DE69321110T2

DE69321110T2 - Verfahren zur Herstellung einer Kapillarrohres, Kapillarrohr für eine Elektrophoresevorrichtung und Elektrophoresevorrichtung mit einem solchen Kapillarrohr

Info

Publication number: DE69321110T2
Application number: DE69321110T
Authority: DE
Inventors: Wolfgang D-66280 Sulzbach Beck; Christian D-76337 Waldbronn Buettner
Original assignee: Hewlett Packard GmbH Germany
Current assignee: Agilent Technologies Deutschland GmbH
Priority date: 1993-07-12
Filing date: 1993-07-12
Publication date: 1999-03-04
Anticipated expiration: 2013-07-13
Also published as: EP0634651B1; US6258238B1; JPH0755771A; EP0634651A1; DE69321110D1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung handelt von einem Verfahren zur Herstellung eines Kapillarrohres für die Elektrophorese und von einem Kapillarrohr des Typs, der der Verwendung als Elektrophoresevorrichtung angepaßt ist.

Hintergrund der Erfindung

Es gibt verschiedene Methoden zur schnellen und genauen Identifizierung kleiner Mengen organischer oder anorganischer Substanzen. Wenn solche Substanzen, deren molekulare Struktur vergleichbar klein ist, nachgewiesen werden müssen, werden dafür seit Jahren Gaschromatographen und Flüssigkeitschromatographen benutzt. Obwohl sich die Chromatographie für die Bestimmung von sowohl metallischen und anorganischen Gemischen als auch von kleinen organischen Ionen als erfolgreicher Ansatz gezeigt hat, ist diese zur Bestimmung eines Bestandteils einer Probe verwendete Technik nicht geeignet, große und komplexe Moleküle wie Aminosäuren, Proteine und DNS zu bestimmen.
Daher ist seit einigen Jahren mit großem Erfolg eine andere Analysemethode angewandt worden, die Elektrophorese genannt wird. Diese Methode umfaßt den Schritt, über die Länge eines Kapillarrohres, das ein Gemisch einer unbekannten Probe und einer nicht-reaktiven Flüssigkeit, das als Probenlösung bezeichnet wird, enthält, ein elektrisches Feld anzulegen. Das elektrische Feld veranlaßt die Bestandteile der unbekannten Probe aufgrund der durch das elektrische Feld verursachten elektrischen Anziehung durch das Kapillarrohr zu wandern. Unterschiedliche Bestandteile innerhalb der Probe werden aufgrund ihrer unterschiedlichen molekularen Eigenschaften (molekulare Beweglichkeit) und unterschiedlichen elektrischen Ladungen mit unterschiedlicher Stärke angezogen. Damit werden die Substanzen während ihrer Fortbewegung entlang des Kapillarrohres zunehmend in deutliche Gebiete oder Gruppen getrennt. Jede Bande von Bestandteilen, aus denen das ursprüngliche, nicht getrennte Gemisch aus unbekanntem Probenmaterial besteht, wandert durch das Kapillarrohr. An einem Punkt entlang des Kapillarrohres wird die Bande mit einem Detektor untersucht und bestimmt. Ein typischer Detektor bei der Elektrophoresetrennung mißt die elektrische Leitfähigkeit der Banden in dem Kapillarrohr. Eine alternative Nachweismethode verwendet die Fluoreszenz, zum Beispiel laserinduzierte Fluoreszenz. Obwohl diese Methode vergleichsweise empfindlich ist, ist sie kostspielig und auf bestimmte Gemische beschränkt, die zur Fluoreszenz angeregt werden können.
In anderen Elektrophoresesystemen wird ein optisches Nachweisverfahren benutzt, das den Schritt der Messung der Lichtabsorption umfaßt, die von jenen Banden verursacht wird, die über die Elektrophoresestrecke voneinander getrennt werden. In konventionellen Elektrophoresevorrichtungen ist die Empfindlichkeit dieser Art des optischen Nachweises nur sehr niedrig aufgrund des kurzen Weges, den das Licht durch das Innere des Kapillarrohres zurücklegt. Eine Vergrößerung des inneren Durchmessers des Kapillarrohres ist jedoch nicht von Vorteil, da ansonsten Turbulenzen und Strömungswirbel auftreten können, wodurch die durch die Elektrophorese herbeigeführte Trennung der Bestandteile zunichte gemacht würde.
