DE602004005802T2

DE602004005802T2 - Elektroforetische Gelmatrix enthaltend DMSO

Info

Publication number: DE602004005802T2
Application number: DE602004005802T
Authority: DE
Inventors: Andreas 76137 Ruefer; Martin 76337 Kratzmeier
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 2004-07-30
Filing date: 2004-07-30
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2024-07-31
Also published as: EP1533612B1; EP1533612A1; US7794576B2; DE602004005802D1; US20060021876A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine elektrophoretische Gelmatrix, welche eine verbesserte Auflösung von Proteinen in mikrofluidischen Trennungsversuchen bereitstellt.
Zum Durchführen von Proteomics mit dem Ziel einer kompletten Analyse des Gesamtbetrags an Proteinen, durch ein Genom ausgedrückt, muss die zu untersuchende Probe den folgenden Schritten unterworfen werden:
In einem ersten Schritt hat die Aufbereitung des biologischen Materials zu erfolgen, was bedeutet, dass die Proteine zu extrahieren sind. In einem herkömmlich durchgeführten zweiten Schritt werden die Proteine durch zweidimensionale Elektrophorese getrennt, bevor ein dritter Schritt in einer punktuellen Identifizierung resultiert, welche in der Vergangenheit meistens nach Hydrolyse des Proteins durch Massenspektrometrie erfolgte. Schließlich erfolgt die Identifizierung der kompletten Proteinsequenz, gestützt durch Datenbankrecherche.
Der Trennungsschritt (zweiter Schritt) weist eine erste Ebene auf, wobei die amphoterischen Proteine isoelektrischer Fokussierung unterworfen werden. Entsprechend steht die Trennung der Moleküle in Verbindung zu deren isoelektrischem Punkt. Die zweite Ebene dieses Trennungsschritts ist üblicherweise die SDS-PAGE, wobei Proteine entsprechend ihrer Größe getrennt werden. Sodiumdodecylsulfat SDS ist ein anionisches Detergens, das elektrisch geladen ist. Da die Ladung der Proteine die Ladung des SDS übersteigt, werden anionische Micellen gebildet, welche pro Masseneinheit eine im Wesentlichen konstante Netto-Ladung haben. Darüber hinaus werden Wasserstoffbrücken getrennt, und somit tertiäre und sekundäre Strukturen der Proteinmoleküle aufgelöst. Disulfidbrücken können durch Zugabe von Thiol-Komponeten mit reduzierenden Eigenschaften aufgelöst werden, und die Zugabe von Harnstoff verursacht die Denaturierung der Probe.
Idealerweise wird die Probe disaggregiert, denaturiert, reduziert und komplett aufgelöst nach der Aufbereitung. Das Zugeben von Dithiothreitol (DDT) zum Puffer hilft, die Disulfidbrücken zu zerstören und hält die Proteine in dem reduzierten Zustand.
Die obige SDS-Trennung kann durch Kapillar-Elektrophorese erfolgen, analog zur Anwendung von Kapillar-Elektrophorese bei der Sequenzierung von Genomen (siehe: Venter, J.C. et al., Science 2001, 291, S. 1304 ff.). Zum Trennen wird eine Mikroeinheit verwendet, welche ein Trennungsgel mit Siebe-Eigenschaften enthält. Dieses wird in einen Kanal der Mikroeinheit gefüllt, und bildet so einen Trennungskanal.
Im Anschluss an die Trennung wird die Identifizierung durchgeführt. Der herkömmlichen SDS-PAGE folgt meistens MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry). Andere Identifizierungstechniken wie optische Techniken oder Techniken, welche auf einem elektrolytischen Abtasten basieren, sind nach Stand der Technik bekannt.
Schließlich ist die Aufbereitung des elektrophoretischen Gels, welches in dem zweiten Schritt verwendet wird, der Schlüssel zu erfolgreicher Trennung und anschließender Identifizierung. Das elektrophoretische Gel oder die Trennungsmatrix müssen jeweils optimale Siebe-Eigenschaften aufweisen in Bezug auf die Reagenzien, welche angewendet werden, sowie in Bezug auf die Fähigkeit, in Mikrokanäle für elektrophoretische Anwendungen gefüllt zu werden. Es ist wünschenswert, dass die elektrophoretische Gelmatrix für eine bestimmte Zeit ohne Alterung lagerfähig ist, da dem Altern meistens ein Verlust an Trennungseffizienz folgt.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine elektrophoretische Gelmatrix zum Durchführen von Proteomics bereitzustellen, welche eine verbesserte Proteinauflösung aufzeigt. Die Aufgabe wird durch die unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungen werden durch die abhängigen Ansprüche gezeigt.
