた。両方のポリメラーゼは正確な断片を有効に増幅し、場合によっては、利用可能なプライマーの大部分を利用した。クレノウ断片に使用した条件下では、感度は非常に高く、０コピーレーンにおいてさえ弱いシグナルが観察され、おそらく、これは、直接隣接するレーン内に存在する４５コピー未満を表す量のヒトＤＮＡによる混入を反映している。ここで示された感度レベルでは、使用した装置に由来する微量レベルの混入を排除することは困難であり、このことは陰性対照においても、シグナルをもたらした。クレノウ媒介性増幅で用いたものと同様の条件の常套的な使用は、多数のプライマー対のノイズの無い増幅に有効なことが、後の実験で証明された。これは、この条件が、このセットのタンパク質成分を伴なう反応に最適なものに近いことを示した。

（実施例１１：クローンおよびタンパク質の作製のための実験方法）
すべてのクローンを、大腸菌、Ｔ４ファージ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＰｈｉ−２９ファージからのＰＣＲ増幅産物のクローニングにより構築した。増幅に使用したすべてのストック生物は、ＤＳＭＺの公の供給元から入手した。タンパク質発現に用いたクローン化したＤＮＡは、一般的に、断片のＰＣＲ増幅中にＮまたはＣ末端のいずれかにヘキサヒスチジンペプチドタグが挿入されるｐＥＴペクター（例えば、ｐＥＴ−２１）にか、またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＰｏｌＩ（Ｂｓｕポリメラーゼ）の場合はｐＱＥペクター（例えば、ｐＱＥ３１）にクローン化した。この開示では、Ｎ末端タグを含有するすべてのタンパク質を（Ｎ）が続くタンパク質名、例えば、ｇｐ３２（Ｎ）で示すか、またはタグをＣ末端に含有する場合は、（Ｃ）が続く名称、例えば、ｇｐ３２（Ｃ）で示す。さらに、本発明者らは、他の場合では修飾タンパク質を作製するために、数個のクローンを構築した。これらとしては、天然タンパク質の最後の１７アミノ酸残基の欠失を有するｒｅｃＡ（Ｃ）（ｒｅｃＡ（Ｃ）δｌ７で示す）が挙げられる。同様の形態のＴ４ＵｖｓＸ（Ｃ）タンパク質を作製し、ＵｖｓＸ（Ｃ）δ２１で示す。また、本発明者らは、リジン３またはアルギニン４のいずれかを修飾しているｇｐ３２の変異形態を構築した。

すべてのタンパク質を、大腸菌において過剰発現させ、従来のプロトコルを用いて精製した。タンパク質は、一般的に、標準的な手順によって、ニッケルレジンにおいて１ＭＮａＣｌおよびリン酸塩バッファー中で精製した。タンパク質は、２５０ｍＭイミダゾールにより溶出し、適切なバッファー中に透析した。所内で作製したクローンから産生されたタンパク質には、大腸菌ｒｅｃＡ（Ｃ）、大腸菌ＳＳＢ（Ｎ）、大腸菌ＰｒｉＡ（Ｎ）、大腸菌ＰｒｉＢ、大腸菌ＰｒｉＣ、大腸菌ＤｎａＢ、大腸菌ＤｎａＣ、大腸菌ＤｎａＣ８１０、大腸菌ＤｎａＴ、大腸菌ＲｕｖＡ、大腸菌ＲｕｖＢ、Ｔ４ファージＵｖｓＸ（Ｃ）、Ｔ４ファージＵｖｓＸ（Ｎ）、Ｔ４ｇｐ３２（Ｎ）、Ｔ４ｇｐ３２（Ｃ）、Ｔ４ｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａ、Ｔ４ファージｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｑ、Ｔ４ファージｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｔ、Ｔ４ファージｇｐ３２、Ｔ４ファージｇｐ３２Ｋ３Ａ、Ｔ４ファージｇｐ３２Ｒ４Ｑ、Ｔ４ファージｇｐ３２Ｒ４Ｔ、Ｔ４ファージＵｖｓＹ（Ｎ）、Ｔ４ファージＵｖｓＹ（Ｃ）、Ｔ４ファージｇｐ４３、Ｔ４ファージｇｐ４３（ｅｘｏ−）、大腸菌クレノウ断片、大腸菌クレノウｅｘｏ−が含まれる。タグ無しｇｐ３２タンパク質を、ＤΕＡΕセファロースアニオン交換の後、単鎖ＤＮＡセルロースマトリックスへの結合を伴なう２−カラム手順によって精製した。

（ＲＰＡ反応に用いたＤＮＡ）
本発明者らは、数個の異なる標的ＤＮＡおよび多数のオリゴヌクレオチドをこの研究において使用した。鋳型の関連する部分の配列、およびオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。

（大腸菌ＲｕｖＢ遺伝子標的）
ＲｕｖＢ遺伝子のΕｃｏＲＶ断片の配列を以下に示す。

この研究において記載したこの鋳型を標的化するオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。

この研究において標的化されるヒトアンギオテンシン変換酵素の一部の配列を以下に示す。

下線は、一部の実験で一部のＤＮＡの調製においてＨｐａＩＩにより標的化されたＨｐａＩＩ制限部位である。

ヒトＡＣＥ遺伝子の一部を標的化するために使用したオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。

（実施例１２：実験結果および解析）
図９は、二本鎖ＤＮＡ標的および標的化オリゴヌクレオチドの性質について調べた結果を示す。スーパーコイル鋳型または線状化ＤＮＡのいずれかを用いた実験は、ｒｅｃＡが、ポリメラーゼ伸長を最も容易にスーパーコイルＤＮＡ上で、または線状化ＤＮＡの末端で補助できる中間体の形成を触媒することを示した。ビオチン化オリゴヌクレオチド、Ｔｅｓｔｅｒ３ｂｉｏを、スーパーコイル標的ＤＮＡ、またはＥｃｏＲＶもしくはＣｌａＩで線状化した標的鋳型のいずれかとともにインキュベートした実験の結果を示す。これにより、それぞれオリゴヌクレオチドまたは組み込まれた配列と重複する末端が生成された。反応溶液は、２０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸塩ｐＨ７．９、１０ｍＭＭｇ−酢酸塩、１３μｇｒｅｃＡ、１μｇ大腸菌ＳＳＢ、２７ｍＭクレアチンリン酸、１Ｕクレアチンキナーゼ、０．２μＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＧ、ｄＣおよびｄＴ；１ｍＭｄＡ、５０Ｕクレノウ、０．５ｐモル鋳型、１２０ｎｇｒｅｃＯ、１２０ｎｇｒｅｃＲ、０．５μＭｄｎａＢ、および０．５μＭｄｎａＣ８１０を含んだ。大腸菌ｒｅｃＯおよびｒｅｃＲタンパク質、ならびにｄｎａＢおよびｄｎａＣ８１０タンパク質をこの実験に含めたが、これらは、結果に有意に影響しなかった。３７℃で２時間の反応後、反応物を沈殿させ、６％変性ゲル上で泳動させ、、ナイロン膜に移し、ストレプトアビジン−ＨＲＰとともにインキュベートした後、ＥＣＬを行ない、反応性物質を検出した。各反応において、０．５ｐモルの鋳型を用いた。ゲル上にサイズおよび量の対照として、０．５ｐモルのビオチン化ＰＣＲ断片（標識ＣＯＮ）を含めた。他の反応成分および条件を図に示す。

図１０は、バックファイヤー（ｂａｃｋｆｉｒｅ）合成を示す。バックファイヤー合成は、リコンビナーゼ−被覆された５’突出端を有する標的化オリゴヌクレオチドが、好適なポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で二本鎖ＤＮＡ末端に侵入する場合に起こる。この新たな二本鎖領域は、後続の分枝点移動に対して安定であり、他の適用の基礎として利用され得る。フォワードファイヤー（ｆｏｒｗａｒｄｆｉｒｅ）は、侵入オリゴヌクレオチドの伸長であり、これもまた、これらの反応において起こる。線状化された標的ＤＮＡの末端に対する５’突出端を有するオリゴヌクレオチドＴｅｓｔｅｒ３を種々の鋳型とともにインキュベートする場合に形成される中間体におけるポリメラーゼの活性を検出する実験の結果を示す。

パートＡでは、使用される鋳型は、生成される二本鎖ＰＣＲ産物であり、その結果、該産物は、ビオチン標識を、標的化オリゴヌクレオチドに相補的な鎖の５’末端に有する。その他の点では、この断片は、この研究において別途使用し、Ｔｅｓｔｅｒ３ｂｉｏオリゴヌクレオチドの標的である大腸菌ＲｕｖＢ遺伝子を保有するプラスミドから解放されるＥｃｏＲＶ断片と類似する。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ−酢酸塩、７．５μｇｒｅｃＡ、１μｇＳＳＢ、２７ｍＭクレアチンリン酸、１Ｕクレアチンキナーゼ、０．３μＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、５０Ｕクレノウ、０．５ｐモルビオチン化鋳型を含んだ。必要に応じて、本発明者らは、０．５μＭｒｕｖＡおよび０．５μＭｒｕｖＢ；または１μＭｒｕｖＡおよび１μＭｒｕｖＢ；または１．５μＭｒｕｖＡおよび１．５μＭｒｕｖＢを含めた。最終容量は３０μｌとした。インキュベーションを、１時間３７℃で行なった。ｒｅｃＡの存在下では、標的のビオチン化鎖は１６塩基伸長され、組換え中間体がポリメラーゼによって接近可能であり、ポリメラーゼが侵入オリゴヌクレオチドの突出端領域を転写したことが予測され得る。

パートＢでは、反応物を、鋳型をビオチン化せず、侵入オリゴヌクレオチドをビオチン化する以外は、同様にして反応を構成する。この実験では数個のポリメラーゼを調べ、修飾されていないクレノウ断片のみで産物の有意な産生が得られた。この実験では、本発明者らはまた、Ｔｅｓｔｅｒ３標的化部位のすぐ下流の標的を認識するように設計した小さなオリゴヌクレオチドを含めて調べた。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ−酢酸塩、１０μｇｒｅｃＡ、１μｇＳＳＢ、２７ｍＭクレアチンリン酸、１Ｕクレアチンキナーゼ、０．３μＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、５０Ｕクレノウ、０．５ｐモル非ビオチン化鋳型を含んだ。必要に応じて、本発明者らは、５μｌの事前に負荷した安定なＡＴＰγＳオリゴヌクレオチドを含めた。最終容量は３０μｌとした。インキュベーションを、１時間３７℃で行なった。本発明者らは、リコンビナーゼを安定的に負荷する試みにおいて、ＡＴＰ−γ−Ｓの存在下で、ｒｅｃＡとともに事前にインキュベートした。事前に負荷した溶液は、１０ｍＭＭｇ−酢酸塩、２．５μｇｒｅｃＡ、５０μＭＡＴＰγＳ、および０．１５μＭオリゴヌクレオチドを含んだ。前負荷溶液は、Ｔｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ侵入／伸長混合物に添加した。すべての場合で、産物の収量は、この予備混合物質を含めることによって減少した。本発明者らのデータに基づき、本発明者らは、反応物中のＡＴＰ−γ−Ｓの存在（最終濃度約８μＭ）は中程度に阻害性であったと考える。この実験の目的は、Ｔｅｓｔｅｒ３標的化部位のすぐ下流に形成された安定な三重鎖ハイブリッドの存在がこのような侵入を分枝点移動に対して安定化させ得るか否かに取り組むことであった。

図１１は、バックファイヤー合成の使用を示す。バックファイヤー合成は、直接的なフォワードファイヤー以外の適用に使用され得る分枝点移動抵抗性の基礎がもたらされるため、有用であり得る。ニック形成酵素標的部位の導入、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの導入、および連続的侵入／合成／切断事象による短いｄｓＤＮＡ断片の線状生成などの、数個の例をここに示す。制限酵素部位をさらなる突出端配列内に含めた場合、好適な線状化断片の標的化の後、バックファイヤー合成により、制限酵素のための二本鎖標的が生じる。該酵素は、次いで、配列を切断し、短い二本鎖ＤＮＡと、さらなる侵入事象の標的となる長い二本鎖ＤＮＡを放出し得る。

図１１Ｂでは、標的化オリゴヌクレオチドの５’突出端を、バックファイヤー合成が起こるべきよう設計し、ニック形成エンドヌクレアーゼの標的を生成させる。ニック形成エンドヌクレアーゼ、例えば、ＢｂｖＣｌａまたはｂの存在下では、好適なポリメラーゼ、例えば、クレノウ断片は、ニックから伸長し得、ＤＮＡ鎖を置換し得る。多数の鎖が、連続的なニック形成および単一の鋳型からの伸長によってラン−オフされ得る。図１１Ｃでは、バックファイヤー合成によって二本鎖に変換される５’突出端は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えば、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の配列を含有する。必要なポリメラーゼおよび好適なヌクレオシド三リン酸の存在下では、転写がプロモーターの下流で開始され得、図示したＲＮＡが生成され得る。非鋳型鎖内の破断の存在により、首尾よい伸長の抑制は予測されない。ＲＮＡ産物は、一部の形態の増幅反応において、または他の目的のために使用され得る。

図１２は、単鎖結合タンパク質がリコンビナーゼ侵入およびプライマー伸長を助長することを示す。大腸菌ＳＳＢおよびＮ−末端Ｈｉｓタグを有するバクテリオファージＴ４ｇｐ３２（ｇｐ３２（Ｎ））はともに、ｒｅｃＡ媒介性侵入／伸長を線状ＤＮＡ鋳型上で刺激することができる。０．５ｐモルの標的鋳型（大腸菌ｒｕｖＢ遺伝子を保有するプラスミドから解放されたＥｃｏＲＶ断片）を、鋳型の一方の末端と重複するＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏオリゴヌクレオチドとともにインキュベートした実験の結果を示す。大腸菌ＳＳＢタンパク質またはＴ４ｇｐ３２（Ｎ）タンパク質のいずれかを、反応を刺激するために含めた。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ−酢酸塩、６μｇｒｅｃＡ、８．８μｇｇｐ３２または１μｇＳＳＢ、２７ｍＭクレアチンリン酸、１Ｕクレアチンキナーゼ、０．３ｍＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、５０Ｕクレノウ、０．５ｐモル鋳型を含んだ。必要に応じて、本発明者らは、１２０ｎｇｒｅｃＯおよび１２０ｎｇｒｅｃＲを含めた。最終容量は３０μｌとした。インキュベーションを、１時間３７℃で行なった。他の反応成分および条件は図に示す。この図はまた、プライマーと標的ＤＮＡの一般的な関係を示す。大腸菌ｒｅｃＯおよびｒｅｃＲタンパク質を含めた反応では、この条件下でそれらの付加による効果はほとんどみられなかった。侵入および伸長は、すべての場合で進行したようであり、ｇｐ３２（Ｎ）は、大腸菌ＳＳＢよりもさらに良好に合成を刺激したようであったが、この実験では、これをより高い濃度で使用した。

図１３は、線状鋳型の末端標的化の際の侵入および伸長のための最小のオリゴヌクレオチド長または突出端の要件を示す。０．５ｐモルの標的鋳型（大腸菌ｒｕｖＢ遺伝子を保有するプラスミドから解放されたＥｃｏＲＶ断片）を、いずれかのＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏオリゴヌクレオチドとともにインキュベートした実験の結果を示す。このオリゴヌクレオチドは、鋳型の一方の末端、または鋳型の他方の末端から突出しておらず、わずか１８残基長であるＧｅｎ２ｂｉｏオリゴヌクレオチドと重複する。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ−酢酸塩、２７ｍＭクレアチンリン酸、１Ｕクレアチンキナーゼ、０．２μＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏまたはＧｅｎ２ｂｉｏ、１０ｍＭｄＡＴＰ、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ混合物、５０ＵクレノウまたはＰｈｉ２９ポリメラーゼ、１３μｇｒｅｃＡ（Ｃ）、１μｇ大腸菌ＳＳＢ、および０．５ｐモル鋳型を含んだ。最終容量は３０μｌとした。インキュベーションは、２時間３７℃で行ない、２μｌの反応物をゲルの各レーンにロードした。他の反応成分、条件、およびプライマーと標的ＤＮＡの一般的な関係を図に示す。侵入および伸長は、クレノウ断片の存在下で効率的に進行したようであり、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼではあまり効率的でなく、Ｇｅｎ２ｂｉｏプライマーとクレノウ断片ではあまり良好でないようであった。本発明者らは、最小のプライマー長および／または鋳型に対する突出端は、効率的な侵入および伸長を刺激するのに必要とされると結論付けた。

図１４は、並行（Ａ−Ｅ）接合およびらせん（Ｆ−Ｈ）接合を示す。並行接合では、ＤＮＡとのリコンビナーゼフィラメントの相互作用が、巻き戻しを刺激する（図１４Ａ）。巻き戻された領域は、相同性検索とともに移動する（図１４Ｂ）。相同性が見られる（図１４Ｃ）。リコンビナーゼは解離し、新たな二本鎖が再び巻くことを試みる（図１４Ｄ）。トポロジーが拘束されているため、「放出」鎖は、新たな二本鎖の周囲で再び巻くことを強いられる（図１４Ｅ）。この状態は、きわめて不都合かつ不安定であり、常にはＳＳＢにより管理され得ない（図１４Ｅ）。らせん接合では、ＤＮＡとのリコンビナーゼフィラメントの相互作用が、巻き戻しを刺激する（図１４Ｆ）。鎖交換がＤＮＡ末端と重複する場合、「放出」鎖が自由になり、リコンビナーゼが解離し、入ってくるオリゴおよびその相補鎖が再び巻かれるにつれ、「放出」鎖が弛緩され得る（図１４Ｇ）。これにより、非拘束産物が形成され、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質が分枝点移動を抑制する（図１４Ｈ）。

この図では、核タンパク質フィラメントが、線状化された二本鎖の末端に配置された相同配列により鎖交換を開始したとき（図の右側）と、またはいずれの端部でも相同性を欠く二本鎖内で鎖交換を開始したとき（図の左側）で起こり得る事象を比較する。左側からはじめると、いったん核タンパク質フィラメントが正しい配列に配置されると、これは、検索ＤＮＡをその相補鎖と対合形成させ、元の二本鎖の一方の鎖は対合形成していない。実際、交換複合体は３つの鎖からなり、これらは比較的巻かれて（ｕｎｄｅｒ−ｗｏｕｎｄ）おり、リコンビナーゼによって安定化されている。リコンビナーゼが５’→３’方向に分解し始めると、巻かれた三重鎖中間体は不安定になる。新たな二本鎖が弛緩ＤＮＡの正常な立体配置を回復するためには、回転しなければならない。しかしながら、そうする際に、上流および下流でその元のパートナーに連結されるため、これは放出鎖と同時に回転しなければならない。このことは、同じ回転数をもたらすはずだが、新たな二本鎖の周囲で長い方の経路が採用されるため、放出鎖を過剰に巻くことをもたらす。このことは、エネルギー的に好ましくない。したがって、単鎖結合タンパク質が、非常に安定なＤＮＡ相互作用を伴ってかかる構造を任意の有意な時点で存在させるのを可能にするには要件が存在する。あるいは、図の右側は、交換が二本鎖の末端を含む場合、交換により放出鎖の完全な解放が一端で引き起こされ得、それゆえ組換えに関与する他方の鎖に拘束されない自由な回転を可能にし得ることを示す。これは、リコンビナーゼ分解後、新たな二本鎖が自由に再び巻くことができ、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質は自発的分枝点移動の抑制にのみ必要とされる安定な状況をもたらす。

図１５は、クラウディング剤（ｃｒｏｗｄｉｎｇａｇｅｎｔ）の効果を示す。ポリエチレングリコールの存在下では、ｇｐ３２（Ｎ）およびｒｅｃＡリコンビナーゼは、標的化オリゴヌクレオチド内に５’突出端を許容し得る鋳型末端を再生する必要なく、多重侵入事象を単一の鋳型上で媒介し得る。図１５Ａは、Ｔｅｓｔｅｒ１ｂｉｏ、またはＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏオリゴヌクレオチド（これらは、鋳型に対する５’突出端の長さにおいて異なる）のいずれかを、大腸菌ｒｕｖＢ遺伝子を保有するプラスミドから解放されたＥｃｏＲＶ断片、またはこのプラスミドのＣｌａＩ消化物とともに、１０％ＰＥＧ８０００の存在下または非存在下でインキュベートした実験の結果を示す。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ−酢酸塩、１０．６μｇｒｅｃＡ、８．８μｇｇｐ３２、２７ｍＭクレアチンリン酸、１Ｕクレアチンキナーゼ、０．３ｍＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏまたはＴｅｓｔｅｒｌｂｉｏ、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ混合物、５０Ｕクレノウ、および０．５ｐモル鋳型（図に示した種）を含んだ。必要に応じて、本発明者らは、１２０ｎｇｒｅｃＯおよび１２０ｎｇｒｅｃＲを含めた。ＰＥＧ８０００は表示のとおりに含めた。最終容量は３０μｌとした。インキュベーションを、１時間３７℃で行なった。

示した図は、２つの可能な鋳型に対するオリゴヌクレオチドの関係を表す。特に、両方のオリゴヌクレオチドは、ＣｌａＩ断片内に組み込まれた配列を認識した。各場合で、０．５ｐモルの鋳型を使用し、他の条件は表示のとおりに行なった。両方のプライマーは、侵入／伸長をＥｃｏＲＶ鋳型上で刺激した。シグナル強度に基づくと、１つの標的鋳型につき、およそ１回の伸長が起こった。しかしながら、１０％ＰＥＧ８０００の存在下では、完全に伸長された断片の強度は、ＰＥＧの非存在下よりも有意に大きく、０．５ｐモルの対照ビオチン化ＰＣＲ産物よりも強かった。最も強いシグナルは、Ｔｅｓｔｅｒ３ｂｉｏオリゴヌクレオチドで見られた。このとき、本発明者らは、鋳型１つにつき、少なくとも１０回の侵入／ラン−オンが起こると推測した。

図１５Ｂにおいて、本発明者らは、侵入／伸長の刺激を１０％ｗ／ｖの種々の市販のポリエチレングリコールにおいて比較した。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ−酢酸塩、１０．６μｇｒｅｃＡ、８．８μｇｇｐ３２、２７ｍＭクレアチンリン酸、１Ｕクレアチンキナーゼ、０．３ｍＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏまたはＴｅｓｔｅｒｌｂｉｏ、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、５０Ｕクレノウ、および０．５ｐモルＲＶ鋳型を含んだ。ＰＥＧ種は表示のとおりに含めた。刺激の程度に有意な多様性が観察された。ＰＥＧ化合物（ＭＷ＝１５，０００〜２０，０００）が最も有効であり、次はＰＥＧ１４５０であるようであった。

図１６は、リーディング鎖ＲＰＡを用いた末端標的化された増幅の効果を示す。数回のラウンドの侵入および伸長を含む増幅が示され、０．０５ｐモルの鋳型から少なくとも１０倍の増幅が達成された。この実験では、本発明者らは、増幅反応を確立するためにオリゴヌクレオチドプライマー対を用いた。使用したオリゴヌクレオチドと、大腸菌ｒｕｖＢ遺伝子を保有するプラスミド由来のＥｃｏＲＶ断片（これは、鋳型として使用した）との関係を概略的に示す。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ−酢酸塩、６μｇｒｅｃＡ、８．８μｇｇｐ３２（Ｎ），２７ｍＭクレアチンリン酸、１Ｕクレアチンキナーゼ、０．３ｍＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ、０．３ｍＭの種々のオリゴヌクレオチド、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、１０％ＰＥＧ化合物、５０Ｕクレノウ、および０．５ｐモル鋳型を含んだ。さらなるタンパク質を表示のとおりに使用した。

Ｔｅｓｔｅｒ３ｂｉｏには、出発鋳型に対する１６−ヌクレオチド突出端を含めたが、Ｔｅｓｔｅｒ２には、２１−ヌクレオチド突出端を含め、鋳型の他方の末端に標的化した。ホスホ−１をホスホロチオレートバックボーンを有するオリゴヌクレオチドとして使用した。このオリゴヌクレオチドは１５残基長であり、標的末端から突出していなかった。ホスホ−１は、リン酸塩バックボーンを欠いたため、リコンビナーゼまたは単鎖ＤＮＡ結合タンパク質と相互作用しないと予測された。しかしながら、これは直接的な溶液ハイブリダイゼーションでは機能することが予測された。０．５ｐモルのＤＮＡのシグナル強度を示すため、ビオチン化ＰＣＲ産物の対照断片を使用し、これはまた、正確なサイズの出発鋳型であった。反応産物を６％変性ゲル上で泳動させ、ナイロンに移し、ストレプトアビジン−ＨＲＰと結合させた後、増強化学発光を行ない、反応のビオチン化産物を明らかにした。

すべての場合で、ビオチン化Ｔｅｓｔｅｒ３ｂｉｏによる成功裏の侵入および伸長が起こった（完全に伸長された産物の存在によりわかる）。該産物は、オリゴヌクレオチド上の突出端の存在により、対照よりも移動度がわずかに低速であった。さらにまた、シグナル強度は少なくとも０．５ｐモル対照と同程度であったので、数回のラウンドの侵入／ラン−オンについての証拠が存在した。（本発明者らは、反応をわずか０．０５ｐモルで開始した）。対照よりもほぼ３７ヌクレオチド大きい産物の有意な蓄積があった。これは、先に対向プライマーからコピーされ、かつこの対向プライマーに由来する突出端を含む鎖上に伸長したＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏから生じていると予測された。両者の同じゲルの曝露を示す。

通常ＤＮＡ代謝に関与する種々の異なるタンパク質を含めることは、さまざまな効果を有した。ＤＮＡジャイレースおよびトポイソメラーゼＩ（ヒト）は増幅産物の収量を減少させ、トポイソメラーゼは、より短い伸長産物の生成を著しく低下させた。大腸菌ｒｕｖＡおよびｒｕｖＢを含めることもまた、産物形成の全体的な低下をもたらした。大腸菌ｐｒｉＡは、形成産物の量を増加させ、形成されるより短い産物の数を有意に増加させた。大腸菌ｄｎａＢおよびｄｎａＣ８１０タンパク質を含めることは、産物の形成量をわずかに増加させた。ホスホ−１オリゴヌクレオチドを含有する反応において、Ｔｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ単独と比べて有意に強いシグナルが検出されたことに注意されたい。これは、ホスホ−１が、被置換鎖とハイブリダイズし、二本鎖ＤＮＡの形成をもたらし得ることを示した。