Jedoch bringen solche bekannte Elektrophoresesysteme mit Kapillarrohren, die auf ihrer gesamten Länge einen gleichförmigen inneren und äußeren Durchmesser besitzen, auch andere Probleme mit sich. Wenn das Kapillarrohr vollständig gefüllt ist, fällt die an die Enden des Kapillarrohres angelegte Spannung gleichförmig über das gesamte Kapillarrohr ab. Der Teil der Spannung, der zu einer Trennung der Substanzen der Probe führt, ist nur der Teil, der entlang der Trennungstrecke zwischen der Probenzufuhr oder eher dem Einlaß des Kapillarrohres und dem Detektor abfällt. Der restliche Spannungsabfall zwischen dem Detektor und dem Auslaß des Kapillarrohres trägt in keinster Weise zur Trennung bei und verursacht lediglich Verluste. Daraus folgt, daß in Verbindung mit solchen Systemen normalerweise vergleichsweise komplizierte und kostspielige Maßnahmen ergriffen werden, um die kürzestmögliche Länge des Kapillarrohres zwischen dem Detektor und dem Auslaßende des Kapillarrohres zu erhalten.
Ein zusätzliches Problem dieses Verfahrens liegt in der Tatsache, daß der Vorteil eines Innendurchmessers des Kapillarrohres, der so klein wie möglich ist, nämlich eines geringen Leistungsverlustes in Verbindung mit einer hohen Massenselektivität, nur um den Preis eines Verlustes an Nachweisempfindlichkeit erreicht werden kann.
Patent US-A-5,061,361 veröffentlicht erstmalig ein Elektrophoresesystem, in dem hohe Massenselektivität und geringer Leistungsverlust erreicht werden können, ohne daß man sich mit einer niedrigen Nachweisempfindlichkeit abfinden müßte. In dem Elektrophoresesystem gemäß Patent US-A-5,061,361 hat das Kapillarrohr zumindest im Bereich der Detektorvorrichtung einen vergrößerten Innendurchmesser, so daß man eine längere effektive Nachweisstrecke des Lichtes zwischen Lichtquelle und dem Sensor der Detektorvorrichtung durch die Flüssigkeit erhält, die die nachzuweisenden Bestandteile enthält, ohne eine Notwendigkeit, den Innendurchmesser des restlichen Teils des Kapillarrohres zu vergrößern. Patent US-A-5,061,361 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Kapillarrohres dieses Typs, das die Schritte umfaßt, das Kapillarrohr, das anfangs einen konstanten Außendurchmesser und einen konstanten Innendurchmesser besitzt, auf dessen einer Seite zu schließen und in dessen Innerem einen niederen Druck anzulegen, worauf das Kapillarrohr lokal geheizt und gleichzeitig in Rotation versetzt wird, so daß sich eine lokale Gasblase formiert, die im Bereich der Detektorvorrichtung angeordnet werden muß. Dieses Herstellungsverfahren, das auf dem Prinzip der Glasbläserei basiert, ist vergleichsweise kompliziert. Aufgrund der Vergrößerung des Außendurchmessers des Kapillarrohres im Bereich der Blase ist es nicht möglich, ein derart modifiziertes Kapillarrohr als Ersatzfürein Standard-Kapillarrohr in kommerziell erhältlichen Kapillarrohrelektrophoresevorrichtungen zu verwenden.
Aus Patent EP-A-0 423 999 ist eine Methode bekannt, eine konisch zulaufende Form des Endes der Öffnung im Kapillarrohr zu bilden. Die bekannte Methode wird insbesondere zu Herstellung von Verbindungen und Kupplungen für Kapillarrohre verwendet. Entsprechend dem bekannten Verfahren fließt ein gasförmiges Ätzmittel durch das Innere des Kapillarrohres und strömt an einem ersten Ende der Röhre aus, welches dann geheizt wird, um einen longitudinalen Temperaturgradienten zu erzeugen. Das gasförmige Ätzmittel reagiert mit dem Rohr und vergrößert diesen Teil des Inneren des Kapillarrohres an dem ersten Ende.

