DE2324521C3

DE2324521C3 -

Info

Publication number: DE2324521C3
Application number: DE2324521A
Authority: DE
Inventors: Jarl Sune Petterson; Svante Harry Rilbe
Original assignee: LKB-PRODUKTER BROMMA (SCHWEDEN) AB
Current assignee: LKB-PRODUKTER BROMMA (SCHWEDEN) AB
Priority date: 1972-05-16
Filing date: 1973-05-15
Publication date: 1979-08-02
Also published as: FR2184858B1; GB1437377A; DE2324521B2; DE2324521A1; SE361829B; US3915839A; FR2184858A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung von Komnonenten in einer Probenlösune mittels isoelektrischer Fokussierung in einer Fokussierungskammer, welche im Einflußbereich eines elektrischen Gleichstromfeldes gehalten wird, und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Zur Erzielung einer möglichst hohen Auflösung hält man bei der Durchführung der isoelektrischen Fokussierung den pH-Verlauf sehr flach, wodurch die Dichteänderung über eine längere Distanz verteilt ist Erschwert wird dabei die Unterbindung von Konvektion. Die

ίο elektrische Feldstärke muß so niedrig gehalten werden, daß die Wärmekonvektion vermieden wird. Das hat jedoch niedrige Geschwindigkeiten bei der Ionenwanderung zur Folge, woraus eine lange Trennzeit resultiert Der pH-Gradient, der sich über eine lange

'5 Distanz bzw. Strecke ausdehnt, bringt darüber hinaus lange Wanderungswege für die Mehrzahl der Probenkomponenten mit sich. Hieraus resultiert eine verlängerte Fokussierungszeit Demnach läßt sich eine möglichst hohe Auflösung nur auf Kosten einer langsamen Fokussierung erreichen.

Die Aufgabe der Erfindung besteht demnach darin, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Trennung von Komponenten in einer Probenlösung mittels isoelektrischer Fokussierung zu schaffen, bei welchen die Fokussierung in kurzer Zeit erzielt werden kann und welches eine hohe Auflösung aufweist

Diese Aufgabe wird beim eingangs genannten Verfahren erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Fokussierung in wenigstens zwei Schritten durchgeführt wird, bei denen der mittlere Querschnitt der Fokussierungskammer senkrecht zum elektrischen Feld bei jedem Fokussierungsschritt kleiner gehalten wird als im unmittelbar vorhergehenden Fokussierungsschritt
Die verschiedenen Fokussierungsschritte können in ein und derselben Fokussierungskammer durchgeführt werden. Hierbei kann eine in verschiedene räumliche Orientierungen verschwenkbare Säuleneinrichtung zur Anwendung kommen, die eine einzige Fokussierungskammer in Form eines Parallelpipedons mit auswechselte baren Elektroden aufweist

Außerdem ist es möglich, die aufeinanderfolgenden Fokussierungsschritte in verschiedenen Fokussierungskammern durchzuführen, wobei die Probenlösung auf einer Hilfsflüssigkeit schwimmend von einer Fokussierungskammer in die nächste Fokussierungskammer übergeführt werden kann. Die Dichte dieser Hilfsflüssigkeit ist größer als die Dichte der schwersten Komponente in der Probenlösung. Als Hilfsflüssigkeiten eignen sich unlösliche Flüssigkeiten, wie beispielsweise

so Trichlorethylen oder Tetrachlorkohlenstoff.

