DE102016108115B4

DE102016108115B4 - Probenpuffer mit niedermolekularem Farbstoffstabilisator für Gelelektrophorese

Info

Publication number: DE102016108115B4
Application number: DE102016108115.9A
Authority: DE
Inventors: Marcus Gassmann; Jim Elliot
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 2016-05-02
Filing date: 2016-05-02
Publication date: 2019-05-09
Anticipated expiration: 2036-05-03
Also published as: DE102016108115A1

Abstract

Probenpuffer (100) zum Beladen mit einer zu trennenden fluidischen Probe (106), wobei der Probenpuffer (100) aufweist:
einen Fluoreszenzfarbstoff (102) zum Koppeln mit der fluidischen Probe (106);
einen Farbstoffstabilisator (104) zum Stabilisieren des Fluoreszenzfarbstoffs (102), wobei der Farbstoffstabilisator (104) ein Molekulargewicht von höchstens 5000 Da aufweist, und
wobei der Farbstoffstabilisator (104) in einer Konzentration in einem Bereich zwischen 0,002 Gew.-% und 0,2 Gew.-% vorgesehen ist.

Description

TECHNISCHER HINTERGRUND
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Probenpuffer, ein Kit zum Trennen einer fluidischen Probe, eine Elektrophoreseanordnung, ein Verfahren zum Trennen einer fluidischen Probe und eine Verwendung.
Gelelektrophorese ist eine analytische Methode der Chemie und Molekularbiologie, um verschiedene Arten von Molekülen zu trennen. Dabei wandert eine Mischung aus zu trennenden Molekülen unter dem Einfluss eines elektrischen Felds durch ein Polymer, welches in einer ionischen Pufferlösung liegt. Je nach Größe und Ladung der Moleküle bewegen sich diese unterschiedlich schnell durch das als Molekularsieb wirkende Polymer. Dabei wandern kleine, negativ geladene Moleküle am schnellsten in Richtung der positiv geladenen Anode und positiv geladene Moleküle in Richtung der negativ geladenen Kathode.
Um mittels Gelelektrophorese getrennte Fraktionen einer fluidischen Probe optisch erfassen zu können, ist es möglich, Moleküle der fluidischen Probe mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu markieren. Allerdings haben derartige Fluoreszenzfarbstoffe die unerwünschte Eigenschaft, sich mit der Zeit auf einem Untergrund oder Träger abzusetzen und somit als Fluoreszenzlabel für die zu detektierende fluidische Probe verloren zu gehen. Dies reduziert die erreichbare Sensitivität einer Analyse mittels Gelelektrophorese.
WO 2005 118806 A2 betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zum Isolieren, Anreichern und/oder Markieren von miRNA-Molekülen und zum Herstellen und Verwenden von Arrays oder anderen Detektionstechniken für die miRNA-Analyse.
WO 2005 118853 A2 beschreibt Verfahren für die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) einer Ziel-DNA, die die Eigenschaften der Rekombinase und verwandter Proteine ausnutzt, um in doppelsträngige DNA mit einzelsträngiger homologer DNA einzudringen, die ein sequenzspezifisches Priming von DNA-Polymerasereaktionen ermöglicht.
WO 2013 000471 A1 betrifft Antikörper gegen Ficolin-3.
OFFENBARUNG
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, Gelelektrophorese mit hoher Sensitivität zu ermöglichen. Die Aufgabe wird mittels der unabhängigen Ansprüche gelöst. Weitere Ausführungsbeispiele sind in den abhängigen Ansprüchen gezeigt.
Gemäß einem exemplarischen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist ein Probenpuffer (Loading Buffer) zum Beladen eines Trennmediums mit einer zu trennenden fluidischen Probe (das heißt einer Probe, die vorzugsweise flüssig Ist, optional aufweisend feste Partikel) geschaffen, wobei der Probenpuffer einen Fluoreszenzfarbstoff zum Koppeln mit der fluidischen Probe, und einen Farbstoffstabilisator zum Stabilisieren des Fluoreszenzfarbstoffs aufweist, und wobei der Farbstoffstabilisator ein Molekulargewicht (oder eine Molekülmasse oder molekulare Masse) von höchstens 5000 Da (Dalton) aufweist. Hierbei ist der Farbstoffstabilisator in einer Konzentration in einem Bereich zwischen 0,002 Gew.-% und 0,2 Gew.-% vorgesehen.
Gemäß einem anderen exemplarischen Ausführungsbeispiel ist ein Kit zum Trennen einer fluidischen Probe bereitgestellt, wobei das Kit einen Träger mit einem Trennmedium, und einen Probenpuffer mit den oben beschriebenen Merkmalen aufweist, wobei der mit der fluidischen Probe zu beladende Probenpuffer zum Trennen der fluidischen Probe auf den mit dem Trennmedium versehenden Träger aufzubringen ist.
Gemäß noch einem anderen exemplarischen Ausführungsbeispiel ist eine Elektrophoreseanordnung bereitgestellt, die ein Kit mit den oben beschriebenen Merkmalen und eine elektrische Felderzeugungseinrichtung zum Erzeugen eines elektrischen Felds entlang des Trägers aufweist, so dass eine fluidische Probe (insbesondere geladene Partikel darin) in dem Probenpuffer bei Aufbringen auf das Trennmedium unter dem Einfluss eines erzeugten elektrischen Felds trennbar ist (insbesondere in Fraktionen trennbar ist).
