DE69024030T2 - Thermisches verfahren für flüssigkeitsgesamtbewegung bei kapillarelektrophorese. - Google Patents

Description

• Die Erfindung bezieht sich auf die Kapillar-Elektrophorese und insbesondere auf Verfahren zur schnellen Flüssigkeits-Volumen- Bewegung entweder in oder durch eine Kapillar-Elektrophoresesäule, unter Hauptbetonung der Probenladung.
Hintergrund und Zusammenfassung der Erfindung
• Die Kapillar-Elektrophorese ist eine Technik, die bei der Analyse von biologischen Geinischen, insbesondere von Gemischen kleiner Peptide, Proteine und Nukleinsäuren von beträchtlichem Interesse ist, da sie mit äußerst kleinen Probenmengen angewendet werden kann und die Verwendung hoher Spannungen erlaubt&sub1; wodurch Trennungen riit hoher Geschwindigkeit erzielt werden.
• Eines der Probleme bei der Kapillar-Elektrophorese ist das Laden der Probe, d.h. das Plazieren der Probe in das Ende der Kapillare bei der Vorbereitung der Trennung. Bisher erreichte man dies üblicherweise durch elektrophoretische, elektroendoosmotische oder Druckdifferential-Methoden (vergl. z.B. JP-A- 56-119 B42, oder J.W. Jorgenson und K. DeArman Lukacs in J. Chromatogr., 218 (1981) 209 und in Science, 222 (1983), 266).
• Beim elektrophoretischen Laden wird über eine kurze Zeitspanne eine hohe Spannung angelegt, um die Probe von einem Probenreservoir in die Kapillare zu überführen. Ziel ist es, kleine Mengen aller Spezies in der Probe über eine kurze Wegstrecke in die Kapillare zu bewegen. Sobald dies geschehen ist, wird das Probenreservcir gegen eine geignete Pufferlösung ausgetauscht, wonach mit der elektrophoretischen Trennung der geladenen Spezies fortgefahren werden kann.
• Was tatsächlich beim elektroendoosmotischen Laden geschieht, ist eine Kombination aus Elektrophorese und Elektroendoosmose, wobei die Elektroendoosmose die dominierende Wirkung hat. Die Elektroendoosmose schwankt jedoch von einem Experiment zum nächsten, wodurch Schwierigkeiten bei der Reproduzierbarkeit des Probenvolumens entstehen.
• Die Elektroendoosmose kann durch geeignete Beschichtungen der Innenseite des Kapillarrohrs unterdrückt werden, wodurch die Elektrophorese als einzige Antriebskraft der Probeninjektion übrigbleibt. Die Elektrophorese hat jedoch ihre eigenen Nachteile. Diese entstehen aus den zwangsläufig zwischen den verschiedenen Spezies in der Probe bestehenden Unterschieden in Bezug auf Verhalten gegenüber dem elektronischen Potential. Diese Unterschiede beeinflussen die Wegstrecke, die die Spezies während dem Laden in die Kapillare wandert, und somit die Menge jeder Spezies, die in die Kapillare eintritt. So wandern langsam wandernde Substanzen eine kürzere Wegstrecke in das Rohr hinein als die schneller wandernden Substanzen. Je nach Ladungsbedingungen kann sich daher die Zusammensetzung der geladenen Probe von derjenigen der ursprünglichen Probe unterscheiden.
• Weiterhin können andere Elektrophoresevariablen, wie Fluktuationen der Stromstärke, in Betracht kommen. Die Bedeutung und Wichtigkeit dieser Variablen kann schwanken.
• Bei hydraulischem Laden erfolgt die Einführung der Probe durch ein Druckdifferential über die Kapillare hinweg, entweder durch das Anlegen eines partiellen Vakuums an das Auslaßende oder eines positiven Drucks an das Einlaßende. Probleme beim hydraulischen Laden entstehen aus der beschränkten Kontrollmöglichkeit des Druckdifferentials und seiner Dauer, zweier kritischer Parameter, die zusammen das eingeführte Probenvolumen bestimmen.
• Es wurde nun gefunden, daß ein Flüssigkeits-Volumenfluß in ein Kapillarrohr hinein bei einem Elektrophoresesystem in einem sehr präzisen und reproduzierbaren Ausmaß erzielt werden kann, wenn eine kontrollierte Temperaturänderung des Inhalts des Rohrs oder eines geschlossenen Gefäßes, das in Fluidverbindung mit dem Kapillarrohr steht vorgenommen wird. Die Erfindung ist anwendbar auf die Einführung kleiner Volumina in das Rohr, z.B. zur Probenladung sowie auf die Überführung großer Volumina in oder durch das Rohr, z.B. um das Rohr mit Puffer zu spülen.