Es hat sich gezeigt, dass die Kapillarelektrophorese ein geeignetes Verfahren zum Durchführen von Proteomics auf günstige Weise ist, insbesondere in Bezug auf die Trennung und Identifizierung von Proteinen, welche in der vorliegenden Erfindung die interessierenden Schritte sind. Bezüglich der Zeit und des Volumens an Probenmaterial, welches für die SDS-PAGE aufgewendet werden muss, ist die Kapillarelektrophorese ein höchst günstiges und effizientes Verfahren. Durchgeführt in einer mikrofluidischen Einheit, und somit linear durchgeführt, ist ein Probenvolumen von nur ein paar Mikrolitern erforderlich, welches den Trennungskanal der mikrofluidischen Einheit in etwa drei Stunden passiert: die für das Passieren benötigte Zeit ist abhängig von der Größe der zu siebenden Moleküle.
Lineare Kapillarelektrophorese, welche in einer mikrofluidischen Einheit durchgeführt wird, erfordert einen mikrofluidischen Kanal als Kapillare, welche mit einer geeigneten elektrophoretischen Gelmatrix gefüllt wird. In der vorliegenden Erfindung wird eine Poly-N-,N-Dimethylacrylamid (PDMA)-Matrix zum Durchführen von Proteomics vorgeschlagen, aber natürlich können auch andere Matrixmaterialien wie Dextran, lineares Polyacrylamid, Poly-N-Acryloylaminoethoxyethanol (PAAEE), Polyacryloylaminopropanol (PAAP), Poly-(acryloylaminoethoxy)ethylglucosepyranosid (PAEG), Polyethylenglykol (PEG), Polyethylenoxid (PEO), Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder Zellulosematerialien wie Methylzellulose (MC), Hydroxyethylzellulose (HEC), Hydroxypropylzellulose (HPC), Hydroxypropylmethylzellulose (HPMC) gewählt werden, um nur ein paar der bekanntesten Materialien zu nennen.
Die Einfüllprozedur wird aufgrund der Viskosität der PDMA Matrix unter Hochdruck durchgeführt, was automatisch (5100 ALP Prototyp, Agilent Technologies) oder in einer manuellen Einfüllstation (2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies) erfolgen kann.
Vor dem Einfüllen ist die Matrix so aufzubereiten, dass der gewünschte Trennungs- oder Siebeschritt durchführbar wird:
Chemische Reagenzien wie denaturierende, disaggregierende, reduzierende, färbende oder auflösende Reagenzien werden zu der elektrophoretischen Gelmatrix, vorliegend aus PDMA, das eine lineare Struktur hat, zugegeben. Das denaturierende Reagenz kann vorzugsweise Sodiumdodecylsulfat (SDS) sein, als auflösende und reduzierende Reagenzien können Thiol enthaltende Komponenten gewählt werden. Zum Puffern des Systems, welches aus dem Zugeben der obigen chemischen Reagenzien zur PDMA Matrix resultiert, kann ein Puffer wie Tris-Tricine oder ähnliches zugegeben werden. Das System kann auf einen pH-Wert von vorzugsweise 7,6 gepuffert werden.
Zum Durchführen einer Visualisierung der zu siebenden Moleküle kann optional ein färbendes Reagenz zu der Lösung gegeben werden. Dann ist die Anwendung eines optisch aktiven Farbstoffes wie eines fluoreszierenden Farbstoffes als Protein färbendes Reagenz wünschenswert, was einen optischen Nachweis der Proteine ermöglicht, wenn diese den elektrophoretischen Trennungskanal verlassen.
Konventionelle organische Farbstoffe, insbesondere fluoreszierende Farbstoffe, welche herkömmlicherweise häufig angewendet werden, sind schlecht löslich oder in Wasser oder wässrigen Lösungen instabil, weshalb sie in organischen Lösungsmitteln aufbewahrt werden. Dimethylsulfoxid (DMSO) ist ein protonenfreies und polares Reagenz und ist somit ein optimal solvatisierendes Reagenz für zahlreiche organische Farbstoffe, insbesondere für die, welche als färbende Reagenzien für Proteomics verwendet werden.