図１７は、リーディング鎖ＲＰＡおよびクレノウ合成能力を示す。この実験では、本発明者らは、出発鋳型のさらに１００倍希釈物を用いたこと以外、図１６に示したものと同様の様式で増幅反応を確立する試みにおいてオリゴヌクレオチドプライマー対を用いた。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ−酢酸塩、６または１２μｇｒｅｃＡ、８．８または１４．３μｇｇｐ３２、２７ｍＭクレアチンリン酸、１Ｕクレアチンキナーゼ、０．３または０．９μＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ、０．３または０．９μＭＴｅｓｔｅｒ２、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、１０％ＰＥＧ化合物、５０Ｕクレノウ、および０．５ｐモル鋳型を含んだ。最終容量は３０μｌとした。インキュベーションは、２時間３７℃で行なった。使用したオリゴヌクレオチドと大腸菌ｒｕｖＢ遺伝子を保有するプラスミド由来のＥｃｏＲＶ断片（これは、標的鋳型として用いた）との関係を概略的に示す。Ｔｅｓｔｅｒ３ｂｉｏには、出発鋳型に対する１６−ヌクレオチド突出端を含めたが、Ｔｅｓｔｅｒ２には、２１−ヌクレオチド突出端を含め、鋳型の他方の末端に標的化し、突出端内にＥｃｏＲＩ部位をコードする。０．５ｐモルのＤＮＡのシグナル強度を示すため、ビオチン化ＰＣＲ産物の対照断片を使用し、これはまた、正確なサイズの出発鋳型であった。反応産物を６％変性ゲル上で泳動させ、ナイロンに移し、ストレプトアビジン−ＨＲＰと結合させた後、増強化学発光を行ない、反応のビオチン化産物を明らかにした。

オリゴヌクレオチド、ｇｐ３２（Ｎ）およびｒｅｃＡ（Ｃ）の濃度を変化させ、本発明者らはまた、Ｔｅｓｔｅｒ２突出端によって組み込まれる追加配列の一部を切断し得るＥｃｏＲＩ制限酵素を含めることが反応に対して何らかの効果を有するか否かを調べた。ほとんどの場合、断片の予測したサイズの増幅について、いくらか制限された程度の証拠があったが、短いＤＮＡ断片の生成が主にみられた。本発明者らは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片の乏しい合成能力（１０〜５０ヌクレオチド）が、短い断片を生成させる大半の相互作用をもたらす（これは、標的鋳型の低い濃度でより有意である）ため、真の完全長産物の比較的乏しい蓄積が、このようなより薄い鋳型濃度で起こり得ると推測した。

図１８は、ＲＰＡプライマーの間隔依存性を示す。先の結果の結論として、本発明者らは、プライマー対間の間隔の減少が、増幅効率の増加をもたらし得るか否かの証明を試みた。これを試験するため、本発明者らは、一連のオリゴヌクレオチド、Ｓｉｚｅｒ１、２、３および４を使用し、これらを、Ｔｅｓｔｅｒ３ｂｉｏオリゴヌクレオチドの３’末端からの間隔が広くなるように配置した。すべてのＳｉｚｅｒオリゴヌクレオチドは、図の右下に示すＥｃｏＲＩ突出端を含んだ。標的ＤＮＡの配列、大腸菌ｒｕｖＢ遺伝子を保有するプラスミド由来のＥｃｏＲＶ断片、および使用したオリゴヌクレオチドの位置を示す。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ−酢酸塩、６μｇｒｅｃＡ、８．８μｇｇｐ３２、２７ｍＭクレアチンリン酸、１Ｕクレアチンキナーゼ、０．３μＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ、０．３μＭの種々のオリゴヌクレオチド、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、１０％ＰＥＧ化合物、５０Ｕクレノウ、５ＵＥｃｏＲＩ、および０．５ｐモル鋳型を含んだ。最終容量は３０μｌとした。反応溶液は２時間３７℃でインキュベートした。他の反応条件を図に示す。

０．５ｐモルのＤＮＡのシグナル強度を示すため、ビオチン化ＰＣＲ産物の対照断片を使用し、これはまた、正確なサイズの出発鋳型であった。反応産物を６％変性ゲル上で泳動させ、ナイロンに移し、ストレプトアビジン−ＨＲＰと結合させた後、増強化学発光を行ない、反応のビオチン化産物を明らかにした。予測した長さの特定の断片が、Ｓｉｚｅｒ２、３および４を使用した場合、０．５ｆモルの出発鋳型から効率的に増幅された。産物の長さが長くなるにつれ、産物の収量はいくぶん減少した。Ｓｉｚｅｒｌを使用した場合、予測したサイズの産物はほとんど生成されないか、または全く生成されない。レーン４は、約４×１０^４倍の増幅を含むと推測した。このプライマーは、２５ヌクレオチドのみの最も狭いオリゴヌクレオチド間隔を含んだ。これは、オリゴヌクレオチドの末端間を分離するのに必要とされる最も狭い間隔があることを示唆したが、他の説明（例えば、乏しいプライマー挙動）でもまた、この結果が説明され得る。実験は、鋳型ＤＮＡを含有しない数個の試料を含んだ。Ｓｉｚｅｒ２の場合、ほぼ予測したサイズのかすかなバンドが、外来ＤＮＡの非存在下でも観察される。さまざまなデータに基づき、本発明者らは、このことがかなりの量の大腸菌ゲノムＤＮＡによる本発明者らのタンパク質調製物の混入に起因すると考える。

図１９は、ＲＰＡ産物が、主に二本鎖であることを示す。ＲＰＡ反応により二本鎖ＤＮＡ産物が生成され得、これは、アガロースゲル電気泳動および制限酵素切断によって証明される。しかしながら、この場合で使用した条件下では、出発鋳型を０．５ｆモル未満に大幅に減少させると、反応効率の有意な減少がみられた。さらに、水のみの対照で観察されたシグナルにより、大腸菌ＤＮＡのかなりのゲノム混入が示唆された。この実験では、本発明者らは、図１０に詳細に示す０．５ｆモル以上の希釈量の断片を、Ｔｅｓｔｅｒ３ｂｉｏおよびＳｉｚｅｒ２とともに表示した条件下でインキュベートした。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ−酢酸塩、６μｇｒｅｃＡ、８．８μｇｇｐ３２、２７ｍＭクレアチンリン酸、１Ｕクレアチンキナーゼ、０．３μＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ、０．３μＭＳｉｚｅｒ２，３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、１０％ＰＥＧ化合物、５０Ｕクレノウ、および０．５ｐモル鋳型または図に示す希釈物を含んだ。最終容量は３０μｌとした。

本発明者らは、ＤＮＡ対照を含めず、鋳型の連続希釈物を含め、ＰＥＧ１４５０および希釈クレノウ断片を用い、組み込まれた鋳型（図１および７に詳細に示すＣｌａＩ断片）により反応を開始して調べた。反応産物の画分（１／１０）を６％変性ゲル上で泳動し、ナイロンに移し、ストレプトアビジン−ＨＲＰと結合させた後、増強化学発光を行ない、反応のビオチン化産物を明らかにした（図１９Ａ）。さらなる画分（３／１０）をフェノール抽出し、沈殿させ、２％アガロースゲル上で泳動させ、臭化エチジウムで染色した（図１９Ｂ）。最後の画分（３／１０）をＢｂｖＣｌで切断し、相当する非切断ＤＮＡと並行して２％アガロースゲル上で電気泳動した（図１９Ｃ）。

レーン２（図１９Ａ）は、５×１０^４倍の増幅を含むと推測し、これは、１０^１３分子の最終産物に相当した。０．５ｆモルの出発鋳型の存在下では、予測したサイズ断片の極めて確固とした増幅が見られ、これは、変性ゲル電気泳動によって証明された。さらにまた、一部の試料をアガロース上で電気泳動させると、正確に二本鎖ＤＮＡ産物についての正しいサイズの強い明白なバンドが観察された。この産物はＢｂｖＣｌによって切断され得、予測したサイズよりわずかに小さい断片が得られた。１００倍以上に希釈した鋳型により、有意に低い強度のバンド、および大量の予測した長さより短い断片がもたらされた。これは、変性ゲル電気泳動およびアガロースゲル電気泳動によって決定した。同様のパターンがＣｌａＩ切断ＤＮＡを使用した場合、またはＤＮＡを使用しなかった場合で観察された。本発明者らは、この条件下で、閾値未満の量のＤＮＡを使用した場合、最適以下の増幅反応がみられ、これが不均一な産物をもたらすことを考え、さらに、本発明者らの試料に、ここで使用した本発明者らの組換えタンパク質作製に使用した単一工程精製手順由来の大腸菌ゲノムＤＮＡが大量に混入していることを考える。

図２０は、ｒｅｃＡＣ−末端切断型変異の活性を示す。Ｃ末端酸性ペプチドの欠失を有するＲｅｃＡタンパク質（ｒｅｃＡ（Ｃ）Δ）は、線状鋳型ラン−オンアッセイでの鎖交換および伸長の促進において活性的である。しかしながら、最適なタンパク質濃度は、ｒｅｃＡ（Ｃ）タンパク質よりも低いというある程度の示唆があった。この実験は、別途記載の大腸菌ｒｅｃＡタンパク質のＣ末端切断型形態が、侵入／伸長反応において成功裏に使用され得るか否かに取り組む。大腸菌ｒｅｃＡ（Ｃ）タンパク質または大腸菌ｒｅｃＡΔ１７（Ｃ）タンパク質（これは、１７個のＣ−末端酸性残基を欠く）のいずれかを用いた一方向ラン−オンアッセイの結果を示す。プライマーと鋳型の関係ならびに他の実験条件を示す。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ−酢酸塩、２７ｍＭクレアチンリン酸、１Ｕクレアチンキナーゼ、０．３μＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、５０Ｕクレノウ、０．５ｐモルＲＶ鋳型、およびｒｅｃＡ種を含み、量は図のとおりとした。ＰＥＧは表示のとおりに含めた。最終容量は３０μｌとした。溶液は２時間３７℃でインキュベートした。反応は、１０％ＰＥＧ１４５０を用いて、またはなしで、および表示した量のそれぞれのリコンビナーゼを用いて行なった。両方のリコンビナーゼは、侵入／伸長を成功裏に補助したが、ここで使用した条件下では、必要とされるタンパク質の最適量は異なるようである。

図２１は、修飾ｇｐ３２タンパク質を示す。この研究に使用したＴ４ｇｐ３２タンパク質および種々の修飾および変異の位置の概略図を示す。

図２２は、ｇｐ３２タンパク質の活性を示す。有意な多様性により、ｇｐ３２協同性が、侵入／伸長の反応速度に対してかなりの効果を有することが確認され、さらに、ｇｐ３２（Ｎ）が協同性の有意な減少を示し、これはＮ−末端Ｂドメインの機能による妨害と矛盾しないことが確認される。線状ラン−オンを、鋳型として大腸菌ＲｕｖＢ遺伝子を保有するプラスミドのＥｃｏＲＶ断片、およびＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏオリゴヌクレオチドを用いて生成させた実験の結果を示す。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ−酢酸塩、２７ｍＭクレアチンリン酸、１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ、４００ｎＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、１０Ｕニワトリミオキナーゼ、８μｇＣ−タグｕｖｓＸ、７．５または１５μｇｇｐ３２（各種）、５０Ｕクレノウ、および０．５ｐモル鋳型を含んだ。ＰＥＧは含めなかった。最終容量は３０μｌとした。溶液は２時間３７℃でインキュベートした。反応物は、ｕｖｓＸ（Ｃ）および表示した種々のｇｐ３２形態を含んだ。この実験では、各ｇｐ３２形態の２つの濃度を使用した。反応産物を解析するため、全容量（３０μｌ）の２μｌをゲル上に負荷した。

すべての場合で、完全長ラン−オンと一致する長さまで伸長されるオリゴヌクレオチドの伸長産物が生成された。本発明者らは、この実験では、時折観察されたゲルアーティファクトがみられたことに注目した。本発明者らは、低速の移動度のかすかなバンドを観察した。これは、ＰＣＲ対照断片レーンでも見られた。ｇｐ３２（Ｃ）タンパク質を用いた場合、最小量の産物が形成された。このことは、低レベルのリコンビナーゼ負荷フィラメントのみが反応物中に存在することを許容することと一致する。１５μｇでは７．５μｇと比べてより少量の産物が形成され、より高濃度ではリコンビナーゼ負荷効率が低下するという概念と一致する。

ｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａタンパク質は、２番目に最も協同性である形態であると予測された。これと一致して、１５μｇのタンパク質を使用した場合、制限された数の完全長産物が生成された。しかしながら、ラン−オンの数は、ｇｐ３２（Ｃ）のいずれかの量で観察されたものより多かった。これは、より多量のリコンビナーゼ負荷フィラメントが反応物中に存在すること、およびより高速の侵入／伸長を示す。７．５ｍｇのｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａを使用した場合、形成された産物の量に劇的な変化がみられた。説明の１つは、この反応での侵入／伸長の速度の増大が、単鎖ＤＮＡラン−オフによりｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａが漸増傾向から外れること（ｏｕｔ−ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）をもたらし得ることである。この条件では、大部分のオリゴヌクレオチドがｕｖｓＸ（Ｃ）で被覆された状態になり、高い侵入速度をもたらし得、放出鎖の安定化およびｇｐ３２での被覆ができなくなり得る。これは、短い切断型産物をもたらし得、その一部は、自身で折りたたまれ、自己プライミングし、さまざまな他のこのような産物に形成され得る。これは、ｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａの侵入／伸長の速度がこのタンパク質の場合、ｇｐ３２（Ｃ）よりも著しく高いことを示した。

１５μｇの各タンパク質を用いた場合に生成された産物の強度を比較することにより、本発明者らは、ｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａを含有する反応物が、ｇｐ３２（Ｃ）のおよそ１０倍の侵入／伸長速度を有すると推測した。この実験で試験したその他のｇｐ３２タンパク質はすべて、ｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａを使用した場合で見られた同様のパターン、および大量の産物をもたらした。これは、１５μｇの関連タンパク質を使用した場合であってもそうであり、これらはすべて、ｇｐ３２（Ｃ）またはｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａのいずれよりも低い協同性を示したことを示す。しかしながら、注目すべきことに、ｇｐ３２（Ｎ）およびｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｔはともに、７．５μｇのタンパク質のみを使用した場合、１５μｇと比べて有意に少ない産物を生成した。これは、他方のタンパク質による状況と対照的であった。これに基づき、本発明者らは、ｇｐ３２（Ｎ）およびｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｔが同程度の協同性を有することを示す。先の研究では、ｇｐ３２Ｋ３Ａおよびｇｐ３２Ｒ４Ｑが同様の協同性であることが示された。しかしながら、本発明者らのデータは、ｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｑが、侵入／合成の補助におけるその挙動に関してｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａおよびｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｔの間の程度の協同性であることを示す。

図２３は、ｕｖｓＸを用いた侵入および伸長を示す。この実験は、バクテリオファージＴ４ｕｖｓＸタンパク質のＣ末端切断型形態が、侵入／伸長反応において成功裏に使用され得るか否かに取り組むものである。ｕｖｓＸ（Ｃ）タンパク質または２１個のＣ−末端酸性残基を欠くｕｖｓＸΔ２１（Ｃ）タンパク質のいずれかを用いた一方向ラン−オンアッセイの結果を示す。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ−酢酸塩、２７ｍＭクレアチンリン酸、１Ｕクレアチンキナーゼ、０．４μＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、５０Ｕクレノウ、１Ｕニワトリミオキナーゼ、ｕｖｓＸ（Ｃ）またはｕｖｓＸΔ２１（Ｃ）、８．８μｇｇｐ３２（Ｎ）、および０．５ｐモルＲＶ鋳型を含んだ。最終容量は３０μｌとした。溶液は２時間３７℃でインキュベートし、２μｌの反応混合物をゲルの各レーンにロードした。鋳型とオリゴヌクレオチドの関係および他の実験条件を図に示す。反応は、表示した量のそれぞれのリコンビナーゼを用いて行なった。

両方のリコンビナーゼは、侵入／伸長を成功裏に補助した。しかしながら、この場合で使用した条件下では、必要とされるタンパク質の最適量は異なるようである。ｕｖｓＸ（Ｃ）の場合、試験した範囲内のタンパク質濃度で、侵入／伸長の速度は進行的に増加した。しかしながら、ｕｖｓＸΔ２１（Ｃ）タンパク質では、速度は、高濃度で抑制され、全体的なレベルの産物の産生は、この条件下でより低かった。同様の反応でのｒｅｃＡ媒介性侵入／伸長とは対照的に、ｕｖｓＸ（Ｃ）は、ポリエチレングリコールの添加を必要とせずに、多重侵入／伸長事象を刺激するようであった。

図２４は、ｕｖｓＸ（Ｃ）を用いたＲＰＡを示す。この実験では、ｕｖｓＸ（Ｃ）をｇｐ３２（Ｎ）と、オリゴヌクレオチドであるＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏおよびＳｉｚｅｒ２の存在下で合せた。この実験における鋳型ＤＮＡは、実施例１で使用した、ＥｃｏＲＶで消化された大腸菌ｒｕｖＢ遺伝子保有プラスミドであった。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ酢酸塩、２７ｍＭクレアチンリン酸、１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ、４００ｎＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ、４００ｎＭＳｉｚｅｒ２、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、５０Ｕクレノウ断片、１０Ｕニワトリミオキナーゼ、１０μｇ（１Ｘ）または２０μｇ（２Ｘ）Ｃ−タグｕｖｓＸ、８．８μｇｇｐ３２（Ｎ）を含んだ。必要に応じて、本発明者らは、０．２ｍＭＡＤＰβＳ、１０μｇ大腸菌トポイソメラーゼＩ、１０％ＰＥＧ１４５０、および１０μｇｕｖｓＸΔ２１（Ｃ）を含めた。Ｔｅｓｔｅｒ３ｂｉｏは、およそ３００塩基対断片の一方の末端を認識し、標的の末端に対する５’突出端を含んだ。Ｓｉｚｅｒ２はこの鋳型の他方の鎖を認識し、組み込まれた配列に対して、その３’末端がＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏの末端から約３回半のヘリックス状のターン（ｔｕｒｎ）となるように指向された。

ＰＥＧ１４５０の存在下では、本発明者らは、予測された断片の増幅を２時間以内に観察した。増幅が起こった場合、オリゴヌクレオチド集団のほぼすべてが消費され、これは、３〜５×１０^４の増幅を示す。反応成分は表示している。一部の試料には追加の成分を含めた。本発明者らは、２００μＭＡＤＰ−β−Ｓが、この条件下で生成される産物の量をわずかに増加させることを見出した。逆に、ここで使用した条件下では、大腸菌トポイソメラーゼＩの添加により増幅が抑制された。使用した条件下で、ｕｖｓＸΔ２１（Ｃ）タンパク質による増幅は検出されなかった。しかしながら、ＰＥＧｌ４５０をこれらの試料に含めず、ｕｖｓＸ（Ｃ）は、ＰＥＧ１４５０を含まないこれらの条件下ではいずれも増幅しなかった。

図２５は、野生型ｇｐ３２対修飾ｇｐ３２を示す。バリアントｕｖｓＸ（Ｃ）タンパク質を測定すると、天然のタグ無しｇｐ３２とは質的に異なっていた。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ酢酸塩、２７ｍＭクレアチンリン酸、１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ、３００ｎＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ、３００ｎＭＳｉｚｅｒ２、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、５０Ｕクレノウ断片、１０Ｕニワトリミオキナーゼ、３００ｎｇ／μｌｕｖｓＸ（Ｃ）、３００ｎｇ／ｍｌｇｐ３２（タグ無し）または１００、２００、３００、４００、５００、もしくは６００ｎｇ／ｍｌｇｐ３２（Ｃ）、表示のとおりのＰＥＧを含んだ。反応物は２時間３７℃でインキュベートした。タグ無しｇｐ３２および漸増ｇｐ３２（Ｃ）の存在下、ＰＥＧ１４５０の存在下または非存在下のいずれかで行なった増幅反応物間の比較を示す。本発明者らは、ｇｐ３２（Ｃ）が機能するためにＰＥＧが反応に必要とされるが、これは、タグ無しｇｐ３２の場合はそうでないことを観察した。しかしながら、ＰＥＧは、反応期間中に形成された産物の量を、いずれの場合でも有意に増加させた。ＰＥＧの存在下であっても、タグ無しｇｐ３２は、ｇｐ３２（Ｃ）よりもわずかに多くの産物を漸増曲線の各点で一貫して生成するようであった。

図２６は、ｇｐ３２の漸増およびｕｖｓＹの効果を示す。ｇｐ３２の漸増により、タグ無しｇｐ３２を使用した場合のｇｐ３２の最小量の要件およびｕｖｓＹ（Ｎ）タンパク質の要件が明らかになった。図２６Ａに、タグ無しｇｐ３２を使用した場合、ｕｖｓＹ（Ｎ）タンパク質が増幅に必要とされることを示す実験の結果を示す。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ−酢酸塩、２７ｍＭクレアチンリン酸、１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ、３００ｎＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ、３００ｎＭＳｉｚｅｒ２、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、１０％ＰＥＧｌ４５０、５０Ｕクレノウ断片、１０Ｕニワトリミオキナーゼ、３００ｎｇ／μｌｕｖｓＸ（Ｃ）、３００ｎｇ／μｌｇｐ３２（タグ無し）、および図に表示したｕｖｓＹ（Ｎ）を含んだ。溶液は２時間３７℃でインキュベートした。ｕｖｓ（Ｙ）タンパク質は、ここに示した濃度範囲にわたって（５０〜３００ｎｇ／μｌ）機能した。他の実験では、より多量では反応が抑制されることが示された。したがって、最適量は、任意の所与の反応に対して確立されなければならない（おそらく、５〜５０ｎｇ／μｌの間）。

図２６Ｂは、ｕｖｓＹ（Ｎ）の存在下または非存在下でのタグ無しｇｐ３２タンパク質の漸増の結果を示す。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ酢酸塩、２７ｍＭクレアチンリン酸、１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ、３００ｎＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ、３００ｎＭＳｉｚｅｒ２、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、１０％ＰＥＧ１４５０、１０Ｕニワトリミオキナーゼ、７５０ｎｇ／μｌｕｖｓＸ（Ｃ）、３００ｎｇ／μｌｇｐ３２（タグ無し）、および３００ｎｇ／μｌｕｖｓＹ（Ｎ）を含んだ。溶液は２時間３７℃でインキュベートした。この場合も、増幅を達成するのにｕｖｓＹ（Ｎ）の必要性があった。さらに、この実験は、最小の量のｇｐ３２が必要であることを示す。この実験では、８０〜１６０ｎｇ／μｌｇｐ３２の種々のｇｐ３２濃度で、増幅なしから効率的な増幅へのはっきりした移行がもたらされた。ｇｐ３２の既知の結合部位のサイズ、オリゴヌクレオチドの長さ、およびその濃度の簡単な解析により、この濃度の上昇は、プライマーに対するｇｐ３２の化学量論以下のレベルから飽和レベルへの移行を表し得ることが示された。したがって、最も簡単な解釈は、ｇｐ３２が、放出鎖を収集および安定化させるために過剰のｇｐ３２を反応物中に有するために、オリゴヌクレオチドを飽和させることである。

図２７は、反応速度およびノイズに影響する要因を示す。高いｇｐ３２協同性は、リコンビナーゼフィラメント形成を抑制する（図２７Ａ）。また、ｕｖｓＹは、好ましくないｇｐ３２環境においてリコンビナーゼ負荷を増加させる機能を果たす（図２７Ｂ）。ＰＥＧは、協同できないｇｐ３２の機能を補助する（図２７Ｃ）。反応速度は、リコンビナーゼ活性およびｇｐ３２の有効性の両方によって影響される（図２７Ｄ）。侵入後反応期は、協同性ｇｐ３２の存在下で増強される（図２７Ｅ）。協同性ｇｐ３２は、反応ノイズを消すのに有効である（図２７Ｆ）。

ｇｐ３２、ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、およびＰＥＧの予測された効果および相互作用により、結論とともに、反応速度とノイズ間の最適な均衡が達成されなければならないことが示唆された。ｇｐ３２の協同性の程度を図の上側に示す。高い協同性は、単鎖ＤＮＡへの効率的な結合に好都合であり、これは、好ましくないプライミング挙動を抑制することにより反応ノイズを有意に抑制した。高い協同性はまた、組換えおよびＤＮＡ合成中の放出鎖の安定化に好都合である。逆に、高い協同性のｇｐ３２は、リコンビナーゼに負荷された検索フィラメントを乏しくし、反応速度に大きく影響し得る。

この挙動は、ｕｖｓＹを反応物中に含めることにより一部解消される。しかしながら、これにより、所望のとおりに高い負荷速度が得られるか否かは、まだ調べる余地がある。協同性が低い修飾されたｇｐ３２タンパク質が使用され得る。また、ｇｐ３２タンパク質およびｕｖｓＸタンパク質の協同性は、ＰＥＧを含めることによって影響され得る。また、ＰＥＧは、反応物の他の成分、例えば、ＤＮＡハイブリダイゼーション挙動およびポリメラーゼ合成能力などに有益な結果を有し得るが、時には有害な結果を有し得る。最適な速度は、リコンビナーゼ負荷とｇｐ３２機能の均衡が達成される必要があり得るので、表示したように、両端から離れた数個の位置で得られ得る。

図２８は、ＰＥＧの効果を示す。ＰＥＧは、ｇｐ３２（Ｃ）の存在下でのｕｖｓＸ媒介性線状ラン−オン実験において線状侵入／ラン−オン産物の平均長を減少させることができた。およそ３００塩基対の大腸菌ＲｕｖＢのＥｃｏＲＶ断片の末端に標的化させたＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏオリゴヌクレオチドを用いた線状ラン−オン実験の結果を示す。この断片は、開示した実験全体を通して使用し、図の右側に概略的に示す。反応物は、８ｍｇのＵｖｓＸ（Ｃ）により、最終反応容量の３０ｍｌで、ｇｐ３２（Ｃ）の存在下で、場合によっては、種々の量のＵｖｓＹ（Ｎ）またはＵｖｓＹ（Ｃ）の存在下で再構成した。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ酢酸塩、２７ｍＭクレアチンリン酸、１Ｕクレアチンキナーゼ、０．４μＭＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ、３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、５０Ｕクレノウ断片、１Ｕニワトリミオキナーゼ、８μｇｕｖｓＸ（Ｃ）、７．５μｇｇｐ３２（Ｃ）または８．８μｇｇｐ３２（Ｎ）、および０．５ｐモル鋳型を含んだ。最終容量は３０μｌとした。溶液は２時間３７℃でインキュベートし、２μｌの溶液を各レーンにロードした。

