DE2929478A1

DE2929478A1 - Verfahren und vorrichtung zur durchfuehrung einer ein- und zweidimensionalen mikro-gelelektrophorese

Info

Publication number: DE2929478A1
Application number: DE19792929478
Authority: DE
Inventors: Robert Dr Neukirchen; Uli Dr Schwarz
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1979-07-20
Filing date: 1979-07-20
Publication date: 1981-02-05
Also published as: US4305799A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung einer ein- und zweidimensionalen Mikro-Gelelektrophorese, insbesondere von Proteinen und Proteingemischen, bei dem zunächst in einem Kapillargel eine eindimensionale Mikro-Gelelektrophorese durchgeführt und danach das Kapillargel seiner Kapillare entnommen wird; außerdem betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.

Io Es ist bekannt, zur Untersuchungen von Proteinen und

Proteingemischen aus biologischem Material eine Gelelektrophorese durchzuführen. Hierbei erfolgt eine Auftrennung von Proteinen gemäß dem isoelektrischen Punkt durch isoelektrische Fokussierung oder gemäß dem Molekulargewicht durch Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese. Eine Kombination dieser beiden eindimensionalen Techniken ermöglicht eine zweidimensionale Gelelektrophorese. Diese zweidimensionale Gelelektrophorese erfordert in ihrer konventionellen Ausführung einen hohen Zeitaufwand, der bis zu zwei Tage für eine zweidimensionale Gelelektrophorese betragen kann, sowie weiterhin einen hohen Aufwand an teuren Reagenzien, wie z. B. an Ampholyten, außerdem werden komplizierte und kostenaufwendige Geräte benötigt, und darüber hinaus besteht ein relativ hoher Bedarf an Probensubstanz, um eine Gelelektrophorese durchführen zu können.

Mit der Erfindung soll ein Verfahren und eine Vorrichtung der eingangs genannten Art geschaffen werden, mit welcher der Zeit-, Material-, Geräte- und Probensubstanzaufwand, der erforderlich ist, und damit der effektive Kostenaufwand zur Durchführung einer Gelelektrophorese

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auf ein Minimum reduziert wird.

Das wird mit dem eingangs genannten Verfahren erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß ein nach Durchführung der

eindimensionalen Mikro-Gelelektrophorese erhaltenes Kapillargelstäbchen längs einer Seitenkante eines Flachkapillargels angeordnet und mit letzterem verbunden wird, wonach in dem Flachkapillargel die zweite Dimension einer zweidimensionalen Mikro-Gelelektrophorese durchgeführt wird.

Eine Vorrichtung zur Durchführung einer ein- und zweidimensionalen Mikro-Gelelektrophorese gemäß der Erfindung zeichnet sich aus durch einen ersten und zweiten langge-

15 streckten, in ihrem Inneren mit je einer Elektrode versehenen Flüssigkeitstrog, die übereinander sowie parallel zueinander angeordnet sind, wobei der untere Flüssigkeitstrog senkrecht zur Längsrichtung der Flussigkeitströge über die eine äußere Längsseite des oberen Flüssigkeits-

2o troges vorsteht, so daß sich ein im unteren Flüssigkeitstrog senkrecht stehender flacher Kapillarkörper an dieser einen äußeren Längsseite des oberen Flüssigkeitstrogs vorbei erstrecken kann.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und mit der Vorrichtung nach der Erfindung, in denen mit Flachgelen gearbeitet wird, deren Dicke im /um-Bereich liegt, können bei minimalem Bedarf an Reagenzien und Geräten Proteingemische im Nanogramm-Bereich in wenigen Stunden zweidimensional analysiert werden, wobei man eine erhebliche Anzahl an aufgetrennten Proteinen und damit eine ausgezeichnete Übersichtlichkeit der Analyse erhält und wobei ferner Schwierigkeiten durch unregelmäßigen "Hintergrund" durch die zweidimensionale, im Mikro-Maßstab erfolgende Auftrennung reduziert werden. Das erfindungs-

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gemäße Verfahren eignet sich also insbesondere für Untersuchungen, bei denen nur eine sehr geringe Menge an Probensubstanz zur Verfügung steht. Der geringe Zeitaufwand erlaubt den Einsatz auch dort, wo die konventionelle GeI-elektrophorese zu zeitraubend wäre, also insbesondere bex Serien- und Routineuntersuchungen.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist gegenüber den aufwendigen Geräten für die konventionelle Gelelektrophorese unter relativ geringem Aufwand herstellbar, und es können damit Probenmengen bis zu Bruchteilen von Mikrolitern untersucht werden.

Insbesondere können mit dem Verfahren nach der Erfindung und mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung Trennungen und autoradiographische Untersuchungen von Proteinen im Subnanogramm-Bereich aus Zellmaterial durchgeführt werden, das aus Gewebekulturen mittels Mikromanipulator und Mikroskop isoliert wurde. Außerdem sind beispielsweise Untersuchungen des Proteinmusters von Einzel- und Serienschnitten aus Gewebeproben möglich, die beispielsweise mittels eines Gefriermikrotoms gewonnen sind, das Schnitte von 15 ,um mit einem Feuchtgewicht von ca. 2o,ug und einem Durchmesser von 2 mm liefert. 25

Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Fig. 1 bis Io der Zeichnung anhand einiger besonders bevorzugter Ausführungsbeispiele näher erläutert; es zeigen:

Fig. 1 eine perspektivische Ansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung bei der Durchführung einer Mikro-Gel-

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- Io -

elektrophorese mittels Kapillargelen bei isoelektrischer Fokussierung;

Fig. 2 eine Ansicht eines Kapillarkörpers mit Kapillargel und einer aus einem Schlauchstück und einem hakenförmigen Röhrchenstück bestehenden Aufhängevorrichtung;

Fig. 3 eine Veranschaulichung der Herstellung eines Flachkapillargels mit Taschen für die eindimensionale Mikro-Gelelektrophorese;

Fig. 4 eine Vorrichtung nach der Erfindung während einer Mikro-Gelelektrophorese an einem Flachkapillargel.

