DE2529606A1 - Isoelektrische fokusierung - Google Patents
Isoelektrische fokusierungInfo
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Description
FRANZ LEDER« 2. JUil 1975
RAN 4105/13
F. HofFmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues verbessertes Verfahren zur Trennung von Ampholyten und Vorrichtungen zur
Durchführung dieses Verfahrens.
Die Trennung und die Reinigung von komplexen Molekülen von biologischem Interesse war bisher der Gegenstand von einer
intensiven Forschung. Da viele dieser Moleküle Ampholyte sind, können sie durch Elektrophorese getrennt werden. Unterwirft
man eine Mischung von Ampholyten in. Lösung einer G-leichötroinspannung
ordnen sich die Ampholyten bei dieser Spannung gemäss ihren isoelektrischen Punkten, was eine Trennung zur
Folge hat.
In den letzten Jahren wurde ein verbessertes Verfahren zur Trennung von Ampholyten, nämlich die isoelektrische Fokussierung,
entwickelt. Each diesem Verfahren wird durch Verwendung
von synthetischen Verbindungen ("hiernach s.1s Trägerarnpholyton
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Hen/ll.6.1975
Hen/ll.6.1975
■bezeichnet) ein künstlicher pH-Gradient hergestellt.
Each Elektrophorese einer Ampholyten-Mischung in einem
derartigen pH-Gradient, welcher als Puffer wirkt, ordnen sich die Ampholyten in diesem Gradient. Genauer gesagt
wandert jeder Ampholyt zu dem pH-Wert in dem Gradient, wo er iaoelektrisch ist, d.h. seine Nettoladung 0 ist.
Die Fokussierung findet an dem Punkt statt, an welchem der pH-Wert mit dem isoelektrischen Punkt des Ampholyten
übereinstimmt .
Detaillierte Angaben über die Theorie und die Methoden der isoelektrischen Fokussierung sind in Haglund,
Methods of Biochemical Analysis, Vol. 19, Seite 1 und Annals of the Hew Xork Academy of Sciences, vol. 209, "Isoelectric
Focusing and Isotachophoresis" vorhanden.
Tor kurzem sind durch Valmet in der XJS Patentschrift No. 3; 616 456 und in Science Tools Vol. 16, Seite 1 (1969)
eine Anzahl von Vorrichtungen für die isoelektrische Fokussierung beschrieben worden. Diese Vorrichtungen besitzen
eine Anzahl, von nacheinander angeordneten Kammern, in der Regel eine "U-Röhre" oder eine "V-Röhre". Der Vorteil eines derartigen
Systems liegt darin, dass im Falle einer Kontaminierung in einer Kammer (z.B. durch einen festen Niederschlag), diese
Kontaminierong sich nicht auf das ganze System überträgt.
Diese Vorrichtungen funktionnieren mit relativ niedrigen Spannungen von ungefähr 800 bis 2400 Volt und einer aufgenommenen
Leistung von ungefähr 15 bis 20 Watt für eine 45 ml-Einheit. Unter diesen Bedingungen !bleiben die Auflösung,
die Leistungsfähigkeit und insbesondere die Schnelligkeit der elektrophorctischen Trennung beschränkt, da die Schnelligkeit
direkt proportional zur Spannung ist. Andererseits ist die Auflösung proportional zur Quadratwurzel der Spannung. Der
Zeitfaktor wird kritisch wenn empfindliche Ampholyte getrennt
werden»
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Es besteht somit ein echtes Bedürfnis Methoden und Vorrichtungen zur Verfügung zu haben, welche,mit hoher
Auflösung, grosser Schnelligkeit und einer guten Reproduzierbarkeit, eine präparative Trennung von Ampholyten ermöglichen.
Diese Erfordernisse werden durch die vorliegende Erfindung,welche eine verbesserte Methode zur isoelektrischen
Fokussierung in pH-G-radienten betrifft, erfüllt. Diese Methode
macht es möglich in grösserem Umfang und mit hoher Auflösung eine schnelle Trennung von Ampholyten zu erreichen. Die vorliegenden
Erfindung betrifft weiterhin eine Anzahl von Vorrichtungen, welche sich zur Durchführung dieser verbesserten Methode
eignen.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur isoelektrischen Fokussierung
in einer mehrere Kammern enthaltenden Vorrichtung, wobei ein Gleichstrom durch eine AmphoIyt-Lösung,bestehend
aus einer Probeampholyt-Mischung,einer einen künstlichen pH-Gradient
erzeugenden Trägerampholyt-Mischung und Wasser,geleitet wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokussierung
mit einer Leistungsaufnahme von mindestens 3 Watt pro Milliliter Ampholyt-Lösung erfolgt und die resultierende
Temperaturerhöhung dieser Ampholyt-Lösung im Durchschnitt 7°C nicht übersteigt.
Veiter betrifft die vorliegende Erfindung ein verbessertes
Verfahren zur isoelektrischen Fokussierung in einer mehrere Kammern enthaltenden Vorrichtung,wobei ein
Gleichstrom durch eine·Ampholyt-Lösung,bestehend aus einer
Probeampholyt-Mischung, einer einen künstlichen pH-Gradient erzeugenden Trägerampholyt-Mischung und Wasser, geleitet
wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Ampholyt-Mischung,
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oder gewünschte Teile davon, ohne wesentliche Verdünnung der isoelektrischen Fokussierung in einer Reihe von mehrere
Kammern enthaltenden Vorrichtungen von immer kleineren Volumen, unterworfen wird.
Veiter "betrifft die vorliegende Erfindung eine verbesserte
Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung enthaltend einen rechteckigen, kastenförmigen Behälter (1)
zur Aufnahme der zu trennenden Ampholyt-Lösung, wobei
-dieser Behälter einen Boden (2), zwei sich gegenüberstehende Stirnwände (3) und (4) und zwei sich
gegenüberstehende Vorder- und Hinterwände (5) und (6) besitzt;
zwei Elektroden (7) und (8),welche mit einer Gleichstromquelle
in Verbindung stehen,in der Fähe der sich gegenüberstehenden Stirnwände in diesen Be-';
halter hineinragen;
der Behälter mit einer Anzahl von undurchlässigen Wänden (9) und (10) versehen ist, welche parallel
zu den Stirnwänden laufen;
die Fände (9) sich bis zum Boden des Behälters erstrecken während die Wände (10) sich bis in die Nähe
des Bodens des Behälters erstrecken, wodurch erreicht wird, dass der Behälter in eine Anzahl von kontinuierlich
in Verbindung stehenden U-förmigen Kammern unterteilt ist,
dadurch gekennzeichnet, dass
a) die Distanz X zwischen den Wänden einer U-förmigen Kammer, zwischen ungefähr 1 mm und 3 mn. liegt;
b) das Verhältnis der Länge T von jedem Schenkel einer
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U-förmigen Kammer zur Distanz X zwischen den Wänden
dieser Kammer über 50 zu 1 liegt;
c) das Verhältnis der Länge Y von jedem Schenkel einer U-förmigen Kammer zur absoluten Länge der gesamten
Strombahn zwischen den Elektroden unterhalb 1 zu 15 liegt;
d) die undurchlässigen Wände mit einer Kühlungseinrichtung
in Verbindung stehen, damit die Ampholyt-Lösung in der Fähe dieser undurchlässigen Wände gekühlt
wird j
e) alle Flächendes Behälters, welche "bei Gebrauch mit
der Ampholyt-Lösung in Berührung kommen, gegen Starkstrom isoliert sind;
f) alle innere Anschlussteilen des Behälters,welche bei
Gebrauch mit der Ampholyt-Lösung in Berührung kommen, durch Verwendung von wasser- und starkstromresistenten
Dichtungen lecksicher abgedichtet sind.