Gemäß einem weiteren exemplarischen Ausführungsbeispiel ist ein Verfahren zum Trennen einer fluidischen Probe geschaffen, wobei bei dem Verfahren ein Probenpuffer mit einer fluidischen Probe beladen wird, der einen Fluoreszenzfarbstoff und einen Farbstoffstabilisator (zum Stabilisieren des Farbstoffs) mit einer Molekülmasse von höchstens 5000 Da aufweist, der mit der fluidischen Probe beladene Probenpuffer auf ein Trennmedium auf einem Träger aufgebracht wird, und ein elektrisches Feld entlang des Trägers zum Trennen der fluidischen Probe angelegt wird.
Gemäß noch einem anderen exemplarischen Ausführungsbeispiel wird ein Polyethylenglykol (PEG), welches ein Molekulargewicht von höchstens 5000 Da aufweist, zum Stabilisieren eines Fluoreszenzfarbstoffs zum Markieren einer fluidischen Probe in der Elektrophorese verwendet.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wird unter einem „Probenpuffer“ (auch Ladepuffer, sample buffer, loading buffer) insbesondere eine Lösung, vorzugsweise mit gepuffertem pH-Wert, verstanden, der vor einer Gelelektrophorese einer fluidischen Probe zugesetzt wird. Ein solcher Probenpuffer kann eine oder mehrere der folgenden Funktionen erfüllen. Durch einen Probenpuffer kann der pH-Wert der Probe stabilisiert werden. Weiterhin kann ein Probenpuffer elektrisch neutrale, wasserlösliche Moleküle höherer Dichte, wie zum Beispiel Glycerol, Saccharose, etc. zur Erhöhung der Dichte der fluidischen Probe aufweisen, so dass die fluidische Probe beim Probenauftrag sich auf dem Gel absetzt. Zur Visualisierung der fluidischen Probe können ferner Farbstoffe zugesetzt werden. Durch die optische Kontrolle anhand einer wandernden farbigen Bande kann die Elektrophorese beendet werden, bevor der Farbstoff und somit auch die fluidische Probe das Gel vollständig durchwandert haben und es wieder verlassen.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wird unter „Gelelektrophorese“ ein Trennverfahren zum Trennen einer fluidischen Probe in Fraktionen (zum Beispiel DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge) verstanden, bei dem eine unterschiedliche lonenbeweglichkeit unterschiedlicher Fraktionen derfluidischen Probe verwendet wird, um ionische Fraktionen im einem elektrischen Feld zu trennen und zum Beispiel getrennt einer Messung (zum Beispiel einer optischen Detektion) zuzuführen. Bei der Gelelektrophorese wandert eine Mischung aus zu trennenden, elektrisch geladenen Molekülen unter Einfluss eines angelegten elektrischen Felds durch ein Gel auf einem Träger, welches in einer ionischen Pufferlösung (auch als Elektrophoresepuffer bezeichnet) liegt. Je nach Größe und Ladung der Partikel bewegen sich diese unterschiedlich schnell durch das Gel oder sonstige Trennmedium. Dabei wandern kleine, negativ geladene Moleküle am schnellsten in Richtung der positiv geladenen Anode und positiv geladene Moleküle in Richtung der negativ geladenen Kathode.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wird unter einem „Farbstoffstabilisator“ insbesondere ein Additiv in einem Probenpuffer verstanden, der auf einen Farbstoff (insbesondere auf einen Fluoreszenzfarbstoff) des Probenpuffers eine stabilisierende Wirkung hat. Farbstoffe eines Probenpuffers neigen in der Elektrophorese häufig dazu, sich während der Lagerung mit der Zeit unerwünscht auf einem Träger (insbesondere auf einem Kunststoffträger) des Lagerungsbehältnisses abzusetzen. Daher steht dann für eine spätere Markierung einer fluidischen Probe weniger Farbstoff zur Verfügung. Ein Additiv kann somit als Farbstoffstabilisator bezeichnet werden, wenn das Additiv die Tendenz eines Farbstoffs (insbesondere eine Fluoreszenzfarbstoffs) reduziert, inhibiert oder vollständig unterdrückt, sich unerwünscht auf einem Träger abzusetzen und somit als Probenlabel verloren zu gehen.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wird unter „Polyethylenglykol“ (PEG) insbesondere ein je nach Kettenlänge flüssiges oder festes, chemisch inertes, wasserlösliches und nichttoxisches Polymer mit der allgemeinen Summenformel C_2nH_4n+2O_n+1. verstanden. Die Grundeinheit einer linear gebauten PEG-Kette ist aus Monomeren (-CH₂-CH₂-O-) mit einer relativen Molekülmasse von 44 aufgebaut, weshalb PEG-Derivate aus ganzzahligen Vielfachen dieser Molekülmasse plus der Molekülmasse von Wasser gebildet sind. Hochmolekulares PEG hat zum Beispiel eine Molekülmasse von 35 kDa oder größer. Niedermolekulares PEG (Low Molecular Weight PEG) hat zum Beispiel eine Molekülmasse von höchstens 5 kDa (vorzugsweise von höchstens 1 kDa). Ein besonders niedermolekulares PEG ist H(OCH₂CH₂)_nOH mit einer Molekularmasse von ca. 200 Da.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wird unter einem „niedermolekularen Farbstoffstabilisator“ insbesondere ein Farbstoffstabilisator verstanden, dessen Molekülmasse unterhalb mehrerer zehn Kilodalton, insbesondere im einstelligen Kilodalton-Bereich oder darunter, liegt.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wird unter dem Begriff „Fluoreszenz“ insbesondere eine spontane Emission von Licht kurz nach der Anregung eines Materials verstanden. Ein Fluoreszenzfarbstoff ist demzufolge in der Lage, fluoreszierend zu wirken. Bei Fluoreszenz ist das emittierte Licht in der Regel energieärmer als das vorher absorbierte. Fluoreszenz eines an einem jeweiligen Molekül der fluidischen Probe gebundenen Fluoreszenzfarbstoffs kann zum Beispiel eingesetzt werden, um eine optische Detektion getrennter Fraktionen der fluidischen Probe mit hoher Leuchtintensität und somit hoher Detektionsgenauigkeit durchzuführen.