Die Vorrichtung, in welcher die aufeinanderfolgenden Fokussierungsschritte in verschiedenen Fokussierungskammern durchgeführt werden können, kann eine Säuleneinrichtung mit mehreren Fokussierungskammern aufweisen, die über Rohrverbindungen miteinander verbunden sind und senkrecht zum jeweiligen elektrischen Feld unterschiedliche Durchmesser besitzen. Wenigstens bei einer dieser Fokussierungskammern können die Elektroden in Elektrolyte enthaltenden Elektrodenbehältern angeordnet sein, wobei die Elektrolyte jedes Elektrodenbehälters durch eine Konvektion unterbindende elektrolytisch leitende Membran, die sich senkrecht zum anzulegenden elektrischen Feld erstreckt, von der Probenlösung getrennt ist. Diese Membranen können beispielsweise aus Glasfilterscheiben, anderen porösen Scheiben, Zellophan, relativ dicken Papiermembranen, tierischen Membranen, natürlichen oder synthetischen Gelschei-

ben bestehen.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann ferner eine Säuleneinrichtung zur Anwendung kommen, welche eine Vorfokussierungssäule und eine Endfokussierungssäule aufweist, und welche um 90° in der Weise verschwenkbar ist, daß bei der Vorfokussierung die Elektroden der Vorfokussierungskammer die Decke und den Boden in dieser Kammer bilden und die Längsachse der Endfokussierungssäuk horizontal liegt, während bei der Endfokussierung die Endfokussierungssäule eine vertikale Stellung einnimmt

Als Elektroden können auch gasende und nichtgasende Elektroden zur Anwendung kommen. Ebenso eignen sich Elektroden aus Edelmetallen, Kohlenstoff, Silber oder Quecksilber.

Der Vorteil, der bei der Erfindung erzielt wird, besteht darin, daß bei der Trennung von Komponenten in einer Probenlösung mittels isoelektrischer Fokussierung die Fokussierung in vergleichsweise kurzer Zeit durchgeführt werden kann, ohne daß dabei die Auflösung über ein breites pH-Intervall beeinträchtigt wird. Die Erfindung eignet sich beispielsweise zur Trennung von Proteinen für analytische und präparative Zwecke.

Aus einem Aufsatz von K ο 1 i η in »Methods of Biochem Analysis«, Band 6, Seiten 259—288 (1958) ist insbesondere aus den Seiten 277 und 278 die Querschnittsverringerung der Säule zur erleichterten Entnahme der Fraktionen mit Hilfe eines in die Säule eingeschobenen Kolbens bekannt Durch den Kolben werden die fertig fokussierten Fraktionen der Höhe nach erweitert so daß mit Hilfe eines in dem Kolben angeordneten Saugkanals die fraktionierten Proben leichter entnommen werden können. Die isoelektrische Fokussierung selbst während welcher die Fokussierungskammer unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes gehalten wird, wird jedoch in einem einzigen Verfahrensschritt durchgeführt, wobei der Querschnitt der Fokussierungskammer senkrecht zum elektrischen Feld während der isolelektrischen Fokussierung nicht verändert wird.

Aus »Separation Science«, 3 (6), Seiten 535 bis 549 (Dezember 1968) ist es bekannt, zur Erzeugung eines i:n wesentlichen konstanten Dichtegradienten in schmalen Säulen die Säule gemäß F i g. 1 auf der Seite 538 dieser Veröffentlichung schwenkbar anzuordnen. Bei dieser schwenkbaren Anordnung bleibt jedoch def Querschnitt der Fokussierungskammer senkrecht zum elektrischen Feld unverändert da die Elektroden in der gezeigten Vorrichtung ortsfest angeordnet sind und mitverschwenkt werden. An eine Verringerung des Querschnitts senkrecht zum angelegten elektrischen Feld ist bei dieser Vorrichtung auch nicht gedacht.