ＰＥＧの非存在下では、多重侵入／ラン−オンサイクルは、各鋳型上で起こったようであり、有意な量の完全長産物の生成が見られた。しかしながら、さらに多くの量のわずかに短い断片が生成され、本発明者らは、これが、自身で折りたたまれ、短いヘアピンを合成し得たわずかに短いラン−オンを構成すると考える。本発明者らは、すべてのバンドが完全伸長を達成しなかった真の侵入／伸長反応の数個の形態に起因して、完全長ではないと解釈した。ＵｖｓＹ（Ｎ）およびＵｖｓＹ（Ｃ）は、ともに形成された産物の量をある程度刺激した。ＰＥＧがない場合、ＵｖｓＹ（Ｃ）は、ＵｖｓＹ（Ｃ）よりも有効なようである。これは、本発明者らが得た他の幾何級数的な増幅データとは対照的であり、ＵｖｓＹ（Ｎ）のみが効率的な幾何級数的な増幅を補助したことを示す。

最も顕著には、ＰＥＧを含めることは、大腸菌ｒｅｃＡでの発見とは反対に、このゲル上での産物の全体的な量を減少させるようであった。また、産物の平均長の分布も減少した。これを説明するため、本発明者らは、この条件下でのｇｐ３２（Ｃ）の協同性（おそらく、既に最大）はＰＥＧによって増大され得ないが、ＵｖｓＸにより増大され得ることを示す。したがって、比較的過剰な活性のＵｖｓＸの挙動は、放出鎖上への迅速な負荷、再侵入、および新たに合成される鎖を追跡し、これをより容易に置換する効率的な「バブル（ｂｕｂｂｌｅ）移動」をもたらす。したがって、平均産物長は有意に減少する。

図２９は、ＤＮＡ末端指向侵入を示す。末端−標的化およびオリゴヌクレオチド突出端を用いる初回の侵入／合成を示す（図２９Ａ）。さらなる約１０〜１５残基（５’末端）および約３０残基（３’末端）は、鎖交換の最小の要件に近い（図２９Ｂ）。侵入が起こり、その後、非拘束放出鎖の解放、およびバックファイヤー合成が起こる（図２９Ｃ）。鎖交換を完了させるのに充分被覆された大部分の核タンパク質フィラメントは、放出鎖の完全な非拘束解放を触媒する（図２９Ｄ）。後続のラウンドの侵入／合成が起こる（図２９Ｅ）。核タンパク質フィラメントは、標的の末端で交換をほとんど行わないか、または全く行なわない（図２９Ｆ）。１個のｇｐ３２分子が提供されるか、または提供されない（図２９Ｇ）。この後、リコンビナーゼ負荷（図２９Ｈ）および分枝点移動（図２９Ｉ）が続く。

この図は、最初、線状標的鋳型に対する突出端を有する標的化オリゴヌクレオチドが、、鎖交換を行なうための第１の試み、次いで、後続の試みにおいて、どのような挙動を示し得るかを示す。このモデルの目的は、かかる状況が実験的に再構成された場合、第１と後続の侵入間に有意な差があることを示すデータを合理化することである。図の上部は、異なる５’伸長部のカバーを示すリコンビナーゼ負荷されたオリゴヌクレオチドフィラメントを示す。５→３’方向の合成は、まさに３’末端への被覆を有するはずであることを意味する。図に示すように、オリゴヌクレオチドはすべて、最初の標的に対する５’突出端を有する。

リコンビナーゼが、検索オリゴヌクレオチドを鎖交換に関与する配列よりもさらに５’伸長部まで被覆する可能性が高いので、最初の侵入事象は放出鎖の完全な解放をもたらし得る。いったん、放出鎖が遊離されたら、放出鎖はトポロジー的に拘束されず、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質（おそらく、比較的乏しい協同性を有するものさえ）によって容易に安定化され得る。さらにまた、安定性は、二本鎖ＤＮＡの３’末端まで伸長して標的化オリゴヌクレオチドのまさに５’末端に相補的な鎖を生成させるポリメラーゼによってももたらされる。本発明者らは、この合成をバックファイヤー合成とよぶ。バックファイヤー合成の結果として、任意の後続の侵入により、伸長された鋳型と整列する。

このような環境下では、大部分のオリゴヌクレオチドは、リコンビナーゼにより、それらのまさに５’末端まで完全に被覆されていない。場合によっては、オリゴヌクレオチドの５’部分を被覆する１種類以上のｇｐ３２分子が存在し得る。このようなオリゴヌクレオチドが鎖交換を現在伸長された標的上で行なう場合、放出鎖は、すぐに遊離されにくい。結果として、この事象は、最初は、既に図６に示したトポロジー的に拘束された事象に類似する。このモデルは、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質の協同性が充分でありさえすれば、このような歪んだ不安定な中間体が、ある程度限定的な期間存在し得ることを示す。図の下部において、本発明者らは、このような不安定な中間体に対して何が起こり得るかを追究する。

シナリオ１では、オリゴヌクレオチドの未交換５’伸長部は、標的の対応する二本鎖部分による分枝点移動を受ける。これは、放出鎖のこの部分の完全な解離を容易にもたらし得、これは、次いで、急速に回転し、あらゆる応力を解放し、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質によって安定化され得る（第１の侵入において起こるように）。このような現在安定な基質は、ポリメラーゼ伸長に理想的で比較的安定な集合体である。あるいはまた、シナリオ２では、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質が放出鎖から分解され、分枝点移動が、シナリオ１と反対方向に進行し、その結果、侵入ＤＮＡが放出される。シナリオ３では、放出鎖は、リコンビナーゼで被覆された状態になり、再侵入し、オリゴヌクレオチドの放出がもたらされる。このプロセスは、別途記載のバブル移動のプロセスに類似する。リコンビナーゼが遊離放出鎖上にシナリオ１で負荷される場合、バブル移動もまた、起こり得る。本発明者らは、図２８に示すようなバブル移動の存在を考慮することにより、最も容易に承諾される実験データを有する。

図３０は、複合体試料におけるＲＰＡを示す。この実験では、本発明者らは、ＲＰＡの感度、およびＤＮＡ末端がＲＰＡ反応において複合体ＤＮＡ標的上に必要であることを調べた。ＤＮＡ配列の概略図を示す。これは、ヒトアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遺伝子の一部に対応する。３つの異なる組合せのプライマーを用いた。この実験では、ｕｖｓＸ（Ｃ）、ｕｖｓＹ（Ｎ）およびｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａの混合物を使用した。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ酢酸塩、２７ｍＭクレアチンリン酸、１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ；３００ｎＭＵｐ３プライマー；３００ｎＭＤｏｗｎ１、２、または３プライマー；３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、１０％ＰＥＧ１４５０、５０Ｕクレノウ断片、１０Ｕニワトリミオキナーゼ、３００ｎｇ／μｌｕｖｓＸ（Ｃ）、３００ｎｇ／μｌｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａ、および５０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ（Ｎ）を含んだ。最終容量は３０μｌとした。溶液を５時間３７℃でインキュベートした。反応産物を電気泳動によりアクリルアミドゲル上で分離し、ナイロン膜に移し、特有の内部配列を認識するビオチン化オリゴヌクレオチドで探索した。

ＲＰＡ反応では、非切断鋳型（ゲノムＤＮＡ）および切断鋳型を比較し、プライマー対を比較した。予測したサイズの断片を検出した。すべての場合で、ゲノムＤＮＡを反応に添加しなかった場合、特異的産物はなかったが、ＤＮＡ（ほぼ１０，０００コピーの任意の配列に相当）を添加した場合、特異的産物が生成された。ＲＰＡ前でのＤＮＡのＨｐａＩＩによる消化は、オリゴヌクレオチドの１つと重複する少なくとも１つの末端の生成、およびシグナル強度の増加をもたらした。しかしながら、ＲＰＡが起こるためにＨｐａＩＩ消化が、必ずしも必須ではなかった。

図３１は、ＲＰＡ感度を示す。この実験では、本発明者らは、複合体ＤＮＡ標的に対するＲＰＡ反応の感度を調べた。ヒトアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遺伝子の一部に対応するＤＮＡ配列の概略図を示す。３つの異なる組合せのプライマーを用いた。この実験では、ｕｖｓＸ（Ｃ）、ｕｖｓＹ（Ｎ）およびｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａの混合物を使用した。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ酢酸塩、２７ｍＭクレアチンリン酸、１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ；３００ｎＭＵｐ３プライマー；３００ｎＭＤｏｗｎ１、２または３プライマー；３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、１０％ＰＥＧｌ４５０、５０Ｕクレノウ断片、１０Ｕニワトリミオキナーゼ、３００ｎｇ／μｌｕｖｓＸ（Ｃ）、３００ｎｇ／μｌｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａ、および５０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ（Ｎ）を含んだ。最終容量は３０μｌとした。溶液を５時間３７℃でインキュベートし、プローブＡＣＥ−ｈｙｂを使用した。反応産物を電気泳動によりアクリルアミドゲル上で分離し、ナイロン膜に移し、特有の内部配列を認識するビオチン化オリゴヌクレオチドで探索した。予測したサイズの断片が検出された。すべての場合で、ゲノムＤＮＡを反応に添加しなかった場合、特異的産物はなかったが、充分なＤＮＡを添加した場合は、特異的産物が生成された。すべての場合で、有意なシグナルを生成させるのに１０００コピーで充分であり、一例において、本発明者らは、非常にかすかなシグナルを１００コピーで検出することができた。

図３２は、ＲＰＡ感度および鋳型依存性アーティファクトを示す。本発明者らが、複合体ＤＮＡ標的に対するＲＰＡ反応の感度を調べた実験の結果を示す。ヒトアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遺伝子の一部に対応するＤＮＡ配列の概略図を示す。増幅の時間経過を、反応試料を１時間、２時間および３時間に採取して行なった。反応産物は、増幅に使用したオリゴヌクレオチドの一方の５’末端に結合されたビオチン残基の存在によって検出された。このようにして、このオリゴヌクレオチドが関与するすべての反応産物（生じ得る任意のアーティファクトを含む）を可視化することが可能であった。本発明者らは、数個の異なる濃度のｕｖｓＹ（Ｎ）タンパク質を試験した。反応溶液は、１０ｍＭＭｇ酢酸塩、２７ｍＭクレアチンリン酸、１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ；３００ｎＭＵｐ３プライマー；３００ｎＭＤｏｗｎ１プライマー；３ｍＭＡＴＰ、２００μＭｄＮＴＰ、１０％ＰＥＧ１４５０、５０Ｕクレノウ断片、１０Ｕニワトリミオキナーゼ、３００ｎｇ／μｌｕｖｓＸ（Ｃ）、３００ｎｇ／μｌｇｐ３２（Ｃ）、および５０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ（Ｎ）を含んだ。最終容量は３０μｌとした。溶液を５時間３７℃でインキュベートした。５０ｎｇ／μｌのｕｖｓＹ（Ｎ）濃度では、本発明者らは、かすかであるにもかかわらず、３時間のインキュベーション後、正確な産物を直接検出した。この期間中、オリゴヌクレオチドのほぼ２倍の長さのバンドの強い蓄積がみられ、これは、鋳型を含まない試料において同様に蓄積された。これは、おそらくプライマーアーティファクトによるものであった。

図３３は、どのようにしてプライマーアーティファクトが生じ得るかを示す。プライマーアーティファクトは、ここに示した誤った自己プライミング事象によって開始する可能性がある。プライマーは、図３３Ａにおいて生じるようにヘアピンを形成し得るか、または、図３３Ｂにおいて生じるように別のプライマーにハイブリダイズし得る。ポリメラーゼがかかるヘアピンを伸長し得る場合、Ａ＊およびＢ＊に見られるような有意なストレッチの二本鎖ＤＮＡが形成され得る。このような構造は、他のリコンビナーゼ負荷フィラメントの標的となり、真の標的由来の活性なフィラメントを漸増させ、おそらく、それ自体の増幅の幾何級数的な形態になり得る。

図３４は、プライマーアーティファクトの抑制を示す。プライマーアーティファクトノイズを抑制するための数例のストラテジーを概略的に示す。図３４Ａでは、標的化オリゴヌクレオチドの３’配列に相補的な別の短い３’がブロックされたオリゴヌクレオチドを反応物中に含め、誤ったプライミングをもたらし得る二次構造形成の形成に関して競合させる。図３４Ｂおよび３４Ｃでは、同様の短いブロックされたオリゴヌクレオチドを、（Ａ）のようにして使用しているが、この場合、共有結合が、標的化オリゴヌクレオチドの５’末端と競合する短いプライマーの５’または３’末端との間で操作されている。このようにして、ブロックされたヌクレオチドの５’末端は、標的化オリゴヌクレオチドの５’末端へつながれる（図３４Ａ〜Ｂ）。図３４Ｄでは、標的化オリゴヌクレオチドの３’領域に相補的な短い配列を、標的化オリゴヌクレオチドの５’領域へ付加する。これは、二次構造形成に関して効率的に競合する。

図３５は、被置換鎖の自己プライミングを刺激するためのヘアピンオリゴヌクレオチドの使用を示す。自己プライミングによる増幅を刺激するために、その３’部分に対する完全な相補性を有する５’部分を含むように設計されたオリゴヌクレオチドが、どのように使用され得るかを示すスキームを示す。図の上面に、Ａと指定する標的ＤＮＡを示す。これは、図の左上および右上に示す２つの標的化オリゴヌクレオチドの一方の標的である異なる末端を有する。このようなオリゴヌクレオチドはともに、それらの５’と３’領域間で相補性を有する（短い矢印で示す）。標的Ａは、これらのオリゴヌクレオチド、およびこれらのオリゴヌクレオチドの最も５’側の領域を欠く最初の標的による先の侵入／伸長事象によって生成され得る。図の左側または右側に、それぞれ左または右のプライマーによる標的化によって開始される侵入／伸長事象の結果を続ける。この結果は、最終生成物がわずかに異なる配列であるにもかかわらず、両方の場合で類似する。

図の左側に着目すると、本発明者らは、標的Ａを、左プライマーによる侵入および伸長に供すると、Ａと同一である新たな二本鎖と、最初の標的の上部鎖に相当する単鎖ＤＮＡ（Ｂと指定する）の形成という結果が得られることを観察する。まさに３’領域と隣接配列との相補性の存在により、Ｂはヘアピンを形成することができ、これは、ＤＮＡ合成をプライミングし、主に二本鎖産物であるＣを生成させる。産物Ｃは、再度、左オリゴヌクレオチドによって容易に標的化され得る。しかしながら、この場合、単鎖被置換鎖は形成されない。代わりに、元の標的のほぼ２倍の長さを有する産物Ｄが形成される。この産物は、逆反復配列であり、左オリゴヌクレオチドの標的である２つの配列、および右オリゴヌクレオチドの標的であって中央に位置する１つの配列を含有する。

後続の侵入／伸長事象、被置換鎖間での考えられ得るハイブリダイゼーション事象の発生は、さらに拡大されるかかる「二量体」種、および一般的により複雑な産物の形成を容易にもたらし得る。同様の過程の事象を図の右側に示すが、これは、右プライマーによる侵入／伸長によって開始される。最終二量体産物であるＤ’は、２つの末端配列が右プライマーの標的であり、中心領域が左プライマーの標的であるため、Ｄに相当しない。ここに示したものと類似または同一であるプロセスは、ある程度の頻度で、一部の条件下、オリゴヌクレオチドがこれを助長するように計画的に設計しなくても、起こりやすい。それは、多くの場合、単鎖ＤＮＡのある程度限定的な自己プライミング能力があるからである。

図３６は、プライマーアーティファクトをほとんど含まないか、または全く含まないＤＮＡの増幅を補助する条件を示す。本発明者らが複合体ＤＮＡ標的に対するＲＰＡ反応の感度を調べた実験の結果を示す。ヒトアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遺伝子の一部に対応するＤＮＡ配列の概略図を示す。使用したオリゴヌクレオチドは、ビオチン化Ａｎｇｉｏｌｂｉｏプライマー、および非ビオチン化Ａｎｇｉｏ３プライマー（その配列を実験方法に示す）である。これらのプライマーは、１３２ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。非切断ヒトゲノムＤＮＡを、４５コピーから２８８０コピーまで漸増させた。反応産物は、増幅に使用したオリゴヌクレオチドの一方の５’末端に結合されたビオチン残基の存在によって検出された。このようにして、このオリゴヌクレオチドが関与するすべての反応産物（生じ得る任意のアーティファクトを含む）を可視化することが可能であった。

反応物は、クレノウｅｘｏ−の場合は２時間３７℃でＢｓｔポリメラーゼの場合は２時間４２℃でインキュベートした。反応には、以下の：５０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ（Ｎ）、３００ｎｇ／μｌｇｐ３２（Ｃ）、１００ｎｇ／μｌｕｖｓＸ（Ｃ）、２０ｍＭクレアチンリン酸、３ｍＭＡＴＰ、２５ミリユニット／μｌミオキナーゼ、１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ、２００μＭｄＮＴＰ、５％ｗ／ｖＰＥＧ化合物、３００ｎＭＡｎｇｉｏｌｂｉｏプライマー、３００ｎＭＡｎｇｉｏ３プライマー、８００ｎｇ／μｌクレノウｅｘｏ−または１．２ユニット／μｌＢｓｔポリメラーゼを含めた。クレノウ媒介性増幅は、２０ｍＭＴｒｉｓ酢酸塩ｐＨ７．９、８ｍＭ酢酸マグネシウム、１２０ｍＭ酢酸カリウムの最終組成を含有するＵ２バッファー中で行なった。Ｂｓｔポリメラーゼ媒介性増幅は、２０ｍＭＴｒｉｓ酢酸塩ｐＨ７．５、６ｍＭ酢酸マグネシウム、１００ｍＭ酢酸カリウムの最終組成のを含有するＵｌバッファー中で行なった。

（実施例１３：ポイントオブユーズ（ｐｏｉｎｔｏｆｕｓｅ）適用のためのＤＮＡ増幅）
クローンおよびタンパクは、上記の実施例１１に記載のようにして作製した。

ＲＰＡ反応に使用したＤＮＡ
本発明者らは、この研究において、数個の異なる標的ＤＮＡおよび多数のオリゴヌクレオチドを使用した。オリゴヌクレオチドの配列を以下に示し、実験での鋳型標的を図３９Ｂに示す。大腸菌ＲｕｖＢ遺伝子標的を線状ラン−オンアッセイに使用した（図３９Ｂ）。この断片を含有する同量のプラスミド鋳型を、ＥｃｏＲＶ（ほぼ３００ｂｐ断片を放出する）または、ＣｌａＩ（ＤＮＡを線状化する）のいずれかで切断した。等モル量の鋳型を、ラン−オン実験に使用した（２０ｎＭの各鋳型）。この鋳型のＫｐｎＩ／ＣｌａＩ断片の配列を以下に示す。ＥｃｏＲＶ断片はこの配列内に組み込まれており、その部位を強調する。

オリゴヌクレオチドＴｅｓｔｅｒ３ｂｉｏ配列。標的に相同な塩基は太字である。

ヒトＤＮＡ
本発明者らは、数個の供給源由来のヒトゲノムＤＮＡを使用した。Ｐｒｏｍｅｇａ製の混合集団の男性ゲノムＤＮＡを利用した。また、男性個体試料由来のＤＮＡを図３８Ａにおいて試験した。個体１および２は父と息子であった。個体２のＤＮＡを、図３９Ｅの実験に使用し、図３９Ｆの実験についてのＤＮＡは別の男性個体であった。ヒトおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの配列の増幅に使用したオリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りである：

標準的なＲＰＡ反応の条件は：５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．４、８０ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭＤＴＴ、５％ＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ）、３ｍＭＡＴＰ、２０ｍＭクレアチンリン酸、１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ、６００ｎｇ／μｌｇｐ３２；１０９ｎｇ／μｌ、または１２５ｎｇ／μｌ、または２００ｎｇ／μｌｕｖｓＸ；１６ｎｇ／μｌ、または２５ｎｇ／μｌ、または４０ｎｇ／μｌ、または６０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ；２０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ、２００μＭｄＮＴＰ、および３００ｎＭの各オリゴヌクレオチドを含んだ。反応条件Ｃ１〜Ｃ４は上記され、そして以下の通りである：Ｃｌ＝１０９ｎｇ／μｌｕｖｓＸ、１６ｎｇ／μｌｕｓｖＹ；Ｃ２＝１２５ｎｇ／μｌｕｖｓＸ、２５ｎｇ／μｌｕｖｓＹ；Ｃ３＝２００ｎｇ／μｌｕｖｓＸ、４０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ；Ｃ４＝２００ｎｇ／ｍｌｕｖｓＸ、６０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ。

実験結果
図３７は、ＲＰＡ法の概略図を示す。図３７Ａ（ｉ）では、リコンビナーゼタンパク質ｕｖｓＸは、ＡＴＰの存在下で、単鎖オリゴヌクレオチドに協同的に結合する。核タンパク質フィラメントは、ＡＴＰをＡＤＰに活発に加水分解する。自発的な分解は、単鎖結合タンパク質ｇｐ３２の競合的結合をもたらし得、ｕｖｓＹタンパク質およびポリエチレングリコールによって、これは抑制され、再負荷が助長される。図３７Ａ（ｉｉ）では、相同なＤＮＡが検出された場合、リコンビナーゼフィラメントが鎖交換を触媒する。図３７Ａ（ｉｉｉ）では、鎖交換により、検索鎖がその相補鎖とマッチングされ、鎖を置換し、次いで、ｇｐ３２に結合される。リコンビナーゼが分解する。図３７Ａ（ｉｖ）では、ポリメラーゼが該構造に接近し、オリゴヌクレオチドを伸長させ、一層多くの元の鎖が置換される。図３７Ｂ（ｉ）では、２つの対向する標的化核タンパク質複合体が、それらのそれぞれの標的と再結合し、ＤＮＡ合成が開始される。図３７Ｂ（ｉｉ）では、ポリメラーゼ複合体が互いに出合い、ポリメラーゼの一方が解離する。図３７Ｂ（ｉｉｉ）では、残ったポリメラーゼが合成を継続し、２つの親鎖を遊離させ、ポリメラーゼは、遊離３’末端に再結合し、したがって、両方の鎖の複製が起こる。図３７Ｂ（ｉｖ）では、新たな標的化事象が起こる。第２のラウンドでは、標的化プライマーの一方が遊離末端を置換する。図３７Ｃでは、ＤＮＡ末端または組み込まれたＤＮＡ配列での鎖交換の産物の比較。

図３８Ａは、７つの独立したマーカーに対するプライマー対を用いた２つの個体（１および２、父と息子）由来のＳＴＲマーカーの増幅の結果を示す。ＲＰＡ条件Ｃ４を使用した（上記参照）。図３８Ｂは、インビトロ増幅を補助する濃度を決定するための反応成分の漸増を示す。反応物には、プライマーＳＲＹ３およびＳＲＹ４を０．３μＭ（ＳＲＹ遺伝子を標的化）、８０ｍＭ酢酸カリウム、５０ｍＭＴｒｉｓＣｌｐＨ８．４、２ｍＭＤＴＴ、５％Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ、２００ｎｇ／μｌｕｖｓＸ、６０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ、６００ｎｇ／μｌｇｐ３２、２０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ、および５０コピー／μｌＹ染色体ＤＮＡを含めた。ただし、所与の成分が研究中である場合は除く。この特定の産物の有効な増幅に最適な量のｇｐ３２、ＡＴＰ、ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、ＰＥＧ、およびＢｓｕポリメラーゼを調べた。ＡＴＰ−γ−ＳおよびＡＤＰ−β−Ｓは反応を阻害した。

図３９Ａは、ＲＰＡ反応のサイズ限界を示す。プライマーＡｐｏＢ４を、表示したサイズの増幅産物を生成することができる対向するプライマーと組合せた。１０９ｎｇ／μｌｕｖｓＸおよび１６ｎｇ／μｌｕｖｓＹを使用したＣｌ以外は、１２５ｎｇ／μｌｕｖｓＸおよび２５ｎｇ／μｌｕｖｓＹ（Ｃ２）の条件を使用した；１５コピー／μｌヒトＤＮＡを使用した（３０μｌの反応物）。Ｃ２条件下、いくらかのヘアピン媒介性産物複製が起こり、３００ｂｐアンプリコンの一部は、２×および３×単位長さ（^＊）に変換された（Ｌ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｄ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，ＪＭｏｌＢｉｏｌ２０６，１９−２７（Ｍａｒ５，１９８９））。

図３９Ｂは、組み込まれた配列または末端配列からの伸長効率を示す。ビオチン化プライマーを、線状化されたプラスミドＤＮＡとともにインキュベートした。ＣｌａＩ（レーン３）またはＥｃｏＲＶ（レーン１および２）のいずれかで線状化した鋳型を等量（２０ｎＭ最終）使用した。プライマーは、切断末端または組み込まれた標的部位のいずれかと重複した（レーン３）。クレノウを含む（レーン２および３）か、または含まない（レーン１）リコンビナーゼ標的化成分とのインキュベーションにより、組み込まれた部位からの限定的な伸長（産物１^＊）、および末端部位からの十分な伸長（産物２^＊）が示される。電気泳動産物をナイロンに移し、化学発光によってビオチンを検出した。弱い共通のバンド（約３００ｂｐ、レーン１および３）は、この特定のプロトコルに起因するアーティファクトであった。

図３９Ｃは、ＲＰＡ反応の感度を示す。表示したコピー数のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムを、２００ｂｐ断片を増幅するオリゴヌクレオチドＢｓＡ１およびＢｓＢ３により増幅した。条件Ｃ１を使用した。図３９Ｄは、３００ｂｐ断片をもたらすプライマーＡｐｏＢ４およびＡｐｏ３００により増幅した、表示したコピー数のヒトＤＮＡを示す。条件Ｃ２を使用した。図３９Ｅ、Ｆは、単一の個体由来のヒトＤＮＡの結果を示す。ＤＮＡを希釈し、表示したコピー数を理論的に含有する試料を、プライマーＤ１８Ｓ５１５’および３’（これらは、約３００〜３６０ｂｐのサイズのＳＴＲを増幅する）により増幅した。予測したコピー数２または３では、多数の試料で単一の対立遺伝子（^＊）が増幅された。使用した条件は、（Ｅ）ではＣ２および（Ｆ）ではＣ４であった。

図４０は、ＲＰＡ反応の特異性を示す。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡ由来の３８０ｂｐ断片を増幅するプライマーＢｓＡ３およびＢｓＢ３を１μｇのヒトＤＮＡとともに、１００コピーのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＤＮＡの添加（＋）してか、または添加せず（−）にインキュベートした（図４０Ａ）。星印は予測された反応産物の位置を示し、矢印はゲノムＤＮＡの位置を示した。条件Ｃ３を使用した。ＲＰＡが検出可能な反応産物を生成するのにどのくらいの時間を要するのかを調べるため、一連の増幅反応を、３４５ｂｐ断片を生成するオリゴヌクレオチドＡｐｏ６００ｂｉｏおよびＡｐｏ３００ｒｅｖを用いて確立した。６０コピー／μｌ（図４０Ｂ）または６コピー／μｌ（図４０Ｃ）のコピー数を用いた。個々の反応は、表示した分間で停止させ、ゲル上で解析した。条件Ｃ４を使用した（図４０Ｄ）。