Fig. 5 und 6 eine Vorrichtung nach der Erfindung während der Durchführung einer zweidimensionalen Mikro-Gelelektrophorese, wobei in Fig. 5 der Eisbehälter aus Darstellungsgründen gegenüber dem übrigen Teil der Vorrichtung stark verkleinert gezeichnet ist;

Fig. 7 eine Glasplatte für die Herstellung eines Flachkapillargels für die zweidimensionale Mikro-Gelelektrophorese;

Fig. 8 und 9 eine Veranschaulichung der Herstellung eines Flachkapillargels für die zweidimensionale Mikro-Gelelektrophorese ; und

Fig. Io das Aufbringen eines KapillargelStäbchens, mit dem eine eindimensionale Mikro-Gelelektrophorese durchgeführt worden ist, auf ein'Flachkapillargel zum Zwecke des Durchführens einer zweidimensionalen Mikro-Gelelek-

35 trophorese.

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Es sei zunächst auf Fig. 1 Bezug genommen, in der eine insgesamt mit 1 bezeichnete Vorrichtung zur Durchführung einer ein- und zweidimensionalen Mikro-Gelelektrophorese perspektivisch veranschaulicht ist. Diese Vorrichtung 1 weist einen oberen Flüssigkeitstrog 2 und einen unteren Flüssigkeitstrog 3 auf, in denen sich je eine, vorzugsweise stab- oder drahtförmige, Elektrode 4 bzw. 5 befindet, die über entsprechende Anschlußleitungen 6 bzw. 7 mit einem in Fig. 1 nicht dargestellten Stromversorgungsgerät verbunden sind.

Die beiden Flüssigkeitströ'ge 2 und 3 dienen zur Aufnahme der Elektroden-Lösungen, und zwar ist je nach der Art der Mikro-Gelelektrophorese im oberen Flüssigkeitstrog 2 entweder eine Anoden-Lösung oder eine Kathoden-Lösung vorgesehen; ersteres ist beispielsweise bei der Durchführung einer eindimensionalen Mikro-Gelelektrophorese mit isoelektrischer Fokussierung der Fall, wie sie in Fig. 1 dargestellt ist, während letzteres z. B. bei der Durchführung der zweiten Stufe oder Dimension einer zweidimensionalen Mikro-Gelelektrophorese der Fall ist, wenn diese zweite Stufe als Natriumdodecylsulfat-Elektrophorese durchgeführt wird, wie sie weiter unten in näheren Einzelheiten erläutert ist.

Der obere Flüssigkeitstrog 2 ist im vorliegenden Ausführungsbeispiel der Vorrichtung 1 einstückig mit einem oberen Halteteil 8 ausgebildet, während der untere Flüssigkeitstrog 3 einstückig mit einem unteren Halteteil 9 ausgebildet ist. Die beiden Halteteile 8 und 9 sowie die damit einstückigen Flüssigkeitströge 2 und 3 können beispielsweise aus Acrylglas oder einem anderen geeigneten Kunststoff hergestellt sein.* Das untere Halteteil 9 ist als Ständer ausgebildet, so daß es auf eine Arbeitsflä-

35 ehe, z. B, auf eine Tischplatte, gestellt werden kann.

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An dem unteren Halteteil 9 ist eine senkrechte Säule Io befestigt, längs derer das obere Halteteil 8 verschiebbar und in einem jeweils gewünschten Abstand von dem unteren Halteteil 9 mittels einer als Klemmschraube ausge-5 bildeten Feststellvorrichtung 11 feststellbar ist, so daß auf diese Weise der Abstand zwischen den beiden Flüssigkeitströgen 2 und 3 in gewünschter Weise eingestellt werden kann.

Io Die beiden Flüssigkeitströge 2, 3 haben vorzugsweise einen rechteckigen oder quadratischen Querschnitt, und ihr Längsschnitt parallel zur Flüssigkeitsoberfläche hat bevorzugt die Form eines langgestreckten Rechtecks. Die beiden Flüssigkeitströge 2 und 3 sind parallel zueinan-

der angeordnet, jedoch steht der untere Flüssigkeitstrog 3 in zur Längsrichtung der Flüssigkeitströge 2, 3 senkrechter Richtung über die vom übrigen Teil der Vorrichtung 1 abgewandte äußere Längsseite 12 des oberen Flüssigkeitstroges 2 vor, so daß Kapillarkörper 13, die mittels eines Schlauchstücks 14 mit einem hakenförmigen Röhrchenstück 15 verbunden und mittels dieses hakenförmigen Röhrchenstücks am oberen, äußeren Rand 16 des oberen Flüssigkeitstrogs 2 aufgehängt sind, mit ihren unteren Enden 17 in den unteren Flüssigkeitstrog 3 hineinhängen, und zwar bei senkrechter Ausrichtung der Kapillarkörper 13.

Die Kapillarkörper 13 sind, wie Fig, 2 zeigt, mit einem Kapillargel 18, dem eigentlichen Trenngel, über den größten Teil ihrer Länge gefüllt, auf das am oberen Ende eine zu analysierende Probe 19 aufgebracht ist, an die sich nach oben eine Überschichtungslösung anschließt, die bis zum oberen öide der Glaskapillare 'reicht und über welche die Verbindung mit der im hakenförmigen Höhrchenstück 15 und im oberen Flüssigkeitstrog 2 befindlichen Anoden-Lösung 2o hergestellt wird.

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Der im Querschnitt vorzugsweise kreisringförmige Kapillarkörper 13 ist in Fig. 2 in dem Zustand dargestellt, den er kurz vor seiner Fertigstellung hat. In diesem Zustand befindet sich noch ein Stopfen 21 im unteren Ende des Kapillarkörpers 13, der beispielsweise aus einer plastischen Kunststoffmasse besteht und dazu dient, ein Herauslaufen der Gellösung vor ihrem Festwerden zu verhindern. Vor der Durchführung der Mikro-Gelelektrophorese, die in Fig. 1 angedeutet ist, wird das untere Ende des aus Glas bestehenden Kapillarkörpers 13, in dem sich der Stopfen 21 befindet, bei 22 abgeschnitten, so daß das Kapillargel 18 am unteren Ende 17 direkt mit der Kathoden-Lösung 23 in Berührung gelangt, die sich im unteren Flüssigkeitstrog 3 befindet.