Anhand der Figuren soll an Ausführungsbeispielen die Erfindung näher erläutert werden. Es zeigt

F i g. 1 eine Säuleneinrichtung in Form eines Parallelpipedons mit einer Fokussierungskammer,

F i g. 2 eine Säuleneinrichtung mit einer Vorfokussierungs- und Endfokussierungssäule, eo

F i g. 3 eine Säuleneinrichtung, welche sich gegenüber der in der F i g. 2 gezeigten Einrichtung lediglich durch das Kühlsystem unterscheidet und

F i g. 4 eine Säuleneinrichtung, bei der die Elektroden in direktem Kontakt mit der Vorfokussierungssäule sind und bei der der Flüssigkeitstransport zwischen den beiden Säulen von oben nach unien erfolgt

Eine in F i g. 1 dargestellte Säuleneinrichtung 14 in

Form eines Parallelpipedons enthält eine Fokussierungskammer 15 mit Abmessungen a, b und c, wobei a>b>c ist Außerhalb der beiden größten Oberflächen mit der Fläche axb sind zwei Kühlmantel 1, 2 vorgesehen. Beide Kühlmäntel sind mit zwei Rohranschlüssen 3,4 versehen. Die beiden kleineren Wände mit der Fläche Z>x e sind mit öffnungen 5, 6 versehen, die mit Gewinden ausgestattet sind. In jede öffnung kann ein mit einem Gewinde versehener Verschlußstopfen, eine mit einem Gewinde versehene Röhre oder eine mit einem Gewinde versehene Elektrodenanordnung eingesetzt sein.

Die in der Figur dargestellte Säuleneinrichtung dient zur Erläuterung des Stromtransportes entlang den Abmessungen b und a, welche dann vertikale Abmessungen sind, wenn die Stromrichtung parallel bzw. antiparallel zum Dichtegradienten verläuft Im ersten Fall steht die Säule auf einer Fläche mit den Abmessungen a χ c In dieser Lage wird die Vorfokussierung durchgeführt Im zweiten Fall steht die Säule auf einer Fläche mit den Abmessungen />xc In dieser Position wird die Endfokussierung durchgeführt Die Säule kann ebenfalls auf eine Fläche mit den Abmessungen abgestellt werden. In diesem Fall ist cdie vertikale Ausdehnung. Diese Lage ist dann geeignet um einen Dichtegradienten hervorzurufen, wie er in »Separation Science« 3, Seite 535 (1968) beschrieben ist Gemäß diesem Verfahren ist eine kleine Anzahl von Lösungen mit anwachsender Dichte eine unter der anderen in die Säule gerichtet wobei die Säule in eine horizontale Lage geschwenkt wird, um sowohl den Diffusionsbereich als auch den Konzentrationsgradienten zu vergrößern. Der Massentransport wird infolge der freien Diffusion bis zu einem solchen Ausmaß erhöht, daß nur eine kurze Zeit für die Entwicklung einer fortlaufenden Dichteänderung in der Säule benötigt wird.

Als Bodenelektrode 7 kann Quecksilber 7 verwendet werden. Dieses dehnt sich immer über dem Boden aus, unabhängig von der räumlichen Orientierung der Säule. Das Quecksilber als Anode ist nichtgasend, wenn es von einer Wasserstoffhalogensäure oder Schwefelsäure umgeben ist, da lösliche Quecksilbersalze sich nur sehr schwer bilden. Quecksilber als Kathode ist nichtgasend, wenn es von Alkalihydroxiden umgeben ist, was von der Bildung von Alkalimetallamalgan herrührt Zur äußeren Kontaktierung der Bodenelektrode 7 genügt ein Platindraht 8, der sich durch die Säulenwand erstreckt und das Quecksilber berührt. Jede nichtgasende Elektrode muß eine große Oberfläche aufweisen, um die Stromdichte so niedrig wie möglich zu halten. Wenn die Säule sich in ihrer vorfokussierenden Stellung (b vertikal) befindet, muß die nichtgasende obere Elektrode demgemäß eine Fläche von a, c aufweisen. Ein geeignetes Material ist eine Palladiumsilberlegierung als Kathode und die gleiche Legierung, welche mit Wasserstoff gesättigt ist als Anode. Da kein Flüssigkeitsraum zwischen der Elektrode und der Säulenwand erwünscht ist, ist die Säulenwand mit der Palladiumsilberlegierung versehen und auswechselbar. Bei der in F i g. 1 gezeigten Konstruktion ist eine Säulenwand 9 aus Kunststoff hergestellt und weist einen T-Querschnitt auf. Diese Wand ist mittels einer Anzahl von Schrauben 10 betestigt, wobei sie mittels eines C-Ringes ti abgedichtet ist. Ein dünnes Blech aus einer Palladiumsilberlegierung mit den Abmessungen cx(a+d), wobei d etwas größer ist als die Dicke der einen Fndwand, bildet eine Elektrode 12. Die Endwand weist einen Schlitz 13