反応成分の長期保存のため、本発明者らは、ＲＰＡ反応を凍結乾燥した。反応成分の混合物を、表示した成分、ＰＥＧおよびバッファーの非存在下で合成した。物質を凍結乾燥し、次いで、ＰＥＧおよびバッファーならびにさらに省略した成分により再構成した。使用したプライマーを示す。ＰＥＧおよびバッファー以外のすべての成分は凍結乾燥され得、機能的反応において成功裏に再構成された。標的ＤＮＡは、１５０コピー／μｌのヒト男性ゲノムＤＮＡであった（図４０Ｅ）。ヒトゲノムＤＮＡ内の３つの独立した遺伝子座を標的化するオリゴヌクレオチドを、表示されるように、２５塩基、２８塩基または３２塩基の重複プライマー対とともにインキュベートした。３２塩基長のプライマーのみ、成功裏に標的を増幅した。他の実験は、３０残基のプライマーもまた、標的ＤＮＡの増幅に有効であることを示す。

図４１は、低標的コピー数でのプライマーノイズを示す。

２つのプライマー、ＢｓＡ１およびＢｓＢ３

（これらは、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムのほぼ３００ｂｐ断片と隣接している）を、水で連続希釈したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡとともにインキュベートした。使用した条件は、８０ｍＭ酢酸カリウム、５０ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ８．４、２ｍＭＤＴＴ、５％Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ、２００μＭｄＮＴＰＳ、３ｍＭＡＴＰ、２０ｍＭクレアチンリン酸、５０ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ、３００ｎＭの各オリゴヌクレオチド、８００ｎｇ／μｌｇｐ３２、１２０ｎｇ／μｌｕｖｓＸ、２５ｎｇ／μｌｕｖｓＹ、および２８ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼであった。反応物を、９０分間３７℃でインキュベートした。産物を２．５％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色した。矢印は、正確なアンプリコンの予測された位置を示す。

図４２は、フォワードおよびリバースプライマー候補の選択と、きわめて低い開始コピー密度での結果の試験を組み合わせることによる、最適プライマーの選択を詳述する。

数個のプライマー対を、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子形成遺伝子座ＳｐｏＯＢ内の配列に設計した。このようなプライマーの位置および配置を（Ｂ）に以下のとおりに示す：

これらのプライマーを（Ａ）に示したようにして組合せ、以下の条件で９０分間、３７℃にてインキュベートした：８０ｍＭ酢酸カリウム、５０ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ８．４、２ｍＭＤＴＴ、５％Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ、２００μＭｄＮＴＰＳ、３ｍＭＡＴＰ、２０ｍＭクレアチンリン酸、５０ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ、３００ｎＭの各オリゴヌクレオチド、８００ｎｇ／μｌｇｐ３２、１２０ｎｇ／μｌｕｖｓＸ、２５ｎｇ／μｌｕｖｓＹ、および２８ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ、約２コピー／μｌＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡ（連続希釈により概算した）。矢印は、サイズに基づいて予測される断片である、測定された産物の位置を示す。一部のプライマー対では産物が得られたが、スミアまたは数個のさらなるバンドを伴った。数個の組合せでは、予測したサイズの産物が得られなかった。プライマーＪ１およびＫ２では、かなりの量の予測したサイズの産物が得られ、ある程度明確であった。興味深いことに、Ｊ１に存在する最も５’側の４つの塩基を欠くＮＥＳＴ１プライマーを同等な反応においてＪ１と置き換えると、反応は改善されず、このことは、試験したすべてが３０残基長を超えるものであっても、塩基の付加および除去により、プライマー性能が改善され得ることを示す。

図４３は、どのようにしてプライマーノイズが生じるかの理論的考察を示す。
（Ａ）オリゴヌクレオチドを示し、その上部に矢印があり、矢印の先端は、オリゴヌクレオチドの３’末端を示す。配列を作製したが、最も３’側の５個の塩基のうち４個は、パリンドロームを形成した。このことは実際面では充分回避され得る。（Ｂ）大部分の初期事象は、３’末端が一過的にその５’配列に折りたたまれ、一過的にワトソンクリック塩基対を形成することから構成されることが推測される。（Ｃ）偶発的に、ポリメラーゼは、成功裏に完全にこの構造を伸長させて、一端でターン（Ｈで示す）を有する長い二本鎖ヘアピンをもたらす。配列および元の逆相補鎖の５’−３’方向を、うすい矢印で示す。（Ｄ）ストラテジー１では、同一の配列の第２のリコンビナーゼ被覆されたオリゴヌクレオチドが、ヘアピンの相同な二本鎖本体を標的化し、したがって、これをほぐすと推測される。この部分への相補鎖が工程Ｃで正しく生成されなかったため、ミスマッチが、侵入オリゴヌクレオチドの３’領域で起こる。４つの塩基対のパリンドロームが、偶然に生成されなかった場合、ミスマッチは、ここに示した場合よりさらにより深刻になり得る。（Ｅ）ごくまれにポリメラーゼが、この中間体のミスマッチ３’領域を伸長し得、中央部にミスマッチを有する逆反復配列を生成させる。この構造はまた、２つの同一のプライマーが短い３’重複部を形成して、プライマー二量体の形成をもたらす場合の産物に類似し得る。このような構造は、容易に幾何学位相（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｐｈａｓｅ）増幅に入り得ない。（Ｆ）ストラテジー２では、（Ｃ）で形成された長いヘアピンが一端で少し開かれる。一部の報告により、ｒｅｃＡがｄｓＤＮＡに結合して短い二本鎖の融解を促進し得ることが示されているため、ｄｓＤＮＡへのリコンビナーゼの結合によって、この工程は増強され得る。（Ｇ）一過的に融解された３’末端（オリゴヌクレオチドの元の５’末端に逆相補的）が、（Ｂ）と同様の様式で折りたたまれ、伸長可能な構造を形成する。（Ｈ）ポリメラーゼ伸長により、大きなヘアピンが作られる。この場合、一方の末端は、親オリゴヌクレオチドと同一の二本鎖配列を含有する。（Ｉ）別の親オリゴヌクレオチドが、完全な二本鎖標的に侵入する。（Ｊ）（Ｉ）のポリメラーゼ伸長により、表示した構造を有する大きな逆反復配列が生成する。両方の末端は、完全なプライマー標的部位を含有し、そのため、この構造は、指数関数的に増幅し得る。興味深いことに、逆反復配列構造は、侵入および伸長が一方の末端から起こると、被置換鎖は急速に自身で折りたたまれ、（Ｈ）に示す構造を形成する傾向を示すことを意味する。この産物は、構造（Ｊ）となるために別の組換え事象を必要とし、したがって、より高度な組換え活性が、特にノイズ増幅に好都合であることが起こり得、低い組換え活性によって強く妨害される。

図４４は、ＲＰＡ反応における信号対ノイズを改善するための、数例のオリゴヌクレオチド設計ストラテジーを示す。

オリゴヌクレオチド設計の局面によるＲＰＡ反応の信号対ノイズ比を改善するための、３つの一般的なストラテジーを示す。（１）連続的に短くなるオリゴヌクレオチドを試験し得る。オリゴヌクレオチドが連続的に５’末端から短くなることは、それぞれの核タンパク質フィラメントの活性の低下をもたらし、このことが、標的の倍増時間よりも、ノイズ性アーティファクトの倍増時間に急速に影響することを推測する。低活性核タンパク質フィラメントはまた、場合によっては、より活性なものと有効に組合せ得る。（２）ロックされた核酸または他の修飾糖をプライマーに含め得、その結果、増幅挙動に影響を与える。ロックされた核酸（ＬＮＡ）糖の構造を示す。（３）オリゴヌクレオチドの挙動は、５’残基（おそらく標的とは無関係）の付加によって改善され得、これは、スナップバック（ｓｎａｐｂａｃｋ）プライミングの抑制などの機構により、または核タンパク質組換え活性を改変することによりノイズを抑制する。配列は、ホモポリマーストレッチなどであり得る。理想の配列は、実験的に決定され得る。

図４５は、プライマー長の縮小の結果を示す。

（Ａ）実験設計の概略的説明。オリゴヌクレオチド対を、３つのヒト標的に対して合成し、最も５’側の残基を連続的に欠失するプライマーセットを作製した。（完全長プライマーは上記に示した：

より短いプライマーは、最も５’側塩基を欠失させ、表示した最終の長さを得ることにより作製した）。同一の長さのプライマー対を、増幅反応物中で、表示したように組み合わせた。（Ｂ）増幅反応は、開始反応物中に５０コピー／μｌで存在するヒトゲノムＤＮＡにより行なった。３つの標的、ＳＴＲマーカーＤ１８Ｓ５１ＩＩ、ヒトＳＲＹ遺伝子の一部、およびヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子座を、オリゴヌクレオチド対により増幅した。オリゴヌクレオチドを、（Ａ）に記載のように、５’末端から連続的に切断し、使用したプライマー対における両方のプライマーの長さは、それぞれのレーンの上部に示す。オリゴヌクレオチドを、３０残基よりやや長いものから、３０残基よりやや短いものにすると、増幅挙動にかなり急激な低下があることは明らかである。したがって、３０残基近辺の長さの多様性を有するオリゴヌクレオチドを比較することは、概して充分特異的だが、バックグラウンドがほとんどないか、または全くない増幅を得るための最適長が明らかとする可能性がある。例えば、２つの２９マーは、Ｄ１８Ｓ５１ＩＩ遺伝子座を増幅するのに充分であり明らかに増幅した。増幅条件は：５０ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ８．３、９０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭＤＴＴ、８０ｍＭ酢酸カリウム、２００μＭｄＮＴＰ、６００ｎｇ／μｌｇｐ３２、２００ｎｇ／μｌｕｖｓＸ、６０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ、３００ｎＭプライマー、２０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ、５０コピー／μｌゲノムＤＮＡ、９０分間３７℃であった。

図４６は、どのようにして３’ＬＮＡ残基がＲＰＡにおける増幅の挙動を改変するかを示す。

ヒトＡＣＥ遺伝子座の一部の増幅を、通常のオリゴヌクレオチドおよび最も３’側の残基がＬＮＡ糖を有する対応物の組合せを用いて示す。（Ａ）オリゴヌクレオチドプライマーの互いの関係の概略的な表示。ＬＮＡ１およびＤＮＡ１は、ＬＮＡ１がＬＮＡ糖を最も３’側の位置に含有する以外は同一である。また、ＬＮＡ２とＤＮＡ２も同様に異なる。

（Ｂ）ＲＰＡ反応物は、表示したオリゴヌクレオチドプライマー組合せにより合成した。標準的な反応条件下で、両方のオリゴヌクレオチドが３’ＬＮＡ含有する場合、産物レベルは有意に減少する。しかしながら、一方のみのオリゴヌクレオチドの置き換えは、反応をあまり大きく抑制しない（レーン２および３）。レーン３のバックグラウンドパターンはレーン４のものと類似するが、２では、これはほぼ存在しないことに注意されたい。これは、バックグラウンドが、主に単一のプライマー種の活性に由来することを示唆する。増幅条件は：５０ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ８．３、９０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭＤＴＴ、８０ｍＭ酢酸カリウム、２００μＭｄＮＴＰ、８００ｎｇ／μｌｇｐ３２、２００ｎｇ／μｌｕｖｓＸ、６０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ、３００ｎＭプライマー、２０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ、５０コピー／μｌゲノムＤＮＡ、１２０分間３７℃であった。（Ｃ）２つのＬＮＡ−修飾されたオリゴヌクレオチドが使用される場合、ポリメラーゼのレベルの増加は、確固とした活性の回復をもたらす。ＬＮＡ１およびＬＮＡ２、またはＤＮＡ１およびＤＮＡ２を、表示した濃度のポリメラーゼの存在下で合わせた。注目すべきことには、ＤＮＡプライマーは、使用した最低濃度で高い活性を示し、どちらかといえば、ポリメラーゼ濃度が増加すると、産物のロックはあまり良好でなくなったように見えた。また、５０〜１００塩基対の短い産物が顕著に見られる。逆に、ＬＮＡプライマーは、高いポリメラーゼ濃度でのみ、最適な活性であった。小さな産物はあまり見られず、予測したサイズ以外で見られたものは、関連する産物である可能性がある（下記参照）。増幅条件は：５０ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ８．３、９０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭＤＴＴ、８０ｍＭ酢酸カリウム、２００μＭｄＮＴＰ、８００ｎｇ／μｌｇｐ３２、２００ｎｇ／μｌｕｖｓＸ、６０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ、３００ｎＭプライマー、４３〜１４００ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ、１００コピー／μｌゲノムＤＮＡ、１２０分間３７℃であった。（Ｄ）ＬＮＡ−修飾されたオリゴヌクレオチドでは、標的が存在しない場合、バックグラウンドは、あったとしてもほとんどないが、反応条件を最適化すると、真の産物を高いレベルまで効率的に増幅する。２００ｎｇ／μｌのＢｓｕポリメラーゼのポリメラーゼ濃度を使用した。反応は、ＤＮＡプライマー対またはＬＮＡプライマー対により、標的の存在下または非存在下で行なった。予測したサイズのかすかなバンドが陰性対照において見られ、混入物の問題を示した。それでも、両方のプライマー対は、標的の存在下で効率的に増幅したが、その非存在下では、ＤＮＡ対は、有意なノイズ性スミアをもたらした。一方、ＬＮＡ対では、若干の混入物以外に産物はもたらされなかった。これは、ＬＮＡプライマー対が試料中の標的の存在と非存在を明確に識別し得るが、ＤＮＡプライマーは、標的の非存在下でプライマー由来の産物を生成することを示す。増幅条件は：５０ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ８．３、９０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭＤＴＴ、８０ｍＭ酢酸カリウム、２００μＭｄＮＴＰ、８００ｎｇ／μｌｇｐ３２、２００ｎｇ／μｌｕｖｓＸ、６０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ、３００ｎＭプライマー、２００ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ、５０コピー／μｌゲノムＤＮＡ、１２０分間３７℃であった。

図４７は、プライマーの５’末端へのホモポリマーのストレッチ付加が核タンパク質活性を改変し得ることを示す。
（Ａ）実験に使用した６個のオリゴヌクレオチドの配列を示す。Ｊ１およびＫ２オリゴヌクレオチドは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＳｐｏＯＢ遺伝子座（配列番号：６６および６９それぞれ）を標的化し、他に記載のオリゴヌクレオチドはこれらの誘導体であり、示されるように、シトシンまたはグアノシンのホモポリマーストレッチを保有する。このようなオリゴヌクレオチドは、対にしてインキュベートし、どのペアが最も効率的に標的を増幅するかを評価し得る。（Ｂ）６つのプライマーを単独またはすべての可能な組合せでインキュベートした結果を示す。反応物は、３７℃で２時間インキュベートした。反応条件は、５０ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ８．４、２ｍＭＤＴＴ、５％Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ、８０ｍＭ酢酸カリウム、２００μＭｄＮＴＰＳ、３ｍＭＡＴＰ、２０ｍＭクレアチンリン酸、５０ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ、３００ｎＭの各関連するオリゴヌクレオチド、８００ｎｇ／μｌｇｐ３２、１２０ｎｇ／μｌｕｖｓＸ、２５ｎｇ／μｌｕｖｓＹ、および２８ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ、約１コピー／μｌＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡ（連続希釈により概算した）（２０μｌ反応容量）であった。最適なプライマー対はＪ１＋Ｋ２であり、次にＪ１Ｃ＋Ｋ２Ｃであった。一般的に、ホモポリマーのシトシンストレッチは、核タンパク質フィラメントをより活性にし、グアノシンストレッチはあまり活性にしないようであった。

図４８は、ＲＰＡ反応に対するベタインの効果を示す。

増大濃度のベタインが各反応物中に存在するＲＰＡ反応を確立した。この実験では、０．５Ｍ以上のベタイン濃度は、増幅の程度を低下させた。０．７５Ｍでは、予測された産物バンドが依然として明白に目視可能であったが、一部の試料中に存在するスミアの大部分は抑制された。本発明者らは、信号対ノイズ比を改善するレベルのベタインが使用され得る可能性と一致して、スミアの低減は、産物の低減よりも大いに重要であると考える。増幅条件は：５０ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ８．３、９０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭＤＴＴ、８０ｍＭ酢酸カリウム、２００μＭｄＮＴＰ、６００ｎｇ／μｌｇｐ３２、２００ｎｇ／μｌｕｖｓＸ、６０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ、３００ｎＭのプライマーＡｐｏＢ４およびＡｐｏ３００（配列番号：２０および２１）、４０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ、２．５コピー／μｌゲノムＤＮＡ、１２０分間３７℃であった。

図４９は、異なる核タンパク質活性を有するオリゴヌクレオチドを伴なう組合せストラテジーを示す。
（Ａ）単一の反応入れ子ストラテジーを概説する。活性な核タンパク質フィラメントの外側対は、ＤＮＡを急速に増幅するが、このようなプライマーはまた、かなりノイズ性であり得る。外側プライマー対は、比較的低く、ゲルで検出可能なレベルの産物が達成し得ないような充分低い濃度で維持され得る。内側オリゴヌクレオチドは低活性であるが、はるかにノイズが少ない。このような内側オリゴヌクレオチドは高レベルで維持される。活性は、本開示において詳述しているように、長さ、組成およびバックボーン特性を変更することにより調整され得る。外側プライマーは試料中の標的を、例えば１００万倍の増幅により急速に富化する。低速だが明瞭な内側プライマーは、ノイズをほとんど／全く生じないが、感受性は低い。外側プライマーによる標的の富化は、適切な時間枠で低速の内側プライマーの作用による確固とした産物蓄積を可能にするのに充分である。（Ｂ）活性なプライマーと活性の低いプライマーとを組合せた増幅スキームを示す。活性なプライマーは、低い標的濃度でノイズに関与し得るが、低速オリゴヌクレオチドはアーティファクトに関与せず、そのため、プライマーの会合を反応の最後に試験した場合、標的が試料中に存在するか非存在であるかが明白に測定され得る。

図５０は、数例の検出プロトコルを示す。標的の増幅がゲル電気泳動の必要なく評価され得る３つの簡単なストラテジーを概略的に示す。すべての場合において、固相に結合され得、バルク反応体からのその分離を可能にし、洗浄され得るプライマーを利用する。図において、一方のプライマー上のビオチン残基は、これが固定化可能なプライマーであることを表すが、他の結合化学物質も使用され得る。（１）一方のプライマーは固定化可能であり、他方はいくつかの種類の標識、例えば、酵素を含有する。（２）増幅プライマーの一方がなんらかの様式で標識され、この固定化可能なプライマーが第３のプライマーであり、これは、主なアンプリコン内の配列を認識する。この第３のプライマーは、主な増幅中に反応環境中に存在し得るが、例えば、静的であるように設計してもよく（例えば、短くすることにより）、または反応の最後にのみ添加してもよい。（３）第３のプライマーを用いる。しかしながら、この場合、固定化可能なプローブは、増幅プライマーの一方と関連するが、反応の最後にアンプリコンを安定的に捕捉するのを可能にするさらなる５’残基を含有する。なぜなら、反応タンパク質が洗浄除去された場合、アンプリコン内の相補鎖の３’末端のポリメラーゼ伸長する（すなわち、「バックファイヤー」合成）が、分枝点移動に供されない安定な二本鎖を作る）からである。

図５１は、第３のプローブ富化ストラテジーを示す。：ビーズ捕捉パートＩ．第３のプローブが標的由来の真の産物富化する実験ストラテジーの概略
（Ａ）プライマー間の関係の概略的な表示。ＮＥＳＴ３−２８（ＧＧＡＴＧＡＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＴＡＡＡＧＧ−配列番号：７６）プライマーおよびＮＥＳＴ３−２６（ＡＴＧＡＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＴＡＡＡＧＧ−配列番号：７７）プライマー（これらは、プライマーＪ１およびＫ２（それぞれの上記される配列番号：６６および６９）によって生成される増幅配列に相同である）の中間に配置されるＰｓｔＩ制限酵素部位を示す。（Ｂ）Ｎ３−２６の５’−ビオチン化型の固定化の図示。これは、ストレプトアビジン被覆磁気粒子に結合させる。（Ｃ）捕捉実験のスキーム。オリゴヌクレオチドＪ１およびＫ２を溶液相中で、ビーズ上に固定化したＮ３−２６プライマーとともに合わせる増幅反応を確立する。反応物を９０分間インキュベートし２０分ごとに軽くたたいてビーズを分散させる。（これらは、５％ＰＥＧ反応溶液中できわめてゆっくり沈降する）。インキュベーション期間の最後に、磁石を用いてビーズを集め、上清みを除去して解析する。ビーズを２回素早く水で洗浄し、次いで、３０分間３７℃で、過剰のＰｓｔＩ酵素とともに適切なバッファー中でインキュベートする。再度、上清みを除去して解析する。

図５２は、第３のプローブ富化ストラテジーを示す：ビーズ捕捉ＩＩ．固相支持体上に固定化した低活性の核タンパク質フィラメントを第３のプライマーとして関与させ得ること、およびプライマーノイズ由来の標的アンプリコンを分離し得ることを示す実験結果。

（Ａ）プライマー間の関係の概略的な表示。Ｎ３−２８およびＮ３−２６プライマーの中間に配置されるＰｓｔＩ制限酵素部位を示す。（Ｂ）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＤＮＡの増幅は、２コピー／μｌの標的ＤＮＡの存在下（下側パネル）または非存在（上側パネル）下で行なった。レーン１は、サイズラダーを含有する。プライマーＪ１およびＫ２は、それらの標的を、数コピーの標的ゲノムＤＮＡの存在下で効率的に増幅する（下側パネル、レーン２）が、試料中の標的の非存在下では、上側パネルレーン２に示されるように、スミアを生じる。オリゴヌクレオチドＮ３−２８およびＮ３−２６は、Ｊ１に対して、わずかに３’側の配列に相同であり、同一のセンスである。Ｎ３−２８は２８マーであり、Ｎ３−２６は、Ｎ３−２８の最も５’側の２つの塩基を欠く２６マーである。Ｎ３−２８またはＮ３−２６とＪ１およびＫ２プライマーとの同時インキュベーションは、Ｊ１／Ｋ２産物、および予測されるＮ３−２８／Ｋ２またはＮ３−２６／Ｋ２産物（下側パネル、レーン３および４）に対応する２つの主産物の生成をもたらす。Ｎ３−２８を単独でインキュベートすると、ある程度スミアが生じるが、Ｎ３−２６を単独インキュベートすると、スミアは生じない。本発明者らは、Ｎ３−２６は、「静的な」オリゴヌクレオチドであり、産物を生成させるために、より活性なプライマーの伸長に由来する被置換鎖に対するハイブリダーゼーションに顕著に依存し得ると推測する。（Ｃ）図５１に概略的に詳述し、３０コピー／μｌの開始標的密度を用いて行なった実験の結果。レーン１：サイズマーカー。レーン２および３：標的なし（レーン２）またはあり（レーン３）で行なった完全に液相反応の産物（Ｎ３−２６を固定化しない）。これは、（Ａ）の上側および下側パネルのレーン４に大体相当する。レーン４および５は、それぞれ、標的なし、または標的ありで増幅インキュベーション後に除去された最初の上清みを含有する。予測されたとおり、標的含有反応物では産物が見られ、Ｎ３−２６プライマー（ビーズ上に固定化）の使用に由来する、より小さい産物は見られない。また、予期されたとおり、標的を含まない試料中ではスミアが生じる。レーン６および７は、洗浄したビーズのＰｓｔＩ消化後の上清みを含有する。興味深いことに、標的を含まない試料中にスミアは存在しない。しかしながら、標的試料中にはＤＮＡが存在する。ビーズから解放された産物は、予測されたＮ３−２６／Ｋ２産物（ＰｓｔＩによる切断により、レーン３のものよりわずかに高速の移動度）ならびに同時精製された非切断Ｊ１／Ｋ２産物を含むようである。かかる産物とビーズ固定化された産物およびオリゴヌクレオチドとの間でのハイブリッドの形成が起こり得るため、一部のＪ１／Ｋ２産物が同時精製されることは、おそらく驚くべきことではない。しかしながら、この物質が、明らかにＰｓｔＩ酵素によって切断されないことは、驚くべきことである。この奇妙な観察結果の理由は不明だが、これらの産物が、消化に対して抵抗性であるハイブリッド内に存在したこと、またはこのような産物の鎖の一方だけにニック形成をもたらしたことを示し得る。

図５３は、トレハロースが凍結乾燥物を安定化させ、緩衝化試料以外すべての成分が、少なくとも１０日間、室温で活性なままであることを可能にすることを示す。

ＲＰＡ反応物を、ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子座に特異的プライマーを用いて合成した。一般的には、最終反応組成は、５５ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ８．４、１ｍＭＤＴＴ、８０ｍＭ酢酸カリウム、５％Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ、２００μＭｄＮＴＰＳ、３ｍＭＡＴＰ、２０ｍＭクレアチンリン酸、１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ、３００ｎＭＡｐｏＢ４およびＡｐｏ３００オリゴヌクレオチド（それぞれ、配列番号：２０および２１）、６００ｎｇ／μｌｇｐ３２、２００ｎｇ／μｌｕｖｓＸ、６０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ、および１７ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ、約１６０コピー／μｌヒトゲノムＤＮＡとした。しかしながら、５５ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ８．４および８０ｍＭ酢酸カリウムは、凍結乾燥物中には含めなかったが、再構成中に、ＤＮＡ試料とともに添加して戻した。さらにまた、特定の成分を凍結乾燥物から除いた。詳細は、以下の通りである。条件Ａ：トレハロース使用なし、Ｃａｒｂｏｗａｘは試料ＤＮＡとともに添加（凍結乾燥物には含めない）、ポリメラーゼは試料ＤＮＡとともに添加。条件Ｂ：５０ｍＭトレハロースは凍結乾燥物に含める、Ｃａｒｂｏｗａｘは試料ＤＮＡとともに添加、ポリメラーゼは試料ＤＮＡとともに添加。条件Ｃ：５０ｍＭトレハロースは凍結乾燥物に含める、ポリメラーゼは試料とともに添加。条件Ｄ：５０ｍＭトレハロースは凍結乾燥物に含める、緩衝化試料ＤＮＡのみ再構成で添加。室温でベンチにおいて、特別な保存条件（例えば、乾燥剤の使用など）なしで、３、６、または１０日間び保存後、凍結乾燥物の活性を、加えなかった試薬を乾燥ペレットに最終容量５０μｌで添加することにより試験した。各場合において、反応条件Ｄは、反応バッファー（５５ｍＭＴｒｉｓ．Ｃｌおよび８０ｍＭ酢酸カリウム）中、試料ＤＮＡのみを欠いた。トレハロースが凍結乾燥物中に存在する場合のみ、反応物は安定であるが、この場合、反応物は、少なくとも１０日間安定な状態であった。試験物質を使い果たしたため、さらに長期間は調べなかったが、可能であり得る。