Eine andere Möglichkeit der Durchführung einer eindimensionalen Mikro-Gelelektrophorese, die bei der Analyse von vielen Proben besonders vorteilhaft ist, besteht darin, daß man, wie die Fig. 3 und 4 zeigen, ein Flachkapillargel 24 verwendet, das sich zwischen zwei parallelen Glasplatten 25 und 26 befindet, auf deren einander zugewandte Seiten längs ihrer seitlichen Ränder jeweils ein .vorzugsweise aus Glas bestehender Abstandsstreifen 25a, 25b bzw. 26a, 26b aufgebracht ist. Diese Abstandsstreifen enden einige mm, beispielsweise 5 mm, vor den oberen Rändern 27 und 28 der Glasplatten 25, 26, wobei sich die Angabe "oben" auf die Lage dieser Ränder bei der Durchführung der Mikro-Gelelektrophorese bezieht, wie sie in Fig, 4 angedeutet ist.

Durch Einfügung der Kammzinken 29 einer kammartigen Folie 3o längs der oberen Ränder 27, 28 der Glasplatten 25, 26 während der Herstellung des Flachkapillargels werden in letzterem nebeneinanderliegende Taschen 31 ausgebildet, die, nachdem die kammartige Folie 3o ent-

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fernt worden ist, in entsprechender Weise wie bei dem Kapillarkörper 13 nach Fig. 2 mit einer Probe 19 und einer Überschichtungslösung 19a versehen werden können.

Die Abstandsstreifen 25a und 26a haben vorzugsweise je eine Dicke von o,1 mm, während die Abstandsstreifen 25b und 26b vorzugsweise je eine Dicke von o,15 nun besitzen, so daß sich insgesamt ein Abstand zwischen den einander zugewandten Flächen der Glasplatten 25 und 26 ergibt, der 25o,um beträgt, also ein 25o,um dickes Flachkapillargel 24 zwischen diesen Glasplatten entsteht.

Während der Herstellung des Gels werden die Glasplatten 25 und 26 durch seitlich angebrachte Klammern 32 zusammengehalten, die beispielsweise je aus einem in Axialrichtung aufgeschlitzten Polyäthylenröhrchenstück bestehen. Nachdem das Gel 24 hergestellt ist, können die Klammern 32 entfernt werden, weil dann die Glasplatten 25, 26 durch das Gel 24 zusammengehalten werden.

Wie Fig. 4 zeigt, umfaßt die Vorrichtung 1 noch einen vorzugsweise aus Aluminium bestehenden Kühlblock 33, der eine ebene Außenfläche 34 hat, und die an den flachen Kapillarkörper 35 angelegbar ist, der von den beiden Glasplatten 25, 26 gebildet wird. Der Kühlblock 33 ist mit einer Kühleinrichtung in Form eines Eisbehälters 36 versehen, und zwar so, daß die der ebenen Außenfläche 34 des Kühlblocks 33 gegenüberliegende Fläche 37 des letzteren eine der Innenwände des Eisbehälters 36 bildet. Die Bodenfläche 38 des Eisbehälters 36 und die Bodenfläche 39 des Kühlblocks 33 sind eben ausgebildet und liegen in der gleichen Ebene, so daß der Kühlblock 33 zusammen mit dem Eisbehälter 36 ebenso wie das untere Halteteil 9 auf eine Arbeitsfläche, beispielsweise eine Tischfläche, gestellt werden können. Der Kühlblock

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33 besitzt eine sich über seine gesamte Länge erstreckende untere Ausnehmung 4o, deren Höhe etwas größer als die Höhe des unteren Flüssigkeitstrogs 3 einschließlich des daran anschließenden Halteteils 9 ist. Die Breite der Ausnehmung 4o ist etwa gleich der Breite des unteren Flüssigkeitstrogs 3.

Die Flüssigkeitsverbindung zwischen der in den Taschen 31 stehenden Überschichtungslösung 19a und der im oberen Trog 2 befindlichen Anoden-Lösung 2o erfolgt durch ein flächiges Kapillarmaterial 41, beispielsweise ein Blatt Filtrierpapier, das einerseits auf die oberen Ränder 27, 28 der Glasplatten 25, 26 und andererseits auf die oberen Ränder des oberen Flüssigkeitstrogs 2 aufgelegt ist, wobei letzterer bis zu seinen oberen Rändern mit der Anoden-Lösung 2o gefüllt ist.

Für die Durchführung der zweiten Stufe oder der zweiten Dimension einer zweidimensionalen Mikro-Gelelektrophorese, die, wie die Fig. 5 und 6 zeigen, mit der gleichen Vorrichtung 1 durchgeführt werden kann, wie die erste Stufe bzw. eine eindimensionale Mikro-Gelelektrophorese, werden ebenfalls Flachkapillargele 24 in einem flachen Kapillarkörper 35 verwendet, die sich von den für die eindimensionale Mikro-Gelelektrophorese benutzten Flachkapillargelen nach den Fig. 3 und 4 im wesentlichen dadurch unterscheiden, daß sie keine Taschen 31 besitzen, sondern vielmehr einen verdickten oberen Rand 42, der in einer konkaven Auflagefläche 43 für ein Kapillargelstäbchen 44 ausläuft. Das Kapillargelstäbchen 44 ist das Ergebnis einer eindimensionalen Mikro-Gelelektrophorese der in Fig. 1 gezeigten Art, es kann aber auch ein aus dem Flachgel 24 der Fig. 3 nach .Durchführung der eindimensionalen Mikro-Gelelektrophorese herausgeschnittenes Kapillargelstäbchen sein, in welchem Falle man die Auflageflä-

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ehe 43 eben ausbilden wird, damit sich eine möglichst große Flächenberührung mit dem dann rechteckigen Kapillargelstäbchen und dem verdickten Rand 42 ergibt. Das Kapillargelstäbchen 44 wird mit seiner Längsrichtung in Längsrichtung des verdickten Randes 42 verlaufend, auf diesen Rand aufgelegt, wie besonders gut aus der perspektivischen Darstellung der Fig. 5 ersichtlich ist.