Es ist dem Fachmann bekannt, dass DMSO andererseits tragend ist und die elektrophoretische Gelmatrix negativ beeinflusst, und somit zu einem beschleunigten Altern der Matrix führt. Daher verwenden Wissenschaftler den färbenden Farbstoff befreit von DMSO.
Mittlerweile sind färbende Farbstoffe verfügbar, welche eine gute Löslichkeit in Wasser oder wässrigen Lösungen bieten, und stabil bleiben, wenn sie in einem wässrigen System aufbewahrt werden. Dies ermöglicht die Verwendung von färbenden Farbstoffen, welche anfänglich frei von DMSO sind, womit ein beschleunigtes Altern einer für Proteomics aufbereiteten Matrix verhindert wird.
Die vorliegende Erfindung basiert daher auf der Entdeckung eines neuartigen technischen Effekts von DMSO, welches in elektrophoretischen Verfahren verwendet wird, welche angewendet werden, um den Trennungsschritt durchzuführen und die optimale Identifizierung in Proteomics zu erlauben. Die Erfindung umfasst die Anwendung von DMSO als ein die Auflösung verbesserndes chemisches Reagenz in der PDMA-Matrix, welche wie oben beschrieben aufbereitet wird. Die spezifische Intention der vorliegenden Erfindung ist die Verbesserung der Auflösung von Proteinmolekülen, insbesondere von Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht, welche in einer mikrofluidischen Einheit durch Anwendung von Kapillarelektrophorese in einer linearen PDMA-Matrix getrennt werden.
Um den oben beschriebenen Auflösungseffekt zu erzielen, weist eine Ausführung der kapillarelektrophoretischen Matrix, welche in mikrofluidischen Einheiten zum Durchführen des Trennungsschritts in dem Proteomics-Prozess mit anschließender Identifizierung der getrennten Proteine verwendet wird, eine PDMA-Gelmatrix auf, welche wie oben beschrieben aufbereitet wird, wobei mindestens eines der oben genannten denaturierenden, disaggregierenden, reduzierenden, färbenden oder auflösenden Reagenzien, zu denen DMSO gehört, zugegeben wird. DMSO wird in einem eigenen Schritt zu den die Matrix bildenden Reagenzien gegeben, was garantiert, dass mindestens ein Volumen von 4 % DMSO in Bezug auf das Gesamtvolumen an chemischen Reagenzien in der Matrix enthalten ist. Die in der Folge beschriebenen Beispiele zeigen deutlich, dass eine Zugabe eines Volumens über 4 % wünschenswert ist, vorzugsweise kann ein Betrag von etwa 6 % DMSO in Bezug auf das Gesamtvolumen an Reagenzien zugegeben werden. Im Allgemeinen nimmt das Auflösungsvermögen der Gelmatrix für niedrige Molekulargewichte zu, je mehr DMSO zuvor der Matrix zugegeben wurde. Aber erwartungsgemäß nimmt die Gesamtzeit für die Analyse, das heißt die Zeit von der Injektion der Probe in den Trennungskanal bis zum Nachweis des größten Proteins (auch als oberes Kennzeichen – Upper Marker oder UM bezeichnet) ebenfalls zu.
Daher führt die Verwendung von Dimethylsulfoxid in PDMA Matrizes zum Trennen und/oder Identifizieren von Proteinen zu einer Verbesserung des Auflösungsvermögens von PDMA Gelmatrizes, welche entsprechend der vorliegenden Erfindung aufbereitet sind. Es findet eine Optimierung der Auflösung statt, was somit zu einer besseren Identifizierung der Proteine führt. Die Identifizierung der Proteine kann durchgeführt werden durch Messen eines Identifikationsparameters, der jeder physikalische oder chemische Parameter sein kann, welcher eine eindeutige Identifizierung des Proteins erlaubt.
Entsprechend ist es leicht verständlich, dass die Verbesserung der Auflösung, welche durch die Anwendung von DMSO in einer Matrix entsprechend der vorliegenden Erfindung erfolgt, komplett unabhängig ist von dem Vorhandensein eines färbenden Farbstoffes, obwohl die Visualisierung der Analyse durch Anwendung eines Farbstoffes erleichtert wird.