実施例１４：ＲＰＡ反応はリアルタイムでモニタリングされ得、開始標的コピー数の評価が可能である。

図５４は、どのようにしてＳＹＢＲ金およびＳＹＢＲ緑蛍光色素を、ＲＰＡ反応におけるそれらの適合性、およびそれらの反応−モニタリング特性について評価するかを示す。
（Ａ）プライマーＡｐｏＢ４およびＡｐｏ３００の配置（それぞれ、配列番号：２０および２１）、これらは、ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子座の断片と隣接する。（Ｂ）ＳＹＢＲ金は、ＲＰＡ反応物中に、１：５０，０００以上での希釈度で、反応を完全に阻害することなく含め得る。反応物は、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．４、８０ｍＭ酢酸カリウム、２００μＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、５０ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ、１．５ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭＤＴＴ、３０ｍＭクレアチンリン酸、３００ｎＭＡｐｏＢ４プライマー、３００ｎＭＡｐｏＢ３００プライマー、５％Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ、３６０ｎｇ／μｌｇｐ３２、８６ｎｇ／μｌｕｖｓＸ、１５ｎｇ／μｌｕｖｓＹ、３５ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼで構成した。表示した希釈度のＳＹＢＲ金を反応物中に含めた。（Ｃ）ＲＰＡ反応を、各々、最終容量５０μｌを有する９６ウェルプレート内で確立した。標的ＤＮＡおよびＳＹＢＲ金色素のみを欠く成分のマスターミックスを氷上で確立した。ＳＹＢＲ金の５つの異なる希釈物を試験し、ストックからの最終希釈度は、１：５０，０００、１：６０，０００、１：７０，０００、１：８０，０００、および１：１００，０００とした。各希釈について、２および２０コピー／マイクロリットルの出発標的コピー密度を調べた。（ＴＥ中で予測されるコピー密度まで希釈したヒトゲノムＤＮＡ）。いったん反応物を氷上で充分混合し、プレートを、ＢＩＯ−ＴＥＫＦＬＸ８００蛍光マイクロプレートリーダーの予備加温プレート（３７℃）に移した。読み値を１分ごとに収集し、５０μｌの水で希釈した３００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを装置の感度標準として使用した。データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌに転送し、各反応について、相対蛍光（任意）をインキュベーション時間に対してプロットした。（Ｄ）ＳＹＢＲ金ではなくＳＹＢＲ緑をアッセイした以外は、（Ｃ）のようにして、実験を確立した。

図５５は、リアルタイムＲＰＡが、ＳＹＢＲ緑を用いて、４桁の大きさにわたって定量的挙動を示すことを示す。図５５（Ａ）この解析に用いたプライマーの配置。（Ｂ）ＲＰＡ反応を、最終容量５０μｌ／反応容量を有する９６ウェルマイクロウェルプレートにおいて、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＳｐｏＯＢ遺伝子座Ｊ１およびＫ２に特異的なプライマーを用いて確立した。

規定コピー数のＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡを、９６ウェルプレートのウェル内にピペッティングし、氷上で保存した。反応マスターミックスを氷上で混合し、次いで、アリコートをＤＮＡ含有ウェル内に入れ、充分混合した。次いで、反応物を、ＢＩＯ−ＴＥＫＦＬＸ８００蛍光マイクロプレートリーダーの予備加温プレート（３８℃に設定）に移した。反応組成は、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．４、８０ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭＤＴＴ、２００μＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、５０ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ、１．５ｍＭＡＴＰ、３０ｍＭクレアチンリン酸、３００ｎＭＢｓＪ１プライマー、３００ｎＭＢｓＫ２プライマー、５％Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ、３６０ｎｇ／μｌｇｐ３２、８６ｎｇ／μｌｕｖｓＸ、１５ｎｇ／μｌｕｖｓＹ、３５ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ、ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ由来ＳＹＢＲ緑のＤＭＳＯストックの１：５０，０００希釈物とした。２つの対応する実験の結果を（Ｂ）および（Ｃ）に示す。反応終了後、７μｌの反応物を１×スクロースローディングバッファーで希釈し、２％アガロースゲルで分離した（Ｄ、Ｅ）。最大濃度の標的を使用した場合、蛍光は、予期されたとおり、早期に検出可能となったが、持続性の指数関数的上昇は示さなかったことに注意されたい。これは、反応試薬（この実験では、ｇｐ３２は、典型的な濃度より低濃度で使用した）の消費により、またはインヒビターの構築などにより生じ得る。後の実験では、これが、ｇｐ３２／ｕｖｓＸの漸増不足（ｕｎｄｅｒｔｉｔｒａｔｉｏｎ）により生じ得ることを示す。下記参照。また、終点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）解析ゲル（Ｄ）での予測されたバンドのかすかな存在により示される、（Ｂ）における産物の混入についてのいくつかの証拠が存在する。

図５６は、ＲＰＡ反応が、少なくとも５桁の大きさのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡのコピー数を反応速度論的に評価し得ることを示す。ＲＰＡ反応を、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓプライマーＪ１およびＫ２を用いて図５５のように確立した。しかしながら、タンパク質試薬の量を以下のとおりに増加させた。：ｇｐ３２は、６００ｎｇ／μｌで使用し、ｕｖｓＸは１４０ｎｇ／μｌで使用し、ｕｖｓＹは３５ｎｇ／μｌで使用し、ＡＴＰは３ｍＭとした。反応容量を１００μｌ最終容量まで増加させ、より広い範囲のゲノムＤＮＡ濃度を使用した（０．１〜１００，０００コピー／μｌ）。より多くのコピー数の試料において初期の痕跡（ｔｒａｉｌ）は観察されなかった。本発明者らは、このことが、先の実験が、いくぶんｇｐ３２およびｕｖｓＸが漸増不足であったことを反映していると考える。反応終了後、７μｌの反応物を、１×スクロースローディングバッファーで希釈し、２％アガロースゲルで分離した。

図５７は、リアルタイムＲＰＡが、ヒトゲノムＤＮＡコピー数の多様性に対して定量的応答を示すことを示す。図５７（Ａ）ヒトＤＮＡ配列を増幅する、ＡｐｏＢ４およびＡｐｏ３００プライマーの配置。

（Ｂ）ＲＰＡ反応を、最終容量１００μｌ／反応容量を有する９６ウェルマイクロウェルプレートにおいて確立した。規定コピー数のヒトゲノムＤＮＡを、９６ウェルプレートのウェル内にピペッティングし、氷上で保存した。反応マスターミックスを氷上で混合し、次いで、アリコートをＤＮＡ含有ウェル内に入れ、充分混合した。次いで、反応物を、ＢＩＯＴＥＫＦＬＸ８００蛍光マイクロプレートリーダーの予備加温プレートに移した。反応組成は、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．４、８０ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭＤＴＴ、２００μＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、５０ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ、１．５ｍＭＡＴＰ、３０ｍＭクレアチンリン酸、３００ｎＭＡｐｏＢ４プライマー、３００ｎＭＡｐｏ３００プライマー、５％Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ、３６０ｎｇ／μｌｇｐ３２、８６ｎｇ／μｌｕｖｓＸ、１５ｎｇ／μｌｕｖｓＹ、３５ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ由来のＳＹＢＲ緑のＤＭＳＯストックの１：５０，０００希釈物とした。実施例２（Ｃ）と同様に、最大濃度の標的では、予想外に早期に逸れる（ｔｒａｉｌｏｆｆ）曲線が得られたことに注目されたい。図５５の場合のように、これらの実験は、高い標的濃度での確固とした検出可能な対数期を確保するための精巧さを必要とし得る、ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、ｇｐ３２、ＡＴＰおよびｄＮＴＰ濃度条件下で行なった。これは、特定の試薬の濃度が以下の通りである：ｇｐ３２は６００ｎｇ／μｌで使用し、ｕｖｓＸは１４０ｎｇ／μｌで使用し、ｕｖｓＹは３５ｎｇ／μｌで使用し、ＡＴＰは３ｍＭとしたこと以外は（Ｂ）と同様の実験が行なわれた（Ｃ）によって支持される。反応終了後、７μｌの反応物を１×スクロースローディングバッファーで希釈し、２％アガロースゲルで分離した。

実施例１５：３’ＬＮＡキャッププライマーを用いた非対称プライマーＲＰＡ
非対称なプライマーＲＰＡ法を用いる標的ＤＮＡの増幅の一例として、標準的なＲＰＡ条件を、２つの違いを伴って用いる。第１に、一方のプライマーは、３’ＬＮＡキャッププライマーである。第２に、さらなるポリメラーゼ、φ２９を使用する。これは、リコンビナーゼ中間体からの合成を開始することができない。

したがって、増幅条件は以下の通りである：
５０ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ７．８５
１０ｍＭ酢酸マグネシウム
２ｍＭジチオトレイトール
８０ｍＭ酢酸カリウム
５％ＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ）
１５ｍＭクレアチンリン酸
３ｍＭＡＴＰ
２００μＭｄＮＴＰ
１２ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
０．３μＭオリゴヌクレオチド１，３’ＬＮＡキャップ
０．３μＭオリゴヌクレオチド２
３５０ｎｇ／μｌＴ４ｇｐ３２
１００ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＸ
２０ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＹ
２０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ
２０ｎｇ／μｌ φ２９ポリメラーゼ（ｅｘｏ−，またはｅｘｏ−減衰）
インキュベーションは３３〜４０℃で３０分間〜２時間
実施例１６：ケージ化（ｃａｇｅｄ）ＡＴＰの脱保護を伴うリアルタイムＲＰＡの開始
インプット鋳型ＤＮＡを定量化するためのＡＴＰパルス（ｐｕｌｓｅｄ）ＲＰＡの使用の一例として、反応を、いくつかの違いを伴う標準的なＲＰＡ反応として構築する。第１に、ＡＴＰの代わりにケージ化ＡＴＰを使用する。第２に、二本鎖ＤＮＡ検出試薬、ＳＹＢＲ緑を使用してＲＰＡ産物を定量化する。ＡＴＰの各パルスで完全な合成が確保されるように、プライマーを、短い（＜２００ｂｐ）反応産物が生成されるように設計する。

したがって、増幅条件は以下の通りである：
５０ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ７．８５
１０ｍＭ酢酸マグネシウム
２ｍＭジチオトレイトール
８０ｍＭ酢酸カリウム
５％ＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ）
３ｍＭケージ化ＡＴＰ
ＳＹＢＲ緑Ｉの市販のストック（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）の１：５０，０００希釈物
２００μＭｄＮＴＰ
０．３μＭオリゴヌクレオチド１
０．３μＭオリゴヌクレオチド２
６００ｎｇ／μｌＴ４ｇｐ３２
１５０ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＸ
２５ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＹ
２０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ
インキュベーションは３３〜４０℃
ＡＴＰ脱ケージ化（ｕｎｃａｇｉｎｇ）の各サイクルの前に、ＳＹＢＲ緑Ｉ蛍光（４９４ｎｍ励起最大−５２１ｎｍ発光最大）を試料中で測定する。検出された蛍光は定量化の基礎となる。１分ごとに、３６５ｎｍの光の短いパルスをケージ化ＡＴＰに適用すると、リコンビナーゼ活性のバーストがもたらされる。各サイクルで測定した蛍光を、次いで、インプット鋳型標準と比較し、インプット試料鋳型の量が測定され得る。

実施例１７は、ポロニー（Ｐｏｌｏｎｙ）解析においてＲＰＡの開始を制御するためのケージＡＴＰの使用を記載する。

ＲＰＡベースのポロニー解析の一例として、ポリアクリルアミドゲルを顕微鏡スライド上に、Ｃｈｕｒｃｈら［ＭｉｔｒａＲ，ＣｈｕｒｃｈＧ（１９９９）ＩｎｓｉｔｕｌｏｃａｌｉｚｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔａｃｔｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍａｎｙｉｎｄｉｖｉｄｕａｌＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ２７（２４）：ｅ３４ｉ−ｖｉ．］に記載のようにして作製する。この解析では、蛍光ヌクレオチドおよび多型標的特異的プライマーを用いる単一塩基伸長による初期増幅後に、異なる多型性産物が検出される。この構成と標準的なポロニー解析との１つの違いは、ＲＰＡが一定の低温度でかなり短時間（通常、ＰＣＲベースのポロニー反応は３〜７時間要し得る）で行なわれるため、５’アクリダイト（ａｃｒｙｄｉｔｅ）修飾されたプライマーの使用が必ずしも必要でなくともよいことである。この実施例では、５’アクリダイト修飾されたプライマーと通常のプライマーの両方を使用する。

ＰＣＲ「内部拡散（ｄｉｆｆｕｓｅ−ｉｎ）」ミックスの代わりに、ＲＰＡ「内部拡散」ミックスを使用し、これは以下のものを含む：
５０ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ７．８５
１０ｍＭ酢酸マグネシウム
２ｍＭジチオトレイトール
８０ｍＭ酢酸カリウム
５％ＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ）
１５ｍＭクレアチンリン酸（構成に応じて含める）
２００μＭｄＮＴＰ
^＊３ｍＭケージ化ＡＴＰ（構成に応じて含める）
１２ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ（構成に応じて含める）
０．３μＭオリゴヌクレオチド１
０．３μＭオリゴヌクレオチド２
３５０ｎｇ／μｌＴ４ｇｐ３２
１００ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＸ
２０ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＹ
２０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ
次いで、反応を、ＡＴＰにより拡散させるか、または元の「内部拡散」ミックスに含まれるケージ化ＡＴＰを活性化することのいずれかにより開始する。ポロニーが、３３〜４０℃で３０分間〜２時間でのインキュベーション後に生成される。

増幅後、新たな多型−標的プライマーを蛍光標識されたヌクレオチドとともに内部拡散させ、手動で適用するか、または光分解によるかのいずれかによる追加のＡＴＰのパルスにより反応を再び開始させる。合わせた蛍光を、次いで、蛍光顕微鏡測定を用いて定量化し得る。

実施例１８：単鎖増幅されたＤＮＡと二本鎖プローブとの間のリコンビナーゼ媒介性ハイブリッド形成を用いたアンプリコン内の多型性反復数の非ゲルベースの測定
この実施例では、ＳＴＲを、隣接するオリゴヌクレオチドプライマーによって増幅する。ＳＴＲは、ＴＰＯＸとして知られるマーカーであり、米国および欧州の両方で法医学的解析に使用される標準的なＳＴＲマーカーセットにより一般的に使用されている。このマーカーは、５’−ＡＣＴＧＧＣＡＣＡＧＡＡＣＡＧＧＣＡＣＴＴＡＧＧＧＡＡＣＣＣ−３’（配列番号９２）のプライマー１および５’−ＧＧＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＡＣＣＡＣＡＣＡＧＧＴＴＡＡＴＴＡ−３’（配列番号９３）のプライマー２の配列を有する隣接プライマーによって増幅される。このマーカーは、４ヌクレオチドＡＡＴＧの反復を有し、この反復は、５〜１４回の反復で変動する。

増幅条件は以下の通りである：
５０ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ７．８５
１０ｍＭ酢酸マグネシウム
２ｍＭジチオトレイトール
８０ｍＭ酢酸カリウム
５％ＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ）
１５ｍＭクレアチンリン酸
３ｍＭＡＴＰ
２００μＭｄＮＴＰ
１２ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
０．３μＭオリゴヌクレオチド１，５’−フルオレセイン−標識
０．０５μＭオリゴヌクレオチド２
６００ｎｇ／μｌＴ４ｇｐ３２
１５０ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＸ
３５ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＹ
２０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ
インキュベーションは３３〜４０℃で３０分間〜２時間
増幅反応では、プライマー不均衡によりある量の単鎖ＤＮＡが生成され、この単鎖ＤＮＡは蛍光標識される。増幅反応反応の最後に、反応混合物を、空間的に固定化された二本鎖プローブのアレイと直接接触させる。各プローブは、研究中のＤＮＡの既知の多型性形態１つに対応し、この形態が試料中に存在すれば、作製され得るアンプリコンと同じ長さである。

リコンビナーゼを、増幅された単鎖試料ＤＮＡに負荷し、相同性検索フィラメントを形成させる。このようなフィラメントは、アレイ支持体表面上に固定化された二本鎖プローブを標的化することができる。リコンビナーゼ被覆された増幅産物とプローブとの間で組換え事象が起こると、増幅産物がもたらされ、プローブ中のその相補鎖とともに増殖的にワトソンクリック塩基対合となり、一方で、元の対合形成された対応鎖は置換され、溶液中に遊離される。試料ＤＮＡと不完全にマッチしたプローブとの間でこの事象が開始されると、理想的には、このような組換え事象の完了は抑制され、完全なハイブリッドのみの富化がもたらされる。

反応は動的であり、その結果、プローブと試料間で形成されたハイブリッドは、それ自体が他の標的化ＤＮＡの標的となり得る。不完全に形成されたハイブリッドの組換えの完了の低い効率と組み合わせた、この動的な挙動は、プローブ／試料混合物の集団において完全なハイブリッドの富化をもたらすはずである。これは、ヘリカーゼ、例えば、大腸菌ＰｒｉＡ（２〜２０ｎｇ／μｌ）、大腸菌ＤｎａＢ（５〜５０ｎｇ／μｌ）、大腸菌ＲｕｖＡＢ（５〜５０ｎｇ／μｌ）、Ｔ４ファージｄｄａヘリカーゼ（５〜５０ｎｇ／μｌ）、Ｔ４ファージｇｐ４１（５〜５０ｎｇ／μｌ）または適切なヌクレアーゼのいずれかの添加によりさらに増強される。このような因子は、ミスマッチに起因して存在し、完全なハイブリッドよりも不安定であるこのような不完全なハイブリッドをもたらす、ヘリックスの崩壊を利用または増強する。

２８〜４０℃での適当なインキュベーション期間、例えば、１０〜３０分間後、反応を、必要であれば、例えば、ＥＤＴＡまたはカオトロピック剤、例えば、ウレアまたは塩酸グアニジンなどの添加によって終了させるが、このような終了は必ずしも必要でなくてもよい。次いで、アレイを適切な波長の光に曝露し、蛍光を適切なフィルターおよびカメラを用いて記録することにより、プローブと試料間の生産的な相互作用を測定する。

実施例１９は、二本鎖の増幅されたＤＮＡと単鎖プローブとの間のリコンビナーゼ媒介性ハイブリッド形成を用いたアンプリコンにおける多型性反復数の非ゲルベースの測定を示す。

上記のように、この実施例は、法医学的に使用されているＴＰＯＸＳＴＲマーカーの増幅を伴い得る。増幅条件は、増幅プライマーの比が１：１であり得、ともに０．３μＭの濃度で使用され得る以外は、実施例１８と同じであり得る。増幅反応物を、次いで、研究中のＤＮＡの既知の可能な多型性形態に対応する単鎖プローブのアレイに接触させる。この形式では、リコンビナーゼは優先的にプローブ上に負荷し、次いで、二本鎖試料ＤＮＡを検索して、これとのハイブリッドを形成する。実施例１８のように、ハイブリッドはが完璧な場合は、これらが理想的には富化され、同様に、ヘリカーゼ（例えば、ＰｒｉＡ、ｒｅｃＧ、ＤｎａＢ、ＲｕｖＡＢ、ｇｐ４１またはｄｄａ）または適切なヌクレアーゼなどの因子を含めることは、この富化を加速および改善すし得る。適当なインキュベーション期間後、必要に応じて、反応を停止させるか、または停止させずに、相互作用を、実施例１８に記載されるように可視化する。

実施例２０は、リコンビナーゼ媒介性ハイブリッド形成および固定化点から標識を解放する異常発生のヌクレアーゼのプロセッシングを用いるアンプリコンにおける多型性反復数の非ゲルベースの測定を示す。

この実施例では、増幅反応、およびプローブと試料との間のハイブリッド形成は、増幅プライマーが標識を含む必要がないこと以外は、実施例１に記載のようにして行なった。試料の代わりにプローブの一端で標識する。適切なインキュベーション期間後、実施例１８および１９に記載のように、アレイを、適切なヌクレアーゼで処理し、これにより不完全なＤＮＡ二本鎖が切断される。不完全なハイブリッドのバックボーンの切断がなされるので、それゆえ標識が固定化点から遊離される。さらに、ＤＮＡポリメラーゼが含まれ得、その結果ニックがヌクレアーゼによって導入されると、ポリメラーゼが鎖置換し、次いで、鎖を置換する様式で合成するよう作用し得る。したがって、標識された鎖が除去される。次いで、アレイを、実施例１８に記載されるように定量化し得る。

実施例２１は、リコンビナーゼ媒介性ハイブリッド形成および異常発生のヌクレアーゼのプロセッシング、続いてＤＮＡ合成標識を用いるアンプリコンにおける多型性反復数の非ゲルベースの測定を示す。

この実施例では、増幅およびハイブリッド形成は、増幅プライマーを必ずしも標識しないこと以外、実施例１８または実施例１９のいずれかと同様である。ハイブリッド形成期中、バブルにおいてニック形成するか、またはヘリックスを不安的にさせるヌクレアーゼを含めた。標識ヌクレオチドおよび鎖を置換するポリメラーゼの反応物中へこのヌクレアーゼを含めることは、不完全なハイブリッドをもたらし、この不完全なハイブリッドはプロセッシングされて完全なハイブリッド形態となり、このハイブリッド形態は、可視化され得る修飾された標識塩基を含む。

実施例２２は、動的な組換え系環境内の不完全なハイブリッドを崩壊させるためのヘリカーゼの使用を示す。

この実施例では、増幅およびハイブリッド形成は、増幅プライマーを必ずしも標識しないこと以外は、実施例１８または実施例１９のいずれかと同様にして行なう。しかしながら、プローブまたは試料ＤＮＡは、標識を含有しなければならない。プローブまたは試料ＤＮＡの一端を、高親和性の非共有結合性相互作用（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用）により固相支持体またはビーズへ固定化する。ハイブリッド形成期中、ヘリカーゼ（例えば、Ｔ４ｄｄａヘリカーゼ）またはヘリカーゼの組合せ（例えば、ＰｒｉＡおよびｄｄａヘリカーゼ）または他の混合物を、標的の不完全なハイブリッドに含め、これらを巻き戻し、物理的な崩壊によって高親和性の非共有結合性相互作用の解離を効率的に加速する。適当なインキュベーション期間後、標識された核酸と固相支持体間の会合を測定し、陽性シグナルは完全なハイブリッドが形成されたことを示す。

図５８は、原理的に、どのようにして不完全なハイブリッドが、動的な組換え環境において、増強された全体的な二本鎖崩壊を可能にするバブルを有するのかを示す。

短いタンデムリピートの８反復配列を含有し、増幅に使用される特有配列と隣接する、Ａに示す二本鎖アンプリコンは、Ｂにおいて種々の数の反復単位を含有する単鎖プローブオリゴヌクレオチドによって標的化される。ハイブリダーゼーションは、リコンビナーゼ（ここでは図示せず）によって誘発される。Ｃにおいて、生じる二本鎖ハイブリッドを示し、これらの一部は、ハイブリッド間の非同一反復の数によって引き起こされるバブルを含有する。このようなバブルは、異なる反復配列の数が増えるほど大きくなり、したがって、かかるハイブリッドは、リコンビナーゼまたは他のＤＮＡプロセッシング酵素のより良好な標的となる。

図５９は、実施例１８に記載される図５８のハイブリダーゼーション反応の起こり得る結果を示す。８反復配列を含有する試料ＤＮＡを種々の反復数に対応するプローブのアレイとともにインキュベートする。経時的に、ハイブリッドは、完全な反復の数に対して富化されるが、１つまたは２つの反復配列だけ異なるものではそれより少ないが、低い程度で富化される。

図６０は、特異的ＲＮＡ種の存在を評価するために、反応において逆転写できる酵素を含めることにより、どれだけ容易にＲＰＡ反応が行なわれ得るかを示す。

規定のコピー数のウイルスＭＳ２ＲＮＡ（市販の供給源から）を、表示のような逆転写酵素を含めたＲＰＡ反応において、インキュベートした。２つのプライマーを使用し、これらは、表示のＭＳ２配列を認識した。より具体的には、これらのプライマー：

であった。

反応条件は、高い濃度のｄＮＴＰ（５００μＭ）、ＤＴＴの増加、ＲＮａｓｅインヒビターを含めること、および表示した場合に逆転写酵素を含めること以外、標準的であった。条件：
５０ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ８．５
１０ｍＭ酢酸マグネシウム
１０ｍＭジチオトレイトール
８０ｍＭ酢酸カリウム
５％ＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ）
１５ｍＭクレアチンリン酸
３ｍＭＡＴＰ
５００μＭｄＮＴＰ
１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
０．３μＭＭＳ２ＵＰ
０．３μＭＭＳ２ＤＯＷＮ
８００ｎｇ／μｌＴ４ｇｐ３２
１２０ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＸ
３０ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＹ
７０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ
０．１３単位／μｌＲＮａｓｅインヒビター
ＭｕＭＬＶ（ＲＮａｓｅＨを含む）逆転写酵素１０単位／μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
であった。

反応産物をフェノール抽出し、沈殿させ、非変性アクリルアミドゲル上で分離し、その後ＳＹＢＲ−金で染色した。１００コピー／マイクロリットルという低いＲＮＡ濃度は、この形式において、さらに最適化せずに、容易に検出され得る。

図６１は、ｄＵＴＰが、ＲＰＡ反応において部分的または完全にｄＴＴＰと置き換えるために使用され得ることを示す。したがって、それにより持ち込み混入物を制御するためのストラテジーが提供される。

ＲＰＡ反応を、以下の条件を用いて確立した：
５０ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ８．５
１０ｍＭ酢酸マグネシウム
２ｍＭジチオトレイトール
１００ｍＭ酢酸カリウム
５％ＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ）
１５ｍＭクレアチンリン酸
３ｍＭＡＴＰ
２００μＭｄＮＴＰ（ｄＡ，ｄＣ＆ｄＧ）
１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
０．３μＭＪ１プライマー（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＤＮＡ用）（配列番号：６６）
０．３μＭＫ２プライマー（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＤＮＡ用）（配列番号：６９）
６３０ｎｇ／μｌＴ４ｇｐ３２
１４０ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＸ
３５ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＹ
２０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ
１００コピー／μｌＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡ
反応の産物は２％アガロースゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した。左端のパネルに示したように、ｄＵＴＰまたはｄＴＴＰを異なる反応で使用した。より詳しくは、上側の左端レーンは、２００μＭｄＴＴＰを含み、したがって、標準的なＲＰＡ反応の典型例であった。続く６つのレーンもまた、２００μＭｄＴＴＰを含んだが、この場合、ｄＵＴＰもまた表示した濃度で存在した。下側左端パネルの最後の６つのレーンはＲＰＡ反応の産物を含み、これらはｄＴＴＰは含まず、表示した濃度（５０〜８００μＭｄＵＴＰ）のｄＵＴＰを使用した。すべての場合において、予測された断片の増幅が起こったが、顕著にｄＵＴＰの存在が、生成するアンプリコンの量を減少させ、多くの場合、スナップバック合成が起こったときに見られる「倍増（ｄｏｕｂｌｉｎｇ−ｕｐ）」現象を抑制した。