Gemäß einem exemplarischen Ausführungsbeispiel der Erfindung wird für einen Probenpuffer zum Einsatz in der Elektrophorese ein relativ kleiner niedermolekularer Farbstoffstabilisator eingesetzt, um einen Fluoreszenzfarbstoff des Probenpuffers über eine ausreichend lange Analysezeit hinweg stabil zu halten und dessen Ankopplung an die fluidischen Probe zu fördern. Zwar hat sich herausgestellt, dass eine solche stabilisierende Wirkung eines Farbstoffstabilisators auf einen Fluoreszenzfarbstoff während eines Gelelektrophorese-Experiments auch mit höhermolekularen Farbstoffstabilisatoren (zum Beispiel PEG mit ca. 35 kDa) erreicht werden kann. Allerdings hat sich experimentell gezeigt, dass sich bei solchen höhermolekularen Farbstoffstabilisatoren mit ausreichender Konzentration zum Erreichen der gewünschten farbstoffstabilisierenden Wirkung eine für hochpräzise Analysen inakzeptabel hohe Abhängigkeit einer Träger-Position einer Bande von der Konzentration der fluidischen Probe einstellt. Anders ausgedrückt ändert sich bei solchen hochmolekularen Farbstoffstabilisatoren die Position einer Bande, die einer bestimmten Fraktion einer fluidischen Probe zugeordnet ist, bei Änderung der Konzentration der fluidischen Probe. Exemplarische Ausführungsbeispiele der Erfindung hingegen beruhen auf der überraschenden Erkenntnis, dass bei Einsatz von niedermolekularen Farbstoffstabilisatoren (zum Beispiel PEG mit ca. 400 Da oder ca. 600 Da) die Abhängigkeit einer Bandenposition von einer Probenkonzentration vorteilhaft extrem gering ist. Weiter überraschend ergibt sich dieser Befund mit Vorteil auch bei relativ hohen Konzentrationen des Farbstoffstabilisators, sodass mit den erfindungsgemäß niedermolekularen Farbstoffstabilisatoren eine präzise Elektrophorese-Untersuchung mit hellen, an reproduzierbar wohldefinierten Positionen befindlichen Banden und einer hohen Stabilität des Fluoreszenzfarbstoffs möglich wird.
Im Weiteren werden zusätzliche Ausgestaltungen des Probenpuffers, des Kits, der Elektrophoreseanordnung, des Verfahrens und der Verwendung beschrieben.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel kann der Farbstoffstabilisator Polyethylenglykol (PEG) aufweisen oder daraus bestehen. Es hat sich herausgestellt, dass ein niedermolekularer (insbesondere mit einem Molekulargewicht von unter 5000 Da) Farbstoffstabilisator auf Basis von PEG besonders herausragende Ergebnisse hinsichtlich Leuchtkraft der Banden, Stabilität des Fluoreszenzfarbstoffs und Konzentrationsunabhängigkeit der Bandenposition liefert.
Alternativ oder ergänzend zu PEG können aber auch andere Farbstoffstabilisatoren im niedermolekularen Bereich eingesetzt werden, zum Beispiel Dextran. Dextrane sind verzweigte, neutrale Biosaccharide. Da die Polymere aus Glucose-Einheiten gebildet sind, zählen Dextrane zu den Homoglykanen. Natürliche Dextrane besitzen Molekülmassen zwischen 10 kDa und 50000 kDa, wobei gemäß exemplarischen Ausführungsbeispielen der Erfindung insbesondere Dextrane mit Molekülmassen im unteren Bereich der genannten Molekülmassen eingesetzt werden können.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel kann der Farbstoffstabilisator ein Molekulargewicht von höchstens 1000 Da aufweisen, insbesondere ein Molekulargewicht von höchstens 600 Da aufweisen. Insbesondere sind PEG-Moleküle mit einem Molekulargewicht von ca. 600 Da, ca. 400 Da oder ca. 200 Da (letzteres entspricht vier Grundeinheiten) besonders vorteilhaft. Mit solchen Molekülmassen konnten experimentell besonders herausragende Ergebnisse erzielt werden (vergleiche 3 und 4).
Gemäß einem Ausführungsbeispiel kann der Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green sein. SYBR Green I (2-{2-[(3-Dimethylamino-propyl)-propylamino]-1-phenyl-1H-chinolin-4-ylidenmethyl}-3-methyl-benzothiazol-3-ium-Kation) ist ein asymmetrischer Cyanin-Farbstoff, der in der Elektrophorese zum Nachweis von doppelsträngiger DNA benutzt werden kann. SYBR Green I bindet doppelsträngige DNA. Der daraus resultierende DNA-Fluoreszenzfarbstoff-Komplex absorbiert blaues Licht bei einer Wellenlänge von 494 nm und emittiert grünes Licht bei einer Wellenlänge von 521 nm. SYBR Green I bindet auch an Einzelstrang-DNA sowie RNA.