• Die Temperaturänderung kann ein Temperaturabfall oder -anstieg sein und kann zwischen jeder Ausgangs- und Endtemperatur auftreten, wodurch eine kontrollierte thermische Kontraktion oder Ausdehnung erhalten wird. Temperaturen, die zu keiner Phasenänderung des erhitzten oder abgekühlten Mediums führen, und somit eine kontinuierliche Volumenänderung bewirken, werden bevorzugt. Falls die Temperaturänderung am Kapillarrohr selbst vorgenommen wird, werden die Temperaturen zweckmäßig so gewählt, daß die Endtemperatur diejenige Temperatur ist, bei der die Trennung durchgeführt werden soll.
• So wird bei bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen eine Temperaturänderung an der Kapillare selbst bewirkt. Diese Ausführungsformen sind beim Laden der Kapillare mit einer Probe am brauchbarsten. Bei diesen Ausführungsformen wird die Kapillare mit Trennmedium gefüllt und die Temperatur der gefüllten Kapillare wird so eingestellt, wie es zur Vorbereitung einer Temperaturabsenkung nötig ist, deren Ausmaß so berechnet ist, daß eine gewählte Volumenkontraktion erfolgt. Das Ausmaß der Temperaturabsenkung wird natürlich im Zusammenhang mit der Länge der Kapillare, an der die Temperaturabsenkung angelegt wird, bestimmt, wobei diese Länge entweder die gesamte Kapillare oder ein ausgewählter Längenabschnitt sein kann.
• Sobald die Kapillartemperatur auf die Ausgangstemperatur eingestellt ist, wird das Kapillarende, in das die Probe eingeführt werden soll, in ein die Probe enthaltendes Reservoir getaucht. Die Temperatur der Kapillare oder des temperaturgeregelten Teils derselben wird dann auf die Endtemperatur abgesenkt, so daß ein Aliquot der Probe in das Kapillarende hineingezogen wird. Dann wird die Endtemperatur beibehalten, während das Reservoir gegen einen Elektrodenpuffer ausgetauscht und die Elektrophorese durchgeführt wird. Eine geeignete und genaue Auswahl der Länge des Kapillarteils&sub1; an dem die Temperaturänderung stattfindet und des Ausmaßes der Temperaturänderung ermöglicht die genaue und sehr gut reproduzierbare Kontrolle der Aliquotgröße, wobei während des Eintritts in die Kapillare keine Änderung des jeweiligen Anteils der Probenkomponenten auftritt.
• Bei anderen Ausführungsformen der Erfindung wird die Temperaturänderung an einem Kolben oder einem anderen äußeren Gefäß vorgenommen, das mit Flüssigkeit gefüllt ist und bei vollständiger Fluidverbindung mit den Kapillarinhalt mit einem Ende der Kapillare verbunden ist. Dies ermöglicht die Flüssigkeits- Volumen-Bewegung ohne Vornahme einer Temperaturänderung an der Kapillare selbst. Je nach seiner Lage kann der Kolben Flüssigkeit durch die Kapillare drücken oder ziehen, wobei dies entweder direkt oder durch zwischengeschaltete Reservoirs bewirkt wird. Die Temperaturänderung kann somit entweder ein Anstieg oder eine Absenkung sein. Die Verwendung eines Kolbens bietet weiterhin einen größeren Bereich für den Volumenfluß, da dieser nicht auf die Abmessungen der Kapillare beschränkt ist. Falls das Kolbenvolumen im Verhältnis zum Kapillarvolumen groß ist, kann das Laden der Probe mit einer sehr kleinen Temperaturänderung erzielt werden. Ein Kolben ist jedoch besonders brauchbar beim Spülen der gesamten Kapillare mit Puffer.
• Die Volumen-Bewegung der Flüssigkeit nach einem dieser Verfahren, ob nun beim Probenladen oder beim Spülen der gesamten Kapillare, kann mit dem gleichen Präzisionsgrad durchgeführt werden, wie bei einem Thermometer. Weitere erfindungsgemäße Vorteile, Nerkmale und Ausführungsformen sind aus der nach- stehenden Beschreibung ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
• Fig. 1 ist ein Diagramm eines verallgemeinerten Erfindungsansatzes, bei dem die Temperaturänderung an der Kapillare selbst vorgenommen wird.
• Fig. 2 ist eine Darstellung einer bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsform, bei der die Prinzipien von Fig. 1 angewendet werden, wobei einzelne Teile ausgeschnitten dargestellt sind.
• Fig. 3 ist ein Diagramm eines erfindungsgemäßen Systems, bei dem die Temperaturänderung an einem Kolben vorgenommen wird, der sich außerhalb des zur Trennung verwendeten Teils der Kapillare befindet.