auf, durch welchen die Elektrode 12 hinausragt, so daß die Elektrode mit einer Spannungsquelle verbunden werden kann. Nachdem die Vorfokussierung beendet ist, wird der Strom abgeschaltet und die Schrauben 10 werden gelockert. Die Elektrode 12 kann dann herausgezogen werden, wonach alle Schrauben 10 wiederum angezogen werden. Die Säule wird dann vorsichtig in aufrechte Stellung gebracht, so daß a die senkrechte Abmessung wird. Durch die mit einem Gewinde ausgestattete öffnung 6 wird ein Platindraht eingeführt, der in einer mit einem Gewinde versehenen Elektrodeneinrichtung angeordnet ist. Diese Elektrodeneinrichtung ist außerdem mit einer nicht näher dargestellten Gasauslaßöffnung versehen. Danach wird eine Spannung zur endgültigen Fokussierung angelegt. Nachdem die Endfokussierung durchgeführt ist, wird die in die öffnung 6 eingeführte Platinelektrode durch eine Einrichtung ersetzt, welche einen dicht einschraubbaren Verschluß aufweist. Der dichte Verschluß in der mit einem Gewinde versehenen öffnung 5 wird dann durch eine mit einem Gewinde versehene Auslaßröhre ersetzt, die ein Steuerventil aufweist Der Verschluß in der öffnung 6 kann dann entfernt werden. Die Röhre wird dann so gekippt, daß die Mündung der öffnung 5 der niedrigste Punkt der Säule wird. Der Säuleninhalt kann dann entleert werden, wobei dieser Inhalt in Fraktionen unterteilt ist, die für die pH-Messung und für die chemische und/oder biologische Analyse geeignet sind.

Die Säule kann aus Quarz hergestellt sein, wobei eine UV-Absorptionsanalyse direkt während der Durchführung der Fokussierung in der Säule vorgenommen werden kann. Die Befestigung der Säulenwand 9 mittels Schrauben wird dann ersetzt durch eine Klemmvorrichtung, wobei jedoch daneben die gleiche Konstruktion beibehalten werden kann. Es können zwei verschiedene Empfindlichkeitsgrade in der optischen Analyse erzielt werden, indem man das Licht entlang der Strecke h oder entlang der Strecke c durch die Säule schickt. Man kann hierzu die Säule um 90° drehen.

Bei Verwendung einer Palladiumsilber-Kathode anstelle des Quecksilbers nimmt man eine symmetrische Einrichtung, bei der zwei Säulenwände eine Fläche von axe aufweisen. Diese beiden Säulenwände sind, wie es in F i g. 1 für eine Wand dargestellt ist, auswechselbar. Die Palladiumsilber-Anode ist mit Wasserstoff gesättigt und die Palladiumsilber-Kathode ist frei von Wasserstoff. Beide Elektroden werden nach der Vorfokussierung entfernt. Eine nichtgasende Bodenelektrode mit Abmessungen bxc während der Endfokussierung erreicht man dadurch, daß eine gesonderte Säulenwand so mit Abmessungen von a χ c am einen Ende mit einer Palladiumsilber-Elektrode ausgestattet wird, die etwas kleinere Abmessungen als bxc aufweist Wenn die Vorfokussierung beendet ist, wird die Bodenelektrode nach einem kurzzeitigen Lösen der Schrauben 10 herausgezogen und die obere Wand mit ihrer Elektrode wird vollständig entfernt und durch die gesonderte Säulenwand, welche am einen Ende die Bodenelektrode aufweist, ersetzt Anschließend wird die Endfokussierung durchgeführt