Alternativ zu SYBR Green können in der Gelelektrophorese auch andere Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden, welche mit DNA interagieren. Beispiele für solche alternativ einsetzbare Fluoreszenzfarbstoffe sind Sybr Gold, Sybr Safe, Gel Red, Gel Green, etc.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel können der Fluoreszenzfarbstoff und der Farbstoffstabilisator in einem Container oder Behälter enthalten sein, der eine bräunliche Farbe hat. Ein solcher Container oder Vial kann demnach in einem Lagerzeitraum den Probenpuffer enthalten, insbesondere mit mindestens einer weiteren Komponente wie einem Lösungsmittel. Vorteilhaft kann ein solcher Container aus braunem Kunststoff hergestellt sein, da die Konstituenten des Probenpuffers lichtempfindlich sind und bei bräunlicher Färbung des Behälters vor einer unerwünschten Wechselwirkung mit Umgebungslicht geschützt sind. Vor einem Elektrophorese-Experiment kann der Probenpuffer aus einem solchen Container mit einer zu analysierenden fluidischen Probe vermischt werden. Diese Mischung kann dann auf einen Endbereich des Trennmediums auf dem Träger aufgebracht werden (insbesondere pipettiert werden), womit die Migration der einzelnen Probenbestandteile unter dem Einfluss eines angelegten elektrischen Felds getriggert werden kann.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel kann der Farbstoffstabilisator ausgebildet sein, eine Leuchtkraft von Banden getrennter Fraktionen der fluidischen Probe zu verstärken. Synergistisch kann der Farbstoffstabilisator somit nicht nur die Stabilität des Fluoreszenzfarbstoffs erhöhen und eine Konzentrationsabhängigkeit der Bandenposition unterdrücken, sondern hat zudem auch noch eine positive Wirkung auf die Leuchtintensität der den einzelnen Fraktionen zugehörigen Banden. Dies gilt insbesondere, wenn der Farbstoffstabilisator in ausreichend hoher Konzentration vorgesehen wird, was bei niedermolekularen Farbstoffstabilisatoren (insbesondere PEG mit höchstens 1000 Da) ohne inakzeptabel hohe Positionsverschiebungen der Probenbanden auf dem Gelstreifen möglich ist.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel kann der Farbstoffstabilisator ausgebildet sein, ein Anhaften des Fluoreszenzfarbstoffs an einem Träger, insbesondere an einem Kunststoffträger, zu inhibieren. Auch diese Wirkung kann mit niedermolekularen Farbstoffstabilisatoren erreicht werden. Der Träger kann hierbei ein Streifen sein, auf den ein Trennmedium in Form von Gel aufgebracht ist und der dann mit der fluidischen Probe und dem Probenpuffer in Wirkverbindung gebracht werden kann.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel kann der Farbstoffstabilisator in einer Konzentration in einem Bereich zwischen 0,002 Gew.-% und 0,2 Gew.-%, insbesondere in einem Bereich zwischen 0,05 Gew.-% und 0,1 Gew.-%, in dem Probenpuffer vorgesehen sein. In diesem Konzentrationsbereich ist die Konzentrationsunabhängigkeit der Bandenposition so stark ausgeprägt, dass exzellente Trennergebnisse erhalten werden (vergleiche in diesem Zusammenhang auch 3 und 4).
Gemäß einem Ausführungsbeispiel kann das Kit als DNAAssay ausgebildet sein. Ein solcher Assay (d.h. Test, Probe) kann für eine Untersuchung zum Nachweis bestimmter Substanzen entsprechend einem standardisierten bzw. vorgegebenen Reaktionsablauf zum Nachweis einer oder mehrerer solcher Substanzen mittels Gelelektrophorese eingesetzt werden. Die Konfiguration des Kits als DNAAssay (zum Beispiel als gDNA Assay) erlaubt daher die Trennung unterschiedlich großer DNA-Fragmente in der fluidischen Probe. Entsprechend kann die fluidische Probe eine Mehrzahl von unterschiedlichen DNA Komponenten aufweisen, die mittels Gelelektrophorese getrennt, identifiziert und/oder quantifiziert werden können.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel kann der Probenpuffer, das Kit bzw. die Elektrophoreseanordnung im Zusammenhang mit einem Agilent 2200 TapeStation System bzw. einem SceenTape eingesetzt werden, wie dieses die Anmelderin Agilent Technologies, Inc., kommerziell vertreibt. Die Agilent 2200 TapeStation System bzw. das SceenTape sind dafür so anzupassen, dass dort der oben beschriebene Probenpuffer mit niedermolekularem Farbstoffstabilisator eingesetzt wird.
Die Elektrophoreseanordnung kann zum Trennen von mindestens zwei Komponenten eines Fluids bzw. als mikrofluidisches Messgerät eingesetzt sein. So kann es im Life-Science-Bereich vorteilhaft sein, eine biologische Probe mit mehreren Protein- oder DNA-Komponenten aufzutrennen, was gemäß dem Verfahren der Gelelektrophorese aufgrund des unterschiedlichen Verhältnisses von Ladung und Masse der unterschiedlichen Fraktionen von Teilchen ermöglicht ist. Hierfür kann die Probe auf das Trennmedium auf dem Trägerstreifen aufgebracht werden und dann mittels Gelelektrophorese aufgetrennt werden. Zum Beispiel kann die fluidische Probe in eines mehrerer Wells eingefüllt werden, nach einem bestimmten Mechanismus durch die Wells hindurchgeführt werden, und kann nach Durchlaufen eines Trennkanals unter Einwirkung eines elektrischen Feldes durch einen Detektor ermittelt werden, welche Fraktionen in der aufgetrennten Probe enthalten sind.
Figurenliste
Andere Ziele und viele der begleitenden Vorteile von Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung werden leicht wahrnehmbar werden und besser verständlich werden unter Bezugnahme auf die folgende detailliertere Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen. Merkmale, die im Wesentlichen oder funktionell gleich oder ähnlich sind, werden mit denselben Bezugszeichen versehen.