• Fig. 4 ist ein Diagramm eines erfindungsgemäßen automatisierten Systems, bei dem ebenfalls ein temperaturgeregelten Kolben verwendet wird.
Nähere Beschreibung der Erfindung und bevorzugte Ausführungsform
• Die Erfindung funktioniert mit einer großen Zahl verschiedener elektrophoretischer Trennmedien. Es kann jedes Medium verwendet werden, das in ein Kapillarrohr gebracht werden kann, und das sich, in Abhängigkeit von der speziellen Ausführungsform, bei einer Temperaturänderung zusammenziehen oder ausdehnen kann, oder das durch ein Medium, das sich in einem dem Rohr angeschlossenen Gefäß zusammenzieht oder ausdehnt, eine Wegstrecke durch das Rohr gezogen werden kann. Die Möglichkeinen umfassen Gele und Lösungen, die allgemein wäßrig sind, wobei die Lösungen Polymerlösungen mit erhöhter Viskosität sowie einfache Pufferlösungen einschließen. Wäßrige Pufferlösungen werden bevorzugt.
• Die nachstehende Diskussion beginnt mit Ausführungsformen, bei denen die Temperaturänderung an der Kapillare selbst vorgenommen wird, gefolgt von Ausführungsformen, bei denen die Temperaturänderung an einem Kolben, der sich außerhalb der Kapillare befindet, aber in Fluidverbindung mit dem Kapillarinneren steht, vorgenommen wird.
• Bei den Ausführungsformen, bei denen die Kapillartemperatur verändert wird, ist die Kapillargröße in Bezug auf den Durchmesser und die Länge unkritisch und kann in einem weiten Bereich schwanken. In den meisten Fällen werden Kapillaren mit einem Innendurchmesser zwischen etwa 10 und etwa 200 um verwendet, vorzugsweise solche mit einem Innendurchmesser zwischen etwa 20 und etwa 100 um. Die gesamte Kapillare kann temperaturgeregelt sein, um die Übertragung zu erzielen. In den meisten Fällen ist es jedoch aufgrund der Notwendigkeit fluid-dichter Verbindungen an den Kapillarenden bequemer, die Temperaturänderung nur an einem Teil der Kapillare vorzunehmen. Bei Kapillaren mit "on-line"-Detektion kann der Detektionspunkt entweder in einem temperaturgeregeltem Bereich der Kapillare oder stromabwärts von dem temperaturgeregeltem Bereich liegen.
• Die Länge des temperaturgeregelten Bereichs kann, je nach der gewünschten Aliguot-Größe und dem bevorzugte Temperaturdifferentialbereich sowie dem Wärmeausdehnungskoeffizienten des Trennmediums stark schwanken. In den meisten Fällen werden die besten Ergebnisse bei temperaturgeregelten Abschnitten mit einer Länge von etwa 50 mm bis etwa 2000 mm, vorzugsweise etwa 100 mm bis etwa 1000 mm erzielt.
• Nach dieser Technik können Probenaliquots mit einem weiten Volumenbereich geladen werden. Dabei ist zu beachten, daß die meisten Trennungen, auf die die Erfindung angewendet wird, Aliquots mit Volumina von etwa 0,0003 bis etwa 0,03 ul, vorzugsweise etwa 0,0005 bis etwa 0,005 ul betreffen. Bei einer Kapillare mit einem Innendurchmesser von 0,05 mm würden Aliquots innerhalb dieser Bereiche etwa 0,15 bis etwa 15 mm, vorzugsweise 0,25 bis etwa 2,5 mm in die Kapillare hineinreichen.
• Die erforderliche Temperaturänderung wird einfach aus der Länge des temperaturgeregelten Bereichs, der Aliquotgröße und dem Wärmeausdehnungskoeffizienten des Trennmediums berechnet. In den meisten Fällen werden Temperaturdifferentiale von mindestens 5ºC, vorzugsweise von mindestens 10ºC, weiter bevorzugt von etwa 10 bis etwa 70ºC, und insbesondere von etwa 20 bis etwa 40ºC angewendet.
• Ein bevorzugtes Verfahren zur Durchführung der Erfindung nach diesen Ausführungsformen besteht darin, das Hineinziehen des Trennmediums durch die Temperaturabsenkung nur an einem Ende des Kapillarrohrs zu gestatten. Auf diese Weise füllt das Probenalicuot die gesamte Volumendifferenz, die sich aus der Kontraktion des Trennmediwns ergibt. Dies erleichtert die Berechnung der Temperatur und erlaubt eine bessere Kontrolle des Probenvolumens. Dies kann durch jede Technik zur Ver- oder Behinderung von Flüssigkeitsbewegung, die einem Fachmann geläufig ist, am gegenüberliegenden Ende der Kapillare erreicht werden. Eine solche Technik ist das Eintauchen des gegenüberliegenden Endes in eine Flüssigkeit mit einer höheren Viskosität als die Probenlösung, und vorzugsweise als die Probenlösung und das Trennmedium, wodurch ein größerer Strömungswiderstand an diesem Ende im Vergleich zu dem Probenlade-Ende besteht. Eine Lösung eines Polymers, wie zum Beispiel Methylcellulose, kann wirkungsvoll als hochviskose Flüssigkeit dienen. Alternativ kann das Rohrende mit einer Dialysemembran oder einem Gelstopfen verschlossen werden.