Dj.e erfindungsgemassen Verfahren und Vorrichtungen erlauben eine Trennung der Ampholyte bis zur Grenze
dessen was mit den im Handel erhältlichen Träger-Ampholyten
theoretisch möglich ist. Im Vergleich zu den bekannten Vorrichtungen führt die erfindungsgemässe Vorrichtung zu einer ungefähr
10-fachen Erhöhung der Intensität des elektrischen Feldes pro Wegstreckeeinheit; einer 30-fachen Erhöhung der insgesamt
angelegten elektrischen Spannung; einer 3~fachen Erhöhung der
Leistungsfähigkeit; einer 6-fachen Erhöhung des Leistungsverbrauchs pro Volumeneinheit und mehr als einer 300-fachen
Erhöhung des totalen Leistungsverbrauchs; einer 8-fachen Erhöhung der Schnelligkeit; und einer 500-fachen Erhöhung
der trennbaren Menge an Ampholyt. Folglich, kann die erfindungsgemässe Vorrichtung mit Spannungen von bis
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zu 100 Kilovolt arbeiten und bei hoher Leistung 6000 Watt oder mehr verbrauchen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur isοelektrischen Fokussierung von Ampholyten,
wobei die Fokussierung unter Bedingungen erfolgt, welche es ermöglichen im Verhältnis zum Volumen der Ampholyt-Lösung
eine hohe aufgenommene Leistung zu haben, wobei die Temperatur der Lösung relativ konstant bleibt.
In den bereits bekannten Vorrichtungen, wie z.B. in den anfangs erwähnten durch Valmet entwickelten Vorrichtungen,
beobachtet man eine bedeutende Erhöhung der Temperatur der Lösung, selbst wenn die Leistungsaufnahme im Verhältnis zum
Volumen der Ampholyt-Lösung relativ klein ist. So wurde
z.B. in einer bestimmten Ausführungsform,bei einer Leistungsaufnahme
von einem halben Watt pro Milliliter an Lösung,eine durchschnittliche Erhöhung der Temperatur der Lösung von 70C
beobachtete—
Das erfindungsgemässe Verfahren und die entsprechende
Vorrichtung erlauben eine erheblich höhere Leistungsaufnahme von mindestens 3 Watt pro Milliliter an Lösung, mit einer durchschnittlichen
Erhöhung der Temperatur der Lösung von 70C.
Wie bereits erwähnt, ist es wichtig, dass die Temperatur der Ampholytlösung relativ konstant bleibt. Viele der
biologisch wichtigen Ampholyte sind Proteine und können sehr leicht durch Hitze denaturiert werden. In der Regel wird
bei diesen Substanzen die isoelektrische Fokussierung bei niedrigen Temperaturen, wie z.B. zwischen O0C und 50C durchgeführt.
Auf diese Weise wird das Auftreten einer Denaturierung oder anderer nachteilhafter Auswirkungen vermieden.
Eine bedeutende Erhöhung der Temperatur oberhalb dieser Grenze kann in vielen Fällen eine Zerstörung der wertvollen
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biologischen Aktivität oder Spezifität der zu reinigenden Molekülen zur Folge haben.
In den bisher bekannten Vorrichtungen, wie z.B. in denjenigen,welche durch Valmet entwickelt wurden, hat man
versucht,die Temperaturerhöhung auf Kosten der Leistungsaufnahme auf ein Minimum zu halten.
Es ist bekannt (siehe z.B. Swensson, Acta. Chemica Scandinavica, 1£, 425 (1961)),dass das Auflösungsvermögen
eines isoelektrischen Fokussierungssystems direkt proportional
zur Quadratwurzel der angelegten Spannung ist.
Während das Auflösungsvermögen technisch nicht vom Strom abhängt, ist die für die Auflösung notwendige Zeit,
d.h. die Zeit nach welcher praktisch ein Aequilibrium erreicht wird, eine Punktion der Leistungsaufnahme d.h.
des Wattverbrauchs. Bei Verwendung einer Vorrichtung mit einem geringen Wattverbrauch wird für die isoelektrische
Fokussierung eine lange Zeit (etwa 2 Wochen) gebraucht. Wegen der Instabilität von vielen Ampholyten ist eine
Durchführung der Fokussierung während einer langen Zeit unerwünscht. Dies hauptsächlich wenn, die Temperatur
nicht relativ niedrig gehalten wird.
Das erfindungsgeiuässe Verfahren, welches einen hohen
Wattverbrauch ohne bedeutende Erhöhung der Temperatur der lösung erlaubt, macht es möglich,in einer Vorrichtung von
vergleichbarem Volumen in viel kürzerer Zeit (ungefähr 1,5 Stunden) eine isοelektrische Fokussierung mit sogar
höherer Auflösung durchzuführen.
Wie bereits erwähnt kann gemäss vorliegender Erfindung
eine verbesserte isoelektrische Fokussierung dadurch erreicht werden, dass die isoelektrische Fokussierung ohne
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wesentliche Verdünnung der Ampholyt-Lösung in einer Reihe
von Vorrichtungen von immer kleineren Volumen erfolgt.
In den "bereits bekannten Vorrichtungen, wie z.B. derjenigejvwelche durch Valmet entwickelt wurde, war die
Anzahl der lammern in einer bestimmten isοelektrischen
lOkussierungseinheit für die Auflösung ausschlaggebend. In der Folge hat man das Auflösungsvermögen als das Verhältnis
der Anzahl von pH-Einheiten in dem pH-Gradient zur Hälfte der Anzahl Kammern pro Einheit, definiert. Bei
einem pH-Gradient von 7 pH-Einheiten mit 30 Kammern pro
Einheit beträgt das Auflösungsvermögen 0,47 pH-Einheiten. Um eine Auflösung von 0,01 pH-Einheiten mit dem gleichen
pH-Gradient (7 Einheiten) zu erreichen,benötigt man eine Einheit mit mehr als 1000 Kammern.
Erfindungsgemäss können Auflösungen von 0,01 pH-Einheiten
(theoretische Grenze der Auflösung, welche mit den handelsüblichen Träger-Ampholyten erreichbar ist) erreicht
werden, indem man bei Verwendung eines pH-Gradienten von 7 pH-Einheiten, drei immer kleiner werdende Einheiten mit je
10 Kammern d.h. insgesamt 30 Kammern, gebraucht. Ein
Kernelement der erfindungsgemässen Methode ist die Verwendung von einer Reihe immer kleiner werdenden Vorrichtungen ohne
wesentliche Verdünnung der Ampholyt-Lösung.