1 zeigt ein Kit mit einem Probenpuffer in einem Vial gemäß einem exemplarischen Ausführungsbeispiel der Erfindung zur Verwendung in der GelElektrophorese.
2 zeigt experimentelle Ergebnisse einer Elektrophorese-Untersuchung mit einem Probenpuffer mit hochmolekularen Polyethylenglykol (PEG) mit einer Molekularmasse von ca. 35 kDa.
3 zeigt experimentelle Ergebnisse einer Elektrophorese-Untersuchung mit einem Probenpuffer gemäß einem exemplarischen Ausführungsbeispiel der Erfindung mit unterschiedlichem niedermolekularen Polyethylenglykol (PEG) als Farbstoffstabilisator.
4 zeigt die Erhöhung der Genauigkeit einer Elektrophorese-Untersuchung mit einem Probenpuffer gemäß einem exemplarischen Ausführungsbeispiel der Erfindung mit unterschiedlichem niedermolekularen Polyethylenglykol (PEG) als Farbstoffstabilisator.

Die Darstellung in der Zeichnung ist schematisch.
Bevor bezugnehmend auf die Figuren exemplarische Ausführungsbeispiele beschrieben werden, sollen einige grundlegende Überlegungen zusammengefasst werden, basierend auf denen exemplarische Ausführungsbeispiele der Erfindung abgeleitet worden sind.
Gemäß einem exemplarischen Ausführungsbeispiel der Erfindung wird PEG mit niedrigem Molekulargewicht als Additiv in einem Probenpuffer für die Gelelektrophorese eingesetzt. Insbesondere kann hierbei mit Vorteil (insbesondere für eine ScreenTape Anwendung zur Durchführung auf einer TapeStation der Anmelderin Agilent Technologies, Inc.) ein DNA Assay mit einer sehr hohen Sensitivität erhalten werden.
In einem Probenpuffer wurde der Einsatz von Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 35 kDa experimentell untersucht. Es hat sich dabei gezeigt, dass die Anwesenheit von PEG auf die Reagenzien einen schützenden Einfluss hat. Allerdings wurde herkömmlich festgestellt, dass eine signifikante Abnahme der Signalintensität (d.h. der Fluoreszenzintensität) bei Alterung der Reagenzien auftreten kann. Die Zugabe von Polyethylenglykol hat den vorteilhaften Effekt, die Signalintensität um einen Faktor von zum Beispiel zwei bis drei zu erhöhen. Darüber hinaus kann die Zugabe von Polyethylenglykol ein Binden oder Anhaften von Fluoreszenzfarbstoff an einer Wandung eines Aufbewahrungsbehälters und an einem Träger einer Elektrophoreseanordnung unterdrücken. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden werden zu wollen, wird gegenwärtig angenommen, dass ein solches Binden oder Anhaften durch eine Bedeckung einer Kunststoffoberfläche des Aufbewahrungsbehälters mit Fluoreszenzfarbstoff zustande kommt. Auf diese Weise kann Polyethylenglykol in einem Probenpuffer einer unerwünschten Reduzierung einer Signalintensität entgegenwirken.
Trotz dieser Schutzwirkungen von Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von ca. 35 kDa hat sich herausgestellt, dass dieser Farbstoffstabilisator einen gewichtigen Nachteil für Elektrophorese-Anwendungen zu haben scheint. Dieser Nachteil besteht darin, dass Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 35 kDa einen unerwünschten Einfluss auf das Migrationsverhalten einer fluidischen Probe in dem gelartigen Trennmedium zu haben scheint. Dieser unerwünschte Effekte äußert sich insbesondere auch darin, dass eine Bandenposition (die indikativ für das Migrationsverhalten der fluidischen Probe bzw. ihrer Konstituenten ist) bei niedrigen Probenkonzentrationen von der Probenkonzentration abhängig ist.
In einem DNA Assay mit Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 35 kDa wird häufig nur ein unterer Marker für das Alignment der Proben bzw. Probenfraktionen verwendet. Entsprechende Anwendungen sind somit sehr sensitiv bezüglich der Erzeugung eines Migrationsoffsets, wenn fluidische Proben mit signifikant unterschiedlichen Konzentrationen analysiert werden sollen. Es hat sich dabei insbesondere gezeigt, dass das Hinzufügen von Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 35 kDa zu einem Probenpuffer das Offset von Bandenpositionen bei unterschiedlichen Probenkonzentrationen unerwünscht stark verstärkt. Dieser Effekt ist in 2 dargestellt und experimentell belegt. Nur bei extrem niedrigen Konzentrationen von Polyethylenglykol ist der Banden-Offset akzeptabel. Bei derart niedrigen Konzentrationen von Polyethylenglykol sind die Banden allerdings auch recht dunkel und ist der fluoreszenzfarbstoffstabilisierende Effekt äußerst gering, was einen negativen Einfluss auf die Trennergebnisse hat.
Um diesen und andere Nachteile zu überwinden, wird gemäß einem exemplarischen Ausführungsbeispiel der Erfindung für ein DNA Assay ein Probenpuffer mit Polyethylenglykol mit einem ausreichend niedrigen Molekulargewicht von insbesondere höchstens 5 kDa eingesetzt. Wie in 3 dargestellt, führt das Hinzufügen von solchem niedermolekularen Polyethylenglykol auch bei höheren Probenkonzentrationen zu einem akzeptabel niedrigen Banden-Offset über einen breiten Konzentrationsbereich von fluidischen Proben hinweg. Besonders gute Ergebnisse konnten für Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von kleiner oder gleich 600 Da erhalten werden. Simultan zu dieser starken Unterdrückung des Migrationsverhaltens kann niedermolekulares Polyethylenglykol vorteilhaft eine bemerkenswerte Erhöhung der Signalintensität bewirken (siehe hierzu ergänzend auch 4).