Zur Ausbildung des verdickten Randes werden Glasplatten Io 45, 46 verwendet, die sich von den Glasplatten 25 und 26 im wesentlichen nur dadurch unterscheiden, daß ihre oberen Ränder 47, 48 eine Abschrägung aufweisen, die mit der äußeren, ebenen Seite der jeweiligen Glasplatte einen Winkel c/ von 2o bis 45 , vorzugsweise von 3o , einschließt 15 und sich praktisch über die gesamte Dicke der Glasplatte 45 bzw. 46 erstreckt, so daß der verdickte obere Rand 42 an seiner dicksten Stelle etwa wenigstens die zweifache Dicke des Flachkapillargels 24 oder eine noch größere Dicke erhält. Die Abstandsstreifen 25a und 25b bzw. 26a 2o ^un<3 26b sind in gleicher Weise wie in Fig. 3 vorgesehen, und ihre oberen Ränder haben einen Abstand A vom unteren Ende der jeweiligen Abschrägung von einigen mm, beispielsweise von 2 mm.

Vorzugsweise wird der verdickte Rand 42 aus Sammelgel ausgebildet, das sich bis auf das Niveau der oberen Ränder der Abstandsstreifen 25a und 25b bzw. 26a und 26b von oben her erstreckt, wozu bei der Herstellung des Flachkapillargels 24 aus Trenngel eine Folie 49 in diesen auszusparenden Bereich, in den später das Sammelgel 5o kommt, eingefügt wird.

Zur Ausbildung einer konkaven Auflagefläche 43 wird während der Polymerisierung des Sammelgels 5o eine Glaskapillare 51 an die Stelle aufgelegt, an der später das

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Kapillargelstäbchen 44 angeordnet werden soll. Die Fig. Io zeigt, daß eine gute Kontaktierung zwischen der konkaven Auflagefläche 43 und der darauf liegenden Fläche des Kapillargelstäbchens 44 durch Benetzung dieser beiden Flächen mittels Natriumdodecylsulfat-Probenpuffer erreicht werden kann, der in ganz geringen Mengen, wie bei 54 in Fig. Io angedeutet, zugefügt wird.

Die für eine Natriumdodecylsulfat-Mikro-Gelelektrophorese in der zweiten Dimension erforderliche Flüssigkeitsverbindung zwischen der in diesem Falle im oberen Flüssigkeitstrog 4 befindlichen Kathoden-Lösung und dem Kapillargelstäbchen 44 wird in gleichartiger Weise wie in Fig. 4 dargestellt, durch ein flächiges Kapillarmaterial 41 hergestellt, das nur in Fig. 6 gezeigt ist, während es aus Zwecken einer klareren Darstellung in Fig. 5 weggelassen ist. Es sei noch darauf hingewiesen, daß bei der Vorrichtung 1 nach den Fig. 5 und 6 eine Längsnut 52 in der senkrechten Säule Io vorgesehen ist, in die das mit dieser Säule zusammenwirkende Ende der Klemmschraube der Feststellvorrichtung 11 eingreift, so daß die beiden Flüssigkeitströge 2 und 3 automatisch immer genau parallel zueinander gehalten werden, was bei den platten- bzw. folienförmigen Flachkapillargelen 24 wichtig ist.

Außerdem ist in Fig. 5 das Stromversorgungsgerät 53 angedeutet.

Die Erfindung wird nachstehend anhand einiger Beispiele noch etwas ausführlicher erläutert. 3o

Beispiele von Ampholyten für die Mikro-Gelelektrophorese

Ampholyten zur isoelektrischen Fokussierung können je nach Bedarf ausgewählt werden. Erzeugnisse verschiedener Firmen können aber zu unterschiedlich guten Ergeb-

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nissen führen. Für die Erzeugung eines breiten pH-Gradienten in Kapillargelen hat sich eine Mischung der verschiedenen "Servalyte" (Serva) als besonders geeignet erwiesen:

Servalyt

pH	2-4	o,2	ml
PH	3-5	o,2	ml
pH	4-6	o,2	ml
pH	5-7	o,2	ml
PH	6-8	o,2	ml
pH	7-9	o,2	ml
pH	8-lo	o,2	ml

Diese Mischung ergibt einen Gradienten im pH-Bereich 15 von ungefähr pH 4 bis pH 9,5 mit gleichmäßigerer Steigung als bei Verwendung einer fertigen Mischung (z. B. pH 2-11). Für die Fokussierung in Mikro-Flachgelen ("slabs") hat sich dagegen der Breitbereichs-Ampholyt "Pharmalyt pH 3-lo" (Pharmacia) gut bewährt. 2o

Beispiele von Lösungen für die isoelektrische Fokussierung

Acrylamid-Stammlösung

Harnstoff 45,ο g

Acrylamid 5,ο g

Bis o,2 g

Saccharose 12,ο g

Triton X-loo 2,ο g

bidest. Wasser bis Ιοο,ο ml

Anoden-Lösung

Saccharose . 6,ο g

o,öl M Phosphorsäure bis Ιοο,ο ml 35

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Kathoden-Lösung

Saccharose 6,0 g

o,o2 M Natronlauge bis loo,ο ml

Proben-Überschichtungslösung

Harnstoff 3,ο g

Ampholyte 1,ο g

Triton X-loo o,2 g

Saccharose 1,2 g

bidest.Wasser bis lo,o ml

Proben-Solubilisierungslösung

Harnstoff 4,5 g

Ampholyte o,5 g

Triton X-loo o,2 g

Saccharose 1,2 g

ß-Mercaptoäthanol o,5 g bidest.Wasser bis Ιοο,ο ml

Homogenisationspuffer für Membran-Rohextrakte

Tris o,öl M o,121 g

Magnesiumchlorid ο,ΐοο g

DNase o,oo5 g

RNase o,oo5 g

Salzsäure bis pH 7,4

bidest.Wasser bis Ιοο,ο ml

Gel-Fixierungslösung

Methanol 15o,o ml

Sulfosalicylsäure 17,25 g

TriChloressigsäure 57,5 g bidest. Wasser bis 5oo,o ml

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Gel-Färbelösung

Coomassie-Brillantblau R 25o (Merck) l,o g

Methanol 5oo,o ml

5 Essigsäure 96 % Ιοο,ο ml

bidest.Wasser bis Ιοοο,ο ml

Gel-Entfärber

Essigsäure 96 % 8o,o ml

Io Äthanol 96 % 25o,o ml

bidest. Wasser bis Ιοοο,ο ml

Beispiele für die Herstellung von Kapillar- und Flachkapillarqelen für die isoelektrische Fokussierung

Für Kapillargele, die als erste Dimension bei der zweidimensionalen Elektrophorese dienen, werden 25-Mikroliter-Glaskapillarpipetten mit einem Innendurchmesser von o,56 mm für einige Tage in alkalien- und detergentienhaltigem Laborreinigungsmittel eingelegt. Die Kapillaren werden heiß ausgespült, mit bidestilliertem Wasser gewaschen und bei 12o°C getrocknet. Mit einem Diamant-Glasschneider werden Abschnitt von 35 mm Länge abgetrennt.