Zusammenfassung der Erfindung

Eine Absicht der vorliegenden Erfindung ist es, ein vereinfachtes Verfahren zur Herstellung eines Elektrophoresekapillarrohres bereitzustellen, dessen Innendurchmesser auf seiner ganzen Länge variiert werden kann.
Eine weitere Absicht der vorliegenden Erfindung ist es, ein Kapillarrohr zur Trennung bereitzustellen, das angepaßt ist, für Elektrophoresevorrichtungen verwendet zu werden und das, obwohl es einen geringen Leistungsverlust besitzt, eine hohe Nachweisempfindlichkeit in Verbindung mit einer guten Trennleistung ermöglicht.
Eine weitere Absicht der vorliegenden Erfindung ist es, ein Kapillarrohr bereitzustellen, das dafür ausgelegt ist, in existierenden Elektrophoresevorrichtungen als ein Ersatz für Standardkapillarrohre mit einem unveränderlichen inneren Durchmesser eingesetzt zu werden, um dadurch die Nachweisempfindlichkeit solcher existierender Elektrophoresevorrichtungen zu erhöhen.
Schließlich ist es eine Absicht der vorliegenden Erfindung, eine Elektrophoresevorrichtung bereitzustellen, die eine hohe Nachweisempfindlichkeit in Kombination mit einem geringen Leistungsverlust und einer hohen Massentrennung besitzt.
In Übereinstimmung mit einem ersten Aspekt der Erfindung wird diese Absicht durch ein Verfahren zur Herstellung eines Kapillarrohres für die elektrophoretische Trennung erreicht, das einen ersten Kapillarrohrbereich umfaßt, der einen ersten Innendurchmesser besitzt und einen zweiten Kapillarrohrbereich, der einen zweiten Innendurchmesser besitzt, der im Vergleich zum dem ersten inneren Durchmesser vergrößert ist und als Nachweisbereich für in diesem Kapillarrohr getrennte Substanzen dient, wobei die Methode den Schritt zur Bereitstellung eines Kapillarrohres umfaßt, das über die gesamte Länge einen im wesentlichen gleichförmigen Innendurchmesser besitzt und welches eine äußere Beschichtung umfaßt, wobei das Verfahren charakterisiert wird durch die folgenden Schritte:
- Einführung eines Ätzmittels in das Innere des Kapillarrohres, mittels dessen das Material des Kapillarrohres abgeätzt werden kann,
- Erzeugung eines Temperaturgradienten über das Kapillarrohr derart, daß die Temperatur des zweiten Kapillarrohrabschnittes höher ist als die Temperatur des ersten Kapillarrohrabschnittes und
- Durchführung des Ätzvorganges bis der zweite Kapillarrohrabschnitt den gewünschten Innendurchmesser besitzt und die äußere Beschichtung intakt bleibt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt derVerfahrensschritt zur Durchführung des Ätzvorganges die Maßnahme, das Ätzmittel durch das Kapillarrohr fließen zu lassen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Verfahrensschritt zur Erzeugung des Temperaturgradienten die folgenden Schritte:
- Einführen eines der beiden Kapillarrohrabschnitte des Kapillarrohres in einen Schlauch,
- Einführen des anderen Kapillarrohrabschnittes in ein Bad, das eine vorbestimmte Temperatur besitzt,
- Durchleiten eines Mediums durch den Schlauch, dessen Temperatur sich von der des Bades unterscheidet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Bad ein Eiswasser-Bad, und das den Schlauch passierende Medium ist Wasserdampf.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das durch das Kapillarrohr fließende Ätzmittel mit Überdruck in das Kapillarrohr eingeleitet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das Kapillarrohr aus Quarzglas und das Ätzmittel ist Flußsäure (HF).
In Übereinstimmung mit einem zweiten Aspekt der Erfindung wird diese Absicht mit einem Trennkapillarrohr mit einer äußeren Beschichtung zur Verwendung in einer elektrophoretischen Vorrichtung erreicht, das umfaßt:
einen ersten Kapillarrohrabschnitt, der einen ersten Innendurchmesser besitzt und einen zweiten Kapillarrohrabschnitt, der einen zweiten Innendurchmesser besitzt, der im Vergleich zu dem ersten inneren Durchmesser vergrößert ist und als Nachweisbereich für die in dem Kapillarrohr getrennten Substanzen dient, wobei der erste Innendurchmesser stetig und ohne irgendwelche Stufen in den zweiten Innendurchmesser übergeht, wobei das Kapillarrohr dadurch charakterisiert ist, daß der erste und zweite Kapillarrohrabschnitt zumindest in deren Übergangsbereich denselben Außendurchmesser besitzen, der zweite Kapillarrohrabschnitt sich von der Übergangsregion zum ersten Kapillarrohrabschnitt bis zum an der Austrittsseite befindlichen Ende des Kapillarrohres erstreckt.
In Übereinstimmung mit einem dritten Aspekt der Erfindung wird diese Absicht durch eine Elektrophoresevorrichtung für den Nachweis zumindest eines Bestandteils einer Probe erreicht, welche ein Trennkapillarrohr mit einer äußeren Beschichtung umfaßt, in Übereinstimmung mit dem oben erwähnten zweiten Aspekt der Erfindung und
- ein Einlaß-Reservoir, von dem aus sich der erste Kapillarrohrabschnitt des Kapillarrohres erstreckt,
- ein Austritts-Reservoir, zu dem hin und in das hinein sich der zweite Kapillarrohrabschnitt des Kapillarrohres erstreckt, ein Generator zur Erzeugung eines elektrischen Feldes zwischen einer Pufferlösung im Einlaß-Reservoir und einer Pufferlösung im Austritts-Reservoir; und
- eine Nachweisvorrichtung, eine Lichtquelle und einen Lichtsensor umfassend, die am zweiten Kapillarrohrabschnitt des Kapillarrohres angeordnet sind, um den zumindest einen Bestandteil der Probe nachzuweisen.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kann die Nachweisvorrichtung entweder eine Absorptions-Nachweisvorrichtung oder eine Fluoreszenz = Nachweisvorrichtung sein.