Um die verbesserte Auflösung zu prüfen oder um zu zeigen, dass einzelne Proteine, insbesondere Proteine mit niedrigem Molekulargewicht, viel klarer von benachbarten Proteinen getrennt sind, können jeweils, entsprechend der vorliegenden Erfindung, optische Nachweisverfahren wie Laser- induzierte Fluoreszenz (LIF) oder jedes andere optische Nachweisverfahren wie Flüssigkeitsleitfähigkeit oder dergleichen angewendet werden.
Das Verfahren zum Durchführen der Trennung und Identifizierung von Proteinen entsprechend der vorliegenden Erfindung weist also zunächst die Aufbereitung einer elektrophoretischen Gelmatrix auf, um eine Trennung von Proteinen, oder breiter gefasst von „Proteomics", im Mikrokanal durchzuführen. Dazu werden die chemischen Reagenzien, welche aus der Gruppe von denaturierenden, puffernden, disaggregierenden, reduzierenden, färbenden oder auflösenden Reagenzien ausgewählt wurden, dem PDMA-Gel zugegeben, zusammen mit einem Volumen an Dimethlysulfoxid.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Aufgaben sowie die begleitenden Vorteile der vorliegenden Erfindung sind einfach zu erkennen und werden besser verständlich durch Bezugnahme auf die folgenden Figuren.
1a zeigt die Ergebnisse einer Reihe von Proteinstandardmessungen mit zunehmender DMSO-Konzentration in der Matrix, unter Verwendung des 5100 ALP Systems,
1b zeigt die Ergebnisse einer Reihe von Proteinstandardmessungen mit zunehmender DMSO-Konzentration in der Matrix in Relation zur Analysezeit, unter Verwendung des 5100 ALP Systems,
2 zeigt die Ergebnisse einer Reihe von Proteinstandardmessungen mit zunehmender DMSO-Konzentration in der Matrix, unter Verwendung des 2100 Bioanalyzer Systems,
3a zeigt die Ergebnisse von Proteinprobentrennung, unter Einfluss von Methylharnstoff oder Methylharnstoff und DMSO, unter Verwendung des 5100 ALP Systems,
3b zeigt den Einfluss einer Zugabe von Methylharnstoff und DMSO zur Gelmatrix auf die Leistungsfähigkeit der Analyse bezüglich der Auflösung von Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht.
VERSUCHE
BEISPIEL 1
Die 1a und 1b beziehen sich auf die folgende Versuchsanordnung:
Die Versuche wurden durchgeführt unter Verwendung der folgenden Analyseinstrumente: 5100 ALP (Prototyp Agilent Technologies) in Kombination mit einer Protein 200 HT² Untersuchung (Prototyp, Agilent Technologies) und dem geeigneten mikrofluidischen Chip (Protein 200 HT² Chip, hergestellt durch Caliper Life Sciences, Inc.).
In der folgenden Beschreibung der Versuche und Ergebnisse ist „Analyse"-Zeit zu verstehen als die Zeit von der Probeninjektion in den Trennungskanal bis zum Nachweis des größten Proteins, welches auch als oberes Kennzeichen – upper marker (UM) bezeichnet wird.
Aufbereitung der Matrix:
Die elektrophoretischen Gelmatrizes wurden aufbereitet unter Verwendung von:

– PDMA als Matrix-Gel, 6,5 % w/v Feststoffe, hergestellt durch Polysciences, Inc., Art. Nr. 12541
– 0,25 % (w/v) SDS zum Denaturieren der Proteine
– fluoreszierend färbender Farbstoff
– 120 mM Tris-Tricine puffernde Lösung
– DMSO: 1.) 0 %; 2.) 2 %; 3.) 4 %; 4.) 6 %; 5.) 8 %; 6.) 10 % in Bezug auf das Gesamtvolumen an Reagenzien.

Die mit den oben genannten Reagenzien aufbereiteten Matrizes wurden auf einen pH-Wert von 7,6 gepuffert. Das Füllen der Matrizes in die elektrophoretischen Kapillare des mikrofluidischen Chips wird voll automatisch durch die Flüssigkeitsförderungs- und Drucksysteme des 5100 ALP Instruments durchgeführt.