In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt jede Reihe von Vorrichtungen die ■ gleiche Anzahl an Kammern und
entspricht das Verhältnis des Volumens jeder Einheit zu dem Volumen der folgenden kleineren Einheit der Anzahl Kammern
in jeder Einheit,
In einer beispielhaften Ausführungsform können drei
Einheiten mit je 10 Kammern und Volumen von je 2100 ml, 215 ml und 25 ml verwendet werden. Die rohe Ampholyt-Mischung
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wird in eine 2100 ml-Vorrichtung mit einem Trager-.Amph.olyt,
welcher einen künstlichen pH-Gradienten von pH 3 his pH
(7 pH-Einheiten) erzeugt,eingesetzt und der isoelektrischen
Fokussierung unterworfen. Die Kammer (210 ml),welche die gewünschte Substanz enthält,wird bestimmt und ihr Inhalt
in die nächste kleinere Vorrichtung (215 ml) überführt.
IM eine quantitative Ueberführung zu erreichen, wird
nur eine minimale Verdünnung benötigt. Der pH-Gradient in dieser Vorrichtung beträgt ungefähr 0,7 pH-Einheiten.
Die isoelektrische Fokussierung wird wiederholt und die
Kammer (ungefähr 22 ml), welche die gewünschte Substanz (pH-Gradient ungefähr 0,07 pH-Einheiten) enthält, wird
bestimmt. Each Ueberführung in die nächste kleinere Vorrichtung (25 ml) wird die Fokussierung wiederholt. Nach der Fokussierung
wird die Kammer (ungefähr 2,5 ml), welche die gewünschte Substanz enthält,bestimmt,und diese Substanz,
welche nun in einem pH-Gradient von ungefähr 0,01 pH-Einheiten enthalten ist, auf konventionelle Art isoliert.
Da gemäss vorliegender Erfindung Vorrichtungen verwendet
werden, die eine grössere Leistungsaufnahme ermöglichen,
kann die isoelektrische Fokussierung in jedem Schritt in einer relativ kurzen Zeit durchgeführt werden. Ferner kann bei
Verwendung von insgesamt 30 Kammern, das gleiche Ergebnis
erreicht werden, wie dasjenige, welches bisher nur bei Verwendung einer Vorrichtung mit wenigstens 1000 Kammern
theoretisch möglich war.
Es können auch grössere Vorrichtungen mit Volumen von ungefähr 20 1 verwendet werden, um eine grobe Trennung
von grossen Mengen an Substanzen zu erreichen. Diese Substanzen werden dann in immer kleiner werdenden Einheiten - wie
bereits beschrieben - gereinigt.
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FerBer zeigt das erfindungsgemässe Verfahren einen
weiteren wesentlichen Vorteil gegenüber einem Verfahren in welchem der Inhalt einer Kammer nach isoelektrischen
Fokussierung verdünnt und in einer gleichgrossen Vorrichtung
nochmals fokussiert wird. Die Verdünnung der Ampholyt-Lösung
ergibt nämlich eine Reduzierung der Pufferungskapazität
der Träger-impholyte und das Auflösungsvermögen ist in
der Folge kleiner.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur verbesserten isoelektrischen Fokussierung mit hoher Leistungsaufnahme
bei ungefäJhr gleichbleibender Temperatur der Ampholyt-Losung
wird in ei&er neuen Reihe von Vorrichtungen zur isoelektrischen Fokussierung durchgeführt. Ein Kernelement dieser
Vorrichtungen ist ein verbessertes Kühlsystem, das eine leistungsfähige Abkühlung der durch die grosse Leistungsaufnahme erzeugten Hitze bewirkt.
': Diese leistungsfähige Kühlung wird durch
eine sorgfältige Auswahl der Materialien, eine sorgfältige Verteilung der Kühlelemente, die Auswahl einer zum Erreichen
einer StaMlität unter hohen Spannungen geeigneten Struktur,
eine einfache und billige Konstruktion und eingebaute Siciierheitselemente
erreicht»
Die verbesserten Elektrophorese-Vorrichtungen zur isoelektrisehen,Fokussierung enthalten einen rechteckigen,
kastenförmigen Behälter (1) zur Aufnahme der zu trennenden Ampholyt-LSsung, wobei
dieser Behälter einen Boden (2), zwei sich gegenüberstehende Stirnwände (3) und (4) und zwei sich
gegenüberstehende Vorder- und Hinterwände (5) und (6) besitzt}
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zwei Elektroden (7) und (8), welche mit einer Gleichstromquelle in Verbindung stehen, in der Nähe der sich
gegenüberstehenden Stirnwände in diesen Behälter hineinragen;
der Behälter mit einer Anzahl von undurchlässigen Wänden (9) und (10) versehen ist, welche parallel
zu den Stirnwänden laufen;
die Wände (9) sich bis zum Boden des Behälters erstrecken während die Wände (10) sich bis in die Mähe
des Bodens des Behälters erstrecken, wodurch erreicht wird, dass der Behälter in eine Anzahl von kontinuierlich
in Verbindung stehenden U-förmigen Kammern unterteilt ist.
Die erfindungsgemässenVorrichtungen enthalten nun die
folgenden Verbesserungen:
a) um eine minimale absolute Dicke des Wasserfilms in
den Schenkeln der U-förmigen Kammern zu erreichen, wird die Distanz zwischen den Wänden der U-förmigen
Kammern so gewählt, dass sie zwischen 1 mm und 3 non
liegt. Für Vorrichtungen mit einem Volumen bis zu 200 ml liegt sie bei ungefähr 1 mm, für Vorrichtungen
mit einem Volumen bis zu 2000 ml bei ungefähr 1,5 mm und für Vorrichtungen mit einem Volumen bis
zu 20 1 bei ungefähr 3 *nm;
b) das Verhältnis der Länge von jedem Schenkel einer U-förmigen Kammer zur Distanz zwischen den nebeneinander liegenden
Wänden dieser Kammer liegt über 50 zu 1 und vorzugsweise über 100 zu 1; dieses Verhältnis kann
sogar noch erhöht werden, wenn die Distanz zwischen den Wänden die unter (a) angegebenen Werte überschreitet;
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c) das Verhältnis der Länge von jedem Schenkel einer U-förmigen Kammer zur absoluten länge der gesamten
Strombahn zwischen, den Elektroden liegt unterhalb 1 zu 15»
d) durch Verwendung einer Elektrode in Form einer Metallfolie oder eines Drahtgitters mit einer zehnfach grösseren
Fläche als die Fläche, welche durch die Distanz zwischen zwei nebeneinander liegenden Wänden und die
Breite oder Tiefe der Kammer definiert ist,wird ein elektrisches Feld erzeugt, welches über die ganze Länge der
Elektrode symetrisch angeordnet ist;
e) die undurchlässigen Wände, stehen mit einer Kühlungseinrichtung in Verbindung, damit die Ampholyt-Lösung
in der Fähe dieser undurchlässigen Wände einer sehr leistungsfähigen Kühlung unterworfen wird;
f) die gesamte Fläche des Behälters, welche bei Gebrauch mit
der Ampholyt-Lösung in Berührung kommt ist gegen Starkstrom isoliert;
g) alle inneren Anschlussstellen des Behälters, welche bei Gebrauch mit der Ampholyt-Lösung in Berührung kommen,
sind durch Verwendung von wasser- und starkstromresistenten
Dichtungen lecksicher abgedichtet.