Beschreibung der Zeichnungen

Abb. 1 zeigt eine Querschnittsdarstellung einer Vorrichtung zur Herstellung eines Kapillarrohres gemäß der vorliegenden Erfindung;
Abb. 2 zeigt einen Schnitt durch einen Unterabschnitt einer Ausführungsform des Kapillarrohres gemäß der vorliegenden Erfindung;
Abb. 3 zeigt einen Schnitt durch einen Schlauch und ein Kapillarrohr;
Abb. 4 zeigt einen Schnitt durch einen Abschnitt einer zusätzlichen Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung;
Abb. 5 zeigt eine schematische Darstellung eines Elektrophoresesystems des Kapillarrohr-Typs; und
Abb. 6 zeigt eine Darstellung eines Details des in der Vorrichtung gemäß Abb. 5 verwendeten Kapillarrohres zur Erklärung der Anordnung des Kapillarrohres relativ zur Nachweisvorrichtung als auch seine innere Form bis zum Austrittsende.
Die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, die in Abb. 1 gezeigt ist, wird für das Abätzen des inneren Bereiches eines Kapillarrohres 1, das aus einem Quarzkapillarrohr besteht, in einem kontrollierten Vorgang verwendet. In der gezeigten Ausführungsform hat das Quarzkapillarrohr eine Länge von 80 cm, einen Außendurchmesser von 360 um und einen Innendurchmesser von 50 um. Wie man an dem bearbeiteten Kapillarrohr in Abb. 2 erkennen kann, zielt das Herstellungsverfahren in der gezeigten Ausführungsform darauf ab, das Quarzkapillarrohr 1 aus einem ersten Bereich, in dem das Kapillarrohr einen inneren Durchmesser von 50 um über eine Strecke von 150 mm bis zum Ende des Kapillarrohres (nicht gezeigt in Abb. 2) zu einem Innendurchmesser von 150 um aufzuweiten.
Die Herstellungsvorrichtung in Abb. 1 umfaßt ein luftdichtes Reservoir 2, das mit konzentrierter Flußsäure (HF) gefüllt ist und im Inneren eines mit einem Eiswasser-Bad 4 gefüllten Rezipienten 6 angeordnet ist, einen außerhalb des Rezipienten angeordneten Auffangbehälter 3, einen Druckversorgungsschlauch 9 zum Anlegen eines Überdruckes von ungefähr 4 bar an das Reservoir 2, und einen Schlauch 5, durch den der Wasserdampf zugeführt wird.
Wie im folgenden im Detail erklärt werden wird, erlaubt die in der Abbildung gezeigte Vorrichtung, an dem zu bearbeitenden Quarzkapillarrohr die Erzeugung eines Temperaturgradienten längs eines wählbaren Abschnittes bei angelegten Temperaturen von ungefähr 100ºC und 0ºC.
Zum Zwecke der Heizung eines vorbestimmten Abschnittes des Kapillarrohres 1 wird ein Schlauch, der vorzugsweise aus Kunststoffmaterial besteht, an zwei voneinander getrennten Stellen durchbohrt, wobei der Abstand zwischen den Löchern 15 cm beträgt, woraufhin das Kapillarrohr 1 in den Schlauch 5 an einer dieser Stellen eingeführt wird und an der anderen wieder zutage tritt. Die Enden des Kapillarrohres werden - um einen luftdichten Abschluß zu erreichen, jedes durch ein Septum 2a, 3a - in das Reservoir 2 beziehungsweise in den Auffangbehälter 3 geführt. Die Spitze des Kapillarrohres wird zusammen mit dem Reservoir 2 bis zu dem Punkt in das Eiswasser-Bad 4 eingelassen, wo das Kapillarrohr in den Schlauch 5 einmündet. Jetzt wird Wasserdampf mit einer Temperatur von ungefähr 100ºC durch den Schlauch 5 geleitet. Kondenswasser, das sich im Bereich der Kapillarrohre bildet, wird durch zusätzliches Absaugen am Ende des Schlauches beseitigt.