Probenaufbereitung:
Die Proteine wurden mit SDS bei 95 °C 5 Minuten lang wärmedenaturiert, dann wurden sie mit Wasser im Verhältnis 1/5 verdünnt. Das Laden der Proben auf den Chip erfolgte in einem vollautomatisierten Verfahren. Jede Probe wurde durch die elektrophoretische Kapillare bewegt, und somit durch den Trennungskanal, zum Trennen der hierin enthaltenen Proteine. Nach der Trennung wird ein Schritt zur Entfärbung durchgeführt, wenn die Probe den Trennungskanal verlässt.
Identifizierung der Proteine:
Die Identifizierung der Proteine erfolgte nach dem Schritt zur Entfärbung durch Laser induzierte Fluoreszenz (LIF). Die Daten werden gesammelt, verarbeitet und gespeichert durch die 5100 ALP Software (Prototyp, Agilent Technologies).
ERGEBNISSE
Die Analyse der Proteinstandards gemäß der obigen in 1a gezeigten Versuchsanordnung zeigt das Auflösungsvermögen als eine Funktion des DMSO- Gehalts der Gelmatrix. Bei der wiederholten Analyse einer bestimmten Proteinstandardprobe kann man sehen, dass mit einer zunehmenden Konzentration von DMSO in der PDMA-Gelmatrix das Auflösungsvermögen der Trennung verbessert wird. Innerhalb des Bereichs mit niedrigem Molekulargewicht kann das zunehmende Auflösungsvermögen mit zunehmender DMSO Konzentration gut visuell detektiert werden: siehe die gepunkteten vertikalen Linien in 1.
1b bestätigt den visuellen Eindruck der 1: Die entsprechende Auflösung des Systems für die beiden Proteinspitzen von grob 19 kDa und 22 kDa Größe (wie in 1a gezeigt, gepunktete vertikale Linien) wurde mit der folgenden Formel berechnet: Auflösung = 2 (t2 – t1)/(w1 + w2)mit
t1 und t2: Rohmigrationszeit der Spitzen 1 und 2
w1 und w2: temporäre Breite der Spitzen.
Die oben gezeigten Ergebnisse sind durchschnittliche Auflösungswerte aus 12 unabhängigen Durchläufen pro DMSO Konzentration. Es ist klar zu sehen, dass das Auflösungsvermögen der Gelmatrix für Proteine mit niedrigem Molekulargewicht zunimmt je mehr DMSO der Matrix zuvor zugegeben wurde, während die Gesamtanalysezeit zunimmt. Das Optimum in Bezug auf beides, Trennungszeit und Trennungsvermögen wurde erreicht bei 6 % DMSO, das der 6,5 % Standard-PDMA-Gelmatrix zugegeben wurde.
BEISPIEL II
2 bezieht sich auf folgende Versuchsanordnung:
Die Versuche wurden durchgeführt unter Verwendung der folgenden Analyseinstrumente:
2100 Bioanalyzer (Prototyp, Agilent Technologies) in Kombination mit einer Protein 50 Untersuchung (Prototyp, Agilent Technologies) und einem geeigneten mikrofluidischen Chip.
Matrixaufbereitung:
Die elektrophoretischen Gelmatrizes wurden aufbereitet unter Verwendung von:

– PDMA als Matrix-Gel, 6,5 % w/v Feststoffe, hergestellt durch Polysciences, Inc., Art. Nr. 12514
– 0,25 % (w/v) SDS zum Denaturieren der Proteine
– fluoreszierend färbender Farbstoff
– 120 mM Tris-Tricine Pufferlösung
– Methyl-Harnstoff
– DMSO: 1.) 4 %; 2.) 6 %; 3.) 8 %, in Bezug auf das Gesamtvolumen an Reagenzien.

Die Matrizes, die mit den oben genannten Reagenzien aufbereitet wurden, wurden auf einen pH-Wert von 7,6 gepuffert. Das Einfüllen der Matrizes in die elektrophoretischen Kapillaren der mikrofluidischen Einheit erfolgte unter Verwendung der manuellen Standard-Einspritzstation des 2100 Bioanalyzer.