Eine der grössten Schwierigkeiten, welche bei der isoelektrischen Fokussierung - hauptsächlich wenn hohe
Spannungen verwendet werden - auftauchen, ensteht durch das
Auftreten einer elektro-osmotischen Strömung. Diese starke
Wasserströmung von einer Elektrode zur anderen, verdrängt die getrennten Ämpholyten von ihren richtigen isoelektrischen
Punkten. Wenn der Ampliolyt eine relativ geringe Ladungsdichte besitzt,kann die Verlagerung bis zur Stelle, an welcher die Ladung
des Ampholyte eine elektrostatische Kraft ergibt, welche die Kraft der osmotischen Strömung ausgleicht, ziemlich gross sein.
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Weiter erfolgt die osmotische Strömung hauptsächlich im
Zentrum des Kanals und nimmt in Richtung der Wänden sehr stark ab. Dies hat zur Folge, dass der Konzentrationsgradient
eine kugelförmige Form besitzt und sich nicht - wie für eine maximale Auflösung erwünscht - senkrecht zur Längsachse
erstreckt. Die oben erwähnten Faktoren reduzieren ganz offensichtlich die Fähigkeit der bekannten Vorrichtungen
zur iso-elektrischen Fokussierung, effektiv für analytische oder präparative Zwecke verwendet zu werden.
Es wurde nun gefunden, dass die Effekte der elektroosmotischen
Strömung auf ein Minimum reduziert und iso~ elektrische Fokussierungsvorrichtungen gebaut werden können,
welche in Bezug auf Zeit, Leistung, Auflösung und Genauigkeit in der Nähe des theoretisch Möglichen arbeiten. Eine
derartige Reduzierung der Effekte der elektro-osmotisehen
Strömung wird erreicht,indem man bei der Konstruktion der Vorrichtungen mehreren kritischen dimensionalen Parametern
Rechnung trägt.
Die erste kritische Bedingung,welche in der erfindungsgemässen
Vorrichtung erfüllt sein muss, ist,dass der Wasserfilm in den Schenkeln der U-förmigen Kammern eine minimale Dicke
aufweist. Dies wird erreicht indem eine geeignete kritische Distanz zwischen den Wänden ausgewählt wird. Diese Distanz ist
von ungefähr 1 mm für eine Vorrichtung mit einem Volumen bis zu 200 ml, von ungefähr 1,5 mm für eine Vorrichtung mit einem
Volumen bis zu. 2000 ml und von ungefähr 3 mm für eine Vorrichtung
mit einem Volumen bis zu 20 1.
Das zweite kritische Mer/kmal ist das Verhältnis der
Länge von einem Schenkel einer U—förmigen Kammer zur Dicke des
Wasserfilms. Dieses Verhältnis muss grosser sein als 50 zu
und vorzugsweise grosser als 100 zu 1. Wenn die Dicke des Wasserfilms die oben erwähnten Werte überschreitet, muss dieses
Verhältnis erhöht werden. Es bestehen offensichtlich nicht viele
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-.14 -
Möglichkeiten diese Einstellung in der Praxis durchzuführen da die Länge der Schenkel "bei jeder Erhöhung der Dicke des Wasserfilms
logarithmisch'vergrössert werden muss.
Ein weiterer kritischer dimensionaler Parameter, welcher zu 'berücksichtigen ist, ist das Verhältnis der
länge eines Schenkels einer U-förmigen Kammer zur absoluten
Länge der gesamten Strombahn zwischen den Elektroden. Dieses Verhältnis muss kleiner sein als 1 zu 15. Auf diese Weise kann
der Effekt 'der elektro-osmotischen Strömung, welche dem
Ampholyt Konzentrationsgradient eine Kugelform gibt, vermieden werden. Als Folge wird die Auflösung der Vorrichtung
erhöht» Weil die Wahrscheinlichkeit, dass ein getrennter Ampholyt sich in mehr als in einer Kammer befindet,kleiner
wird.
Die Gestaltung der Elektrode ist ebenfalls ein wichtiges Merkmal, insbesondere wenn hohe Spannungen verwendet werden.
Um ein elektrisches Feld zu erhalten, welches über die ganze Länge der Elektrode synaetrisch angeordnet ist, muss
eine Elektrode verwendet werden, deren Fläche mindestens zehnfach grosser ist als die Fläche,welche durch die Distanz
zwischen zwei nebeneinander liegenden Wänden und die Breite oder Tiefe der Kammer definiert ist, d.h. die Querschnittsfläche des WasBerfilms in einem Schenkel der U~förmigen Kammer.
Dies wird vorzugsweise durch eine Elektrode in Form einer Metallfolie Oder eines Drahtgitters, beispielsweise durch eine
Platinfolie oder ein Platingitter, erreicht.
Wenn alle den oben erwähnten Mer/kmalen bei der
Konstruktion einer iso-elektrischen Vorrichtung Rechnung getragen wird funktional ort diese Vorrichtung praktisch
unter den theoretischen Bedingungen. Die gewünschten Ampholyte werden auf schnelle und leistungsfähige Weise
getrennt, sie sammeln sich an oder in der Fähe ihrer isoelektrischen
Punkte die Diferenz 7/wi sehen 7,wei Spitzen f
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welche getrennten Ampholyten entsprechen,ist maximal,und
das Verhältnis der Fläche einer Spitze zu ihrer Höhe ist ebenfalls maximal.
Eine weitere Verbesserung der Leistungsfähigkeit der erfindungsgemässen Vorrichtungen kann erreicht werden, indem
man die Absorption von Kohlenstoffdioxyd während der Trennung verhindert. Zu diesem Zweck kann die gesamte Vorrichtung in
einen leck-dichten Behälter eingeschlossen werden, damit der Kontakt mit der Luft verhindert wird. Weiter kann die Vorrichtung
mit einer Kohlenstoffdioxyd freien Luft versehen werden, indem man in diese Vorrichtung einen Luftstrom einbläst, welcher
- Ά.Β. nach Durchleiten durch eine Aetzlauge - von Kohlenstoffdioxyd
befreit wurde.
Eine Eliminierung der Absorption des Kohlenstoffdioxyds während de* Verfahrens zur iso-elektrischen Fokussierung dient
dazu,eine Verschiebung des pH-Gradienten zu vermeiden.