1 zeigt eine Elektrophoreseanordnung 150 mit einem Kit 120 mit einem Probenpuffer 100 und mit einem unten näher beschriebenen Trägerstreifen mit Elektrodenanschlüssen gemäß einem exemplarischen Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Die in 1 gezeigte Elektrophoreseanordnung 150 weist das Kit 120 und eine elektrische Felderzeugungseinrichtung 152 zum Erzeugen eines elektrischen Felds entlang eines als Kunststoffstreifen ausgebildeten Trägers 110 des Kits 120 auf. Folglich ist eine fluidische Probe 106 bei Inkontaktbringen mit dem Probenpuffer 100 vor Aufbringen auf einem Gel als Trennmedium 112 unter dem Einfluss eines erzeugten elektrischen Felds trennbar. Die elektrische Felderzeugungseinrichtung 152 weist zwei schematisch dargestellte Kohleelektroden 154 in Kontakt mit dem Trennmedium 112 auf dem Träger 110 auf. Die Kohleelektroden 154 können mit einer elektrischen Energieversorgungseinrichtung 156, insbesondere mit einer elektrischen Spannungsquelle, verbunden werden, um zwischen den Kohleelektroden 154 eine elektrische Spannung anzulegen, die ein elektrisches Feld entlang des Trennmediums 112 erzeugt. Ein von einem Benutzer oder von einer Steuereinrichtung betätigbarer Schalter 158 kann geschlossen werden, um das elektrische Feld anzulegen und das Elektrophorese-Experiment somit zu starten.
Das Kit 120 ist zum Trennen einer Mischung aus mehreren DNA-Fragmenten als fluidische Probe 106 und somit als DNA Assay ausgebildet. Das Kit 120 weist den aus Kunststoff gebildeten streifenförmigen Träger 110 und ein darauf aufgebrachtes Gel als Trennmedium 112 auf.
Ferner gehört zu den Kit 120 ein Probenpuffer 100, der in einem Vial oder Container 108 mit braunen Wänden enthalten und gelagert ist. Bevor die Elektrophorese-Analyse begonnen wird, wird eine zu analysierende fluidische Probe 106 (zum Beispiel eine Mischung von zu trennenden Gensequenzen) mit dem Probenpuffer 100 gemischt und zum Beispiel in eine Pipette 160 eingefüllt. Zum Trennen der fluidischen Probe 106 ist diese Mischung mittels der Pipette 160 auf das eine Ende des mit dem Trennmedium 112 versehenden Trägers 110 aufzupipettieren, was durch einen Benutzer oder gesteuert durch einen Roboter oder dergleichen erfolgen kann. Dies ist in 1 schematisch dargestellt. Unter dem Einfluss des angelegten elektrischen Felds bewegen sich die unterschiedlichen DNA-Fragmente der fluidischen Probe 106 in gemäß 1 horizontaler Richtung (siehe Pfeil 162) mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten entlang des Trägermediums 112. Aufgrund der unterschiedlichen Ladungszustände und der unterschiedlichen Massen der unterschiedlichen DNA-Fragmente werden diese während der durch das elektrische Feld und die daraus resultierende Kraft generierten Migration in unterschiedliche Banden 164 an für die jeweiligen Fraktionen charakteristischen Bandenpositionen aufgespalten.
Nach Beendigung der beschriebenen Elektromigration können die Banden 164 dann entweder innerhalb der Elektrophoreseanordnung 150 oder an separater Position optisch ausgelesen werden. Dadurch können die einzelnen Fraktionen (insbesondere DNA-Fragmente) in der fluidischen Probe 106 identifiziert und quantifiziert werden. Zu diesem Zweck kann der Streifen mit den Banden 164 mit elektromagnetischer Strahlung beleuchtet werden und kann die Fluoreszenz von an den einzelnen Fraktionen der fluidischen Probe anhaftenden Fluoreszenzfarbstoffen 102 detektiert werden.
Wie bereits ausgeführt, kann die fluidische Probe 106 vor dem Aufbringen auf das Trennmedium 112 mit dem Probenpuffer 100 vermischt werden bzw. mit der fluidischen Probe 106 beladen werden. Gemäß dem beschriebenen Ausführungsbeispiel der Erfindung weist der Probenpuffer 100 einen als SYBR Green ausgebildeten Fluoreszenzfarbstoff 102 zum Koppeln mit und somit Einfärben der fluidischen Probe 106 auf. Dadurch kann die fluidische Probe nach Beendigung des Elektrophorese-Experiments optisch ausgelesen werden bzw. können die Bandenpositionen ermittelt werden. Darüber hinaus weist der Probenpuffer 100 Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von zum Beispiel 600 Da als Farbstoffstabilisator 104 zum Stabilisieren des Fluoreszenzfarbstoffs 102 in einem Lösungsmittel 170 des Probenpuffers 100 auf.
Vorteilhaft ist der eingesetzte Farbstoffstabilisator 104 aus niedermolekularem Polyethylenglykol dazu in der Lage, eine Leuchtkraft der Banden 164 der getrennten Fraktionen der fluidischen Probe 106 zu verstärken. Darüber hinaus bewerkstelligt der beschriebene Farbstoffstabilisator 104 es, ein unerwünschtes Anhaften des Fluoreszenzfarbstoffs 102 an einer Kunststoffoberfläche des Trägers 110 zu inhibieren.