Probenaufbereitung:
Die Proteinproben wurden mit SDS bei 95 °C 5 Minuten wärmedenaturiert, dann wurden diese mit Wasser im Verhältnis 1/15 verdünnt. Das Laden der Proben auf den Chip erfolgte manuell. Jede Probe wurde durch die elektrophoretische Kapillare bewegt, und somit durch den Trennungskanal, zum Trennen der hierin enthaltenen Proteine. Nach der Trennung wird ein Schritt zur Entfärbung durchgeführt, wenn die Probe den Trennungskanal verlässt.
Identifizierung der Proteine:
Die Identifizierung der Proteine erfolgte nach dem Schritt zur Entfärbung durch Laser induzierte Fluoreszenz (LIF). Entsprechende Elektropherogramme werden gesammelt, verarbeitet und gespeichert durch die 2100 Expert Software (Agilent Technologies).
ERGEBNISSE
2 zeigt drei Kurven von Elektropherogrammen, die gesammelt, verarbeitet und gespeichert wurden durch die 2100 Expert Software (Agilent Technologies). Versuche mit drei Proben eines Proteinstandards (Proteinstandardstufen, auf Bestellung gefertigt für Agilent Technologies (Fermentas AB)) wurden durchgeführt. Jede Probe wurde mit einer anderen Matrix getrennt, wobei die Matrizes 4 %, 6 und 8 % DMSO enthielten. Es wird deutlich, dass die Signale, welche von zwei Proteinen herrühren, umso klarer getrennt werden, je mehr DMSO in der Matrix enthalten ist:
Kurve 1, erzielt mit einer Matrix enthaltend 4 % DMSO: der erste Maximalwert, der von Protein 1 herrührt, wurde nach etwa 42,6 s gemessen, der zweite Maximalwert, der von Protein 2 herrührt, wurde nach etwa 43,9 s gemessen, eine Differenz von etwa 1,3 s trennt die Spitzen.
Kurve 3, erzielt mit einer Matrix enthaltend 8 % DMSO: der erste Maximalwert, der von Protein 1 herrührt, wurde nach etwa 42,55 s gemessen, der zweite Maximalwert, der von Protein 2 herrührt, wurde nach etwa 44,3 s gemessen, eine Differenz von etwa 1,95 s trennt die Spitzen.
Die Intensitäten der Signale stehen nicht in Beziehung zu der Auflösung, sie reflektieren eher normale Fluktuationen beim Laden und Verarbeiten der Proben in Richtung Trennungskanal.
Eine Verbesserung der Auflösung ist klar zu sehen.
Entsprechend wurden, obwohl zwei verschiedene mikrofluidische Systeme verwendet wurden, in den Beispielen I und II ähnliche Ergebnisse erzielt.
In den Beispielen I und II (und III, siehe unten) hat DMSO das Auflösungsvermögen von PDM-Gelmatrizes generell verbessert, unabhängig von ihrer Stärke und anderen zugegebenen Zusätzen.
BEISPIEL III
Die 3a und 3b beziehen sich auf die folgende Versuchsanordnung:
Die Versuche wurden durchgeführt unter Verwendung der folgenden Analyseinstrumente:
5100 ALP (Prototyp Agilent Technologies) in Verbindung mit einer Protein 200 HT² Untersuchung (Prototyp, Agilent Technologies) und dem geeigneten mikrofluidischen Chip (Protein 200 HT², hergestellt durch Caliper Life Sciences, Inc.).
Matrixaufbereitung:
Die elektrophoretischen Gelmatrizes wurden aufbereitet unter Verwendung von:

– PDMA als Matrix Gel, 6,5 % w/v Feststoffe, hergestellt durch Polysciences, Inc., Art. Nr. 12514
– 0,25 % (w/v) SDS zum Denaturieren der Proteine
– 0,25 % (vol.) SDS zum Denaturieren der Proteine
– fluoreszierend färbender Farbstoff
– 120 mM Tris-Tricine Pufferlösung
– Die Matrix wurde versehen mit: 1.) 0,4 M Methyl-Harnstoff-Lösung; 2.) 0,2 M Methyl-Harnstoff-Lösung; 3.) 0,2 M Methyl-Harnstoff-Lösung und 4 % DMSO (in Bezug auf das Gesamtvolumen an Reagenzien).