Der eigentliche Ätzvorgang zur Strukturierung des Inneren des Kapillarrohres beginnt mit dem Anlegen eines Überdruckes von ungefähr 4 bar an den Druckversorgungsschlauch 9. Nach 15 Minuten wird der Druck, der den Fluß des Ätzmittels durch das Innere des Kapillarrohres bewirkt, abgestellt, und anschließend wird das Kapillarrohr mit Wasser gespült. Nachdem das Kapillarrohr auf Länge zugeschnitten wurde, ist es verwendungsbereit.
Das Aufweitungsprofil des bearbeiteten Kapillarrohres, das wie bereits erwähnt in Abb. 2 in einer Querschnittsdarstellung gezeigt ist, zeigt einen stetigen Übergang von einem Innendurchmesser von 50 um in einem ersten Bereich 7 zu einem Innendurchmesser von 150 um in einem zweiten Bereich 8, der sich bis zum Ende des Kapillarrohres 1 erstreckt. Zusätzlich den geometrischen Verhältnissen des Quarzkapillarrohres ist es im wesentlichen die Grenzschicht zwischen den angelegten Temperaturen, die den Übergangsbereich definiert. In dem vorliegenden Fall ist die Grenzschicht die Wandung des Schlauches 5 am Punkt des Durchstoßes mit einer Dicke von ungefähr 1 mm. In der in Abb. 2 gezeigten Ausführungsform führt dies zu einem Übergangsbereich zwischen dem ersten Kapillarrohrbereich 7 und dem zweiten Kapillarrohrbereich 8 über eine Kapillarrohrlänge von 1200 um. Ausgehend von einer ursprünglich konzentrischen Lage der Außenwand des Kapillarrohres und der Innenwand derselben, werden sich die inneren Grenzflächen während des Ätzprozesses konzentrisch ausdehnen.
Die Ätzgeschwindigkeit und die Verhältnisse zwischen dem Innendurchmesser des ersten Kapillarrohrbereiches 7 und dem Innendurchmesser des zweiten Kapillarrohrbereiches 8 kann über die Ätzdauer und die Temperaturdifferenz gesteuert werden. Dies beruht auf dem Prinzip, daß das Ätzmittel bei höheren Temperaturen eine höhere chemische Aktivität besitzt. Als Daumenregel gilt, daß jede Erhöhung der Temperatur um 10ºC die Reaktionsgeschwindigkeit ungefähr verdoppelt.
Grundsätzlich können für dieses Verfahren alle Mittel verwendet werden, mit deren Hilfe die inneren Wände von durchbohrten Quarzkörpern an verschiedenen Stellen gleichzeitig oder nacheinander durch passende Temperaturgradienten in einer definierten Weise entfernt werden. Es ist nicht unbedingt notwendig, die Abtragung konzentrisch bezüglich des Loches durchzuführen. Die äußeren Abmessungen des Quarzkörpers bleiben unverändert. Beschichtete Oberflächen des Quarzes, mit der dieser vielleicht versehen ist, bleiben intakt.
In der vorliegenden Ausführungsform ist das Kapillarrohr 1 mit einer äußeren Beschichtung aus Polyamid versehen. Diese Polyamidbeschichtung bleibt intakt. Die äußeren Abmessungen des Kapillarrohres 1 bleiben ebenfalls unverändert. Dieser Aspekt ist, wie in der im folgenden aufgeführten Erklärung deutlicher gezeigt werden wird, besonders wichtig in Fällen, in denen ein Kapillarrohr 1, das mit einen Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verändert worden ist, in einem Detektor einer elektrophoretischen Vorrichtung des Kapillarrohr-Typs verwendet werden soll, dessen Kapillarrvhrhalterung für Kapillarrohre mit einer konstanten Dicke ausgelegt ist.
Die konzentrische Abtragung, die man bei Verwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhält und die einen glatten, stetigen Übergang zwischen dem ersten Kapillarrohrbereich 7 mit einer kleinen lichten Weite und dem zweiten Kapillarrohrbereich 8 mit einer großen lichten Weite bereitstellt, ist optimal bezüglich der Anforderungen, die im Zusammenhang mit einem Elektrophoreseprozeß des Kapillarrohr-Typs erfüllt werden müssen, da in der Feldstärkekurve während des darauffolgenden Anlegens der Hochspannungen an die zwei Enden des mit einer Pufferflüssigkeit gefüllten Kapillarrohres keine Sprünge auftreten.