• Die Temperatursenkung kann auf jede herkömmliche Weise erreicht werden, wobei die verschiedenen Möglichkeiten einem Fachmann geläufig sind. Das Eintauchen der Kapillare in, oder das Umstömen des Äußeren mit einer Kühlflüssigkeit geeigneter Temperatur ist einer der bequemsten Wege, dieses Ergebnis zu erzielen. Es eröffnet den weiteren Vorteil einer ständigen Temperaturregelung in der Kapillare. Da die elektrophoretischen Wandergeschwindigkeiten bis zu 2,5% je 1ºC Temperaturänderung schwanken können, kann eine genaue Regelung der Temperatur die Reproduzierbarkeit des Versuchs wesentlich erhöhen. Ein kontinuierliches Abkühlen des Kapillarrohrs ermöglicht weiterhin die Anwendung höherer Spannungen und somit kürzere Laufzeiten, eines der attraktivsten Merkmale der Kapillar-Elektrophorese.
• Sobald das Probenaliquot auf die Kapillarsäule geladen ist, wird das Probenreservoir entfernt und zur Elektrophorese gegen eine geeignete Pufferlösung ausgetauscht. Es ist darauf zu achten, daß während dieses Austauschs das Aliquot nicht aus der Kapillare verloren geht. Dies kann dadurch erreicht werden, daß die Temperatur der Kapillare auf der zum Laden verwendeten Temperatur gehalten wird, so daß keine Ausdehnung oder Kontraktion des Trennmediums stattfindet. Die Systemkomponenten können weiterhin mit geeigneten Kanälen und Ventilanordnungen zwischen verschiedenen Fluidreservoiren ausgebildet sein, so daß der Austausch ohne Trennung irgendwelcher Teile erfolgen kann.
• In Fig. 1, ist eine Skizze eines etwas einfachen Systems zur Veranschaulichung der allgemeinen erfindungsgemäßen Konzepte dargestellt. Eine Kapillarrohr aus Quarzglas 11 ist um einen Trägerstab 12 gewickelt, der sich in einer Wanne 13 befindet, die mit einer Wärmeübertragungsflüssigkeit mit einer geregelten Temperatur gefüllt ist. Die zwei Enden 14 und 15 der Kapillare erstrecken sich außerhalb der Wanne 13 bis in die äußeren Reservoire 16, 17.
• Zum Laden der Probe werden gefüllt: die Kapillare 11 über ihre gesamte Länge mit dem Trennmedium, das Reservoir 17 auf der Auslaßseite mit einer Pufferlösung, vorzugsweise einer Lösung mit einem viskositätserhöhenden gelösten Stoff, wie Methylcellulose, und das Reservoir 16 auf der Einlaßseite mit der Probenlösung. Die freiliegenden Enden 18, 19 der Kapillare werden in die entsprechenden Lösungen eingetaucht. Alle Medien, einschließlich des Wärmeübertragungsmediums in der Wanne und der Lösungen in jedem der zwei Reservoirs befinden sich auf einer Ausgangstemperatur. Bei dieser Anordnung der Medien wird die Probe geladen, indem die Wärmeübertragungsflüssigkeit gegen ein kälteres Wärmeübertragungsmedium ausgetauscht wird, wobei der Temperaturunterschied auf Grundlage der sich in der Wanne befindenden Kapillilarlänge, des Kapillardurchmessers und des Wärmeausdehnungskoeff izienten des Trennmediums in der Kapillare so gewählt wird, daß die gewünschte Volumenkontraktion des Trennmediums erzielt wird, wodurch das gleiche Volumen aus dem Reservoir auf der Einlaßseite gezogen wird.
• Sobald sich das System im Gleichgewicht befindet, wird die Probenlösung in dem Reservoir auf der Einlaßseite gegen den Puffer ausgetauscht, und die Elektrophorese wird fortgesetzt, während sich das kalte Wärmeübertragungsmedium weiterhin in der Wanne 13 befindet. Die Detektion erfolgt bei dieser Ausführungsform durch einen Ultraviolett-Strahl 20, der an einem Punkt außerhalb der Kühlwanne 13 auf der dem Probeneinführungsende gegenüberliegenden Seite durch die Kapillare tritt. Andere herkömmliche Detektionssverfahren, zum Beispiel Fluoreszenz, können ebenfalls angewendet werden.