右端パネルは、出発物質として、左端パネルの第１の反応物から概略図に示すようなプロセッシング後に生成した産物を用いた結果を示す。より詳しくは、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥとして左端パネルに示す反応物は、以下のようにプロセッシングされた。染色強度およびＤＮＡ含量の概算に基づき、推定１０^６分子の各産物を、２０分間、１μｌの非耐熱性ｄＵＴＰ−デグリコシラーゼの市販の調製物（Ｒｏｃｈｅ）とともにインキュベートし、同様の量を未処理のままとし、次いで、最終的に、すべての試料を９４℃まで１０分間加熱した。この酵素は、１０^５分子の持ち込み混入物に有効に対処するように製造業業者によって品質制御されていた。したがって、本発明者らは、この場合、ストリンジェントな試みを課した。試料を、次いで、２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ（上記の条件参照）により正常なＲＰＡ条件下で構成されたＲＰＡ反応を開始するために使用した。表示のように、ｄＵＴＰ−デグリコシラーゼで未処理の試料は、優れた出発鋳型であったが、処理されたものは、初期にｄＵＴＰを使用しなかった場合を除き、極めて悪かった。特に、混合されたブレンド（ｂｌｅｎｄ）でさえ有効であった。

図６２は、ＲＰＡ系において、いかにして持ち込み混入物に対処し得るかを示す。

ＲＰＡ反応においてｄＵＴＰを受容する能力は、図示したスキームにしたがって、持ち込み混入物を抑制するために使用され得る。ＲＰＡ反応は、純粋なｄＵＴＰ、またはｄＴＴＰおよびｄＵＴＰミックスを用いて、図６１に示すようにして行なわれ得る。ＲＰＡ反応の開始前、または開始時、大腸菌ウラシルデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）または類似物を、試料とともにインキュベートさせ得、持ち込み物質を攻撃させ得る。次いで、数分後、または反応の開始時、ＵＤＧインヒビターを添加し得る。大腸菌ＵＤＧの特異的インヒビターは、ウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）と称されるものとして知られ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の９．５ｋＤペプチドであり、市販されている。

図６３は、試料中の特異的ＤＮＡ配列の存在に関する迅速なポイントオブユーズ試験を可能する簡単な一体型使い捨てシステムが、どのようにして、構成され得るかを示す。（Ａ）では、使い捨てＲＰＡ反応／側方流動ストリップの概略的な説明を示し、これは、乾燥ＲＰＡ試薬を含む反応ポーチの近傍でほぼ３０〜３９℃で送達し得る廉価なヒーター内に配置され得る。プロセッシング／溶解された試料が、適切な容量のポーチ内の内容物を再水和させるために使用され得ること、次いで、このポーチを適切な温度で１５〜６０分間、必要に応じてインキュベートされ得ることを想定する。続いて、一部または全部の試料を側方流動ストリップの試料パッドに移し得、このストリップは、正確なアンプリコンが形成されたときのみ、ストリップの特定の位置に目に見えるラインが形成されるような様式で構成されている。（Ｂ）には、それぞれ、男性および女性のＤＮＡについてＲＰＡ反応に使用した２つのオリゴヌクレオチドプライマーの配置を示す。オリゴヌクレオチドＳＲＹ３およびＳＲＹ４を使用し、一方は５’−フルオレセイン部分を含有し、他方は５’−ビオチン部分を含有した。反応の最後に、５０μｌ反応物の１／５００を「泳動バッファー」（Ｍｉｌｅｎｉａ，ｇｅｒｍａｎｙ）と混合し、市販の側方流動ストリップ（Ｍｉｌｅｎｉａ，ｇｅｒｍａｎｙ）に適用し、その結果、フルオレセインおよびビオチンが同時会合した（すなわち、増幅産物での）産物のみが検出ライン上に目視可能な金粒子の蓄積がもたらされ得る。（Ｃ）には、この実験の結果を示す。男性ＤＮＡで行なった反応でのみ、シグナルラインが生成され、増幅反応の有効性は、別途、アガロースゲル（データ示さず）において確認した。

図６４は、適切な比率の試薬を使用した場合、血中の物質の存在によってＲＰＡ反応が抑制されないことを示す。

直接ＲＰＡ反応物に添加した全血および溶解血液からゲノムＤＮＡ断片を増幅する能力を調べた。ＲＰＡ反応物は、以下のように構成した：
５０ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ８．５
１０ｍＭ酢酸マグネシウム
２ｍＭジチオトレイトール
８０ｍＭ酢酸カリウム
５％ＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ）
２５ｍＭクレアチンリン酸
３ｍＭＡＴＰ
２００μＭｄＮＴＰ
１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
０．３μＭオリゴヌクレオチドＡｐｏＢ４（配列番号：２０）
０．３μＭオリゴヌクレオチドＡｐｏＢ３００（配列番号：２１）
４２０ｎｇ／μｌＴ４ｇｐ３２
１４０ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＸ
３５ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＹ
２０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ
（Ａ）では、１μｌの水または１μｌの新鮮なヒト全血のいずれかを、ＲＰＡ反応に添加した。産物を２％アガロースゲルで分離した。矢印は、予測されたアンプリコンの位置を示す。非特異的「プライマー」アーティファクトを、水対照および試料中に存在させた。おそらく、標的の非存在または非常に低コピーの標的の結果として起こる。本発明者らは、きわめて少ないコピーのゲノムＤＮＡが血液試料の増幅での増幅に利用可能であると推測する。（Ｂ）では、ｌμｌの血液をまず、１０ｍＭ｜Ｔｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡ、１２０ｍＭＮａＯＨ、０．１％ＳＤＳ（表示のとおり）を含有する溶解溶液ｌμｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ、または５μｌのいずれかと混合した試料を解析した。各場合で、ｌμｌのそれぞれのライセートをＲＰＡ反応の開始に使用した。（したがって、１回の増幅で、より多くのバッファーで溶解したものは、より少ない血液試料を含んだ）。また、同じ実験での、水のみ（レーン１）または５００コピーの標的（Ｐｒｏｍｅｇａ）に相当する精製ＤＮＡ（レーン７）を、増幅反応を開始するのに使用した試料も示す。４μｌまたは５μｌの溶解バッファーを使用した場合、赤血球の溶解は、明白に目視可能であり、溶液は粘性となった。本発明者らは、これらの試料がＲＰＡ反応の優れた開始物質になり、おそらく、大部分のＤＮＡが接近可能な鋳型として放出されていることに注目する。

図６５は、ＲＰＡ反応のリアルタイムのモニタリングが、反応を最適化するためにどのようにして使用され得るかを示す。

この場合、ＲＰＡ反応を、上記のプライマー対Ｊ１およびＫ２、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡからなる鋳型（開始密度は１コピー／マイクロリットル）を用いて確立した。酢酸カリウム濃度またはＰＥＧ化合物濃度のいずれかを変化させた。他の条件は、特に記載のない限り：
５０ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ８．５
１０ｍＭ酢酸マグネシウム
２ｍＭジチオトレイトール
８０ｍＭ酢酸カリウム（または、表示の通り）
５％ＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ）（または、表示の通り）
２５ｍＭクレアチンリン酸
３ｍＭＡＴＰ
２００μＭｄＮＴＰ
１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
０．３μＭオリゴヌクレオチドＪ１プライマー（配列番号：６６）
０．３μＭオリゴヌクレオチドＫ２（配列番号：６９）
６２０ｎｇ／μｌＴ４ｇｐ３２
１４０ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＸ
３５ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＹ
ＳＹＢＲ緑（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のストックの１：５０，０００希釈物形態
２０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ。
反応の終了時に、反応物の一部を、スクロースローディングバッファーと混合し、そしてアガロースゲル上で分離し、そしてその後、臭化エチジウムで染色した。本発明者らは、高濃度の塩が反応を遅延するが、しかし十分に作用する広範な塩濃度があることに注目する。本発明者らは、４％から９％にＰＥＧ濃度を増大させることが、常に早い反応挙動を生じるが、しかし、ゲル系での産物の見掛けは、高いＰＥＧ濃度によって不利に影響されたことにも注目する。本発明者らは、高ＰＧＥ濃度サンプルのスミアの多い外観が、非常に高い組換え活性によって発生されるＤＮＡの進行中のネットワークから生じうることを推測する。これが、ゲル分析にとって望ましくないが、それは、蛍光を使用したリアルタイム分析にとって申し分なく適切でありうる。

図６６は、どのようにＲＰＡ反応が、マグネシウム濃度によって影響されるかを示す。
リアルタイムＲＰＡ反応を、以下のとおりに確立した：
５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）
示されるとおりの６、１０または１６ｍＭ酢酸マグネシウム
２ｍＭジチオスレイトール
８０ｍＭ酢酸カリウム
５％ＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ）
２５ｍＭクレアチンリン酸
３ｍＭＡＴＰ
２００μＭｄＮＴＰ
１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
０．３μＭオリゴヌクレオチドＪ１プライマー（配列番号：６６）
０．３μＭオリゴヌクレオチドＫ２プライマー（配列番号：６９）
６００ｎｇ／μｌＴ４ｇｐ３２
１２０ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＸ
３０ｎｇ／μｌＴ４ｕｖｓＹ
２０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ
ＳＹＢＲ緑（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のストックからの１：５０，０００希釈物。

マイクロリットル当たりのコピー中の標的ＤＮＡであるＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡの出発密度を示す。６ｍＭおよび１６ｍＭの酢酸マグネシウム・サンプルにおいて、ある程度の持ち込み混入は、終点でのサンプルをアガロースゲル上で調べて明らかになった。これは、マイクロリットル出発密度当たり０コピーと１コピーの間の分解能が乏しいことを部分的に説明し得る。ＲＰＡは、全ての試験されたマグネシウム濃度で有効であるが、しかしマグネシウム濃度が上昇したときよりいっそう早いことに注目する。これらの高マグネシウム・サンプルから得た最終産物は、なお高い品質のように見える（データは示されず）。これは、最大の反応速度を達成するために、１０ｍＭより有意に高いマグネシウム濃度（本明細書の大半を通しての基準として使用される）が有用に使用されうることを示す。

図６７は、様々なプライマー対／アンプリコンが様々な増幅反応速度を示すことを示す。反応時間への依存性は、オリゴヌクレオチド・プライマーの間で変化し、そして分析は、この現象の根底にある可能な配列の偏りを示す。

２つの異なる時間経過が、異なるプライマー対を使用して行われた。示された変動のレベルが、本発明者らの側でプライマー対の間で観察した挙動の範囲の典型であり、そして観察される速度のただ１つの典型的例（１２５ｎｇ／μｌＵｖｓＸ、４５ｎｇ／μｌｕｖｓＹで使用されたＣＳＦプライマー；２００ｎｇ／μｌＵｖｓＸ、６０ｎｇ／μｌｕｖｓＹで使用されたＡｐｏプライマー）として示されるにもかかわらず、これらの反応の間の条件は一致しなかった。プライマー配列が示される。プライマーＣＳＦ５’（配列番号：３２）およびＣＳＦ３’（配列番号：３３）（ヒトＳＴＲ遺伝子座ＣＳＦ１ＰＯ）を標的化する）は、それらが特に迅速な産物蓄積反応速度を示した限りで真に例外的なプライマー対であり、これらは、現在本発明者らが決定した中では最速である。ヒトアポリプロテインＢ遺伝子座の一部を標的化する、プライマーＡｐｏＢ６００（配列番号：４６）およびＡｐｏＢ３００ｒｅｖ（配列番号：４７）は、遅い増幅反応速度を示す。この実験では、この後者の対は、ＣＳＦプライマーを用いてわずか２０分後に生じる量と同じ量を４０分後に生じた。このことと他のものとに基づいて、本発明者らは、典型的な倍増時間は、ＲＰＡ中の３０−３５残基の大半のプライマー対について、平均で、約３０秒と１分の間で変化することを結論づけた。ＣＳＦプライマーは、複数の実験（データは示されず）でも顕著に際立っており、それらが特に有効かつ早いという概念と一致した。両方のＣＳＦプライマーと、この場合には本明細書で使用されるＡｐｏプライマーとを比較する、プライマーの組成分析は、グアノシン含有量が、両方のＣＳＦプライマーで低い一方で、Ａｐｏプライマーでは平均的であり、そしてシトシン含有量は、両方のプライマーについて三分の一以上である一方で、Ａｐｏプライマーについては四分の一以下であることを強調する。これは、速度の可変性に関する有望な組成起点を本発明者らに示唆する。ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹでの前述の差、および僅かな変異のｄＮＴＰ濃度は別として類似の条件下で反応を行った：
５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．４）
８０ｍＭ酢酸カリウム
１０ｍＭ酢酸マグネシウム
２ｍＭＤＴＴ
５％ＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ）
３ｍＭＡＴＰ
２０ｍＭクレアチンリン酸
１００ｎｇ／□ｌクレアチンキナーゼ
６００ｎｇ／ｍｌｇｐ３２
Ａｐｏプライマーについては２００□ＭｄＮＴＰ；ＣＳＦプライマーについては１００□ＭｄＮＴＰ
３００ｎＭ各オリゴヌクレオチド。

図６８は、付加５’ホモポリマーストレッチが、反応挙動に影響する−シトシンが活性を増大させ、グアノシンがそれを減少させる。

プライマーは示されるとおりであった。Ｊ１およびＫ２（配列番号：６６および６９）は、ＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＳｐｏＯＢ遺伝子座の一部と相同である。反応条件は、
５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．４）
８０ｍＭ酢酸カリウム
１０ｍＭ酢酸マグネシウム
２ｍＭＤＴＴ
５％ＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ）
３ｍＭＡＴＰ
３０ｍＭクレアチンリン酸
１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
４２０ｎｇ／μｌｇｐ３２
１４０ｎｇ／μｌＵｖｓＸ
３５ｎｇ／μｌＵｖｓＹ
２００μＭｄＮＴＰ
３００ｎＭの各オリゴヌクレオチド
３５ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ
２５コピー／μｌＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡ
ＳＹＢＲ緑（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ）のストックから得た１：５０，０００希釈物
反応体積５０μｌ、３７℃
であった。

プライマーＪ１（Ｃ）、Ｋ（Ｃ）、Ｊ１（Ｇ）、およびＫ２（Ｇ）は、示されるとおり、Ｊ１およびＫ２に相当したが、シトシンまたはグアノシンの付加ストレッチを保有している。反応物を、氷上のマイクロタイタープレート中で確立し、そしてその後、蛍光測定器（ＦＬＸ８００）の加熱ステージに移した。９０分後、反応物を、１×スクロースローディングバッファーで希釈して、当初の反応体積の二倍にし、その後この２０μｌを、直接２％アガロースゲルで泳動した。反応物は、標的ＤＮＡを含むか、または標的を含まないかのいずれかであった。本発明者らは、そのプライマーにシトシン残基を付加させることが、早い増幅速度を生じる一方で、グアノシンを付加させると、不完全な増幅を生じることを観察した。シトシン付加プライマーも、非常に迅速に「ノイズ」を増幅した。

図６９は、チミンとシトシン残基より構成される付加５’配列が、増幅挙動で明らかな変動を示すことを示す。

プライマーは、示されるとおりであった。Ｊ１およびＫ２（配列番号：６６および６９）は、ＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＳｐｏＯＢ遺伝子座の一部と相同である。反応条件は、
５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．４）
８０ｍＭ酢酸カリウム
１０ｍＭ酢酸マグネシウム
２ｍＭＤＴＴ
５％ＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ）
３ｍＭＡＴＰ
３０ｍＭクレアチンリン酸
１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
４２０ｎｇ／μｌｇｐ３２
１４０ｎｇ／μｌＵｖｓＸ
３５ｎｇ／μｌＵｖｓＹ
２００μＭｄＮＴＰ
３００ｎＭの各オリゴヌクレオチド
３５ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ
２０コピー／μｌＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡ
ＳＹＢＲ緑（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ）のストック由来の１：５０，０００希釈物
反応体積５０μｌ、３７℃
であった。

増幅反応を、図６６で示されるとおりＳＹＢＲ緑色素を用いてリアルタイムで評価した。条件は、わずか２０コピー／μｌの出発標的鋳型を使用し、そしてプライマー配列を変化させた以外は同様だった。図６８について示されるとおり希釈した後、２％アガロースゲル上で６０分間に生じた産物を泳動することによって、終点分析を行った。ホモポリマーチミジン・ストレッチ、または非常にチミジンが豊富なストレッチを含む反応物が、ある程度弱く増幅された。典型的には、少量のＤＮＡを生じ、そして増幅の非対称性が実質的に起こっているというある程度の指標があった。概して、このデータは、シトシン残基が５’配列で好ましいことと一致し、他の測定の困難な現象（おそらく望ましいリコンビナーゼの「位相調整（ｐｈａｓｉｎｇ）」のある程度の効果）が生じている。

図７０は、５’付加配列の効果についてのいっそう詳細な研究を示す。

本発明者らは、Ｊ１およびＫ２プライマー（配列番号：６６および６９）から誘導したなおさらなるプライマーを調べた。これらの大部分は、追加のピリミジン残基を含有するが、しかし１つの対は、まさに５’グアノシン残基を含有する。いくつかのプライマー（このシリーズでは６および１２）は、５’ピリミジンを含有したが、しかしそれぞれ５’（Ｊ１）または３’末端（Ｋ３）で塩基を除去することによって総計３３残基に短縮された。したがって、これらのプライマーは、ゲノム標的と相同な３０未満の残基を共有した。プライマーを、図６９および７０で使用したものと類似の条件下でインキュベートした。主要な差は、６３０ｎｇ／ｍｌのｇｐ３２を使用し、そしてマイクロリットル当たり、ほんの１コピーの標的ゲノムＤＮＡを使用したことであった。さらに、これらの実験では、本発明者らは、１つのプライマーのみを含有する反応物で生じる増幅の速度も試験した。プライマー対を含有するような反応物では、Ｊ１誘導体である１つのオリゴヌクレオチド、およびＫ２誘導体であるものを含有する対を試験した。誘導体が類似の５’修飾物を含んでいる対を使用した。明らかに、単一のプライマーの増幅速度が、この低い標的密度での２つのプライマーの増幅速度にほとんど類似し、そしてプライマーのノイズが、このきわめて低い標的密度での競合効果として始まる傾向にあることを示した。奇妙なことに、ただ１つのシトシン残基で異なるプライマー８および９は、大きく異なる増幅挙動を示した。このことは、シトシンの最小限のストレッチが高速の活性に要求されるか、またはある程度特異的な位相調整が明らかであることを示しうる。

図７１は、配列検出の特異性が、「第三プローブ」の使用によって改善される可能性があり、そしてどのようにフルオロフォア／消光剤の対で機能するように構成されうるかについての数例の戦略を示す。

特異的ＤＮＡ配列の存在は、３’末端がブロックされている第三のオリゴヌクレオチド・プローブの使用によって検出され得て、したがって、ノイズのある増幅（少なくとも、続くプロセッシングなしに）に関与しない。このような第三のプローブは、アンプリコンと特異的にハイブリッドを形成し得、そしてこのような二本鎖環境では、そのプローブを切断するＤＮＡプロセッシング酵素のための基質になり、フルオロフォアおよび消光剤を分離しうる。リコンビナーゼ環境の特性を考慮すると、フルオロフォアと消光剤とは、約１０−１２個未満のヌクレオチドにより分離される。候補のヌクレアーゼの選択を列挙し、そしてプローブ中に含まれるであろう修飾塩基、または各ヌクレアーゼに対するプローブのバックボーン特性を示す。

図７２は、ヘリックスを歪める（ｈｅｌｉｘ−ｄｉｓｔｏｒｔｉｎｇ）か、または塩基特異的なヌクレアーゼが、特異的配列を含む多型性を検出するために、どのように使用され得るかを示す。

リコンビナーゼで被覆され、相同性を検索する核タンパク質フィラメントを形成する単鎖ＤＮＡが示される。矢印は、このような構造の相互作用を示し、この相同な二本鎖は、単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）に関してそのプローブと同一であるか、または異なる（Ｇの代わりにＡ）かのいずれかである。両方の場合で、鎖交換は、首尾よく起こり、そして放出鎖は、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質によって安定化され得る。生じた新たな二本鎖は、完全に相補的であるか、または塩基ミスマッチを含むかのいずれかであり、それは、ヘリックスの局所的な変形（ゆがみ）を生じる。適切な構造特異的ヌクレアーゼの存在下で、変形を含むプローブ／鋳型は、ヌクレアーゼによって、おそらくいずれかの鎖でのニックまたは二重鎖切断のいずれかとして特異的に切断される。他の様式では、類似のアプローチは、プローブ内の修飾塩基（例えば、８−オキソグアニン）を含むことによって、多型性状態であろうとなかろうと関係なく、特異的の配列の存在または不在を検出するために使用されうる。この場合には、大腸菌Ｆｐｇタンパク質（８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ）のような、８−オキソグアニンおよび二本鎖環境に特異的な塩基除去酵素および無塩基部位切断酵素を使用し得る。いずれの場合にも、プローブ分子は、切断で分離されるフルオロフォアと消光剤の両方を含みうる。

図７３は、どのようにして二重標識蛍光オリゴヌクレオチドが、飽和リコンビナーゼおよび単鎖ＤＮＡ結合タンパク質を欠く環境と比較して、ＲＰＡ環境で異なる特性を示すかを示す。

左上で、ＲＰＡ環境で使用されるタンパク質の存在または不在下でそれらのオリゴヌクレオチドの蛍光特性を調査する実験で使用されたこれらのプローブが示される。条件は以下のとおりであった：
５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．４）
８０ｍＭ酢酸カリウム
１０ｍＭ酢酸マグネシウム
２ｍＭＤＴＴ
５％ＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ）
３ｍＭＡＴＰ
３０ｍＭクレアチンリン酸
１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
２００μＭｄＮＴＰ
示されるとおり１２０ｎＭの各オリゴヌクレオチド
必要に応じて：
６３０ｎｇ／μｌｇｐ３２
１４０ｎｇ／μｌＵｖｓＸ
３５ｎｇ／μｌＵｖｓＹ
本発明者らは、オリゴヌクレオチドのみを含むＦＡＭが、ＤＮＡ結合タンパク質の存在下で僅かに消光され、同様に、フルオロフォアに密接に結合したタンパク質による蛍光のある程度の消光を示すことを観察する。しかし、明らかに対照的には、フルオロフォアと消光剤の両方を含有するオリゴヌクレオチドは、逆の現象を示し、そしてこれは、それらが、長さ１０または１５の残基であるかどうかによって、明らかに異なる。さらに特に、両方の後者のプローブは、タンパク質の不在下で明らかに消光され、ランダム・コイルの形成が、長さにかかわらず十分な消光を確保するという概念と一致する。しかし、タンパク質の存在下では、この消光は低減される。特に、１５マーについての消光は、ほとんどなくなり、そしてそれは、タンパク質の存在下でオリゴヌクレオチドのみを含有するＦＡＭの蛍光レベルに近いと想定する。逆に、１０マーは、ほとんど影響されず、そして大きく消光されたままである。１５マーに対する消光の減少は、ＤＮＡ結合タンパク質の存在下で、プローブが、非常に堅いロッド（ｒｏｄ）に伸ばされるという示唆によって最も容易に説明される。例えば、ＵｖｓＸおよびｒｅｃＡは、単鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを、等価なＢ形態のＤＮＡの長さの約１．５倍に伸ばし、そして類似の伸長は、ｇｐ３２について説明される。したがって、そして遊離溶液の挙動と対照的に、フルオロフォアと消光剤は、ＲＰＡ環境で大きく分離され、ＤＮＡ二本鎖ではよりいっそう分離され、さらにそしてハイブリダイゼーションでさらに消光される可能性がある（しかし、この実験では調査されない）。右側に、１０マーおよび１５マーのプローブが、リコンビナーゼ環境の不在下または存在下、および二本鎖ＤＮＡにハイブリダイズした場合に潜在的にどのようなの状態であるかを示す略図を供する。フルオロフォアと消光剤とをより大きな「励起」半径により示し、これらは重なったときに、十分な蛍光共鳴エネルギー移動、および蛍光発生の同時的な減少を導く。

図７４は、テトラヒドロフラニル残基を含有するアンプリコン−プローブが、ＲＰＡ増幅反応での大腸菌Ｎｆｏ酵素についての基質になり、切断され、そして切断産物が伸長され得ることを示す。

ＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡ特異的プライマーＪ１およびＫ２（配列番号：６６および配列番号：６９）、入れ子プライマーＮＥＳＴ２６（配列番号：７７）およびビオチンおよびジゴキシゲニン標識プローブＴＨＦ−プローブ１（５’−ビオチン−ＣＡＴＧＡＴＴＧＧＡＴＧＡＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＧ−テトラヒドロフラン−ＴＧＡＴＴＡＡＡＧＧＡＡＡＣ−ＤＩＧ−３’配列番号：８０）（これは、プローブ本体内にテトラヒドロフラニル残基も含有した）を使用して、ＲＰＡ反応を確立した。このプローブは、Ｊ１およびＫ２プライマーによって増幅される断片に特異的であり、そしてＮＥＳＴ２６プライマーの配列を重複する（これら全てのプライマーは、いずれかで検討される）。それ自身でノイズを発生しないプライマーであるＮＥＳＴ２６が含まれ、その結果、より小さな入れ子産物（その末端の一方がそのプローブについての標的である）が発生される可能性があり、ちょうどその場合には、プローブは、二本鎖Ｊ１／Ｋ２アンプリコンへのプローブ浸入から生じるトポロジー的に拘束された環境できわめて不安定であった。反応は以下の条件を有した：
５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）
８０ｍＭ酢酸カリウム
１０ｍＭ酢酸マグネシウム
２ｍＭＤＴＴ
５％ＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ）
３ｍＭＡＴＰ
２５ｍＭクレアチンリン酸
１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
６００ｎｇ／μｌｇｐ３２
１２０ｎｇ／μｌＵｖｓＸ
３０ｎｇ／μｌＵｖｓＹ
１００μＭｄＮＴＰ
２００ｎＭのＪ１プライマー、Ｋ２プライマー、およびＮＥＳＴ２６プライマー
１００ｎＭプローブ
３０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ
１０００コピー／μｌＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡ、または示されるとおりの水対照。