Bei der in F i g. 2 dargestellten Säuleneinrichtung ist eine Vorfokussieningssäule 21 und eine Endfokussierungssäule 25 vorgesehen, wobei die Einrichtung sich in einer Stellung befindet, während der der Transport des vorfokussierten Materials von der einen Säule in die andere und die Endfokussierung durchgeführt werden können. Während der Vorfokussierung wird die Einrichtung um 90° um eine zur Zeichenebene senkrechte Achse gedreht, so daß die Längsachse der Endfokussierungssäule 25 eine horizontale Lage einnimmt.

Diese konstruktiven Merkmale dieser Endfokussierungssäule sind an und für sich bekannt, und in der Figur sind lediglich die Außenabmessungen der Säule dargestellt. Die Volumina der Vorfokussierungssäule und der Endfokussierungssäule sind gleich.

Der zentrale Teil der Vorfokussierungssäule 21 ist die Fokussierungskammer selbst (ebenfalls mit 21 bezeichnet). Diese Fokussierungskammer ist in der Stellung für die Vorfokussierung am oberen Teil und am Bodenteil von zwei elektrolytisch leitenden Membranen 24, welche jedoch eine Konvektion unterbrechen, begrenzt. Die Membranen bestehen beispielsweise aus Giasfiiterscheiben. Seitlich ist die Fokussierungskammer von senkrechten Wänden begrenzt die an zwei diametral gegenüberliegenden Punkten mit Gewinde versehene öffnungen 30 und 31 aufweisen. In diese können wahlweise Verschlußstopfen oder Röhren eingeschraubt werden. Während der Vorfokussierung befindet sich in der öffnung 30 ein Verschlußstopfen und in der öffnung 31 eine Röhre, welche über einen Hahn 32 eine Verbindung zur Endfokussierungssäule bildet.

Außerhalb der Membranen 24 ist eine Kammer 22 für den die Anode umgebenden Elektrolyten und eine Kammer 23 für den die Kathode umgebenden Elektrolyten vorgesehen. Die Anordnung kann auch umgekehrt sein. Diese Kammern sind über Röhren und Zirkulationspumpen 29 mit Elektrodenbehältern 26, 28, von denen jeder eine Elektrode 27 enthält, verbunden, Jede Röhre enthält eine Rohrschlange, welche in ein Kühlreservoir eingetaucht ist was jedoch in der Figur nicht im einzelnen dargestellt ist Eine nicht nähet dargestellte Verspannvorrichtung hält die Kammern für den die Anode und die Kathode umgebender Elektrolyten sowie die Fokussierungskammern zusammen, so daß ein Lecken ausgeschlossen ist

Beim Betrieb der Säuleneinrichtung werden zunächst die Membranen 24 gründlich befeuchtet, damit sie luftundurchlässig werden. Dann wird in die öffnung 30 eine Röhre eingesetzt und der Hahn 32 geöffnet wobei die Säuleneinrichtung die in der F i g. 2 gezeigte Stellung einnimmt Die Endfokussierungssäule wird evakuiert, se daß in die Vorfokussierungssäule 21 eine Lösung mil gewünschter Dichteänderung gesaugt wird. Der Hahn 32 wird dann geschlossen, und die Röhre in der Öffnung 30 wird durch ein Verschlußelement ersetzt. Die gesamte Einrichtung wird dann um 90° um eine zui Zeichenebene senkrechte Achse geschwenkt Die Elektrodenbehälter werden mit den die Anode und die Kathode umgebenden Elektrolyten entsprechend gefüllt und die Zirkulationspumpen 29 gestartet. An die Elektroden wird die für die Vorfokussierung notwendige Spannung gelegt