Daraus folgt, daß das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zur Steuerung der Feldstärke und insbesondere zur Konzentrierung der Feldstärkeabnahme auf vorbestimmte Abschnitte des Kapillarrohres geeignet ist.
Abb. 3 zeigt eine zur Durchführung des Herstellungsverfahrens relativ zum Schlauch 5 veränderte Anordnung des Kapillarrohres 1. In der in dieser Abbildung gezeigten Anordnung wird das Kapillarrohr 1 durch den Schlauch 5 im rechten Winkel zur Längsachse des Schlauches geführt. Wie man an den jeweiligen Temperaturprofilen tp deutlich erkennen kann, erhält man an beiden Stellen entlang des Kapillarrohres 1 eine Temperaturverteilung von 0ºC bis 100ºC von der äußeren Wand des Schlauches 5 zur inneren Wand desselben. Wenn das beschriebene Herstellungsverfahren durchgeführt wird, wird eine derartige Ausprägung des angelegten Temperaturprofils zu einer Form des inneren Profils des Kapillarrohres 1 in der in Abb. 4 deutlich gezeigten Art führen. Aus dieser Abbildung ist zu ersehen, daß sich innerhalb eines vergleichsweise kurzen Abschnittes, dessen Länge ungefähr der Dicke des Schlauches 5 entspricht, eine Blase bildet, die durch einen stetigen Übergang vom ersten Kapillarrohrbereich 7 mit einem kleineren Durchmesser zum zweiten Kapillarrohrbereich 8 mit einem großen Innendurchmesser und wieder zurück zu einem weiteren Kapillarrohrbereich 7 mit einem kleineren Durchmesser bestimmt ist.
Abb. 5 zeigt ein Elektrophoresesystem des Kapillarrohr-Typs, das auch als Kapillarzonen-Elektrophoresesystem (KZE) bezeichnet wird und das ein mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestelltes Kapillarrohr 10 enthält. Das Kapillarrohr besitzt eine Eintrittsöffnung 12 mit einem Eintritts-Reservoir 14. Das Eintritts-Reservoir 14 versorgt das Kapillarrohr 10 mit einem elektrolytischen, wässrigen Medium, das auch als Pufferlösung 15 bezeichnet werden kann. Eine Probe mit unbekannten Bestandteilen wird der Eintrittsöffnung 12 dadurch zugeführt, indem man diese Öffnung 12 kurz in ein Probengefäß (nicht gezeigt) taucht und durch Anlegen von Spannung oder Druck eine kleine Probenmenge in das Kapillarrohr einzieht.
Eine Hochspannungsversorgung 22 ist mit einer positive Elektrode 18 verbunden, die im Eintrittts-Reservoir 14 angeordnet ist. Eine geerdete Leitung 24 verbindet die Hochspannungsversorgung 22 mit einer negativen Elektrode 26, die gleicherweise in einem Auslaß-Reservoir angebracht ist. Selbstverständlich kann die Polung umgekehrt werden, das heißt, daß die Hochspannungsversorgung 22 mit der positiven Elektrode 18 verbunden ist und die geerdete Leitung 24 die Hochspannungsversorgung 22 mit einer negativen Elektrode 26 verbindet.
Wie aus der rechten Seite von Abb. 5 zu ersehen ist, liegt der zweite Kapillarrohrbereich 8, der einen vergrößerten Innendurchmesser besitzt, auf der Auslaßseite 30 in dem Auslaß-Reservoir 28, wohingegen der erste Kapillarrohrbereich 7, der einen kleinen Innendurchmesser besitzt, an der Eintrittsöffnung 12 liegt. Der zweite Kapillarrohrbereich 8 des Kapillarrohres ist zwischen einer Lichtquelle 38 und einem Detektor 42 plaziert, der Licht von der Lichtquelle empfängt, nachdem dieses Licht den zweiten Kapillarrohrbereich 8 passiert hat, wobei das Licht dort von den Bestandteilen der gelösten Stoffe, die in der Pufferlösung 15 transportiert werden, absorbiert wird. Der Detektor 42 ist über die Leitungen 40 mit einem Schaltkreis zur Auswertung der Ultraviolett-Absorption 34 verbunden. Die Messungen können von einem Computer 44 ausgewertet und dargestellt werden.