増幅反応物を、フェノール抽出、沈殿し、そして１６．５％変性尿素−ＰＡＧＥで分離した。分離した産物を、ナイロン膜に移動させ、そしてストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体を使用して産物を検出した。プローブの５’末端をビオチン化したので、これは、未切断、切断および伸長プローブの検出を可能にした。（Ａ）遊離、およびプロセッシングされたプローブの検出。標的断片を増幅し得るＲＰＡ環境の存在下で、そのプローブは優先的に伸長された。伸長プローブのサイズは、Ｊ１／Ｋ２増幅産物の末端に対する伸長と一致し、そして、Ｎｆｏ切断活性が３’−ヒドロキシルを生じ、次にプローブを「遮断解除（ｕｎｂｌｏｃｋｉｎｇ）」し、そして合成伸長を可能にする。さらなる伸長は、高濃度のＮｆｏ酵素が使用されたときに見られた。（Ｂ）では、この実験に使用されたプローブの構造が示される。それは、Ｊ１およびＫ２プライマーによって発生されたアンプリコンの一部に相同な配列を含むが、しかし、テトラヒドロフラニル残基を含み、そしてビオチンで５’末端を、そしてジゴキシゲニンで３’末端を標識された（それゆえブロックされている）。（Ｃ）では、プローブと所望のアンプリコンとの相互作用、遊離３’末端の切断およびそれに続くポリメラーゼ伸長を介して伸長した産物の生成の根底にあると考えられる事象の順序の概略が示される。この実験では、出発鋳型を欠く反応での見掛けの活性は、ＲＰＡの非常に高い感度により、本発明者らの実験室で問題になってきた現象である、先の実験室規模の実験から得たアンプリコンの持ち込み混入から生じると考えられる。支持する証拠は、続く図面で提供される。

図７５は、テトラヒドロフラニル残基を含有するアプリコン−プローブが、ＲＰＡ増幅反応での大腸菌Ｎｆｏ酵素に対する基質になり、切断され、この切断産物が伸長され得ることを示す。

これらの実験では、テトラヒドロフラニル残基含有アンプリコン特異的プローブの切断および伸長が、特異的であり、そして反応中でのその標的配列の存在に依存し、そしてまた、ブローブ標的と重複する遊離末端を有すること（プローブ／標的組換え中間体の位相的な変形を避けるために）は必須でないという証拠が示される。（Ａ）では、反応設定を、概略的に描く。プライマーＪ１、Ｋ２、Ｌ２、ＮＥＳＴ２６（配列番号：６６、６９、７１、および７７）およびプローブによって標的にされたＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子座を描いた（実際の配列は、図４２Ｂで示される）。通常は、プライマーＪ１およびＫ２は、この遺伝子座を増幅するために日常的に使用され、したがって、原則的な実験室での混入は、これらの２つのプライマーによって生じる断片である。したがって、本発明者らもまた、数回の実験でＪ１とＬ２とを組み合わせ、この断片を、先のアンプリコンからの持ち込み混入に由来する増幅に供さなかった。（Ｂ）では、添加した出発鋳型（ゲノムＤＮＡ）の存在下、または不在下での、ＲＰＡ反応がＪ１／Ｋ２産物、またはＪ１／Ｌ２産物のいずれかを増幅するように構成された実験の結果が示される。その反応に含まれるのは、プローブおよび大腸菌Ｎｆｏタンパク質である。さらに詳細には、以下の条件を使用した：
５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）
８０ｍＭ酢酸カリウム
１０ｍＭ酢酸マグネシウム
２ｍＭＤＴＴ
５％ＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ）
３ｍＭＡＴＰ
２５ｍＭクレアチンリン酸
１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
６００ｎｇ／μｌｇｐ３２
１２０ｎｇ／μｌＵｖｓＸ
３０ｎｇ／μｌＵｖｓＹ
１００μＭｄＮＴＰ
２００ｎＭのＪ１プライマー、２００ｎＭのＫ２またはＬ２プライマー、および２００ｎＭＮＥＳＴ２６プライマー（レーン１−４）；レーン５および６では、Ｊ１およびＬ２プライマーは、３００ｎＭであり、そしてＮＥＳＴ２６を使用しなかった。
１２０ｎＭプローブ
３０ｎｇ／μｌＢｓｕポリメラーゼ
１０００コピー／μｌＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡ、または示される水対照
増幅反応物を、フェノール抽出、沈殿し、そして１６．５％変性尿素−ＰＡＧＥで分離した。分離した産物を、ナイロン膜に移動させ、そしてストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体を使用して産物を検出した。プローブの５’末端をビオチン化したので、このことは、未切断、切断および伸長プローブの検出を可能にした。（Ａ）遊離、およびプロセッシングされたプローブの検出。標的断片を増幅し得るＲＰＡ環境の存在下で、そのプローブは、優先的に伸長されたことに注目する。明らかな伸長が、Ｊ１／Ｋ２プライマーの対について、標的が添加されない場合に起こる（混入によると思われる）一方で、Ｊ１／Ｌ２プライマー対が使用されるときに、これが起こらない（非常にかすかなバンドはサンプル交差ローディングのアーティファクトであると思われる）ことにも注目べきである。結局、本発明者らは、プローブ切断／伸長が、特異的な事象であることを推定する。さらに、鋳型Ｊ１／Ｋ２サンプルなしでの明らかな信号は、その系が、おそらく持ち込み混入から生じる、きわめてわずかな標的に対してでさえ応答性が高いことを示唆する。（Ｃ）では、Ｊ１とＬ２プライマーが、標的ＤＮＡなしか、またはマイクロリットル当たり１０００コピーでの標的ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）を有するサンプルによりプローブと組合わせて使用された類似の実験の結果が示される。オリゴヌクレオチド濃度は以下の通りである：２４０ｎＭでのＪ１およびＬ２、ちょうど１２ｎＭでのプローブ、およびマイクロリットル当たり約１０００ｎｇのＮｆｏ酵素を使用した。他の条件は、パート（Ｂ）での実験について記述されるとおりである。サンプルを、所定の時間で取出し、そして停止した。サンプルを、フェノール抽出し、沈殿させ、そしてすでに示したとおり変性ゲルで泳動し、ナイロン膜に移動させ、そして上に記述されるとおり検出した。本発明者らは、切断／身長産物が、プローブが１２ｎＭ程度に低い場合でさえ３０分までに検出されうることに注目する。これは、これらの条件下でのＮｆｏ作用の反応速度が、リアルタイムで反応を良好にモニタリングするのに十分早いことを示唆する。

図７６は、ＲＰＡ反応のリアルタイム分析のために使用される可能性のある数種の有望な種類のプローブの全般的構造を示す。

ＲＰＡで使用するための二重標識プローブが、消光を可能にするのに比較的短い分離距離を必要とすることを示唆するデータを、ＴＨＦ残基含有プローブと二本鎖標的の間の中間体をプロセッシングする際の大腸菌Ｎｆｏタンパク質の有効な作用についての本発明者らの知見とを合わせることによって、本発明者らは、数個のプローブ構造を提案する。（Ａ）および（Ｂ）では、本発明者らは、フルオロフォアと消光剤の両方が内部で存在し（塩基修飾を通して）、そしてそれらの間に、ＴＨＦ残基が配置されるプローブを示す。フルオロフォアと消光剤との分離は、その基の間の有効なＦＲＥＴを確保するために１０−１２残基未満である。そのプローブは、適切な基で、３’末端でブロックされる。ＴＨＦ残基でのＮｆｏ酵素による切断は、フルオロフォアと消光剤の共有結合を排除し、最終的に、溶液の蛍光における増大をもたらす。（Ｃ）および（Ｄ）では、代替的配列が描かれる。この場合には、フルオロフォアまたは消光剤のいずれかは、プローブの３’末端に配置され、したがって伸長をブロックする。他の光吸収部分は、僅かに５’よりの内部連結を介して付着される。ＴＨＦ残基は、これらの２つの基の間に配置され、そして２つの光吸収基は、１０−１２未満の残基によって隔てられ、ＤＮＡ結合タンパク質によって伸ばされたときにさえ良好なＦＲＥＴを確保する。

（考察）
特定のＤＮＡ配列を増幅する、ｉｎｖｉｔｒｏ法に対する長く続く必要性が存在する。１９８０年代後半、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が、主にこの必要性を満たしてきた（Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９，４８７−９１（Ｊａｎ２９，１９８８））。しかしながら、温度サイクル器具の必要性が、研究室の場面の外でのＰＣＲの利用に対して、明らかな障壁となっている。本明細書で記述したように、本発明者らは、鋳型ＤＮＡの温度融解に対する必要性を取り除く、ＲＰＡと呼ぶ方法を開発した。ＲＰＡは、鋳型ＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションを媒介するための、決定的な規定条件下での、ｉｎｖｉｔｒｏでバクテリオファージＴ４組換え／複製系の成分を組み合わせている。特に、バクテリオファージＴ４リコンビナーゼｕｖｓＸ、単鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質ｇｐ３２、およびリコンビナーゼローディング因子ｕｖｓＹ、分子クラウディング剤とともに、忠実性の高い、ｉｎｖｉｔｒｏリコンビナーゼ−媒介ＤＮＡ標的化が可能になる。この標的化系を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰｏｌＩクラスの酵素によって媒介された、鎖置換ＤＮＡ合成と組み合わせた場合、有効な指数関数的ＤＮＡ増幅が達成される。

任意のオリゴヌクレオチド配列が、実質的に任意のＤＮＡ配列の増幅を可能にする、広い利用性をＲＰＡに与える、相同性検索フィラメント（図３７）を形成するリコンビナーゼによって覆われうる。この特徴が、他のｉｎｖｉｔｒｏＤＮＡ増幅方法に対してのＰＣＲの主要な利点の１つであった（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｍ．Ｃ．Ｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｇ．Ｎａｄｅａｕ，Ｄ．Ｄ．Ｓｈａｎｋ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８９，３９２−６（Ｊａｎ１，１９９２）；Ｄ．Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｍ．Ｂｒａｎｄｗｅｉｎ，Ｔ．Ｈｓｕｉｈ，Ｈ．Ｂ．Ｌｉ，ＭｏｌＤｉａｇｎ６，１４１−５０（Ｊｕｎ，２００１）；Ｍ．Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｙ．Ｘｕ，Ｈ．Ｋｏｎｇ．ＥＭＢＯＲｅｐ５，７９５−８００（Ａｕｇ，２００４）；Ｊ．Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ３５０，９１−２（Ｍａｒ７，１９９１））。そのｉｎｖｉｖｏの役割と類似して、相同性検索フィラメントが、オリゴヌクレオチドの配列と相補的な配列に関して、二本鎖ＤＮＡをスキャンする（Ｔ．Ｙｏｎｅｓａｋｉ，Ｙ．Ｒｙｏ，Ｔ．Ｍｉｎａｇａｗａ，Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ１４８，１２７−３４（Ａｐｒ１，１９８５）；ＴＳｈｉｂａｔａ，Ｃ．ＤａｓＧｕｐｔａ，Ｒ．Ｐ．Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｃ．Ｍ．Ｒａｄｄｉｎｇ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７６，１６３８−４２（Ａｐｒ，１９７９））。合致を発見した場合、リコンビナーゼが、数個の反応を触媒し、プライマーがその相補鎖と対をなし、類似する「放出」鎖が置換され、リコンビナーゼが分離する。これによって、他の反応成分に対して接近可能な「Ｄ−ループ」構造が確立される。放出鎖が、交換された領域の両側に連結するので、遊離ＤＮＡ末端から離れておこる交換事象によって、トポロジー的に歪んだ結合部が生成される（図３７Ｃ）。

組み込まれた配列によって、不安定である、トポロジー的に拘束された中間体が作製される。ＤＮＡ末端にて形成された結合部によって、置換された鎖の自由な回転が可能になる（Ｐ．Ｗ．Ｒｉｄｄｌｅｓ，Ｉ．Ｒ．Ｌｅｈｍａｎ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６０，１６５−９（Ｊａｎ１０，１９８５））。これら２つの構造が異なる安定性を持つので、初期鎖侵入事象の伸長は、続くものよりも効果が少ない（図３９Ｂ）。オリゴヌクレオチドの遊離３’末端が、大腸菌のクレノウ断片または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｓｕ）のような、鎖−置換ＤＮＡポリメラーゼによる合成を開始させる。ポリメラーゼの合成および鎖−置換活性が、二本鎖ＤＮＡおよび置換単鎖の生成をもたらす。この置換鎖は、直接的なハイブリダイゼーションおよび第二オリゴヌクレオチドの伸長によってか、または侵入事象がすでに反対の末端から起こっている場合には、鎖置換合成によって、のいずれかで複製される。２つの完全な娘二本鎖の発生によって、ＲＰＡの一ラウンドが完了する。侵入は、反応を最終的に支配している、末端標的化産物による先の合成反応の産物上で働き続ける。

本発明の方法の開発において、本発明者らは、数個の重要な条件が、最適なＲＰＡが生じるために重要であることを発見した。第一に、飽和量の核酸融解タンパク質（特に、ｇｐ３２のようなＳＳＢ）が、反応中に存在することが必要である。第二に、許容可能な侵入／鎖−交換速度を達成するために、十分な量のリコンビナーゼ負荷プライマーが存在することが必要である。最後に、リコンビナーゼ／単鎖ＤＮＡプライマーフィラメントが、動的であり、脱離可能であることが必要である。反応成分の競合する生化学的活性が存在する。たとえば、典型的なｉｎｖｉｔｒｏ状態で、リコンビナーゼは通常、飽和量の、ｇｐ３２のようなＳＳＢｓによって打ち負かされる。

この問題を克服するために、他の研究者らは、リコンビナーゼ／単鎖プライマーＤＮＡ相互作用を安定化する、ＡＴＰ−γ−Ｓのような非加水分解性ＡＴＰアナログを使用してきた（Ｓ．Ｃ．Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｃｌｏｗ，Ｒ．Ｓｏｍａｎｉ，Ａ．Ｖａｒｇｈｅｓｅ，ＪＭｏｌＢｉｏｌ１９３，８１−９５（Ｊａｎ５，１９８７）；Ａ．Ｌ．Ｅｇｇｌｅｒ，Ｓ．Ｌ．Ｌｕｓｅｔｔｉ，Ｍ．Ｍ．Ｃｏｘ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７８，１６３８９−９６（Ｍａｙ２，２００３）；Ｔ．Ｓｈｉｂａｔａ，Ｃ．ＤａｓＧｕｐｔａ，Ｒ．Ｐ．Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｃ．Ｍ．Ｒａｄｄｉｎｇ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７７，２６０６−１０（Ｍａｙ，１９８０））。しかしながら、非加水分解性ＡＴＰアナログは、鎖−交換反応を完了し、ポリメラーゼをＤ−ループに接近可能であるために必要な、リコンビナーゼ／単鎖ＤＮＡプライマーフィラメントの動的な活性と不適合である（Ｌ．Ｘｕ，Ｋ．Ｊ．Ｍａｒｉａｎｓ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７７，１４３２１−８（Ａｐｒ１９，２００２）；Ｐ．Ｗ．Ｒｉｄｄｌｅｓ，，Ｉ．Ｒ．Ｌｅｈｍａｎ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６０，１７０−３（Ｊａｎ１０，１９８５）；Ｎ．Ａｒｍｅｓ，Ｄ．Ｓｔｅｍｐｌｅ、ＰＣＴ国際特許第ＷＯ０３／０７２８０５号（ＡＳＭＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ２００３））（図３８）。

リコンビナーゼ／単鎖プライマーＤＮＡ相互作用を安定化させ得る他の方法が存在する。たとえば、ｕｖｓＹと呼ばれる他のバクテリオファージＴ４タンパク質が、ｇｐ３２被覆されたＤＮＡ上へのｕｖｓＸの負荷を補助することが知られている（Ｌ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｄ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，ＪＭｏｌＢｉｏｌ２０６，１９−２７（Ｍａｒ５，１９８９））。さらに、分子クラウディング剤もまた、大腸菌ｒｅｃＡリコンビナーゼタンパク質の負荷および安定化を促進することが知られている（Ｐ．Ｅ．Ｌａｖｅｒｙ，Ｓ．Ｃ．Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６７，９３０７−１４（Ｍａｙ５，１９９２））。したがって本発明者らは、ｕｖｓＹおよび分子クラウディング剤が、動的、ＡＴＰ−依存系中で、ｕｖｓＸとｇｐ３２間の好ましくない競合を軽減し得るか否かを試験した。

反応成分の漸増によって、規定量のＴ４ｇｐ３２、Ｔ４ｕｖｓＸ、Ｔ４ｕｖｓＹ、ＡＴＰおよびＰＥＧが、ＤＮＡ増幅に必要であることが明らかになった（図３８）。実際、Ｔ４ｕｖｓＹリコンビナーゼ媒介因子タンパク質およびＰＥＧ−化合物（Ｃｏｒｂｏｗａｘ２０Ｍ）が、検出可能な増幅を達成するために必要である。ｇｐ３２の濃度を減少させると、増幅効率が減じられ、反応産物のスミアとラダー化が発生する。リコンビナーゼｕｖｓＸタンパク質は、ＲＰＡに対して重要であり、反応速度が高濃度で加速されるが、このことはまたアーティファクトもまた増加させる（図３９Ａ）。ＡＴＰが反応に重要であり、本発明者らは、ＡＴＰの再生系が、ほとんどの反応に対して、産物の検出可能レベルに達するために必要であることを発見した。反対に、ＡＴＰ−γ−Ｓは、増幅の強力な阻害剤である。

診断試験のような、日常的なＤＮＡ増幅の適用のための有用なツールとするために、ＲＰＡは、多様な配列標的に対して感度がよく、特異的であり、適用可能であるべきであり、また、十分な大きさの断片を増幅可能であるべきである。本発明者らはまず、産出可能である産物の大きさを調査した。大きさにして、１０００塩基対までの増幅産物が、標準の反応条件を用いて増幅可能であった（図３８Ａ）。より大きな増幅産物がまた、ＲＰＡを用いて産出しうる。

本発明者らは、入れ子なしの単一段階ＲＰＡ反応、およびアガロースゲルの従来の臭化エチジウム染色による産物の検出を用いて、もっともストリンジェントな条件下でＲＰＡの感度を試験した。数個の独立したプライマー／標的のセットで、本発明者らは従来のように、１０コピー未満の開始二本鎖鋳型を検出した。本発明者らは、もっとも低い検出可能なコピー数での実験間で変化を観察したが、すべての試みが、１０コピー未満を検出することにおいて成功した。適切な試料操作にて、ＲＰＡが、単一反応において、単一分子から検出可能なレベルまで増幅するために使用可能である。この可能性を探索するために、本発明者らは、数コピーのみが残るまで希釈した、ヒトＤＮＡからの、多型試料タンデムリピート（ＳＴＲ）マーカーを増幅した。本発明者らは、試料ＤＮＡ中に存在する両方の可能な別々の対立遺伝子に相当する、多数の増幅された産物を産出した（図３９Ｅ、Ｆ）。この対立遺伝子分離効果によって、ＲＰＡが、単一分子感度を持ち、したがって、多くの他のＤＮＡ増幅方法の感度を超えていることが示される。

増幅された産物の量の解析によって、ＲＰＡが、少量の出発鋳型から、１０^{１１〜１２}倍まで、ＤＮＡ試料を日常的に増幅しうることが示される。最終的な産物レベルは、典型的には、１０〜２５０ｎＭの範囲であり、最も感度の悪い検出プロトコールのためにも十分すぎる量のＤＮＡを生成する。増幅反応の特異性を評価するために、本発明者らは、多くのプライマー対（ほとんどがヒトＤＮＡ配列に指向されるもの）を解析した。それぞれのプライマー／鋳型のセットに関して、本発明者らは、予想された産物の大きさ、制限酵素消化パターン、または増幅が特異的であることを示す産物ＤＮＡ配列を試験した。本発明者らは、本発明者らのデータのもっともよい解釈のために、試料ＤＮＡからの、非標的配列の増幅は観察しなかった。本発明者らが観察したアーティファクトは、産物またはプライマーに関連するものである（図３９Ａ）。

しばしば診断の場面において、試料中に存在する多量の非標的ＤＮＡから、特異性の問題が生じる。たとえば、病原体検出において、血液試料からのヒトＤＮＡが、病原体ＤＮＡの検出を干渉しうる。したがって、本発明者らは、多量の無関係なＤＮＡ中の、標的ＤＮＡの痕跡量を検出するために努めた。本発明者らは、ＲＰＡが、１μｇのヒトＤＮＡの存在下（すなわち、量にして、ヒトＤＮＡに対して、枯草菌ＤＮＡが１０^８倍分の１である）、１００コピーの枯草菌ＤＮＡから検出可能なレベルまで、標的を増幅可能であったことを発見した。そのような多量の試料ＤＮＡにて、本発明者らは、許容可能な反応速度を達成するために、過剰な競合ＤＮＡなしでの等価の反応と比較して、ｕｖｓＸおよびｕｖｓＹのレベルを増加させなければならないことを発見した。このことがおそらく、相同性−検索成分の（漸増不足）による。

数組の異なるプライマー／鋳型のセットでの経時的実験にて、本発明者らは、増幅速度が、産物の長さに部分的に依存することを発見した。しかしながら、１５０〜４００塩基対の範囲の断片に関しては、ほとんど同様の速度が観察され、２０分以内に、数百から数千の開始コピーから、ゲル検出可能なレベル（〜１０^１２コピー）まで増幅することを可能にする。本発明者らは、本発明者らが、そのような断片に対して、平均して、３０秒以下まで、平均「サイクル」時間を減少可能であったことを推定している。最適な短い標的配列と、感度よい検出方法を用いて、本発明者らは、診断増幅／検出アッセイを、１時間以内に良好に実施可能であったと期待する。本発明者らの研究によって、複合試料中の多数の任意のＤＮＡ標的に関して、高品質プライマー対が簡単に設計可能であることを示している。本発明者らは、最小オリゴヌクレオチド長を扱い、３０ヌクレオチドより小さなオリゴヌクレオチドは十分にＤＮＡを増幅しないが、３０〜３５ヌクレオチド長は、よいプライマーであり、簡単な合成に十分な長さであることを発見した（図４０）。

本明細書で示したように、ＲＰＡは、特定のＤＮＡ配列を増幅するための、優れた一般的な方法である。本発明者らは、ＲＰＡ反応を、マイナーグローブ結合色素を用いて、リアルタイムでモニタ可能であり、開始標的コピー数を評価する優れた能力を示している。さらに、多数の標的を、同時に増幅可能であり、配列−特異的リアルタイムセンサー（「第三プローブ」）を、反応環境中に簡単に組み込むことができる。本発明者らは、ｆｐｇ、ＮｔｈおよびとりわけＮｆｏのようなＤＮＡ修復酵素が、ＲＰＡ反応中で機能し、好適なプローブと組合せて、配列特異的な様式で、反応の挙動のリアルタイム評価が可能であることを同定し、示した。本発明者らは、蛍光に基づくプローブ系が、従来のＰＣＲ反応環境に対して、ＲＰＡ反応中環境中で明らかに異なる特性を示すか、または同様であることを示している。最後に、本発明者らの初期実験によって、従来の保存および再構築のために、ＲＰＡ反応の成分を凍結乾燥することが簡単であることが示唆されている（図４０）。一定の低温で確実に動作する、この方法を、簡便な保存のために、凍結乾燥可能であり、高感度のための温度サイクリングまたは融解の必要がなく、他の複雑な操作も必要なく、リアルタイムで簡単にモニタリング可能であり、ＤＮＡ診断、法医学、および他の使用時適用の開発において、有意な突破口を提供する。いったん、持ち運び可能な試料ＤＮＡ抽出および産物検出システムと統合したならば、ＲＰＡは、種々の病原体（たとえば、クラミジア（Ｃｌａｍｙｄｉａ）またはＭＲＳＡ）に対する簡単に使用できる臨床または家庭用試験キット、ならびに他の適用のための野外キットを可能にするに違いない。

本発明の１つまたはそれ以上の実施様態の詳細は、以上の付加する記述で列記されている。本明細書で記述された同様の、または等価の任意の方法および物質を、本発明の実施または試験にて使用可能であり、好ましい方法および物質がここに記載されている。本発明の他の特徴、目的および利点は、記述および請求項より明らかであろう。

本明細書および付加する請求項において、単数形態には、内容が特に他に明らかな指摘しない限り、複数の参照が含まれる。他の定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同様の意味を持つ。他の言及されない限り、本明細書で使用されるか、または企図される技術は、当業者によく知られている標準の方法である。本明細書で引用されたすべての特許、特許明細書および発行物は、本明細書で参考として援用される。