Ein weitere Verbesserung in den erfindungsgemässen Vorrichtungen wird durch eine Kühlungseinrichtung, welche mit den
undurchlässigen Wänden in Verbindung steht erbracht. Auf diese Weise wird die Ampholyt-Lösung in der Nähe dieser Wände einer
leistungsfähigen Kühlung unterworfen. In einer bevorzugten Ausfiihrungsforin
umfasst die Kühlungseinrichtung das Durchfliessen eines Kühlmediums durch Kanäle, welche in den undurchlässigen
Wänden angebracht sind und sich von der Vorderwand bis zur Hinterwand der Vorrichtung erstrecken.
Eine leistungsfähige Kühlung hängt im wesentH ichen
von den drei nachstehenden Faktoren ab. Der erste Faktor ist die Bildung einer Turbulenz an der Grenzfläche zwischen
dem Kühlmedium und den undurchlässigen Wänden. Der zweite Faktor ist der Wärmedurchgang (Induktion) durch die undurchlässigen
Wände. Der dritte Faktor ist die Konvektion, welche -
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wegen einer nicht vollständig regelmässigen Temperatur _ in der
Ampholyt-Lösung entsteht.
Die Turbulenz an der Grenzfläche erfolgt durch den Schereffekt des Kühlmediums an den inneren Wandoberflächen
der undurchlässigen Wand. Dieser Schereffekt wird dadurch verursacht, dass das Eühltnedium mit grosser Geschwindigkeit
einen engen,im Inneren der undurchlässigen Wand sich "befindlichen
Kanal durchfliesst. Damit die Turbulenz stattfindet, sollte
die durchschnittliche Geschwindigkeit des Kühlmediums mindestens 30 cm pro Sekunde betragen und der Durchschnitt
des Kanals zwischen 1 mm und 3 mm liegen.
Paktoren,welche die Konduktions- und die Konvektions-Effekte
beeinflussen,sind die Dicke der undurchlässigen Wände zwischen dem Kühlmedium und der Ampholyt-Lösung,
sowie die Distanz zwischen zwei nebeneinander liegenden undurchlässigen Wänden. Damit die gewünschten Effekte
stattfinden, sollte die Dicke der undurchlässigen Wand zwischen dem Kühlmedium und der Ampholyt-Lösung nicht grosser als
3 mm sein. Diese Dicke liegt vorzugsweise zwischen 0,8 und 2,5 mm. Die Distanz zwischen den undurchlässigen Wänden wird
in Abhängig zur Grosse des Behälters in einer Weise vorbestimmt,
welche es ermöglicht,durch Beschaffung einer grossen Kontaktfläche
mit der Ampholyt-Lösung maximale Konvektions- und Konduktionseffekte zu erreichen.
Andere Faktoren, welche einen mehr generellen Einfluss auf die Leistungsfähigkeit der Kühlung der Ampholyt-Lösung
haben, sind die Art des Kühlmediums, die Temperatur des Kühlmediums, die Wärmeleitfähigkeit der undurchlässigen
Wände , der Ampholyt-Lösung und des Kühlmediums, die Viskosität des Kühlmediums und der Ampholyt-Lösung usw.
In der Regel werdsndie Temperatur des Kühlmediums sowie andere Parameter wie z.B. der Durchfluss kontrolliert, damit
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die Wärmeabfuhr in Abhängigkeit der Art und der Stabilität der zu trennenden Ampholyte/ optimiert wird. Die Temperatur kann
zwischen -600C und +500C liegen, wobei jedoch für die meisten
denaturierbaren Ampholyte eine Temperatur zwischen -100C
und +100C bevorzugt wird.
Es können viele übliche Kühlmedia verwendet werden. Einige dieser Kühlmedia sind Kühlflüssigkeiten wie Wasser oder
Mischungen von Wasser mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln,welche eine Erniedrigung des Gefrierpunktes unter
den normalen Gefrierpunkt von Wasser ergeben.Für diesen Zweck geeignete organische Lösungsmittel sind Aethylenglycol, Isopropanol
und dergleichen. Weiter können als Kühlmedia fluorierte Kohlenwasserstoffe oder gekühlte Gase wie Luft
usw., verwendet werden.
Das Kühlmedium wird vorzugsweise mittels einer Pumpe durch die Kanäle in den undurchlässigen Wänden gefördert.
Diese Pumpe wird so eingestellt, dass die oben erwähnte erwünschte Geschwindigkeit erreicht wird. In einer bevorzugten
Ausführungsform wird das Kühlmedium auf geeignete Weise in eine Kammer oder einen Vorratsraum, entweder an der
Vorderwand oder an der Hinterwand in die Vorrichtung eingeleitet, durch eine Anzahl von undurchlässigen Wänden geführt
und ansschliessend über einen weiteren Vorratsraum aus der Vorrichtung entfernt. Mit Vorteil wird ein geschlossenes
Kühlsystem verwendet, wobei das verbrauchte aus der Vorrichtung entfernte Kühlmedium durch externe Wärmeaustauscheinrichtungen
geführt wird, um die Temperatur des Kühlmediums vor einer neuen Einführung in die isoelektrische
Fokussierungsvorriehtung wieder herabzusetzen.
Verschiedene Ausführungsformen und weitere Einzelheiten der vorliegenden Erfindung werden in der folgenden
Beschreibung unter Berücksichtigung der beiliegenden
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Figuren näher erläutert:
Figur 1: zeigt sehematisch eine erste Ausführungsform, der
erfindungsgemässen Vorrichtung im Schnitt;
Figur 2: ist eine Aufsicht der durch Figur 1 veranschaulichten Vorrichtung entlang der Linie II-II,wobei die
Deckplatte entfernt ist;
Figur 3: zeigt schematisch eine zweite Ausführungsform der
erfindungsgemässen Vorrichtung im Schnitt.
Die erfindungsgemässe isoelektrische Fokussierungsvorrichtung,
welche durch die Figuren 1, 2 und 3 veranschaulicht wird, besteht aus einen im wesentlichen rechteckigen,
kastenförmigen Behälter (1) zur Aufnahme der zu trennenden Ampholyt-Mischung. Dieser Behälter besitzt einen
Boden (2), zwei sich gegenüberstehende Stirnwände (3) und (4) und zwei sich gegenüberstehende Vorder- und Hinterwände (5)
und (6). In der Nähe der sich gegenüberstehenden Stirnwände ragen zwei Elektroden (7) und (8), welche mit einer Gleichstromquelle
in Verbindung stehen,in diesen Behälter hinein. Die Elektroden sind Metallfolien oder Drahtgitter, vorzugsweise
aus Platin, deren Fläche mehr als zehnmal grosser ist als die Durchschnittsfläche des Wasserfilms (x . z). Besonders
bevorzugte Elektroden sind an Glasträger befestigte Platinfolien. Die Vorrichtung ist mit einer Anzahl, von undurchlässigen
Wänden (9) und (10) versehen. Diese undurchlässigen Wände laufen parallel zu den Stirnwänden und sind so angeordnet,
dass die Wände (9) sich bis zum Boden des Behälters erstrecken-, während die Wände (10) sich nur bis in die Nähe des Bodens
erstrecken und vorzugsweise ungefähr 1 bis 10 mm davon entfernt sind. Durch diese Anordnung der undurchlässigen
Wände , wird erreicht, dass der Behälter in eine Anzahl von kontinuierlich in Verbindung stehenden TJ-förmigen Kammern
unterteilt ist.