Der Farbstoffstabilisator 104 kann in dem Probenpuffer 100 in einer ausreichend hohen Konzentration von zum Beispiel 0,05 Gew.-% vorgesehen sein. Die Vorteile einer ausgeprägten stabilisierenden Wirkung auf den Fluoreszenzfarbstoff 102, die signifikante Stärkung der Leuchtkraft und die weitestgehende Unabhängigkeit der Positionen der Banden 164 von der Konzentration der fluidischen Probe 106 können simultan mit der beschriebenen Zusammensetzung des Probenpuffers 100 erhalten werden.
Somit kann unter Verwendung des Kits 120 ein Verfahren zum Trennen der fluidischen Probe 106 mittels Gelelektrophorese durchgeführt werden und hierbei eine hohe Analysegenauigkeit erreicht werden. Hierfür wird der Probenpuffer 100 zunächst mit der fluidischen Probe 106 beladen, der den Fluoreszenzfarbstoff 102 und den als niedermolekulares PEG ausgebildeten Farbstoffstabilisator 104 aufweist. Der mit der fluidischen Probe 106 beladene Probenpuffer 100 kann dann auf das Trennmedium 112 auf dem streifenförmigen Träger 110 aufgebracht werden. Durch Anlegen eines elektrischen Felds entlang des Trägers 110 kommt es dann zu einem elektrophoretischen Trennen der fluidischen Probe 106 in die den einzelnen Fraktionen zugeordneten Banden 164. Jede der Banden 164 entspricht daher einer von mehreren unterschiedlichen DNA-Fragmenten in der fluidischen Probe 106. Durch die Verwendung von niedermolekularem Polyethylenglykol zum Stabilisieren des Fluoreszenzfarbstoffs 102 zum Markieren der fluidischen Probe 106 in der beschriebenen Elektrophoreseanordnung 150 ist ein einfaches und hochpräzises DNA Assay geschaffen.
2 zeigt Ergebnisse einer Elektrophorese-Untersuchung mit einem Probenpuffer mit hochmolekularen Polyethylenglykol.
In 2 sind diverse Elektrophorese-Diagramme gezeigt. Als Größen- oder Eichstandard auf der Basis bekannter Fragmente ist in 2 eine sogenannte Ladder 200 dargestellt. Darüber hinaus ist auch ein unterer Marker 202 zu erkennen. Ferner sind experimentelle Ergebnisse für unterschiedliche Probenpuffer (loading buffer, LB) dargestellt, die kein PEG, PEG mit einer Konzentration von 0,2 Gew.%, PEG mit einer Konzentration von Gew.0,02 %, PEG mit einer Konzentration von 0,002 Gew.% und PEG mit einer Konzentration von 0,0002 Gew.% entsprechen. Diverse Banden 164 sind für Konzentrationen einer fluidischen Probe 106 von 5 ng/µl (jeweils links dargestellt), von 0,5 ng/µl (jeweils in der Mitte dargestellt) bzw. von 0,05 ng/µl (jeweils rechts dargestellt) gezeigt.
Aus 2 ist ersichtlich, dass außer in Abwesenheit von PEG (siehe ganz links) und bei der niedrigsten PEG-Konzentration von 0,0002 % (siehe ganz rechts) inakzeptabel starke Schwankungen in den Positionen der Banden 164 für unterschiedliche Konzentrationen der fluidischen Probe 106 auftreten. Diese werden darauf zurückgeführt, dass PEG mit 35 kDa stark das Migrationsverhalten der fluidischen Probe 106 beeinflusst.
3 zeigt Ergebnisse einer Elektrophorese-Untersuchung mit Probenpuffern 100 gemäß exemplarischen Ausführungsbeispielen der Erfindung mit niedermolekularem Polyethylenglykol (PEG).
In 3 sind diverse Elektrophorese-Diagramme gezeigt. Als Größen- oder Eichstandard auf der Basis bekannter Fragmente ist in 2 wiederum die Ladder 200 dargestellt. Darüber hinaus ist auch wieder der untere Marker 202 dargestellt. Ferner sind experimentelle Ergebnisse für unterschiedliche Probenpuffer (loading buffer, LB) dargestellt, die kein PEG, PEG mit einem Molekulargewicht von 400 Da und mit einer Konzentration von 0,1 Gew.%, PEG mit einem Molekulargewicht von 400 Da mit einer Konzentration von 0,05 Gew.% und PEG mit einem Molekulargewicht von 600 Da einer Konzentration von 0,05 Gew.% entsprechen. Diverse Banden 164 sind für Konzentrationen einer fluidischen Probe 106 von 5 ng/µl (jeweils links dargestellt), von 2,5 ng/µl (jeweils als zweites von links dargestellt), von 1 ng/µl (jeweils als drittes von links dargestellt), von 0,5 ng/µl (jeweils in der Mitte dargestellt), von 0,1 ng/µl (jeweils als drittes von rechts dargestellt), von 0,05 ng/µl (jeweils als zweites von rechts dargestellt) bzw. von 0,025 ng/µl (jeweils rechts dargestellt) gezeigt.
Aus 3 ist ersichtlich, dass in allen Fällen allenfalls minimale und somit noch akzeptable Schwankungen in den Positionen der jeweiligen Banden 164 für unterschiedliche Konzentrationen der fluidischen Probe 106 auftreten. Somit hat das untersuchte niedermolekulare Polyethylenglykol als Fluoreszenzstabilisator 102 vorteilhafterweise annähernd keinen Einfluss auf das Migrationsverhalten der fluidischen Probe 106.