図１は、ＲｅｃＡ／プライマー負荷の略図である。図２Ａは、リーディング鎖リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ｌｓＲＰＡ）の連続的な工程の概略図である（パネル（Ａ）において示される）。図２Ｂは、リーディング鎖リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ｌｓＲＰＡ）の連続的な工程の概略図である（パネル（Ｂ）において示される）。図３Ａは、リーディング鎖およびラギング鎖リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅の連続的な工程の概略図である（パネル（Ａ）において示される）。図３Ｂは、リーディング鎖およびラギング鎖リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅の連続的な工程の概略図である（パネル（Ｂ）において示される）。図３Ｃは、リーディング鎖およびラギング鎖リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅の連続的な工程の概略図である（パネル（Ｃ）において示される）。図３Ｄは、リーディング鎖およびラギング鎖リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅の連続的な工程の概略図である（パネル（Ｄ）において示される）。図４は、ネステッドＲＰＡのために選択されるネステッドプライマーの例を示す。図５は、好適な二本鎖鋳型核酸の例を示す。図６Ａは、標的核酸とのハイブリダイゼーションにおけるＲＰＡプライマー対の種々の方向を、パネル（ａ）において示す。図６Ｂは、標的核酸とのハイブリダイゼーションにおけるＲＰＡプライマー対の種々の方向を、パネル（ｂ）において示す。図７Ａは、進行中のＲＰＡ反応の概略図を、パネル（Ａ）において示す。図７Ｂは、進行中のＲＰＡ反応の概略図を、パネル（Ｂ）において示す。図７Ｃは、進行中のＲＰＡ反応の概略図を、パネル（Ｃ）において示す。図８Ａ〜Ｃは、（Ａ）二本鎖プライマーの例；（Ｂ）プライマー対の第二のメンバーの伸長後およびアニーリング後の二本鎖プライマー；（Ｃ）非侵入鎖が置換されたプライマー対の第二のメンバーの伸長後を示す。図９は、二本鎖ＤＮＡ標的および標的にするオリゴヌクレオチドの性質についての調査を示す。スーパーコイル鋳型または線状ＤＮＡのいずれかを使用する実験は、ｒｅｃＡが、スーパーコイルＤＮＡにおいてかまたは線状ＤＮＡの末端において最も敏速にポリメラーゼ伸長を支持し得る中間体の形成を触媒することを示唆する。Ｔｅｓｔｅｒ３ｂｉｏオリゴヌクレオチド（配列番号１９）が示される。図１０は、バックファイアー合成を示す。好適なポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で、５’オーバーハングを有するｒｅｃＡ被覆された標的オリゴヌクレオチドが二重鎖ＤＮＡ末端に侵入するときに、バックファイアー合成が起こる。この新たな二重鎖領域は、その後の分枝の移動に対して安定であり、他の活性についてのプラットフォームとして使用され得る。侵入オリゴヌクレオチドからの伸長であるフォワードファイアーもまた、起こり得る。図１１は、バックファイアー合成の使用を示す。バックファイアー合成は有用であり得る。なぜなら、バックファイアー合成は、通常のオリゴヌクレオチドプライミングとは異なる用途に使用され得る、分枝の移動に耐性な構造を生成するからである。本明細書中にいくつかの例が示される。この例としては、連続的な侵入／合成／切断事象による、ニック形成酵素標的部位の導入、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの導入、および短いｄｓＤＮＡフラグメントの線状生成が挙げられる。図１２は、一本鎖結合タンパク質がリコンビナーゼの侵入およびプライマー伸長を促進することを示す。大腸菌ＳＳＢおよびＮ末端のヒスタグを有するＴ４ｇｐ３２（ｇｐ３２（Ｎ））はいずれも、線状ＤＮＡ鋳型においてｒｅｃＡ媒介性の侵入／伸長を刺激する。図１３は、線状の鋳型の末端標的化の間の、侵入および伸長のための最小オリゴヌクレオチド長またはオーバーハングに対する要求量を示す。侵入するオリゴヌクレオチドが線状化された鋳型の末端において標的化される場合、最小のオリゴヌクレオチド長またはオーバーハングが、侵入／伸長が起こるために必要とされる。図１４は、並行接合およびらせん接合を示す。ＤＮＡ末端または組み込まれる配列が関与する組み換え事象による、並行接合およびらせん接合の形成の概略図である。図１５は、クラウディング剤の効果を示す。クラウディング剤は、反応挙動を改変し得る。ポリエチレングリコール、ｇｐ３２（Ｎ）およびｒｅｃＡリコンビナーゼの存在下では、標的オリゴヌクレオチドにおける５’オーバーハングを必要とすることなく、複数の侵入事象が単一鋳型上で刺激され得る。図１６は、リーディング鎖ＲＰＡを使用する末端標的化増幅を示す。末端指向オリゴヌクレオチド、ｒｅｃＡ（Ｃ）タンパク質、および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を使用する、標的ＤＮＡの増幅である。図１７は、リーディング鎖ＲＰＡおよびクレノウ連続的合成能の制限を示す。０．５ｆｍｏｌのみの開始時の鋳型がｒｅｃＡタンパク質、ｇｐ３２（Ｎ）および大腸菌のクレノウ断片と一緒に使用された場合の、ほぼ３００塩基対のフラグメントの制限された増幅である。より短い産物が多く蓄積することは、クレノウ（１０〜５０ヌクレオチド）の乏しい連続的合成能が、反応の鋳型濃度依存性の根底にあり得ることを示唆する。図１８は、ＲＰＡプライマーの空間依存性を示す。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを使用する場合には、ＲＰＡのための最適のオリゴヌクレオチド間長さが存在する。鋳型配列（配列番号１）およびＥｃｏＲＩオーバーハング配列（配列番号１２４）が示される。図１９は、大規模に二本鎖になっているＲＰＡ産物を示す。ＲＰＡ反応は、アガロースゲル電気泳動および制限酵素切断によって証明されるように、二本鎖ＤＮＡ産物を生成し得る。図２０は、ｒｅｃＡＣ末端切断変異体の活性を示す。Ｃ末端酸性ペプチドの欠失を有する変異ｒｅｃＡタンパク質（ｒｅｃＡ（Ｃ）Δ）は、線状の鋳型ラン−オンアッセイにおける鎖交換および伸長を促進し得る。図２１は、改変ｇｐ３２タンパク質を示す。本研究において使用されるバクテリオファージＴ４ｇｐ３２タンパク質、ならびに種々の改変位置および変異位置についての模式図を示す。図２２は、ｇｐ３２タンパク質の活性を示す。改変したｇｐ３２タンパク質は、線状侵入／ラン−オンアッセイにおいて種々の活性を示す。図２３は、ｕｖｓＸを使用する侵入および伸長を示す。Ｃ末端ヒスタグを有する改変したｕｖｓＸタンパク質（ｕｖｓＸ（Ｃ））、またはＣ末端の酸性ペプチドの欠失をさらに有するものは、線状の鋳型のラン−オンアッセイにおいて侵入／伸長を刺激する。図２４は、ｕｖｓＸ（Ｃ）を使用するＲＰＡを示す。改変したリコンビナーゼｕｖｓＸ（Ｃ）は、ｇｐ３２（Ｎ）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下でＤＮＡ増幅を支持し得る。図２５は、改変したｇｐ３２を野生型に対して示す。ｇｐ３２の改変したバージョンのｇｐ３２（Ｃ）は、未タグの野生型ｇｐ３２とは定性的に異なっている。図２６は、ｇｐ３２の漸増およびｕｖｓＹの作用を示す。ｇｐ３２の漸増は、非タグのｇｐ３２が使用される場合の、最少量のｇｐ３２についての要件およびｕｖｓＹ（Ｎ）タンパク質についての要件を、明らかにする。図２７は、反応速度およびノイズに影響する要因を示す。反応挙動、特に、反応速度およびノイズに影響を与える要因の模式図を示す。ｇｐ３２、ｕｖｓＸ、ＵｖｓＹおよびＰＥＧの予想される効果および相互作用が示され、結論として、反応速度とノイズとの間の最適な平衡が突き止められるはずである。図２８はＰＥＧの効果を示す。ＰＥＧはｇｐ３２（Ｃ）の存在下でのｕｖｓＸ媒介性の線状ラン−オン実験において、線状の侵入／ラン−オン産物の平均長を低下させ得る。図２９は、ＤＮＡ末端指向性侵入を示す。末端指向性侵入事象の可能性のある結果を描いた模式図が示される。図３０は、複合サンプル中のＲＰＡを示す。ヒトゲノムＤＮＡからの特異的ＤＮＡ標的の増幅である。図３１はＲＰＡ感度を示す。ヒトゲノムＤＮＡからの特異的ＤＮＡ標的の増幅の感度である。図３２は、ＲＰＡ感度および鋳型非依存的なアーティファクトを示す。ヒトゲノムＤＮＡからの特異的ＤＮＡ標的の増幅感度、および競合性の鋳型非依存的プライマーアーティファクトの存在を示す。図３３は、プライマーアーティファクトが起こり得る方法を示す。プライマーアーティファクトが起こり得る、可能性ある機構の模式図が示される。図３４は、プライマーアーティファクトの抑制を示す。プライマーアーティファクトを抑制するための方法を模式的に示す。図３５は、被置換鎖の自己プライミングを刺激するためのヘアピンオリゴヌクレオチドの使用を示す。被置換鎖の自己プライミングを刺激するために、自己相補的なヘアピンオリゴヌクレオチドを意図的に使用した増幅の模式図を示す。図３６は、複合ＤＮＡ供給源からの高効率のノイズ無しの増幅を可能にする条件を示す。プライマーアーティファクトを低減するかまたは除く最適化した条件の下での、ヒトゲノムＤＮＡからの特異的ＤＮＡ標的の増幅感度。図３７は、（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に示されるようにＲＰＡ方法の模式図を示す。図３８は、以下を示す：（Ａ）ＲＰＡ条件Ｃ４を使用した７つの独立したマーカーに対するプライマー対を用いて増幅した、２人の個体（１および２、父親と息子）由来のＳＴＲマーカー；（Ｂ）インビトロ増幅を支持する濃度を決定するための、反応成分の漸増。図３９は、以下を示す：（Ａ）ＲＰＡ反応のサイズ限界；（Ｂ）組み込まれた配列または末端配列からの伸長効率；（Ｃ）ＲＰＡ反応の感度；（Ｄ）条件Ｃ２を使用して３００ｂｐのフラグメントを生成するプライマーＡｐｏＢ４およびＡｐｏ３００を用いて増幅した、示されるコピー数のヒトＤＮＡ；（Ｅ）、（Ｆ）プライマーＤ１８Ｓ５１５’およびＤ１８Ｓ５１３’を用いて増幅した、一人の個体からのヒトＤＮＡ。使用した条件は（Ｅ）においてはＣ２であり、（Ｆ）においてはＣ４であった。図４０は、以下に関するＲＰＡ反応の特異性を示す：（Ａ）プライマーＢｓＡ３およびＢｓＢ３、これらは条件Ｃ３を使用して３８０ｂｐのフラグメントを増幅する。アスタリスクは予想される反応産物の位置を示し、矢印はゲノムＤＮＡの位置を示す；（Ｂ）、（Ｃ）条件Ｃ４を使用して３４５ｂｐのフラグメントを生成するオリゴヌクレオチドＡｐｏ６００ｂｉｏおよびＡｐｏ３００ｒｅｖ；（Ｄ）示される成分ＰＥＧおよびバッファーの非存在下で組立た反応成分の混合物。使用したプライマーを示す。標的ＤＮＡは１５０コピー／μｌのヒト男性のゲノムＤＮＡであった；（Ｅ）示されるように２５塩基、２８塩基または３２塩基の重なり合うプライマー対を使用してインキュベートした、ヒトゲノムＤＮＡにおける３つの独立した遺伝子座を標的化するオリゴヌクレオチド。低い標的コピー数でのプライマーノイズ。代表的ＲＰＡ反応における標的の出発コピー密度を低下させた結果を示す。候補フォワードプライマーおよび候補リバースプライマーの選択と、極めて低い出発コピー密度での結果を試験することとを合わせた、最適プライマーの選択（配列番号１２３）。どれくらいのプライマーノイズで開始するかという理論的な考慮事項。オリゴヌクレオチド改善ストラテジー（３つの一般的スキームの概要）。プライマーを減らした結果（短いプライマーは、より少ない産物を与えるが、３０未満の残基でも依然として活性を保持し得る）。ロックされた核酸は、ＲＰＡにおいて機能し得、そして産物蓄積、ノイズ蓄積およびポリメラーゼ濃度の必要要件において有意差を示し得る。ホモポリマー伸長鎖をプライマーの５’末端に付加することは、核タンパク質活性を変更し得る。ベタインは、産物およびノイズのレベルを低下させる。差示的な活性を有する核タンパク質フィラメントを合わせる組合せストラテジー。産物富化のための「第３の」プライマーを組み込んでいる検出フォーマット。ビーズ捕獲Ｉ。第３のプローブが、標的からの真の産物を濃縮する実験ストラテジーの概略図。ビーズ捕獲ＩＩ。固体支持体に固定された低活性核タンパク質フィラメントが第３のプライマーとして参加し得、そして標的アンプリコンをプライマーノイズから切り離し得ることを証明している実験結果。トレハロースは凍結乾燥物を安定化させ、緩衝化されたサンプル以外のすべての成分を室温で少なくとも１０日間活性のままにし得る。副溝結合色素であるＳＹＢＲ緑およびＳＹＢＲ金は、ＲＰＡ反応に含まれ得、そしてＤＮＡ反応産物の蓄積を検出する。ＳＹＢＲ緑色素を使用して、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡコピー数の定量的評価を４オーダーの大きさにわたって行い得る。ＳＹＢＲ緑色素を使用して、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡコピー数の定量的評価を、少なくとも５オーダーの大きさにわたって行い得る。定量的リアルタイムＲＰＡは、ヒトゲノムＤＮＡの漸増に素晴らしく応答する。不完全なプローブ：標的ハイブリッドにおける一本鎖バブルの存在は、動的組換え環境における二重鎖破壊全体の増強をもたらす。動的組換え環境における潜在的な長さの多型プローブのアレイに対するアンプリコンのハイブリダイゼーションは、古典的ハイブリダイゼーションまたは非動的組換え環境と比較して、完全な、または完全に近いマッチのハイブリッドの富化をもたらす。単一チューブ逆転写ＲＰＡ（ＲＴ−ＲＰＡ）は、大した最適化のない高感度を示す。ｄＵＴＰはＲＰＡ反応に含まれて、ｄＴＴＰと完全または部分的に置き換わり得、従って、有効なキャリーオーバー混入コントロールを開発する機構を提供し得る。ＲＰＡ反応におけるキャリーオーバー混入を制御するためのストラテジー。成功裏の増幅を検出するための使い捨て増幅ポーチおよび側方流動ストリップを備える、特定の核酸の存在を決定する、独立型ＲＰＡアッセイのフォーマット。ヒトの血液の溶解物とのＲＰＡの適合性は、複雑な試料調製が多くの試料について除去され得るという可能性を示す。反応環境（塩およびＰＥＧ濃度）を最適化する際のリアルタイムＲＰＡ分析の有用性。反応環境（マグネシウム濃度）を最適化する際のリアルタイムＲＰＡ分析の有用性。プライマー配列は、増幅速度挙動に影響を及ぼす（事前分析は、「速い」プライマーが、低いＧ含量および高いＣ含量またはＣ／Ｔ含量と関係し得ることを示唆する。反応環境を最適化する際のリアルタイムＲＰＡ分析の有用性：オリゴヌクレオチドに付加された異種５’配列は、反応挙動に影響を及ぼす。反応環境を最適化する際のリアルタイムＲＰＡ分析の有用性；オリゴヌクレオチドに付加された異種５’配列は、反応挙動に影響を及ぼす（すべてのピリミジン高含有５’配列が優れた反応速度挙動を駆動するというわけではない）。反応環境を最適化する際のリアルタイムＲＰＡ分析の有用性；オリゴヌクレオチドに付加された異種５’配列は、反応挙動に影響を与えた（すべてのピリミジン高含有５’配列が優れた反応速度挙動を駆動するというわけではない）。いわゆる、「第３プローブ」は、ＲＰＡ反応をモニターして特異性を増加させるために用いられ得る。標的およびプローブを含んでいる特定の二重鎖を連続合成するための候補酵素。らせん変形および損傷塩基／脱塩基部位のような異常な特徴を認識する酵素は、プローブ／標的ハイブリッドを連続合成するために使用され得る。蛍光プローブは、他の増幅反応において使用される標準環境と比較して、ＲＰＡ環境における有意に異なる特性を実証する。テトラヒドロフラニル残基を含んでいるプローブは、増幅された標的、大腸菌Ｎｆｏ酵素およびポリメラーゼを含んでいるＲＰＡ環境において、効率的に切断され、伸長される。テトラヒドロフラニル残基を含んでいるプローブは、増幅された標的、大腸菌Ｎｆｏ酵素およびポリメラーゼを含んでいるＲＰＡ環境において、効率的に、迅速にかつ特異的に切断され、そして伸長される。大腸菌Ｎｆｏ酵素を使用しているリアルタイムＲＰＡ研究のためのプローブ計画の例。

Claims

標的核酸分子のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
該標的核酸分子は、第１のＤＮＡ鎖および第２のＤＮＡ鎖を含み、
該方法は、
（ａ）リコンビナーゼ因子を核酸プライマーと接触させてリコンビナーゼ因子／核酸プライマー複合体を形成する工程であって、該リコンビナーゼ因子／核酸プライマー複合体は単鎖領域をその３’末端に含む、工程；
（ｂ）該リコンビナーゼ因子／核酸プライマー複合体を該標的核酸分子と接触させ、それにより該標的核酸分子の一部において二本鎖構造を形成する工程；
（ｃ）該核酸プライマーの３’末端を、１種類以上のポリメラーゼとｄＮＴＰとを用いて伸長させて、二本鎖核酸と、核酸被置換鎖とを生成する工程；ならびに
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）を、所望の増幅度に達するまで反復することを介して、該反応を継続する工程
を含み、ここで、
該標的核酸分子の一部は該核酸プライマーの配列に対して相同な配列からなり、そして、該方法は、工程（ｂ）および（ｃ）において、１重量％〜１２重量％または１容量％〜１２容量％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下において実施され、該１重量％〜１２重量％または１容量％〜１２容量％のＰＥＧの存在が増幅を刺激する、方法。
前記ＰＥＧが、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、１５，０００〜２０，０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧ化合物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記工程（ｂ）および（ｃ）がアクセサリー因子の存在下で実施され、該アクセサリー因子が、単鎖結合タンパク質、ヘリカーゼ、リゾルベース、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、ＲｕｖＣ、ＲｅｃＧ、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＴ、ＤｎａＢ、ＤｎａＣ、ＤｎａＧ、ＤｎａＸクランプ負荷体、ポリメラーゼコア複合体、ＤＮＡリガーゼ、スライディングクランプおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記アクセサリー因子が、単鎖結合タンパク質、ヘリカーゼ、リゾルベースおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
前記アクセサリー因子が、単鎖結合タンパク質、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、ＲｕｖＣ、ＲｅｃＧ、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＴ、ＤｎａＢ、ＤｎａＣ、ＤｎａＧ、ＤｎａＸクランプ負荷体、ポリメラーゼコア複合体、ＤＮＡリガーゼ、スライディングクランプおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
前記核酸プライマーが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノ主鎖核酸、ホスホロチオレート主鎖核酸、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記方法がリコンビナーゼ因子／核酸プライマー複合体安定化因子の存在下で実施され、該リコンビナーゼ因子がＲｅｃＡであり、そして、該核酸プライマーがｓｓＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
前記安定化因子が、ＲｅｃＲ、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＦおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
前記方法がｇｐ３２、大腸菌ＳＳＢタンパク質、Ｔ４ｇｐ３２タンパク質、およびｇｐ３２の誘導体からなる群より選択される単鎖安定化因子の存在下で実施され、該ｇｐ３２の誘導体が、Ｎ末端にタグを有するｇｐ３２、Ｃ末端にタグを有するｇｐ３２、リシンではないアミノ酸による３位のリシンの置換を有するｇｐ３２、およびアルギニンではないアミノ酸による４位のアルギニンの置換を有するｇｐ３２、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記リシンではないアミノ酸がアラニンであり、そして、前記アルギニンではないアミノ酸がグルタミンまたはトレオニンである、請求項９に記載の方法。
前記方法がリコンビナーゼ負荷タンパク質の存在下で実施され、該リコンビナーゼ負荷タンパク質が、Ｔ４ｕｖｓＹ、大腸菌ｒｅｃＯ、大腸菌ｒｅｃＲならびにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記リコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法が前記リコンビナーゼ因子の補因子をさらに含み、該補因子が、ＡＴＰ、ＡＴＰ−γ−Ｓ、ＡＴＰ−β−Ｓ、ｄｄＡＴＰ、およびその組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記リコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法がＡＤＰをＡＴＰに変換するためのＡＴＰ再生系をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記ＡＴＰ再生系が、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含む、請求項１３に記載の方法。
前記リコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法がピロリン酸塩をリン酸塩に変換するためのピロホスファターゼをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記１種類以上のＤＮＡポリメラーゼが、原核生物のポリメラーゼ、真核生物のポリメラーゼおよびファージにコードされたポリメラーゼからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記真核生物のポリメラーゼが、ｐｏｌ−α、ｐｏｌ−β、ｐｏｌ−δ、ｐｏｌ−εならびにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
前記原核生物のポリメラーゼが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片、バクテリオファージＴ４ｇｐ４３ＤＮＡポリメラーゼ、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼＩラージフラグメント、φ−２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＰｏｌＩラージフラグメント（Ｂｓｕポリメラーゼ）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＶならびにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
前記リコンビナーゼ因子が温度感受性であり、該温度感受性リコンビナーゼ因子は、許容温度で鎖侵入活性を有するが、非許容温度では鎖侵入活性を有さない、請求項１に記載の方法。
ネステッドリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
（ａ）請求項１に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法を用い、第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いてＤＮＡの一領域を増幅し、第１の増幅産物を生成させる工程；
（ｂ）第３のプライマーおよび第４のプライマーを用い、請求項１に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法を用いて該増幅産物を増幅し、第２の増幅産物を生成させる工程であって、該第２の増幅産物は、該第１の増幅産物内に含まれる、より短い配列である、工程；
を含む、方法。
前記ｄＮＴＰのうちの少なくとも一部または少なくとも１つのプライマーが、検出可能なマーカーで標識されている、請求項１に記載の方法。
前記標識が、蛍光色素、酵素、蛍光消光剤、酵素阻害剤、放射性標識およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
前記リコンビナーゼ因子が、ｕｖｓＸまたはＴ４ｕｖｓＸである、請求項１に記載の方法。
請求項１に記載のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
（ａ）以下の試薬
（１）少なくとも１種類のリコンビナーゼ；
（２）少なくとも１種類の単鎖ＤＮＡ結合タンパク質；
（３）少なくとも１種類のＤＮＡポリメラーゼ；
（４）ｄＮＴＰ、またはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物；
（５）ＰＥＧ；
（６）バッファー；
（７）還元剤；
（８）ＡＴＰ、ＡＴＰ−γ−Ｓ、ＡＴＰ−β−ＳまたはｄｄＡＴＰ；
（９）少なくとも１種類のリコンビナーゼ負荷タンパク質；
（１０）第１のプライマー、および任意選択の第２のプライマー；ならびに
（１１）標的核酸分子
を反応物中で合わせる工程；ならびに
（ｂ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含み、１重量％〜１２重量％または１容量％〜１２容量％の該ＰＥＧが増幅を刺激する、方法。
請求項１に記載のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
（ａ）以下の試薬
（１）０．２〜１２μＭの濃度のｕｖｓＸリコンビナーゼ；
（２）１〜３０μＭの濃度のｇｐ３２単鎖ＤＮＡ結合タンパク質；
（３）５０〜５０００単位／ｍｌの濃度のＴ４ｇｐ４３ＤＮＡポリメラーゼまたはＢｓｕポリメラーゼ；
（４）１〜３００μＭの濃度のｄＮＴＰ、またはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物；
（５）１重量％〜１２重量％または１容量％〜１２容量％の濃度のポリエチレングリコール；
（６）１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；
（７）１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のＤＴＴ；
（８）１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のＡＴＰ；
（９）０．２μＭ〜８μＭの濃度のｕｖｓＹ；
（１０）第１のプライマー、および任意選択の第２のプライマーであって、該第１のプライマーおよび第２のプライマーは５０ｎＭ〜１μＭの濃度である、プライマー；ならびに
（１１）少なくとも１コピーの標的核酸分子
を反応物中で合わせる工程；
（ｂ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含み、
該ポリエチレングリコールが増幅を刺激する、方法。
請求項１に記載のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
（ａ）以下の試薬
（１）１００〜２００ｎｇ／μｌｕｖｓＸリコンビナーゼ；
（２）６００ｎｇ／μｌｇｐ３２；
（３）２０ｎｇ／μｌのＢｓｕポリメラーゼまたはＴ４ポリメラーゼ；
（４）２００μＭｄＮＴＰ；
（５）１ｍＭＤＴＴ；
（６）３ｍＭのＡＴＰ、ＡＴＰ−γ−Ｓ、ＡＴＰ−β−ＳまたはｄｄＡＴＰ；
（７）１６ｎｇ／μｌ〜６０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ；
（８）３００ｎＭの第１のプライマーおよび３００ｎＭの第２のプライマー；
（９）８０ｍＭ酢酸カリウム；
（１０）１０ｍＭ酢酸マグネシウム；
（１１）２０ｍＭクレアチンリン酸；
（１２）１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
を反応物中で合わせる工程；
（ｂ）該工程（ａ）の試薬を凍結乾燥して凍結乾燥試薬を形成する工程；
（ｃ）該凍結乾燥試薬を
（１）１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；
（２）１重量％〜１２重量％または１容量％〜１２容量％の濃度のポリエチレングリコール；
（３）標的核酸
により再構成する工程；
（ｄ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含み、
該ポリエチレングリコールが増幅を刺激する、方法。
請求項１に記載のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
（ａ）以下の試薬
（１）１００〜２００ｎｇ／μｌｕｖｓＸリコンビナーゼ；
（２）３００〜１０００ｎｇ／μｌｇｐ３２；
（３）１０〜５０ｎｇ／μｌのＢｓｕポリメラーゼまたはＴ４ポリメラーゼ；
（４）５０〜５００μＭｄＮＴＰ；
（５）０．１〜１０ｍＭＤＴＴ；
（６）３ｍＭのＡＴＰ、ＡＴＰ−γ−Ｓ、ＡＴＰ−β−ＳまたはｄｄＡＴＰ；
（７）１６ｎｇ／μｌ〜６０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ；
（８）５０〜１０００ｎＭの第１のプライマーおよび５０〜１０００ｎＭの第２のプライマー；
（９）４０〜１６０ｍＭ酢酸カリウム；
（１０）５〜２０ｍＭ酢酸マグネシウム；
（１１）１０〜４０ｍＭクレアチンリン酸；
（１２）５０〜２００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ；
を反応物中で合わせる工程；
（ｂ）該工程（ａ）の試薬を凍結乾燥して凍結乾燥試薬を形成する工程；
（ｃ）該凍結乾燥試薬を
（１）１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；
（２）１重量％〜１２重量％または１容量％〜１２容量％の濃度のポリエチレングリコール；
（３）標的核酸
により再構成する工程；
（ｄ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含み、
該ポリエチレングリコールが増幅を刺激する、方法。
請求項１に記載のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
（ａ）以下の試薬
（１）１００〜２００ｎｇ／μｌｕｖｓＸリコンビナーゼ；
（２）３００〜１０００ｎｇ／μｌｇｐ３２；
（３）１０〜５０ｎｇ／μｌのＢｓｕポリメラーゼまたはＴ４ポリメラーゼ；
（４）５０〜５００μＭｄＮＴＰ；
（５）０．１〜１０ｍＭＤＴＴ；
（６）３ｍＭのＡＴＰ、ＡＴＰ−γ−Ｓ、ＡＴＰ−β−ＳまたはｄｄＡＴＰ；
（７）１６ｎｇ／μｌ〜６０ｎｇ／μｌｕｖｓＹ
（８）５０〜１０００ｎＭの第１のプライマーおよび５０〜１０００ｎＭの第２のプライマー；
（９）４０〜１６０ｍＭ酢酸カリウム；
（１０）５〜２０ｍＭ酢酸マグネシウム；
（１１）１０〜４０ｍＭクレアチンリン酸；
（１２）５０〜２００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ；
（１３）１重量％〜１２重量％または１容量％〜１２容量％の濃度のポリエチレングリコール
を反応物中で合わせる工程；
（ｂ）該工程（ａ）の試薬を凍結乾燥して凍結乾燥試薬を形成する工程；
（ｃ）該凍結乾燥試薬を
（１）１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；
（２）標的核酸
により再構成する工程；
（ｄ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含み、
該ポリエチレングリコールが増幅を刺激する、方法。