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Die Anzahl von U-f örmigen Kammern in einer Vorrichtung
kann zwischen 3 und mehr als 100 liegen. Eine Vorrichtung enthält jedoch mit Vorteil ungefähr 10 U-förmige lammern.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform sind die undurchlässigen
Wände im wesentlichen hohl und enthalten einen Kanal zum Durchfluss eines Kühlmediums. In der Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, welche durch die Figuren 1 und 2 illustriert wird, sind die undurchlässigenWände im wesentlichen
rechteckig gestaltet und enthalten einen rechteckigen Kanal zum Durchfluss eines Kühlmediums. In
der AusfUhrungsform, welche durch die Figur 3 veranschaulicht
wird,bestehen die undurchlässigen Wände (9) aus einer Serie von senkrecht angrenzenden Röhren zum Durchfluss eines
Kühlmediums. In einer weiteren Ausführungsform bestehen alle undurchlässigenWände (9) und (10) aus diesen senkrecht
sich berührenden Röhren.
In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt die erfindungsgemässe Vorrichtung zusätzliche Kühlelemente
(11), welche über den Wänden (9) angeordnet sind, um bei Gebrauch mit der Oberfläche (12) der Ampholyt-Lösung in
Kontakt zu sein. Auf diese Weise erreicht man eine leistungsfähige Kühlung der Ampholyt-Lösung an ihrer Oberfläche, das
heisst an einer Stelle,an der die anderen .Kühlmittel eine minimale
Kühlung ergeben. Die Kühlelemente (11) bestehen in der Regel aus dem gleichen Material wie die undurchlässige«Wände
(9) und (10). Die Form dieser Elemente ist nicht kritisch, obwohl ein ringförmiges Rohr bevorzugt wird.
Die kritischendimensionalenParameter sind in Figur 1
angegeben. So werden die Distanz zwischen zwei nebeneinander liegenden Wänden als X, die Länge eines Sehenkels der
U-förmigen Kammer als Y und die Breite oder Tiefe eines Schenkels der ü-förmigen Kammer als Z bezeichnet.
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Wie durch. Figur 2 veranschaulicht, wird ein Kühlmedium
über ein Torratsraum (13) in die Vorrichtung eingeleitet. Dieses Kühlmedium fliesst dann durch eine
Anzahl von undurchlässigen Wänden (9) und (10) und falls erwünscht, durch die zusätzliche Kühlungselemente (11).
Schliesslich verlässt dieses Kühlmedium die Vorrichtung über einen Vorratsraum (14)· Die Vorrichtung enthält
weiterhin Elemente (15) und (16), welche mit den Vorratsräumen (13) und (14) in Verbindung stehen und
zum Ein- und Ableiten des Kühlmediums dienen. Wie bereits erwähnt können verschiedene flüssige oder gasförmige
Kühlmedia verwendet werden. Flüssige fluorierte Kohlenwasserstoffe sind besonders "bevorzugt,
weil sie den elektrischen Strom nicht leiten. Auf diese Weise wird bei den verwendeten hohen Spannungen die Gefahr
eines durch einen zufälligen Bruch oder Lcckschadcn verursachten Kurzschlusses zwischen der (wässerigen) Ampholyt-Lösung
und dem Kühlmedium, stark vermindert.
Ein weiteres Mer/4cmal der erfindungsgemässen Vorrichtung
ist, dass alle Flächen des Behälters, welche bei Gebrauch mit der Ampholyt-lösung in Berührung kommen, gegen Starkstrom
isoliert sind. Diese Starketrom-Isolierung sollte eine dielektrische
Widerstandsfähigkeit von mindestens 300 Volt pro
0,001 cm. besitzen. Da die erfindungsgemässen Vorrichtungen mit Spannungen bis zu 100.000 Volt arbeiten, besteht selbstverständlich
ein eindeutiges Bedürfnis innere Oberflächen zu haben, welche den elektrischen Strom nicht leiten und, welche,
ohne einen Kurzschluss zu verursachen, gegen die verwendeten hohen Spannungen isoliert und stabil sind.
Wenn Glas für die Isolierung gebraucht wird, erlaubt dessen Festigkeit und dessen Widerstandsfähigkeit neben
der Verwendung als Isoliermaterial - die zusätzliche Verwendung dieses Glases als Träger für die Bauteile. Falls
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erwünscht, können geeignete Isoliermaterialien dazu
verwendet werden, Materialien die nicht isolierend sind, zu beschichten. So können z.B. feste Materialien, wie Metall mit
Glas überdeckt werden, ITm die Herstellung der erfindungsgemässen Vorrichtung zu vereinfachen und billiger zu machen, wird mit
Vorteil das gleiche Material, wie z.B. Glas, als Isolier und als Trägermaterial verwendet.
Ein weiteres Meivkmal der erfindungsgemässen Vorrichtung
ist, dass alle inneren Anschlussstellen des Behälters, welche bei Gebrauch mit der Ampholyt-Lösung in Berührung
kommen ,durch Verwendung von wasser- und starkstromresistenten Dichtungen lecksicher abgedichtet sind, V/egen der Gefahren,
welche mit der Verwendung von hohen Spannungen verbunden sind,ist das Bedürfnis für derartige lecksichere Dichtungen
eindeutig. Sine Undichtigkeit zwischen der Kammer,welche die
Ampholyt-Lösung enthält,und der wässerigen Kühlungsflüssigkeit würde den Bedienungsmann in grosse Gefahr bringen. Die
Dichtungen müssen gegenüber den wässerigen Ampholyt-Lösungen resistent sein und die Fähigkeit besitzen,die verwendeten
hohen Spannungen über längere Zeit auszuhalten. Bevorzugte Dichtungen sind Dichtungen,welche auf der Verwendimg von
Silikon beruhen.
Der Behälter (l) wird vorzugsweise durch einen nichtleitenden
Schutzmantel (17) umgeben und mit einer nicht-leitenden Deckplatte (18) überdeckt. Ein bedeutender Vorteil
gegenüber den bekannten Vorrichtungen liegt darin, dass in einer bevorzugten Ausführungsform die Deckplatte abnehmbar
ist, was während dem Gebrauch eine Probenahme usw. aus den geöffneten U-förmigen Kammern ermöglicht. Um die Absorption
von Kohlenstoffdioxyd zu vermeiden und dementsprechend die Vorrichtung gegenüber der Luft zu isolieren, kann die Deckplatte
mit Dichtungen versehen werden. Weiter kann ein geeignetes Röhrchen zur Einleitung von Luft ,Vielehe von Kohlenstoff-
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dioxyd "befreit wurde, durch die Deckplatte hindurchgehen.