Die mit den obigen Reagenzien aufbereiteten Matrizes wurden auf einen pH-Wert von 7,6 gepuffert. Das Einfüllen der Matrizes in die elektrophoretischen Kapillare der mikrofluidischen Einheit erfolgte in einem voll automatisierten Verfahren.
Probenaufbereitung:
Die Proben wurden mit 1 % SDS bei 95 °C 5 Minuten wärmedenaturiert, dann wurden sie mit Wasser im Verhältnis 1/5 verdünnt. Das Laden der Proben auf den Chip erfolgte in einem voll automatisierten Verfahren. Jede Probe wurde durch die elektrophoretische Kapillare bewegt, und somit durch den Trennungskanal, zum Trennen der darin enthaltenen Proteine. Nach der Trennung wird ein Schritt zur Entfärbung durchgeführt, wenn die Probe den Trennungskanal verlässt.
Identifizierung der Proteine:
Die Identifizierung des Proteins erfolgte nach dem Schritt zur Entfärbung. Die Daten werden erfasst, verarbeitet und gespeichert durch die 5100 ALP Software (Prototyp, Agilent Technologies).
ERGEBNISSE
3a gibt eine bildliche Darstellung der Verbesserung der Auflösung für Proteine mit niedrigem Molekulargewicht (molecular weight – MW). Drei Proben einer Proteinstandardstufe (Fermentas AB) wurden getrennt unter Verwendung der oben genannten Matrix, versehen mit:

1.) 0,4 M Methyl-Harnstoff-Lösung; Kurve 1
2.) 0,2 M Methyl-Harnstoff-Lösung; Kurve 2,
3.) 0,2 M Methyl-Harnstoff-Lösung und 4 % DMSO; Kurve 3.

Die dritte Kurve zeigt, dass das Zugeben von DMSO zu einer bedeutenden Verbesserung der Auflösung führt. Dies wurde gezeigt durch Berechnen der Auflösung entsprechend der unten angegebenen Formel für ein in 3b gezeigtes Beispiel, somit wird ein Detail der 3a hervorgehoben: Auflösung = 2 (t2 – t1)/(w1 + w2)mit
t1 und t2: Rohmigrationszeit der Spitzen 1 und 2
w1 und w2: temporäre Breite der Spitzen
Die Auflösung der analysierten Spitzen, markiert mit vertikalen Linien in 3b, Kurve 3, ist ungefähr 1,5 Mal höher als die Auflösung, welche erzielt wird mit DMSO-freien Matrizes (Kurven 1 und 2).

Claims

Verwendung von Dimethylsulfoxid in einer elektrophoretischen Matrix zur Durchführung von Proteomics als steigerndes Reagenz für die Analyse von Proteinen, wobei das Volumen an Dimethylsulfoxid ungefähr 2 % beträgt oder im Bereich von 4 % bis 15 % liegt, vorzugsweise zwischen 5 % bis 10 %, am meisten bevorzugt zwischen 6 % bis 8 % in Bezug auf das Gesamtvolumen an chemischen Reagenzien, welche in der Matrix enthalten sind.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Matrix zumindest eine der Folgenden ist: eine elektrophoretische Gelmatrix, welche mindestens ein chemisches Reagenz enthält, welches mindestens ein denaturierendes, pufferndes, disaggregierendes, reduzierendes, färbendes oder auflösendes Reagenz ist, wobei die Matrix ein Volumen an Dimethylsulfoxid enthält, eine elektrophoretische Gelmatrix zur Durchführung von Proteomics, eine Poly-N,N-Dimethylacrylamid (PDMA)-, Methylzellulose (MC)-, Hydroxyethylzellulose (HEC)-, Hydroxypropylzellulose (HPC)-, Hydroxypropylmethylzellulose (HPMC)-, Dextran-, lineare Polyacrylamid-, Poly-N-Acryloylaminoethoxyethanol (PAAEE)-, Polyacryloylaminopropanol (PAAP)-, Poly-(acryloylaminoethoxy)ethyl-glucosepyranosid (PAEG)-, Polyethylenglykol (PEG)-, Polyethylenoxid (PEO)- oder Polyvinylpyrrolidon (PVP)-Matrix.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, mindestens einen der folgenden Merkmale aufweisend: das puffernde Reagenz ist ein Tris-Tricine-Puffer und/oder das denaturierende Reagenz ist Sodiumdodecylsulfat und/oder das auflösende und reduzierende Reagenz ist eine Thiol enthaltende Komponente und/oder das färbende Reagenz ist ein fluoreszierender Farbstoff; der fluoreszierende Farbstoff ist wasserlöslich und/oder in wässrigen Lösungen stabil.