Für die Herstellung.von kleinen Flachkapillargelen werden 1 mm dicke Glasplatten 25, 26 wie die Kapillaren mit dem Laborreinigungsmittel vorbehandelt und mit dem Diamanten halbiert. Die Kanten werden mit feinem Sandpapier entgratet. Die 24 χ 38 mm großen Glasplatten 25, 26 werden an den schmalen Kanten mit etwa 2 mm breiten Abstandsstreifen 25a, b und 26a, b aus o,1 mm dünnem Glas versehen, die aufgekleb't werden. Das Laborreinigungsmittel verbessert die Benetzbarkeit der Glasplatten und ermöglicht das Anhaften der Gele, ünbehandeltes Glas

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ermöglicht keine gleichmäßige Polymerisation der Gele und ist deshalb ungeeignet.

Für ein Flachkapillargel 24 nach Fig. 3 wird eine kammartige Folie 3o mit 5 bis Io Kammzinken 29 etwa 3 mm tief eingesteckt, die die Stellen für das Auftragen der Proben freihält. Die Kammzinken 29 können aus 1 mm breiten Streifen geeigneten Materials bestehen, die die Polymerisation der Gele nicht beeinflussen aber auch nicht selbst zu fest einpolymerisiert werden (Beschädigung der Gelkanten) sollen,

Beispiel für Ansätze für Kapillargele bzw. Fiachkapillargele _; ,

Acrylamid-Stammlösung o,55o nil

Servalyte-Mischung bzw. Pharmalyt pH 3-lo o,o25 ml

TEMED-Lösung {lo ,ul/ml) o.. o4o rul

Ammoniumperoxodisulfat-Lösung (Io mg/ml) o,o4o ml

Acrylamidgehalt effektiv: 4,3 % Ampholyte effektiv: 1,6 %.

Beispiel für das Gießen der Gele

Die Glaskapillaren-Abschnitte, welche die Kapillarkörper 13 bilden, werden durch schräges Eintauchen in die Gellösung vollständig gefüllt und in eine etwa 2 mm dicke Plastilinschicht gesteckt. Sofort danach werden mit einer dünn ausgezogenen Glaskapillare die obersten 2 bis 3 mm jedes Röhrchens freigesaugt, um Platz für das Auftragen der Probe freizuhalten. Die Kapillargele polymerisieren in senkrechte"!: Stellung.

Flachgele werden liegend gegossen, indem der Zwischenraum

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zwischen den Glasplatten 25, 26 mit eingesetzter kammartiger Folie 3o mit einer Pipette vorsichtig und vollständig gefüllt wird.

Alle Gele für die isoelektrische Fokussierung werden bei Raumtemperatur und in gesättigter Wasserdampfatmosphäre polymerisiert ("pneumatische Wanne"). Sie sind nach etwa zwei Stunden fertig und bis zu zwei Tage lang gebrauchsfähig,

Beispiel für die Vorbereitung der Proben für die isoelektrische Fokussierung

Kleine Gewebeproben werden unter Verwendung von Homogenisationspuffer, der Membranbestandteile stabilisiert und Nucleinsäuren abbaut, gründlich homogenisiert. Nach Zentrifugieren des Homogenats werden die im Sediment enthaltenen Membranen durch Homogenisation in Solubilisierungslösung in Lösung gebracht. Für lo,ug Gesamtprotein sind 1 bis 2,ul ausreichend. Ungelöste Bestandteile werden abzentrifugiert, die Probe, d. h. der Überstand wird mit etwas Saccharose,und zwar etwa Io %, versetzt. Dadurch erhöht sich die Dichte und das Auftragen wird erleichtert (keine Vermischung oder Abschwemmung der Proben an der Auftragstelle). Bei gereinigten Proteinen können Konzentrationen von o,l mg/ ml bis o,öl mg/ml verwendet werden. Einzelne Proteine sind bis unter 5 ng pro Probe nachweisbar.

Beispiel für den Verlauf der Fokussierung in der ersten Dimension '

Die optimalen elektrischen Bedingungen wären bei Versorgung durch konstante elektrische Leistung gegeben. Dabei bliebe die Belastung der Gele durch Wärmeentwick-

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lung über die Dauer des Laufes konstant. In der Praxis ist ein anderes Vorgehen erforderlich, da Stromversorgungsgeräte für konstante Leistung im Mikro- und Milliwatt-Bereich praktisch nicht verfügbar sind. So wird ein Kompromiß zwischen thermischer Belastung der Gele und der kürzestmöglichen Laufzeit getroffen. Bei Betrieb mit einer konstanten Spannung würde sich zu Beginn des Laufs eine sehr hohe Erwärmung ergeben, die mit der Zunahme des Gel-Innenwiderstandes über die Laufzeit abnimmt. Betrieb mit einem konstanten Strom hätte zur Folge, daß die thermische Belastung im Laufe der Fokussierung ständig zunimmt und gegen Ende des Laufes zu hohe Spannungen auftreten. Es wäre natürlich möglich, durch fortlaufende manuelle Regelung das Produkt "Leistung = Spannung χ Strom" konstant zu halten, dieser Aufwand hat sich jedoch als unnötig erwiesen. Folgender Kompromiß hat sich für die Mikro-Gelelektrophoresen bewährt und führt zu gut reproduzierbaren Auftrennungen: In der ersten Phase des Laufes wird das Gel mit einem konstanten Strom versorgt. Dieser wird so eingestellt, daß sich zu Beginn eine resultierende Spannung von 3o bis 4o Volt ergibt. Die Spannung steigt dann im Verlauf der nächsten Minuten an. Sobald loo Volt erreicht sind, wird das Stromversorgungsgerät 53 auf konstante Spannung umgeschaltet und ein Wert von loo Volt eingestellt, der bis zum Ende des Laufes beibehalten wird. Die gesamte Laufzeit einer isoelektrischen Fokussierung beträgt etwa 75 Minuten. Davon entfallen 15 bis 2o Minuten auf die erste (Konstantstrom-) Phase. Wenn Cytochrom C als Indikatorsubstanz verwendet wird, gilt der Lauf 5 Minuten nachdem das Cytochrom die Gelunterkante verlassen hat, als beendet. Das gilt gleichermaßen für die Fokussierung in Flachkap'i 1 largelen.