Nach Beendigung der Vorfokussierung wird dei Strom abgeschaltet und die Einrichtung wird vorsichtig um 90° um eine zur Zeichenebene senkrechte Achse geschwenkt Die Elektroylte, welche die Anode und die Kathode umgeben, können dann durch nicht nähei dargestellte GasauslaBöffnungen der Elektrodenanordnungen ausfließen. Außerdem können die Elektroder vollständig aus ihren entsprechenden Elektrodenanordnungen entfernt werden. Nachdem die Säuleneinrichtung in aufrechte, in die in der Fig.2 dargestellte Stellung für die Endfokussierung gebracht ist, wird da; Verschlußelement in der öffnung 30 durch eine Röhre ersetzt, welche in eine Flüssigkeit eingetaucht ist, die

eine größere Dichte aufweist als die Lösung im Boden der Säule. Diese Röhre ist ebenfalls mit einem Hahn oder, falls eine Gummi- oder Kunststoffröhre verwendet wird, mit einer Ligaturklammer versehen. Die Endfokussierungssäule 25 wird evakuiert und der Hahn 32 geöffnet. Durch Regulierung des Hahnes oder der Ligaturklammer in der in die öffnung 30 eingesteckten Röhre wird der Säuleninhalt in der Kammer 21 durch die Flüssigkeit mit der größeren Dichte ersetzt, und das vorfokussierte Material steigt in die Endfokussierungssäule. Der Kühlmantel der Endfokussierungssäule wird dabei von einem Kühlmedium durchflossen. Wenn der Flüssigkeitstransport beendet ist, wird der Hahn 32 verschlossen und eine Spannung an die nicht näher dargestellten Elektroden der Endfokussierungssäule gelegt. Die Vorfokussierungssäule wird dann entfernt, und nachdem die Endfokussierung durchgeführt ist, kann der Säuleninhalt durch sorgfältiges Ausfließenlassen durch den Hahn 32 fraktioniert werden.

Die in Fig.3 dargestellte Säuleneinrichtung unterscheidet sich von der in Fig.2 lediglich durch die Anordnung des Kühlsystems, wobei die Kammern für die Elektrolyten, welche die Anode und die Kathode umgeben, größer ausgebildet sind, und in diesen sind Kühlschlangen 33, 34, durch welche ein Kühlmittel hindurchgeleitet wird, angeordnet. Es ergibt sich dabei der zusätzliche Vorteil, daß die Zirkulationspumpe für das Kühlmittel nicht unter Spannung steht. Elektroden 35 können in ziemlich dünnen Elektrodenröhren 36, 37 vorgesehen sein, welche mit den Kammern, welche die die Anode und die Kathode umgebenden Elektrolyten enthalten, in Verbindung stehen.

Die Säuleneinrichtungen gemäß den Fig.2 und 3 haben gemeinsam, daß der Elektrolyt, welcher die Anode umgibt, aus einer Lösung einer starken Säure und der Elektrolyt, der die Kathode umgibt, aus einer Lösung einer starken Base bestehen. Ihre Konzentrationen sollen zwischen 0,1 und 1 Äquivalenten pro Liter liegen. Die Leitfähigkeiten sind dann um einige Zehnerpotenzen größer als die Leitfähigkeit, welche in den mittleren Teilen der Vorfokussierungssäule bei der Fokussierung vorherrscht

Bei der in F i g. 4 dargestellten Säuleneinrichtung sind in der Vorfokussierungssäule 52 Elektroden 42 und 46 in direktem Kontakt mit der zu fokussierenden Lösung. Der Flüssigkeitstransport zwischen der Vorfokussierungssäule 52 und einer Endfokussierungssäule 48 wird bei der in der Figur dargestellten Stellung von oben nach unten durchgeführt. Die Endfokussierung wird ebenfalls in der in der Fig.4 dargestellten Stellung durchgeführt Zur Vorfokussierung wird die Säuleneinrichtung um 90° um eine zur Zeichenebene senkrechte Achse geschwenkt, so daß die Längsachse der Endfokussierungssäule 48 eine horizontale Lage einnimmt Diese konstruktiven Einzelheiten der Endfokussierungssäule sind bekannt und in der Figur ist somit lediglich die Außenabmessung der Säule dargestellt Die Volumina der beiden Säulen 48 und 52 sind gleich.