• Die in Fig. 2 dargestellte Ausführungsform enthält eine Kartusche 30, die die Kapillare 31 umgibt und als Mantel oder Umhüllung für den Durchtritt der Wärmeübertragungsflüssigkeit dient. Die Einlaß- und Austrittsanschlüsse 32, 33 für die Wärmeübertragungsflüssigkeit erlauben die kontinuierliche Zirkulation der Flüssigkeit außen um die Kapillare. Eine innere Ablenkplatte 34 lenkt die Flüssigkeitsbewegung. Die Kapillarenden sind als kegelförmige Einlaß- und Austrittsanschlüsse 35, 36 ausgebildet, die eine Verbindung des Äußeren der Kapillare mit dem Äußeren der Kartusche ergeben. Diese kegelförmigen Anschlüsse passen zu ähnlich geformten Anschlüssen 37, 38, 39 in den Flüssigkeitsreservoirblöcken, wodurch eine Druckabdichtung gebildet wird, wenn die Teile in einem geeigneten Trägerblock miteinander verbunden werden.
• Die Probenlösung und die Pufferlösung, die die Probenlösung ersetzt, können sich, wie in der Zeichnung dargestellt, in verschiedenen Blöcken 40, 41 befinden, oder in getrennten Abteilen zu einem einzigen Block verbunden sein, wobei die Verbindungen durch manuell oder automatisch betriebene Ventile geregelt werden. Alternativ kann die Auswahl zwischen Probenlösung und Elektrodenpuffer von einem zeitgesteuerten Spülmechanismus geregelt sein. Ein Austrittsblock 42 enthält die am Austrittsende der Kapillare verwendete Pufferlösung. Die Elektrodenverbindungen 44, 43 sind bei jedem Block dargestellt. Die Detektion erfolgt mit einem Ultraviolettstrahl, der durch ein Fenster 46 tritt, das an einem Punkt nahe am Austrittsanschluß 38 zu der Kapillare ausgerichtet ist.
• Fig. 3 bietet eine verallgemeinerte Darstellung der Ausführungsformen, bei denen das Temperaturdifferential an einen Kolben stromabwärts von der Kapillare angelegt wird. Bei dieser Anordnung findet die elektrophoretische Trennung der Proben in einem Teil 51 der Kapillare statt, der rechts vom Kolben 52 dargestellt ist. Die Probe wird am rechten Kapillarende 53 eingeführt, und die Probenkomponenten wandern während der Elektrophorese nach links, in die durch den Pfeil 54 angezeigte Richtung. Die getrennten Probenkomponenten werden von einem Detektionsstrahl 56, z.B. einem Ultraviolett-Lichtstrahl detektiert, während sie durch einen Detektionspunkt 55 treten. Der Kolben 52 ist eingeschlossen oder eingetaucht in einen Mantel oder ein Kühlgefäß 57 mit Einlaß- und Austrittsanschlüssen 58, 59, wodurch ein kontinuierlicher Fluß der Wärmeübertragungsflüssigkeit ermöglicht wird. Es sind mit den Elektroden 62, 63 ausgestattete Pufferreservoirs 60, 61 und ein Probenreservoir 64 zum Probenladen vorgesehen, wobei das Probenreservoir gegen eines der Pufferreservoirs 61 ausgetauscht werden kann, sobalc die Probe geladen ist. In der Figur sind die Teile zum Probenladen angeordnet. Alternativ zur dargestellten Anordnung kann die linke Elektrode 62 nicht in ein getrenntes Reservoir, sondern in den Kolben 52 gesetzt werden.
• Bei dieser Ausführungsform sind das Kolbenvolumen, das Temperaturdifferential und der Wärmeausdehnungskoeffizient des Kolbeninhalts die Parameter, die die Flüssigkeitsmenge bestimmen, die durch das angelegte Temperaturdifferential in die Kapillare gezogen wird. Der Kolbeninhalt kann das gleiche Medium sein, wie es in dem zur Trennung verwendeten Teil 51 der Kapillare vorliegt, oder beide können unterschiedlich sein. Am bequemsten wird ein Kolben verwendet, der mit dem gleichen Trennmedium wie die Kapillare gefüllt ist. Bei der dargestellten Anordnung wird an beiden Seiten des Kolbens Flüssigkeit eingezogen. Das System kann jedoch, wie bei den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen, so angepaßt werden, daß nur auf der rechten Seite Flüssigkeit durch die Kapillare gezogen wird. Die vorstehend angegebenen Beispiele gelten hier auch, d.h. es wird eine hochviskose Flüssigkeit im linken Pufferreservoir 60, oder eine Dialysemembran oder ein Gelstopfen auf der linken Seite des Kolbens verwendet. In jedem Fall muß der Kolben mit dem thermisch kontrahierbaren Medium gefüllt sein.