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Beispiele für das Fixieren und Färben

Das Kapillargel 18 kann dann mit einem passenden Stahldraht, einen Paraffinpfropf als Stempel verwendend, 5 langsam aus dem Kapillarkörper 13 geschoben werden. Das Paraffin verhindert eine Beschädigung des Kapillargels 18, Die Kapillargele werden für 15 bis 2o Minuten in Fixierlösung fixiert und danach einige Minuten in Gel-Entfärber gewaschen, bis die milchig-trüben Gele

Io wieder völlig klar und durchsichtig werden. Die Kapillargele werden 15 bis 2o Minuten in Färbelösung, die im Verhältnis 1 : 1 mit Entfärber verdünnt ist, gefärbt und danach entfärbt. Die Färbelösung wird verdünnt, da die Kapillargele sonst irreversibel verformt werden.

Für die zweidimensionale Elektrophorese bestimmte Kapillargele werden vor dem zweiten Lauf für 2 bis 3 Minuten in Natriundodecylsulfat-Elektrodenpuffer gewaschen. Ohne Beeinträchtigung der Ergebnisse kann die Auftrennung in der zweiten Dimension zu 2ο einem späteren Zeitpunkt durchgeführt werden, wenn die Kapillargele sofort nach der Fokussierung zusammen mit einigen Tropfen SDS-Elektrodenpuffer schnell tiefgefroren werden, vorzugsweise unter Verwendung eines Trcckeneis-Methanol-Geniisches.

Beispiele von Lösungen für eine Natriumdodecylsulfat-Mikro-Gelelektrophorese

Die Natriumdodecylsulfat-Mikro-Gelelektrophorese kann für sich allein (eindimensional) oder in Kombination mit der isoelektrischen Fokussierung zweidimensional

durchgeführt werden. In beiden Fällen erfolgt eine Trennung nach dem Molekulargewicht der Proteine in Mikro-Flachgelen, die hier als Flachkapillargele bezeichnet und bevorzugt 25o/Um dick sind.

Acrylamid-Stammlösung für Natriumdodecylsulfat-Gele Acrylamid 3o,o g

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Bis ο, 8 g

bidest. Wasser bis Ιοο,ο ml

Unterer Gelpuffer (Konzentrat)

Natriumdodecylsulfat o,2 g

Saccharose 24,ο g

Tris 9,1 g Salzsäure bis pH 8,8

bidest. Wasser bis Ιοο,ο ml

Oberer Gelpuffer (Konzentrat)

Natriumdodecylsulfat o,2 g Saccharose 2A₁ ο g

Tris 3,ο g

Salzsäure bis pH 6,8

bidest. Wasser bis Ιοο,ο ml

Natriumdodecylsulfat-Elektrodenpuffer (pH 8,3)

Tris o,3o g

Glycin 1,44 g

Natriumdodecylsulfat o,lo g Saccharose 12,ο g

bidest. Wasser bis Ιοο,ο ml

"Blauer" Probenpuffer

Saccharose 12,ο g

Glycerin lo,o g

Natriumdodecylsulfat 5,ο g

ß-Mercaptoäthanol 5,ο g

Tris o,75 g

Salzsäure bis pH 6,8

bidest. Wasser bis Ιοο,ο ml

Der Puffer wird zur Sichtbarmachung der Lauffront im Gel mit einigen Tropfen Bromphenolblau-Lösung (2 %) gefärbt ,

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Ansatz für 11 %-xge Trenngele

Acrylamid-Stammlösung 3,65 ml

bidest. Wasser 1,35 ml Unterer Gelpuffer (Kon-

zentrat) 5,oo ml

= Ιο,οο ml

Ansatz für 4 %-ige Sammelgele

Acrylamid-Stammlösung l,3o ml bidest. Wasser 3,7o ml Oberer Gelpuffer (Konzentrat) 5,oo ml

= Ιο,οο ml

In allen angegebenen Fällen wird Natriumdodecylsulfat reinst, salzfrei von 99 % verwendet.

Beispiel für die Herstellung von Natriumdodecylsulfat-Flachkapillargelen

ο Die Flachkapillargele 24 für die zweite Dimension nüssen so hergestellt werden, daß die Kapillargele der ersten Dimension in direktem Kontakt mit dem Sammelgel 5o, welches getrennt van Flachgel in einem gesonderten Arbeitsabschnitt hergestellt wird, aufgelegt werden können, ohne Luft oder Puffer einzuschließen.

Wurden die Proteine durch eine Pufferschicht elektrophoriert, wäre eine Verbreiterung der Banden durch horizontale Diffusion die Folge. Un Platz zum Auflegen der Kapillargele zu erhalten, werden die oberen Ränder 42 verbreitert, wie weiter oben bereits erläutert. Vorteilhaft ist für das Flachgel eine Größe von etwa 15 bis 5o χ 15 bis 5o mm, z. B. 24 χ 36 mm.

Bei Flachkapillargelen für zweidimensionale Auftrennung ist es auch möglich, das Sammelgel 5o ganz wegzulassen, also das gesamte Gel in nur einem Arbeitsgang aus Trenngel-Lösung zu gießen. In diesem Fall übernimmt der ver-

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dickte Rand 42 des Flachkapillargels 24 zusammen mit einem Tropfen Natriumdodecylsulfat-Probenpuffer 54 die Rolle des Sammelgels 5o. Die Ersparnis an Arbeitsund Zeitaufwand muß allerdings mit einem gewissen Verlust an Schärfe bei den Proteinflecken erkauft werden.

Gegenüber den zweischichtigen Gelen sollte der Acrylamidgehalt von 11 % auf 9 oder Io % verringert und die Dauer der Elektrophorese um Io Minuten verlängert werden.