Die Anordnung des zweiten Kapillarrohrbereiches 8 zwischen der Lichtquelle 38 und dem Detektor 42 kurz hinter dem Übergangsbereich zum ersten Kapillarrohrbereich mit dem kleineren Innendurchmesser ist in Abb. 6 im Detail gezeigt. Für einen Fachmann ist es offensichtlich, daß der Spannungsabfall im wesentlichen entlang des ersten Kapillarrohrbereiches 7 stattfindet, wohingegen der Spannungsabfall über die Länge des zweiten Kapillarrohrbereiches aufgrund des vergrößerten Innendurchmessers des zweiten Kapillarrohrbereiches praktisch vernachlässigbar ist.
Es folgt, daß eine angemessene Anordnung der Kapillarrohraufweitung in dem Übergangsbereich zwischen dem ersten und zweiten Kapillarrohrbereich 7, 8 in kurzer Entfernung, in Flußrichtung gesehen, vor dem Detektor 42, den Effekt hat, daß die zur Verfügung stehende Feldstärke in dem Kapillarrohrabschnitt vor dem Detektor 42 konzentriert wird, der in bezug auf die Trennung der wichtige Abschnitt ist, wobei Spannungsverluste, in Flußrichtung der Pufferlösung gesehen, hinter dem Detektor 42 praktisch unmöglich sind. Somit wird eine merkliche Verringerung der Zeit erreicht, die für die Untersuchung benötigt wird.
Angesichts der Tatsache, daß das Kapillarrohr 10 gemäß der vorliegenden Erfindung eine im Wesentlichen über seine gesamte Länge gleichbleibende äußere Form besitzt, und angesichts der Tatsache, daß mögliche äußerer Schichten, wie Polyamid-Schichten, intakt bleiben, wenn das Kapillarrohr mit den Mitteln des Herstellungsverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt wird, kann ein nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziertes Kapillarrohr in einem Detektor verwendet werden, der ursprünglich für Standardkapillarrohre ausgelegt worden ist, die einen konstanten Innendurchmesser und einen konstanten Außendurchmesser besitzen.
In Abweichung von der bevorzugten Ausführungsform des am Anfang beschriebenen Herstellungsverfahrens, ist es ebenfalls möglich, ein Kapillarrohr 10, das schon am Detektor 42 installiert worden ist, am Nachweisort aufzuweiten, wenn während des Ätzprozesses eine lokale Temperaturerhöhung veranlaßt wird; dies kann zum Beispiel erreicht werden durch Anblasen mit heißem Gas oder mittels Mikrowellenheizung.
In diesem Fall kann der Zeitpunkt, zu dem der Ätzprozeß des Herstellungsverfahrens abgeschlossen ist, durch Nachweis mit Hilfe eines Nachweissignals bestimmt werden.
Ein vergleichsweise langsamer Übergang vom kleineren zum größeren Innendurchmesser über eine Länge von z. B. 1 bis 2 mm erlaubt eine freie Wahl der vorteilhaftesten Nachweisbedingungen, dadurch, daß das aufgeweitete Kapillarrohr 10 vor dem Nachweisfenster, das durch die Lichtquelle 38 und den Detektor 42 bestimmt wird, in Achsenrichtung verschoben wird.
Der optimale Punkt zur Durchführung des Nachweises hängt von der notwendigen Nachweisempfindlichkeit ab; er liegt jedoch in jedem Falle nahe beim Übergangsbereich.
Wie man leicht versteht, kann der temperaturkontrollierte Ätzprozeß gemäß der Erfindung auch dazu verwendet werden kann, Quarz-Detektorzellen mit speziell angepaßten Strömungsprofilen für die Flüssigkeitschromatographie zu formen.