Die Vorfokussierungssäule 52 ist in der Vorfokussierungsstellung an ihrem oberen Teil und Bodenteil von zwei nichtgasenden Elektroden 42 und 46 begrenzt Beide Elektroden sind mit Außenwänden zweier Kühlkammern 47 und 49 verlötet Jede Kühlkammer ist mit zwei Rohranschlüssen 41 versehen. Seitlich wird die Vorfokussierungssäule 52 von vertikalen Wänden 44 begrenzt, welche an zwei diametral sich gegenüberliegenden Punkten mit Gewinden ausgestattete öffnungen 45, 50 aufweisen. In diese können abwechselnd Verschlußstopfen oder Röhren eingeschraubt werden. Während der Vorfokussierung ist die öffnung 45 mit einem Verschlußstopfen versehen, und die öffnung 50 ist mittels einer Röhre, die mit einem Hahn 51 versehen ist, mit der Endfokussierungssäule 48 verbunden. Die Vorfokussierungssäule ist mittels eines O-Ringes 43 abgedichtet, wobei eine nicht näher dargestellte Verspann- bzw. Klemmvorrichtung auf die äußeren

ίο Wände der beiden Kühlkammern einwirkt.

Beim Betrieb dieser Säuleneinrichtung wird diese zunächst in die Lage gebracht, welche sie bei der endgültigen bzw. bei der Endfokussierung einnimmt (diese Stellung ist in der Figur dargestellt). Die

Endfoicussicrungssäule wird mit einer Flüssigkeit, deren Dichte größer ist als die der Bodenlösung, welche in der Vorfokussierungssäule fokussiert werden soll, aufgefüllt, und der Hahn 51 zwischen den beiden Säulen 48 und 52 wird verschlossen. Die Vorfokussierungssäule wird dann mit einer Ampholytlösung, die die Proteinprobe enthält, angefüllt. Die Öffnung 45 wird mittels eines Verschlußstopfens verschlossen, und die Säuleneinrichtung wird dann langsam um 90° um eine zur Zeichenebene senkrechte Achse geschwenkt. Der Kühlwasserfluß wird dann gestartet, und an die Elektroden 42 und 46 wird eine elektrische Spannung für die Vorfokussierung angelegt. Nach Beendigung der Vorfokussierung wird der Strom abgeschaltet, und die Säuleneinrichtung wird um 90° um die vorstehend erwähnte Achse zurückgedreht. Die Hähne 51 und 53 an beiden Enden der Endfokussierungssäule 48 werden geöffnet, und der Verschlußstopfen wird aus der Öffnung 45 entfernt. Mittels eines der beiden Hähne 51 und 53 wird die Fließgeschwindigkeit bzw. die nach unten fließende Menge auf einen geeigneten geringen Wert eingestellt. Nachdem der Flüssigkeitsinhalt der Vorfokussierungssäule 52 nach unten in die Endfokussierungssäule 48 geflossen ist, wird der Hahn 52 geschlossen und die Vorfokussierungssäule entfernt und

an die nicht näher dargestellten Elektroden der Endfokussierungssäule eine elektrische Spannung gelegt. Nachdem die Endfokussierung durchgeführt ist, wird der elektrische Strom abgeschaltet und der Säuleninhalt in Fraktionen aufgeteilt, welche durch den Hahn 53 ausfließen.