Verwendung nach Anspruch 1 oder einem der oben genannten Ansprüche, aufweisend die Trennung und/oder die Identifizierung von Proteinen.
Verwendung nach Anspruch 1 oder einem der oben genannten Ansprüche, wobei der Matrix Sodiumdodecylsulfat zugegeben wird zum Denaturieren der Proteine und/oder Tris-Tricine zugegeben wird zum Puffern der Matrix, und/oder eine Thiol enthaltende Komponente verwendet wird zum Auflösen und Reduzieren der Proteine, und/oder ein fluoreszierender Farbstoff zugegeben wird zum Färben der Proteine.
Verwendung nach Anspruch 1 oder einem der oben genannten Ansprüche für mindestens eines des Folgenden: Einfüllen in eine elektrophoretische Kapillare, welche Teil einer mikrofluidischen Einheit ist zum Austragen von Proteomics, Erzielen einer verbesserten Analyse im Vergleich zu einer Analyse, welche erzielt wird durch Verwendung einer Matrix, welche weniger als 2 Dimethylsulfoxid enthält in Bezug auf das Gesamtvolumen an Reagenzien.
Verfahren zum Verbessern der Analyse bei der Trennung und Identifizierung von Proteinen, aufweisend: Einführen einer Proteine enthaltenden Probe in eine mikrofluidische Einheit mit einer elektrophoretischen Kapillare als Trennungskanal; Verwenden einer Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 6, Bewegen der Probe durch den Trennungskanal zum Sieben der Proteine nach deren Größe, und Identifizieren der Proteine, wenn diese die elektrophoretische Kapillare verlassen, durch Anwendung eines Identifizierungsverfahrens, wobei die durch das Identifizierungsverfahren erzielten Resultate eine verbesserte Analyse aufweisen im Vergleich zu Resultaten, welche erzielt werden, wenn die Matrix verwendet wird, welche weniger als 2 Dimethlysulfoxid enthält in Bezug auf das Gesamtvolumen an chemischen Reagenzien, welche in der Matrix enthalten sind.
Verfahren nach Anspruch 7, mindestens einen der folgenden Merkmale aufweisend: die Verbesserung der Analyse wird optisch nachgewiesen, die Verbesserung der Analyse wird durch Flüssigkeitsleitfähigkeitsmessungen gemessen, das Identifizierungsverfahren ist ein optisches Nachweisverfahren wie Laserinduzierte Fluoreszenz oder jede andere geeignete Identifizierungstechnik.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, des Weiteren aufweisend: Zugeben mindestens eines chemischen Reagenzes welches mindestens ein denaturierendes, pufferndes, disaggregierendes, reduzierendes, färbendes oder auflösendes Reagenz ist, und Zugeben eines Volumens an Dimethylsulfoxid zu einem elektrophoretischen Gel, insbesondere zu einem Poly-N,N-Dimethylacrylamid (PDMA)-, Methylzellulose (MC)-, Hydroxyethylzellulose (HEC)-, Hydroxypropylzellulose (HPC)-, Hydroxypropylmethylzellulose (HPMC)-, Dextran-, linearen Polyacrylamid-, Poly-N-Acryloylaminoethoxyethanol (PAAEE)-, Polyacryloylaminopropanol (PAAP)-, Poly-(acryloylaminoethoxy)ethylglucosepyranosid (PAEG)-, Polyethylenglykol (PEG)-, Polyethylenoxid (PEO)- oder Polyvinylpyrrolidon (PVP)-Matrixgel.
Verfahren nach Anspruch 7 bis 9, des Weiteren aufweisend: Einfüllen in die Kapillare, vorzugsweise unter Druck, wobei die Matrix eine elektrophoretische Gelmatrix ist, insbesondere eine Matrix, welche mindestens ein chemisches Reagenz aufweist, welches mindestens ein denaturierendes, pufferndes, disaggregierendes, reduzierendes, färbendes oder auflösendes Reagenz ist.