4 zeigt die Erhöhung der Genauigkeit einer Elektrophorese-Untersuchung mit Probenpuffern 100 gemäß unterschiedlichen exemplarischen Ausführungsbeispielen der Erfindung, die jeweils niedermolekulares Polyethylenglykol aufweisen.
4 zeigt für das Beispiel zweier Fraktionen einer fluidischen Probe mit 2000 bp bzw. 15000 bp das Signal/Rauschverhältnis, ein Maß für Sensitivität (in beliebigen Einheiten) von entsprechenden Banden 164 für die vier Szenarien gemäß 3 (kein PEG, PEG mit einem Molekulargewicht von 400 Da und mit einer Konzentration von 0,1 Gew.%, PEG mit einem Molekulargewicht von 400 Da mit einer Konzentration von 0,05 Gew.% und PEG mit einem Molekulargewicht von 600 Da mit einer Konzentration von 0,05 Gew.%). Es zeigt sich, dass das Hinzufügen von niedermolekularem PEG in allen Fällen zu einer deutlichen Erhöhung der Sensitivität gegenüber einem Szenario führt, in dem in einem Probenpuffer kein PEG enthalten ist. Die Erhöhung der Sensitivität durch das niedermolekulare PEG in dem Probenpuffer 100 liegt in der Größenordnung eines Faktors von drei bis drei.
Es sollte angemerkt werden, dass der Begriff „aufweisen“ nicht andere Elemente ausschließt und dass das „ein“ nicht eine Mehrzahl ausschließt. Auch können Elemente, die in Zusammenhang mit unterschiedlichen Ausführungsbeispielen beschrieben sind, kombiniert werden. Es sollte auch angemerkt werden, dass Bezugszeichen in den Ansprüchen nicht als den Schutzbereich der Ansprüche beschränkend ausgelegt werden sollen.

Claims

Probenpuffer (100) zum Beladen mit einer zu trennenden fluidischen Probe (106), wobei der Probenpuffer (100) aufweist: einen Fluoreszenzfarbstoff (102) zum Koppeln mit der fluidischen Probe (106); einen Farbstoffstabilisator (104) zum Stabilisieren des Fluoreszenzfarbstoffs (102), wobei der Farbstoffstabilisator (104) ein Molekulargewicht von höchstens 5000 Da aufweist, und wobei der Farbstoffstabilisator (104) in einer Konzentration in einem Bereich zwischen 0,002 Gew.-% und 0,2 Gew.-% vorgesehen ist.
Probenpuffer (100) gemäß Anspruch 1, wobei der Farbstoffstabilisator (104) Polyethylenglykol aufweist oder daraus besteht.
Probenpuffer (100) gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Farbstoffstabilisator (104) ein Molekulargewicht von höchstens 1000 Da aufweist.
Probenpuffer (100) gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Farbstoffstabilisator (104) ein Molekulargewicht von höchstens 600 Da aufweist.
Probenpuffer (100) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Fluoreszenzfarbstoff (102) SYBR Green ist.
Probenpuffer (100) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Fluoreszenzfarbstoff (102) und der Farbstoffstabilisator (104) in einem Container (108) enthalten sind, der eine bräunliche Farbe hat.
Probenpuffer (100) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Farbstoffstabilisator (104) ausgebildet ist, eine Leuchtkraft von Banden getrennter Fraktionen der fluidischen Probe (106) zu verstärken.
Probenpuffer (100) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Farbstoffstabilisator (104) ausgebildet ist, ein Anhaften des Fluoreszenzfarbstoffs (102) an einem Träger (110), insbesondere an einem Kunststoffträger, zu inhibieren.
Probenpuffer (100) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Farbstoffstabilisator (104) in einer Konzentration in einem Bereich zwischen 0,05 Gew.-% und 0,1 Gew.-% vorgesehen ist.
Kit (120) zum Trennen einer fluidischen Probe (106), wobei das Kit (120) aufweist: einen Träger (110) mit einem Trennmedium (112); einen Probenpuffer (100) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9; wobei der mit der fluidischen Probe (106) zu beladende Probenpuffer (100) zum Trennen der fluidischen Probe (106) auf den mit dem Trennmedium (112) versehenden Träger (110) aufbringbar ist.
Kit (120) gemäß Anspruch 10, ausgebildet als DNA Assay.
Elektrophoreseanordnung (150), aufweisend: ein Kit (120) gemäß einem der Ansprüche 10 bis 11; eine Felderzeugungseinrichtung (152) zum Erzeugen eines elektrischen Felds entlang des Trägers (110), so dass eine fluidische Probe (106) in dem Probenpuffer (100) bei Aufbringen auf das Trennmedium (112) unter dem Einfluss eines erzeugten elektrischen Felds trennbar ist.
Verfahren zum Trennen einer fluidischen Probe (106), wobei das Verfahren aufweist: Beladen eines Probenpuffers (100) mit einer fluidischen Probe (106), der einen Fluoreszenzfarbstoff (102), und einen Farbstoffstabilisator (104) mit einer Molekülmasse von höchstens 5000 Da aufweist; Aufbringen des mit der fluidischen Probe (106) beladenen Probenpuffers (100) auf ein Trennmedium (112) auf einem Träger (110); Anlegen eines elektrischen Felds entlang des Trägers (110) zum Trennen der fluidischen Probe (106).
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die fluidische Probe (106) eine Mehrzahl von unterschiedlichen DNA-Fragmenten aufweist.
Verwendung von Polyethylenglykol, welches ein Molekulargewicht von höchstens 5000 Da aufweist, zum Stabilisieren eines Fluoreszenzfarbstoffs (102) zum Markieren einer fluidischen Probe (106) in der Elektrophorese.