Mit einer Vorrichtung gemäß F i g. 1 benötigt man für die Vorfokussierung 1,5 Stunden und für die Endfokussierung 3 Stunden.
Bei einem Versuch mit der Einrichtung gemäß F i g. 4

so wurde die Vorfokussierung während 1 Stunde durchgeführt Der vorfokussierte Säuleninhalt wurde während 15 Minuten in die Endfokussierungssäule übergeführt. Die Endfokussierung wurde dann während 5 Stunden durchgeführt Bei Verwendung einer dieser Vorrichtungen ist es möglich, eine Auflösungsstärke ApI = 0,02 zu erreichen.

Man kann jedoch davon ausgehen, daß mit der Vorrichtung gemäß Fig.4 diese Auflösung in einer Vorfokussierungszeit von nur 10 Minuten und einer Endfokussierungszeit von nur 3 Stunden erreicht werden kann. Somit kann die Fokussierungszeit von 24—48 Stunden auf etwa 3,5—6,5 Stunden reduziert werden. Die isoelektrische Fokussierung bei dieser hohen Auflösung in einer derart kurzen Zeit bedeutet eine beträchtliche Verbesserung der bekannten Technik.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

909 631/139

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Trennung von Komponenten in einer Probenlösung mittels isoelektrischer Fokussierung in einer Fokussierungskammer, welche im Einflußbereich eines elektrischen Gleichstromfeldes gehalten wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Fokussierung in wenigstens zwei Schritten durchgeführt wird, bei denen der mittlere Querschnitt der Fokussierungskammer senkrecht zum elektrischen Feld bei jedem Fokussierungsschritt kleiner gehalten wird als im unmittelbar vorhergehenden Fokussierungsschritt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verschiedenen Fokussierungsschritte in ein und derselben Fokussierungskammer durchgeführt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die aufeinanderfolgenden Fokussierungsschritte in verschiedenen Fokussierungskammern durchgeführt werden, wobei die Probenlösung, auf einer Hilfsflüssigkeit schwimmend, von einer Fokussierungskammer in die nächste Fokussierungskammer übergeführt wird.

4. Vorrichtung zur Trennung von Komponenten in einer Probenlösung mittels isoelektrischer Fokussierung mit einer oder mehreren Fokussierungskammern und Elektroden, die in den Fokussierur.gskammern ein Gleichstromfeld erzeugen zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fokussierungskammer (15) bzw. Fokussierungskammern (21,25,48,52) in einer Säuleneinrichtung angeordnet sind, welche in verschiedene räumliche Orientierungen verschwenkbar ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Säuleneinrichtung mehrere Fokussierungskammern (21, 25) aufweist, welche über Rohrverbindungen miteinander verbunden sind und welche unterschiedliche Durchmesser senkrecht zum jeweiligen elektrischen Feld in der Fokussierungskammer besitzen und daß wenigstens bei einer Fokussierungskammer die Elektroden (27 bzw. 35) in Elektrolyte enthaltenden Elektrodenbehältern (26 bzw. 28; 36 bzw. 37) angeordnet sind und der Elektrolyt jedes Elektrodenbehälters durch eine eine Konvektion unterbrechende elektrolytisch leitende Membran (24), die senkrecht zum elektrischen Feld sich erstreckt, von der Probenlösung getrennt ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Säuleneinrichtung eine einzige Fokussierungskammer (15) in Form eines Parallelpipedons mit auswechselbaren Elektroden (7, 12) aufweist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die eine Vorfokussierungssäule (21 bzw. 52) und eine Endfokussierungssäule (25 bzw. 48) aufweisende Säuleneinrichtung um 90° in der Weise verschwenkbar ist, daß bei der Vorfokussierung die Längsachse der Endfokussierungssäule horizontal liegt und bei der Bildfokussierung die Längsachse der Endfokussierungssäule eine vertikale Stellung einnimmt.