Un eine gleichmäßige Polymerisation zu erzielen, werden die Gele in horizontaler Lage polymerisiert. Die Polymerisation findet zweckmäßig in einer "feuchten Kammer" (pneumatische Wanne) statt, in die nun zusätzlich ein Inertgas, wie Stickstoff, eingeleitet wird, um den Luftsauerstoff zu verdrängen. Hierdurch wird eine

15 gleichmäßige Polymerisation des Gels bei den angewendeten sehr

kleinen Abmessungen wesentlich begünstigt. Nach etwa 9o bis 12o Minuten ist die Polymerisation beendet und die Gele sind gebrauchsfertig.

Beispiel für eine Mikro-Gelelektrophorese in der zweiten Dimension

Das Flachkapillargel 24 wird zusammen mit den Glasplatten 45, 46 in die Vorrichtung 1 (Fig. 5 und 5) gestellt, dessen Flüssigkeitströge 2, 3 mit Natriumdodecylsulfat-Elektrodenpuffer gefüllt sind und an den eisgefüllten Kühlblock 33 angelegt. Das Flachkapillargel soll genau parallel zum oberen Flüssigkeitstrog stehen. Eine dünne Pufferschicht hält den Kapillarkörper 35 am Kühlblock 33 fest und dient als Wärmeleiter. Die Anschlüsse der Elektroden sind gegenüber der isoelektrischen Fokussierung anders herum gepolt.

Die'konkave Oberfläche des Sammelgels wird mit zwei Tropfen "blauem Probenpuffer" befeuchtet. Das Bromphenolblau zeigt während der Elektrophorese die Lauffront an. Der hohe Natriumdodecylsulfat-Gehalt des Probenpuf-

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fers begünstigt die Eluierung der Proteine aus dem tritonhaltigen Kapillargelstäbchen 44.

Ein frisch fokussiertes oder aufgetautes Kapillargelstäbchen 44, das wenige Minuten in Natriumdodecylsulfat-Elektrodenpuffer gewaschen wurde, wird auf das Sammelgel 5o aufgebracht.

Proben für die eindimensionale Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese werden in üblicher Weise durch Kochen mit Probenpuffer vorbereitet. Durch Zusatz von Saccharose wird die Dichte der Probe erhöht. Das Auftragen erfolgt analog zur Fokussierung, wie anhand der Fig. 1 bis 4 erläutert, der restliche Raum über der Probe wird mit Elektrodenpuffer gefüllt.

Die Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese wird unter ähnlichen elektrischen Bedingungen wie die Fokussierung durchgeführt. Mit konstantem Strom und einer sich ergebenden effektiven Spannung von 4o Volt beginnend, steigt die Spannung im Verlauf von etwa 15 Minuten auf loo Volt an. Das Speisegerät wird auf konstante Spannung von loo Volt umgeschaltet und die Elektrophorese bei sinkendem Strom fortgesetzt.

Beispiel für Fixierung und Färbung

Nach der Mikro-Gelelektrophorese werden die beiden Glasplatten 45, 46 getrennt und das Flachkapillargel wird zusammen mit der anhaftenden Glasplatte 15 bis 2o Minuten in Fixierlösung fixiert, voir Glas abgeschwemmt und mit Entfärber klargewaschen. Anschließend wird es 2o bis 3o Minuten in Färbelösung angefärbt und danach entfärbt« Eindimensionale Natriumdodecylsulfat-Kapillar- bzw. Flachkapillargele können ohne Fixierung sofort gefärbt werden.

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Gegenüberstellung

ο co·

σ σ> σ>

CaJ O ro>

	Konventionelle zwei- dimensionale Gelelek trophorese	Zweidimensionale Mi- kro-Gelelektrophore se mit Flachkapillar gelen	Faktor
Abmessungen der Gelplatten (Fläche)	13 χ 16 cm (-"2Oo cm²)	2,4 χ 3,2 cm (7,8 cm²)	25
Dicke der Gele	2 mm	o,25 mm	8
Volumen der Gele	4o cm	o,2 cm³	2oo
Volumen der Probensubstanzlösung	-^25,Ul	ο* ο, 25 /Ul	loo
Laufzeit für zwei Dimensionen	18-24 Stunden	3 Stunden	6
Bedarf an Ampholyten	^ 2 ml	r- lO /Ul	2oo
Nachweismenge pro Protein (Coomassie Blau)	«*lyug	2-5 ng	2oo-5oo
Aufwand an Färbe-, Entfärbelösung	ff5oo ml	«-Ίο ml	5o

Die Auswertung der Gele ist photographisch, photometrisch, autoradiographisch möglich.

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Claims

MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FÖRDERUNG DER WISSENSCHAFTEN e. V. Bunsenstraße lo, 34oo Göttingen Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung einer ein- und zweidimensionalen Mikro-Gelelektrophorese Patentansprüche

1. Verfahren zur Durchführung einer ein- und zweidimensionalen Mikro-Gelelektrophorese, insbesondere von Proteingemischen, bei dem zunächst in einem Kapillargel eine eindimensionale Mikro-Gelelektrophorese durchgeführt und danach das Kapillargel seiner Kapillare entnommen wird, dadurch gekennzeichnet , daß ein nach Durchführung der eindimensionalen Mikro-Gelelektrophorese erhaltenes Kapillargelstäbchen (44) längs einer Seitenkante (42) eines Flachkapillargels (24) an-

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geordnet und mit letzterem verbunden wird, wonach in dem Flachkapillargel (24) die zweite Dimension einer zweidimensionalen Mikro-Gelelektrophorese durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Kapillargelstäbchen (44) mittels eines Sammelgels (5o) mit dem Flachkapillargel

(24) verbunden wird, indem es direkt auf das Sammelgel (5o) aufgelegt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Kapillargelstäbchen (44) auf eine verdickt aus Trenngel ausgebildete Seitenkante (42)

15 des Flachkapillargels (24) aufgelegt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , daß das Kapillargelstäbchen

(44) mittels einer Pufferlösung (54) als Benetzungsverbindung mit dem Sammelgel (5o) oder der aus Trenngel ausgebildeten verdickten Seitenkante (42) des Flachkapillargels (24) verbunden wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch g e kennzeichnet, daß ein Kapillargelstäbchen C44) von gerundetem, vorzugsweise kreisförmigem oder elliptischem Querschnitt verwendet und die Auflagefläche (43) des Sammelgels (5o) oder der aus Trenngel ausgebildeten verdickten Seitenkante (42) des Flachkapillargels (24), auf die das Kapillargelstäbchen (44) aufgelegt wird, konkav ausgebildet wird.