• Unter Berücksichtigung dieser Betrachtungen ist die Volumenkapazität des Kolbens unkritisch und kann stark schwanken. Bei den meisten Anwendungen ist davon auszugehen, daß das Kolbenvolumen im Bereich zwischen etwa 1 ml und etwa 100 ml liegt.
• Die Temperaturänderung wird durch die Änderung der Temperatur der Wärmeübertragungsflüssigkeit, die durch den den Kolben umgebenden Mantel 57 fließt, bewirkt. Das Ausmaß der Änderung wird natürlich je nach der Flüssigkeitsmenge, die in oder durch den zur Trennung verwendeten Teil 51 der Kapillare gezogen werden soll, gewählt. Zum Laden einer Probe in die Kapillare ist somit eine geringe Temperaturänderung ausreichend, während zum Spülen des gesamten zur Trennung verwendeten Teils der Kapillare mit Pufferlösung eine größere Temperaturänderung vorgenommen werden kann.
• Bei weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann gleichzeitig ein temperaturgeregelter Kolben und eine temperaturgeregelte Kapillare verwendet werden, wodurch sich eine größere Flexibilität bei den verschiedenen durchzuführenden Prozeduren ergibt und eine wirkungsvolle kontinuierliche Temperaturregelung der Kapillare erreicht wird.
• Das in den Ausführungsformen mit Kolben verkörperte Prinzip kann auf verschiedene Systeme angewendet werden. Die Erfindung ist besonders vorteilhaft bei automatisierten Systemen, die auf eine Reihe von sequentiell durchgeführten Trennungen ausgelegt sind.
• Ein Beispiel eines solchen Systems ist schematisch in Figur 4 dargestellt. Wie bei dem in Figur 3 beschriebenen System erfolgt die elektrophoretische Trennung in einer Kapillare 70, und die Flüssigkeits-Volumen-Bewegung innerhalb der Kapillare wird von einem ummantelten Kolben 71 geregelt.
• An dem gegenüberliegenden Ende der Kapillare 70 befindet sich eine Karussell 72, das Vertiefungen 73 für Proben und Puffer enthält. Bei der in der Figur dargestellten Aufsicht des Karussells wechseln die Vertiefungen zwischen großen Vertiefungen 74 für Puffer und kleinen Vertiefungen 75 für Proben. Die Karusselloberfläche ist aus einem nicht benetzbaren Material, wie Teflon, wodurch, wenn die Vertiefungen überfüllt sind, die Probe und der Puffer über der Karusselloberfläche Perlen bilden können. Wenn Proben mit sehr geringem Volumen verwendet werden, kann das Karussell in einen Laborabzug oder eine andere Kammer gestellt werden, um eine wasserdampfgesättigte Atmosphäre aufrecht zu erhalten, wodurch eine Verminderung der Perlengröße durch Verdampfung verhindert wird.
• Kapillare und Karussell werden so zueinander angeordnet, daß das offene Ende 76 der Kapillare in die Perle taucht, die zu jedem bestimmten Zeitpunkt mit der Kapillare ausgerichtet ist. Die Elektroden 77, 78 werden in geeigneter Weise angeordnet, wobei eine der Elektroden 77 mit den Pufferreservoirs zugeordnet ist, jedoch nicht notwendigerweise in direktem Kontakt dazu steht. Flußrichtung der Probe während der Elektrophorese verläuft bei dieser Anordnung, wie durch den Pfeil 79 angezeigt, nach rechts, und die Detektion kann "on- line" durchgeführt werden. Andere Anordnungen dieser Elemente, die die gleiche Funktion erfüllen, ergeben sich für einen Fachmann ohne weiteres.
• Zur Betriebsvorbereitung werden die Kapillare 70 und der Kolben 71 unter Verwendung herkömmlicher Vorrichtungen, wie einer Kanüle, vollständig mit Puffer gefüllt, und die Vertiefungen des Karussells werden abwechselnd mit Probe und Puffer in ausreichenden Mengen gefüllt, so daß sich oberhalb der Karusselloberfläche Perlen bilden. Das Karussell wird dann auf eine Position gedreht, in der die Kapillare mit einer Probenperle in Kontakt gebracht wird, worauf bei geschlossenem Abschlußventil 81 auf der gegenüberliegenden Seite des Kolbens eine geringe Temperatursenkung am Kolben vorgenommen wird, wodurch ein kleines Probenvolumen in das offene Ende 76 der Kapillare gezogen wird. Während der Kolben auf die Temperatur, auf die er abgesenkt worden ist, gehalten wird, wird das Karussell so gedreht, daß eine Perle der Pufferlösung über einer der größeren Puffervertiefungen 74 in Kontakt mit dem Kapillarende gebracht wird, worauf zur Durchführung der Elektrophorese ein elektrisches Potential zwischen den Elektroden angelegt wird.