Die erfindungsgemässen Vorrichtungen können verschiedene G-rössen besitzen.So kann z.B. deren Volumen (totales Volumen
der Ampholyt-Lösung) zwischen 1 ml und 100 Liter liegen. Wie bereits erwähnt, kann zur Reinigung von Ampholyt-Mischungen
für präparative Zwecke eine Reihe von Vorrichtungen von immer kleineren Volumen verwendet werden.
In den erfindungsgemässen Vorrichtungen verwendet man mit Vorteil die erfindungsgemässe Methode, welche durch isoelektrische
Fokussierung bei einer Leistungsaufnahme von 3 Watt pro Milliliter Ampholyt-Lösung und einer durchschnittlichen
Temperaturerhöhung von weniger als 70C verbesserte Ampholyt-Trennungen ermöglicht. Verwendet man mehrere dieser
Vorrichtungen der Reihe nach, können Trennungen von Ampholyt-Mischungen in der Grössenordnung eines G-rams mit einer
bisher noch nicht erreichten grossen Geschwindigkeit und hohen Auflösung durchgeführt werden.
Eine Art von Ampholyte^ welche mit den erfindungsgemässen
Methoden und Vorrichtungen getrennt werden können, sind Proteine, insbesondere diejenige von therapeutischem
Interesse.
Genauer gesagt eignet sich die vorliegende Erfindung zur Trennung von jedem löslichen Ampholyt,welcher an seinem
iso-elektrischen Punkt ohne irreversibele Denaturierung zurückgewonnen
werden kann. Einige dieser Ampholyte sind Enzyme, Hormone, Zellteilchen, Viren, strukturelle Proteine, Proteine aus
dem Blut, der Gehirnflüssigkeit oder dem Harn usw.
Wie bereits erwähnt,wird in der Methode der isoelektrischen
Fokussierung durch Verwendung von synthetischen Verbindungen, die als Träger-Ampholyte bezeichnet werden,
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ein künstlicher pH-Gradient erzeugt. Diese Träger-Ampholyte
besitzen in der Regel ein niedriges Molekulargewicht. Nach der Fokussierung der Substanzen aus der Probe, werden
die gewünschten Substanzen von den Träger-Ampholyten durch
übliche chemische oder physikalische Methoden wie z.B. die Dialyse oder die Chromatographie,getrennt.
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Weitere Einzelheiten der vorliegenden Erfindung werden durch die nachstehenden Beispielen veranschaulicht.
Dieses Beispiel veranschaulicht die Geschwindigkeit, welche unter Verwendung der erfindungsgemässen "Vorrichtungen
"bei der Trennung von Ampholyt-Mischungen erreicht wird.
Die verwendete Vorrichtung "besitzt ein Volumen von 25 ml und enthält 10 U-förmige Kammern. Der Behälter ist
ausschliesslich aus Glas gebaut, wobei alle Anschlussstellen mit Klebstoff (Dow Corning No. 734) abgedichtet sind. Die
Bauart der Vorrichtung entspricht derjenigen,welche durch
die Figuren 1 und 2 veranschaulicht wird. Die Distanz zwischen den nebeneinander liegenden Wänden der U-förmigen Kammorn, die
Dicke der Glaswände zwischen dem Kühlmedium und der Ampholyt-Lösung und der Durchmesser der Kühlungskanäle in
den Wänden betragen alle 1 mm. Als Kühlmedium wird ein flüssiger fluorierter Kohlenwasserstoff, welcher bei der
Einleitung in die Vorrichtung eine Temperatur von 20C besitzt,
verwendet. Die Geschwindigkeit der Kühlflüssigkeit in den Kanälen beträgt ungefähr 60 cm pro Sekunde.
20 mg Vollblut werden in 25 ml Wasser enthaltend Ampholine IjKB (pH 3,5-10) gelöst. Die Fokussierung wird bei
einer Spannung von 3000 bis 7000 Volt und einer durchschnittli chen Leistungsaufnahme von175 Watt durchgeführt. Nach 1,5
Stunden sind 90$ des Haemoglobins (bestimmt durch Messung
der optischen Dichte) in einer der 10 Kammern der Vorrichtung fokussiert.
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Dieses Beispiel veranschaulicht die hohe Auflösung, welche bei der Verwendung von immer kleiner werdenden
iOkussierungseinrichtungen ohne wesentliche Verdünnung der Ampholyt-Mischung erhalten wird:
200 mg von 100 g überstehender Flüssigkeit eines wässrigen Extraktes der Riechwerkzeuge einer Ratte werden der
iso-elektrischen Fokussierung unterworfen. Dieses Material wird dialysiert und in 2 Liter einer 0,8 prozentigen Ampholin
IiKB (pH 3-6) enthaltenden Lösung gelöst. Diese Lösung
wird dann in eine Vorrichtung, die mit Ausnahme des Fehlens von zusätzlichen Fühlelementen (U), gleicher Bauart ist,
wie diejenige,welche im Beispiel 1 besehrieben wird,eingesetzt.
Diese Vorrichtung besitzt ein Volumen von ungefähr 2 Liter
und enthält 10 Kammern. Nachdem ein Gleichgewicht erreicht worden ist, wird der Inhalt der 200 ml U-förmigen Kammer,
welche den grössten Teil des Riechwerkzeug-Proteins enthält,
nach Verdünnung mit 20 ml destilliertem Wasser, in eine 220 ml Vorrichtung gleicher Bauart eingeleitet. Nachdem in dieser
Vorrichtung ein Aequilibrium erreicht worden ist, wird der
Inhalt der U-förmigen Kammer, welche den grössten Teil des Riechwerkzeug-Proteins enthält, nach Verdünnung mit 3 ml
destilliertem Wasser, in eine 25 ml-Vorrichtung eingeleitet.
Nachdem in dieser dritten Vorrichtung ein Aequilibrium erreicht worden ist, wird die Verteilung des gewünschten Proteins durch
ein Tminunoverfahren und eine diskontinuierliche Gelelektrophorese
bestimmt. Der grösste Anteil (90fo) der Aktivität ist
in 5 U-förmigen Kammern dieser Vorrichtung, d.h. in einem Volumen von 11 ml, vorhanden. Vergleicht man dieses Volumen
mit dem ursprünglichen Volumen von 2000 ml, entspricht dies einer 50-fachen Konzentration. Das Riechwerkzeug-Protein hat in
den 5 Kammern ungefähr eine G-auß' sehe Verteilung mit einer
Abweichung von - 0,01-0,015 pH-Einheiten. Nach Entfernen der
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Ampholine durch Dialyse wird das Protein dann in einer
DEAE-Kolonne gereinigt.