Claims

1. Ein Verfahren zur Herstellung eines Kapillarrohres zur elektrophoretischen Trennung, einen ersten Kapillarrohrabschnitt umfassend, der einen ersten Innendurchmesser besitzt und einen zweiten Kapillarrohrabschnitt, der einen zweiten Innendurchmesser besitzt, der im Vergleich zu dem ersten Innendurchmesser vergrößert ist und als Nachweisbereich für die in dem Kapillarrohr getrennten Substanzen dient, das Verfahren umfassend den Schritt zur Bereitstellung eines Kapillarrohres, das einen über seine Länge im wesentlichen gleichförmigen Innendurchmesser besitzt und das eine äußere Beschichtung umfaßt, wobei das Verfahren durch die folgenden Schritte charakterisiert wird:

- Einführung eines Ätzmittels in das Innere des Kapillarrohres (1; 10), mittels dessen das Material des Kapillarrohres geätzt werden kann,

- Erzeugung eines Temperaturgradienten über das Kapillarrohr derart, daß die Temperatur des zweiten Kapillarrohrabschnittes (8) höher ist als die Temperatur des ersten Kapillarrohrabschnittes (7), und

- Durchführung des Ätzvorganges bis der zweite Kapillarrohrabschnitt (8) den gewünschten Innendurchmesser besitzt und die äußere Beschichtung intakt bleibt.

2. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Verfahrensschritt der Durchführung des Ätzvorganges die Maßnahme umfaßt, das Ätzmittel durch das Kapillarrohr (1; 10) fließen zu lassen.

3. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Verfahrensschritt zur Erzeugung des Temperaturgradienten die folgenden Schritte umfaßt:

- Einführen einer der beiden Kapillarrohrabschnitte (8) des Kapillarrohres (1; 10) in einen Schlauch (5),

- Einführen des anderen Kapillarrohrabschnittes (7) in ein Bad (4), das eine vorbestimmte Temperatur besitzt,

- Durchleiten eines Mediums, dessen Temperatur sich von der des Bades (4) unterscheidet, durch den Schlauch.

4. Ein Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Bad (4) ein Eiswasser-Bad ist und wobei das den Schlauch (5) passierende Medium Wasserdampf ist.

5. Ein Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das durch das Kapillarrohr hindurchfließende Ätzmittel (1; 10) in das Kapillarrohr mit Überdruck eingeleitet wird.

6. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Kapillarrohr (1; 10) aus Quarzglas besteht und wobei das Ätzmittel Flußsäure (HF) ist.

7. Ein Trennkapillarrohr mit einer äußeren Beschichtung zur Verwendung in einer Elektrophoresevorrichtung, einen ersten Kapillarrohrabschnitt umfassend, der einen ersten Innendurchmesser besitzt und einen zweiten Kapillarrohrabschnitt, der einen zweiten Innendurchmesser besitzt, der im Vergleich zu dem ersten Durchmesser vergrößert ist und der als Nachweisbereich für in dem Kapillarrohr getrennte Substanzen dient, wobei der erste Innendurchmesser stetig und ohne irgendwelche Stufen in den zweiten Innendurchmesser übergeht, dadurch charakterisiert, daß der erste und zweite Kapillarrohrabschnitt (78) zumindest in deren Übergangsbereich denselben Außendurchmesser besitzen, und der zweite Kapillarrohrabschnitt (8) sich von der Übergangsregion zum ersten Kapillarrohrabschnitt (7) bis zum Ende (30) des an der Austrittsseite befindlichen Kapillarrohres erstreckt.

8. Eine Elektrophoresevorrichtung zum Nachweis zumindest eines Bestandteils einer Probe, umfassend

- ein Kapillarrohr (10) gemäß Anspruch 7

- ein Einlaß-Reservoir (14), von dem aus sich der erste Kapillarrohrabschnitt (7) des Kapillarrohres (10) erstreckt,

- ein Austritts-Reservoir (28), zu dem hin und in das hinein sich der zweite Kapillarrohrabschnitt (8) des Kapillarrohres (10) erstreckt,

- ein Generator (22) zur Erzeugung eines elektrischen Feldes zwischen einer Pufferlösung (15) im Einlaß-Reservoir (14) und einer Pufferlösung (15) im Austritts-Reservoir (28); und

- eine Nachweisvorrichtung (38, 42, 34), eine Lichtquelle (38) und einen Lichtsensor (42) umfassend, die am zweiten Kapillarrohrabschnitt (8) des Kapillarrohres (10) angeordnet sind, um den zumindest einen Bestandteil der Probe nachzuweisen.

9. Eine Elektrophoresevorrichtung zum Nachweis zumindest eines Bestandteils einer Probe gemäß Anspruch 8, wobei die Nachweisvorrichtung eine Vorrichtung zum Nachweis der Absorption (38, 42, 34) ist.

10. Eine Elektrophoresevorrichtung zum Nachweis zumindest eines Bestandteils einer Probe gemäß Anspruch 8, wobei die Nachweisvorrichtung eine Vorrichtung zum Nachweis der Fluoreszenz (38, 42, 34) ist.