• Nach Beendigung der Elektrophorese kann die Kapillare für die nächste Probe vorbereitet werden, indem die Temperatur des Kolbens 71 wiederum gesenkt wird, diesmal so stark, daß genügend Puffer durch die Kapillare gezogen wird und diese vollständig durchgespült wird. Das Karussell wird dann zu der nächsten Probenvertiefung gedreht, und der gesamte Ablauf wird wiederholt. Die Kolbentemperatur kann jederzeit angehoben werden, ohne daß der Inhalt der Kapillare gestört wird, indem das äußere Abschlußventil 81 geöffnet wird, um den Austritt von Flüssigkeit Zu ermöglichen, während ein inneres Abschlußventil 82 geschlossen ist. Es ist leicht ersichtlich, daß ein Durchspülen der Kapillare außerdem durch Erhöhen der Kolbentemperatur erfolgen kann, wodurch Pufferlösung in entgegengesetzter Richtung durch die Kapillare gedrückt wird.
• Die vorliegende Erfindung ist auf den gesamten Bereich elektrophoretischer Trennungsarten anwendbar, die in Kapillarrohren durchgeführt werden können. Beispiele solcher Arten sind die einfache Elektrophorese, die diskontinuierliche Elektrophorese, die Verdrängungs(displacement)-Elektrophorese und die isoelektrische Fokussierung.
• Das folgende Beispiel dient der Veranschaulichung und soll die Erfindung in keiner Weise begrenzen oder beschränken.
Beispiel
• Es wurde eine Vorrichtung zusammengebaut, die allgemein der von Figur 1 entsprach. Die Kapillare war ein Quarzglasrohr mit einer Gesamtlänge von 210 mm und einer gekühlten Länge von 140 mm. Der Innendurchmesser betrug 0,05 mm. Es wurde eine Pufferlösung bestehend aus 0,1 M Tris-Essigsäure, pH 8,6, verwendet. Die Probe war eine Lösung von 3,4-Dimethoxybenzoesäure, hergestellt durch Lösen von 1 mg 3,4-Dimethoxybenzoesäure in 1 ml Puffer und anschließende Verdünnung mit Wasser im Verhältnis 1:10.
• Es wurden gefüllt: das Kapillarrohr mit der Pufferlösung, die Wanne mit Wasser bei Raumtemperatur (20ºC), und das rechte Elektrodengefäß mit der Pufferlösung, die zusätzlich 0,1% Methylcelluloselösung enthielt. Das linke Elektrodengefäß wurde mit der Probenlösung gefüllt. Das Wasser in der Wanne wurde dann gegen Eiswasser (0ºC) ausgetauscht, wodurch die Probe rasch bis zu einer Länge von 0,5 mm in das Rohr gezogen wurde. Die Probenlösung in der linken Elektrode wurde dann gegen Puffer ausgetauscht, worauf die Elektrophorese fortgesetzt wurde.
• Bei Verwendung der vorstehend beschriebenen Rohre und Lösungen sind die berechneten Längen der probenbeladenen Teile bei vorgegebenen Temperaturabsenkungen und Längen der gekühlten Kapillarbereiche wie folgt: Berechnete Länge des probenbeladenen Bereichs Gekühlte Kapillarlänge (mm) Temparaturabsenkung (ºC) Länge der Probenzone (mm)
• Das Vorstehende dient in erster Linie der Veranschaulichung. Es für den Fachmann leicht erkennbar, daß bei den hier beschriebenen Materialien und Prozeduren zahlreiche Variationen, Modifikationen und Substitutionen vorgenommen werden können, ohne daß der Rahmen der Erfindung verlassen wird.