Claims (23)
1. Verbesserte Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung enthaltend einen rechteckigen, kastenförmigen
Behälter (1) zur Aufnahme der zu trennenden Ampholyt-Lösung, wobei
dieser Behälter einen Boden (2), zwei sich gegenüberstehende Stirnwände (3) und (4) und zwei sich
gegenüberstehende Vorder- und Hiaterwände (5) und (6) besitzt;
zwei Elektroden (7) und (8) ,welche mit einer Gleichstromquelle
in Verbindung stehen,Ia der Nähe der
sich gegenüberstehenden Stirnwand* in diesen Behälter hineinragen;
der Behälter mit einer Anzahl von undurchlässigen Wänden (9) und (10) versehen ist, welche parallel
zu den Stirnwänden laufen;
die Wände (9) sich bis zum Boden ües Behälters erstrecken
während die Wände (10) sich bis in die Nähe des Bodens des Behälters erstrecken, wodurch erreicht
wird, dass der Behälter in eine Anzahl von kontinuierlich in Verbindung stehenden U-föimigen Kammern
unterteilt ist,
dadurch gekennzeichnet, dass
a) die Distanz X zwisohen den Wänden einer U-förmigen
Kammer, zwischen ungefähr 1 mm uM 3 mm liegt;
b) das Verhältnis der länge Y eines Schenkels einer U-förmigem.
Kammer zur Distanz X zwischen den Wänden dieser Kammer
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über 50 zu 1 liegt;
c) das Verhältnis der Länge von jedem Schenkel einer U-förmigen Kammer zur absoluten Länge der gesamten
Strombahn zwischen den Elektroden unterhalb 1 zu 15 liegt;
d) die undurchlässigen Wände mit einer Klihlungseinrichtung
in Verbindung stehen, damit die Ampholyt-Lösung
in der Fähe dieser undurchlässigen Wände gekühlt wird;
e) alle Flächendes Behälters, welche bei Gebrauch mit der Ampholyt-Lösung in Berührung kommen, gegen Starkstrom
isoliert sind}
f) alle inneren Anschlussstellen des Behälters, welche bei Gebrauch mit der Ampholyt-Lb'sung in Berührung kommen,
durch Verwendung von wasser- und starkstromresistenten Dichtungen lecksicher abgedichtet sind.
2. Vorrichtung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass die Ausgestaltung der Elektrode das Erzeugen eines syrnetrischen
elektrischen Feldes über die ganze Länge der Elektrode erlaubt.
3.·Vorrichtung gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
dass die Elektrode aus einer Metallfolie oder einem Drahtgitter mit einer zehnfach grösseren Oberfläche als die Fläche, welche
durch die Distanz zwischen zwei nebeneinander liegenden Wänden und der Breite oder Tiefe der Kammer definiert ist, besteht.
4« Vorrichtung gemäes Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet,
dass die Elektrode aus einer auf einen Glasträger aufgebrachten Platinfolie besteht.
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5. Vorrichtung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis der Länge eines
Schenkels einer U-förmigen Kammer zur Distanz zwischen den nebeneinander liegenden Wänden dieser Kammer ungefähr 100
zu 1 ist.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass,durch die Bauart des Behälters
bedingt, eine Absorption vom Kohlenstoffdioxyd der Luft während des Gebrauches vermieden wird.
7. Vorrichtung gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter Einrichtungen zum Einleiten von Kohlenstoffdioxyd
freier Luft in die Vorrichtung enthält.
8. Vorrichtung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Kühleinrichtung Kühlungskanäle in den undurchlässigen Wänden (9) und (10) umfasst.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Kühlmedium die Kühlungskanäle mit einer durchschnittlichen
Geschwindigkeit von mindestens 30 cm pro Sekunde durchfliesst.
10. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Kühlmedium ein flüssiger fluorierter Kohlenwasserstoff
ist.
11. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Kühlungskanäle einen Durchmesser von 1 bis 3 mm
besitzen.
12. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der Wände zwischen dem Kühlmedium und der
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Ampholyt-Iiösung weniger als 3 ^m. ist.
13. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die undurchlässigen Wände (9) und (10) hohl sind, um den
Durchfluss von. Eihlmedium zu erlauben.
14« Vorrichtung gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
dass die undurchlässigen Wände (9) und (10) aus einer Anzahl von senkrecht sich berührenden Rohren zum Durchfluss
von Kühlmedium gebildet sind.
15. Vorrichtung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch
gekennzeichnet, dass die Distanz zwischen den undurchlässigen Wänden in einer Weise vorbestimmt sind, welche es ermöglicht, maximale
Konvektionseffekte in der AmphoIyt—Lösung zu erreichen.
16. Vorrichtung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzliche Kühlelemente
(11), welche über den undurchlässigen Wänden (9) angebracht sind und sich bei Gebrauch in Kontakt mit der Oberfläche (12)
der Ampholyt-Lösung befinden, aufweist.
17. Vorrichtung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 16,
dadurch gekennzeichnet, dass die Starkstromisolierung eine dielektrische Widerstandsfähigkeit von 200 Volt pro 0,001 cm
besitzt.
18. Vorrichtung gemäss Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass als Isoliermaterial Glas verwendet wird.
19. Vorrichtung· nach einem der Ansprüche 1 bis 18,
dadurch gekennzeichnet, dass als Basis für die wasser- und starkstromresistenten Dichtungen Silikon verwendet wird.
20. Verbessertes Verfahren zur isoelektrischen Fo-
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kussierung in einer mehrere Kammern enthaltenden Vorrichtung,
wobei ein Gieichstrom durch eine Ampholyt-Lösung bestehend aus einer Probeatapholyt Mischung, einer einen künstlichen pH-Gradient
erzeugenden Trägerampholyt-Mischung und Wasser,geleitet wird,
dadurch gekennzeichnet, dass die Fokussierung mit einer Leistungsaufnahme von mindestens 3 Watt pro Milliliter Ampholyt-Lösung
erfolgt und die resultierende Temperaturerhöhung dieser Ampholyt-Lösung
im Durchschnitt 70G nicht übersteigt.
nach Anspruch 20
21. Verbessertes Verfahren/zur isoelektrischen Fokussierung
in einer mehrere Kammern enthaltenden Vorrichtung,wobei ein Gleichstrom durch eine Ampholyt-Lösung bestehend aus einer
Probeampholyt-Mischung, einer einen künstlichen pH-Gradient erzeugenden Trägerampholyt-Mischung und Wasser, geleitet wird,
dadurch gekennzeichnet, dass die Ampholyt-Mischung,oder gewünschte
Teile davon, ohne wesentliche Verdünnung,der isoelektrischen Fokussierung in einer Reihe von mehrere Kammern enthaltenden
Vorrichtungen von immer kleineren Volumen, unterworfen wird.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass jede der verwendeten Vorrichtungen von immer kleineren
Volumen die gleiche Anzahl an Kammern besitzt und das Verhältnis des Volumens von jeder Vorrichtung zu dem Volumen der nachfolgenden
kleineren Vorrichtung ungefähr der Anzahl an Kammern in einer Vorrichtung entspricht.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl von Kammern in jeder Vorrichtung ungefähr 10 ist.
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OHW | Rejection |