6. Verfahren nach einem der ,Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß die eindimensionale Mikro-Gelelektrophorese in einem Flachkapillar-

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gel (24) durchgeführt wird, auf dessen eine Seitenkante mehrere Proben (19) in sich in Längsrichtung der Seitenkante erstreckenden Abständen aufgebracht werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sich quer, vorzugsweise senkrecht, zur Seitenkante des Flachkapillargels (24) erstreckende Taschen (31) in dem Flachkapillargel (24) vorgesehen und in diese einzelnen Taschen (31) jeweils die einzelnen Proben (19) eingegeben werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß die eindimensionale Mikro-Gelelektrophorese in einem stäbchenförmigen Kapillargel (18), insbesondere in einem solchen mit gerundetem, vorzugsweise kreisförmigem oder elliptischem Querschnitt durchgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Flachkapillargele (24) mit einer Dicke von weniger als 5oo ,um verwendet werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß Flachkapillargele (24) mit einer Dicke von 2oo bis 3oo ,um, vorzugsweise von 25o ,um, verwendet werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis lo, dadurch gekennzeichnet , daß die eindimen-

3o sionale Mikro-Gelelektrophorese mit isoelektrischer Fokussierung durchgeführt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadur.ch gekennzeichnet , daß die zweite Di-

35 mension oder zweidimensionale Mikro-Gelelektrophorese

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als Natriumdodecylsulfat-Elektrophorese durchgeführt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet , daß die eindimensionale Mikro-Gelelektrophorese und/oder die zweite Dimension der zweidimensionalen Mikro-Gelelektrophorese zunächst während einer vorbestimmten Zeitdauer mit konstantem Strom und anschließend während der restlichen

Io Zeitdauer mit konstanter Spannung durchgeführt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß die vorbestimmte Zeitdauer etwa

2o bis 3o % der Gesamtzeitdauer der Mikro-Gelelektro-15 phorese beträgt.

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikro-Gelelektrophorese mit einer Spannung von 3o bis 4o Volt begonnen und so lange mit konstantem Strom durchgeführt wird, bis die Spannung auf 9o bis loo Volt angestiegen ist, wonach sie mit konstanter Spannung weitergeführt wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, da-25 durch gekennzeichnet , daß in horizontaler Lage polymerisierte Flachkapillargele (24) verwendet werden.

17. Vorrichtung zur Durchführung einer ein- und zwei-3o dimensionalen Mikro-Gelelektrophorese nach einem der

Ansprüche 1 bis 16, gekennzeichnet durch einen ersten und zweiten langgestreckten, in seinem Inneren mit je einer Elektrode (4, 5) versehenen Flüssigkeitstrog (2, 3), die übereinander sowie parallel zueinander angeordnet sind, wobei der untere Flüssigkeits-

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trog (3) senkrecht zur Längsrichtung der Flussigkeitströge (2, 3) über die eine äußere Längsseite (12) des . oberen Flüssigkeitstroges (2) vorsteht, so daß sich ein im unteren Flüssigkeitstrog (3) senkrecht stehender flacher Kapillarkörper (35) an dieser einen äußeren Längsseite (12) des oberen Flüssigkeitstroges (2) vorbei erstrecken kann.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, gekennzeichnet durch eine Höhenversteileinrichtung (8 - 11) zum Verstellen des senkrechten Abstandes zwischen den beiden Flüssigkeitströgen (2, 3).

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch g e -

kennzeichnet, daß die Höhenverstelleinrichtung (8 - 11) ein unteres Halteteil (9), an dem der untere Flüssigkeitstrog (3) vorgesehen ist, ein oberes Halteteil (8), an dem der obere Flüssigkeitstrog (2) vorgesehen ist, eine senkrechte Säule (lo), an welcher das untere Halteteil (9) fest und das obere Halteteil (8) in Längsrichtung der Säule (lo) verschiebbar angebracht ist, sowie eine Feststellvorrichtung (11) zum Feststellen des oberen Halteteils (8) in seiner jeweiligen Höhe umfaßt.

20. Vorrichtung nach Anspruch 17, 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet , daß die Halteteile (8, 9) mit den Flüssigkeitströgen (2, 3) jeweils einstückig ausgebildete Platten sind.

21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 2o, dadurch gekennzeichnet , daß das untere Halteteil (9) als Ständer zum Aufstellen der Vorrichtung (1) auf einer ebenen waagerechten Fläche ausgebil-

35 det ist.

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22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, gekennzeichnet durch einen aus Metall, vorzugsweise Aluminium, bestehenden Kühlblock (33), der eine ebene Außenfläche (34) hat, die an einen im

5 unteren Flüssigkeitstrog (3) senkrecht stehenden flachen Kapillarkörper (35) anlegbar ist, und der mit einer Kühleinrichtung versehen ist.

23. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch g e -

Io kennzeichnet, daß die Kühleinrichtung ein Eisbehälter (36) ist, dessen eine Innenwand von einer der ebenen Außenflächen (34) des Kühlblocks (33) gegenüberliegenden Fläche (37) des letzteren gebildet ist.

24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet , daß die äußeren Bodenflächen (38, 39) des Eisbehälters (36) und des Kühlblocks (33) eben sind und in der gleichen Ebene liegen, wobei der Kühlblock (33) eine sich über seine gesamte Länge erstreckende untere Ausnehmung (4o) besitzt, deren Höhe etwas größer als die Höhe und deren Breite etwa gleich der Breite des unteren Flüssigkeitstroges (3) ist.

25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß der flache Kapillarkörper (35) aus zwei parallelen Glasplatten (25, 26; 45, 46) besteht, die durch an den gegenüberliegenden Seitenrändern zwischen ihnen vorgesehene Abstandsstreifen (25a, b, 26a, b; 45a, b, 46a, b) im Abstand voneinander gehalten sind.

26. Vorrichtung nach Anspruch. 25, dadurch gekennzeichnet , daß sich die Innenseiten der oberen Ränder (47, 48) der Glasplatten (45, 46) nach oben zu konisch auf wenigstens das Doppelte der Dicke des Flachkapillargels (24) erweitern.

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