Claims (10)

1. Verfahren zum Einführen eines bestimmten Flüssigkeitsvolumens in ein Kapillarrohr in einem kapillar-elektrophoretischen System, wobei das Kapillarrohr mit einem elektrophoretischen Trennmedium gefüllt wird, wobei das Verfahren (folgende Schritte) umfaßt:

a) Anordnung des Kapillarrohres, so daß ein Ende des Kapillarrohres sich in einen Vorrat der Flüssigkeit öffnet und

b) bei dieser Anordnung des Kapillarrohres, Änderung der Temperatur eines mit einem fluidem Medium gefüllten Gefäßes in Fluidverbindung mit dem Kapillarrohr durch ein vorgewähltes Temperaturdifferential, wobei das fluide Medium volumetrisch auf die Temperatur anspricht und auf diese Weise bewirkt, daß ein Teil der Flüssigkeit in das Kapillarrohr überführt wird, wobei die Größe des Temperaturdifferentials und das Volumen des Gefäßes so gewählt sind, daß die so überführte Flüssigkeitsmenge gleich dem bestimmten Volumen ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Gefäß ein Teil des Kapillarrohres ist und das fluide Medium der Teil des elektrophoretischen Trennmediums in dem Teil des Kapillarrohres ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Gefäß ein Teil des Kapillarrohres ist und der Schritt (b) die Erniedrigung der Temperatur um etwa 10 bis etwa 70ºC umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Gefäß ein Teil des Kapillarrohres ist und eine Länge von etwa 50 mm bis etwa 2000 mm hat und das Kapillarrohr einen Innendurchmesser von etwa 20 bis etwa 100 um hat.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Gefäß ein Teil des Kapillarrohres ist und das Temperaturdifferential und die Länge dieses Teils des Kapillarrohres so gewählt sind, daß das bestimmte Volumen etwa 0,0005 bis etwa 0,005 ul beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Gefäß ein Teil des Kapillarrohres ist und das Ende des Kapillarrohres, das sich in der Stufe (a) in die Flüssigkeit öffnet, als Einlaßende und das gegenüberliegende Ende des Kapillarrohres als Austrittsende definiert ist, und daß während der Dauer der Stufe (b) das Austrittsende in ein äußeres flüssiges Medium mit einer höheren Viskosität als das Trennmedium eingetaucht wird, die ausreicht, um jede Neigung das äußere flüssige Medium infolge der Erniedrigung der Temperatur in das Kapillarrohr am Austrittsende zu ziehen, zu unterdrücken.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin das elektrophoretische Trennmedium eine Flüssigkeit ist.

8. Verfahren zum Einbringen eines bestimmten Volumens einer Flüssigkeitsprobe in das Einlaßende eines Kapillarrohres mit Einlaß- und Austrittsende und einem Innendurchmesser von etwa 20 bis etwa 100 um, wobei das Kapillarrohr mit einem Trennmedium gefüllt ist, zum Zwecke einer elektrophoretischen Trennung, wobei das Verfahren (folgende Schritte) umfaßt:

(a) Eintauchen des Einlaßendes in einen Vorrat der flüssigen Probe und Eintauchen des Austrittsendes in ein äußeres flüssiges Medium mit wesentlich höherer Viskosität als die flüssige Probe und das Trennmedium; und

(b) Leiten eines flüssigen Wärmeaustauschmediums über das Äußere eines mittleren Teils des Kapillarrohres mit einer Länge von etwa 100 bis etwa 1000 mm, wobei das Einlaßende und das Austrittsende so eingetaucht sind, daß die Temperatur des mittleren Teils über einen vorgewählten Temperaturabfall erniedrigt wird, wodurch eine Kontraktion des flüssigen Trennmediums bewirkt wird; Einziehen eines Teils der flüssigen Probe in das Kapillarrohr am Einlaßende, wobei der vorgewählte Temperaturabfall und die Länge des mittleren Teils des Kapillarrohres so gewählt sind, daß die in das Kapillarrohr eingezogene Flüssigkeitsprobe gleich dem bestimmten Volumen ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Gefäß ein mit dem Kapillarrohr verbundener Kolben ist und das Volumen des Kolbens und die Größe des Temperaturdifferentials so gewählt werden, daß das bestimmte Volumen mindestens gleich dem Volumen des Kapillarrohres ist.

10. Verfahren zum Trennen eines Gemisches von Spezies in einer flüssigen Lösung, in Komponenten in einem Kapillarrohr mit Einlaß- und Austrittsende, das bei einer Ausgangstemperatur mit einem Trennmedium gefüllt wird, wobei das Verfahren (folgende Schritte) umfaßt:

(a) Eintauchen des Einlaßendes des Kapillarrohres in einen Vorrat der flüssigen Lösung;

(b) Erniedrigen der Temperatur mindestens eines Teils des Kapillarrohres unter die Ausgangstemperatur um ein vorgewähltes Temperaturdifferential, wobei das Einlaßende so eingetaucht wird, daß das Trennmedium kontrahiert wird und auf diese Weise ein Teil der flüssigen Lösung in das Einlaßende der Kapillare gezogen wird;

(c) Entfernen des Eintrittsendes des Kapillarrohres aus dem Vorrat der flüssigen Lösung; und

(d) Anlegen eines elektrischen Potentials über das Kapillarrohr, um eine Elektrophoreses der auf diese Weise in das Eintrittsende gezogenen flüssigen Lösung zu bewirken.